CN1323346A - Tpl－2/cot激酶和使用方法 - Google Patents

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Abstract

证实了TPL－2与p105的磷酸化及其产生的蛋白酶解有关,蛋白酶解导致p50Rel转运至核。因此本发明提供的TPL－2是激活NFkB的特异性调节剂,因此它是p105参与的炎症反应调节剂并且是开发能够影响NFkB活化的化合物的靶。

Description

TPL-2/COT激酶和使用方法
相关信息
本申请是1998年12月16日申请的系列号GB9827712.2的部分连续申请，后一申请要求1998年8月18日申请的临时申请系列号GB9817930.2的优先权权益。上述申请和本申请整个说明书引用的所有其它专利、专利申请和参考文献通过引用整体结合到本文中。
本发明背景
核因子κB(NFκB)是以参与κ轻链转录的核因子于1986年首次在B细胞中发现(Sen和Baltimore,(1986)Cell 46:705-716)，而且自那以后证实它是真正存在于所有真核细胞类型的遍在转录因子(综述于Ghosh等，(1998)Ann.Rev.Immunol.16:225-260)。在细胞中，NFκB以与抑制蛋白IκB复合的失活形式存在于细胞质中。当用合适的诱导物刺激时，IκB与NFκB解离并暴露其核定位信号，使其转运到核中，在核中发挥其作为转录因子的生物活性。因此，NFκB是基因表达的快速调节剂，因为其诱导与从头蛋白合成无关。
活性NFκB是Rel家族的蛋白二聚体，它含有称为Rel同源域的300个氨基酸N-末端保守域。该区与DNA结合、与其它Rel蛋白二聚合、核定位和与IκB结合有关。每种Rel蛋白含有所需要的DNA结合位点的一半，因此容许适当的Rel结合，表现为共有NFκB结合位点5’-GGGGYNNCCY-3’的微小变异。
如上所述，Rel蛋白在胞质中与IκB分子结合。IκB是含有锚蛋白重复序列的分子，其中许多成分已经表征，包括IκB-α、β、γ、ε、Bc1-3和Cactus。Bcl-3是高等脊椎动物多肽，而Cactus是果蝇基因。锚蛋白重复序列和NFκB/Rel的相互作用似乎是调节NFκB蛋白进化上的保守机制。
Rel蛋白家族包括Relish、Dif、Dorsal、RelB、c-Rel、v-Rel(鸡癌基因)、p65、p100/p52和p105/p50。列于前面的3个是果蝇蛋白。后两种多肽不常见，因为较大的前体分子(p100或p105)编码Rel蛋白和IκB,IκB与其相关的Rel蛋白结合阻断其核定位。p50和p52的单体或同型二聚体没有转录激活域。因此，为了激活基因转录，它们与另一种反式激活Rel蛋白以杂二聚体形式缔合。p50/p52同型二聚体可能在某些细胞类型中抑制基因转录。
IκB磷酸化触发激活NFκB/Rel。紧接着蛋白酶体降解IκB，但是IκB磷酸化的主要机制迄今仍然很不清楚。如果是p100/p105，需要蛋白酶剪切Rel区的含锚蛋白重复序列的C末端区，以暴露核定位信号p52/p50。
NFκB在体内调节参与免疫应答、急性期反应和炎症反应的基因中起重要作用。虽然NFκB的作用是高度多效的，但是用失效小鼠(p105-/-)研究了p105的作用。这些动物缺失p105的C末端区，使得所述小鼠能够表达p50，但是表达的不是与p105的IκB样抑制性锚蛋白重复序列复合的形式的p50。换句话说，产生组成活性的p50(Ishikawa等，(1998)J.Exp.Med.187:985-996)。这些小鼠呈现炎症表型，包括肺部和肝脏的淋巴细胞侵润、对感染的易感性增加、多个淋巴结增大、脾大和淋巴样细胞增生。巨噬细胞产生细胞因子的能力受损，而B细胞的增生增强。
不适当或不正确的NFκB合成与哺乳动物的多种疾病和机能障碍有关。如Schreck等(1991)EMBO J.10:2247-2258所述，NFκB迁移至核与在HIV感染细胞中的HIV基因组转录和产生HIV病毒体以及HIV基因表达有关(Swingler等，(1992)AIDS Res Hum Retroviruses 8:487-493)。NFκB还参与其它逆转录病毒如EBV的复制(Powell等，(1993)Clin Exp Immunol 91:473-481)。
而且，已知NFκB保护细胞免于发生凋亡(参见例如Sikora等，(1993)BBRC 197:709-715)，介导TNF的生物效应(Renier等，(1994)JLipid Res 35:271-278；WO97/37016)、介导应激反应(Tacchini等，(1995)Biochem J 309:453-459)以及保护细胞免于发生例如局部缺血(Mattson,(1997)Neurosci.Biobehav.rev.21:193-206)，而且NFκB与各种癌症有关(Chang等，(1994)Oncogene 9:923-933；Enwonwu和Meeks,(1995)CritRev Oral Biol Med 6:5-17；Denhardt,(1996)Crit Rev Oncog 7:261-291)。
但是，一般来说，NFκB参与调节表达各种各样的细胞因子和淋巴因子。说明NFκB活性在治疗伴随或涉及应激、感染或炎症，或者利用在体内受NFκB控制的反应例如炎症反应的各种病症中起调节剂作用。
最早鉴定C末端缺失型的TPL-2，它是与莫洛尼鼠类白血病病毒诱发的大鼠T细胞淋巴瘤有关的癌基因产物(Patriotis等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2251-2255)。TPL-2是一种丝氨酸蛋白激酶，其催化域与MAP激酶激酶激酶(3K)同源(Salmeron,A.等，(1996)EMBOJ.15:817-826)，而且与人COT的原癌基因产物的同一性在90％以上(Aoki,M.等，(1993)J.Biol.Chem.268:22723-22732)。TPL-2还与激酶NIK高度同源，已经证实NIK调节诱导性降解IκB-α(Malinin等，(1997)Nature 385:540-544；WO97/37016；May和Ghosh,(1998)Immunol.Today 19:80-88)。然而，TPL-2/COT的生物学功能迄今仍然不清楚。
发明概述
本发明涉及调节NFκB的新途径。具体来说，本发明涉及使用激酶TPL-2/COT作为开发能够调节NFκB的药物的靶，而且在一个优选的实施方案中，作为开发能够调节IκBp105与TPL-2相互作用的药物的靶。在整个说明书中，除非另有说明，否则术语“TPL-2”应该理解为包括大鼠TPL-2和人TPL-2同源物COT。还应该指出的是，本发明范围包括任何一种TPL-2同源物、优选哺乳动物TPL-2同源物。除非另有说明，否则术语“NFκB”包括具有本领域已知的NFκB结合活性的任何一种蛋白质(或其片段)或蛋白复合物。这种蛋白或蛋白复合物可包括一种或多种蛋白，并且可以是同型二聚体、杂二聚体或多聚体。通常这种复合物可包括例如relA、relB、p50、p52、p65、c-Rel、v-Rel和/或dorsal。
下文证实TPL-2与p105降解有关而且导致释放Rel亚单位。所以，本发明提供的TPL-2为p105降解的特异性调节剂，因此成为p50Rel参与的炎症反应的调节剂。
因而，本发明的第一方面提供应用TPL-2调节NFκB活性，从而发挥NFκB的调节作用。在一个优选的实施方案中，通过p105发挥调节作用。
本发明的第二个方面提供鉴定能够直接或间接调节p105的蛋白酶解而因此调节其抑制活性的一种或多种化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)温育TPL-2分子与需要评价的一种或多种化合物；和
(b)鉴定影响TPL-2分子活性的化合物。
如在下文中证实的一样，发现TPL-2与p105的直接或间接磷酸化有关，所述磷酸化直接导致p105降解并以同型二聚体或与其它Rel单体的杂二聚体转移到核的相关Rel亚单位。因此，以下这样的化合物能够通过p105调节NFκB的激活，所述化合物能够调节TPL-2和p105之间的直接或间接作用，其调节作用是通过结合TPL-2调节TPL-2的活性，或者影响TPL-2与p105或其它参与p105磷酸化作用的多肽的相互作用实现。
而且本发明提供产生能够调节TPL-2活性的多肽的方法，包括表达编码它们的核酸序列、调节体内细胞中的NFκB活性的方法和治疗与NFκB有关的病症或需要减轻或抑制炎症的病症的方法。
本发明的再一方面提供应用TPL-2调节肿瘤坏死因子在细胞中的活性或对细胞的活性。如下所述，应用TPL-2拮抗剂TPL-2(A270)可阻断TNF激活的基因转录。
已知TNF-α能够刺激p105的降解以及NFκB诱导激活的基因转录。因此本发明涉及调节TNF激活p105的途径的方法。在一个优选的实施方案中，本发明提供鉴定药用前导化合物的方法，包括：
除了存在受试化合物之外，在TNF和TPL-2相互作用产生可测量的化学或生物效应的条件下将待测的一种或多种化合物与TPL-2分子和肿瘤坏死因子(TNF)温育；
检测在受试化合物存在下TNF与TPL-2直接或间接作用产生可测量的化学或生物效应的能力；和
选择调节TNF和TPL-2相互作用的化合物。
在一个优选的实施方案中，本发明包括鉴定药用前导化合物的方法，包括以下步骤：
提供纯化的TPL-2分子；
温育TPL-2分子和被TPL-2磷酸化的已知底物和受试的一种或多种化合物；和
鉴定能够调节所述底物磷酸化作用的受试化合物。
然后，任选的是使所鉴定的受试化合物进行体内测试，确定其对TNF/p105产生的信号通道的作用。
另一方面，本发明提供鉴定调节TPL-2介导的炎症反应的化合物的方法，包括使包括TPL-2多肽或其片段的反应混合物与受试化合物接触，以及测定所述受试化合物对NFκB活性指标的效应，由此鉴定调节TPL-2介导的NFκB活性的化合物。
在一个相关方面，本发明提供鉴定调节TPL-2介导的NFκB活性的化合物的方法。
另一方面，本发明提供鉴定调节TPL-2信号转导的化合物的方法，包括使含有TPL-2多肽或其片段的反应混合物与受试化合物接触，以及测定所述受试化合物对所述反应混合物中的TPL-2多肽的信号转导指标的效应，以便鉴定调节TPL-2信号转导的化合物。
甚至再一方面，本发明提供鉴定调节TPL-2多肽与TPL-2调节作用的靶组分相互作用的化合物的方法，包括使含有TPL-2多肽或其片段的反应混合物与TPL-2调节作用的靶组分和受试化合物在以下条件下接触，所述接触条件是除了存在所述受试化合物之外，所述TPL-2多肽或其片段与参考水平的靶组分特异性作用。因此，所述方法可测定在所述受试化合物存在下TPL-2多肽或其片段与TPL-2调节作用的靶组分相互作用的水平变化，其中变化水平差值说明所述受试化合物对TPL-2多肽或其片段与TPL-2调节作用的靶组分之间的相互作用的调节作用。在一个优选的实施方案中，所述靶组分是p105、IκB-α、IκB-β、MEK-1、SEK-1或NFκB，优选纯化的多肽。
在前述方面的一个优选实施方案中，所述方法包括使用TPL-2多肽，优选使用重组多肽，所述多肽包括与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列具有至少75％的同一性的氨基酸序列。
在前述方面的另一优选实施方案中，所述方法包括TPL-2多肽、优选重组多肽，其由在高严格条件下与具有SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3所示序列的核酸分子杂交的核酸分子编码。
在前述方面的另一优选实施方案中，所述方法包括使用无细胞混合物或基于细胞的混合物，而且这种混合物可以衍生自重组细胞、优选具有编码TPL-2多肽的异源核酸的重组细胞。在一个优选的实施方案中，所述无细胞混合物可使用纯化的TPL-2多肽。在另一个实施方案中，所述方法包括测定信号活动，该信号活动包括TNF表达。在一个相关实施方案中，所述重组细胞含有与转录调节序列有效连接的报道基因构建物，所述转录调节序列对TPL-2或NFκB转导的细胞内信号敏感。在一个优选的实施方案中，所述转录调节序列是TNF转录调节序列。
在前述方面的另一优选实施方案中，所述方法包括测定TPL-2活性，例如激酶活性、结合活性和/或信号活动。
在前述方面的再一优选实施方案中，所述方法包括的测定有检测细胞凋亡、细胞增殖或免疫应答。
在前述方面的又一优选实施方案中，所述方法包括使用基于蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸、天然有机物、合成有机物或抗体的受试化合物。
在另一优选实施方案中，本发明提供按照前述方面的方法鉴定的化合物，这种化合物优选为适合治疗疾病的化合物，所述疾病例如是多发性硬化症(MS)、炎症性肠病(IBD)、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、脓毒病、牛皮癣、移植排斥反应、调节异常的TNF表达或优选是类风湿性关节炎。
另一方面，本发明提供在其需要患者治疗免疫系统疾病的方法，该方法通过给予能够调节TPL-2的药用组合物调节TPL-2活性进行治疗，所给予的所述药用组合物量足以调节所述患者免疫系统应答。
在一个相关方面，本发明提供治疗患者TPL-2介导的病症的方法，该方法通过给予能够调节TPL-2的组合物进行治疗，所给予的所述组合物的有效治疗量足以在所述接受者调节TPL-2介导的病症。
在另一相关方面，本发明提供在其需要对象调节TPL-2介导的NFκB调节作用的方法，该方法是对所述人类对象给予有效治疗量的药用组合物，以产生所需要的调节作用。
在又一相关方面，本发明提供在一种细胞中调节TPL-2介导的NFκB调节作用的方法，包括给予细胞能够调节TPL-2的组合物，所给予的量足以达到改变TPL-2介导的NFκB调节作用。
在前述方面的一个优选实施方案中，所治疗的病症是多发性硬化症(MS)、炎症性肠病(IBD)、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、脓毒病、牛皮癣、移植排斥反应、调节异常的TNF表达或优选是类风湿性关节炎。
在前述方面的另一优选实施方案中，所给予的组合物含有选自以下的化合物：N1-[4-(4-氨基-7-环戊基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯苯基]-1-苯磺酰胺、5-氧代-4-[4-(苯硫基)苯胺基]-5,6,7,8-四氢-3-喹啉羧酸乙酯、3-(4-吡啶基)-4,5-二氢-2H-苯并[g]-吲唑甲磺酸盐和2-氯苯并[1][1,9]菲咯啉-7-羧酸钠。
另一方面，本发明提供治疗TNF调节异常的方法，该方法给予TNF调节异常风险个体有效治疗量的TPL-2调节剂，以进行治疗。
在一个相关方面，本发明提供治疗类风湿性关节炎的方法，该方法给予类风湿性关节炎风险个体有效治疗量的TPL-2调节剂，以进行治疗。
在以上两个方面的一个优选实施方案中，所述TPL-2调节剂是N1-[4-(4-氨基-7-环戊基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯苯基]-1-苯磺酰胺、5-氧代-4-[4-(苯硫基)苯胺基]-5,6,7,8-四氢-3-喹啉羧酸乙酯、3-(4-吡啶基)-4,5-二氢-2H-苯并[g]-吲唑甲磺酸盐或2-氯苯并[l][1,9]菲咯啉-7-羧酸钠。
在再一实施方案中，当所治疗的病症是关节炎例如类风湿性关节炎时，使用的TPL-2调节剂不是3-(4-吡啶基)-4,5-二氢-2H-苯并[g]-吲哚甲磺酸盐。
附图简述图1
需要TPL-2C末端与NF-κBl p105在体外相互作用。
A)TPL-2缺失突变体标示myc和TSP3表位的位置(Salmeron,A.等，(1996)EMBO J.15,817-826)。M30相当于TPL-2的选择性起始位点(Aoki,M.等，(1993)J.Biol.Chem.268,22723-22732)。B)TPL-2ΔC不能与p105形成稳定复合物。合成p105(Blank等，(1991)EMBO J.10,41594167)，并用[35S]-Met通过独立或与TPL-2或TPL-2ΔC一起的体外无细胞翻译进行标记(Salmeron等，1996)。然后用抗-TPL-2抗体-/+竞争肽免疫沉淀合适的翻译混合物。用10％SDS-PAGE分开分离的蛋白，并用荧光自显影显现(右侧组)。左侧组标记的‘溶胞产物’显示在整个兔网织红细胞溶胞产物翻译混合物中的TPL-2和p105表达。体外翻译的p105产生只在过度曝光的胶片(数据未提供)才可见到的低水平p50(泳道3)。C)TPL-2N末端不需要与p105结合。与B一样，所指示的TPL-2蛋白(均在其N末端标记的myc表位)与p105在体外翻译，然后用抗-myc MAb免疫沉淀。10％SDS-PAGE后荧光自显影显示[35S]-Met-标记蛋白。下面一组显示溶胞产物中的p105表达。图2
TPL-2与NF-κBl p105的C末端在体外的相互作用。
A)p105缺失突变体(Fan等，(1991)Nature 354,395-398)。标示Rel同源结构域(RHD)(Ghosh等，(1998)Annu.Rev.Immunol.16,225-260)、富含甘氨酸区(GRR)(Lin等，(1996)Mol.Cell Biol.16,2248-2254)和抗体表位myc和NF-κBl(N)的位置。空心箭头指示p50 C末端的位置。实心箭头指示不同TPL-2互作的NF-κBl双杂交克隆的N末端起始位置，它们均与所述蛋白的C末端连接。B)和C)TPL-2与p105的C末端相互作用。TPL-2与指示的p105突变体一起在体外翻译。通过对抗-TPL-2免疫沉淀物(右侧组)进行8％SDS-PAGE以及荧光自显影分析复合物的形成。左侧组显示溶胞产物中的TPL-2和p105突变体的表达。B)中的箭头指示p48的位置。图3
TPL-2与NF-κBl p105在体内缔合而且瞬时表达后激活NF-κB-依赖性报道基因。
A)TPL-2与p105在体内缔合。用指示的抗体-/+竞争肽免疫沉淀HeLa细胞溶胞产物。通过10％SDS-PAGE分开分离的蛋白，然后依次对所示蛋白进行蛋白质印迹。B)大部分TPL-2与p105在体内复合。用抗-NF-κBl抗体对HeLa细胞溶胞产物连续免疫沉淀3次。细胞溶胞产物的蛋白质印迹证实消除了p105/p50，但是没有消除α-微管蛋白。用抗-TPL-2抗血清探测溶胞产物和溶胞产物的抗-TPL-2免疫沉淀物的蛋白质印迹，测定耗竭NF-κBl的溶胞产物的TPL-2含量。C)TPL-2表达激活NF-κB-依赖性荧光素酶报道基因。用0.5μg指定表达载体和2μg报道构建物(用空pcDNA3载体将总DNA调节为4μg)转染JurkateT细胞。复份进行荧光素酶测定，并表示为相当于空载体对照的平均刺激指数(+/-SE)。按蛋白质印迹测定，根据其表达水平，相对于指定为任意值1的TPL-2，对TPL-2ΔC数据归一化。TPL-2ΔC(A270)是TPL-2的激酶失活点突变。D)C末端p105片段的共表达阻断TPL-2激活NF-κB。用0.5μg指定表达载体和或者2μg空载体或者3’NN构建物和2μg NF-κB荧光素酶报道构建物转染JurkatT细胞。复份荧光素酶测定表示为相对于空载体对照的平均刺激指数(+/-SE)。蛋白质印迹证实3’NN的表达不会影响共转染的TPL-2的表达(数据未提供)。图4
TPL-2与myc-p105共表达诱导活性myc-p50的核转运。
A)TPL-2诱发共表达的NF-κBl的核转运。用0.5μg各指定表达载体瞬时转染3T3细胞，并用定位myc-p105/myc-p50的抗-myc MAb(绿色；表现为亮点)和抗-TPL-2抗血清(红色，表现为黑点)对其进行间接免疫荧光染色。所示图象是透过典型转染细胞的一个共焦区的图片。还显示了相差图。
B)TPL-2诱导myc-p50转运入细胞核中。从用指定载体转染的细胞制备胞质和细胞核提取物。用抗-NF-κBl(N)抗血清探测抗-myc免疫沉淀物的蛋白质印迹，显示myc-p105/myc-p50。与总细胞溶胞产物比较提示，不能从细胞核部分有效提取myc-p50，所以它不能充分说明问题。
C)TPL-2诱导的核NF-κBl具有生物活性。用EMSA(Alkalay,I等，(1995)Mol.Cell. Biol.15,1294-1301)分析从用指定表达载体(各0.5μg；Watanabe等，(1997)EMBO J.16,3609-3620)转染的3T3细胞制备的核提取物的NF-κB DNA结合活性。实心箭头指示检测到的两种NF-κB复合物的位置。空心箭头指示抗体-超漂移(supershifted)的NF-κB复合物的位置(泳道6和7)。在泳道8中，与100倍未标记的κB寡核苷酸的竞争证实检测到的NF-κB复合物的特异性。图5
TPL-2促进与p105加工无关的p50的核转运。
用编码HA-p50(0.4μg)、或者TPL-2(A270)或者TPL-2(0.2μg)和myc-p105AGRR的载体或空载体(0.4μg)瞬时转染3T3细胞。培养24小时后，用定位HA-p50的抗-HA MAb(绿色表现为亮点)和抗-TPL-2抗血清(红色表现为黑点)对细胞进行间接免疫荧光染色。所示图象是透过典型转染细胞的一个共焦区图片。还提供了相差图。图6
TPL-2刺激共表达的myc-p105的蛋白酶解。
A)TPL-2共表达对p105蛋白酶解的影响。用编码myc-p105和TPL-2(TPL-2)的表达载体或用编码myc-p105的表达载体和空载体(对照)瞬时转染3T3细胞。培养24小时后，用[35S]-Met/[35S]-Cys对细胞进行代谢性脉冲标记30分钟，然后追踪指定时间。用抗-myc MAb从细胞溶胞产物免疫沉淀标记蛋白，通过8％SDS-PAGE分开，并用荧光自显影显示。实心箭头证实共免疫沉淀的TPL-2的位置。空心箭头指示TPL-2共表达引起的myc-p105的电泳迁移率变化。B)和C)用激光光密度测定法定量A组的免疫沉淀的myc-p105和myc-p50，而且图示数据表明myc-p105的转换(B)和myc-p50/myc-p105比(C)。D)用编码myc-p105AGRR和TPL-2(TPL-2)的载体或编码myc-p105AGRR的载体以及没有插入片段的载体(对照)瞬时转染3T3细胞。如同B一样测定myc-p105的转换。E)用编码myc-p105的载体和编码TPL-2(A270)的载体或空载体(对照)一起转染3T3细胞。如同B一样测定myc-p105的转换。F)蛋白酶体的抑制剂阻断TPL-2诱导的p105蛋白酶解。如同A一样转染3T3细胞。在脉冲标记前加入MG132蛋白酶体抑制剂(2011M)或DMSO溶媒(对照)并保持于整个追踪期。如同A一样通过免疫沉淀分离标记的myc-p105，并用激光光密度测定法进行定量。图示数据表示所述药物对TPL-2诱导的myc-p105蛋白酶解的影响。在追踪期，MG132处理完全阻断了TPL-2共转染细胞产生myc-p50(数据未提供)。G)如同A一样，用指定载体复份转染3T3细胞。24小时后用抗-myc抗血清探测细胞溶胞产物的蛋白质印迹，测定稳态水平的myc-p50/myc-p105。与对照相比，TPL-2共转染提高myc-p50的绝对水平。因此，在TPL-2共表达细胞中myc-p50可能更稳定，可能由于其核转运所致，因为不增加由myc-p105产生myc-p50的总速率(图6A)。图7
TNF-α诱导的降解p105需要TPL-2活性。
A)激酶失活TPL-2阻断TNF-α诱导的p105降解。按蛋白质印迹测定，转染的JurkatT细胞稳定表达激酶失活TPL-2(A270)。用[35S]-Met/[35S]-Cys对用空载体稳定转染的载体对照细胞和两种独立衍生的表达TPL-2(A270)的克隆进行代谢性脉冲标记30分钟，然后在TNF-a(20ng/ml)或对照介质(如图所示)存在下追踪指定时间。用抗-NF-κBl(N)抗血清从细胞溶胞产物免疫沉淀标记的p105，通过SDS-PAGE分开并用荧光自显影显示。通过激光光密度测定法定量免疫沉淀的p105，而且数据以图形式提供。
B)TPL-2诱导共表达的myc-p105的磷酸化。用编码myc-p105和指定蛋白或没有插入片段的对照(O)的载体瞬时转染3T3细胞。用抗-myc MAb经免疫沉淀分离myc-p105，然后用对照缓冲液(1)、磷酸酶(2)或磷酸酶和磷酸酶抑制剂(3)处理。通过8％SDS-PAGE分开分离的蛋白，并用抗-NF-κBl(N)抗血清进行蛋白质印迹。箭头指示TPL-2共表达引起的myc-p105的电泳迁移率的变化。图8
显性失活TPL-2调节TNF-诱导的报道基因的转录
用在TNF诱导型NFκB反应启动子系统控制下表达荧光素酶报道基因的载体，按照图7A的方法转化Jurkat T细胞。TPL-2 KD(激酶失活)或TPL-2 Cter(C末端截短)的共表达导致TNF-介导的激活降低。图9
图示化合物N-(6-苯氧基-4-喹啉基)-N-[4-(苯硫基)苯基]胺的化学结构，它能够在50μM水平时抑制TPL-2激酶活性50％。图10
图示化合物5-氧代-4-[4-(苯硫基)苯胺基]-5,6,7,8-四氢-3-喹啉羧酸乙酯的化学结构，它能够在10μM水平时抑制TPL-2激酶活性50％。图11
图示化合物3-(4-吡啶基)-4,5-二氢-2H-苯并[g]吲唑-2-鎓甲磺酸盐的化学结构，它能够在100μM水平时抑制TPL-2激酶活性50％。图12
图示化合物2-氯苯并[l][1,9]菲咯啉-7-羧酸钠的化学结构，它能够在100μM水平时抑制TPL-2激酶活性50％。图13
为放射性自显影图片，它证实几种不同化合物在降低TPL-2自身磷酸化(FLAG-COT(30-397))和靶多肽即GST-IκB-α的磷酸化水平中的抑制活性(泳道1,3-(4-吡啶基)-4,5-二氢-2H-苯并[g]吲唑；泳道2,5-氧代-4-[4-(苯硫基)苯胺基]-5,6,7,8-四氢-3-喹啉羧酸乙酯；泳道3,N-(6-苯氧基-4-喹啉基)-N-[4-(苯硫基)苯基]胺；泳道4，星形孢菌素；泳道5,SB203580；泳道6,PD098059；泳道7，只有FLAG-COT(30-397)和溶媒(DMSO)；以及泳道8，只有FLAG-COT(30-397)、GST-IκB-α和溶媒(DMSO)；进一步的细节参见文本)。图14
图示喹啉基衍生物的核心结构。
发明详述
TPL-2(肿瘤发展基因座2(tumour progression locus 2))是首次分离的与莫洛尼鼠类白血病病毒有关的MAP激酶激酶激酶。基因(tpl-2)编码的多肽与各个系统的肿瘤发展以及肿瘤发生有关，而且似乎它是在肿瘤中通过C末端截短作用激活(Makris等，(1993)J Virol 67:1286-1291；Patrotis等，(1993)PNAS(USA)90:2251-2255；Makris等，(1993)J Virol 67:4283-4289；Patrotis等，(1994)PNAS(USA)91:97559759；Salmeron等，(1996)EMBO J 15:817-826；Ceci等，(1997)Genes Dev 11:688-700)。大鼠TPL-2的完整核酸和氨基酸序列可以登录号M94454在GenBank获得。Oska甲状腺癌(cancer Osaka throid)的TPL-2人同源物(称为COT)的核酸和氨基酸序列可以登录号NM 005204和729884在GenBank获得(另外参见例如Miyoshi等，Mol.Cell.Biol.11(8),4088-4096(1991))。1．TPL-2是NFκB调节剂
第一方面，本发明涉及利用TPL-2分子调节NFκB活性。1a．TPL-2分子的应用
本发明包括例如应用TPL-2分子调节在体外和/或体内测定中的NFκB活性、尤其是在这类测定系统中磷酸化p105；应用TPL-2分子调节体内细胞中的NFκB活性，例如以便诱导或防止免疫反应或炎症反应。在一个优选的实施方案中，本发明涉及应用TPL-2分子治疗与去调节的NFκB表达有关的疾病。
在一个优选的实施方案中，或者在体内或在体外(例如在体外进行的测定方法中或细胞中例如细胞培养物中)，按照本发明的TPL-2分子可用于调节处于NFκB控制元件控制下的基因转录。
用于以上定义的测定或方法的TPL-2分子可用来诱导或防止p105磷酸化和蛋白酶解。因此，例如具有野生型TPL-2生物活性和能够结合并磷酸化p105的TPL-2分子可用来诱导p105降解和/或炎症反应。而且可使用组成型活性的TPL-2突变体，由此使其活性从其它细胞控制途径分离。
本发明的再一方面，可应用TPL-2的“激酶失活(kinase dead)”显性失活突变体，通过与内源野生型TPL-2竞争p105但不调节所述靶的磷酸化，向下调节p105磷酸化作用。最好通过使TPL-2在激酶域中的例如位置270发生突变，制备激酶失活突变体。可进行随机突变，并通过评价磷酸化人工底物的能力选择突变，或者可以通过模拟活性位点和定点诱变设计突变，以阻止或降低激酶活性。优选的激酶失活突变体是TPL-2(A270)和TPL-2(R167)。根据TPL-2结构的序列同源性推测这两种已知的突变体。1b．TPL-2分子
本文使用的“TPL-2分子”是指具有至少一种TPL-2生物活性的多肽。因此该术语包括保留至少一个TPL-2结构决定簇的TPL-2片段。
优选的TPL-2分子具有GenBank(登录号M94454)所给出的结构。此大鼠TPL-2多肽也由登录号M94454给出的核酸序列编码。本领域技术人员可以按照遗传密码简并性设计编码M94454多肽的替代序列。而且，本发明包括由与M94454给出的核酸序列基本同源的序列编码的TPL-2多肽。当同源性是指序列同一性时，“基本同源”意味着按照直接的序列排列和对比判断，序列同一性高于40％，优选序列同一性高于45％，优选序列同一性高于55％，优选序列同一性高于65％，最优选序列同一性为75％或更高。
例如术语“TPL-2分子”是指COT，即TPL-2的人同源物(登录号NM005204)。COT与TPL-290％相同。
此外，可使用例如默认参数用任何合适同源性算法确定序列同源性(或同一性)。最好使用BLAST算法，参数设定为默认值。BLAST算法详细描述于http://www.nchi.nih.gov/BLAST/blast_help.html，将其通过引用结合到本文中。检索参数定义如下，而且最好设定为定义的默认参数。
当用BLAST评价时，最好将“基本同源”看作EXPECT值至少约7、优选至少约9和最优选10或更高的序列。BLAST检索的EXPECT的默认阈值通常为10。
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx使用的探试检索算法；这些程序利用少许增强的Karlin和Altschul的统计学方法(参见http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html)对其发现进行显著性检验。使BLAST程序适于进行序列相似性检索，以便例如鉴定查询序列的同源物。该程序一般不适用于主题型检索。关于序列数据库的相似性检索的基本问题讨论，见Altschul等，(1994)Nature Genetics 6:119-129。
在http://www.ncbi.nlm.nih.gov可获得5个BLAST程序进行以下工作：blastp比较氨基酸查询序列与蛋白序列数据库；blasm比较核苷酸查询序列与核苷酸序列数据库；blastx比较核苷酸查询序列(双链)的6个读框概念翻译产物与蛋白序列
数据库；tblastn比较蛋白查询序列与所有6个读框(双链)动态翻译的核苷酸序
列数据库；tblastx比较核苷酸查询序列的6个读框翻译与核苷酸序列数据库的6
个读框翻译。
BLAST采用以下检索参数：
HISTOGRAM显示每次检索评分(score)的直方图；默认值为是(yes)。(参见BLAST手册的参数H)。
DESCRIPTIONS限定匹配序列的简短描述的数目，以具体数字报告；默认限定值是100条描述。(参见手册页的参数V)。另外参见EXPECT和CUTOFF。
ALIGNMENTS将数据库序列限定于报告为高评分区段对(HSP)的具体数字；默认限值为50。如果更多的数据库序列符合报告的统计学显著性阈值(见下文的EXPECT和CUTOFF)，则只报告统计学显著性最大的匹配。(参见BLAST手册中的参数B)。
EXPECT是相对于数据库序列的报告序列匹配的统计学显著性阈值；默认值是10，因此，按照Karlin和Altschul的统计学模型(1990)认为10个匹配只是偶然发现。如果匹配统计学显著性大于EXPECT阈值，则不能报告匹配。较低的EXPECT阈值更严格，使报告的匹配的机会性更小。分数值是可接受的(参见BLAST手册中的参数E)。
CUTOFF是报告高评分区段对的临界评分。根据EXPECT值计算默认值(见上文)。只有当其统计学显著性至少高至等于CUTOFF临界值的评分的单一HSP时，报告HSP为数据库序列。CUTOFF临界值越高，则报告序列匹配的机会性就越小。(参见BLAST手册的参数S)。通常用EXPECT能够更直观地处理显著性阈值。
MATRIX指定BLASTP、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX的变更评分矩阵。默认矩阵是BLOSUM62(Henikoff&Henikoff,1992)。有效的变更选择包括：PAM40、PAM120、PAM250和IDENTITY。BLASTN没有可用的变更评分矩阵；指定BLASTN请求的MATRIX命令返回错误应答。
STRAND将TBLASTN检索刚好限定在数据库序列的上链或下链；或者将BLASTN、BLASTX或TBLASTX检索刚好限定于查询序列的上链或下链的读框。
如果按Wootton&Federhen(1993)Computers and Chemistry 17:149-163的SEG程序测定，FILTER屏蔽组成复杂性小的查询序列的区段；如果按Claverie&States(1993)Computers and Chemistry 17:191-201的XNU程序测定或者对于BLASTN按Tatusov和Lipman(见http://www.nchi.nlm.nih.gov)的DUST程序测定，FILTER屏蔽短周期性的内重复序列组成的区段。筛选可从blast输出筛除具有统计学显著性但是没有生物学意义的报告(例如找到常见的富含酸性氨基酸、碱性氨基酸或脯氨酸的区)，保留相对于数据库序列特异性匹配的查询序列的更具有生物学意义的区。
用核苷酸序列中的字母“N”(例如“NNNNNNNNNNNNN”)和蛋白序列中的字母“X”(例如“XXXXXXXXX”)代替筛选程序发现的复杂性低的序列。
筛选只适用于查询序列(或其翻译产物)，而不适用于数据库序列。BLASTN的默认筛选是DUST，其它程序的默认筛选是SEG。
当应用于SWISS-PROT序列时，SEG、XNU或二者常常什么也不能屏蔽，所以不能期望筛选总能产生作用。而且在某些情况下，整个序列全被屏蔽，说明应该怀疑对未筛选的查询序列报告的任何匹配的统计学显著性。
除了访问名称和/或位置名称之外，输出时显示NCBI-gi CausesNCBI gi用户标识符。
最优选采用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST提供的简单BLAST检索算法比较序列。
而且，本发明包括在低、中等或高严格条件中的任何一种条件下能够与GenBank M94454所示的核酸序列杂交的核酸序列编码的多肽。
杂交的严格性是指一些条件，在所述条件下多核酸杂种分子是稳定的。这样的条件对本领域一般技术人员而言是显而易见的。本领域技术人员已知，杂种分子的解链温度(Tm)反映杂种分子的稳定性，序列同源性每降低1％，解链温度约降低1-1.5℃。一般来说，杂种分子的稳定性是钠离子浓度和温度的函数。通常在高严格条件下进行杂交反应，然后以变化的严格性进行洗涤。
本文所用的高严格性是指只允许在1M Na+、65-68℃下形成稳定杂种分子的核酸序列进行杂交的条件。例如在含有6×SSC、5×Denhardt试剂、1％SDS(十二烷基硫酸钠)、0.1焦磷酸钠和作为非特异性竞争物的0.1mg/ml变性鲑精DNA的水溶液中进行杂交可以获得高严格条件。杂交后，可以几个步骤进行高严格洗涤，最后一次洗涤(约30分钟)在0.2-0.1×SSC、0.1％SDS中于杂交温度下进行。
中等严格性是指等同于在上述溶液中但是于约60-62℃进行杂交的条件。在此情况下，最后一次洗涤在1×SSC、0.1％SDS中于杂交温度下进行。
低严格性是指等同于在上述溶液中于约50-52℃下杂交的条件。在此情况下，最后一次洗涤在2×SSC、0.1％SDS中于杂交温度下进行。
当然可用各种缓冲液例如基于甲酰胺的缓冲液以及不同温度应用上述条件，并重复一次。Denhardt溶液和SSC同其它合适的杂交缓冲液一样是本领域众所周知的(参见例如Sambrook等编辑(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York或Ausubel等编辑(1990)Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,Inc.)。必须经验性确定最佳杂交条件，因为探针的长度和GC含量也对其有影响。
而且，本发明有利提供在严格条件下能够与GenBank M94454或NM005204所示的核酸序列(分别参见SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3)的片段杂交的核酸序列。所述片段优选是15-50个碱基长度。最好它为约25个碱基长度。
如果按照本文提供的指导，本发明的核酸可按照本领域周知的方法获得。例如可利用聚合酶链反应(PCR)通过化学合成或者通过筛选从认为含有TPL-2并以可检测水平表达TPL-2的来源制备的基因组文库或合适的cDNA文库获得本发明的DNA。
合成目的核酸的化学法是本领域已知的，包括三酯法、亚磷酸酯法、亚磷酰胺和H-磷酸酯法、PCR和其它自动引物法以及在固体支持物上的寡核苷酸合成。如果所述核酸的全部核酸序列是已知的或者可获得与所述编码链互补的核酸序列，则可使用这些方法。另一方面，如果已知目的氨基酸序列，人们可用每个氨基酸的已知和优选编码残基推测潜在的核酸序列。
分离编码TPL-2的基因的替代方法可使用按例如Sambrook等，1989中的14小节中所述的PCR技术。该方法需要使用将与TPL-2核酸杂交的寡核苷酸探针。选择寡核苷酸的策略如下所述。
用设计来鉴定目的基因或由其编码的蛋白的探针或分析手段筛选文库。对于cDNA表达文库，合适的材料包括识别并特异性结合TPL-2的单克隆抗体或多克隆抗体；编码已知的或可疑的来自相同或不同物种的TPL-2 cDNA的约20-80个碱基长度的寡核苷酸；和/或编码相同基因或杂交基因的互补或同源cDNA或其片段。筛选基因组DNA文库的合适探针包括但不限于编码相同或杂交DNA的寡核苷酸、cDNA或其片段；和/或同源基因组DNA或其片段。
通过用探针筛选在合适杂交条件下的合适cDNA或基因组文库，可分离编码TPL-2的核酸，所述探针即本文公开的核酸，包括可衍生自GenBank登录号M94454或NM005204所示序列(分别参见SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:3)的寡核苷酸。合适的文库可从市场上获得，或者可以由例如细胞系、组织标本等制得。
本文所用的探针是例如单链DNA或RNA，它们具有含10-50个连续碱基、优选15-30个连续碱基、最优选至少约20个连续碱基的核苷酸序列，所述连续碱基其数量等于或大于M94454所示连续碱基数，或与M94454所示连续碱基互补。选作探针的20个核酸序列的长度应该足够长而且遍在性足够小，使得假阳性结果最小。所述核苷酸序列一般基于TPL-2的保守的或高度同源的核苷酸序列或区。用作探针的核酸可以在一个或多个位置是简并性的。当从不知道其优选密码子使用的物种中筛选文库时，使用简并寡核苷酸可能特别重要。
由其构建探针的优选区包括5’和/或3’编码序列、预期编码配体结合位点的序列等。例如本文公开的全长cDNA克隆或其片段可用作探针。最好用杂交时检测简便的合适标记措施标记本发明的核酸探针。例如合适的标记措施是放射性标记。标记DNA片段的优选方法是在随机引发的反应中混合DNA聚合酶的Klenow片段和α-32P dATP，这是本领域众所周知的。通常用α-32P-标记的ATP和多核苷酸激酶对寡核苷酸进行末端标记。但是，其它方法(例如非放射性标记法)也可用来标记所述片段或寡核苷酸，包括例如酶标记、采用合适荧光团的荧光标记和生物素化标记。
例如用含有基本完整的TPL-2编码序列的DNA的一部分或基于所述DNA的一部分的合适寡核苷酸筛选所述文库后，通过检测杂交信号鉴定阳性克隆；所鉴定克隆的特征在于限制酶图谱和/或DNA序列分析，然后通过与本文给出序列比较进行检测，以确定它们是否含有编码完整TPL-2的DNA(即它们是否含有翻译起始密码子和终止密码子)。如果选定的克隆是不完整的，则可用它们再筛选相同或不同文库，以获得重叠克隆。如果所述文库是基因组文库，那么所述重叠克隆可能包括外显子和内含子。如果所述文库是cDNA文库，那么所述重叠克隆将含有可读框。在这两种情况下，通过与本文提供的DNA和推定的氨基酸序列比较可以鉴定完整克隆。
“结构决定簇”意味着所述衍生物保有至少一种TPL-2结构特征。结构特征包括具有能够重现天然产生的TPL-2多肽的至少一种生物活性的结构基元。因此，本发明提供的TPL-2包括由初级转录物可变剪接产生的mRNA编码的剪接变体、氨基酸突变体、糖基化变异体和保有至少一种TPL-2的生理特性和/或物理特性的TPL-2的其它共价衍生物。典型的衍生物包括其中通过取代、化学方法、酶学方法或利用非天然产生氨基酸的部分的其它合适途径共价修饰本发明的蛋白的分子。所述非天然产生氨基酸的部分是可检测到的部分例如酶或放射性同位素。所述TPL-2衍生物还包括见于特定物种、尤其是哺乳动物的天然产生的TPL-2变异体。这种变异体可由同一基因家族的相关基因或特定基因的等位变异体编码，或者这种变异体是TPL-2基因的可变剪接变体。
观测到TPL-2的C末端对于与p105的相互作用是必需的。因此，按照本发明的TPL-2分子优选保有天然产生的TPL-2的C末端部分。按照本发明的TPL-2分子优选至少保有天然产生的TPL-2例如M94454代表的TPL-2的氨基酸398-468。
按照本发明的TPL-2分子最好包括TPL-2的氨基酸350-468；优选为TPL-2的氨基酸300-468；优选为TPL-2的氨基酸250-468；优选为TPL-2的氨基酸200-468；最优选为TPL-2的氨基酸131-468。
另一方面，按照本发明的TPL-2分子包含M94454所示的7个TPL-2外显子中的至少一个。所以，所述TPL-2分子最好包含氨基酸425-468(外显子7)；最好它包含氨基酸343-424(外显子6)；优选它包含氨基酸256-342(外显子5)；优选它包含氨基酸169-255(外显子4)；优选它包含氨基酸113-168(外显子3)；优选它包含氨基酸1-112(外显子2)；或者以上的任何一种组合。
而且，本发明外延至以上定义的这类片段的同源物。
如上所述，保有共同结构决定簇的衍生物可以是TPL-2的片段。TPL-2片段包括其各个结构域以及衍生自所述结构域的较小多肽。最好是，衍生自按照本发明的TPL-2的较小的多肽确定了一个为TPL-2特征的功能域。在理论上片段几乎可以是任何大小，前提是它们保有一种TPL-2特征。片段最好是4-300个氨基酸长度。更长的片段被认为是对全长TPL-2的截短所致，而且它通常包括在术语“TPL-2”定义内。
TPL-2衍生物还包括其可含有氨基酸缺失、添加或取代的突变体，前提是它保有至少一种TPL-2特征。因此，可以进行保守的氨基酸取代而基本上不改变TPL-2的性质，从N末端截短就可以做到这一点。而且可以对本发明包括的TPL-2片段进行缺失和取代。可以使编码TPL-2的DNA在体外进行诱变，导致例如一个或多个氨基酸的添加、交换和/或缺失，从而由所述DNA产生TPL-2突变体。例如通过重组的方法可制备TPL-2的取代、缺失或插入突变体，并筛选与天然形式的TPL-2的交叉免疫反应性。
TPL-2的片段、突变体和其它衍生物优选保有与TPL-2的显著同源性。本文使用的“同源性”是指两种实体共有的足够特征，以便技术人员确定它们在来源和功能上的相似性。同源性优选用来指序列同一性，而且按以上定义确定序列同一性。
在一个实施方案中，不同形式的TPL-2蛋白包括例如称为COT的人TPL-2同源物的不同氨基酸区，特别包括例如氨基酸残基30-397的人TPL-2多肽(即COT(30-397))、氨基酸残基30-467的人TPL-2多肽(即COT(30-467))、氨基酸残基1-397的人TPL-2多肽(即COT(1-397))和氨基酸残基1-467的人TPL-2多肽(即COT(1-467))。这些不同形式的TPL-2多肽可以与本领域已知的各种免疫标记物或亲和标记物融合，以有助于纯化特定多肽。标记物包括但不限于FLAG标记物、GST(谷胱甘肽S转移酶)和聚组氨酸残基例如His6。此外，本发明还包括工程后具有例如需要的蛋白酶剪切位点的多肽，所述蛋白酶剪切位点可插入上述标记物的邻近部位，有助于在纯化蛋白后将其去除。
因此，可表达本发明的TPL-2多肽，通过免疫沉淀从本文所述的例如转染的人293A细胞或从例如杆状病毒感染的昆虫细胞纯化TPL-2多肽。通常杆状病毒感染的昆虫细胞允许大量纯化适合大量筛选化学文库的重组表达蛋白。制备TPL-2分子的其它方法在下文描述。1c．制备TPL-2分子
本发明包括产生用于调节如上所述的p105活性的TPL-2分子。TPL-2分子最好通过重组DNA技术产生，利用重组DNA技术可将编码TPL-2分子的核酸掺入载体中，以进行进一步操作。本文使用的载体(或质粒)是独立元件，它用来将外源DNA导入细胞，以使其表达或复制。所述载体的选择和使用均是本领域技术人员熟知的。可使用许多载体，而合适载体的选择取决于载体的预定用途(即它用于扩增DNA还是表达DNA)、需要插入所述载体中的DNA的大小和将用所述载体转化的宿主细胞。根据每种载体的功能(扩增DNA还是表达DNA)以及与其匹配的宿主细胞，每种载体含有不同的组分。所述载体组分一般包括但不限于以下组分中的一种或多种组分：复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子、转录终止序列和信号序列。
表达载体和克隆载体一般均含有能够使所述载体在一种或多种选定的宿主细胞中复制的核酸序列。通常在克隆载体中，该序列是使所述载体能够独立于所述宿主染色体DNA复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。对于各种细菌、酵母和病毒而言，这种序列是众所周知的。质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，2p质粒复制起点适用于酵母，而各种病毒复制起点(例如SV 40、多瘤病毒、腺病毒)适用于哺乳动物细胞的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分，除非在能够高水平复制DNA的哺乳动物细胞(例如COS细胞)中使用复制起点。
大多数表达载体是穿梭载体，即它们能够在至少一类生物体中复制，但是可转染入另一类生物体表达。例如，在大肠杆菌中克隆一种载体，然后将该载体转染入酵母细胞或哺乳动物细胞，但是它不能独立于宿主细胞染色体进行复制。DNA也可以通过插入宿主基因组而进行复制。但是，编码TPL-2的基因组DNA的回收比外源性复制载体的回收更复杂，因为需要限制酶消化切除TPL-2 DNA。DNA能够通过PCR扩增并直接转染入宿主细胞，而不需要任何复制组分。
最好是表达及克隆载体含有也称为选择标记的选择基因。该基因编码在选择培养基中培养的转化宿主细胞生存或生长所必需的蛋白。没有被含有所述选择基因的载体转化的宿主细胞不能在所述培养基中存活。通常选择基因编码的蛋白质赋予抗生素以及其它毒素例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素抗性；赋予互补的营养缺陷；或者提供不能从复合培养基获得的关键营养素。
关于适用于酵母的选择基因标记，可使用因为所述标记基因的表型表达而有助于选择转化体的任何标记基因。合适的酵母标记例如是赋予抗生素G418、潮霉素或博莱霉素抗性的标记，或者为营养缺陷酵母突变体供给原养的标记，例如URA3、LEU2、LYS2、TRP1或HIS3基因。
因为载体的复制通常在大肠杆菌中进行，所以最好包括大肠杆菌遗传标记和大肠杆菌复制起点。它们可从大肠杆菌质粒获得，大肠杆菌质粒例如有pBR322、Bluescript载体或pUC质粒，例如pUC18或pUC19质粒，它们同时含有大肠杆菌复制起点和赋予抗生素如氨苄青霉素抗性的大肠杆菌遗传标记。
适用于哺乳动物细胞的选择标记是能鉴定可吸收TPL-2核酸的细胞的选择标记，例如二氢叶酸还原酶(DHFR，氨甲喋呤抗性)、胸腺嘧啶激酶或赋予G418或潮霉素抗性的基因。将所述哺乳动物细胞转化体置于选择压力下，在该选择压力下只有吸收并表达所述标记的转化体才能存活。如果是DHFR或谷氨酰胺合酶(GS)标记，选择压力施加是通过在所述选择压力进行性增强的条件下培养所述转化体，由此导致所述选择基因和编码TPL-2的连锁DNA扩增(在其染色体整合位点)。扩增过程是在所述重组细胞的染色体上串联性重复对于产生生长关键性蛋白大量需要的基因和与其紧密连接的编码目的蛋白的基因。一般通过由此扩增的DNA合成增加量的目的蛋白。
表达以及克隆载体一般含有所述宿主生物体识别并与TPL-2核酸有效连接的启动子。这种启动子可以是诱导型或组成型启动子。通过用限制酶消化来源DNA取出所述启动子，然后将分离的启动子序列插入所述载体，从而将启动子与编码TPL-2的DNA有效连接。天然TPL-2启动子序列和许多异源启动子启动子均可用来控制TPL-2 DNA的扩增和/或表达。术语“有效连接”是指其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系状态的并列。与编码序列“有效连接”的控制序列的连接方式使得可在适合所述控制序列的条件下实现表达所述编码序列。
适用于原核生物宿主的启动子包括例如β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂种启动子例如tac启动子。它们的核苷酸序列均已公布，所以技术人员能够采用提供任何需要的限制位点的接头将其与编码TPL-2的DNA有效连接。用于细菌系统的启动子也一般含有与编码TPL-2的DNA有效连接的Shine-Delgamo序列。
优选的表达载体是含有能够在细菌中起作用的嗜菌体(例如phagex或T7)启动子的细菌表达载体。在一个最广泛使用的表达系统中，编码所述融合蛋白的核酸通过T7 RNA聚合酶从所述载体转录(Studier等，Methods in Enzymol.185；60-89,1990)。在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌株与pET载体结合使用时，T7 RNA聚合酶从宿主细菌的\-溶原体DE3产生，而且其表达处于IPTG诱导型lac UV5启动子控制之下。已成功将该系统用于过量产生许多蛋白。或者通过用int-嗜菌体例如市售获得的CE6嗜菌体(Novagen,Madison,USA)感染可将所述聚合酶基因导入λ嗜菌体。其它载体包括含有λPL启动子的载体例如PLEX(Invitrogen,NL)、含有trc启动子的载体例如p TrcHisXpressTm(Invitrogen)或pTrc99(Pharmacia Biotech,SE)或含有tac启动子的载体例如pKK223-3(Pharmacia Biotech)或PMAL(new England Biolabs,MA,USA)。
此外，按照本发明的TPL-2基因优选包含分泌序列，以便促进所述多肽从细菌宿主分泌，因而它以可溶性天然肽而不是以包涵体产生。可根据情况从所述细菌的周质间隙或培养基回收所述肽。
适用于酵母宿主的启动子序列是调节型或组成型启动子序列，并优选衍生自高表达的酵母基因尤其是酿酒酵母基因。因此可以使用TRPl基因、ADIH或ADHII基因、酸性磷酸酶(PH05)基因的启动子；接合编码a或a因子的信息素基因的酵母启动子；或衍生自编码糖酵解酶的基因的启动子，例如以下糖酵解酶的启动子：烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)、3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡糖异构酶或葡糖激酶基因；酿酒酵母GAL 4基因启动子；S.pombe nmt l基因启动子或TATA结合蛋白(TBP)基因的启动子。此外，可以使用含有一种酵母基因的上游激活序列(UAS)和另一种酵母基因的下游启动子元件(包括有功能的TATA盒)的杂种启动子，例如包含酵母PH05基因的UAS和下游启动子元件(包括酵母GAP基因的有功能的TATA盒)的杂种启动子(PH05-GAP杂种启动子)。合适的组成型PH05启动子有例如去除上游调节元件(UAS)的缩短的酸性磷酸酶PH05启动子，如起始于PH05基因的核苷酸-173而终止于核苷酸-9的PH05(-173)启动子元件。
在哺乳动物宿主中从载体转录的TPL-2基因可受控于衍生自病毒基因组的启动子或异源哺乳动物启动子以及通常与TPL-2序列连接的启动子，前提是这类启动子与所述宿主细胞系统匹配，所述病毒例如多瘤病毒、腺病毒、禽痘病毒、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、逆转录病毒和猿猴病毒40(SV40)，所述异源哺乳动物启动子诸如肌动蛋白启动子或非常强的启动子如核糖体蛋白启动子。
通过在所述载体中插入增强子序列可增强高等真核生物转录编码TPL-2的DNA。增强子的取向和位置相对独立。已知哺乳动物基因(例如弹性蛋白酶和球蛋白)的许多增强子序列。但是人们一般使用真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点后侧的SV40增强子(bp100-270)和CMV早期启动子增强子。可在TPL-2 DNA的5’或3’位置将所述增强子剪接入所述载体中，但是优选增强子位于所述启动子的5’位置。
编码TPL-2的真核生物表达载体最好含有基因座控制区(LCR)。LCR能够控制高水平整合部位独立表达整合入宿主细胞染色质的转基因，当TPL-2基因将在所述载体整合入染色体的永久性转染的真核细胞系中表达时，LCR特别重要，其中所述载体设计用于基因治疗用途和转基因动物。
真核表达载体也含有转录终止和稳定mRNA必需的序列。这类序列常常可得自于真核生物或病毒DNA或cDNA的5’和3’非翻译区。这些区含有转录为编码TPL-2的mRNA的非翻译部分的聚腺苷酸片段的核苷酸区段。
表达载体包括能够表达TPL-2核酸的任何载体，所述TPL-2核酸与能够表达所述DNA的调节序列如启动子区有效连接。因此，表达载体是指当导入合适宿主细胞时导致所述克隆DNA表达的重组DNA或RNA构建物，例如质粒、嗜菌体、重组病毒或其它载体。合适的表达载体是本领域众所周知的，包括可在真核生物和/或原核生物细胞中复制的载体以及保持游离的载体或整合入宿主细胞基因组的载体。例如编码TPL-2的DNA可插入适合在哺乳动物细胞中表达cDNA的载体中，所述载体例如是基于CMV增强子的载体如pEVRF(Matthias等，(1989)NAR 17,6418)。
使得编码TPL-2的DNA在哺乳动物细胞中瞬时表达的表达载体对于实施本发明特别有用。瞬时表达通常涉及使用能够在宿主细胞中有效复制的表达载体，使得所述宿主细胞累积许多拷贝的表达载体，然后合成高水平的TPL-2。为了本发明的目的，瞬时表达系统用于例如鉴定TPL-2突变体，以鉴定潜在的磷酸化位点或表征所述蛋白的功能域。
应用常规连接技术构建按照本发明的载体。将分离的质粒或DNA片段切割、加尾并以产生所需要质粒的需要方式重新连接。如果需要，用已知方法进行分析以确证在所构建的质粒中的正确序列。构建表达载体、制备体外转录物、将DNA导入宿主细胞中并分析评价TPL-2的表达和功能的合适方法是本领域技术人员已知的。例如直接用适当标记的基于本文提供的序列的探针通过常规DNA印迹法、定量mRNA转录的RNA印迹法、点印迹法(DNA或RNA分析)或原位杂交，可测定基因在样品中的存在、扩增和/或表达。如果需要的话，本领域技术人员将容易地设计如何改进这些方法。
因此本发明包括用编码异源TPL-2分子的载体转化的宿主细胞。本文使用的外源TPL-2分子可以是突变型内源TPL-2、或者突变型或野生型外源TPL-2。
TPL-2最好可在昆虫细胞系统中表达。适用于本发明方法的昆虫细胞一般包括能够用表达载体转化并因此表达由其编码的异源蛋白的任何鳞翅目昆虫细胞。特别优选应用Sf细胞系，例如草地夜蛾细胞系IPBL-SF-21 AE(Vaughn等，(1997)In vitro,13,213-217)。特别优选衍生的细胞系Sf9。但是可以使用其它细胞系，例如Tricoplusia ni 368(Kurstack和Marmorosch,(1976)Invertebrate Tissue Culture Applicationsin Medicine,Biology and Agriculture,Academic Press,New York,USA)。这些细胞系以及适用于本发明的其它昆虫细胞系可市售获得(例如从Stratagene,La Jolla,CA,USA获得)。
除了在培养的昆虫细胞中表达之外，本发明还包括在完整的昆虫生物体中表达TPL-2蛋白。应用病毒载体例如杆状病毒可感染整个昆虫，昆虫生长在一定程度上比培养细胞容易，因为它不怎么要求特殊的生长条件。大昆虫例如蚕蛾提供高产率的外源蛋白。可按照常规提取技术从昆虫提取所述蛋白。
适用于本发明的表达载体包括能够在昆虫细胞系中表达上述蛋白的所有载体。一般而言，用于哺乳动物和其它真核细胞的载体也适用于昆虫细胞培养物。特别优选特异性用于昆虫细胞培养物的杆状病毒载体，而且它可广泛市售获得(例如从Invitrogen和Clotech获得)。能够感染昆虫细胞的其它病毒载体是已知的，例如新培斯病毒(Hahn等，(1992)PNAS(USA)89,2679-2683)。精选的杆状病毒载体(综述于Miller(1988)Ann.Rev.Microbiol.42,177-199)是苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒AcMNPV。
一般所述异源基因至少部分取代AcMNPV的多角体基因，因为产生病毒不需要多角体。为了插入所述异源基因，最好使用转移载体。在大肠杆菌宿主中制备转移载体，然后将所述DNA插入片段通过同源重组转移到AcMNPV中。2．TPL-2是药物开发的靶
按照本发明，TPL-2分子用作鉴定化合物例如药物前导化合物的靶，所述化合物能够通过p105蛋白酶解和Rel亚单位释放调节NFκB活性。因此本发明涉及一种测定并提供鉴定能够直接或间接调节p105活性的一种或多种化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将TPL-2分子与需要评价的一种或多种化合物温育；和
(b)鉴定影响TPL-2分子活性的化合物。2a．TPL-2结合化合物
按照这方面发明的第一个实施方案，应用所述测定检测直接与TPL-2分子结合的多肽。
因此本发明提供鉴定NFκB活性调节剂的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将TPL-2分子与需要评价的一种或多种化合物温育；和
(b)鉴定与TPL-2分子结合的化合物。
最好所述方法还包括以下步骤：
(c)评价与TPL-2结合的化合物在基于细胞的测定中调节NFκB活化的能力。
可用本领域技术人员已知的任何技术评价与TPL-2的结合。
合适测定的实例包括检测体内相互作用的双杂交测定系统、亲和层析测定(例如包括结合至固定在柱上的多肽)、其中所述化合物和TPL-2的结合与结合对中的一个或两个配偶体荧光变化有关的荧光测定等。优选在细胞内进行测定，例如双杂交测定。
在该实施方案的一个优选方面，本发明提供鉴定用于治疗涉及或利用炎症反应的疾病的药物的前导化合物的方法，包括在除了存在待测化合物之外TPL-2与具有参比亲合性的p105缔合的条件下使待测化合物与TPL-2分子和p105温育；
测定在待测化合物存在下TPL-2对p105的结合亲和力；和
选择相对于参比结合亲和力调节TPL-2对p105的结合亲和力的化合物。
所以，在不存在待测化合物或存在参比化合物的情况下校正按照本发明的测定，所述参比化合物与TPL-2的结合活性是已知的或者其活性用作参比值是理想的。例如在双杂交系统中，参比值可在没有任何化合物的情况下获得。加入增强TPL-2与p105的结合亲和力的化合物使所述测定的读数高于所述参比水平，而加入降低该亲和力的化合物导致测定读数低于所述参比水平。2b．调节有功能的p105/TPL-2相互作用的化合物
在第二个实施方案中，本发明具体检测化合物和TPL-2的有功能的相互作用。在调节水平的TPL-2时发生这种相互作用，使得这种激酶本身在对待测化合物的反应中活化或失活，或者在调节TPL-2对p105的生物效应的水平时发生所述相互作用。本文使用的“活化”和“失活”包括化合物对酶活性或其它活性的调节作用以及其对生产速率的调节作用，例如激活或抑制多肽在细胞中的表达。该术语包括对基因转录的控制作用，以调节表达基因产物。
检测对TPL-2和p105的有功能的相互作用的调节作用的测定优选为基于细胞的测定。例如它们可基于对p105磷酸化程度的评价，TPL-2-p105相互作用导致p105磷酸化，其磷酸化程度指示NFκB活化程度。
在优选的实施方案中，编码TPL-2分子的核酸连接入载体并导入合适宿主细胞中，产生表达TPL-2分子的转化细胞系。然后生产所获得的细胞系，以可重复性定性和/或定量分析潜在化合物影响TPL-2功能的作用。因此可用表达TPL-2的细胞鉴定调节TPL-2功能的化合物、特别是低分子量化合物。因此表达TPL-2的宿主细胞可用于药物筛选，本发明的另一目的是提供鉴定调节TPL-2活性的化合物的方法，所述方法包括使含有编码TPL-2的异源DNA的细胞暴露于试图检测其调节所述TPL-2活性的能力的至少一种化合物或化合物的混合物或信号，其中所述细胞产生有功能的TPL-2，然后监测所述细胞由所述调节作用引起的变化。这种测定使得能够鉴定TPL-2的调节剂，例如激动剂、拮抗剂和变构调节剂。本文使用的调节TPL-2活性的化合物或信号是指改变TPL-2活性的化合物，其改变方式使得在所述化合物或信号存在下TPL-2激活p105的活性不同(与缺乏所述化合物或信号时比较)。
可通过构建细胞系设计基于细胞的筛选测定，其中报告蛋白(即容易检测的蛋白，例如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)或荧光素酶)的表达依赖于34 TPL-2激活p105。例如编码一种上述多肽的报告基因可以处于特异性激活p50的NFκB反应元件控制之下。当p50杂二聚体激活所述元件时，必须保证以预期水平表达可变的Re1单体。这种测定使得可检测直接调节TPL-2功能的化合物，例如拮抗TPL-2引起的p105磷酸化的化合物或者抑制或增强TPL-2活性需要的其它细胞功能的化合物。
替代形式的测定包括直接评价生物系统的炎症反应的测定。已知不受调节的组成型表达p50使动物产生炎症表型。基于细胞的系统例如依赖于细胞因子释放或细胞增殖的测定可用来评价p50的活性。
在本发明该实施方案的一个优选方面，提供鉴定用于治疗涉及或利用炎症反应的疾病的药物前导化合物的方法，包括：
在其中除了存在待测化合物之外，TPL-2以参比磷酸化效率直接或间接磷酸化p105的条件下，使待测化合物与TPL-2分子和p105温育；
测定在待测化合物存在下TPL-2直接或间接引起p105磷酸化的能力；以及选择相对于参比磷酸化效率具有调节TPL-2磷酸化p105的能力的化合物。
当TPL-2间接磷酸化靶多肽例如p105时，可能涉及其它激酶，所以按照本发明该实施方案的测定最好具体检测TPL-2对靶多肽或p105的间接磷酸化作用。
在又一优选方面，本发明涉及鉴定药物前导化合物的方法，包括以下步骤：
提供纯化的TPL-2分子；
将所述TPL-2分子与被TPL-2磷酸化的已知底物以及受试化合物温育；以及
鉴定能够调节所述底物的磷酸化的受试化合物。
TPL-2磷酸化的底物是MEK(EMBOJ.15:817-826,1996)。所以优选MEK用作底物，以监测能够调节TPL-2激酶活性的化合物。在另一实施方案中，所述受试底物可以是任何合适的TPL-2靶多肽例如MEK-1、SEK-1、IκB-α、IκB-β、NF-κBl p105、NFκB和TPL-2/COT本身。本发明特别提供重组融合蛋白构建物，以使这类底物例如成为常规的典型融合蛋白。在一个优选的实施方案中，典型融合蛋白包括例如GST-IκB-α(1-50)即IκB-α的氨基酸残基1-50与GST融合以及GST-p105Ndel.498(包含p105的残基498-969)。TPL-2/COT的其它肽底物可衍生自这些蛋白底物，而且包括例如IκB-α衍生的肽NH2-DDRHDSGLDSMKDKKK-COOH(其中粗体丝氨酸残基相当于IκB-α的丝氨酸残基32)和MEK衍生的肽NH2-QLIDSMANSFVGTKKK-COOH(其中粗体丝氨酸残基相当于MEK-1的丝氨酸残基217)。本文所述的这些靶多肽和其它TPL-2靶多肽使得本领域技术人员可以直接筛选激酶调节剂。激酶调节剂优选为激酶(TPL-2)抑制剂。
然后可任选地使所鉴定的受试化合物进行体内测试，以确定其对TNF/p105产生的原信号通路(例如以上实施方案中给出的信号通路)的作用。2c．调节TPL-2活性的化合物
本文使用的“TPL-2活性”可以是指任何TPL-2活性，包括其结合活性，但是特别指TPL-2的磷酸化活性。因此，本发明可具体为检测TPL-2对靶化合物的磷酸化作用以及潜在治疗药物对该活性的调节作用。
调节TPL-2的磷酸化活性的化合物实例包括TPL-2本身的显性失活突变体。这类化合物能够与TPL-2的靶竞争，因此降低TPL-2在生物或人工系统中的活性。所以，本发明另外还涉及能够调节TPL-2磷酸化活性的化合物。3．化合物
在再一方面中，本发明涉及可通过本发明前述方面定义的测定方法鉴定的一种或多种化合物。因此提供应用可通过本文所述测定鉴定的化合物调节NFκB活性。
影响TPL-2/NFκB相互作用的化合物几乎可以是任何常规类型，包括低分子量化合物，包括可以是线性、环形、多环或其组合的有机化合物，肽，多肽(包括抗体)或蛋白。一般来说，本文使用的“肽”、“多肽”和“蛋白”可以认为是相同的。3a．抗体
本文使用的抗体是指能够结合选定靶的完整抗体或抗体片段，包括Fv、ScFv、Fab’和F(ab’)2、单克隆抗体和多克隆抗体、工程抗体(包括嵌合型抗体、CDR-移植性抗体和人源化抗体)以及用嗜菌体展示或替代技术产生的人工选定抗体。因为小片段例如Fv和ScFv较小并因而具有良好的组织分布，所以所述小片段在诊断和治疗应用中具有有利的特性。
特别说明按照本发明的抗体用于诊断和治疗用途。因此它们可以是经改变的抗体，包括效应蛋白例如毒素或标记物。特别优选为允许对所述抗体的体内分布成象的标记物。这类标记物可以是放射性标记物或不透射线的标记物例如金属颗粒，它们容易在患者体内显现。此外，它们可以是荧光标记物或在从患者取出的组织标本中显现的其它标记物。
可用重组DNA技术改进本发明的抗体。因此可构建嵌合型抗体，以便降低其在诊断或治疗应用中的免疫原性。而且通过CDR移植[参见欧洲专利申请0239400(Winter)]以及任选改进构架[参见国际专利申请WO90/07861(Protein Design Labs)]人源化所述抗体，可使得免疫原性最小化。
按照本发明的抗体可得自动物血清，或者如果是单克隆抗体或其片段时，以细胞培养物产生本发明抗体。可用重组DNA技术按照所建立的方法在细菌或优选哺乳动物细胞培养物中产生所述抗体。所选定的细胞培养系统优选分泌所述抗体产物。
因而本发明包括产生按照本发明的抗体的方法，包括培养宿主细胞例如大肠杆菌或哺乳动物细胞以及分离所述蛋白，其中所述宿主细胞是用包括表达盒的杂合载体转化的宿主细胞，所述表达盒含有与编码信号肽的第一DNA序列有效连接的启动子，所述第一DNA序列以合适的读框与编码所述蛋白的第二DNA序列连接。
在合适的培养基中体外增殖杂交瘤细胞或哺乳动物宿主细胞，所述培养基是常规标准培养基，例如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)或RPMI 1640培养基，在培养基中任选加入哺乳动物血清例如胎牛血清或微量元素和持续生长添加物，例如饲养细胞如正常小鼠腹膜渗出物细胞、脾细胞、骨髓巨噬细胞、2-氨基乙醇、胰岛素、转铁蛋白、低密度脂蛋白、油酸等。同样在本领域已知的合适培养基中增殖细菌或酵母宿主细胞，例如在培养基LB、NZCYM、NZYM、NZM、Terrific Broth、SOB、SOC、2×YT或M9基本培养基中增殖细菌细胞，而在培养基YPD、YEPD、基本培养基或CompleteMinimal Dropout培养基中增殖酵母细胞。
体外生产提供相对纯的抗体制剂，使得可以放大产生大量的所需抗体。细菌细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞培养技术是本领域已知的，包括例如在气升式反应器或持续搅拌反应器中的均一悬浮培养；或者例如在中空纤维、微囊、琼脂糖微珠和陶瓷盒(cartridge)中的固定或截留细胞培养。
通过在体内增殖哺乳动物细胞也可以获得大量需要抗体。为此，可将产生需要抗体的杂交瘤细胞注射入组织型匹配的哺乳动物，使产生抗体的肿瘤生长。注射前任选用碳氢化合物尤其是矿物油如降植烷(四甲基-十五烷)激发(prime)所述动物。1-3周后，从这些哺乳动物的体液分离所述抗体。例如通过将合适的骨髓瘤细胞与产生抗体的Balb/c小鼠的脾细胞融合获得的杂交瘤细胞或衍生自产生需要抗体的杂交瘤细胞系Sp2/0的转染细胞注入Balb/c小鼠腹膜内，所述小鼠任选用降植烷预处理，1-2周后，从所述动物取出腹水。
上述技术以及其它技术，例如在Kohler和Milstein,(1975)Nature256:495-497；US4,376,110；Harlow和Lane,Antibodies:a LaboratoryManual,(1988)Cold Spring Harbor中所讨论的技术，均通过引用将它们结合到此处。制备重组抗体分子的技术描述于上述参考文献，另外还描述于例如EP0623679；EP0368684和EP0436597，均通过引用将其结合到此处。
最好通过免疫印迹、酶免疫测定(例如夹层测定或点测定)或放射免疫测定经免疫荧光染色表达TPL-2的细胞筛选细胞培养上清液中的需要抗体。
为了分离所述抗体，例如可用硫酸铵沉淀、对疏水性物质如聚乙二醇进行透析、通过选择性膜过滤等浓缩培养上清液或腹水中的免疫球蛋白。必要和/或需要时，用常规层析方法如凝胶过滤、离子交换层析、经DEAE-纤维素层析和/或(免疫)亲和层析(例如用TPL-2分子或A蛋白进行亲和层析)纯化所述抗体。
本发明还涉及分泌本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞。本发明的优选杂交瘤细胞是分泌具有需要特异性的本发明单克隆抗体的遗传稳定细胞，而且可通过解冻和再克隆深度冰冻的培养物进行活化。
本发明还涉及制备分泌针对TPL-2分子的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法，该方法的特征在于用纯化的TPL-2分子、含纯化TPL-2分子的抗原性载体或用带有TPL-2的细胞免疫合适的哺乳动物如Balb/c小鼠，将得自免疫哺乳动物的产抗体细胞与合适的骨髓瘤细胞系细胞融合，克隆融合中获得的杂种细胞，选择分泌需要抗体的细胞克隆。例如将得自用带有TPL-2细胞免疫的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系PAI或骨髓瘤细胞系Sp2/0-Ag14的细胞融合，从所获得的杂种细胞筛选分泌需要抗体的杂种细胞，克隆阳性杂交瘤细胞。
制备杂交瘤细胞系的优选方法的特征在于用含有合适佐剂的表达TPL-2的人肿瘤来源的107-108细胞皮下和/或腹膜内注射免疫Balb/c小鼠，在数月(例如2-4个月)内免疫注射数次例如4-6次，而且在最后一次注射后2-4天从免疫的40只小鼠中取出脾细胞，在融合起动物质、优选聚乙二醇存在下将其与骨髓瘤细胞系PAI细胞融合。最好在含有约30％-约50％分子量约4000的聚乙二醇溶液中将所述骨髓瘤细胞与3-20倍过量的得自免疫小鼠的脾细胞融合。融合后以规律的间隔在补加选择培养基(例如HAT培养基)的如前所述的合适培养基中对所述细胞进行扩增，以防止正常骨髓细胞生长超过所需要的杂交瘤细胞。
本发明还涉及包含编码针对本文前述TPL-2分子的抗体的重链可变域和/或轻链可变域的插入片段的重组DNA。根据定义，这类DNA包括编码的单链DNA、由所述编码DNA和其互补DNA或这些互补(单链)DNA本身组成的双链DNA。
此外，编码针对TPL-2分子的抗体的重链可变域和/或轻链可变域的DNA可以是具有编码重链可变域和/或轻链可变域或其突变体的真实DNA序列的酶学合成DNA或化学合成DNA。真实DNA的突变体是编码上述抗体的重链可变域和/或轻链可变域的DNA，其中缺失一个或多个氨基酸或一个或多个氨基酸与一个或多个其它氨基酸交换。所述修饰最好在所述抗体的重链可变域和/或轻链可变域的CDR之外。也可以使这种突变的DNA成为沉默突变，其中一个或多个核苷酸被含有编码相同氨基酸的新密码子的其它核苷酸替代。这种突变序列也可以是简并序列。简并序列是在遗传密码意义上的简并，因为没有限制的核苷酸数可被其它核苷酸取代，而不会改变原来编码的氨基酸序列。这种简并序列是有用的，这归因于其不同的限制位点和/或具体的密码子的频率，所述密码子是所述特定宿主、尤其是大肠杆菌优选密码子，以达到最佳表达鼠类重链可变域和/或鼠类轻链可变域。
术语突变体包括按照本领域已知的方法体外诱变真实DNA获得的DNA突变体。
为了装配完整四聚体免疫球蛋白分子和表达嵌合型抗体，将编码重链和轻链可变域的重组DNA插入片段与相应的编码重链和轻链恒定域的DNA融合，然后例如在导入杂合载体中后转移入合适宿主细胞中。
所以本发明还涉及包含编码针对TPL-2的抗体的鼠类重链可变域的插入片段的重组DNA，所述重链可变域与人类恒定γ域融合，γ域例如为γ1、γ2、γ3或γ4，其中优γ1或γ4。同样，本发明涉及包含编码针对TPL-2的抗体的鼠类轻链可变域的插入片段的重组DNA，该轻链可变域与人类恒定域κ或λ融合，其中恒定域优选为恒定域κ。
在另一实施方案中，本发明涉及编码重组多肽的重组DNA，其中所述重链可变域和轻链可变域借助于间隔基连接，所述重组DNA任选包含促进所述抗体在所述宿主细胞中加工的信号序列和/或编码促进所述抗体纯化的肽的DNA和/或切割位点和/或肽间隔基和/或效应分子。
编码效应分子的DNA是指编码在诊断和治疗应用中有用的效应分子的DNA。因此特指毒素或酶尤其是能够催化前体药物活化的酶的效应分子。编码这种效应分子的DNA具有天然产生的酶或毒素的编码DNA或其突变体的序列，而且可用本领域周知的方法制得。
按照本发明的抗体和抗体片段在诊断和治疗中是有用的。因此本发明提供用于治疗或诊断的组合物，包括按照本发明的抗体。
如果是诊断用组合物时，所述抗体最好与检测所述抗体的物质一起提供，所述检测物质可以是酶物质、荧光物质、放射性物质或其它物质。所述抗体和所述检测物质可以以诊断用诊断试剂盒提供，以同时应用、同时分别应用或序贯应用。3b．肽
按照本发明的肽有效衍生自TPL-2、p105或参与有功能的TPL-2/p105相互作用的另一种多肽。所述肽优选衍生自与p105/TPL-2相互作用有关的所述TPL-2或p105结构域。例如Thomberry等，(1994)Biochemistry 33:39343940和Milligan等，(1995)Neuron 15:385-393描述了应用修饰的四肽抑制ICE蛋白酶。例如可用醛基、氯甲基酮、(酰氧基)甲基酮或CH2OC(0)-DCB基以类似的方式修饰衍生自TPL-2、p105或相互作用蛋白的肽，以抑制TPL-2/p105相互作用。
为了有助于将肽化合物传递至细胞，可修饰肽以提高其跨过细胞膜的能力。例如US5,149,782公开了应用融合形成肽、构成离子通道的肽、膜肽、长链脂肪酸和其它膜融合剂以增强蛋白跨过所述细胞膜。在WO97/37016和US5,108,921中也描述了这些以及其它方法，该文献通过引用结合到本文中。
按照本发明的许多化合物可以是用于药物开发的前导化合物。有用的前导化合物特别为抗体和肽，尤其是在基因治疗细胞中表达的细胞内抗体，所述前导化合物可用作开发肽或低分子量治疗药物的典型化合物。在本发明的一个优选实施方案中，前导化合物和TPL-2/p105或其它靶肽可共结晶，以有助于设计模拟用所述前导化合物观测到的相互作用的合适低分子量化合物。
结晶涉及制备结晶缓冲液，例如用形成结晶必需的低浓度沉淀剂优选以1∶1比率混合所述肽或肽复合物溶液与“贮藏缓冲液”。为了形成结晶，例如通过加入沉淀剂、滴定或通过结晶缓冲液和贮藏缓冲液之间的扩散平衡沉淀剂的浓度，提高所述沉淀剂的浓度。在合适条件下沿沉淀剂梯度产生这种沉淀剂的扩散，例如从含有较高浓度沉淀剂的贮藏缓冲液扩散入沉淀剂浓度较低的结晶缓冲液中。例如通过允许常规气相扩散的蒸汽扩散技术可达到扩散。已知技术例如为蒸汽扩散法，如“悬滴”或“连续滴(sitting drop)”法。在蒸汽扩散法中，含有所述蛋白的结晶滴悬挂在大得多的贮藏缓冲液池之上或连续滴在贮藏缓冲液池的旁边。另一方面，通过分隔结晶缓冲液和贮藏缓冲液而且防止所述蛋白稀释性进入贮藏缓冲液中的半透膜可达到平衡所述沉淀剂。
在所述结晶缓冲液中，所述肽或肽/结合配偶体复合物的浓度优选高达30mg/ml，优选为约2mg/ml-约4mg/ml。
在基本上由以下参数决定的不同条件下可达到形成结晶，所述参数为：pH、存在的盐和添加剂、沉淀剂、蛋白质浓度和温度。pH范围为4.0-9.0。缓冲剂的浓度和类型不是非常重要，所以例如可根据需要的pH改变缓冲剂的浓度和类型。合适的缓冲系统包括磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、Tris、MES和HEPES缓冲液。有用的盐和添加剂包括例如盐酸盐、硫酸盐和本领域技术人员已知的其它盐。所述缓冲液含有沉淀剂或合适的盐，所述沉淀剂选自水混溶性有机溶剂，优选为100-20000、优选4000-10000分子量的聚乙二醇，所述盐例如硫酸盐特别是硫酸铵、盐酸盐、柠檬酸盐或酒石酸盐。
例如通过重原子衍生作用可化学修饰按照本发明的肽或肽/结合配偶体复合物的晶体。简而言之，这种衍生作用可通过将晶体浸在含有重金属原子盐或能够扩散通过所述晶体并结合在所述蛋白表面的有机金属化合物实现，所述有机金属化合物例如氯化铅、硫羟苹果酸金、乙基汞硫代水杨酸钠或乙酸双氧铀。通过对浸泡晶体进行X射线衍射分析可确定结合的重金属原子的部位，该信息可用来例如构建所述肽的三维模型。
例如通过晶体的重金属原子衍生物和/或所述结晶作用提供的全部或部分结构数据可获得三维模型。构建这种模型最好包括同源性模型和/或分子置换。
通过综合与任何一种MAPKK激酶或其结构已知的NFκB(包括IκBα,Bauerle等/，(1998)Cell95:729-731)的序列对比、预期的二级结构以及筛选结构文库可建立初步的同源性模型。例如可用合适的软件程序对比TPL-2和候选肽的序列。
也可以用计算机软件预测所述肽或肽复合物的二级结构。所述肽序列可加入TPL-2结构中。通过筛选具有需要长度和合适构象的肽结构文库可模拟结构不相干性例如在插入/缺失附近的结构片段。为了预测侧链构象，可利用侧链旋转异构体文库。
最终的同源性模型用来通过用合适计算机软件经分子置换解决所述肽的晶体结构问题。根据分子置换结果决定同源性模型的位置，并对其进行进一步的精确定位，包括分子力学计算和将结晶用抑制剂转化为电子密度的模型设计。3c．其它化合物
在一个优选的实施方案中，上述测定用来鉴定肽，而且也用来鉴定可调节TPL-2活性(例如激酶活性、靶多肽的相互作用或信号活性)的不是基于肽的受试化合物。采用包括本领域已知的组合文库法的许多方法中的任何一种可获得本发明的受试化合物，所述方法包括：生物文库、可访问空间平行固相(spatially addressable parallel solid phase)或溶液相文库；需要去卷积的合成文库法；‘一珠一化合物’文库法以及利用亲和层析选择的合成文库法。这些方法适用于肽、非肽寡聚体或小分子化合物文库(Lam,K,S.(1997)Anticancer Drug Des.12:145)。
在本领域中可找到合成分子文库的方法实例，例如在以下文献中有这样的实例：DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad Sci.US.A.90:6909；Erb等(1994)Proc.Natl.Acad Sci.USA 91:11422；Zuckermann等(1994)J.Med.Chem.37:2678；Cho等(1993)Science 261:1303；Carrell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；和Gallop等(1994)，Med.Chem.37:1233。
化合物文库可存在于溶液中(例如Houghten(1992)Biotechniques13:412-421)、存在于珠子上(Lam(1991)Nature 354:82-84)、存在于碎片上(Fodor(1993)Nature 364:555-556)、存在于细菌上(Ladner USP5,223,409)、存在于孢子上(Ladner USP’409)、存在于质粒上(Cull等(1992) Prac Natl Acad Sci USA 89:1865-1869)或存在于嗜菌体上(Scott和Smith(1990)Science 249:389-390)；(Devlin(1990)Science 249:404-406)；(Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad Sci87:6378-6382)；(Felici(1991)J.Mol.Biol.222:301-310)；(Ladner同上)。
需要的话，可将本文所述的任何一种化合物文库分为包括例如具有特定化学结构或特定活性如激酶抑制活性的化合物的预选文库。预选化合物文库可还包括使用任何本领域已知的分子模型，以便鉴定可能具有特定活性、反应位点或其它需要化学官能度的特定化合物或特定组别化合物或特定组合的化合物。在一个实施方案中，使用用来鉴定具有或可能具有激酶抑制活性的分子模型预选TPL-2的调节剂。
本领域已知的合适方法可用来选择与TPL-2或靶组分例如p105的特定结构域相互作用的特定部分。例如可用特别利用三维模型的目测检查。最好用计算机模型程序或软件选择可与特定结构域作用的一个或多个部分。合适的计算机模型程序包括QUANTA(MolecularSimulations,Inc.,Burlington,MA(1992))、SYBYL(Tripos Associates,Inc.,St.Louis,MO(1992))、AMBER(Weiner等，J.Am.Chem.Soc.106:765-784(1984))和CHARMM(Brooks等，J.Comp.Chem.4:187-217(1983))。可用来选择相互作用部分的其它程序包括GRID(OxfordUniversity,U.K.；Goodford等，J.Mod.Chem.28:849-857(1985))；MCSS(Molecular Simulations,Inc.,Burlington,MA；Miranker,A.和M.Karplus,Proteins:Structure,Function and Genetics 11:29-34(1991))；AUTODOCK(Scripps Research Institute,La Jolla,CA；Goodell等，Proteins:Structure,Funtions and Genetics:195-202(1990))；和DOCK(University of Califomia,San Francisco,CA；Kuntz等，J.Mol.Biol.161:269-288(1982)。
在选定有效的相互作用部分后，可将其连接至可以适于与选定结构域作用的方式提供它们的支架上。例如用物理或计算机产生的三维模型或用合适的计算机程序如CAVEAT(University of Califomia,Berkeley,CA；Bartlett等，“Molecuar Recognition of in Chemecal andBiological Problems”,Special Pub.,Royal Chemical Society 78:182-196(1989))、三维数据库系统如MACCS-3D(MDL Information Systems,SanLeandro,CA(Martin,Y.C.,J.Mod.Chem.35:2145-2154(1992))；以及HOOK(Molecular Simulations,Inc.)可目测确定合适支架和其上的作用部分的空间分布。可用于设计和/或评价有效TPL-2抑制剂的其它计算机程序包括LUDI(Biosym Technologies,San Diego,CA；Bohm H.J.,J.Comp.Aid.Molec.Design:61-78(1992))、LEGEND(MoleculaarSimulations,Inc.；Nishibata等，Tetrahedron 47:8985-8990(1991))和LeapFrog(Tripos Associates,Inc.)。
另外，模拟蛋白-药物相互作用的各种技术是本领域已知的，并可在本发明方法中使用(Cohen等，J.Med.Chem.33:883-894(1994)；Navia等Current Opinions in Structural Biology 2:202-210(1992)；Baldwin等，J.Mod.Chem.32:2510-1513(1989)；Appelt等，J.Mod.Chem.34:1925-1934(1991)；Ealick等，Proc.Nat.Acad.Sci USA 88:11540-11544(1991))。
所以，可装配化合物文库，所述化合物例如是基于蛋白质、基于碳水化合物、基于脂质、基于核酸、基于天然有机物、基于合成产生的有机物或基于抗体的化合物，而且如果需要的话，使所述化合物文库进一步进行包括上述模型技术中的任何一种的预选步骤。然后可以从本领域已知的来源如商业来源选定用这些模型技术确定为TPL-2调节剂的合适候选化合物，或者用本领域已知的技术合成所述候选化合物，所述化合物含有用所述分子模型预测的具有活性例如TPL-2抑制剂活性的需要部分。然后可使用这些化合物构建用本文所述的测定进行筛选的较小或较大的靶向受试化合物文库。
因此，需要的TPL-2激酶抑制剂的受试文库可包括例如化合物N-(6-苯氧基-4-喹啉基)-N[4-(苯硫基)苯基]胺。如下一般合成4-(4-苯基硫代-苯胺基)-喹啉基衍生物。向在1,2-二甲氧基乙烷和二氯乙烷的1∶1(v/v)混合物中的0.1M 4-羟基-5-氧代-5,6,7,8-四氢-3-喹啉羧酸乙酯溶液中加入四氯化碳(10mol相当量)和结合聚合物的三苯膦(3-6相当量；Fluka)。于80℃在密封管形瓶中振摇下加热混合物36小时。加入4-(苯硫代)苯胺(2-6mol相当量；0.5M叔丁醇溶液)并在密封管形瓶中振摇下加热混合物至90℃24小时。然后，滤除聚合物树脂并用甲醇洗涤。在高真空下浓缩合并的滤液和洗涤物，并用RP-HPLC层析残余物。通过进行分析性RP-HPLC/MS(0-100％乙腈/pH4.5,50mM醋酸铵，流速为3.5mL/min,Perkin Elmer Pecosphere柱(4.6mm×3cm)),5-氧代-4-[4-(苯硫基)苯胺基]-5,6,7,8-四氢-3-喹啉羧酸乙酯的保留时间为3.85分钟，MH+m/z419。
为了特别制备N-(6-苯氧基-4-喹啉基)-N-[4-(苯硫基)苯基]胺(分析性RP-HPLC RT:4.32分钟；MS:MH+421)，利用4-羟基-6-苯氧基-喹啉和4-(苯硫代)苯胺进行上述方法。
也可选择一种相关化合物5-氧代-4-[4-(苯硫基)苯胺基]-5,6,7,8-四氢-3-喹啉羧酸乙酯和/或其变异体用于所述文库，可用标准技术和以下方法产生该化合物。简而言之，在0.1M 4-羟基-5-5,6,7,8-四氢-3-喹啉羧酸乙酯的乙二醇二甲醚和二氯乙烷的1∶1混合物溶液中加入10相当量的四氯化碳和3-6相当量的结合聚合物的三苯膦。然后将混合物加热至80℃36小时。加入过量的4-硫代苯基苯胺(2-6相当量)的250μl叔丁醇溶液，并加热混合物至90℃24小时。然后滤除聚合物树脂，用甲醇洗涤，在高真空下去除残留溶剂获得所需要的受试化合物。
预测4-(4-苯硫代-苯胺基)-喹啉基(及其衍生物)代表一类化合物物质，在这一类物质中包含适用于抑制激酶例如色氨酸/苏氨酸激酶的化合物(如COT)。因此本发明包括含有图14所示核心结构的任何化合物。在一个实施方案中，所述喹啉环系统可以是例如二氢喹啉环系统或四氢喹啉环系统(参见图14的例如虚线)。此外，R和R’基可独立选自：羟基、卤基、-NHC(O)烷基、-COOH、-C(O)O-烷基、-C(O)NH-烷基、C1-C6-链烯基、C1-C6-链炔基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、芳氧基、取代的芳氧基、C1-C6-烷基硫代基、C1-C6-烷基氨基、氰基、全卤代甲基、全卤代甲氧基、氨基、一或二烷基氨基、芳基、取代的芳基、ara-烷基和ara-烷氧基。另外，应该指出的是R’也可以是(R’)n，其中n=0,1,2等，使得允许例如多个R’取代。还应该指出的是烷基、链烯基和/或烷酰基(alkyonyl)可以是直链或支链。而且本发明包括含有或衍生自图14所示通式结构的任何盐或者适当时包括例如类似物、游离碱形式、互变异构体、对映体外消旋物或它们的组合。
受试文库的另一种合适化合物是3-(4-吡啶基)-4,5-二氢-2H-苯并[g]吲唑甲磺酸盐和/或其变异体，该化合物一般可从Aldrich ChemicalCo.,Inc.购买获得(登记号80997-85-9)。
所述文库还可包括化合物2-氯苯并[l][1,9]菲咯啉-7-羧酸钠和/或其变异体，可用标准的本领域已知的技术和采用图12所示的结构产生该化合物。
本领域技术人员知道可用各种本领域已知的技术对前述化合物进行所需要的标准修饰，本发明包括这些修饰化合物。
在一个实施方案中，一种测定是基于细胞的测定或无细胞测定，其中使表达例如TPL-2多肽的细胞或含有TPL-2的细胞裂解液/或纯化蛋白与受试化合物接触，并检测所述受试化合物改变TPL-2活性例如激酶活性、靶多肽相互作用或信号活动的能力。
基于细胞测定中的任何一种测定可用例如真核生物或原核生物来源的细胞。例如通过将受试化合物与放射性同位素或酶标记物偶联，使得可通过检测复合物中的标记化合物检测受试化合物与所述多肽的结合，从而可检测所述受试化合物结合TPL-2或TPL-2靶多肽的能力。例如可用125I、35S、14C、33P、32P或3H直接或间接标记受试化合物，并通过直接计数辐射放射或液闪计数检测放射性同位素。或者可用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶酶学标记受试化合物，并通过适当底物转化为产物的测定检测酶标记物。
测定受试化合物与靶多肽相互作用的能力而没有标记任何反应物也属于本发明范围。例如可用微型生理仪(microphysiometer)检测受试化合物与TPL-2或靶多肽的相互作用而没有标记所述受试化合物、TPL-2或靶多肽(McConnell,H.M.等(1992)Science 257:1906-1912)。在再一实施方案中，本发明的测定是无细胞测定，其中使例如TPL-2和靶多肽与受试化合物接触，并测定受试化合物改变所述作用的能力。这种相互作用包括或不包括TPL-2和/或TPL-2靶多肽的磷酸化。可直接或间接测定所述受试化合物与所述靶多肽的结合。也可用技术如实时生物分子相互作用分析(BIA)(Sjolander,S.和Urbaniczky,C.(1991)Anal.Chem.63:2338-2345和Szabo等(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705)检测所述候选化合物结合所述两种多肽中的任何一种多肽的能力。本文使用的“BIA”是实时研究双特异性的相互作用而不标记任何一种反应物的技术(例如BIAcoreTM)。光学现象表面质粒基因组共振(SPR)的变化可用于指示生物分子之间的实时反应。
在测试化合物和天然提取物文库的许多药物筛选程序中，最好是高效测定以便使在特定时间内测量的化合物数最多。在无细胞系统中进行的测定，例如可用纯化或半纯化蛋白进行的测定，它们通常称为“初级”筛选，因为所述测定的进行可允许快速展开和相对容易检测受试化合物介导的分子靶的变化。而且，在体外系统中一般可忽略受试化合物的细胞毒性和/或生物利用度作用，相反体外测定主要关注所述药物对所述分子靶的作用，该作用可表现为与上游或下游元件的结合亲和力的变化。因此，在本发明的典型筛选测定中，使目的化合物与TPL-2多肽接触，同时与或者不与TPL-2靶多肽例如p105(Kieran等，1990,Cell 62:1007-1018，另外参见登记号M37492)或IκB-α(Zabel等，1990,Cell 61:255-265)接触，并用例如放射性同位素通过评价化合物抑制磷酸化TPL-2和/或TPL-2靶多肽形成的效力，从而测定以及定量TPL-2和/或靶多肽的磷酸化。通过根据用不同浓度的受试化合物获得的数据产生的剂量反应曲线可评价所述受试化合物的效力。而且也可进行对照测定以提供比较基础。在另一实施方案中，测试不同候选化合物并与已知活性的对照化合物例如具有已知普通活性或特异性活性的抑制剂进行比较，从而可确定所述受试化合物的特异性。所以，需要的话，可使用一般的激酶抑制剂例如星形孢菌素(参见例如Tamaoki等，1986,Biochem.Biophys.Res.Comm.135:397-402；Meggio等，1995,Eru.J.Biochem.234:317-322)或例如特异性激酶抑制剂如可市售获得的抑制剂PD98059(一种有效的MEK抑制剂，参见例如Dudley等，1995,P.N.A.S.92:7686-7689)和SB203580(一种有效的p38 MAP激酶抑制剂，参见例如Cuenda等，1995,FEBSLett.364:229-233)。
在本发明的上述测定法的一个以上的实施方案中，最好固定所述靶多肽，以有助于分离复合形式与非复合形式或者适应所述测定的自动化(参见例如实施例4)。可在适合装量所述反应物的任何容器中完成存在或缺乏所述受试化合物的情况下TPL-2和靶多肽的磷酸化或结合。这种容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可提供加入允许所述蛋白中的一种或两种均与一种基质结合的结构域的融合蛋白。例如谷胱甘肽S转移酶/靶多肽融合蛋白可吸附在谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical,St.Lousis,MO)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板，然后将其与受试化合物混合并在有助于磷酸化或复合物形成的条件(例如盐和pH的生理条件)下进行温育。温育后，洗涤所述珠或微量滴定板孔去除任何未结合的组分，如果是珠子则固定所述基质，而且例如如上所述直接或间接检测所述复合物。或者所述复合物可与所述基质解离，用标准技术可测定靶多肽的结合或磷酸化活性水平。在本发明的筛选测定中也可用将蛋白质固定在基质上的其它技术。
在本发明的再一方面，TPL-2和靶多肽可用作双杂交或三杂交测定中的“饵蛋白”(参见例如美国专利第5,283,317号；Zervos等(1993)Cell 72:223-232；Madura等(1993)J.Biol.Chem.268:12046-12054；bartel等(1993)Biotechniques 14:920-924；Iwabuchi等(1993)Oncogene8:1693-1696；和Brent WO94/10300)，以鉴定与TPL-2和/或TPL-2靶多肽结合或相互作用的其它蛋白或化合物。
本发明还涉及用上述筛选测定鉴定的新物质以及涉及利用这些测定产生这类物质的方法。因此，在一个实施方案中，本发明包括可用包括任何一种上述筛选测定(例如基于细胞的测定或无细胞测定)步骤的方法获得的化合物或物质。例如在一个实施方案中，本发明包括可用本文所述的任何一种方法获得的化合物或物质。
因此，进一步在合适的动物模型中应用按本文所述鉴定的一种物质例如TPL-2分子或化合物属于本发明范围。例如可在动物模型中应用按本文所述鉴定的物质以确定用这种物质治疗的效力、毒性或副作用。或者可在动物模型中应用按本文所述鉴定的物质以确定这种物质的作用机理。此外，适当时可将这种物质给予人类个体，优选给予炎症性疾病风险个体。
本发明还涉及应用上述筛选测定鉴定的新物质诊断、预测预后和治疗本文所述的任何一种疾病。因此，在设计、配方、合成、制备和/或生产用于诊断、预测预后和治疗本文所述任何一种疾病的药物或药用组合物中应用这类物质属于本发明范围。4．药用组合物
在一个优选的实施方案中，提供包含可用本发明前述方面定义的测定方法鉴定的化合物的药用组合物。
按照本发明的药用组合物是包括作为活性成分能够调节TPL-2的p105磷酸化活性的一种或多种化合物组成的组合物。通常所述化合物为药学上可接受的任何盐形式或者例如适当时为其类似物、游离碱形式、互变异构体、对映体外消旋物或它们的组合。设计包括按照本发明的活性成分在内的药用组合物的活性成分，使其例如当以取决于特定病例的剂量给予时在肿瘤或与细胞增殖有关的其它疾病、感染和炎症性病症治疗中具有良好的治疗活性。例如本发明包括能够改变TPL-2信号活动的任何化合物。在一个实施方案中，所述化合物能够抑制TPL-2活性，导致参与炎症的基因的调节异常。例如抑制TPL-2活性而由此降低TNF基因表达的化合物是治疗例如炎症性疾病的优选化合物。在一个优选实施方案中，按照本发明的方法鉴定的化合物可用于治疗炎症性疾病例如类风湿性关节炎、多发性硬化症(MS)、炎症性肠病(IBD)、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、脓毒病、牛皮癣、TNF介导的疾病和移植排斥反应。在另一实施方案中，本发明的一种或多种化合物可与在治疗任何一种上述病症时已知适合治疗具体适应症的本领域已知的任何化合物联合使用。因此，本发明的一种或多种化合物可与已知适合治疗上述适应症的本领域已知的一种或多种化合物混合，使得可以方便地给予所述对象单一组合物。
可以调节剂量方案以获得最佳治疗反应。例如每日可给予几个分剂量或者根据治疗情况的要求指征可按比例降低剂量。
可以以常规方式例如口服、静脉内(当是水溶性药物时)、肌内、皮下、鼻内、皮内或栓剂途径或植入(例如用缓释分子)给予所述活性成分。根据给予途径，可能需要用一种材料包衣所述活性成分，保护该成分不受酶、酸和可以使所述成分失活的其它天然条件的作用。
为了胃肠内给予所述活性成分，用避免其失活的材料将其包衣或者与避免其失活的材料一起给予。例如所述活性成分可用辅助剂给予、与酶抑制剂共同给予或以脂质体给予。在其最广义上使用辅助剂，包括任何免疫刺激化合物例如干扰素。本文涉及的辅助剂包括间苯二酚、非离子表面活性剂例如聚氧乙烯油醚和正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰腺胰蛋白酶。
脂质体包括水包油包水CGF乳剂以及常规脂质体。
也可以胃肠外或腹膜内给予所述活性成分。也可以在甘油、液体聚乙二醇和它们的混合物中以及在油中制备分散剂。在常规贮藏和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
适合注射用的药物形式包括无菌水溶液(当是水溶性的时)或分散剂和用于临时制成无菌注射溶液或分散剂的无菌粉。在所有情况下，所述形式必须是无菌的而且必须是容易注射的流体。在制造和贮藏条件下必须稳定而且必须防腐抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。所述载体可以是溶剂或含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物以及植物油的分散介质。例如可以通过使用包衣如卵磷脂包衣、如果是分散剂通过保持需要的颗粒大小以及通过应用表面活性剂能够维持适当的流动性。
可用各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、thirmerosal等防止微生物的作用。在许多情况下最好包含等渗剂，例如糖或氯化钠。在所述组合物中应用延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝和明胶能够延长注射组合物的吸收。
用合适溶剂混合需要量的所述活性成分和以上列举的各种其它成分制得无菌注射溶液，然后根据需要过滤除菌。一般而言，在含有基本分散介质和以上列举的其它需要成分的无菌溶媒中加入无菌活性成分制得分散剂。如果是用于制备无菌注射溶液的无菌粉时，制备的优选方法是真空干燥以及冷冻干燥技术，由前述其除菌过滤溶液获得所述活性成分粉和其前任何其它需要成分。
当所述活性成分如上所述经适当保护时，可以用例如惰性稀释剂或可吸收食用载体口服给予，或者所述活性成分可装入硬壳或软壳明胶胶囊中，或者可压入片剂中，或者可直接掺入日常饮食的食物中。对于口服治疗药物的给予，所述活性成分可掺入赋形剂中，而且使用的形式可以是摄食片、颊片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等。将获得的在这些治疗性应用的组合物的活性成分的量是合适的剂量。
所述片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等也可以含有以下组分：粘合剂例如西黄蓍树胶、金合欢胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂例如磷酸二钙；崩解剂例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂例如硬脂酸镁；以及甜味剂例如蔗糖、乳糖或者可加入糖精，或者调味剂例如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当所述单位剂型是胶囊时，除了上述类型的物质之外，它还可以含有液体载体。
各种其它物质可以作为包衣存在或者相反改进所述剂型的物理形式。例如可用虫胶、糖或此二者对片剂、丸剂或胶囊剂进行包衣。糖浆剂或酏剂可以含有所述活性成分、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂如樱桃或橙调味剂。当然，在制备任何剂型中使用的任何物质应该是药物纯而且在使用量情况下基本无毒。此外，所述活性成分可掺入缓释制剂以及配方中。
本文使用的“药学上可接受的载体和/或稀释剂”包括任何以及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这样的用于药物活性物质的介质和各种添加剂是本领域周知的。除了在任何常规介质或添加剂与所述活性成分不匹配的情况之外，在所述治疗药物组合物中均可应用它们。也可以在所述组合物中加入辅助活性成分。
特别优选将胃肠外组合物配制成单位剂型以便易于给药以及剂量均一。本文使用的单位剂型是指适合用作所治疗哺乳动物对象的单位剂量的物理性分开的单位；每一个单位含有经计算将结合需要的药用载体产生需要治疗效应的预定量的活性物质。本发明的新单位剂型的规格取决于以及直接依赖于(a)所述活性物质的独特特性以及需要达到的具体治疗效应，和(b)配方技术固有的限制，例如用于在惠有影响机体健康的疾病的活的个体治疗疾病的活性物质。
对所述主要活性成分进行配方，以单位剂型中的有效量和合适的药学上可接受的载体常规而有效地给予。如果是含有辅助活性成分的组合物时，参考常规剂量和给予所述成分的方式确定剂量。
再一方面提供单独或联合适合治疗特定适应症的本领域已知的化合物用于治疗疾病的本文前面定义的本发明的活性成分。因而提供应用本发明的活性成分生产用于治疗与NFκB诱导或抑制有关的疾病的药物。
此外，提供治疗与NFκB诱导或抑制有关的病症的方法，包括给予受试者有效治疗量的可用上述测定方法鉴定的化合物。
用以下实施例进一步描述本发明，其目的只是阐明本发明。
实施例1鉴定TPL-2和p105的相互作用
为了鉴定可能的TPL-2靶，用改进的接合策略(Fromont-Racine等，(1997)Nature Gene.16:277-282)进行酵母双杂交筛选。亚克隆入pAS2ΔΔ载体的TPL-2 cDNA用作饵以筛选人类肝脏cDNA文库(Legrain博士提供，Pasteur Institute,Paris)。
从平板上的22×106二倍体酵母集落获得68个HIS3选择和LacZ表达的阳性克隆。通过DNA测序鉴定互作蛋白，并通过再转化入酵母证实互作蛋白。
在所获得的68个阳性克隆中的32个克隆编码NF-κBl p105的IκB-样C末端(图2a)。p105与TPL-2的共免疫沉淀，它们通过无细胞翻译一起合成，证实这两种蛋白以高化学计量相互作用(图1b)。用Promega TNT偶联的兔网织红细胞系统经无细胞翻译一起合成TPL-2和p105，并用[35S]-Met(Amersham-Pharmacia Biotech)进行标记。用裂解缓冲液A(Salmeron,A.等(1996)EMBO J.15:817-826)和0.1mg/mlBSA稀释翻译的蛋白，并按以上引用的参考文献所述的方法进行免疫沉淀。用SDS-PAGE解析分离蛋白并用荧光自显影显示。
在其中翻译的p105超过TPL-2的试验中，用抗TPL-2抗体分离的TPL-2/p105复合物的化学计量估计约为1∶1。激酶失活的TPL-2突变体以相似的化学计量和p105结合。
为了在体内证实TPL-2/p105相互作用，从HeLa细胞免疫沉淀内源蛋白。用缓冲液A提取并以100,000g离心15分钟后按文献(Kabouridis等，(1997)EMBO J.16:4983-4998)所述对融合HeLa细胞(90mm培养皿；Gibco BRL)的细胞溶解产物的内源蛋白进行免疫沉淀和蛋白质印迹分析。已经描述了(Salmeron,A等(1996)EMBO J.15:817-826)抗TPL-2抗体TSP3。从所述商业供应商可获得针对NF-κBl(N)(Biomol Research labs)、Rel-A(Santa Cruz)和c-Rel(Santa Cruz)的抗体。抗-myc MAb 3E10(G.Evan博士，ICRF,London)用于myc-p105/myc-p50的免疫沉淀和免疫荧光测定，而抗myc抗血清(Santa Cruz)用于免疫印迹。抗-HA MAb 12CA5用于免疫荧光染色HA-p50。
蛋白质印迹清楚证实p105与TPL-2的特异性共免疫沉淀(图3a)。p105、Rel-A和c-Rel也特异性与TPL-2共免疫沉淀。但是体外试验不能检测到TPL-2和p50(产生自p48突变体；图2b，泳道14)、Rel-A或c-Rel之间的任何直接关系。因此在体内与TPL-2缔合的p105可能通过p105的N末端Rel同源结构域(RHD)与Rel亚单位结合(Ghosh等，(1998)Annu.Rev.Immunol.16:225-260)。
通过用抗-NFκB(N)抗血清免疫耗竭HeLa细胞溶胞产物研究体内TPL-2与p105的相互作用的化学计量。抗-TPL-2免疫沉淀的蛋白质印迹证实实际上在耗竭NF-κBl的细胞溶胞产物中消除了所有可检测到的TPL-2(图3b，最下面一组)。免疫耗竭TPL-2去除了细胞总p105的约50％。所以在HeLa细胞中，基本上全部TPL-2与大部分的总p105复合，与体外结果数据一致，说明发生了高化学计量相互作用(图1b和c)。
实施例2对TPL-2和p105突变体的分析A．缺失突变体
将TPL-2缺失构建物亚克隆入pcDNA3表达载体(Invitrogen)中。利用合适寡核苷酸的PCR在TPL-2 cDNA上加入N末端myc表位-标记物，产生TPL-2缺失突变体(图1a)和TPL-2(A270)激酶失活突变体(未标记)，并通过DNA测序证实。除非在图注中另外指明，否则使用全长TPL-2。以前已经描述了亚克隆入pcDNAl(Invitrogen)或pEF-BOS表达载体的myc-p105缺失突变体和HA-p50(Watanabe等，(1997)EMBO J.16:3609-3620；Fan等，(1991)Nature 354:395-398)，例外的是用PCR产生myc-NΔ-p105并亚克隆入pcDNA3中。在图1所示的试验中，亚克隆在pRc-CMV表达载体(Invitrogen)中的未标记p105 cDNA用于翻译p105(Blank等，(1991)EMBO J.10:4159-4167)。
用TPL-2和p105的缺失突变体按实施例1所述进行免疫沉淀试验表明，这两种蛋白通过其C末端相互作用(图1和2)。其中特别令人感兴趣的是，缺乏所述C末端的TPL-2的致瘤突变体TPL-2AC(Salmeron,A等(1996)EMBO J.15:817-826)不能有效与p105共免疫沉淀(图1b，泳道5和6)。此外，在酵母双杂交测定中刚好在TPL-2C末端的92氨基酸的GAL4融合物与p105C末端(残基459-969)相互作用。在体外TPL-2似乎与p105的C末端中的两个区(一个是最后89个氨基酸而另一个是残基545-777)相互作用(图2b，右侧组)。分离的p105C末端足以与TPL-2形成稳定的复合物(图2c)。B．显性失活的TPL-2
重要的是确立TPL-2表达对p105蛋白酶解的作用(参见下文)反映其正常生理功能。为此，测试激酶失活的TPL-2(A270)阻断激动剂诱导的p105降解的能力。用亚克隆在PMT2载体中的TPL-2(A270)cDNA(5pg)和选择载体J6-Hygro(0.5pg)一起通过电穿孔共转染1×107JurkatT细胞。用PMT2对照载体和J6Hygro共转染对照细胞。通过限制性稀释克隆转染细胞，并对潮霉素抗性(0.5mg/ml)进行选择。用蛋白质印迹测定TPL-2(A270)在所产生的克隆中的表达。用每点8×1063T3细胞对Jurkat克隆进行脉冲追踪代谢标记。
与早期的研究(Mellits等，(1993)Nuc.Acid.Res.21,5059-5066)一样，在稳定表达对照空载体的JurkatT细胞或未转染的原细胞中，TNF-a刺激p105降解(图7a)。但是，TNF-a对转染表达TPL-2(A270)的JurkatT细胞的刺激作用对p105的转换几乎没有影响(图7a)。因此，TNF-a诱导p105降解需要TPL-2活性，而其显性失活突变体的表达可阻断TPL-2活性。
该结果在进一步的试验中得到证实，说明显性失活的TPL-2抑制p105/TNF的转录激活潜力。用驱动荧光素酶基因的TNF诱导的报道构建物如上所述转染Jurkat T细胞。没有激酶结构域的激酶失活的TPL-2或TPL-2的截短C末端的共表达显著降低荧光素酶基因表达(见图8)。
实施例3p105和TPL-2的功能性相互作用(A)NFκB的活化
为了研究TPL-2是否通过p105激活NF-κB，首次测试瞬时转染的TPL-2激活NF-κB报道基因的能力。对于NF-κB报道基因测定，用2μg含有荧光素酶基因上游共有NF-κB增强子元件的5个串联重复序列的质粒(Invitrogen)和指定量合适表达载体一起共转染(Kabouridis等，(1997)EMBO J.16:4983-4998)JurkatT细胞。TPL-2和NIK cDNA均亚克隆在pcDNA3载体中(Salmeron等，(1996)；Malintn等，(1997)Nature 385:540-544)。通过增加空pcDNA3载体使转染DNA量保持恒定。至少进行3次荧光素酶试验(Kabourids等，(1997))，获得相似的结果。
TPL-2表达激活报道基因增加140倍(图3c)，其激活水平与通过刺激降解IκB-a激活NF-κB的相关的MAP 3K酶NIK诱导的水平(Malinin等，(1997)；May,M.J.&Ghosh,S.(1998)Immunol.Today 19,80-88)相似。激酶失活的点突变的TPL-2(A270)对NF-κB诱导没有作用。在体外(图1b)或体内不能与p105形成稳定复合物的TPL-2AC的表达只对NF-κB报道基因产生非常适度的激活作用(12倍)(图3c)。为了证实TPL-2必须与p105复合才能有效激活NF-κB，将p105的C末端片段3’NN(图2a)与TPL-2共表达。此C末端片段与体内共转染的TPL-2相互作用，竞争性结合内源p105。3’NN的共表达明显抑制TPL-2对NF-κB报道基因的激活作用，但是对NIK的激活作用没有影响(图3d)。总而言之，这些数据表明转染的TPL-2有效激活NF-κB，而且这似乎需要与内源p105直接作用。这意味着TPL-2可能直接激活p105。(B)NFκB的核转运
如果TPL-2表达确实激活p105，则会发生NF-κBl核转运。为了研究此作用，用3T3成纤维细胞进行免疫荧光测定，因为在3T3细胞中容易区分胞质和核。简而言之，用指定载体瞬时转染NIH-3T3细胞，并在盖玻片上培养24小时。然后固定、透化处理细胞，并如前所述(Huby等，(1997)J.Cell Biol.137,1639-1649)用指定抗体和合适荧光标记的第二阶段的抗体染色。用Leica TCS NT聚焦显微镜观察一个光区的染色转染细胞。
在用myc-p105单独或和激酶失活的TPL-2(A270)一起转染的细胞中，抗-myc染色限于细胞质(图4a，上面一组)，符合p105作为IκB的作用。然而，与TPL-2共表达导致抗-myc染色基本上定量向核转移(图4a，下面一组)。细胞分级分离和蛋白质印迹证实在TPL-2转染的细胞中的核NF-κB信号是myc-p50而不是限于胞质的myc-p105(图4b)。这些数据提示，TPL-2表达因为共转染的myc-p105加工为myc-p50的增多或者因为其降解释放伴生的myc-p50导致myc-p50的核转运。
为了确定TPL-2是否必须诱导p105蛋白酶解加工以促进p50的核转运，用编码不能加工为myc-p50的myc-p105AGRR的载体和独立质粒上的HA-p50一起转染3T3细胞。当HA-p50与TPL-2(A270)(图5，顶上一组)或空载体共表达时HA-p50定位在核中。myc-p105ΔGRR将HA-50保留在与TPL-2(A270)共转染的细胞质中(图5，中间一组)。然而，TPL-2与myc-p105ΔGRR共表达导致HA-p50染色基本上定量向核转移(图5，下面一组)。所以TPL-2激活的p50核转运不需要刺激p105加工为p50。这些数据支持以下观点：TPL-2诱导p105降解释放伴生的p50或其它相关Rel亚单位，转运到核，由此产生活性NF-κB。(C)NFκB的生物活性
为了证实在共表达TPL-2的细胞中myc-p105产生的核myc-p50具有生物活性，用相对于小鼠Igκ增强子的NF-κB结合位点(Lenardo,M.J.&Baltimore,D.,(1989)Cell 58,227-229)的放射性标记的双链寡核苷酸(Promega)，按文献(Alkalay,I.等，(1995)Mol.Cell.Biol.15,1294-1301)所述进行电泳迁移率变动分析(EMSA)。
TPL-2表达导致两种κB结合复合物的显著增加(图4c，泳道2)，与TPL-2在JurkatT细胞中激活NF-κB报道基因一致(图3c)。单独的myc-p105表达只适度增加较小的κB复合物的结合活性(图4c，泳道3)。然而，myc-p105与TPL-2共表达协同增加较小的κB复合物的结合活性(图4c，泳道4)。激酶失活的TPL-2(A270)对κB结合活性没有作用(图4c，泳道5)。p105的加工缺陷型突变体myc-p105AGRR(Watanabe等，(1997)EMBO J.16:3609-3620)在存在或缺乏共表达的TPL-2的情况下也不能产生κB结合活性(图4c，泳道6和7)。
在TPL-2和myc-p105共转染的细胞中抗-myc MAb与诱导的较小κB复合物强反应，引起超漂移(图4c，泳道8)。证实在该复合物中存在加工的myc-p50。产生的较小复合物不与针对Rel-A(图4c，泳道9)或c-Rel的抗体反应。因此，TPL-2和myc-p105共表达刺激产生NF-κB活性复合物，主要包括在myc-p105转染细胞中过量产生的myc-p50二聚体。对单独用TPL-2转染(图4c，泳道2)的细胞的核提取物进行超漂移分析显示，诱导的主要内源NF-κB复合物由p50/Rel-A二聚体组成(图4c，泳道9)。(D)TPL-2对p105的生物效应
进行脉冲追踪代谢标记，以确定TPL-2是否调节3T3成纤维细胞中的myc-p105的蛋白酶解。为了进行脉冲追踪代谢标记，用脂质转染胺(Gibco-BRL)瞬时转染NIH-3T3成纤维细胞(Huby等，(1997)J.Cell.Biol.137,1639-1649)。按文献(Watanabe等，(1997)EMBO J.16,3609-3620)所述方法制备胞质和核部分。为了进行脉冲追踪代谢标记，用指定表达载体转染2.7×1053T3细胞/60mm培养皿(Nunc)。24小时后，洗涤细胞，并在不含Met/Cys的培养基中培养1小时。然后每个培养皿用145 MBq[35S]-Met/[35S]-Cys(Pro-Mix,Amersham-Phamacia Biotech)标记细胞30分钟，洗涤后在完全培养基中追踪指定时间。用加有0.1％SDS和0.5％脱氧胆酸盐的缓冲液A(RIPA缓冲液)(Salmeron等)裂解细胞，并通过荧光自显影显示免疫沉淀蛋白。在Met/Cys饥饿期的最后15分钟加入2O’1M MG132蛋白酶体抑制剂(Biomol Researchlabs)，并在整个脉冲追踪期间进行保持。用分子动力学专用光密度计通过激光光密度测定法定量标记带。进行全部脉冲追踪试验，至少两次获得相似结果。
与TPL-2共表达降低myc-p105半衰期约5.5-1.8小时(图5a和b)。比较myc-p105降低速率和myc-p50产生速率提示，如前所述(Lin等，(1998)Cell 92,819-828)，大部分myc-p105简单降解而不是转化为myc-p50(图6a)。但是TPL-2共表达不改变产生myc-p50总速率，myc-p50在这些细胞中主要由myc-p105翻译后产生(图6a)，而不是通过最近描述的共同翻译机制产生(Lin等，1998)。因为在TPL-2转染细胞与在对照细胞中的myc-p50产生速率相似，而myc-p105的量进行性减少(图6c)，说明TPL-2显著增加myc-p105加工效率。TPL-2共表达促进myc-p105AGRR的降解(图6d)，类似于野生型p105(图6b)。然而，激酶失活TPL-2(A270)对共表达的myc-p105的降解(图6e)或加工均没有可检测到的效应。
测定蛋白酶体有效抑制剂肽醛MG132的作用，以研究TPL-2诱导的myc-p105蛋白酶解是否是通过蛋白酶体介导的。MG132处理阻断myc-p105的转换增加(图6f)而且在TPL-2共表达细胞中完全阻断产生myc-p50。总之，脉冲追踪代谢标记试验表明TPL-2表达的主要作用是增强蛋白酶体对myc-p105的降解速率。而同时蛋白酶体由myc-p105产生myc-p50的总速率不变。
为了测定TPL-2表达对稳态水平的myc-p105/myc-p50的影响，用指定载体瞬时共转染3T3细胞，并在24小时后用RIPA缓冲液溶解细胞。然后用抗-myc抗血清探测细胞溶胞产物的蛋白质印迹。用激光光密度测定法定量条带。瞬时转染3T3细胞的溶胞产物的蛋白质印迹证实，与对照相比，TPL-2共表达显著增加myc-p50/myc-p105的稳态比(图6g)。
因此在TPL-2转染细胞中，myc-p50表达的摩尔显著超过myc-p105(myc-p50/myc-p105均值=10.3+/-SE 1.3；n=2)，而对照细胞中的myc-p105和myc-p50几乎等摩尔(myc-p50/myc-p105均值=0.93+/-SE 0.07；n=2)。所以，myc-p50转移到TPL-2共转染细胞核中，因为没有足量的myc-p105保持在细胞质中。
NIK磷酸化并激活称为IKK-a(IKK-1)和IKK-α(IKK-2)的两种相关激酶，它们又磷酸化IκB-αN末端的调节性丝氨酸。这引发蛋白酶体的IκB-α遍在作用和降解作用。为了研究磷酸化是否引起与TPL-2共表达的myc-p105的迁移率变动，将洗涤后的抗-myc免疫沉淀物重悬浮在含有50mM Tris-pH7.5、0.03％Brij-96、0.1mM EGTA、1mM DTT、0.1mg/ml BSA的缓冲液中。在适当的样品中加入400U/ml小牛肠道磷酸酶(CIP；Boehringer-Mannheim)，其中含有或没有磷酸酶抑制剂原钒酸钠(1mM)、氟化钠(5mM)和okadaic酸(0.1μm)。于37℃温育1小时后，对免疫沉淀蛋白进行蛋白质印迹分析，并用抗-NF-κBl(N)抗血清探测。
TPL-2对myc-p105降解的刺激作用需要其激酶活性(图6b和e)，说明磷酸化对该作用同样是必需的。总是发现与TPL-2共表达的myc-p105在SDS-PAGE中的迁移更慢(图6a)。这种TPL-2诱导的迁移率变化是由于myc-p105磷酸化所致，正如对磷酸酶体外处理的敏感性所示一样(图7b)。相反，激酶失活TPL-2(A270)不会导致共表达myc-p105的迁移率变化(图7b)。因此，TPL-2对myc-p105蛋白酶解的刺激作用与其诱导的磷酸化有关。与IκB-α类似，可能TPL-2诱导的p105磷酸化促进其遍在作用，由此刺激蛋白酶体对p105的蛋白酶解。
所以，TPL-2是新的信号通路中的一个组分，它通过刺激对NF-κB抑制蛋白p105的蛋白酶体介导的蛋白酶解激活NF-κB。TPL-2增强对p105的降解，而保持p50产生的总速率(图6a)。因此，相关的Re1亚单位本身(可能为二聚体)或者移入细胞核或者与p50产物复合。因为TPL-2与p50、Rel-A和c-Rel特异性共免疫沉淀(图3a)，所以它可以调节存在于细胞中的所有主要p105复合物的蛋白酶解(Rice等，(1992)Cell 71,243-253；Mercurio等，(1993)Gene.Devel.7,705-718)。有趣的是，TPL-2是与NIK最密切同源的激酶(Malinin,1997),NIK调节对IκB-α诱导性降解。所以，导致NF-κB活化的两个信号通路均受相关的MAP 3K-家族酶的调节。
最后，这些数据提出了TPL-2致瘤性活化的潜在机制，它需要TPL-2缺失其C末端(Ceci等，(1997)Gene.Devel.11,688700)。因此，C末端缺失既增强TPL-2表达又使其由于与p105的化学计量作用而释放(图1b)，它们一起可促进不适当的靶蛋白磷酸化。所述靶蛋白可能包括MEK，突变激活时MEK是致瘤性的(Cowley等，(1994)Cell 77,841-852)而且被TPL-2强激活(Salmeron,A等，(1996)EMBO J.15,817-826)。
实施例4用于鉴定TPL-2/COT调节剂的筛选测定(A)利用从转染哺乳动物细胞免疫沉淀的COT蛋白的TPL-2/COT激酶测定
在整个实施例中使用以下材料和方法，除非另有说明。材料和方法
在哺乳动物细胞中表达COT多肽
通过转染在293A细胞中表达FLAG标记的COT蛋白。通常在转染前24小时，以2×106细胞/10cm平板平板接种人293A细胞(Quantum)。在15ml试管中装有60μl脂质转染胺(Gibco)和800μlOptimem(Gibco)制备转染混合物。在另一试管中，向800μl Optimem中加入8μg编码pCDNA载体的FLAG-标记的COT(30-397)基因的DNA。然后用吸管轻轻混合每管内容物，使其在室温下温育25分钟。用Optimem洗涤细胞一次，并与所述转染混合物和6.4ml Optimem温育，使其于37℃和5％CO2下温育5小时。然后在第1天将细胞与8mlDMEM+10％FBS+L-谷氨酰胺温育，在第2天与DMEM+5％FBS+L-谷氨酰胺温育，转染后48小时收获细胞。
免疫沉淀FLAG标记的COT蛋白
在溶胞缓冲液(1％Troton X-100,50mM Tris-HCl pH7.5,150mMNaCl,1mM EDTA,1mM EGTA,20mM NaF,10mM Na4P2O7,50mMNa3VO4和完全蛋白酶抑制剂(Boehinger))中于冰上溶解表达FLAG-COT(30-397)的293A转染细胞15分钟，离心(14,000rpm,10分钟，4℃)溶胞产物，收集上清液。于4℃搅拌下用FLAG Ab凝胶(Sigma)以50μgAb/ml溶胞产物进行免疫沉淀。于4℃用溶胞缓冲液洗涤凝胶珠两次，然后用洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5,100mM NaCl,0.1mM EGTA和1mM DTT)洗涤两次。然后将凝胶珠重悬浮在洗涤缓冲液中，并等分到装有不同激酶反应物的试管中。
TPL-2/COT激酶测定和抑制剂筛选
用TPL-2/COT激酶测定筛选不同候选TPL-2/COT激酶抑制剂。如下进行激酶测定。于25℃在合适放射性标记物(30μM ATP和5μCiγ-32P-ATP(Amersham))存在下，在激酶缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5,10mM MgCl2,1mM EGTA,2mM DTT和0.01％Brij35)中将结合在凝胶珠的TPL-2激酶(即FLAG-COT(30-397))与2μg靶多肽底物(即GSTIκB-α(1-50))(Boston Biologicals)温育10分钟。在用100％DMSO配制成为10mM母液的抑制剂活性的候选化合物存在或缺乏下进行反应。在激酶反应混合物中加入所述受试化合物后，立即加入γ-32P-ATP。加入5×SDS样品缓冲液、于100℃加热3分钟终止反应，利用离心收集上清液。通过凝胶电泳(10％SDS-PAGE)，然后转移到硝酸纤维素膜上并进行放射自显影，分析COT的自身磷酸化以及靶多肽即GST-IκB-α的磷酸化。作为用于证实的对照，在不同激酶反应中使用相同水平的FLAG-COT(30-397)和GST-IκB-α蛋白以及使用相同的凝胶加样量，在用于放射自显影的相同膜上分别用抗-FLAG和抗-GST抗体进行免疫印迹。通过对放射性自显影图片的扫描定量对COT激酶活性、靶多肽GST-IκB-α的自身磷酸化活性或磷酸化活性的抑制作用(图13)。如下所述进一步分析改变这些活性水平的化合物。
利用杆状病毒表达的重组COT蛋白的TPL-2/COT激酶测定
与以上所述相似，在候选调节剂化合物存在或缺乏下用靶多肽测试在昆虫细胞中表达的TPL-2多肽的激酶活性。在该测定中，采用标准技术从用表达COT激酶的杆状病毒感染的昆虫细胞制备TPL-2激酶即COT(30-397)。在激酶测定缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5,10mMMgCl2,1mM EGTA,2mM DTT,0.01％Briji 35,5mM β-磷酸甘油)中，在受试化合物存在或缺乏以及放射性标记物([33P]-γ-ATP 3×母液：60μM冷ATP和50μCi/ml[33P]-γ-ATP)存在下将TPL-2激酶(100ng,5μg/ml的50mM Tris-HCl pH8.0)与包括p105典型蛋白的靶多肽(即1μgGST-P105Δ1-497,1.4mg/ml的PBS溶液)温育。另外，在缺乏靶多肽(即p105典型多肽)情况下进行该测定，以确定任何一种受试化合物是否改变TPL-2自身磷酸化活性。
在96孔板中进行测定以便可以有效筛选大量化合物。例如在10μl化合物、10μl[33P]-γ-ATP存在下在96孔板的每孔中通常温育10μl激酶和底物，并于25℃温育30分钟。用100μl 5mM ATP的75mMH3PO4溶液终止反应。然后将反应混合物各120μl转移到96孔磷酸纤维素滤膜板上，于25℃温育30分钟，洗涤(6×100μl 75mM H3PO4/孔)，(用25μl闪烁混合物)测定为以闪烁计数器测定的回收标记蛋白的函数的激酶活性结果。
用上述测定，从用分子模型选定的化学文库鉴定能够调节TPL-2激酶活性的几种化合物，因为所述分子模型包括有效的ATP竞争性TPL-2激酶抑制剂。所鉴定的化合物显示对以GST-IκB-α为代表的IκB-α靶多肽的COT介导的磷酸化具有作用。
TPL-2/COT激酶调节剂
开始以100μM浓度复份筛选具有TPL-2作用的化合物对激酶活性的抑制作用。在图13中显示了选定化合物的TPL-2激酶抑制剂筛选数据的实例。为了确定所测试的化合物是TPL-2特异性抑制剂还是普通激酶抑制剂，另外平行测试了特异性的已知激酶抑制剂。普通激酶抑制剂星形孢菌素、MEK抑制剂PD98059和p38MAP激酶抑制剂SB203580显示对COT自身磷酸化和COT靶(即IκB-α)的磷酸化几乎没有或没有抑制活性。相反，每种受试化合物显示不同水平的特异性抑制活性(参见图13)。与只含有DMSO溶媒(终浓度为5％)的对照激酶反应相比，对100μM时抑制TPL-2活性大于50％的活性化合物，再测试3个浓度100μM、10μM和1μM以确定抑制TPL-2的IC50值。鉴定的TPL-2抑制剂包括IC=50μM的N-(6-苯氧基-4-喹啉基)-N-[4-(苯硫基)苯基]胺、IC=10μM的5-氧代-4-[4-(苯硫基)苯胺基]-5,6,7,8-四氢-3-喹啉羧酸乙酯、IC50=100μM的3-(4-吡啶基)-4,5-二氢-2H-苯并[g]吲唑甲磺酸盐和IC50=100μM的2-氯苯并[l]1,9]菲咯啉-7-羧酸钠。这些化合物中的每种化合物的化学结构见图9-12。等同实施方案
本领域技术人员最多用常规试验就可知道或能够确定本文所述的本发明具体实施方案的无数等同实施方案。以下权利要求书包括这类等同实施方案。
                                序列表<110>MRC and BASF<120>TPL-2/COT激酶和使用方法<130>BBI-110CPPC<140><141><160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2720<212>DNA<213>褐鼠<220><221>CDS<222>(318)..(1742)<400>1ggaatttccc atcgcggggg ctcgggtgtt ctgggccagc cggcaggccc tttctgttta 60cggagagaaa ggggaaatgg aaaaggcggg gaggacgctg gcgtcggcta cgccgccccg 120gggccagttc agacgccgag agtccggggc tgcagcgtac cgctcctccc gctgcggatc 180gcccggcctt tggtcggccg ccggtcgtcc ggacgcccgt acgtctggct cccgctggca 240agccacccgc tgcccaccaa gcccgagctc cgggcgggca cacggaacac tcagactccc 300cagcaggcac cacagtg atg gag tac atg agc acc gga agc gac gag aaa    350
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 50                  55                  60Arg Ser Gly Gln Glu Val Pro Trp Leu Ser Ser Val Arg Tyr Gly Thr65                 70                  75                  80Val Glu Asp Leu Leu Ala Phe Ala Asn His Ile Ser Asn Thr Thr Lys
             85                  90                  95His Phe Tyr Arg Cys Arg Pro Gln Glu Ser Gly Ile Leu Leu Asn Met
        100                 105                 110Val Ile Ser Pro Gln Asn Gly Arg Tyr Gln Ile Asp Ser Asp Val Leu
    115                 120                 125Leu Val Pro Trp Lys Leu Thr Tyr Arg Ser Ile Gly Ser Gly Phe Val
130                135                  140Pro Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Tyr Leu Ala Gln Asp Met Lys Thr145                150                  155                 160Lys Lys Arg Met Ala Cys Lys Leu Ile Pro Val Asp Gln Phe Lys Pro
            165                 170                 175Ser Asp Val Glu Ile Gln Ala Cys Phe Arg His Glu Asn Ile Ala Glu
        180                 185                 190Leu Tyr Gly Ala Val Leu Trp Gly Asp Thr Val His Leu Phe Met Glu
    195                 200                 205Ala Gly Glu Gly Gly Ser Val Leu Glu Lys Leu Glu Ser Cys Gly Pro
210                 215                 220Met Arg Glu Phe Glu Ile Ile Trp Val Thr Lys His Val Leu Lys Gly225                 230                 235                 240Leu Asp Phe Leu His Ser Lys Lys Val Ile His His Asp Ile Lys Pro
            24S                 250                 255Ser Asn Ile Val Phe Met Sar Thr Lys Ala Val Leu Val Asp Phe Gly
        260                 265                 270Leu Ser Val Gln Met Thr Glu Asp Val Tyr Leu Pro Lys Asp Leu Arg
    275                 280                 285Gly Thr Glu Ile Tyr Met Ser Pro Glu Val Ile Leu Cys Arg Gly His
290                 295                 300Ser Thr Lys Ala Asp Ile Tyr Ser Leu Gly Ala Thr Leu Ile His Met305                 310                 315                 320Gln Thr Gly Thr Pro Pro Trp Val Lys Arg Tyr Pro Arg Ser Ala Tyr
            325                 330                 335Pro Ser Tyr Leu Tyr Ile Ile His Lys Gln Ala Pro Pro Leu Glu Asp
        340                 345                 350Ile Ala Gly Asp Cys Ser Pro Gly Met Arg Glu Leu Ile Glu Ala Ala
    355                 360                 365Leu Glu Arg Asn Pro Asn His Arg Pro Lys Ala Ala Asp Leu Leu Lys
370                 375                 380His Glu Ala Leu Asn Pro Pro Arg Glu Asp Gln Pro Arg Cys Gln Ser385                 390                 395                 400Leu Asp Ser Ala Leu Phe Asp Arg Lys Arg Leu Leu Ser Arg Lys Glu
            405                 410                 415Leu Glu Leu Pro Glu Asn Ile Ala Asp Ser Ser cys Thr Gly Ser Thr
        420                 425                 430Glu Glu Ser Glu Val Leu Arg Arg Gln Arg Ser Leu Tyr Ile Asp Leu
    435                 440                 445Gly Ala Leu Ala Gly Tyr Phe Asn lle Val Arg Gly Pro Pro Thr Leu
450                 455                 460Glu Tyr Gly465<210>3<211>2763<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(367)..(1770)<400>3ggatcccagt ggcccggcgt gctcggctcc cacaggcctg cagccagcat cgcaccgaac 60cttcgggggg ccgcggctgg agcgctcggc cggcgtggga gcgcaaggcc gcagatgcaa 120tcttcttacc gcgaagaagc caggggaata ggtagccaca tcttgtttgc agataagaaa 180ggaagctaac gcagtatctg caaagccagg agtctgactc agtacttttc tcactcatgc 240atacaagcag ctaaaaatga cacagcttat ttaccatgcc cctgacactg cactgagcac 300tttatgagct tgaactctgt taatctcacg accacctcat gagactctcc agaaagagca 360acagta atg gag tac atg agc act gga agt gac aat aaa gaa gag att    408
   Met Glu Tyr Met Ser Thr Gly Ser Asp Asn Lys Glu Glu Ile
     1               5                  10gat tta tta att aaa cat tta aat gtg tct gat gta ata gac att atg   456Asp Leu Leu Ile Lys His Leu Asn Val Ser Asp Val Ile Asp Ile Met
 15              20                  25                  30gaa aat crt tat gca agt gaa gag cca gca gtt tat gaa ccc agt cta   504Glu Asn Leu Tyr Ala Ser Glu Glu Pro Ala Val Tyr Glu Pro Ser Leu
             35                  40                  45atg acc atg tgt caa gac agt aat caa aac gat gag cgt tct aag tct   552Met Thr Met Cys Gln Asp Ser Asn Gln Asn Asp Glu Arg Ser Lys Ser
         50                  55                  60ctg ctg ctt agt ggc caa gag gta cca tgg ttg tca tca gtc aga tat   600Leu Leu Leu Ser Gly Gln Glu Val Pro Trp Leu Ser Ser Val Arg Tyr
     65                  70                  75gga act gtg gag gat ttg ctt gct ttt gca aac cat ata tcc aac act   648Gly Thr Val Glu Asp Leu Leu Ala Phe Ala Asn His Ile Ser Asn Thr
 80                  85                  90gca aag cat ttt tat gga caa cga cca cag gaa tct gga att tta tta   696Ala Lys His Phe Tyr Gly Gln Arg Pro Gln Glu Ser Gly Ile Leu Leu95                 100                 105                 110aac atg gtc atc act ccc caa aat gga cgt tac caa ata gat tcc gat   744Asn Met Val Ile Thr Pro Gln Asn Gly Arg Tyr Gln Ile Asp Ser Asp
            115                 120                 125gtt ctc ctg atc ccc tgg aag ctg act tac agg aat att ggt tct gat   792Val Leu Leu Ile Pro Trp Lys Leu Thr Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Asp
        130                 135                 140ttt att cct cgg ggc gcc ttt gga aag gta tac ttg gct caa gat ata   840Phe Ile Pro Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Tyr Leu Ala Gln Asp Ile
    145                 150                 155aag acg aag aaa aga atg gcg tgt aaa ctg atc cca gta gat caa ttt   888Lys Thr Lys Lys Arg Met Ala Cys Lys Leu Ile Pro Val Asp Gln Phe
160                 165                 170aag cca tct gat gtg gaa att cag gct tgc ttc cgg cac gag aac atc   936Lys Pro Ser Asp Val Glu Ile Gln Ala Cys Phe Arg Mis Glu Asn Ile175                 180                 185                 190gca gag ctg tat ggc gca gtc ctg tgg ggt gaa act gtc cat ctc ttt   984Ala Glu Leu Tyr Gly Ala Val Leu Trp Gly Glu Thr Val His Leu Phe
            195                 200                 205atg gaa gca ggc gag gga ggg tct gtt ctg gag aaa ctg gag agc tgt   1032Met Glu Ala Gly Glu Gly Gly Ser Val Leu Glu Lys Leu Glu Ser Cys
        210                 215                 220gga cca atg aga gaa ttt gaa att att tgg gtg aca aag cat gtt ctc   1080Gly Pro Met Arg Glu Phe Glu Ile Ile Trp Val Thr Lys His Val Leu
    225                 230                 235aag gga ctt gat ttt cta cac tca aag aaa gtg atc cat cat gat att    1128Lys Gly Leu Asp Phe Leu His Ser Lys Lys Val Ile His His Asp Ile
240                 245                 250aaa cct agc aac att gtt ttc atg tcc aca aaa gct gtt ttg gtg gat    1176Lys Pro Ser Asn Ile Val Phe Met Ser Thr Lys Ala Val Leu Val Asp255                 260                 265                 270ttt ggc cta agt gtt caa atg acc gaa gat gtc tat ttt cct aag gac    1224Phe Gly Leu Ser Val Gln Met Thr Glu Asp Val Tyr Phe Pro Lys Asp
            275                 280                 285ctc cga gga aca gag att tac atg agc cca gag gtc atc ctg tgc agg    1272Leu Arg Gly Thr Glu Ile Tyr Met Ser Pro Glu Val Ile Leu Cys Arg
        290                 295                 300ggc cat tca acc aaa gca gac atc tac agc ctg ggg gcc acg ctc atc    1320Gly His Ser Thr Lys Ala Asp Ile Tyr Ser Leu Gly Ala Thr Leu Ile
    305                 310                 315cac atg cag acg ggc acc cca ccc tgg gtg aag cgc tac cct cgc tca    1368His Met Gln Thr Gly Thr Pro Pro Trp Val Lys Arg Tyr Pro Arg Ser
320                 325                 330gcc tat ccc tcc tac ctg tac ata atc cac aag caa gca cct cca ctg    1416Ala Tyr Pro Ser Tyr Leu Tyr Ile Ile His Lys Gln Ala Pro Pro Leu335                 340                 345                 350gaa gac att gca gat gac tgc agt cca ggg atg aga gag ctg ata gaa    1464Glu Asp Ile Ala Asp Asp Cys Ser Pro Gly Met Arg Glu Leu Ile Glu
            355                 360                 365gct tcc ctg gag aga aac ccc aat cac cgc cca aga gcc gca gac cta    1512Ala Ser Leu Glu Arg Asn Pro Asn His Arg Pro Arg Ala Ala Asp Leu
        370                 375                 380cta aaa cat gag gcc ctg aac ccg ccc aga gag gat cag cca cgc tgt    1560Leu Lys His Glu Ala Leu Asn Pro Pro Arg Glu Asp Gln Pro Arg Cys
    385                 390                 395acg agt ctg gac tct gcc ctc ttg gag cgc aag agg ctg ctg agt agg    1608Thr Ser Leu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Arg Lys Arg Leu Leu Ser Arg
400                 405                 410aag gag ctg gaa ctt cct gag aac att gct gat tct tcg tgc aca gga    1656Lys Glu Leu Glu Leu Pro Glu Asn Ile Ala Asp Ser Ser Cys Thr Gly415                 420                 425                 430agc acc gag gaa tct gag atg ctc aag agg caa cgc tct ctc tac atc    1704Ser Thr Glu Glu Ser Glu Met Leu Lys Arg Gln Arg Ser Leu Tyr Ile
            435                 440                 445gac ctc ggc gct ctg gct ggc tac ttc aat ctt gtt cgg gga cca cca    1752Asp Leu Gly Ala Leu Ala Gly Tyr Phe Asn Leu Val Arg Gly Pro Pro
        450                 455                 460acg ctt gaa tat ggc tga aggatgccat gtttgcctct aaattaagac           1800Thr Leu Glu Tyr Gly
    465agcattgatc tcctggaggc tggttctgct gcctctacac aggggcccgt tacagtgaat 1860ggtgccattt tcgaaggagc agtgtgacct cctgtgaccc atgaatgtgc ctccaagcgg 1920ccctgtgtgt ttgacatgtg aagctatttg atatgcacca ggtctcaagg ttctcatttc 1980tcaggtgacg tgattctaag gcaggaattt gagagttcac agaaggatcg tgtctgctga 2040ctgtttcatt cactgtgcac tttgctcaaa attttaaaaa taccaatcac aaggataata 2100gagtagccta aaattactat tcttggttct tatttaagta tggaatattc attttactca 2160gaatagcctg ttttgtgtat attggtgtat attatataac tctttgagcc tttattggta 2220aattctggta tacattgaat tcattataat ttgggtgact agaacaactt gaagattgta 2280gcaataagct ggactagtgt cctaaaaatg gctaactgat gaattagaag ccatctgaca 2340gacggccact agtgacagtt tcttttgtgt tcctatggaa acattttata ctgtacatgc 2400tatgctgaag acattcaaaa cgtgatgttt tgaatgtgga taaaactgtg taaaccacat 2460aattttgtac atccaaggat gaggtgtgac ctttaagaaa aatgaaaact tttgtaaatt 2520attgatgatt ttgtaattct tatgactaaa ttttctttta agcatttgta tattaaaata 2580gcatactgtg tatgttttat atcaaatgcc ttcatgaatc tttcatacat atatatattt 2640gtaacatgta aagtatgtga gtagtcttat gtaaagtatg tttttacatt atgcaaataa 2700aacccaatac ttttgtccaa tgtggttggt caaatcaact gaataaattc agtattttgc 2760ctt                                                               2763<210>4<211>467<212>PRT<213>人<400>4Met Glu Tyr Met Ser Thr Gly Ser Asp Asn Lys Glu Glu Ile Asp Leu1               5                  10                  15Leu Ile Lys His Leu Asn Val Ser Asp Val Ile Asp Ile Met Glu Asn
         20                  25                  30Leu Tyr Ala Ser Glu Glu Pro Ala Val Tyr Glu Pro Ser Leu Met Thr
     35                  40                  45Met Cys Gln Asp Ser Asn Gln Asn Asp Glu Arg Ser Lys Ser Leu Leu
 50                  55                  60Leu Ser Gly Gln Glu Val Pro Trp Leu Ser Ser Val Arg Tyr Gly Thr65                  70                  75                  80Val Glu Asp Leu Leu Ala Phe Ala Asn His Ile Ser Asn Thr Ala Lys
             85                  90                  95His Phe Tyr Gly Gln Arg Pro Gln Glu Ser Gly Ile Leu Leu Asn Met
        100                 105                 110Val Ile Thr Pro Gln Asn Gly Arg Tyr Gln Ile Asp Ser Asp Val Leu
    115                 120                 125Leu Ile Pro Trp Lys Leu Thr Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Asp Phe Ile
130                 135                 140Pro Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Tyr Leu Ala Gln Asp Ile Lys Thr145                 150                 155                 160Lys Lys Arg Met Ala Cys Lys Leu Ile Pro Val Asp Gln Phe Lys Pro
            165                 170                 175Ser Asp Val Glu Ile Gln Ala Cys Phe Arg His Glu Asn Ile Ala Glu
        180                 185                 190Leu Tyr Gly Ala Val Leu Trp Gly Glu Thr Val His Leu Phe Met Glu
    195                 200                 205Ala Gly Glu Gly Gly Ser Val Leu Glu Lys Leu Glu Ser Cys Gly Pro
210                 215                 220Met Arg Glu Phe Glu Ile Ile Trp Val Thr Lys His Val Leu Lys Gly225                 230                 235                 240Leu Asp Phe Leu His Ser Lys Lys Val Ile His His Asp Ile Lys Pro
            245                 250                 255Ser Asn Ile Val Phe Met Ser Thr Lys Ala Val Leu Val Asp Phe Gly
        260                 265                 270Leu Ser Val Gln Met Thr Glu Asp Val Tyr Phe Pro Lys Asp Leu Arg
    275                 280                 285Gly Thr Glu Ile Tyr Met Ser Pro Glu Val Ile Leu Cys Arg Gly His
290                 295                 300Ser Thr Lys Ala Asp Ile Tyr Ser Leu Gly Ala Thr Leu Ile His Met305                310                  315                 320Gln Thr Gly Thr Pro Pro Trp Val Lys Arg Tyr Pro Arg Ser Ala Tyr
            325                 330                 335Pro Ser Tyr Leu Tyr Ile Ile His Lys Gln Ala Pro Pro Leu Glu Asp
        340                 345                 350Ile Ala Asp Asp Cys Ser Pro Gly Met Arg Glu Leu Ile Glu Ala Ser
    355                 360                 365Leu Glu Arg Asn Pro Asn His Arg Pro Arg Ala Ala Asp Leu Leu Lys
370                 375                 380His Glu Ala Leu Asn Pro Pro Arg Glu Asp Gln Pro Arg Cys Thr Ser385                 390                 395                400Leu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Arg Lys Arg Leu Leu Ser Arg Lys Glu
            405                 410                     415Leu Glu Leu Pro Glu Asn Ile Ala Asp Ser Ser Cys Thr Gly Ser Thr
        420                 425                     430Glu Glu Ser Glu Met Leu Lys Arg Gln Arg Ser Leu Tyr Ile Asp Leu
    435                 440                     445Gly Ala Leu Ala Gly Tyr Phe Asn Leu Val Arg Gly Pro Pro Thr Leu
450                 455                 460Glu Tyr Gly465

Claims (68)

1．调节NFκB活性的方法，它包括：
使TPL-2分子与NFκB调节组分接触，使得产生对NFκB活性的调节作用。
2．按照权利要求1的方法，其中所述TPL-2分子是野生型TPL-2。
3．按照权利要求1的方法，其中所述TPL-2分子保留野生型TPL-2的p105-磷酸化活性。
4．按照权利要求1的方法，其中所述TPL-2分子是显性失活TPL-2突变体。
5．按照权利要求1的方法，其中所述TPL-2分子保留野生型TPL-2的C-末端。
6．鉴定能够直接或间接调节p105活性的一种或多种化合物的方法，包括以下步骤：
(a)使TPL-2分子与待评价的一种或多种化合物温育；和
(b)鉴定影响所述TPL-2分子的活性的化合物。
7．按照权利要求6的方法，其中所述一种或多种化合物与所述TPL-2分子结合。
8．按照权利要求6或权利要求7的方法，还包括：
(c)评价影响TPL-2活性的化合物在基于细胞的测定中调节NFκB活化的能力。
9．鉴定可用于治疗涉及或利用炎症反应的疾病的药物的前导化合物的方法，包括：
在其中除了存在一种或多种待测化合物之外，TPL-2与具有参考亲和力的p105缔合的条件下，使所述一种或多种待测化合物与TPL-2分子和p105温育；
测定TPL-2与p105在所述一种或多种待测化合物存在下的结合亲和力；以及
参照参考结合亲和力，选择调节TPL-2与p105结合亲和力的化合物。
10．鉴定可用于治疗涉及或利用炎症反应的疾病的药物的前导化合物的方法，包括：
在其中除了存在一种或多种待测化合物之外，TPL-2与具有参考亲和力的p105缔合的条件下，使所述一种或多种待测化合物与TPL-2分子和p105温育；
测定TPL-2与p105在所述一种或多种待测化合物存在下的结合亲和力；以及
参照参考结合亲和力，选择调节TPL-2与NFκB结合亲和力的化合物。
11．鉴定药物前导化合物的方法，包括：
在其中除了存在一种或多种待测化合物之外，肿瘤坏死因子(TNF)和TPL-2相互作用诱导可测量化学或生物效应的条件下，使所述一种或多种待测化合物与TPL-2分子和TNF温育；
测定在所述一种或多种待测化合物存在下TNF直接或间接与TPL-2相互作用诱导可测量化学或生物效应的能力；以及
选择调节TNF与TPL-2的相互作用的化合物。
12．按照权利要求11的方法，它在体内细胞中进行。
13．鉴定药物前导化合物的方法，包括以下步骤：
提供纯化的TPL-2分子；
使TPL-2分子与被TPL-2磷酸化的已知底物和一种或多种受试化合物温育；和
鉴定能够调节所述底物磷酸化的一种或多种受试化合物。
14．按照权利要求13的方法，其中所述底物是MEK。
15．可用权利要求6-14中任意一项的方法鉴定的化合物，它能够调节TPL-2与p105的直接或间接相互作用。
16．按照权利要求15的化合物，它是一种抗体。
17．按照权利要求16的抗体，它是TPL-2特异性的抗体。
18．按照权利要求15的化合物，它是一种多肽。
19．按照权利要求18的多肽，它是TPL-2分子。
20．按照权利要求19的多肽，它是TPL-2的组成型活性突变体或显性失活突变体。
21．调节细胞内的p105活性的方法，包括给予所述细胞按照权利要求15-20中任意一项的化合物。
22．一种药用组合物，它含有作为活性成分的有效治疗量的按照权利要求15-20中任意一项的化合物。
23．按照权利要求15-20中任意一项的化合物的用途，用于治疗与NFκB诱导或抑制有关的病症。
24．治疗与NFκB诱导或抑制有关的病症的方法，包括给予受试者有效治疗量的按照权利要求15-20中任意一项的化合物。
25．鉴定调节TPL-2介导的炎症反应的化合物的方法，包括：
使含有TPL-2多肽或其片段的反应混合物与受试化合物接触；以及
测定所述受试化合物对NFκB活性指标的效应，由此鉴定调节TPL-2介导的NFκB活性的化合物。
26．鉴定调节TPL-2介导的NFκB活性的化合物的方法，包括：
使含有TPL-2多肽或其片段的反应混合物与受试化合物接触；以及
测定所述受试化合物对NFκB活性指标的效应，由此鉴定调节TPL-2介导的NFκB活性的化合物。
27．鉴定调节TPL-2的信号转导的化合物的方法，包括：
使含有TPL-2多肽或其片段的反应混合物与受试化合物接触；以及
测定所述受试化合物对所述反应混合物中的TPL-2多肽信号转导指标的作用，由此鉴定调节TPL-2信号转导的化合物。
28．鉴定调节TPL-2多肽与TPL-2调节作用的靶组分相互作用的的化合物的方法，包括：
使含有TPL-2多肽或其片段的反应混合物与所述TPL-2调节作用的靶组分和受试化合物在以下条件下接触，所述接触条件是除了存在所述受试化合物之外，所述TPL-2多肽或其片段与参考水平的所述靶组分特异性相互作用；以及测定在所述受试化合物存在下相互作用的水平变化，其中变化水平差值说明所述受试化合物调节TPL-2多肽或其片段与TPL-2调节作用的靶组分之间的相互作用。
29．按照权利要求25、26、27和28中任意一项的方法，其中所述TPL-2多肽包含与选自SEQ ID NO:2和4的多肽具有至少75％同一性的氨基酸序列。
30．按照权利要求25、26、27和28中任意一项的方法，其中所述TPL-2多肽由在高严格条件下与选自SEQ ID NO:1和3的核酸分子杂交的核酸分子编码。
31．按照权利要求25、26、27和28中任意一项的方法，其中所述反应混合物是无细胞反应混合物。
32．按照权利要求25、26、27和28中任意一项的方法，其中所述反应混合物是基于细胞的混合物。
33．按照权利要求32的方法，其中所述反应混合物是一种重组细胞。
34．按照权利要求33的方法，其中所述重组细胞含有编码TPL-2多肽的异源核酸。
35．按照权利要求25、26、27和28中任意一项的方法，其中所述测定包括测量选自激酶活性、结合活性和信号活性的TPL-2活性。
36．按照权利要求35的方法，其中所述TPL-2活性是激酶活性。
37．按照权利要求25、26、27和28的方法，其中所述重组细胞含有报道基因构建物，该构建物含有与对TPL-2或NFκB转导的细胞内信号敏感的转录调节序列有效连接的报道基因。
38．按照权利要求37的方法，其中所述转录调节序列包括TNF转录调节序列。
39．按照权利要求28的方法，其中所述靶组分选自p105、IκB-α、IκB-β、MEK-1、SEK-1和NFκB。
40．按照权利要求25、26、27和28中任意一项的方法，其中所述TPL-2分子是重组多肽。
41．按照权利要求40的方法，其中所述TPL-2多肽包括选自SEQID NO:2和4的氨基酸序列。
42．按照权利要求35的方法，其中所述信号活动包括TNF表达。
43．按照权利要求37的方法，其中所述重组细胞含有对TPL-2信号转导敏感的报道基因。
44．按照权利要求25、26、27和28中任意一项的方法，其中所述测定包括测定细胞凋亡。
45．按照权利要求25、26、27和28中任意一项的方法，其中所述测定包括测定细胞增殖。
46．按照权利要求25、26、27和28中任意一项的方法，其中所述测定包括测定免疫反应。
47．按照权利要求25、26、27和28中任意一项的方法，其中所述TPL-2多肽是纯化的TPL-2多肽。
48．按照权利要求28的方法，其中所述靶组分以纯化的多肽提供。
49．按照权利要求28的方法，其中所述靶组分是选自p105、IκB-α、IκB-β、MEK-1、SEK-1和NFκB的多肽或其片段。
50．按照权利要求49的方法，其中所述靶组分是IκB-α。
51．按照权利要求49的方法，其中所述靶组分是p105。
52．按照权利要求25、26、27和28中任意一项的方法，其中所述受试化合物选自基于蛋白质、基于碳水化合物、基于脂质、基于核酸、基于天然有机物质、基于合成有机物质和基于抗体的化合物。
53．按照权利要求25、26、27和28中任意一项的方法鉴定的化合物。
54．按照权利要求25、26、27和28中任意一项的方法鉴定的化合物，其中所述化合物适用于治疗选自类风湿性关节炎、多发性硬化症(MS)、炎症性肠病(IBD)、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、脓毒病、牛皮癣、调节异常的TNF表达和移植排斥反应的病症。
55．按照权利要求25、26、27和28中任意一项的方法鉴定的化合物，其中所述化合物适用于治疗类风湿性关节炎。
56．按照权利要求25、26、27和28中任意一项的方法鉴定的化合物，其中所述化合物适用于治疗调节异常的TNF表达。
57．通过调节TPL-2活性治疗其需要对象的免疫系统病症的方法，包括：
给予能够调节TPL-2的药用组合物，所述给予量足以调节所述患者免疫系统反应。
58．治疗患者TPL-2介导病症的方法，该方法包括：
给予足以调节所述对象的所述TPL-2介导病症的有效治疗量的能够调节TPL-2的组合物。
59．在其需要对象调节TPL-2介导的NFκB调节作用的方法，该方法包括：
给予所述人类对象有效治疗量的药用组合物，使其发挥调节作用。
60．调节细胞内TPL-2介导的NFκB调节作用的方法，该方法包括：
给予细胞能够调节TPL-2的组合物，给予量足以导致TPL-2介导的NFκB调节作用的变化。
61．按照权利要求57和58任意一项的方法，其中所述病症选自类风湿性关节炎、多发性硬化症(MS)、炎症性肠病(IBD)、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、脓毒病、牛皮癣、调节异常的TNF表达和移植排斥反应。
62．权利要求61的方法，其中所述病症是类风湿性关节炎。
63．权利要求61的方法，其中所述病症是调节异常的TNF表达。
64．按照权利要求57-59中任意一项的方法，其中所述组合物选自N-(6-苯氧基-4-喹啉基)-N-[4-(苯硫烷基)苯基]胺、5-氧代-4-[4-(苯硫烷基)苯胺基]-5,6,7,8-四氢-3-喹啉羧酸乙酯、3-(4-吡啶基)-4,5-二氢-2H-苯并[g]吲唑甲磺酸盐和2-氯苯并[l][1,9]菲咯啉-7-羧酸钠。
65．治疗TNF调节异常的方法，该方法包括：
给予TNF调节异常风险个体有效治疗量的TPL-2调节剂，从而实现治疗。
66．权利要求65的方法，其中所述TPL-2调节剂选自N-(6-苯氧基-4-喹啉基)-N-[4-(苯硫烷基)苯基]胺、5-氧代-4-[4-(苯硫烷基)苯胺基]-5,6,7,8-四氢-3-喹啉羧酸乙酯、3-(4-吡啶基)-4,5-二氢-2H-苯并[g]吲唑甲磺酸盐和2-氯苯并[l][1,9]菲咯啉-7-羧酸钠。
67．治疗类风湿性关节炎的方法，该方法包括以下步骤：
给予类风湿性关节炎风险个体有效治疗量的TPL-2调节剂，从而实现治疗。
68．权利要求67的方法，其中所述TPL-2调节剂选自N-(6-苯氧基-4-喹啉基)-N-[4-(苯硫烷基)苯基]胺、5-氧代-4-[4-(苯硫烷基)苯胺基]-5,6,7,8-四氢-3-喹啉羧酸乙酯、3-(4-吡啶基)-4,5-二氢-2H-苯并[g]吲唑甲磺酸盐和2-氯苯并[l][1,9]菲咯啉-7-羧酸钠。
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