JP2002531058A - Tpl−2/cotキナーゼおよび使用方法 - Google Patents
Tpl−2/cotキナーゼおよび使用方法Info
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Abstract
Description
.2の優先権を主張する1998年12月16日に出願されたセリアル番号:G
B9827712.2の一部継続出願である。前記出願および全ての他の特許、
特許出願、および本明細書を通じて引用された文献の内容は、ここに、出典明示
して本明細書の一部とみなす。
子として1986年に発見され(SenおよびBaltimore,(1986
)Cell46:705−716)、それ以来、実質的に全ての真核生物細胞タ
イプに存在する普遍的転写因子であることが示されている(Ghosh等,(1
998)Ann. Rev.Immunol. 16:225−260)。細胞
中では、NFκBは細胞質に存在し、阻害剤蛋白質IκBに複合体化した不活性
形態である。適当なインデューサでの刺激に対して、IκBはNFκBから解離
し、その核局所化シグナルをマスク解除し、核への輸送を可能とし、そこで転写
因子としてのその生物学的活性が発揮される。このように、その誘導はde n
ovo蛋白質合成から独立しているからであるので、NFκBは遺伝子発現の迅
速なモジュレータである。
l相同性ドメインとして知られている保存された300アミノ酸N−末端ドメイ
ンを含有する。この領域は、DNA結合、他のRel蛋白質とのダイマー化、核
局所化、およびIκBへの結合を担う。各Rel蛋白質は必要なDNA結合部位
の1/2を含有し、このように、適当なRel組合せが、コンセンサスNFκB
結合部位、5’−GGGGYNNCCY−3’におけるわずかな改変によって特
定されることを可能とする。
れる。IκBはIκB−α、β、γ、εBcl−3およびCactusを含めた
、その数が特徴づけられている、アンキリン反復含有分子である。Bcl−3は
高等脊椎動物のポリペプチドであり、他方、Cactusはショウジョウバエの
遺伝子である。アンキリン反復およびNFκB/Relの間の相互作用は、NF
κB蛋白質の調節についての進化的に保存されたメカニズムのようである。
、c−Rel、v−Rel(ニワトリ・オンコジーン)、p65、p100/p
52およびp105/p50を含む。最初の3つのリストはショウジョウバエ蛋
白質である。後者の2つのポリペプチドは、より大きい前駆体分子(p100ま
たはp105)が共にRel蛋白質およびIκBをコードする点で異常であり、
これはその関連Rel蛋白質と組み合わせてその各局所化をブロックする。モノ
マーまたはホモダイマーとして、p50およびp52は転写活性化ドメインを含
有しない。よって、遺伝子転写を活性するために、それらはホモダイマーの形態
でもう1つのトランス活性化Rel蛋白質と会合する。p50/p52のホモダ
イマーはある種の細胞タイプにおいて遺伝子転写を後退させ得る。
はプロテオソームによる分解のためのIκBにタグを付すが、IκBリン酸化の
メカニズムは今日依然としてかなり不明瞭なままである。p100/p105の
場合、p52/p50の核局所化シグナルをマスク解除するためには、Rel領
域からのC−末端アンキリン反復含有領域の蛋白質分解開裂が必要である。
調節で重要な役割を演じる。NFκB効果はかなり多面的であるが、p105の
効果はノックアウトマウス(p105−/−)で調べられている。これらの動物
において、p105のC−末端領域は欠失され、従って、マウスはp50を発現
できたが、p105のIκB−様阻害性アンキリン反復と複合体化しない形態で
ある。換言すれば、構成的に活性なp50が生産された(Ishikawa等、
(1998)J. Exp. Med. 187:985−996)。これらの
マウスは肺および肝臓におけるリンパ球侵潤、感染に対する増大した感受性、複
数リンパ節の拡大、巨脾腫およびリンパ様過形成を含む炎症表現型を呈した。マ
クロファージのサイトカイン生産能力は損なわれ、他方、B−細胞増殖は増加し
た。
び機能不全に関連する。例えば、Schick等(1991)EMBO J.
10:2247−2258によって示されるごとく、NFκBの核への移動はH
IVゲノムの転写およびHIV感染細胞におけるHIVビリオンの生産、ならび
にHIV遺伝子発現に関連づけられている(Svingler等(1992)A
IDS Res Hum Retroviruses(8,487−493)。
また、それはEBVのごとき他のレトロウイルスの複製に関連する(Powel
lら、(1993)Clin Exp Immunol 91:473−481
)。
(1993)BBRC 197:709−715参照)、TNFの生物学的効果
(Renier等(1994)J. Lipid Res 35:271−27
8;WO 97/37016)、ストレスに対する応答(Tacchini等,
(1995)Biochem J 309−453−459)を媒介し、例えば
、虚血症から細胞を保護する(Mattson,(1997)Neurosci
. Biobehav. Rev. 21:193−206)ことが知られてお
り、種々の癌と関連づけられている(Chang等,(1994)Oncoge
ne 9:928−933; EnwonwuおよびMeeks,(1995)
Crit Rev Oral Biol Med 6:5−17; Denha
rdt,(1996)Crit Rev Oncog 7:216−291)
。
インの発現の調節に関与している。これは、ストレス、感染または炎症に関連す
るまたはそれに関与する疾患の治療における、またはイン・ビボでNFκBによ
って制御される炎症応答のごとき応答を使用することによる疾患の治療における
NFκB活性のモジュレータについての役割を示唆する。
細胞リンパ腫と関連するオンコジーンの産物として、C−末端欠失形態で同定さ
れた(Patriotis等,(1993)Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 90:2251−2255)。TPL−2は、その触媒
ドメインにおいてMAPキナーゼキナーゼキナーゼ(3K)に相同であり(Sa
lmeron, A.等,(1996)Embo J. 15:817−826
)、ヒトCOTのプロト−オンコジーン産物と>90%同一である(Aoki,
M.,(1993)等 G. Biol. Chem. 268:22723
−22732)蛋白質セリンキナーゼである。TPL−2もまた、IκB−αの
誘導分解を調節することが示されているキナーゼNIKと高度に相同である(M
alinin等,(1997)Nature 385:540−544;Wo
97/37016;MayおよびGhosh,(1998)Immunol.
Today 19:80−88)。しかしながら、TPL−2/−COTの生物
学的機能は従来は知られていない。
を変調できる剤および、好ましい具体例においては、IκB p105とTPL
−2の相互作用を変調できる剤の開発のための標的としてのキナーゼTPL−2
/COTの使用に関する。明細書を通じて、用語「TPL−2」は、特に断りの
ない限り、ラットTPL−2およびヒトTPL−2ホモログCOTを含むことが
理解されるであろう。また、いずれかのTPL−2ホモログ、好ましくは哺乳動
物TPL−2ホモログは本発明の範囲内に含まれると理解される。用語「NFκ
B」は、他に定義がなければ、当業者に認められたごとくNFκB−結合活性を
有するいずれの蛋白質(またはその断片)、または蛋白質複合体も含むことを意
図する。かかる蛋白質または蛋白質複合体は1以上の蛋白質を含むことができ、
ホモダイマー、ヘテロダイマーまたはマルチマーの形態を採り得る。典型的には
、かかる複合体は、例えば、rel A、rel B、p50、p52、p65
、c−Rel、V−Relおよび/またはdorsalを含むことができる。
出を担うことが以下に示される。従って、本発明はp105の分解の特異的レギ
ュレータとしての、このように、p50 Relが関与する炎症応答のモジュレ
ータとしてのTPL−2を提供する。
κB活性の変調におけるTPL−2の使用が提供される。好ましい具体例におい
て、変調はp105を介して起こる。
は複数化合物と共にインキュベートする工程と、 (b)TPL−2分子の活性に影響する化合物を同定する工程を含む、p10
5の蛋白質分解およびそれによりその阻害活性を直接または間接に変調すること
ができる化合物または複合化合物を同定する方法が提供される。
ノマーとのヘテロダイマーとしての、その分解および関連Relサブユニットの
核への移動に直接的に導く、p105の直接的または間接的リン酸化を担うと判
明した。従って、TPL−2に結合する、TPL−2の活性を変調するまたはT
PL−2とp105またはp105のリン酸化に関与する他のポリペプチドとの
相互作用に影響することによって、TPL−2およびp105の間の直接的また
は間接的相互作用を変調することができる化合物は、NFκBのp105を介す
る活性化を変調することができる。
ドする発現核酸配列を含む)、イン・ビボで細胞中でNFκB活性を変調する方
法、およびNFκBに関連する、あるいは炎症を誘導または抑制するのが望まし
い疾患の治療方法を提供する。
延長のためのTPL−2の使用が提供される。後述するように、遺伝子転写のT
NF活性化はTPL−2アンタゴニスト、TPL−2(A270)の使用によっ
てブロックされ得る。
することができるのが知られている。従って、本発明は、p105のTNF活性
化経路を変調する方法に関する。好ましい具体例において、本発明は、 テストすべき化合物または複数化合物の存在なくしては、TNFおよびTPL
−2の相互作用が測定可能な化学的または生物学的効果を誘導する条件下でテス
トすべき化合物または複数化合物をTPL−2分子および腫瘍壊死因子(TNF
)と共にインキュベートすることと; テストすべき化合物または複数化合物の存在下でTPL−2と直接的または間
接的に相互作用して測定可能な化学的または生物学的効果を誘導するTNFの能
力を測定することと: TNFおよびTPL−2の相互作用を変調する化合物を選択する医薬のための
リード化合物を同定する方法を提供する。
質およびテスト化合物または複数化合物と共にインキュベートする工程と; 基質のリン酸化を変調できるテスト化合物または複数化合物を同定する工程を
含む薬剤のためのリード化合物の同定方法を含む。
/p105に由来するシグナリング経路に対するその効果を測定することができ
る。
を含む反応混合物をテスト化合物と接触させ、NFκBの活性のインジケータに
対するテスト化合物の効果を測定して、それにより、TPL−2によって媒介さ
れるNFκB活性を調製する化合物を同定することを含む、TPL−2によって
媒介される炎症応答を調節する化合物を同定する方法を提供する。
合物を同定する方法を提供する。
含有する反応混合物をテスト化合物と接触させ、反応混合物中でのTPL−2ポ
リペプチドによる情報伝達のインジケータに対するテスト化合物の効果を測定し
てTPL−2による情報伝達を調節する化合物を同定することを含む、TPL−
2による情報伝達を調節する化合物を同定する方法を提供する。
TPL−2ポリペプチドまたはその断片が参照レベルにおいて標的成分と特異的
に相互作用する条件下で、TPL−2ポリペプチドまたはその断片を含有する反
応混合物をTPL−2変調の標的成分、およびテスト化合物と接触させることを
含む、TPL−2ポリペプチドとTPL−2変調の標的成分との相互作用を変調
する化合物を同定する方法を提供する。従って、前記方法はテスト化合物の存在
下で相互作用のレベルでの変化を測定することを可能とし、ここに、差異は、テ
スト化合物がTPL−2ポリペプチドまたはその断片とTPL−2変調の標的成
分との相互作用を変調することを示す。好ましい具体例において、標的成分はp
105、IκB−α、IκB−β、MEK−1、SEK−1またはNFκB、好
ましくは精製されたポリペプチドである。
れたアミノ酸配列と少なくとも75%同一性を有するアミノ酸配列を含む、TP
L−2ポリペプチド、好ましくは組換えポリペプチドの使用を含む。
配列番号3で供される配列を有する核酸分子と高度にストリンジェント条件下で
ハイブリダイズする核酸分子によってコードされるTPL−2ポリペプチド、好
ましくは組換えポリペプチドを含む。
たは細胞ベースの混合物の使用を含み、かかる混合物は組換え細胞、好ましくは
TPL−2ポリペプチドをコードする異種核酸を有する組換え細胞に由来するこ
とができる。好ましい具体例において、無細胞混合物は精製されたTPL−2ポ
リペプチドを使用することができる。もう1つの具体例において、前記方法は、
TNF発現を含むシグナリングの測定を含む。関連する具体例において、組換え
細胞は、TPL−2またはNFκBによって変換される細胞内シグナルに対して
感受性である転写調節配列と作動可能に連結したレポーター遺伝子構築体を含む
。好ましい具体例において、転写調節配列はTNF転写調節配列である。
結合活性、および/またはシグナリング活性のごときTPL−2活性の測定を含
む。
または免疫反応のアポトーシスを測定することを含む測定を含む。
質ベース、核酸ベース、天然有機物ベース、合成由来有機物ベース、または抗体
ベースであるテスト化合物の使用を含む。
された化合物を提供し、かかる化合物は、多発性硬化症(MS)、炎症性腸疾患
(IBD)、インスリン−依存性糖尿病(IDDM)、敗血症、乾癬、移植片拒
絶、誤調節TNF発現、または好ましくは慢性関節リウマチのごとき疾患を治療
するのに適している。
十分な量で、TPL−2を変調できる医薬組成物を投与することによる、TPL
−2活性を変調することによってそれを必要とする対象において免疫系疾患を治
療する方法を提供する。
調するのに治療上十分な量で、TPL−2を変調できる組成物を投与することに
よる、対象においてTPL−2−媒介疾患の治療方法を提供する。
の医薬組成物をヒトに投与することによる、それを必要とする対象においてTP
L−2−媒介NFκB調節を変調する方法を提供する。
節が達成されるのに十分な量で、TPL−2を変調できる組成物を細胞に投与す
ることを含む、細胞内でTPL−2−媒介NFκB調節を変調する方法を提供す
る。
、炎症性腸疾患(IBD)、インスリン−依存性糖尿病(IDDM)、敗血症、
乾癬、移植片拒絶、誤調節TNF発現、または好ましくは慢性関節リウマチであ
る。
4−(4−アミノ−7−シクロペンチル−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジ
ン−5−イル)−2−クロロフェニル]−1−ベンゼンスルホンアミド、5−オ
キソ−4−[4−(フェニルスルファニル)アニリノ]−5,6,7,8−テト
ラヒドロ−3−キノリンカルボン酸エチル、3−(4−ピリジル)−4,5−ジ
ヒドロ−2H−ベンゾ[g]インダゾールメタンスルホン酸塩および2−クロロ
ベンゾ[1][1,9]フェナントロリン−7−カルボン酸ナトリウムからなる
群から選択される化合物を含有する。
PL−2モジュレータをTNF誤調節の危険性がある対象に投与することによる
TNF誤調節の治療方法を提供する。
モジュレータを慢性関節リウマチの危険性がある対象に投与することによる慢性
関節リウマチの治療方法を提供する。
[4−(4−アミノ−7−シクロペンチル−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミ
ジン−5−イル)−2−クロロフェニル]−1−ベンゼンスルホンアミド、5−
オキソ−4−[4−(フェニルスルファニル)アニリノ]−5,6,7,8−テ
トラヒドロ−3−キノリンカルボン酸エチル、3−(4−ピリジル)−4,5−
ジヒドロ−2H−ベンゾ[g]インダゾールメタンスルホン酸塩および2−クロ
ロベンゾ[1][1,9]フェナントロリン−7−カルボン酸ナトリウムである
。
リウマチである場合、3−(4−ピリジル)−4,5−ジヒドロ−2H−ベンゾ
[G]インダゾールメタンスルホン酸塩でないTPL−2モジュレータが使用さ
れる。
用に必要である。 A)TPL−2欠失突然変異体。mycおよびTSP3エピトープの位置(S
almeron, A.等,(1996)EMBO J. 15, 817−8
16)が示される。M30はTPL−2の別の開始部位に対応する(Aoki,
M.等,(1993)J. Biol. chem. 268,22723−
22732)。B)TPL−2ΔCはp105とで安定な複合体を形成しない。
p105(Blankら,(1991)EMBO J. 100, 41594
167)を合成し、それ自体またはTPL−2もしくはTPL−2ΔCといっし
ょにイン・ビトロ無細胞翻訳によって[35S]−Metで標識する(Salm
eron等,(1996))。次いで、適当な翻訳ミックスを抗−TPL−2抗
体−/+競合ペプチドと免疫沈殿させる。単離された蛋白質を10%SDS−P
AGEによって解像し、フルオログラフィーによって明らかにする(右側パネル
)。「溶解物」で表される左側パネルは全ウサギ網状赤血球溶解物翻訳ミックス
におけるTPL−2およびp105発現を示す。イン・ビトロで翻訳されたp1
05は、フィルムの過剰露出で目に見える(データは示さず)に過ぎない低いレ
ベルのp50を生じた(レーン3)。C)TPL−2のN−末端はp105への
結合に必要でない。示されたTPL−2蛋白質(それらのN−末端にタグした全
てのmycエピトープ)をBにおけるごとくp105にてイン・ビトロで翻訳し
、次いで、抗−myc MAbで免疫沈殿させる。[35S]−Met−標識蛋
白質は10%SDS−PAGE後にフルオログラフィーによって明らかにされる
。下方パネルは溶解物におけるp105の発現を示す。
する。 A)p105欠失突然変異体(Fan等,(1991)Nature 354
, 395−398)。Rel相同性ドメイン(RHD)(Ghosh等,(1
998)Annu. Rev. Immunol.16, 225−260)、
グリシンリッチ領域(GRR)(Iin等,(1996)Mol. Cell.
Biol. 16, 2248−2254)および抗体エピトープ、mycお
よびNF−κB1(N)の位置を示す。開いた矢印の頭はp50のC−末端の位
置を示す。塗りつぶした矢印の頭は、全て蛋白質のC−末端まで続くN−κB1
2−ハイブリッドクローンと相互作用する種々のTPL−2のN−末端スター
ト部位を示す。B)およびC)TPL−2はp105のC−末端と相互作用する
。TPL−2はイン・ビトロで示されたp105突然変異体といっしょに翻訳さ
れる。複合体形成は抗−TPL−2免疫沈殿の8%SDS−PAGE(右側パネ
ル)およびフルオログラフィーによって分析される。左側パネルは溶解物中のT
PL−2およびp105突然変異体の発現を示す。B)における矢印の頭はp4
8の位置を示す。
にNF−κB−依存性レポーター遺伝子を活性化する。 A)TPL−2はイン・ビボでp105と会合する。HeLa細胞溶解物を示
した抗体−/+競合ペプチドと免疫沈殿させる。単離された蛋白質を10%SD
S−PAGEによって解像し、次いで、示された蛋白質につき順次ウエスタンブ
ロットする。B)TPL−2の大部分はp105とで複合体化する。HeLa細
胞溶解物を抗−NF−κB1抗体と系列的に3回免疫沈殿させる。細胞溶解物の
ウエスタンブロッティングはp105/p50の枯渇を確認したが、α−チュー
ブリンの枯渇は確認しなかった。NF−κB1−枯渇溶解物のTPL−2含有量
は、溶解物および溶解物からの抗−TPL−2免疫沈殿のウエスタンブロットを
抗−TPL−2抗血清でプロービングすることによって測定される。C)TPL
−2発現はNF−κB−依存性ルシフェラーゼレポーター遺伝子を活性化する。
ジャーカットT細胞は0.5μgの示された発現ベクター+2μgのレポーター
構築体でトランスフェクトする(全DNAは空pcDNA3ベクターで4μgに
調整する。ルシフェラーゼアッセイは二連で行い、空ベクター対照に対する平均
刺激指標(+/−SE)として表す。TPL−2ΔCデータは、1の任意値を与
えられた、TPL−2に対するウエスタンブロッティングによって測定されたそ
の発現レベルに基づいて正規化される。TPL−2(A270)はTPL−2の
キナーゼ−不活性点突然変異体である。D)C−末端p105断片の共発現はT
PL−2によるNF−κB活性化をブロックする。ジャーカットT細胞は0.5
μgの示された発現ベクターおよび2μgの空ベクターもしくは3’NN構築体
+2μgのMF−κBルシフェラーゼレポーター構築体いずれかでトランスフェ
クトする。二連ルシフェラーゼアッセイは空ベクター対照に対する平均刺激指標
として表される(+/−SE)。ウエスタンブロッティングにより、3’NNの
発現が共トランスフェクトされたTPL−2の発現に影響しないことが確認され
た(データは示さず)。
する。 A)TPL−2は共発現されたNF−κB1の核転移を誘導する。3T3細胞
を0.5μgの示された発現ベクターの各々で一過的にトランスフェクトし、抗
−myc MAb(緑色)を用いて間接免疫蛍光につき染色してmyc−p10
5/myc−p50および抗−TPL−2抗血清(赤色)を位置決定する。示さ
れたイメージは代表的なトランスフェクト細胞を通じての単一共焦点セクション
である。相コントラストイメージも示す。 B)TPL−2はmyc−p50を誘導して核に転移させる。細胞質および核
抽出物を、示されたベクターでトランスフェクトされた細胞から調製する。抗−
myc免疫沈殿のウエスタンブロットを抗−NF−κB1(N)抗血清でプロー
ビングすることによって明らかにする。全細胞溶解物の比較は、myc−p50
が核分から不十分に抽出され、従って過小に表されることを示唆した。 C)TPL−2によって誘導された核NF−κB1は生物学的に活性である。
示された発現ベクター(各々0.5μg;Watanabe等,(1997)E
MBO J. 16, 3609−3620)でトランスフェクトされた3T3細
胞から調製された核抽出物のNF−κB DNA−結合活性をEMSAによって
分析する(Alkalay, I.等(1995)Mol. Cell. Bi
ol. 15, 1294−1301)。塗りつぶした矢印の頭は2つの検出され
たNF−κB複合体の位置を示す。塗りつぶしていない矢印の頭は抗体−スーパ
ーシフトしたNF−κB複合体の位置を示す(レーン6および7)。レーン8に
おいて、100倍の未標識κBオリゴヌクレオチドとの競合は、検出されたNF
−κB複合体の特異性を示した。
。 3T3細胞は、HA−p50(0.4μg)、TPL−2(A270)または
TPL(0.2μg)いずれかおよびmyc−p105AGRRをコードするベ
クターまたは空ベクター(0.4μg)で一過的にトランスフェクトする。培養
の24時間後、HA−p50(緑色)を位置決定するための抗−HA MAeお
よび抗−TPL−2抗血清(赤色)を用いて間接免疫蛍光につき染色する。示さ
れたイメージは代表的なトランスフェクト細胞を通じた単一共焦点セクションで
ある。また、相コントラストイメージも提示する。
yc−p105およびTPL−2をコードする発現ベクター(TPL−2)で、
またはmyc−p105および空ベクター(対照)で一過的にトランスフェクト
する。培養の24時間後、細胞を[35S]−Met/[35S]−Cysで3
0分間代謝的にパルス標識し、次いで、示された時間チェイスする。標識蛋白質
を抗−myc MAbを用いて細胞溶解物から免疫沈殿させ、8%SDS−PA
GEによって解像し、フルオログラフィーによって明らかにする。塗りつぶした
矢印の頭は共免疫沈殿TPL−2の位置を示す。塗りつぶしていない矢印の頭は
TPL−2共発現によって引き起こされたmyc−p105の電気泳動移動度の
シフトを示す。B)およびC)パネルA中の免疫沈殿したmyc−p105およ
びmyc−p50をレーザーデンシトメトリーによって定量し、データをグラフ
表示して、myc−p105の代謝回転(B)およびmyc−p50/myc−
p105の比率(C)を示す。D)myc−p105AGRRおよびTPL−2
(TPL−2)またはmyc−p105AGRRおよびインサート無し(対照)
をコードするベクターで3T3細胞を一過的にトランスフェクトする。myc−
p105代謝回転をBにおけるごとく測定する。E)TPL−2(A270)を
コードするベクター空または空ベクター(対照)といっしょでmyc−p105
をコードするベクターで3T3細胞をトランスフェクトする。myc−p105
の代謝回転をBにおけるごとく測定する。F)TPL−2−誘導p105蛋白質
分解をプロテアソームのインヒビターによってブロックする。3T3細胞をAに
おけるごとくトランスフェクトする。MG132プロテアソームインヒビター(
2011M)またはDMSOビヒクル(対照)をパルス標識に先立って添加し、
チェイス時間の間維持する。標識myc−p105をAにおけるごとく免疫沈殿
によって単離し、レーザーデンシトメトリーによって定量する。データをグラフ
表示して、TPL−2−誘導myc−p105蛋白質分解に対する薬物の効果を
示す。TPL−2共トランスフェクト細胞におけるチェイスの間に、MG132
処理はmyc−p50の生産を完全にブロックした(データは示さず)。G)3
T3細胞を、二連にて、Aにおけるごとく示したベクターでトランスフェクトす
る。細胞溶解物のウエスタンブロットを抗−myc抗血清でプロービングするこ
とによって、myc−p50/myc−p105の定常レベルが24時間後に測
定される。TPL−2共トランスフェクションは対照と比較してmyc−p50
の絶対レベルを増加させた。このように、恐らくはその核位置のため、myc−
p50はTPL−2共発現細胞でより安定であり得る。というのは、myc−p
105からのmyc−p50の生産の全速度は増大されないからである(図6A
)。
解をブロックする。ウエスタンブロッティングによって判断されるごとく、ジャ
ーカットT細胞はトランスフェクトされてキナーゼ−不活性TPL−2(A27
0)を安定に発現する。空ベクターで安定にトランスフェクトされたベクター対
照細胞、およびTPL−2(A270)を発現する2つの独立して誘導されたク
ローンを、[30S]−Met/[35S]−Cysで代謝的に30分間パルス
標識し、次いで、示すごとく、TNF−a(20ng/ml)または対照培地の
存在下で示された時間チェイスする。標識p105を抗−NF−κB1(N)抗
血清を用いて細胞溶解物から免疫沈殿させ、SDS−PAGEによって解像し、
フルオログラフィーによって明らかにする。免疫沈殿したp105をレーザーデ
ンシトメトリーによって定量し、データをグラフ形態で提示する。 B)TPL−2は共発現されたmyc−p105のリン酸化を誘導する。my
c−p105および示された蛋白質またはインサート対照無し(O)をコードす
るベクターで3T3細胞を一過的にトランスフェクトする。myc−p105を
抗−myc MAbでの免疫沈殿によって単離し、次いで、対照緩衝液(1)、
ホスファターゼ(2)またはホスファターゼ+ホスファターゼインヒビター(3
)で処理する。単離された蛋白質を8%SDS−PAGEによって解像し、抗−
NF−κB1(N)抗血清でウエスタンブロットとする。矢印の頭はTPL−2
共発現によって引き起こされたmyc−p105の電気泳動移動度のシフトを示
す。
。 TNF−誘導性NFκB応答性プロモーター系の制御下でルシフェラーゼレポ
ーター遺伝子を発現するベクターで、図7Aの手法に従ってジャーカットT細胞
を形質転換する。TPL−2 KD(キナーゼデッド)またはTPL−2 Ct
er(C−末端切形)の共発現はTNF−媒介活性化の減少に至る。
きる化合物N−(6−フェノキシ−4−キノリル)−N−[4−(フェニルスル
ファニル)フェニル]アニンの化学構造を示す。
きる化合物5−オキソ−4−[4−(フェニルスルファニル)アニリノ]−5,
6,7,8−テトラヒドロ−3−キノリンカルボン酸エチルの化学構造を示す。
できる化合物3−(4−ピリジル)−4,5−ジヒドロ−2H−ベンゾ[g]イ
ンダゾール−2−イウムメタンスルフォネートの化学構造を示す。
とができる化合物2−クロロベンゾ[l][1,9]フェナントロリン−7−カ
ルボン酸ナトリウムの化学構造を示す。
ペプチド、すなわち、GST−IκB−αリン酸化のレベルを減少させるにおけ
るいくつかの異なる化合物の阻害活性を示すオートラジオグラフィーが示される
(レーン1、3−(4−ピリジル)−4,5−ジヒドロ−2−H−ベンゾ[g]
インダゾール;レーン2、5−オキソ−4−(4−(フェニルスルファニル)ア
ニリノ]−5,6,7,8−テトラヒドロ3−キノリンカルボン酸エチル;レー
ン3、N−(6−フェノキシ−4−キノリル)−N−[4−(フェニルスルファ
ニル)フェニル]アミン;レーン4、スタウロスポリン;レーン5、SD 20
3580;レーン4、PD 098059;レーン7、FLAG−COT(30
−397)およびビヒクルのみ(DMSO);およびレーン8、FLAG−CO
T(30−397)、GST−IκB−αおよびビヒクルのみ(DMSO);さ
らなる詳細については明細書を参照)。
との関連で単離されたMAPキナーゼキナーゼキナーゼである。遺伝子(tpl
−2)は種々の系において腫瘍進行および腫瘍形成と関連し、C−末端切形によ
って腫瘍中で活性化されるように見えるポリペプチドをコードする(Makri
s et al.,(1993)J Virol 67:1286−1291;
Patrotis et al.,(1993)PNAS(USA)90:2
251−2255;Makris et al.,(1993)J Virol
67:4283−4289; Patrotis et al.,(1994
)PNAS(USA)91:97559759; Salmeron et a
l.,(1996)EMBO J 15:817−826; Ceci et
al.,(1997)Genes Dev 11:688−700)。ラットT
PL−2の完全なアミノ酸配列は受託番号M94454下でGene Bank
で利用可能である。癌Osaka 甲状腺COTと呼ばれるヒトTPL−2ホモ
ログの核酸およびアミノ酸配列は受託番号NM 005204および72988
4下でGene Bankで利用可能である(例えば、 Miyoshi, e
t al., Mol.Cell. Biol. 11(8), 4088−4
096(1991も参照))。
使用に関する。 1a. TPL−2分子の使用 本発明は、例えば、イン・ビトロおよび/またはイン・ビボアッセイにおいて
NFκB活性を変調するための、特にかかるアッセイ系においてp105をリン
酸化するためのTPL−2分子の使用;イン・ビボにて細胞中でNFκB活性を
変調するための、例えば、免疫反応または炎症応答を誘導または防止するための
TPL−2分子の使用を含む。有利な具体例において、本発明は、脱調節された
NFκB発現と関連する病気の治療におけるTPL−2分子の使用に関する。
て、あるいは例えばイン・ビトロまたは細胞培養のごとく細胞中で行われるアッ
セイ方法において、NFκB制御エレメントの下で遺伝子の転写を変調するのに
有用である。
リン酸化および蛋白質分解を誘導または防止すように設計することができる。こ
のように、例えば、野生型TPL−2の生物学的活性を有し、p105に結合し
、それをリン酸化できるTPL−2分子を用いてp105分解および/または炎
症応答を誘導することができる。さらに、TPL−2の構成的に活性な突然変異
体を用いることができ、このように、さらなる細胞制御経路からその活性を分離
させる。
然変異体を用いて、p105についての内因性野生型TPL−2と競合させるが
標的のリン酸化は調節しないことによって、p105リン酸化を下降調節するこ
とができる。キナーゼデッド突然変異体は、好ましくは、例えば位置270にお
いてキナーゼドメイン中でTPL−2を突然変異体させることによって調製され
る。突然変異は、ランダムに行うことができ、人工基質をリン酸化する能力の評
価によって選択することができるが、あるいはキナーゼ活性を防止または低下さ
せるための活性部位および部位特異的突然変異誘発のモデリングによって設計す
ることができる。好ましいデッド突然変異体はTPL−2(A270)およびT
PL−2(167)。これらの既知の突然変異体は共にTPL−2の構造におけ
る配列相同性から予測された。
生物学的活性を有するポリペプチドをいう。このように、前記用語はTPL−2
の少なくとも1つの構造決定基を保持するTPL−2の断片を含む。
載された構造を有する。このポリペプチド、ラットTPL−2はやはり受託番号
M94454下で記載される核酸配列によってコードされる。94454のポリ
ペプチドをコードする別の配列は、遺伝子暗号の縮重に関連して、当業者によっ
て設計され得る。さらに、本発明はM94454に記載された核酸配列に対して
実質的相同性を有する配列によってコードされるTPL−2ポリペプチドを含む
。相同性が配列同一性を有する場合、「実質的相同性」は、直接的な配列併置お
よび比較によって判断して、40%を超える配列同一性、好ましくは45%を超
える配列同一性、好ましくは55%を超える配列同一性、好ましくは65%を超
える配列同一性、最も好ましくは75%以上の配列同一性を意味する。
号NM005204)をいう。COTはTPL−2と90%同一である。
の適当な相同性アルゴリズムを使用して決定することができる。有利には、BL
ASTアルゴリズムを、欠陥値に設定されたパラメータと共に使用する。BLA
STアルゴリズムは、出典明示して本明細書の一部とみなすhttp://ww
w.nchi.nih.gov/BLAST/blast help.html
に詳細に記載されている。検索パラメータは以下のごとく定義され、有利には、
定義された欠陥パラメータに対して設定される。
とも約7、好ましくは少なくとも約9、最も好ましくは10以上の期待値でマッ
チする配列と同等である。BLAST検索における期待についての欠陥閾値は通
常10である。
blastn.blastx.tblastnおよびtblastxによっ
て使用される試行錯誤検索アルゴリズムであり;これらのプログラムは、少数の
増強と共にKarlinおよびAltscheul(http://www.n
chi.nih.gov/BLAST/blast help.html)参照
の統計学的方法を用いてそれらの知見に対する優位性を規定する。BLASTプ
ログラムは、例えば、クエリー配列に対する相同性を同定するために、配列同様
性検索のために作成された。前記プログラムは、一般にはモチーフ−スタイルの
検索では有用ではない。配列データベースの同様性検索における基本的論点の議
論については、Altscheul等(1994)Nature Geneti
cs 6:119−129参照。
のBLASTプログラムは以下のタスクを実行する: blastpはアミノ酸クエリ配列を蛋白質配列データベースに対して比較す
る; blastnはヌクレオチドクエリ配列をヌクレオチド配列データベースに対
して比較する; blastxはヌクレオチドクエリ配列(両ストランド)の6フレーム概念翻
訳産物を蛋白質配列データベースに対して比較する; tblastnは蛋白質クエリ配列をすべての6つのリーディングフレーム(
両ストランド)において動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対し
て比較する; tblastxはヌクレオチドクエリ配列をヌクレオチドデータベースの6フレ
ーム翻訳に対して比較する。
yes(BLASTマニュアルにおけるパラメータH参照)。
定の数に制限する;欠陥制限は100記載である(マニュアルのページ中のパラ
メータV参照)。また、EXPECTおよびCUTOFF参照)。
グメント対(ASP)が報告されている特定の数に制限する;欠陥制限は50で
ある。もしこれよりも多いデータベース配列が、報告する統計学的優位性閾値を
偶然に満足するならば(後記EXPECTおよびCUTOFF参照)、最大統計
学的優位性に帰するマッチのみが報告される(BLASTマニュアル中のパラメ
ータB参照)。
ッチする;KarlinおよびAltscheul(1990)の推計モデルに
従って、10のマッチが単に偶然に見出されることが期待されるように欠陥値は
10である。もしマッチに帰せられる統計学的優位性がEXPECT閾値より大
であるならば、前記マッチは報告されないであろう。より低いEXPECT閾値
はより厳格であり、報告されるより少ないチャンスのマッチに導く。分率値は許
容される(BLASTマニュアル中のパラメータE参照)。
。欠陥値はEXPECT値から計算される(前記参照)。もし、それらに帰せら
れる統計学的優位性が、少なくとも、CUTOFF値と同等のスコアを有する孤
立HSPに帰せられるであろう程高い場合のみ、データベース配列についてHS
Pが報告される。より高いCUTOFF値はより厳格であり、報告されるより少
ないチャンスのマッチに導く(BLASTマニュアル中のパラメータS参照)。
典型的には、優位性閾値は、EXPECTを用いてより直感的に管理することが
できる。
STXについての交互スコアリングマトリックスを特定する。欠陥マトリックス
はBLOSUM62(Henikoff & Henikoff, 1992)
。有効な代替選択はPAM40、PAM120、PAM250およびIDENT
ITYを含む。BLASTNでは交互スコアリングマトリックスは利用できず;
BLASTN要求におけるMATRIX指令を特定するにはエラー応答を復帰さ
せる。
底部のストランドに制限するか;あるいはBLASTN、BLASTXまたはT
BLASTXで検索を、クエリー配列の頂部または底部ストランド上のちょうど
リーディングフレームに制限する。
uters and Chemistry 17:149−163のSEGプロ
グラムによって決定された低い構成複雑性を有するクエリー配列のセグメント、
またはClaverie & States(1993)Computers
& Chemistry 17:191−201のXNUプログラムによって、
またはブラスチンNについては、TatusovおよびLipman のDUS
Tプログラムによって(http:///www.nchi.nlm.nih.
gov参照)で決定された短い周期性の内部反復からなるセグメントをマスク解
除する。フィルタリングはBLAST出力から統計学的に有意であるが生物学的
には興味のない報告を排除でき、(例えば、共通の酸性−、塩基性−またはプロ
リン−リッチ領域に対するヒット)、データベース配列に対しての特異的マッチ
ングで利用できるクエリー配列のより生物学的に興味のある領域を残す。
列中の文字「N」(例えば、「NNNNNNNNNNNNN」)および蛋白質配
列における文字「X」(例えば、「XXXXXXXXX」)を用いて置換される
。
タベース配列には適用されない。欠陥フィルタリングはBLASTNについては
DUSTであり、他のプログラムについてはSEGである。
方によってマスクされるものが全く何もないということは異常なことではなく、
従って、フィルタリングは効果を常に生じると期待されるべきではない。さらに
、ある場合には、配列はそのすべてがマスクされ、未濾過クエリ配列に対して報
告されたいずれかのマッチの統計学的有意性は疑われることである。
gi アイデンティファイアーが出力中で示されるようにする。
nih.gov/BLASTに供された単純なBLAST検索アルゴリズムを用
いて行われる。
においてGene Bank M94454に記載された核酸配列にハイブリダ
イズできる核酸配列によってコードされたポリペプチドを含む。
である条件をいう。かかる条件は当業者に明白である。当業者に知られているご
とく、ハイブリッドの安定性は、配列相同性の1%減少ごとにほぼ1から1.5
℃減少するハイブリッドの融解温度(Tm)に反映されている。一般に、ハイブ
リッドの安定性はナトリウムイオン濃度および温度の関数である。典型的には、
ハイブリダイゼーション反応は高ストリンジェンシーの条件下、続いて種々のス
トリンジェンシーの洗浄下で行われる。
a+中で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーション
を可能とする条件をいう。高ストリンジェンシー条件は、例えば、6×SSC、
5×デンハルト、1%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、0.1 Na+ピロ
フォスフェイトおよび非特異的なコンペティターとしての0.1mg/ml変性
サケ精子DNAを含有する水性溶液中でのハイブリダイゼーションによって供す
ることができる。ハイブリダイゼーションに続き、いくつかの工程で高ストリン
ジェンシー洗浄を行うことができ、0.2から0.1×SSC、0.1% SD
S中でハイブリダイゼーション温度にて最後の洗浄を行う(約30分)。
したハイブリダイゼーションと同等の条件をいう。その場合、最後の洗浄は1×
SSC、0.1% SDS中でハイブリダイゼーション温度にて行う。
イゼーションと同等の条件をいう。その場合、最終洗浄は、2×SSC、0.1
% SDS中でハイブリダイゼーション温度にて行う。
れらの条件を適合させ複製することができるのが理解される。デンハルト溶液お
よびSSCは、他の適当なハイブリダイゼーション緩衝液と同様に当業者によく
知られている(例えば、Sambrook等編(1989)Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Colds
pring harbor Laboratory Press New Yo
rk または Ausubel等編(1990)Current Protoc
ols inn Molecular Biology, John Wile
y&Sons, innc.)。最適ハイブリダイゼーション条件は、プローブ
の長さおよびGC内容もまた役割を演じるので経験的に決定されなければならな
い。
k M94454またはNM005204に記載されている核酸配列の断片にハ
イブリダイズすることができる核酸を提供する(各々、配列番号:1および配列
番号:3参照)。好ましくは、断片は長さが15および50塩基の間である。有
利には、それは長さが約25塩基である。
られた方法に従って得ることができる。例えば、本発明のDNAは、ポリメラー
ゼ鎖反応(PCR)を用いる化学合成によって、またはゲノムライブラリもしく
はTPL−2を保有し、それを検出可能なレベルで発現すると考えられる源から
調製した適当なcDNAライブラリをスクリーニングすることによって得ること
ができる。
ル、ホスファイト、ホスホルアミダイトおよびH−ホスホネイト方法、PCRお
よび他の自動プライマー方法ならびに固体支持体上のオリゴヌクレオチド合成を
含む。これらの方法は、もし核酸の全核酸配列が知られていれば、あるいはコー
ディングストランドに相補的な核酸の配列が利用できれば使用することができる
。別法として、もし標的アミノ酸配列が知られていれば、各アミノ酸残基につい
ての既知かつ好ましいコーディング残基を用いて可能な核酸配列を推定すること
ができる。
rookら、1989のセクション14に記載されているPCR技術を用いるこ
とである。この方法は、TPL−2核酸にハイブリダイズするであろうオリゴヌ
クレオチドプローブの使用を要する。オリゴヌクレオチドの選択のための戦略は
後記する。
れたプローブまたは分析ツールでライブラリをスクリーニングする。cDNA発
現ライブラリでは、適当な手段はTPL−2を認識しそれに特異的に結合するモ
ノクローナルまたはポリクローナル抗体;同一または異なる種からの既知または
そうであると思われるTPL−2 cDNAをコードする長さが約20から80
塩基のオリゴヌクレオチド;および/または同一またはハイブリダイズする遺伝
子をコードする相補的または相同cDNAまたはその断片を含む。ゲノムDNA
ライブラリをスクリーニングするための適当なプローブは、限定されるものでは
ないが、同一またはハイブリダイズするDNAをコードするオリゴヌクレオチド
、cDNAまたはその断片;および/または相同ゲノムDNAまたはその断片を
含む。
ローブ、すなわち、Gene Bank 受託番号M94454またはNM00
5204(各々、配列番号:1、配列番号:3)に記載された配列から得ること
ができるオリゴヌクレオチドを含めた本明細書中に開示した核酸で適当なcDN
Aまたはゲノムライブラリをスクリーニングすることによって単離することがで
きる。適当なライブラリは商業的に利用可能であるか、あるいは細胞系、組織試
料等から調製することができる。
と同等またはそれより大きな数と同一である(またはそれと相補的である)約1
0および50の間、好ましくは15および30の間、最も好ましくは少なくとも
約20連続塩基を含むヌクレオチドの配列を有する一本鎖DNAまたはRNAで
ある。プローブとして選択された20核酸配列は、偽陽性結果が最小化されるよ
うに、十分な長さかつ十分に明確であるべきである。ヌクレオチド配列は、通常
、TPL−2の保存されたまたはコードに相同なヌクレオチド配列もしくは領域
に基づく。プローブとして使用される核酸は1以上の位置で縮重する。縮重オリ
ゴヌクレオチドの使用は、その種における優先的コドン用法が知られていない種
からライブラリがスクリーニングされる場合に特に重要であり得る。
ィング配列、リガンド結合部位をコードするのが予測される配列等を含む。例え
ば、本明細書中に開示された全長cDNAクローンまたはその断片いずれかをプ
ローブとして用いることができる。好ましくは、本発明の核酸プローブを、ハイ
ブリダイゼーションに際して容易な検出のための適当な標識手段で標識する。例
えば、適当な標識手段は放射性標識である。DNA断片を標識する好ましい方法
は、当業者によく知られているごとく、DNAポリメラーゼのクレノウ断片でα
−32P dATPをランダムプライミング反応で取り込むことによる。オリゴ
ヌクレオチドは、通常、α−32P−標識ATPおよびポリヌクレオチドキナー
ゼで末端標識する。しかしながら、他の方法(例えば、非放射性)を用いて断片
またはオリゴヌクレオチドを標識することもでき、例えば、酵素標識、適当なフ
ルオロフォアでの蛍光標識およびビオチン化を含む。
に基づく適当なオリゴヌクレオチドを含めたDNAの一部を持つライブラリでス
クリーニングした後、ハイブリダイゼーションシグナルを検出することによって
陽性クローンを同定し;同定されたクローンを制限酵素マッピングおよび/また
はDNA配列分析によって特徴づけ、次いで、例えば、本明細書中に記載する配
列との比較によって調べて、それらが完全なTPL−2をコードするDNAを含
むか否か(すなわち、それらが翻訳開始および終止コドンを含むかを)確認する
。選択されたクローンが不完全であれば、それらを用いて同一または異なるライ
ブラリを再スクリーニングして重複クローンを得る。ライブラリがゲノムのもの
である場合、重複クローンはエクソンおよびイントロンを含み得る。もしライブ
ラリがcDNAライブラリであれば、重複クローンはオープンリーディングフレ
ームを含むであろう。両方の場合において、完全なクローンはDNAおよびここ
に提供する推定アミノ酸配列との比較によって同定することができる。
を保有することを意味する。構造的特徴は天然に生じるTPL−2ポリペプチド
の少なくとも1つの生物学的活性を複製することができる構造モチーフの保有を
含む。このように、本発明によって提供されるTPL−2は一次転写体、アミノ
酸突然変異体、グリコシル化変種およびTPL−2の少なくとも1つの生理学的
および/または物理的特性を保有するTPL−2の他の共有結合誘導体の別のス
プライシングによって生じたmRNAによってコードされるスプライス変種を含
む。誘導体の例は、本発明の蛋白質が天然に生じるアミノ酸以外の部位での置換
、化学的、酵素的または他の適当な手段によって共有結合修飾される分子を含む
。かかる部位は、酵素またはアイソトープ電池のような検出可能な部位であって
よい。さらに、特定の種、好ましくは哺乳動物で見出されるTPL−2の天然に
生じる変種がさらに含まれる。かかる変種は、同一遺伝子ファミリーの関連遺伝
子によって、特定の遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードできるか、あるい
はTPL−2の別のスプライシング変種を表すことができる。
。このように、本発明によるTPL−2分子は、好ましくは、天然に生じるTP
L−2のC−末端部分を保有する。好ましくは、本発明によるTPL−2分子は
天然に生じるTPL−2、例えば、M94454に表されるTPL−2の少なく
ともアミノ酸398−468を保有する。
8;好ましくは、TPL−2のアミノ酸300−468;好ましくは、TPL−
2のアミノ酸250468;好ましくは、TPL−2のアミノ酸200−468
;最も好ましくは、TPL−2のアミノ酸308−468を含む。
2の7つのエクソンのうち少なくとも1つを含む。好ましくは、従って、TPL
−2分子はアミノ酸425から468(エクソン7)を含み;有利には、それは
アミノ酸323−424(エクソン6)を含み;好ましくは、それはアミノ酸2
56−342(エクソン5)を含み;好ましくは、それはアミノ酸169から2
55(エクソン4)を含み;好ましくは、それはアミノ酸113から168(エ
クソン3)を含み;好ましくは、それはアミノ酸1から112(エクソン2)を
含み;あるいは前記のいずれかの組合せを含む。
であり得る。TPL−2の断片はその個々のドメイン、ならびにドメインに由来
するより小さなポリペプチドを含む。好ましくは、本発明によるTPL−2に由
来するより小さなポリペプチドは、TPL−2に特徴的な単一の基本的ドメイン
を規定する。断片は、それがTPL−2の1つの特徴を保有する限り、理論的に
はほとんどいずれのサイズであってもよい。好ましくは、断片は長さが4および
300アミノ酸の間である。より長い断片は全長TPL−2の切形と見なされ、
一般に、用語「TPL−2」に含まれる。
る要件を条件として、アミノ酸欠失、付加または置換を含有し得るその突然変異
体を含む。このように、保存的アミノ酸置換は、N末端からの切形がそうであり
得るごとく、TPL−2の性質を実質的に改変することなく行うことができる。
さらに、欠失および置換は本発明に含まれるTPL−2の断片に対してなすこと
ができる。TPL−2突然変異体は、例えば、1以上のアミノ酸の付加、交換お
よび/または欠失の結果となるイン・ビトロ突然変異誘発に付されたTPL−2
をコードするDNAから生産することができる。例えば、TPL−2の置換、欠
失または挿入変種は組換え方法によって調製することができ、TPL−2の天然
形態との免疫−交差反応性につきスクリーニングすることができる。
との実質的相同性を保有する。本明細書で用いるごとく、「相同性」とは、2つ
の存在が、当業者がそれらが期限および機能において同様であると判断するため
の十分な特徴を有することを意味する。好ましくは、相同性は配列同一性をいう
のに用いられ、前記したごとく決定される。
呼ばれるヒトTPL−2ホモログの種々のアミノ酸領域を含み、特に、例えば、
アミノ酸残基30から397を表すヒトTPL−2ポリペプチド(すなわち、C
OT(30−397))、アミノ酸残基30から467を表すヒトTPL−2ポ
リペプチド(すなわち、COT(30−467))、アミノ酸残基1から397
を表すヒトTPL−2ポリペプチド(すなわち、COT(1−397))および
アミノ酸残基1から467を表すヒトTPL−2ポリペプチド(すなわち、CO
T(1−467))を含む。TPL−2ポリペプチドのこれらの異なる形態は当
業者に既知の種々のイムノ−またはアフィニティタグに融合して、所与のポリペ
プチドの精製を助けることができる。タグは、限定されるものではないが、FL
AGタグ、GST(グルタチオン−S−トランスフェラーゼ)およびポリ−ヒス
チジン残基、例えば、His6を含む。加えて、本発明は、例えば、前記タグに
隣接して挿入して、蛋白質精製後のその除去を容易とすることができる望ましい
プロテアーゼ切断部位を有するように作成されたポリペプチドを含む。
たヒト293A細胞からの、または例えば本明細書中に記載するバクロウイルス
感染昆虫細胞からの免疫沈殿によって発現され、精製することができる。典型的
には、バクロウイルス感染昆虫細胞は、化学ライブラリの質量−スクリーニング
に適した大量の組換え発現蛋白質の精製を可能とする。TPL−2分子の調製の
ためのさらなる方法は後記する。
む。好ましくは、TPL−2分子は組換えDNA技術によって、TPL−2分子
をコードする核酸をさらなる操作のためにベクターに取り込むことができる手段
によって生産される。本明細書中で用いるごとく、ベクター(またはプラスミド
)とは、その発現または複製のために異種DNAを細胞に導入するのに使用され
る区別されるエレメントを言う。かかるビイクルの選択および使用は十分に当業
者の技量内のものである。多くのベクターが入手可能であり、適当なベクターの
選択はベクターの意図した使用、すなわち、それがDNA増幅またはDNA発現
に使用されるのか、ベクターに挿入すべきDNAのサイズ、およびベクターで形
質転換すべき宿主細胞に依存する。各ベクターは、その機能(DNAの増幅また
はDNAの発現)およびそれが適合する宿主細胞に応じて種々の成分を含有する
。ベクター成分は、一般に、限定されるものではないが、以下の:複製起点1以
上のマーカー遺伝子エンハンサーエレメント、プロモータ、転写終止配列および
シグナル配列のうちの1以上を含む。
でベクターを複製させることができる核酸配列を含有する。典型的には、クロー
ニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体DNAとは独立してベクターを
複製させることができるものであり、複製起点または自律複製配列を含む。かか
る配列は種々の細菌、酵母およびウイルスでよく知られている。プラスミドpB
R322からの複製起点はほとんどのグラム陰性菌に適しており、2pプラスミ
ド起点は酵母に適しており、種々のウイルス起点(例えば、SV40、ポリオー
マ、アデノウイルス)は哺乳動物細胞においてクローニングベクターで有用であ
る。一般に、複製起点成分は、これらがCOS細胞のごとき、高レベルのDNA
複製の能力がある哺乳動物細胞で用いられるのでなければ、哺乳動物発現ベクタ
ーで必要とされない。
くとも1つのクラスの生物中で複製することができるが、発現のためにもう1つ
のクラスの生物にトランスフェクトすることができる。例えば、ベクターをE.
Coliにクローン化し、次いで、同ベクターを酵母または哺乳動物細胞にトラ
ンスフェクトするが、それは宿主細胞染色体とは独立して複製できない。DNA
は宿主ゲノムへの挿入によって複製することができる。しかしながら、TPL−
2をコードするゲノムDNAの回復は、外因的に複製されたベクターのそれより
も複雑である。なぜならば、TPL−2 DNAを切り出すのに制限酵素消化が
必要だからである。DNAはPCRによって増幅することができ、いずれの複製
成分なくしても宿主細胞に直接トランスフェクトすることができる。
遺伝子を含有することができる。この遺伝子は選択培地中で増殖させた形質転換
宿主細胞の生存または増殖に必要な蛋白質をコードする。選択遺伝子を含有する
ベクターで形質転換してない宿主細胞が培地中で生存しないであろう。典型的選
択遺伝子は抗生物質および他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン
、メトトレキセートまたはテトラサイクリン、補体要求欠陥に対する抵抗性を付
与し、、あるいは複雑な培地から利用できない非常に重要な栄養素を供給する蛋
白質をコードする。
のため形質転換についての選択を容易とするいずれの遺伝子も使用することがで
きる。酵母についての適当なマーカーは、例えば、抗生物質G418、ヒグロマ
イシンまたはブレオマイシンに対する耐性を付与するものであるか、あるいは栄
養要求株酵母突然変異体におけるプロトトロピー、例えば、URA3、LEU2
、LYS2、TRP1またはHIS3遺伝子を提供する。
子マーカーおよびE.Coli複製起点が有利には含まれる。これらはpBR3
22、BluescriptCベクターまたはpUCプラスミド、例えば、pU
C18またはpUC19のごときE.Coliプラスミドから得ることができ、
これらはE.Coli複製起点およびアンピシリンのごとき抗生物質に対する耐
性を付与するE.Coli遺伝子マーカーを共に含有する。
HFR、メトトレキセート耐性)、チミジンキナーゼ、またはG418またはヒ
グロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子のごとき、TPL−2核酸を摂取す
る能力のある細胞の同定を可能とするものである。哺乳動物細胞形質転換体は、
摂取されて、マーカーを発現している形質転換体のみがユニークに生存するのに
適合する選択圧下に置く。DHFRまたはグルタミンシンターゼ(GS)マーカ
ーの場合、選択圧は、圧力が漸次増加する条件下で形質転換体を培養し、それに
より、選択遺伝子およびTPL−2をコードする連結されたDNA双方の(その
染色体組込部位における)増幅に導くことによって課すことができる。増幅は、
所望の蛋白質をコードすることができる密接に関連した遺伝子と共に、増殖に非
常に重要な蛋白質の生産がかなり必要である場合、遺伝子が組換え細胞の染色体
内でタンデムに繰り返すプロセスである。増大した量の所望の蛋白質は、通常、
このように増幅されたDNAから合成される。
L−2核酸に作動可能に連結されたプロモータを含有する。かかるプロモータは
誘導性または構成的であり得る。前記プロモータは、制限酵素消化により源DN
Aからプロモータを除去し、単離されたプロモータ配列をベクターに挿入するこ
とによって、TPL−2をコードするDNAに作動に可能に連結させる。天然T
PL−2プロモータ配列および多くの異種プロモータ双方を用いて、TPL−2
DNAの増幅および/または発現を指令することができる。用語「作動可能に
連結した」とは、記載された成分がその意図したように機能するようにさせる関
係である併置をいう。コーディング配列に「作動可能に連結した」制御配列は、
コーディング配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるように連結さ
れる。
よびラクトースプロモータ系アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン(tr
p)プロモータ系およびtacプロモータのごときハイブリッドプロモータを含
む。そのヌクレオチド配列は公表されており、それにより、当業者は、いずれか
の必要な制限部位を供するためのリンカーまたはアダプターを用い、それをTP
L−2をコードするDNAに作動可能に連結させることができる。細菌系で用い
るプロモータは、一般に、TPL−2をコードするDNAに作動可能に連結した
シャインダルガノ配列を含有する。
7のごときバクテリオファージのプロモータを含む細菌発現ベクターである。最
も広く使用される発現系の1つにおいて、融合蛋白質をコードする核酸を、T7
RNAプロメラーゼによってベクターから転写することができる(Studi
er等, Methods inn Enzyme. 185;60−89, 1
990)。pETベクターと組み合わせて用いられるE.Coli BL21(
DE3)宿主株において、T7 RNAプリメラーゼは宿主細菌においてリソー
ゲンDE3から生産され、その発現はIPTG誘導性lac UV5プロモータ
の制御下にある。この系は多くの蛋白質の過剰生産で成功して使用されてきた。
別法として、商業的に入手可能な(Novagen, Madison,米国)
CE6ファージのごときint−ファージでの感染によってラムダファージに導
入することができる。他のベクターはPLEX(Invitrogen, NL
)のごときラムダPLプロモータを含有するベクター、pTrcHisXpre
ssTm(Invitrogen)またはpTrc99(Pharmacia
Biotech, SE)のごときtrcプロモータを含有するベクター、また
はpKK223−3(Pharmacia Biotech)またはPMAL(
New England Biolabs, MA,米国)のごときtacプロ
モーターを含有するベクターを含む。
りもむしろ可溶性天然ペプチドとしてそれが生産されるように細菌宿主からポリ
ペプチドの分泌を容易とするための分泌配列を含む。前記ペプチドは、適当には
、細菌ペリプラズム空間または培地から回収することができる。
成的であり、好ましくは、高度に発現された酵母遺伝子、特にSaccharo
mycs cerevisiae遺伝子に由来する。このように、TRP1遺伝
子のプロモーター、ADHIまたADHII遺伝子、酸性ホスファターゼ(PH
05遺伝子、a−またはa−因子をコードする酵母接合フェロモン遺伝子のプロ
モーターまたはエノラーゼ、グリセロアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ
(GAP)、3−ホスフォグレセレートキナーゼ(PGK)、ヘキソキナーゼ、
ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスフォフルクトキナーゼ、グルコース−6−
リン酸イソメラーゼ、3−ホスフォグリセートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、
トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスフォグルコースイソメラーゼまたはグルコ
キナーゼ遺伝子、S. cerevisiae GAL 4遺伝子、S. po
mbe nmt1遺伝子のプロモーターのごとき解糖酵素をコードする遺伝子に
由来するプロモーターまたはTATA結合蛋白質(TBP)遺伝子に由来するプ
ロモーターを用いることができる。さらに、1つの酵母遺伝子の上流活性化配列
(UAS)を含むハイブリッドプロモーターおよびもう1つの酵母遺伝子の機能
的TATAボックスを含む加硫プロモーターエレメント、例えば、酵母PH05
遺伝子のUAS(類)を含むハイブリッドプロモーターおよび酵母GAP遺伝子
の機能的TATAボックスを含めた加硫プロモーターエレメント(PH05−G
APハイブリッドプロモーター)を使用することができる。適当な構成的5プロ
モーターは、例えば、PHO5遺伝子のヌクレオチド−173で開始し、ヌクレ
オチド−9で終わるPHO5(−173)プロモーターエレメントのごとき上流
調節エレメント(UAS)に欠く短化酸性ホスファターゼPHO5プロモーター
である。
ウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫
ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、レトロウイルスおよびシニアンウ
イルス40(SV40)のごときウイルスのゲノムから、アクチンプロモータま
たは非常に強力なプロモーター、例えば、リボソーム蛋白質プロモーターのごと
き異種哺乳動物プロモーターから、およびTPL−2配列に通常関連したプロモ
ーターから由来したプロモーターによって制御することができ、但し、かかるプ
ロモーターは宿主細胞系に適合する。
列をベクターに挿入することによって増加させることができる。エンハンサーは
比較的向きおよび位置独立性である。多くのエンハンサー配列は哺乳動物遺伝子
(例えば、エラスターゼおよびグロビン)から知られている。しかしながら、典
型的には、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーが使用されるであろう。そ
の例は複製起点の後期側のSV40エンハンサー(BP100−270)および
CMV初期プロモーターエンハンサーを含む。エンハンサーは位置5’または3
’からTPL−2DNAにおいてベクターにスプライスすることができるが、好
ましくはプロモーターから5’側の部位に位置する。
(LCR)を含むことができる。LCRは宿主細胞クロマチンに取り込まれたト
ランスジーンの高レベル取り込み部位独立性発現を指令することができ、これは
特に、遺伝子治療適用のために設計したベクターにおいてまたはトランスジェニ
ック動物において、ベクターの染色体取り込みが起こった永久的にトランスフェ
クトされた真核生物細胞系の意味でTPL−2遺伝子が発現されるべき場合に重
要である。
めに必要な配列をも含有するであろう。かかる配列は真核生物またはウイルスD
NAまたはcDNAの5’および3’非翻訳領域から通常は利用可能である。こ
れらの領域はTPL−2をコードするmRNAの非翻訳部分におけるポリアデニ
ル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含む。
調節配列と作動可能に連結したTPL−2核酸を発現することができるいずれの
ベクターも含むことができる。このように、発現ベクターとは、適当な宿主細胞
への導入に際して、クローン化されたDNAの発現がもたらされるプラスミド、
ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターのごとき組換えDNAまたはRN
A構築体をいう。適当な発現ベクターは当業者によく知られており、真核生物お
よび/または原核生物細胞中で複製可能なもの、または宿主細胞ゲノムに組み込
まれるものを含む。例えば、TPL−2をコードするDNAは、哺乳動物細胞中
でのcDNAの発現に適したベクター、例えば、pEVRFのごときCMVエン
ハンサーベースのベクターに挿入することができる(Matthias等(19
89)NAR 17,6418)。
コードするDNAの一過性発現を供する発現ベクターである。一過性発現は、通
常、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積させ、今度は高レベルのTP
L−2を合成するように、宿主細胞中で効果的に複製できる発現ベクターの使用
を含む。本発明の目的では、一過性発現系は、例えば、TPL−2突然変異体を
同定するには、潜在的リン酸化部位を同定するのに、または蛋白質の機能的ドメ
インを特徴づけるのに有用である。
ミドまたはDNA断片を切断し、仕立て、必要なプラスミドを生じさせるのに望
まれる形態で再連結する。所望ならば、構築されたプラスミド中の正しい配列を
確認するための分析を既知の方法で行う。発現ベクターを構築し、イン・ビトロ
転写体を調製し、DNAを宿主細胞に導入し、およびTPL−2発現および機能
を評価するための分析を行うための適当な方法は当業者に知られている。遺伝子
の存在、増幅および/または発現は、例えば、通常のサザーンブロッティング、
mRNAの転写を開始させるためのノーザンブロッティング、ドットブロッティ
ング(DNAまたはRNA分析)またはイン・サイチュハイブリダイゼーション
によって、本明細書中で提供される配列に基づくことができる適当に標識された
プローブを用いて直接的に試料中で測定することができる。当業者にあれば、所
望ならば、これらの方法をいかにして修飾することができるかを容易に考えつく
であろう。
た宿主細胞を含む。本明細書中で用いるごとく、異種TPL−2分子は内因性T
PL−2の突然変異した形態、または外因性TPL−2の突然変異したまたは野
生型形態であり得る。
法で使用するのに適した昆虫細胞は、原理的には、発現ベクターで形質転換でき
、それによりコードされた異種蛋白質を発現できるいずれの鱗翅類細胞を含む。
特に、Spodoptera frugiperda細胞系IPBL−SF−2
1 AEのごときSf細胞系の使用(Vaughn等、(1977)Invit
ro, 13, 213−217)が好ましい。誘導細胞系Sf9が特に好まし
い。しかしながら、Tricoplusia ni368(Kurastack
およびMarmorosch,(1976)Invertebrate Tis
sue Culture Applications inn Medison
, Biology and Agriculture. Academic
Press, New York,米国)のごとき他の細胞系を使用することが
できる。これらの細胞系、ならびに本発明で使用するのに適した他の昆虫細胞系
は(例えば、Strategene, La Jolla, CA,米国)から
商業的に入手可能である。
−2の発現を含む。バクロウイルスのごときウイルスベクターの使用は全昆虫の
感染を可能とし、これは、いくつかの方法では、培養した細胞よりも増殖が容易
である。というのは、それらは特別の増殖条件に対して有する要件が少ないから
である。シルクモス(silk moth)のごとき大きな昆虫は高収率の異種
蛋白質を供する。前記蛋白質は通常の抽出技術に従って昆虫から抽出することが
できる。
質を発現することができるすべてのベクターを含む。一般に、哺乳動物および他
の真核生物細胞で有用なベクターは昆虫細胞培養に適用することができる。特に
昆虫培養細胞を意図したバクロウイルスベクターが特に好ましく、(例えば、I
nvitrogenおよびClontechから)商業的に広く得ることができ
る。シンドビスウイルス(Hahn等(1992)PNAS(米国)89, 2
679−2683)のごとき昆虫細胞を感染させることができる他のウイルスベ
クターが知られている。(Millar(1988)Ann. Rev. Mi
crobiol.42, 177−199によってレビュされている)選択され
たバクロウイルスベクターはAutographa californica多
重核多角体ウイルスAcMNPVである。
cMNPVのポリヘドリン遺伝子を少なくとも一部分置き換える。異種遺伝子を
挿入するには、導入ベクターが有利に用いられる。導入ベクターはE.Coli
宿主で調製され、次いで、相同組換えのプロセスによってDNAインサートがA
cMNPBに導入される。
、p105蛋白質分解およびRelサブユニット放出を介してNFκBの活性を
変調することができる医薬のためのリード化合物を同定する。従って、本発明は
アッセイに関し、 (a)評価すべき化合物または複数化合物と共にTPL−2分子をインキュベ
ートする工程と;次いで、 (b)1 PL−2分子の活性に影響する化合物を同定する工程を含む、直接
的または間接的にp105の活性を変調することができる化合物または複数化合
物を同定する方法を提供する。
直接結合するポリペプチドを検出するように構成される。 従って、本発明は、 (a)評価すべき化合物または複合化合物と共にTPL−2分子をインキュベ
ートする工程と;次いで、 (b)TPL−2分子に結合する化合物を同定する工程を含むNFκB活性の
モジュレータを同定する方法を提供する。 好ましくは、前記方法は、 (c)細胞ベースのアッセイにおいて、NFκB活性化を変調する能力につき
TPL−2に結合する化合物を評価する工程をさらに含む。 TPL−2への結合は当業者に知られたいずれかの技術によって評価すること
ができる。
セイ系、例えば、カラムに固定化されたポリペプチドへの結合を含むアフィニテ
ィクロマトグラフィアッセイ、化合物およびTPL−2の結合対における一方ま
たは双方のパートナーの蛍光の変化に関連する蛍光アッセイを含む。好ましいの
は2−ハイブリッドアッセイのごときイン・ビボで細胞中で行われるアッセイで
ある。
複数化合物の存在なくしては、TPL−2が参照親和性でもってp105と会合
する条件下で、テストすべき化合物または複数化合物をTPL−2分子およびp
105と共にインキュベートすることと; テストすべき化合物または複数化合物の存在下でp105に対するTPL−2
の結合親和性を測定することと;次いで 参照結合親和性に関してp105に対するTPL−2の結合親和性を変調する
化合物を選択することを含む炎症応答に関するまたはそれを用いる病気の治療で
有用な医薬のためのリード化合物を同定する方法を提供する。
合物類の不存在下において、あるいはそのTPL−2への結合での活性が知られ
ているかまたはそうでなければ参照値として望ましい参照化合物の存在下でキャ
リブレートする。例えば、2−ハイブリッド系においては、参照値はいずれかの
化合物の存在下で得ることができる。p105に対するTPL−2の結合活性を
増加させる化合物または複数化合物の添加は参照レベルを超えてアッセイからの
読みを増加させ、他方、この親和性を低下させる化合物または複数化合物の添加
の結果、参照レベル未満のアッセイ読みの減少がもたらされる。
間の機能的相互作用を検出するように構成することができる。テストすべき化合
物または複数化合物に応答して、またはp105に対するTPL−2の生物学的
効果の変調のレベルでこのキナーゼがそれ自体活性化されまたは不活性化される
ように、かかる相互作用はTPL−2の調節のレベルで起こるであろう。本明細
書で用いる「活性化」および「不活性化」は化合物の酵素的または他の活性の変
調、ならびに、例えば、細胞中でのポリペプチドの発現の活性化または抑制によ
るその生産速度の変調を含む。前記用語は遺伝子産物の発現を変調する遺伝子転
写に対する直接的作用を含む。
好ましくは細胞−ベースのアッセイである。例えば、それらはp105のリン酸
化の程度の評価に基づくことができ、これはTPL−2−p105相互作用に由
来するNFκB活性化の程度の指標である。
され、適当な宿主細胞に導入されて、TPL−2分子を発現する形質転換細胞系
を得る。従って、得られた細胞系は、TPL−2活性に影響する潜在的化合物の
再現性ある定性的および/または定量的分析のために生産される。このように、
TPL−2発現細胞は化合物、特に、TPL−2の機能を変調する低分子量化合
物の同定で使用することができる。このように、TPL−2を発現する宿主細胞
は薬物スクリーニングで有用であって、TPL−2の活性を変調する化合物を同
定する方法を提供するのは本発明のさらなる目的であり、前記方法はTPL−2
をコードする異種DNAを含有する細胞を、前記TPL−2の活性を変調するそ
の能力が測定されることを求められる少なくとも1つの化合物または化合物の混
合物またはシグナルに暴露し(ここに、前記細胞は機能的TPL−2を生産する
)、しかるのち、前記変調によって引き起こされた変化につき前記細胞をモニタ
リングすることを含む。かかるアッセイはTPL−2のアゴニスト、アンタゴニ
ストおよびアロステリックモジュレータのごときモジュレータの同定を可能とす
る。本明細書で用いるごとく、TPL−2の活性を変調する化合物またはシグナ
ルとは、(当該化合物またはシグナルの不存在と比較して、化合物またはシグナ
ルの存在下でp105活性化におけるTPL−2の活性が異なるように、TPL
−2の活性を改変する化合物をいう。
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)またはルシフェラーゼのごと
き、レポーター蛋白質、すなわち容易にアッセイできる蛋白質の発現がTPL−
2によるp105の活性化に依存する細胞系を構築することによって設計するこ
とができる。例えば、前記ポリペプチドの1つをコードするレポーター遺伝子を
、特異的に活性化されたp50であるNFκB−応答エレメントの制御下に置く
ことができる。前記エレメントがp50ヘテロダイマーによって活性化される場
合、予測可能なレベルでの別のRelモノマーの発現のために準備しなければな
らない。かかるアッセイは、TPL−2によるp105のリン酸化に拮抗する化
合物、またはTPL−2の活性に必要な他の細胞機能を阻害または増強する化合
物のごとき、TPL−2機能を直接的に変調する化合物の検出を可能とする。
イを含む。未調節p50の構成的発現の結果、動物において炎症表現型がもたら
されることは既知である。サイトカイン放出または細胞増殖に依存するもののご
とき細胞ベースのシステムを用いてp50の活性を評価することができる。
ン酸化効率でもってp105のリン酸化を直接的または間接的に引き起こす条件
下で、TPL−2分子およびp105と共にテストすべき化合物または複数化合
物をインキュベートすることと; テストすべき化合物または複数化合物の存在下でp105のリン酸化を直接的
または間接的に引き起こすTPL−2の能力を測定することと;次いで、 参照リン酸化効率に関してp105をリン酸化するTPL−2の能力を変調す
る化合物を選択することを含む炎症応答に関係するまたはそれを用いる病気の治
療で有用な医薬のためのリード化合物を同定する方法が提供される。
合、さらなるキナーゼまたは複数キナーゼを含めることができ、このように、本
発明のこの具体例によるアッセイは、有利には、TPL−2による間接的標的ポ
リペプチドまたはp105のリン酸化を検出するように構成することができる。
が知られている基質と共にTPL−2分子をインキュベートする工程と;次いで
、 基質のリン酸化を変調できるテスト化合物または複数化合物を同定する工程を
含む医薬のためのリード化合物を同定する方法に関する。
26, 1996)。好ましくは、従って、MEKはTPL−2キナーゼ活性を
変調できる化合物をモニターするための基質として使用される。もう1つの具体
例において、テスト基質は、例えば、MEK−1、SEK−1、IκBα、Iκ
B−β、NFκB p105、NFκBおよびTPL−2;COTそれ自身のご
ときいずれの適当なTPL−2標的ポリペプチドであり得る。特に、本発明は、
例えば、便宜なモデル融合蛋白質として、これらの基質を作成するための組換え
融合蛋白質構築体を提供する。好ましい具体例において、モデル融合蛋白質は、
例えば、GST−IκBα(1−50)、すなわち、GSTに融合したIκB−
αのアミノ酸残基1から50、および(p105の残基498−969を含む)
GST−p105Ndel.498を含む。TPL−2/COTのための他のペ
プチド基質はこれらの蛋白質基質から誘導することができ、例えば、IκB−α
−由来ペプチドNH2−DDRHDSGLDSMKDKKK−COH(ここに、
太文字のセリン残基はIκB−αのセリン残基32に対応する)およびMEK−
由来ペプチドNH2−QLIDSMANSFVGTKKK−COH(ここに、太
文字のセリン残基はNEK−1のセリン残基217に対応する)を含む。本明細
書中で記載するこれらおよび他のTPL−2標的ポリペプチドは、当業者がキナ
ーゼモジュレータにつき直接的にスクリーニングするのを可能とする。好ましく
は、キナーゼモジュレータはキナーゼ(TPL−2)インヒビターである。
例えば前記具体例に記載されたTNF/p105由来シグナリング経路に対する
その効果を測定することができる。
いずれの活性もいうことができるが、特に、TPL−2のリン酸化活性をいう。
従って、本発明はTPL−2による標的化合物のリン酸化、および潜在的治療剤
によるこの活性の変調を検出するように構成することができる。
陰性突然変異体を含む。かかる化合物はTPL−2の標的につき競合することが
でき、このように、生物学的または人工的系においてTPL−2の活性を減少さ
せる。このように、本発明は、さらに、TPL−2のリン酸化活性を変調するこ
とができる化合物に関する。
方法によって同定可能な化合物または複数化合物に関する。従って、NFκBの
活性の変調のための、本明細書中に記載するアッセイによって同定可能な化合物
の使用が提供される。
に記載のものであってよく、低分子量化合物を含み、線上、環状、多環状または
その組合せ、抗体または蛋白質を含めたペプチド、ポリペプチドであってよい有
機化合物を含む。一般に、本明細書中で用いる「ペプチド」、「ポリペプチド」
および「蛋白質」は同等と考えられる。
体断片をいい、Fv、ScFv、Fab’およびF(ab’2)、モノクローナ
ルおよびポリクローナル抗体、キメラ、CDR−グラフト化およびヒト化抗体を
含む作成された抗体、およびファージ提示または別の技術を用いて生産された人
工的に選択された抗体を含む。FvおよびScFvのごとき小さな断片は、その
小さなサイズおよび結果としての優れた組織分布のため診断および治療適用のた
めの有利な特性を保有する。
シンまたは標識のごときエフェクター蛋白質を含む改変された抗体であり得る。
特に好ましいものはイン・ビボで抗体の分布のイメージングを可能とする標識で
ある。かかる標識は、患者の身体内で容易に可視化できる金属粒子のごとき放射
性標識または放射性不透過性標識であり得る。さらに、それは蛍光標識または患
者から取り出された組織試料上で可視化可能な他の標識であり得る。
、キメラ抗体を構築して診断または治療適用においてその免疫原性を減少させる
ことができる。さらに、免疫原性はCDRグラフティング[欧州特許出願0 2
39 400(Winter)参照]および、所望により、フレームワーク修飾
(国際出願WO90/07861(Protein Design Labs)
参照]によって抗体をヒト化することによって最小化することができる。
体またはその断片のまわりには、細胞培養から生成させることができる。組換え
DNA技術を用いて、細菌または好ましくは哺乳動物細胞培養において確立され
た手法に従って抗体を産生させることができる。選択された細胞培養系、好まし
くは、抗体産物を分泌する。
ングフレームにて連結したシグナルペプチドをコードする第1のDNA配列に作
動可能に連結したプロモータを含む発現カセットを含むハイブリッドベクターで
形質転換された宿主、例えば、E.Coliまたは哺乳動物細胞を培養し、次い
で前記蛋白質を単離することを含む本発明の抗体の製法を提供する。
的標準培養培地である適当な培養培地、例えば、所望により哺乳動物血清、例え
ば、胎児ウシ血清、または微量元素および成長維持補足物、例えば、通常のマウ
ス腹腔滲出物細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ、2−アミノエタノール、イ
ンスリン、トランスフェリン、低密度リポ蛋白質、オレイン酸等のごときフィー
ダー細胞によって補足されたダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)またはR
PMI1640培地中で行われる。細菌細胞または酵母細胞である宿主細胞の増
殖は、同様に、当業者に既知の適当な培地中、例えば、細菌では培地LB、NZ
CYM、NZTM、NZM、テリフィックブロス、SOB、SOC、2×YT、
またはMQ最小培地中で、および酵母では培地YPD、YEPD、最小培地、ま
たは完全な最小ドロップアウト培地中で行われる。
るためのスケールアップを可能とする。細菌細胞、酵母または哺乳動物細胞培養
のための技術は当業者に知られており、例えば、エアリフトリアクター中または
連続的スターラーリアクター中での均一懸濁培養、または例えば中空繊維、マイ
クロカプセル中、アガロースマイクロビーズ上またはセラミックカートリッジ上
での固定化または捕獲細胞培養を含む。
こともできる。この目的では、所望の抗体を生産するハイブリドーマ細胞を組織
適合哺乳動物に注射して抗体−生産腫瘍の増殖を引き起こす。所望により、動物
を注射に先立って炭化水素、特にプリスタン(テトラメチル−ペンタデカン)の
ごとき鉱物油で感作させる。1から3週間後、抗体をそれらの哺乳動物の体液か
ら単離する。例えば、適当な骨髄細胞とBalb/cマウスからの抗体生産脾臓
細胞との融合によって得られたハイブリドーマ細胞、または所望の抗体を生産す
るハイブリドーマ細胞系Sp2/0に由来するトランスフェクト細胞を、所望に
よりプリスタンで予備処理したBalb/cマウスに腹腔内注射し、1から2週
間後に、腹水を前記動物から採取する。
lerおよびMilstin,(1975)Nature 256:495−4
97;US4,376,110; HarlowおよびLane, Antib
odies:A Laboratory Manual,(1988)Cold
spring Harborで議論されている。組換え抗体分子の調製のための
技術は前記文献および、例えば、出典明示して本明細書の一部とみなすEP 0
623679;EP 0368684およびEP 0436597に記載されて
いる。
ンドウィッチアッセイもしくはドット−アッセイ、またはラジオイムノアッセイ
によって、TPL−2を発現する細胞の免疫蛍光染色により優先的に所望の抗体
につきスクリーニングする。
ルのごとき吸湿性物質に対する透析、選択膜を通す濾過によって、培養上清また
は腹水中の免疫グロブリンを濃縮することができる。必要および/または所望な
らば、慣用的クロマトグラフィー方法、例えば、ゲル濾過、イオン−交換クロマ
トグラフィー、DEAE−セルロース上のクロマトグラフィーおよび/または(
イムノ−)アフィニティクロマトグラフィー、例えば、TPL−2分子でのまた
はプロテイン−Aでのアフィニティクロマトグラフィーによって抗体が精製され
る。
胞に関する。本発明の好ましいハイブリドーマ細胞は遺伝的に安定であり、所望
の特異性の本発明のモノクローナル抗体を分泌し、解凍および再クローニングに
よって深−凍結培養から活性化することができる。
PL−2分子、精製されたTPL−2分子を含有する抗原性担体またはTPL−
2を担う細胞で免疫化し、免疫化哺乳動物の抗体生産細胞を適当な骨髄細胞系の
細胞と融合させ、融合で得られたハイブリッド細胞をクローン化し、所望の抗体
を分泌する細胞クローンを選択する、TPL−2分子に向けられたモノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系の製法に関する。例えば、TPL−2を
担う細胞で免疫化したBalb/cマウスの脾臓細胞を骨髄腫細胞系PAIまた
は骨髄腫細胞系Sp2/0−Ag14の細胞と融合させ、得られたハイブリッド
細胞を所望の抗体の分泌につきスクリーニングし、陽性ハイブリドーマ細胞をク
ローン化する。
L−2を発現するヒト腫瘍起源の107および108の間の細胞を数回、例えば
、4から6回、数カ月にわたって、例えば、2カ月および4カ月の間、皮下およ
び/または腹腔内注射することによって免疫化し、免疫化マウス40からの脾臓
細胞を最後の注射から2から4日後に採取し、融合プロモーター、好ましくはポ
リエチレングリコールの存在下で骨髄腫細胞系PAIの細胞と融合させるハイブ
リドーマ細胞系の調製方法である。好ましくは、骨髄腫細胞を分子量約4000
の約30%から約50%ポリエチレングリコールを含有する溶液中、免疫化マウ
スからの3から20倍過剰の脾臓細胞と融合させる。融合の後、選択培地、例え
ば、HAT培地を補足した前記適当な培養培地中で細胞を正規の間隔で増殖させ
て、正常な骨髄腫細胞が所望のハイブリドーマ細胞を過剰増殖させるのを防止す
る。
ンおよび/または軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換えDNA
に関する。定義により、かかるDNAはコーディング一本鎖DNA、前記コーデ
ィングDNAおよびそれに対して相補的なDNAからなる二本鎖DNA、または
これらの相補的(一本鎖)DNAそれ自体を含む。
軽鎖可変ドメインをコードするDNAは、重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖
可変ドメイン、またはその突然変異体をコードする真性DNA配列を有する酵素
的または化学的に合成されたDNAであり得る。真性DNAの突然変異体は、1
以上のアミノ酸が欠失し、または1以上のアミノ酸と交換された前記抗体の重鎖
可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインをコードするDNAである。好ま
しくは、前記修飾は抗体の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインの
CDRの外部にある。かかる突然変異体DNAは、1以上のヌクレオチドが同一
アミノ酸をコードする新しいコドンを持つ他のヌクレオチドによって置き換えら
れたサイレント突然変異体であることが意図される。かかる突然変異体配列は縮
重した配列でもある。縮重配列は、ヌクレオチドの限定されない数が元来コード
されたアミノ酸配列の変化をもたらすことなく他のヌクレオチドによって置き換
えられたという遺伝子暗号の意味内で縮重している。かかる縮重配列は、重鎖ネ
ズミ可変ドメインおよび/または軽鎖ネズミ可変ドメインの最適発現を得るのに
特別の宿主、特にE.Coliによって好まれるその異なる制限部位および/ま
たは特定コドンの頻度のため有用であり得る。
ロ突然変異誘発によって得られたDNA突然変異体を含むことを意図する。
、重鎖および軽鎖可変ドメインをコードする組換えDNAインサートを、重鎖お
よび軽鎖定常ドメインをコードする対応するDNAと融合させ、次いで、例えば
ハイブリッドベクターへの取り込み後に適当な宿主細胞に導入する。
γ4、好ましくは、γ1またはγ4に融合したTPL−2に向けられた抗体の重
鎖ネズミ可変ドメインをコードするインサートを含む組換えDNAに関する。同
様に、本発明は、ヒト定常ドメインκまたはλ、好ましくはκに融合したTPL
−2に向けられた抗体の軽鎖ネズミ可変ドメインをコードするインサートを含む
組換えDNAに関する。
えDNAに関し、ここに、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、所望に
より、宿主細胞中で抗体のプロセッシングを容易とするシグナル配列および/ま
たは抗体の精製を容易とするペプチドをコードするDNAおよび/または切断部
位および/またはペプチドスペーサーおよび/またはエフェクター分子を含むス
ペーサー基によって連結される。
ター分子をコードするDNAであることを意図する。このように、トキシンまた
は酵素、特にプロドラッグの活性化を触媒することができる酵素であるエフェク
ター分子が特に示される。かかるエフェクター分子をコードするDNAは天然に
生じる酵素またはトキシンをコードするDNA、またはその突然変異体の配列を
有し、当業者によく知られた方法によって調製することができる。
発明は、本発明の抗体を含む治療または診断用の組成物を提供する。
段であり得る、抗体を検出する手段と共に供される。抗体および検出手段は、診
断を意図した診断キットにおいて、同時に、同時別々にまたは順次に使用するた
めに提供することができる。
するTPL−2、p105またはもう1つのポリペプチドに由来する。好ましく
は、前記ペプチドはp105/TPL−2相互作用を担うTPL−2またはp1
05におけるドメインに由来する。例えばThornberry,(1994)
Biochemistry 33:39343940およびMilligan等
,(1995)Neuron 15:385−393はICEプロテアーゼを阻
害するための修飾されたテトラペプチドの使用を記載する。同様に、TPL−2
、p105または相互作用蛋白質に由来するペプチドは、例えば、アルデヒド基
、クロロメチルケトン、(アシルオキシ)メチルケトンまたはCH2OC(0)
−DCB基で修飾してTPL−2 p105相互作用を阻害することができる。
膜を横切るその能力を改良することができる。例えば、米国特許第5,149,
782号は細胞膜を横切っての蛋白質輸送を増大させるための融合誘導ペプチド
、イオンチャネル形成ペプチド、膜ペプチド、長鎖脂肪酸および他の膜ブレンデ
ィング剤の使用を開示する。これらおよび他の方法は、出典明示して本明細書の
一部とみなすWO97/37016および米国特許第5,108,921号に記
載されている。
なリード化合物は特に抗体および抗原、特に遺伝子治療において細胞内で発現さ
れた細胞内抗体であり、これはペプチドまたは低分子量治療剤の開発のためのモ
デルとして用いることができる。本発明の好ましい態様において、リード化合物
およびTPL−2/p105または他の標的ペプチドを共結晶化して、リード化
合物で観察された相互作用を模倣する適当な低分子量化合物の設計を容易とする
ことができる。
体と「貯蔵器緩衝液」との溶液を、結晶形成に必要な低濃度の沈殿剤と混合する
ことによる結晶化緩衝液の調製を含む。結晶形成には、例えば、沈殿剤の添加に
よって、例えば、滴定によって、あるいは結晶化緩衝液および貯蔵器緩衝液の間
の拡散により沈殿剤の濃度をバランスさせることによって沈殿剤の濃度を増加さ
せる。適当な条件下で、例えば、高濃度の沈殿剤を有する貯蔵器沈殿剤から低濃
度の沈殿剤を有する結晶化緩衝液への沈殿剤のグラジエントに沿って沈殿剤のか
かる拡散が起こる。拡散は、例えば、共通ガス相中での拡散を可能とする蒸気拡
散技術によって達成することができる。既知の技術は、例えば、「ハンギングド
ロップ」または「シッティングドロップ」方法のごとき蒸気拡散方法である。蒸
気拡散方法において、蛋白質を含有する結晶化緩衝液の液滴を貯蔵器緩衝液のか
なり大きなプールの上方に垂らすかまたはその横に位置させる。別法として、沈
殿剤のバランシングは、貯蔵器緩衝液から結晶化緩衝液を分離し、蛋白質の貯蔵
器緩衝液への拡散を防ぐ半透過性膜を通じて達成することができる。
、好ましくは、30mg/mlまでの、好ましくは約2mg/mlから約5mg
/mlの濃度を有する。
蛋白質濃度および温度によって実質的に決定される種々の条件下で達成すること
ができる。pHは約4.0から9.0の範囲であり得る。緩衝液の濃度およびタ
イプはむしろ重要ではなく、従って、例えば所望のpHとは独立して変更可能で
ある。適当な緩衝液系はホスフェート、アセテート、シトレート、トリス、ME
SおよびHPES緩衝液を含む。有用な塩および添加剤は、例えば、当業者に知
られた塩化物、スルフェートおよび他の塩を含む。緩衝液は、水混和性有機溶媒
、好ましくは100および2000の間、好ましくは4000および10000
の間の分子量を有するポリエチレングリコール、またはスルフェート、特に硫酸
アンモニウム、塩化物、シトレートまたはタルタレートのごとき適当な塩からな
る群から選択される沈殿剤を含有する。
ば、重原子誘導体化によって化学的に修飾することができる。略言すると、かか
る誘導体化は、結晶を通じて拡散でき、蛋白質の表面に結合することができる重
金属原子塩、または有機金属化合物、例えば、塩化鉛、チオリンゴ酸金、チメロ
サールまたは酢酸ウラニルを含有する溶液中に結晶を浸漬することによって達成
することができる。結合した重金属の位置は浸漬した結合のX線の回折分析によ
って測定することができ、その形成は、例えば、ペプチドの三次元モデルを構築
するのに用いることができる。
って供された構造データのすべてまたは一部から得ることができる。好ましくは
かかるモデルの形成は相同性モデリングおよび/または分子置き換えを含む。
ll 95:729−730を含めた)その構造が知られているいずれかのMA
PKKキナーゼまたはNFκBとの配列併置、二次構造予測および構造ライブラ
リのスクリーニングの組合せによって創製することができる。例えば、適当なソ
フトウェアプログラムを用いてTPL−2および候補ペプチドの配列を併置する
ことができる。
次構造を予測することができる。ペプチド配列をTPL−2構造に取り込むこと
ができる。構造的矛盾、例えば、挿入/欠失のまわりの構造フラグメントは、所
望の長さのペプチドのための適当な立体配座を持つ構造ライブラリをスクリーニ
ングすることによってモデリングすることができる。側鎖立体配座の予測では、
側鎖ドタマーライブラリを使用することができる。
き換えによってペプチドの結晶構造を解明する。相同性モデルは分子置き換えの
結果に従って位置させ、分子動力学計算からなるさらなる仕上げおよび電子密度
への結晶化で用いるインヒビターのモデリングに位置づけされる。
2活性、例えば、キナーゼ活性、標的ポリペプチド相互作用、またはシグナリン
グ活性を変調することができる非−ペプチドベースのテスト化合物も同定する。
本発明のテスト化合物は、:生物学的ライブラリ、空間的にアドレス可能な平行
固相または液相ライブラリ;脱回盤を要する合成ライブラリ方法;「1−ビーズ
1−化合物」ライブラリ方法;およびアフィニティクロマトグラフィ選択を用い
る合成ライブラリ方法を含めた当業者に既知のコンビナトリアルライブラリ方法
を含む多数アプローチのいずれかを用いて得ることができる。これらのアプロー
チはペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリに適用
できる(Lam, K. S.(1997)Anticancer Drug
Des. 12:145)。
93)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:
6909;Erb等、(1994)Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 91:11422; Zuckermann等、(1994)
J. Med. Chem. 37:2678; Cho等、(1993)Sc
ience 261:1303; Carrellら(1994)Angrew
. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Care
ll等、(1994)Angrew. Chem. Int.Ed.Engl.
33:2061;および inn Gallop等、(1994)J. Med
. Chem. 37:1233に見出すことができる。
techniques 13:412−421)、ビーズ(Lam(1991)
Nature 354:82−84)、チップ(Fodor(1993)Nat
ure 364:555−556)、細菌(Ladner USP 5,223
,409)、胞子(Ladner USP ’409)、プラスミド(Cull
ら(1992)Proc Natl Acad Sci USP 89:186
5−1869)、ファージ上(Scott and Smith(1990)S
cience 249:386−390);(Devlin(1990)Sci
ence 249:404−406);(Cwirlaら,(1990)Pro
c. Natl. Acad. Sci. 87:6378−6382);(F
elici(1991)J. Mol. Biol. 222:301−310
);(Ladner 前掲)に提示されている。
与の化学的構造、または所与の活性、例えば、キナーゼ阻害活性を有する化合物
を含む予備選択ライブラリに分割することができる化合物ライブラリの予備選択
は、さらに、いずれかの当業者に認められた分子モデリングを行って、所与の活
性、反応部位、または他の所望の化学的機能性を有するようである特定の化合物
または化合物の群もしくは組合せを同定することを含むことができる。1つの具
体例において、キナーゼ阻害活性を有する、または有するようである化合物を同
定するために設計した分子モデリングを用いてTPL−2のモジュレータを予備
選択する。
インまたは標的成分、例えば、p105と相互作用する特定の部位を選択するこ
とができる。例えば、特に三次元モデルを利用する肉眼観察を使用できる。好ま
しくは、コンピュータモデリングプログラムまたはソフトウェアを用いて、特定
のドメインと相互作用できる1以上の部位を選択する。適当なコンピュータモデ
リングプログラムはQuanta(Molecular Simulation
s, Inc., Burlington, MA(1992)), SYBY
L(Tripos Associates, Inc., St. Louis
, MO(1992)), AMBER(Weiner等, J. Am. C
hem. Soc. 106:765−784(1984))およびCHARM
M(Brooks等、 J. Comp. Chem. 4:187−217(
1983))を含む。相互作用部位を選択するのに使用することができる他のプ
ログラムはGRID(Oxford University, U. K.;
Goodford等、 J. Mod. Chem.28:849−857(1
985)); MCSS(Molecular Simulations, I
nc., Burlington, MA; Miranker, A.および
M. Karplus, Proteins:Structure, Func
tion and Genetics 11:29−34(1991)); A
UTODOCK(Scripps Research Institute,
La Jolla, CA; Goodsellら、 Proteins: S
tructure, Function and Genetics:195−
202(1990);およびDOCK(University of Cali
fornia, San Francisco, CA; Kuntz等、 J
. Mol. Biol. 161:269−288(1982)を含む。
作用に適した方法でそれらを提示することができる足場に付着させることができ
る。適当な足場およびその上の相互作用部位の空間的分布は、例えば、物理的ま
たはコンピューター創製三次元モデルを用い、またはCAVEATのごとき適当
なコンピュータープログラム(University of Californ
ia, Barkeley, CA; Bartlett、 inn ”Mol
ecular Recognition of inn Chemical a
nd Biological Problems”, Special Pub
., Royal Chemical Society 78:182−196
(1989));MACCS−3Dのごとき三次元データベースシステム(MD
L Information Systems, San Leandro,
CA(Martin, Y. C., J. Mod. Chem. 35:2
145−2154(1992));および HOOK(Molecular S
imulations, Inc.)を用いることによって目で測定することが
できる。潜在的TPL−2阻害剤の設計および/または評価で用いることができ
る他のコンピュータープログラムはLUDI(Biosym Technolo
gies, San Diego, CA; Bohm, H. J., J.
Comp. Aid. Molec. Design:61−78(1992
)), LEGEND(Molecular Simulations, In
c.; Nishibata等、 Tetrahedron 47:8985−
8990(1991)),およびLeapFrog(Tripos Assoc
iates, Inc.)を含む。
既知であって、この方法で用いることができる(Cohen等、 J. Med
. Chem. 33:883−894(1994); Navia等、 Cu
rrent Opinions in Structural Biology
2: 202−210(1992); Baldwin等、 J. Mod.
Chem. 32:2510−2513(1989); Appelt等;
J. Mod. Chem. 34:1925−1934(1991); Ea
lick等、 Proc. Nat. Acad. Sci. USP 88:
11540−11544(1991))。
有機物ベース、合成由来有機物ベース、または抗体ベース化合物のライブラリを
組み立て、所望ならば、前記したモデリング技術のいずれかを含むさらなる予備
選択工程に付すことができる。次いで、これらのモデリング技術を用いて、TP
L−2モジュレータであると決定された適当な候補化合物を、当業者に認められ
た源、例えば、商業的源から選択することができるか、あるいは別法として、分
子モデリングにより活性、例えば、TPL−2インヒビター活性を有すると予測
される所望の部位を含有させる当業者に認められた技術を用いて合成することが
できる。次いで、これらの化合物を用いて、例えば、本明細書中に記載したアッ
セイを用いるスクリーニング用の化合物のより小さいまたはより標的化されたテ
ストライブラリを形成することができる。
合物N−(6−フェノキシ−4−キノリル−N[4−(フェニルスルファニル)
フェニル]アミンを含むことができる。4−(4−フェニルチオアニリノ)キノ
リニル誘導体の一般的合成は以下のごとく行われる。1,2−ジメトキシエタン
およびジクロロエタンの1:1混合物(V/V)中の4−ヒドロキシ−5−オキ
ソ−5,6,7,8−テトラヒドロ−3−キノリンカルボン酸エチルの0.1M
溶液に四塩化炭素(10モル等量)およびポリマー−結合トリフェニルフォスフ
ィン(3から6等量;Fluka)を添加する。次いで、混合物を80℃の密封
バイアル中で震盪しつつ36時間加熱する。4−(フェニルチオ)アニリン(2
−6モル等量;tert−ブタノール中0.5M)を添加し、混合物を密封バイ
アル中で震盪しつつ24時間で90℃まで加熱する。次に、ポリマー樹脂を濾過
し、メタノールで洗浄する。プールした濾液および洗液を高真空下で濃縮し、残
渣をRP−HPLCによるクロマトグラフィーに付した。分析RP−HPLC/
MS(PERKIN Elmmer Pecosphereカラム(4.6mm
×3cm)で3.5mL/分にて(0−100%アセトニトリル/pH4.5、
50MM NH4OAc))によると、5−オキソ−4−[4−(フェニルスル
ファニル)アニリノ]−5,6,7,8−テトラヒドロ−3−キノリンカルボン
酸エチルは3.85分の保持時間およびm/z419におけるMH+を有してい
た。
ァニル)フェニル]アミン(分析RP−HPLC RT:4.32分;MS:M
H+421)を調製するには、4−ヒドロキシ−6−フェノキシ−キノリンおよ
び4−(フェニルチオ)アニリンを用いて前記手法を追跡する。
5,6,7,8−テトラヒドロ−3−キノリンカルボン酸エチルおよび/または
その変異体もまたライブラリのために選択することができ、標準的な技術および
以下の方法を用いてこの化合物を生産することができる。略言すれば、10等量
の四塩化炭素および3−6等量のポリマー結合トリフェニルホスフィンを、エチ
レングリコールジメチルエーテルおよびジクロロエタンの1:1混合物中の4−
ヒドロキシ−5−5,6,7,8−テトラヒドロ−3−キノリンカルボン酸エチ
ルの0.1M溶液に添加する。次いで、混合物を36時間で80℃まで加熱する
。250μlのtertブタノール中の過剰の4−チオフェニルアニリン(2−
6等量)を添加し、混合物を24時間で90℃まで加熱する。次いで、ポリマー
樹脂を、濾過し、メタノールで洗浄し、残存する溶媒を高真空下で除去して所望
のテスト化合物を得る。
ーゼ、例えば、COTのごときセリン/トレオニンキナーゼを阻害するのに適し
た化合物を含有する化学クラスを表すと予測される。従って、図14に示された
コア構造を含むいずれの化合物も本発明に含まれる。1つの具体例において、キ
ノリニル環系は、例えば、ジヒドロキノリニルまたはテトラヒドロキノリニル環
系であり得る(図14、例えば、点線参照)。加えて、RおよびR’基はヒドロ
キシ、ハロ、−NHC(O)アルキル−COOH、−C(O)O−アルキル、−
C(O)NH−アルキル、C1−C6アルケニル、C1−C6−アルキニル、C 1 −C6−アルキル、C1−C6−アルコキシ、アリールオキシ、置換アリール
オキシ、C1−C6−アルキルチオ、C1−C6−アルキルアミノ、シアノ、ペ
ルハロメチル、ペルハロメトキシ、アミノ、モノ−もしくはジアルキルアミノ、
アリール、置換アリール、ara−アルキルおよびara−アルコキシから独立
して選択される。加えて、R’は(R’)n(ここに、n=0,1,2等)を表
し、従って、例えば、複数のR’置換が許容されることが理解される。また、ア
ルキル、アルケニルおよび/またはアルキオニル基は直鎖または分岐鎖であり得
ることが理解される。さらに、いずれの塩も、または例えば適当には、図14に
示した上位概念構造を含むまたはそれに由来するアナログ、遊離塩基形態、互変
異性体、エナンチオマーラセメート、またはその組合せは本発明に含まれること
を意図する。
−4,5−ジヒドロ−2H−ベンゾ[g]インダゾールメタンスルホネートおよ
び/またはその変種であり、この化合物はAldrich Chemical
Co., Inc.(Registry No.80997−85−9)から商
業的に入手可能である。
−7−カルボン酸ナトリウムおよび/またはその変種を含むことができ、この化
合物は標準的な当業者に認められた技術を用い、図12に示す構造を用いて生産
することができる。
すことができ、これらの修飾された化合物は本発明に含まれることが認識されよ
う。
セイと呼ばれ、ここに、例えば、TPL−2ポリペプチドを発現する細胞、また
はTPL−2を含む細胞溶解物/または精製された蛋白質いずれかをテスト化合
物と接触させ、TPL−2活性、例えば、キナーゼ活性、標的ポリペプチド相互
作用、またはシグナリング活性を改変するテスト化合物の能力を測定する。
を使用することができる。TPL−2またはTPL−2標的ポリペプチドに結合
するテスト化合物の能力の測定は、例えば、テスト化合物のポリペプチドへの結
合が複合体中の標識化合物を検出することによって測定することができるように
、テスト化合物を放射性同位体または酵素標識とカップリングさせることによっ
て達成することができる。例えば、テスト化合物を125I、35S、14C、 33 P、32P、または3Hで直接的または間接的に標識することができ、放射
性同位体を放射の直接的カウンティングによって、またはシンチレーションカウ
ンティングによって検出することができる。別法として、テスト化合物を、例え
ば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、または
ルシフェラーゼで酵素的に標識することができ、酵素標識を適当に基質の生成物
への変換の測定によって直接的に検出することができる。
テスト化合物の能力を特定するのは本発明の範囲内のものである。例えば、マイ
クロフィジオメーターを用いて、テスト化合物、TPL−2または標的ポリペプ
チドの標識なくしてテスト化合物とTPL−2または標的ポリペプチドとの相互
作用を検出することができる(McConnell, H.M.等(1992
)Science 257:1906−1912)。さらにもう1つの具体例に
おいて、本発明のアッセイは細胞フリーアッセイであり、ここに、例えば、TP
L−2および標的ポリペプチドをテスト化合物と接触させ、相互作用を改変する
テスト化合物の能力を測定する。この相互作用はさらにTPL−2および/また
はTPL−2標的ポリペプチドのリン酸化を含むことができるか、含まなくても
よい。テスト化合物の標的ポリペプチドへの結合は直接的または間接的に測定す
ることができる。いずれかのポリペプチドに結合する候補化合物の能力の測定も
またリアルタイム生物化学相互作用分析(BIA)のごとき技術を用いて達成す
ることができる(Sjolander, S.およびUrbaniczky,
C.(1991)Anal. Chem. 63:2338−2345およびS
zaboら(1995)Curr. Opin. Struct. Biol.
5:699−705)。本明細書で用いる「BIA」はいずれの相互作用物質
(例えば、BIAcoreTM)も標識することなくリアルタイムで二特異的相
互作用を研究するための技術である。光学現象表面プラズモン共鳴(SPR)の
変化は、生物学的分子の間のリアルタイム反応の指標として用いることができる
。
グプログラムにおいて、所与の時間で観察する化合物の数を最大化するには望ま
しい。精製されたまたは半精製された蛋白質を用いて行うことができるごとく、
細胞フリー系で行われるアッセイは、それがテスト化合物によって媒介される分
子標的における改変の迅速な開発および比較的容易な検出を可能する点で、しば
しば「一次」スクリーニングとして好まれる。さらに、テスト化合物の細胞毒性
および/または生物学的利用性の効果はテン・ビトロ系では一般的に無視され、
その代わり、アッセイは、上流または下流エレメントとの結合親和性の改変で発
現され得るごとく、分子標的に対する薬物の効果に主として焦点を当ててきた。
従って、本発明の例示的スクリーニングアッセイにおいて、TPL−2標的ポリ
ペプチド、例えば、p105(Kieran等, 1990, Cell 62
:1007−1018、またAcc. No.M37492も参照)またはIκ
B−α(Zabel等 1990, Cell 61:255−265)と共に
またはそれなくして注目する化合物をTPL−2ポリペプチドと接触させ、TP
L−2および/または標的ポリペプチドのリン酸化の検出および定量は、例えば
、放射性同位体を用いリン酸化TPL−2および/またはTPL−2標的ポリペ
プチドの形成を阻害するときの化合物の効果を評価することによって測定される
。テスト化合物の効果は、種々の濃度のテスト化合物を用いて得られたデータか
らの用量応答曲線を作成することによって評価することができる。さらに、対照
アッセイを行って、比較のためのベースラインを供することができる。もう1つ
の具体例において、種々の候補化合物をテストし、既知の活性、例えば、既知の
上位概念活性を有するインヒビター、あるいは特異的活性を持つ対照化合物を、
テスト化合物の特異性が測定することができるように比較する。従って、所望な
らば、一般的キナーゼインヒビター、例えば、スタウロスポリン(例えば、Ta
maoki等, 1986, Biochem. Biophys. Res.
Comm. 135:397−402;Meggio等, 1995, Eur
. J. Biochem. 234:317−322)、または例えば商業的
に入手可能なPD98059(MEKの優れたインヒビター、例えば、Dudl
ey等, 1995, P.N.A.S. 92:7686−7689参照)お
よびSB203580(p38 MAPキナーゼの優れたインヒビター、例えば
、Cuenda等, 1995, FEBS Lett. 364:229−23
3)のごとき特異的キナーゼインヒビターを用いることができる。
固定化して非複合体化形態から複合体化形態の分離を容易とし、アッセイの自動
化を収容するのが望ましいであろう(例えば、実施例4参照)。テスト化合物の
存在下または不存在下でのTPL−2および標的ポリペプチドのリン酸化または
結合は、反応体を含有するのに適したいずれかの容器中で達成することができる
。かかる容器の例はマイクロタイタープレート、試験管、およびミクロ遠心管を
含む。1つの具体例において、蛋白質の一方または双方がマトリックスに結合す
るのを可能とするドメインを付加する融合蛋白質を供することができる。例えば
、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ/標的ポリペプチド融合蛋白質をグル
タチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, St. Lu
oise,MO)またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着
させることができ、次いで、これを(例えば、塩およびpHについて生理学的条
件で)リン酸化または複合体形成に誘導する条件下でテスト化合物と組合せ、イ
ンキュベートする。インキュベーションに続き、ビーズまたはマイクロタイター
プレートウェルを洗浄していずれの未結合成分も、ビーズの場合には固定化され
たマトリックスも除去し、複合体を例えは前記してごとく直接的または間接的に
測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離され、標的ポリペプチドの
結合またはリン酸化活性のレベルを、標準的な技術を用いて測定することができ
る。マトリックス上への蛋白質を固定化する他の技術もまた本発明のスクリーニ
ングアッセイで用いることができる。
は、2−ハイブリッドアッセイまたは3−ハイブリッドアッセイにおける「餌蛋
白質」として使用して(例えば、米国特許第5,283,317号;Zeros
ら(1993)Cell 72:223−232; Madura等(1993
)J. Biol. Chem. 268:12046−12054; Bat
el等(1993)Biotechniques 14:920−924; I
wabuchi等(1993)Oncogene 8:1693−1696;お
よびBrent WO94/10300)、TPL−2および/またはTPL−
2標的ポリペプチドに結合またはそれと相互作用する他の蛋白質または化合物を
同定することができる。
およびこれらのアッッセイの使用によるかかる剤の製法に関する。従って、1つ
の具体例において、本発明は前記スクリーニングアッセイ(例えば、細胞ベース
アッセイまたは細胞フリーアッセイ)のいずれか1つの工程を含む方法によって
得ることができる化合物または剤を含む。例えば、1つの具体例において、本発
明は本明細書に記載されたもののいずれかによって得ることができる化合物また
は剤を含む。
例えば、TPL−2分子または化合物をさらに使用するのは本発明の範囲内のも
のである。例えば、本明細書に記載したごとくに同定された剤を動物モデルで使
用して、かかる剤での処置の効率、毒性または副作用を測定することができる。
別法として、本明細書に記載したごとくに同定された剤は動物モデルで使用して
かかる剤の作用メカニズムを測定することができる。加えて、かかる剤は、もし
適当とみなされるならば、ヒト対象、好ましくは炎症障害の危険性がある対象に
投与することができる。
療のための前記スクリーニングアッセイによって同定された新規剤の使用に関す
る。従って、本明細書に記載された障害のいずれかの診断、予後または治療で使
用するための薬物または医薬組成物の設計、処方、合成、製造および/または生
産においてかかる剤を使用するのは本発明の範囲内のものである。
て同定することができる化合物または複数化合物を含む医薬組成物が提供される
。
活性を変調することができる化合物または複数化合物を含む組成物である。典型
的には、前記化合物はいずれかの医薬上許容される塩、例えば、適当であれば、
アナログ、遊離塩基形態、互変異性体、エナンチオマーラセメート、またはその
組合せの形態である。本発明による有効成分を含む医薬組成物の有効成分は、例
えば、特定の場合に応じた量で投与された場合、細胞増殖、感染状態および炎症
状態に関連した腫瘍または他の病気の治療において優れた治療活性を呈すると考
えられる。例えば、本発明は、TPL−2シグナリングを改変することができる
いずれの化合物も含む。1つの具体例において、前記化合物は、炎症に関与する
遺伝子の誤調節の結果となるTPL−2活性を阻害することができる。例えば、
TPL−2活性を阻害し、それにより、TNF遺伝子発現を低下させる化合物は
、例えば、炎症疾患を治療するための好ましい化合物である。1つの好ましい化
合物において、本発明の方法に従って同定された化合物は、例えば、慢性関節リ
ウマチ、多発性硬化症(MS)、炎症性腸疾患(IBD)、インスリン−依存性
糖尿病(IDDM)、敗血症、乾癬、TNF−媒介病、および移植片拒絶のごと
き炎症性疾患を治療するのに使用することができる。もう1つの具体例において
、本発明の1以上の化合物は、前記疾患のいずれかを治療するのに特定の兆候を
治療するのに適していることが知られているいずれかの当業者に認められている
化合物と組み合わせて使用することができる。従って、本発明の1以上の化合物
は、便宜な単一組成物を対象に投与することができるように、前記兆候を治療す
るのに適したことが知られている1以上の当業者に認められた化合物と組み合わ
せることができる。
つかの分割用量を毎日投与することができるか、あるいは用量は治療状況の要件
によって示されたごとく比例して減少させることができる。
は坐薬経路または(例えば、徐放性分子を用いる)移植によるごとく便宜に方法
で投与することができる。投与経路に応じて、有効成分は、前記成分を酵素、酸
および前記成分を不活化し得る他の天然状態から保護するために物質中にコート
するのが必要であり得る。
するか、またはそれと共に投与してその不活化が防止されるであろう。例えば、
有効成分をアジュバント中で投与することができ、酵素インヒビターと共にまた
はリポソーム中で共投与することができる。アジュバントはその最も広い意味で
使用され、インターフェロンのごときいずれの免疫刺激化合物も含む。ここに考
えられるアジュバントはレゾルシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテル
およびヘキサデシルポリオキシエチレンエーテルのごとき非イオン性界面活性剤
を含む。酵素インヒビターは膵臓トリプシンを含む。
む。
ロール、液体ポリオキシエチレングリコール、およびその混合物中、および油中
で調製することもできる。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの製剤は微
生物の増殖を防止するための防腐剤を含有する。
よび滅菌注射溶液または分散液の処方箋調合製剤のための滅菌粉末を含む。全て
の場合において、前記形態は滅菌されていなければならず、容易なシリンジ性が
存在する程度に液状でなければならない。それは製造および貯蔵条件下で安定で
なければならず、細菌および菌類のごとき微生物の汚染作用に対して保存されな
ければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリ
セロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコール等)、そ
の適当な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。例え
ば、レシチンのごときコーティングの使用によって、分散液の場合において必要
な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、適当な流動性
を維持することができる。
ロブタノール、ソルビン酸、チメサロール等によって達成できる。多くの場合、
等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めるのが好ましいであろう。注射
組成物の延長吸収は、吸収を遅延する剤の組成物、例えば、モノステアリン酸ア
ルミニウムおよびゼラチンの使用によって達成できる。
当な溶媒中に配合し、続いて、濾過滅菌することによって調製される。一般に、
分散液は滅菌有効成分を基本的分散媒体および前記したものからの所要の他の成
分を含有する滅菌ビヒクルに配合することによって調製される。滅菌注射溶液の
調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は真空乾燥および凍結乾燥で
あり、これは、有効成分+その前記した滅菌濾過溶液からのいずれかのさらなる
所望の成分を生じる。
は許容される可食性担体と共に経口投与することができるか、あるいはそれはハ
ードもしくはソフトゼラチンカプセルに入れることがでるか、あるいはそれはダ
イエットの食品と共に直接配合することができる。経口治療投与では、結う濃い
成分は賦形剤と共に配合することができ、摂取可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ
剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェハー剤等の形態で使
用することができる。かかる適当な剤型のかかる治療上有用な組成物におけるあ
る量の有効成分が得られるであろう。
トラガカントガム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンのごときバインダ
ー;リン酸二カルシウム;コーンスターチ、ジャガイモスターチ、アルギン酸等
のごとき崩壊剤;ステアリン酸のごとき滑沢剤;およびスクロース、ラクトース
またはサッカリンのごとき甘味剤を添加することができるか、あるいはペパーミ
ント、ヒメコウジの油、またはチェリーフレーバーのごときフレーバー剤を添加
することができる。投与単位形態がカプセル剤である場合、それは、前記タイプ
の物質に加えて、液状担体を含有することができる。
ために存在させることができる。例えば、錠剤、丸剤たはカプセル剤をシェラッ
ク、糖または双方でコートすることができる。シロップ剤またはエリキシル剤は
有効成分、甘味剤としてのスクロース、防腐剤としてのメチルおよびプロピルパ
ラベン、色素およびチェリーもしくはオレンジフレーバーのごときフレーバー剤
を含有することができる。勿論、いずれの投与単位形態を調製するのに使用され
るいずれの物質も医薬上純粋であるべきであり、使用する量で実質的に非特性で
あるべきである。加えて、有効成分を持続放出製剤および処方に配合することが
できる。
かのおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗菌類剤、等
張剤および吸収遅延剤を含む。医薬上活性な物質のためのかかる媒体および剤の
使用は当業者によく知られている。いずれの通常の媒体もしくは剤も有効成分と
不適合である限りを除けば、治療組成物におけるその使用が考えられる。補足的
有効成分もまた組成物に配合することができる。
が特に有利である。ここに使用される投与単位形態とは、治療すべき哺乳動物対
象のための単位剤形として適した物理的に区別される単位をいい;各単位は所要
の医薬担体と組み合わせて所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活
性物質を含有する。本発明の新規な投与単位形態の仕様は(a)有効物質のユニ
ークな特徴および達成すべき特定の治療効果、および/(b)身体の健康が損な
われた病気状態を有する生きた対象における病気の治療のための有効物質のごと
き調剤分野で固有の制限に指示され、直接それに依存する。
有効量にて便宜かつ効果的な投与のために調合される。補足的有効成分を含有す
る組成物の場合、剤形は通常の用量および前記成分の投与方法を参照することに
よって決定される。
者に認められた化合物と組み合わせてまたは単独で病気の治療で使用される前記
定義の本発明の有効成分が提供される。その結果、NFκB誘導または抑制に関
連した病気の治療のための医薬の製造のための本発明の有効成分の使用が提供さ
れる。
治療上有効量を対象に投与するNFκB誘導または抑制に関連した疾患の治療方
法が提供される。
て酵母2−ハイブリッドスクリーニングを行う(Fromont−Racine
ら, 1(1997)Nature Gene 16:277−282)。pAS
2ΔΔベクターにサブクローンされたTPL−2 cDNAを餌として用いて、
(Legrain, パスツール研究所、パリによって提供された)ヒト肝臓c
DNAライブラリをスクリーニングする。
LacZ発現に対して陽性である68のクローンが得られる。相互作用蛋白質は
DNA配列決定によって同定され、酵母への再形質転換によって確認される。
様C−末端をコードする(図2a)。無細胞翻訳によって一緒に合成された、p
105とTPL−2との共免疫沈殿により、2つの蛋白質が高化学量論的量で相
互作用することが確認される(図1b)。TPL−2およびp105は一緒に合
成され、Promega TNT結合ウサギ網状赤血球系を用いる無細胞翻訳に
よって、[35S]−Met(Amersham−Pharmacia Bio
tech)で標識する。翻訳された蛋白質は溶解緩衝液A(Salmeron,
A.等(1996)EMBO J. 15, 817−826)+0.1mg
/ml BSA中に希釈し、前記文献に記載されているごとく免疫沈殿させる。
単離された蛋白質はSDS−PAGEによって解像され、フルオログラフィーに
よって明らかにされる。
体で単離されたTPL−2/p105複合体の化学量論はほぼ1:1であると見
積もられる。TPL−2のキナーゼ不活性突然変異体は同様の化学量論にてp1
05と会合する。
質をHeLa細胞から免疫沈殿させる。密集HeLa細胞の細胞溶解物からの内
因性蛋白質の免疫沈殿およびウエスタンブロッティング(90mm皿;Gibc
o−BRL)を、緩衝液A中の抽出および15分間の100,000gにおける
遠心により記載されているごとく行う(Kabouridis等,(1997)
EMBO J. 16:4983−4998)。抗−TPL−2抗体、TSP3
はすでに記載されている(Salmeron,A.等(1996)EMBO J
.15:817−826)。NF−κB1(N)(Biomol Resear
ch Labs), Lel−A(Santa Cruz)およびC−Rel(
Santa Cruz)に対する抗体は示された商業的供給業者から得られる。
抗−myc MAb、9E10(G. Eval博士、ICRF ロンドン)は
myc−p105/myc−p50の免疫沈殿および免疫蛍光で用いられるが、
抗−myc抗血清(Sant Cruz)は免疫ブロッティングで使用される。
抗−HA MAb、12CA5はHA−p50の免疫蛍光染色で使用される。
瞭い示す(図3a)。p50、RelAおよびc−RelもまたTPL−2と特
異的に共免疫沈殿する。イン・ビトロ実験はTPL−2およびp50(p48突
然変異体から生成;図2b、レーン14)、Rel−AまたはcRelの間のい
ずれの直接的会合も検出できなかった。このように、イン・ビボでTPL−2と
会合したp105は恐らくはp105のN−末端Rel相同性ドメイン(RHD
)を介してRelサブユニットと複合体化している(Ghosh等,(1998
)Annu. Rev. Immunol. 16, 225−260)。
溶解物と抗−NFκB1(N)抗血清での免疫枯渇によって調べられる。抗−T
PL−2免疫沈殿のウエスタンブロッティングは、実質的全ての検出可能なTP
L−2がNF−κB1−枯渇細胞溶解物中で除去されることを示す(図3b、底
部パネル)。TPL−2の免疫枯渇は全細胞p105のほぼ50%を除去する。
このように、HeLa細胞において、実質的に全てのTPL−2は全p105の
大きな割合と複合体化し、これは高化学量論相互作用を示すイン・ビトロデータ
と合致する(図1、bおよびc)。
にサブクローンする。N−末端mycエピトープ−タグのTPL−2 cDNA
への付加、TPL−2欠失突然変異体の創製(図1a)およびTPL−2(A2
70)キナーゼ−不活性突然変異体(未タグ付加)は、適当なオリゴヌクレオチ
ドでのPCRを用いて行い、DNA配列決定によって確認する。図の説明で特記
しない限り、全長TPL−2はmyc−エピトープタグなくして使用する。pc
DNA1(Invitrogen)またはpEF−BOS発現ベクターいずれか
にサブクローンされたmyc−p105欠失突然変異体およびHA−p50は、
PCRによって創製され、pcDNA3にサブクローンされたmyc−NΔ−p
105を例外として、従前に記載されている(Watanabe等,(1997
)EMBO J.16:3609−3620; Fan等,(1991)Nat
ure 354:395−398)。図1に示された実験において、pRC−C
MV発現ベクター(Invitrogen)にサブクローンされた未タグドp1
05 cDNAをp105の翻訳で用いる(Blank等,(1991)EMB
O J. 10:4159−4167)。
行った免疫沈殿実験は、2つの蛋白質がそれらのC−末端を通じて相互作用する
ことを明らかにする(図1および2)。特に興味深いのは、C−末端を欠くTP
L−2、TPL−2AC(Salmeron, A.等(1996)EMBO
J.15:817−826)の癌形成性突然変異体は効果的にはp105と共免
疫沈殿しない(図1b,レーン5および6)。加えて、TPL−2のちょうどC
−末端92アミノ酸のGAL4融合は酵母2−ハイブリッドアッセイにおいてp
105のC−末端(残基459から969)と相互作用する。イン・ビトロにて
、TPL−2はp105のC−末端における2つの領域と相互作用するようであ
り(図2b,右側パネル)、1つは最後の89アミノ酸におけるものであって、
他方は残基545および777の間である。単離されたp105 C−末端はT
PL−2と安定な複合体を形成するのに十分である(図2c)。
生理学的機能を反映することを確立するのは重要である。この目的で、キナーゼ
−不活性TPL−2(A270)を、アゴニスト−p105分解をブロックする
その能力につきテストする。1×107ジャーカットT細胞を、選択ベクターJ
6−Hygro(0.5pg)と共にPMT2ベクター(5pg)にサブクロー
ンしたTPL−2(A270)cDNAと共にエレクトロポレーションによって
共トランスフェクトする。対照細胞をPMT2対照ベクターおよびJ6Hygr
oと共トランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を限定希釈によって
クローン化し、ヒグロマイシン耐性(0.5mg/ml)につき選択する。生じ
たクローンにおけるTPL−2(A270)の発現はウエスタンブロックによっ
て測定する。ジャーカットクローンのパルスチェース代謝標識を、点当たり8×
106細胞を用いて3T3細胞につき行う。
ランスフェクト親細胞において、TNA−aはp105分解を刺激し(図7a)
、初期の研究と一致する(Mellits等,(1993)Nuc. Acid
. Res. 21, 5059−5066)。しかしながら、TPL−2(A
270)を発現するようにトランスフェクトされたジャーカットT細胞のTNA
−a刺激はp105代謝回転に対してほとんど効果を有しない(図7a)。この
ように、TNA−aがp105分解を誘導するのにTPL−2に活性が必要であ
って、TPL−2の活性はその優性陰性突然変異体の発現によってブロックされ
得る。
5/TNFの転写−活性化ポテンシャルの阻害を示す。ルシフェラーゼ遺伝子を
駆動するTNF−誘導レポーター構築体を用いてジャーカットT細胞を前記した
ごとくトランスフェクトする。キナーゼドメインを有しないキナーゼ−デッドT
PL−2、またはTPL−2の切形C−末端の共発現はルシフェラーゼ遺伝子の
発現を顕著に減少させる(図8)。
一過的にトランスフェクトされたTPL−2をまず、NF−κBレポーター遺伝
子を活性化するその能力につきテストする。NF−κBレポーター遺伝子アッセ
イでは、ジャーカットT細胞を、適当な発現ベクターの示した量と共にルシフェ
ラーゼ遺伝子(Invitrogen)の上流のコンセンサスNF−κBエンハ
ンサーエレメントの5つのタンデム反復を含有する2μgのプラスミドで共トラ
ンスフェクトする(Kabouridis等,(1997)EMBO J. 1
6:4983−4998)。TPL−2およびNIK CDNAは全てpcDN
A3ベクターにサブクローンする(Salmeron等,(1996); Ma
lintn等,(1997)、 Nature 385:540−544)。ト
ランスフェクトされたDNAの量を、空pcDNAベクターの補足によって一定
に保つ。ルシフェラーゼ実験(Kabouridis等,(1997))を少な
くとも3回行って同様の結果を得る。
の分解を刺激することによってNF−κBを活性化する関連MAP 3K酵素で
あるNIKによって誘導されたものと同様のレベルまで活性化する(Malin
in等,(1997); May, M. J.&Ghosh, S.(199
8)Immunol. Today 19, 80−88)。キナーゼ不活性点
突然変異体TPL−2(A270)はNF−κB誘導に対して効果を有しない。
イン・ビトロ(図1b)またはイン・ビボいずれかでp105とで安定な複合体
を形成しないTPL−2ACの発現の結果、NF−κBレポータのまさに中程度
の活性化(12倍)が得られるに過ぎない(図3c)。TPL−2がNF−κB
を十分に活性化するにはp105と複合体化されなければならないことを確認す
るために、p105のC−末端断片である3’NN(図2a)をTPL−2と共
発現させる。このC−末端断片は共トランスフェクトされたTPL−2とイン・
ビボで相互作用し、内因性p105への結合と競合する。3’NNの共発現はT
PL−2によるNF−κBレポーターの不活化を劇的に阻害するが、NIKによ
る不活化は阻害しない(図3d)。まとめると、これらのデータは、トランスフ
ェクトされたTPL−2がNF−κBを優れて活性化し、これは内因性p105
との直接的相互作用を要するように見えることを示す。これは、TPL−2がp
105を直接的に活性化するのではないかということを意味する。
結果となるはずである。これを調べるために、免疫蛍光を3T3繊維芽細胞で用
い、ここでは、細胞質および核の間の区別は容易である。略言すれば、NIH−
3T3細胞を示したベクターで一過的にトランスフェクトし、カバーグラス上で
24時間培養する。次いで、細胞を固定し、透過させ、従前に記載されているよ
うに(Huby等,(1997)J. Cell. Biol. 137, 16
39−1649)示した抗体および適当な蛍光標識第2段階抗体で染色する。L
eica TCS NT共焦点顕微鏡を用いて、染色されたトランスフェクト細
胞の単一光学セクションを可視化する。
と一緒にそれでトランスフェクトした細胞において、抗−myc染色は細胞質に
限られ(図4a、上方パネル)、これはIκBとしてのp105の機能と合致す
る。しかしながら、TPL−2との共発現は抗−myc染色の核への実質的に定
量的なシフトを誘導する(図4a、下方パネル)。細胞分別およびウェスタンブ
ロッティングは、TPL−2でトランスフェクトされた細胞における核NF−κ
Bシグナルが、細胞質に限定されるmyc−p105よりもむしろmyc−p5
0であることを確認する(図4b)。これらのデータは、TPL−2発現が、共
トランスフェクトされたmyc−p105のp50への増大したプロセッシング
、または解離されたmyc−p50を放出するその分解のプロセッシングいずれ
かの結果としての、myc−p50の核転移を誘導することを示唆する。
進するにちがいないか否かを調べるために、3T3細胞を、別のプラスミド上の
HA−p50と共に、myc−p50にプロセッシングされ得ないmyc−p1
05AGRRをコードするベクターでトランスフェクトする。HA−p50はT
PL−2(A270)(図5、頂部パネル)または空ベクターと共発現させると
核に局所化する。Myc−p105ΔGRRはTPL−2(A270)で共トラ
ンスフェクトした細胞の細胞質にHA−p50を保持する(図5、中央パネル)
。しかしながら、TPL−2のmyc−p105ΔGRRの共発現はHA−p5
0染色の核への実質的定量的シフトを誘導する(図5、下方パネル)。このよう
に、p50核転移のTPL−2活性化はp50へのp105プロセッシングの刺
激を要しない。これらのデータは、TPL−2がp105の分解を誘導して会合
したp50を放出させ、あるいは他の会合Relサブユニットを放出させて、核
へ転移させ、それによりNF−κBを生成させるという立場を支持する。
re, D.,(1989)Cell 58,227−229)中のNF−κB
結合部位に対応する放射性標識二本鎖オリゴヌクレオチド(Promega)を
用い、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)を記載されているごとく(A
lkalai, I.等(1995)Mol. Cell. Biol 15,
1294−1301)行って、TPL−2を共発現する細胞においてmyc−p
105から生産された核myc−p50が生物学的活性であることを確認する。
レーン2)これはジャーカットC細胞におけるNF−κBレポータ遺伝子のTP
L−2活性化と合致する(図3c)。Myc−p105発現は単独でより低いκ
B複合体の結合活性を中程度に増加させる(図4c、レーン3)。しかしながら
、myc−p105とTPL−2との共発現の結果、より低いκB複合体の結合
活性が相乗的に増加する(図4c、レーン4)。キナーゼ−不活性TPL−2(
A270)はκB結合活性に影響を有しない(図4c、レーン5)。また、p1
05のプロセッシング欠陥突然変異体、myc−p105AGRR(Watan
abe等,(1997)AEMBO J. 16:3609−3620)は共発
現されたTPL−2の存在下または不存在下でκB結合活性を生じない(図4c
、レーン6および7)。
胞において誘導されたより低いκB複合体と強く反応し、スーパーシフトを引き
起こす(図4c、レーン8)。これにより、この複合体におけるプロセッシング
されたmyc−p50の存在が確認される。この誘導されたより低い複合体はR
el A(図4c,レーン9)またはc−Relに対する抗体と反応しない。こ
のように、TPL−2とmyc−p105との共発現は、myc−p105トラ
ンスフェクト細胞において過剰発現されるmyc−p50のダイマーを主として
含む活性NF−κB複合体の生産を刺激する。TPL−2単独でトランスフェク
トした細胞からの核抽出物スーパーシフト分析(図4c、レーン2)は、主要な
誘導された内因性NF−κB複合体がp50/Rel−Aダイマーからなること
を明らかとする(図4c、レーン9)。
yc−p105の蛋白質分解を調節するか否かを決定する。パルスチェイス代謝
標識では、NIH−3T3繊維芽細胞がLipofectAMINE(Gibc
o−BRL)(Huby等,(1997)J. Cell. Biol. 13
7,1639−1649)を用いて一過的にトランスフェクトする。細胞質およ
び核画分の調製は記載されているごとく行う(Watanabe等、(1997
)。
、60mm当たり2.7×105 3T3細胞(Nunc)を示した発現ベクタ
ーでトランスフェクトする。24時間後に、細胞を洗浄し、Met/Cys−フ
リー培地中で1時間培養する。次いで、皿当たり145 MBqの[35S]−
Met/[35S]−Cys(ProMix, Amersham−Pharm
acia Biotech)で細胞を30分間標識し、洗浄の後、示した時間完
全培地中でチェイスする。0.1%SDSおよび0.5%デオキシコレート(R
IPA緩衝液)を補足した緩衝液B(Salmeron等)に細胞を溶解させ、
免疫沈殿した蛋白質をフルオログラフィーによって明らかにするMG132プロ
テオソームインヒビター(Biomol Research Labs)を、M
et/Cys飢餓期間の最後の15分間に2O’1Mで添加し、チェイスの間維
持する。Molecular Dynamics Personal デンシト
メーターを用いるレーザーデンシトメトリーによって標識されたビーズを定量す
る。全てのパルスチェイス実験は少なくとも2つの場合に行い、同様の結果が得
られる。
8時間まで減少させる(図5aおよびb)。myc−p105の減少速度のmy
c−p50生産のそれとの比較は、myc−p105の大部分が、すでに提案さ
れているごとく(Lin等, 1998)Cell92, 819−828)m
yc−p105に変換されるよりも(図6a)単純に分解されることを示唆する
。しかしながら、TPL−2共発現は、最近記載されている共翻訳メカニズム(
Lin等, 1998)よりもむしろ、これらの細胞においてmyc−p105
から翻訳後に圧倒的に生じる(図6a)myc−p50の生産の全速度を変更し
ない。myc−p50は対照細胞におけるごとくTPL−2共トランスフェクト
細胞で同様の速度であるが徐々に減少していく量のmyc−p105から生じる
ので(図6c)、TPL−2myc−p105プロセッシングの効率を劇的に増
加させることを示唆する。野生型p105(図6b)と同様に、TPL−2共発
現はmyc−p105AGRRの分解を促進する(図6d)。しかしながら、キ
ナーゼ−不活性TPL−2−(A270)は分解(図6e)または共発現された
myc−p105のプロセッシングいずれかに対して検出可能な効果を有しない
。
して、TPL−2によって誘導されたmyc−p105蛋白質分解がプロテアソ
ームによって媒介されるか否かを調べる。MG132処理はmyc−p105の
増大した代謝回転をブロックし(図6f)、TPL−2共発現細胞におけるmy
c−p50の生産を完全に妨げる。結論として、パルスチェイス代謝標識実験は
、TPL−2発現の支配的効果がプロテアソームによるmyc−p105分解の
速度を増加させることにあるのを示す。しかしながら、同時に、プロテアソーム
によるmyc−p105からのmyc−p50の生産の全速度は変化されない。
の効果を測定するために、3T3細胞を示したベクターで一過的に共トランスフ
ェクトし、24時間後にRIPA緩衝液に溶解させる。次いで、細胞溶解物のウ
ェスタンブロットを抗−myc抗血清でプローブする。バンドをレーザーデンシ
トメトリーによって定量する。一過的にトランスフェクトされた3T3細胞から
の溶解物のウェスタンブロッティングは、myc−p50/myc−p105の
定常比率が対照と比較してTPL−2共発現によって有意に増加することを示す
(図6g)。
yc−p105よりも大モル過剰で発現され(myc−p50/myc−p10
5)平均値=10.3+/−SE1.3;n=2)、他方、対照細胞において、
myc−p105およびmyc−p50はほとんど同等モラーである(myc−
p50/myc−p105平均=0.93+/−SE0.07;n=2)。従っ
て、細胞質にそれを維持する不十分なmyc−p105があるので、myc−p
50はTPL−2共トランスフェクト細胞の核に転移する。
a)およびIKK−2)と呼ばれる2つの関連キナーゼをNIKはリン酸化し、
それを活性化する。これはIκB−α普遍化およびプロテアソームによる分解を
トリガーする。リン酸化がTPL−2で共発現されたmyc−p105における
移動度シフトを引き起こすか否かを調べるために、洗浄した抗−myc免疫沈殿
を、50mMトリス−pH7.5、0.03%Brij−96、0.1mM E
DTA、1mM DTT、0.1mg/ml BSAを含有する緩衝液に再懸濁
させる。子ウシ腸ホスファターゼ(CIP;Boehringer Mannh
eim)を、ホスフェートインヒビターのオルトバナジン酸ナトリウム(1mM
)、フッ化ナトリウム(5mM)および Okada酸(0.1μm)と共にま
たはそれなくして400U/mlにて適当な試料に添加する。37℃での1時間
のインキュベーション後に、免疫沈殿した蛋白質をウェスタンブロットし、抗−
NF−κB1(N)高血清でプローブする。
よびe)、これはリン酸化がこの効果で同様に必要であることを示す。TPL−
2と共発現させたmyc−105はSDS−PAGEにおいてよりゆっくりと移
動することが常に見出される(図6a)。このTPL−2誘導移動度シフトは、
イン・ビトロでのホスファターゼでの処理に対する感受性によって明らかにされ
るごとく、myc−p105リン酸化によるものである。(図7b)。対照的に
、キナーゼ−不活性TPL−2(A270)は共発現されたmyc−p105に
おいて移動度シフト誘導しない(図7b)。このように、myc−p105蛋白
質分解のTPL−2刺激はその誘導されたリン酸化と相関する。IκBαとの類
似性により、TPL−2−誘導p105リン酸化はその普遍化を促進し、それに
よりプロテアソームによるp105蛋白質分解を刺激するようである。
−媒介蛋白質分解を刺激することによってNF−Bを活性化する新規なシグナリ
ング経路の構成要素である。TPL−2は、p50生産の全速度を維持しつつp
105の分解を増大させる(図6a)。このように、会合したRelサブユニッ
トはそれ自身の核まで移動するか(恐らくはダイマーとして)、あるいはp50
産物と複合体化する。TPL−2はp50、Rel−Aおよびc−Relと特異
的に共免疫沈殿するので(図3a)、それは細胞に存在する全ての主要なp10
5複合体の蛋白質分解を調節できる(Rice等,(1991)Cell7,
243−253; Mercurio等,(1993)Genes. Deve
l. 7, 705−718)。興味深いことには、TPL−2は、IκB
−αの誘導性分解を調節するNIKに最も密接に相同なキナーゼである(Mal
inin, 1997)。従って、NF−κB活性化に至る2つのシグナリング
経路は関連するMAP 3K−ファミリー酵素によって調節される。
形成性活性化についての潜在的メカニズムを提案する(Ceci等,(1997
)Gene. Devel. 11, 688700)。このように、C−末端
欠失はTPL−2の発現を増加させると共に、それをp105との化学量論的相
互作用から放出させ(図1B)、これは一緒になって不適当な標的蛋白質のリン
酸化を促進し得る。これらは、突然変異によって活性化された場合、癌形成性で
あり(Cowely等,(1994)Cell 77, 841−852)、T
PL−2によって強力に活性化される(Salmeron, A.等,(199
6)EMBO J. 15, 817−826)MEKを含み得る。
用いるTPL−2/COTキナーゼアッセイ 実施例を通じて、特記しない限り、以下の材料および方法を用いる。
で発現させた。典型的には、トランスフェクションの24時間前に、ヒト293
A細胞(Quantum)を10cmのプレート当たり2×106細胞で平板培
養した。15mlのチューブ中に60μlリポフェクタミン(Gibco)およ
び800μlのOptimem(Gibco)を含むトランスフェクション混合
物を調製した。別のチューブ中で、pCDNAベクター中のFLAG−タグドC
OT(30−397)遺伝子をコードする8μgのDNAを800μlのOpt
imemに添加した。次いで、各チューブの内容物をピペットで温和に混合し、
室温にて25分間インキュベートした。細胞をOptimemで1回洗浄し、ト
ランスフェクション混合物および6.4mlのOptimemとインキュベート
し、35℃および5%CO2にて5時間インキュベートした。次いで、細胞を第
1日に8mlのDMEM+10%FBS+L−グルタミンと共に、第2日にDM
EM+5%FBS+L−グルタミンと共にインキュベートし、トランスフェクシ
ョンから48時間後に収穫した。
A細胞を、溶解緩衝液(1%トリトンX−100、50mMトリス−HCl p
H7.5、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EDTA、20
mM NaF、10mM Na4P2O7、50mM Na3VO4+完全プロ
テアーゼ阻害剤(Boehringer))中で15分間、氷上で、溶解させ、
上清を遠心し(4℃での10分間の14,000rpm)、上清を収集した。混
合しつつ、溶解物1mM当たり50μg AbにてFLAG Abゲル(Sig
ma)を用いて4℃で3時間免疫沈殿を行った。ゲルビーズを4℃にて溶解緩衝
液で2回洗浄し、次いで、洗浄緩衝液(50mMトリス−HCl pH7.5、
100mM NaCl、0.1mM EDTAおよび1mM DTT)で2回洗
浄した。次いで、ゲルビーズを洗浄緩衝液に再懸濁し、種々のキナーゼ反応のた
めにチューブに小分けした。
キナーゼインヒビターをスクリーニングした。キナーゼアッセイは以下のごとく
行った。ゲルビーズに結合したTPL−2キナーゼ(すなわち、FLAG−CO
T(30−397))を、25℃にて、適当な放射性標識(30μm ATPお
よび5μCi γ−32P−ATP(Amersham))の存在下で、キナー
ゼ緩衝液(50mMトリス−HCl pH7.5、10mM MgCl2、1m
M EGTA、2mM DTTおよび0.01%Brij35)中で2μgの標
的ポリペプチド基質(すなわち、GST IκB−α(1−50)(Bosto
n Biologicals)と共に10分間インキュベートした。100%D
MSO中の10mMストック溶液として調製した阻害活性のための候補化合物の
存在下または不存在下で反応を行った。γ−32P−ATPの添加直前に、テス
ト化合物をキナーゼ反応混合物に添加した。5×SDS試料緩衝液を添加し、1
00℃で3分間加熱することによって反応を停止させ、遠心を用いて上清を収集
した。COTの自動リン酸化および標的ポリペプチド、すなわち、GST−Iκ
B−αのリン酸化は、ゲル電気泳動(10% SDS−PAGE)、続いてのニ
トロセルロース膜への移動およびオートラジオグラフィーによって分析した。同
等レベルのFLAG−COT(30−397)およびGST−IκB−α蛋白質
が異なるキナーゼ反応および同等のゲル負荷で用いられたことを確認するための
対照として、オートラジオグラフィーで使用した同一膜上で、各々、抗−FLA
Gおよび抗−GST抗体でイムノブロットを行った。COTキナーゼ活性、いず
れかの自動リン酸化活性の阻害または標的ポリペプチドGST−IκB−αのリ
ン酸化はオートラジオグラフのスキャンニングによって定量した(図13)。こ
れらの活性のレベルを変更する化合物をさらに後述するように分析した。
ゼアッセイ 前記と同様に昆虫細胞で発現されたTPL−2ポリペプチドを、候補モジュレ
ータ化合物の存在下または不存在下で標的ポリペプチドを用いてキナーゼ活性に
つきテストした。このアッセイにおいて、TPL−2キナーゼ、すなわち、CO
T(30−397)を、標準技術を用いてCOTキナーゼを発現するバクロウイ
ルスで感染した昆虫細胞から調製した。キナーゼアッセイ緩衝液(50mMトリ
ス−HCl pH7.5、10mM MgCl2、1mM EGTA、2mM
DTT、0.01%Brij35、5mM β−ホスフォグリセロール)中、テ
スト化合物の存在下または不存在下、放射性標識([33P]−γ−ATP 3
×ストック:50μCi/ml [33P]−γ−ATPを含む60μM冷AT
P)の存在下で、モデルp105蛋白質を含む標的ポリペプチド(すなわち、P
BS中の1.4mg/mlにおける1μgのGST−P105Δ1−497)と
共にTPL−2キナーゼ(50mM トリス−HCl pH8.0中の5μg/
mlにおける100ng)をインキュベートした。加えて、このアッセイを標的
ポリペプチド(すなわち、モデルp105ポリペプチド)の不存在下で行って、
テスト化合物のいずれかがTPL−2自動リン酸化活性を改変したかを測定した
。
スクリーニングを行った。例えば、典型的には、10μlのキナーゼおよび基質
を、10μlの化合物、10μlの[33P]−γ−ATPの存在下で96ウェ
ルプレート中のウェル当たりでインキュベートした。反応を75mM H3PO 4 中の100μlの5mM ATPで停止させた。次いで、120μlの各反応
混合物の96−ウェルホスフォセルセロール膜フィルタープレートへの移動を行
い、25℃で30分間インキュベートし、洗浄し(ウェル当たり100μlの7
5mM H3PO4にて6×)、シンチレーションカウンターで測定した回収標
識蛋白質の関数としての得られたキナーゼ活性につき(25μlのシンチレーシ
ョンカクテルを用いて)アッセイした。
を含有するものとして分子モデリングによって選択された化学ライブラリーから
、TPL−2キナーゼ活性を変調できるいくつかの化合物を同定した。同定され
た化合物はGST−IκB−αによって表されるIκB−α標的ポリペプチドの
COT−媒介リン酸化に対する効果を示した。
ーゼ活性の阻害につき、まずスクリーニングした。選択された化合物についての
TPL−2キナーゼインヒビタースクリーニングデータの例を図13に示す。テ
ストすべき化合物がTPL−2の特異的阻害剤であるかまたは一般的キナーゼ阻
害剤であるかを決定するために、既知の特異性を持つキナーゼ阻害剤もまた平行
してテストした。一般的キナーゼ阻害剤であるスタウロスポリン、MEKインヒ
ビターPD98059およびp38 MAPキナーゼインヒビターSB2035
80は、COT自動リン酸化およびCOT標的(すなわち、IκB−α)のリン
酸化に対してほとんどまたは阻害活性を示さなかった。対照的に、テスト化合物
の各々は、変化するレベルの特異的阻害活性を示した(図13)。DMSOビヒ
クルのみを含有する対照キナーゼ反応(5%の最終濃度)と比較して100μM
においてTPL−2活性>50%阻害した活性化合物を3つの濃度100μM、
10μMおよび1μMで再テストして、TPL−2阻害に対するIC50値を測
定した。同定されたTPL−2阻害剤はIC50=50μMを持つN−(6−フ
ェノキシ−4−キノリル)−N−[4−(フェニルスルファニル)フェニル]ア
ミン]、IC50=10μMを持つ5−オキソ−4−[4−(フェニルスルファ
ニル)アニリノ]−5、6,7,8−テトラヒドロ−3−キノリンカルボン酸エ
チル、IC50=100μMを持つ3−(4−ピリジル)−4,5−ジヒドロ−
2H−ベンゾ[g]インダゾールメタンスルフォネートおよびIC50=100
μMを持つ2−クロロベンゾ[l][1,9]フェナントロリン−7−カルボン
酸ナトリウムを含む。これらの化合物の各々の化学構造は図9から12に示され
る。
た本発明の具体例の多くの同等物を認識し、あるいは確認できるであろう。かか
る同等物は以下の請求の範囲に含まれることを意図する。
Claims (68)
- 【請求項1】 NFκB活性の変調方法であって、NFκB活性の変調が起
こるようにTPL−2分子をNFκB調節の成分と接触させることを含む方法。 - 【請求項2】 TPL−2分子が野生型TPL−2である請求項1に記載の
方法。 - 【請求項3】 TPL−2分子が野生型TPL−2のp105−リン酸化活
性を保持する請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 TPL−2分子が優性ネガティブTPL−2変異体である請
求項1に記載の方法。 - 【請求項5】 TPL−2分子が野生型TPL−2のC−末端を保持する請
求項1に記載の方法。 - 【請求項6】 p105の活性を直接的または間接的に変調できる化合物ま
たは複数化合物を同定する方法であって、 (a)TPL−2分子を評価すべき化合物または複数化合物と共にインキュベ
ートする工程と;次いで、 (b)TPL−2分子の活性に影響する化合物を同定する工程を含む方法。 - 【請求項7】 化合物または複数化合物がTPL−2分子に結合する請求項
6に記載の方法。 - 【請求項8】 (c)細胞ベースのアッセイにおいて、TPL−2の活性に
影響する化合物をNFκB活性化を変調する能力につき評価することをさらに含
む請求項6または7に記載の方法。 - 【請求項9】 炎症応答に関係するまたはそれを用いる病気の治療で有用な
医薬のためのリード化合物を同定する方法であって、 テストすべき化合物または複数化合物の存在がなければ、TPL−2が参照親
和性を持ってp105に会合する条件下にて、テストすべき化合物または複数化
合物をTPL−2分子およびp105と共にインキュベートすることと; テストすべき化合物または複数化合物の存在下でp105に対するTPL−2
の結合親和性を測定することと; 参照結合親和性に関して、p105に対するTPL−2の結合親和性を変調す
る化合物を選択することを含む方法。 - 【請求項10】 炎症応答に関係するまたはそれを用いる病気の治療で有用
な医薬のためのリード化合物を同定する方法であって、 テストすべき化合物または複数化合物の存在がなければ、TPL−2が参照親
和性を持ってp105に会合する条件下にて、テストすべき化合物または複数化
合物をTPL−2分子およびp105と共にインキュベートすることと; テストすべき化合物または複数化合物の存在下でp105に対するTPL−2
の結合親和性を測定することと;次いで 参照結合親和性に関して、NFκBに対するTPL−2の結合親和性を変調す
る化合物を選択することを含む方法。 - 【請求項11】 医薬のためのリード化合物を同定する方法であって、 テストすべき化合物または複数化合物の存在がなければ、腫瘍壊死因子(TN
F)およびTPL−2の相互作用が測定可能な化学的または生物学的効果を誘導
する条件下で、テストすべき化合物または複数化合物をTPL−2分子およびT
NFと共にインキュベートすることと; テストすべき化合物または複数化合物の存在下で測定可能な化学的または生物
学的効果を誘導するTNFとのTPL−2の直接的または間接的相互作用能力を
測定することと; TNFおよびTPL−2の相互作用を変調する化合物を選択することを含む方
法。 - 【請求項12】 細胞中にてイン・ビボで行われる請求項11に記載の方法
。 - 【請求項13】 医薬のためのリード化合物を同定する方法であって、 精製されたTPL−2を提供する工程と; TPL−2分子を、TPL−2によってリン酸化されることが既知の基質およ
びテスト化合物または複数化合物と共にインキュベートする工程と; 基質のリン酸化を変調できるテスト化合物または複数化合物を同定する工程を
含む方法。 - 【請求項14】 基質がMEKである請求項13に記載の方法。
- 【請求項15】 TPL−2とp105との直接的または間接的相互作用を
変調することができる請求項6から14のいずれか1つの方法によって同定可能
な化合物。 - 【請求項16】 抗体である請求項15に記載の化合物。
- 【請求項17】 TPL−2に特異的である請求項16に記載の抗体。
- 【請求項18】 ポリペプチドである請求項15に記載の化合物。
- 【請求項19】 TPL−2分子である請求項18に記載のポリペプチド。
- 【請求項20】 TPL−2の構成的に活性な変異体または優性ネガティブ
突然変異体である請求項19に記載のポリペプチド。 - 【請求項21】 請求項15から20のいずれか1項に記載の化合物を細胞
に投与する、細胞におけるp105の活性を変調する方法。 - 【請求項22】 治療上有効量の請求項15から20のいずれか1項に記載
の化合物を有効成分として含む医薬組成物。 - 【請求項23】 NFκB誘導または抑制に関連する疾患の治療のための請
求項15から20のいずれか1項に記載の化合物の使用法。 - 【請求項24】 治療上有効量の請求項15から20のいずれか1項に記載
の化合物を患者に投与する、NFκB誘導または抑制に関連する疾患を治療する
方法。 - 【請求項25】 TPL−2によって媒介される炎症応答を調節する化合物
を同定する方法であって、 TPL−2ポリペプチドまたはその断片を含む反応混合物をテスト化合物と接
触させる工程、および、 NFκB活性のインジケーターに対するテスト化合物の効果を測定して、それ
により、TPL−2によって媒介されるNFκB活性を調節する化合物を同定す
る工程を含む方法。 - 【請求項26】 TPL−2によって媒介されるNFκB活性を調節する化
合物を同定する方法であって、 TPL−2ポリペプチドまたはその断片を含む反応混合物をテスト化合物と接
触させる工程、および、 NFκB活性のインジケーターに対するテスト化合物の効果を測定して、それ
により、TPL−2によって媒介されるNFκB活性を調節する化合物を同定す
る工程を含む方法。 - 【請求項27】 TPL−2による情報伝達を調節する化合物を同定する方
法であって、 TPL−2ポリペプチドまたはその断片を含む反応混合物をテスト化合物と接
触させる工程、および、 反応混合物中、TPL−2ポリペプチドによる情報伝達のインジケーターに対
するテスト化合物の効果を測定して、それにより、TPL−2による情報伝達を
調節する化合物を同定することを含む方法。 - 【請求項28】 TPL−2ポリペプチドとTPL−2変調の標的成分との
相互作用を変調する化合物の同定方法であって、 TPL−2ポリペプチドまたはその断片を含む反応混合物を前記TPL−2変
調の標的成分およびテスト化合物とテスト化合物が存在するのでなければ、前記
TPL−2ポリペプチドまたはその断片が参照レベルにおいて標的成分と特異的
に相互作用する条件下で接触させることと、 前記テスト化合物がTPL−2ポリペプチドまたはその断片とTPL−2変調
の標的成分との相互作用を変調する差異を示す前記テスト化合物の存在下で相互
作用のレベルの変化を測定することを含む方法。 - 【請求項29】 TPL−2ポリペプチドが配列番号2および4からなる群
から選択されるポリペプチドと少なくとも75%同一性を有するアミノ酸配列を
含む請求項25、26、27および28のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項30】 TPL−2ポリペプチドが、高ストリンジェント条件下で
配列番号1および3からなる群から選択される核酸分子とハイブリダイズする核
酸分子によってコードされる請求項25、26、27および28のいずれか1項
に記載の方法。 - 【請求項31】 反応混合物が細胞を含む混合物である請求項25、26、
27および28のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項32】 反応混合物が細胞ベースの混合物である請求項25、26
、27および28のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項33】 反応混合物が組換え細胞である請求項32に記載の方法。
- 【請求項34】 前記組換え細胞がTPL−2ポリペプチドをコードする異
種核酸を含む請求項33に記載の方法。 - 【請求項35】 前記測定が、キナーゼ活性、結合活性、およびシグナリン
グ活性からなる群から選択されるTPL−2活性の測定を含む請求項25、26
、27および28のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項36】 前記TPL−2活性がキナーゼ活性である請求項35に記
載の方法。 - 【請求項37】 組換え細胞が、TPL−2またはNFκBにより変換され
た細胞シグナルに感受性である転写調節配列と作動可能に連結したレポータ遺伝
子を含むレポータ遺伝子構築体を含む請求項25、26、27および28のいず
れか1項に記載の方法。 - 【請求項38】 前記転写調節配列がTNF転写調節配列を含む請求項37
に記載の方法。 - 【請求項39】 前記標的成分がp105、IκB−α、IκB−β、ME
K−1、SEK−1およびNFκBからなる群から選択される請求項28に記載
の方法。 - 【請求項40】 前記TPL−2分子が組換えポリペプチドである請求項2
5、26、27および28のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項41】 前記TPL−2ポリペプチドが配列番号2および4からな
る群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項40に記載の方法。 - 【請求項42】 前記シグナリングがTNF発現を含む請求項35に記載の
方法。 - 【請求項43】 前記組換え細胞がTPL−2情報伝達に対して感受性であ
るレポータ遺伝子を含む請求項37に記載の方法。 - 【請求項44】 前記測定が細胞のアポトーシスの測定を含む請求項25、
26、27および28のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項45】 前記測定が細胞の増殖の測定を含む請求項25、26、2
7および28のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項46】 前記測定が免疫応答の測定を含む請求項25、26、27
および28のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項47】 TPL−2ポリペプチドが精製されたTPL−2ポリペプ
チドである請求項25、26、27および28のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項48】 前記標的成分が精製されたポリペプチドである請求項28
に記載の方法。 - 【請求項49】 前記標的成分がp105、IκB−α、IκB−β、ME
K−1、SEK−1およびNFκBを含む群から選択されるポリペプチドまたは
その断片である請求項28に記載の方法。 - 【請求項50】 前記標的成分がIκB−αである請求項49に記載の方法
。 - 【請求項51】 前記標的成分がp105である請求項49に記載の方法。
- 【請求項52】 前記テスト化合物が蛋白質ベース、炭水化物ベース、脂質
ベース、核酸ベース、天然有機物ベース、合成された有機物ベースおよび抗体ベ
ースの化合物からなる群から選択される請求項25、26、27および28のの
いずれか1項に記載の方法。 - 【請求項53】 請求項25、26、27および28のいずれか1項に記載
の方法により同定された化合物。 - 【請求項54】 前記化合物が慢性関節リウマチ、多発性硬化症(MS)、
炎症腸疾患(IBD)、インスリン−依存性糖尿病(IDDM)、敗血症、乾癬
、誤調節TNF発現および移植片拒絶からなる群から選択される疾患を使用する
のに適した請求項25、26、27および28のいずれか1項に記載の方法によ
って同定された化合物。 - 【請求項55】 前記化合物が慢性関節リウマチを治療するのに適している
請求項25、26、27および28のいずれか1項に記載の方法によって同定さ
れた化合物。 - 【請求項56】 前記化合物が誤調節されたTNF発現を治療するのに適し
ている請求項25、26、27および28のいずれか1項に記載の方法によって
同定された化合物。 - 【請求項57】 TPL−2を変調することができる医薬組成物を投与する
ことを含み、前記投与は患者における免疫系応答を変調するのに十分な量である
、TPL−2活性を変調することにより、治療の必要な患者において免疫系疾患
を治療する方法。 - 【請求項58】 患者のTPL−2−媒介疾患を変調するのに治療上有効量
のTPL−2を変調できる組成物を投与することを含む、患者のTPL−2−媒
介疾患を治療する方法。 - 【請求項59】 治療上有効量の医薬組成物を、変調が起こるようにヒトに
投与することを含む、治療の必要な患者のTPL−2−媒介NFκB調節を変調
する方法。 - 【請求項60】 TPL−2−媒介NFκB調節の変化を得るのに十分な量
の、TPL−2を変調できる組成物を細胞に投与することを含む、細胞内でTP
L−2−媒介NFκB調節を変調する方法。 - 【請求項61】 前記疾患が慢性関節リウマチ、多発性硬化症(MS)、炎
症腸疾患(IBD)、インスリン−依存性糖尿病(IDDM)、敗血症、乾癬、
誤調節TNF発現および移植片拒絶からなる群から選択される請求項57および
58のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項62】 前記疾患が慢性関節リウマチである請求項61に記載の方
法。 - 【請求項63】 前記疾患が誤調節されたTNF発現である請求項61に記
載の方法。 - 【請求項64】 前記組成物がN−(6−フェノキシ−4−キノリル)−N
−[4−(フェニルスルファニル)フェニル]アミン]、5−オキソ−4−[4
−(フェニルスルファニル)アニリノ]−5,6,7,8−テトラヒドロ−3−
キノリンカルボン酸エチル、3−(4−ピリジル)−4,5−ジヒドロ−2H−
ベンゾ[g]インダゾールメタンスルフォネート、および2−クロロベンゾ[1
][1,9]フェナントロリン−7−カルボン酸ナトリウムからなる群から選択
される請求項57から59のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項65】 治療上有効量のTPL−2モジュレータを、治療が起こる
ようにTNF誤調節の危険性がある患者に投与することを含む、TNF誤調節を
治療する方法。 - 【請求項66】 前記TPL−2モジュレータがN−(6−フェノキシ−4
−キノリル)−N−[4−(フェニルスルファニル)フェニル]アミン]、5−
オキソ−4−[4−(フェニルスルファニル)アニリノ]−5,6,7,8−テ
トラヒドロ−3−キノリンカルボン酸エチル、3−(4−ピリジル)−4,5−
ジヒドロ−2H−ベンゾ[g]インダゾールメタンスルフォネート、および2−
クロロベンゾ[1][1,9]フェナントロリン−7−カルボン酸ナトリウムか
らなる群から選択される請求項65に記載の方法。 - 【請求項67】 治療上有効量のTPL−2モジュレータを、慢性関節リウ
マチの危険性がある患者に投与して治療を行うことを含む、慢性関節リウマチの
治療方法。 - 【請求項68】 前記TPL−2モジュレータがN−(6−フェノキシ−4
−キノリル)−N−[4−(フェニルスルファニル)フェニル]アミン]、5−
オキソ−4−[4−(フェニルスルファニル)アニリノ]−5,6,7,8−テ
トラヒドロ−3−キノリンカルボン酸エチル、3−(4−ピリジル)−4,5−
ジヒドロ−2H−ベンゾ[g]インダゾールメタンスルフォネート、および2−
クロロベンゾ[1][1,9]フェナントロリン−7−カルボン酸ナトリウムか
らなる群から選択される請求項67に記載の方法。
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