CZ2001625A3 - TPL-2/COT kinasa a způsoby jejího pouľití - Google Patents

TPL-2/COT kinasa a způsoby jejího pouľití Download PDF

Info

Publication number
CZ2001625A3
CZ2001625A3 CZ2001625A CZ2001625A CZ2001625A3 CZ 2001625 A3 CZ2001625 A3 CZ 2001625A3 CZ 2001625 A CZ2001625 A CZ 2001625A CZ 2001625 A CZ2001625 A CZ 2001625A CZ 2001625 A3 CZ2001625 A3 CZ 2001625A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
tpl
compounds
activity
polypeptide
compound
Prior art date
Application number
CZ2001625A
Other languages
English (en)
Inventor
Hamish John Allen
Richard Woodward Dixon
Joanne Sara Kamens
Dinelli Wickramasinghe
Yajun Xu
Monica Polidoro Belich
Leland Herries Johnston
Steven Charles Ley
Andres Salmeron
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
Medical Research Council
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9817930.2A external-priority patent/GB9817930D0/en
Priority claimed from GBGB9827712.2A external-priority patent/GB9827712D0/en
Application filed by Basf Aktiengesellschaft, Medical Research Council filed Critical Basf Aktiengesellschaft
Publication of CZ2001625A3 publication Critical patent/CZ2001625A3/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4706—4-Aminoquinolines; 8-Aminoquinolines, e.g. chloroquine, primaquine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)

Description

Vynález popisuje, že TPL-2 je odpovědná za fosforylaci pl05 a jeho následnou proteolýzu, což vede ke translokaci p50 Rel do jádra. V souladu s tím vynález poskytuje TPL-2 jako specifický regulátor aktivace NFKB a proto jako modulátor zánětlivých odpovědí, který se účastní pl05, a dále poskytuje TPL-2 jako cíl pro vývoj sloučenin schopných ovlivnění aktivace NFKB.
Dosavadní stav techniky
Jaderný faktor κ B (NKKB) byl prvně popsán v roce 1986 jako jaderný faktor účastnící se transkripce kappa-lehkého řetězce v B lymfocytech (Sen and Baltimore, 1986, Cell 4-6: 705-716) a od té doby bylo prokázáno, že je universálním transkripčním faktorem existujícím prakticky ve všech typech eukaryotických buněk (přehled je uveden v Ghos et al., 1998, Ann. Rev. Immunol. 16: 225-260). V buňkách existuje NFKB v cytoplasmatické, inaktivní formě, v komplexu s inhibičním proteinem, IKB. Po stimulaci vhodným induktorem se IKB dissociuje od NFKB a odkrývá se jeho jaderný lokalizační signál, což umožňuje jeho transport do jádra, kde se projeví jeho biologická aktivita transkripčního faktoru. Tak je NFKB rychlý modulátor genové exprese, protože jeho indukce je nezávislá na syntéze proteinů de novo.
Aktivní NFKB je dimer proteinů Rel rodiny, které obsahují konzervovanou 300 aminokyselinovou N-koncovou doménu známou • · • ·
jako Rel homologická doména. Tento region je odpovědný za vazbu na DNA, za dimerizaci s jinými Rel proteiny, za jadernou lokalizaci a za vazbu na IkB. Každý Rel protein obsahuje jednu polovinu potřebného mista pro vazbu na DNA, což umožňuje specificitu vhodné Rel kombinace prostřednictvím drobných variací v konsensuálním vazebném místu NFKB, 5'-GGGGYNNCCY-3 ' .
Jak bylo uvedeno výše, Rel proteiny jsou v cytoplasmě navázané na IKB molekuly. IkB jsou molekuly obsahující ankyrinovou repetitivní sekvenci, který bylo charakterizováno již mnoho, včetně ΐκΒ-α, β, γ, ε, Bcl-1-3 a Cactus. Bcl-3 je polypeptid od vyšších obratlovců, zatímco Cactus je gen Drosophily. Interakce mezi ankyrinovými repetitivními sekvencemi a NFKB/Rel se zdá být evolučně konzervovaným mechanismem pro regulaci NFKB proteinů.
Rel rodina proteinů zahrnuje Relish, Dif, Dorsal, RelB, cRel, v-Rel (kuřecí onkogen), p65, pl00//p52 a pl05/p50. První tři uvedené jsou proteiny od Drosophily. Poslední dva polypeptidy jsou neobvyklé v tom, že větší, prekursorová molekula (plOO nebo pl05) kóduje jak Rel protein, tak IKB, který se kombinuje s aso^ciovaným Rel proteinem a brání jeho jaderné lokalizaci. Jako monomery nebo homodimery neobsahují p50 a p52 transkripční aktivační domény. Proto se pro aktivaci genové transkripce asociují ve formě heterodimerů s jiným transaktivačním Rel proteinem. Homodimery p50/p52 mohou potlačovat transkripci genů v některých typech buněk.
Aktivace NFKB/Rel je spouštěna fosforylací IKB. Ta umožňuje degradaci IKB v proteosomu, ale mechanismus fosforylace IKB zůstává v současnosti značně nejasný. V případě pl00/pl05 je • · · nutné proteolytické štěpeni C-koncové ankyrinové repetitivní sekvence obsahující region z Rel regionu pro to, aby se demaskoval jaderný lokalizační signál p52/p50.
In vivo má NFKB významnou úlohu v regulaci genů účastnících se imunitní reakce, reakce akutní fáze a zánětlivé odpovědi. Ačkoliv jsou efekty NFkB značně pleiotropní, byly efekty pl05 zkoumány na knock-outovaných myších (pl05~/_) . U těchto zvířat byl C-koncový region pl05 deletován, takže myši mohly exprimovat p50, ale ve formě, která nebyla v komplexu s IKBpodobnými inhibičními ankyrinovými repetitivními sekvencemi pl05. Jinými slovy, byl produkován konstitutivně aktivní p50 (Ishikawa et al., 1998, J. Exp. Med. 187: 985-996). Tyto myši měly zánětlivý fenotyp, včetně lymfocytární infiltrace plic a jater, zvýšené citlivosti k infekci, zvětšení mnoha lymfatických uzlin, splenomegalie a hyperplasie lymfoidní tkáně. Schopnost makrofágů produkovat cytokiny byla narušena, zatímco proliferace B-lymfocytů byla zvýšena.
Nevhodná nebo nesprávná syntéza NFKB je spojena s mnoha onemocněními a dysfunkcemi u savců. Například, jak je uvedeno v Schreck et al. (1991) EMBO J., 10:2247-2258, migrace NFKB do jádra je spojena s transkripcí HIV genomu a s produkcí HIV virionů v buňkách infikovaných HIV, stejně jako s expresí HIV genů (Swingler et al., (1992) AIDS Res. Hum. Retroviruses 8:487-493). NFkB se také účastní replikace dalších retrovirů, jako je EBV (Powell et al., (1993) Clin. Exp. Immunol. 91:4 73-481) .
Dále je také známo, že NFKB chrání buňky před apoptosou (viz např. Sikora et al., (1993) BBRC 197:709-715), zprostředkuje • ·
biologické efekty TNF (Renier et al., (1994) J. Lipid Res.
35:271-278; WO 97/37016), odpověď na stres (Tacchini et al., (1995) Biochem J. 309:453-459) a chrání buňky před, například, ischemií (Mattson, (1997) Neurosci. Biobehav. Rev. 21:193206), a je asociován s různými nádory (Chang et al., (1994)
Oncogene 9:923-933; Enwonwu and Meeks, (1995) Crit Rev Oral Biol Med 6:5-17; Denhardt, (1996) Crit Rev Oncog 7:261-291).
Obecně se, nicméně, NFKB účastní regulace exprese mnoha cytokinů a lymfokinů. Toto naznačuje možnost použití modulátorů aktivity NFKB v léčbě onemocnění asociovaných se stresem, infekcí nebo zánětem, nebo pro léčbu stavů zahrnujících odpovědi, jako jsou například zánětlivé odpovědi, které jsou in vivo kontrolovány NFKB.
TPL-2 byl původně identifikován - ve formě s C-koncovou delecí - jako produkt onkogenu asociovaného s T-lymfocytárními lymfomy indukovanými Moloney virem myší leukemie u krys (Patriotis, et al., (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:22512255). TPL-2 je protein serin kinasfc, která je homologická s. MAP kinasa kinasa kinasou (3K) v katalytické doméně (Salmeron, A., et al., (1996) EMBO J., 15:817-826) a je >90% identická s proto-on^ogenní*’produktem lidské COT (Aoki, M., (1993) et al.
J Biol. Chem. 268:22723-22732). TPL-2 je také vysoce homologická s kinasou NIK, která reguluje indukovatelnou degradaci ΐκΒ-α (Malinin et al., (1997), Nátuře 385:540-544; WO 97/37016; May and Ghosh, (1998) Immunol. Today 19:8088). Nicméně, biologická funkce TPL-2/COT není dosud známá.
Podstata vynálezu • · · · * · ·
Předkládaný vynález se týká nového způsobu pro regulaci NFkB. Konkrétně se předkládaný vynález týká použití kinasy TPL2/COT jako cíle pro vývoj činidel schopných modulovat NFKB a ve výhodném provedení - činidel schopných modulovat interakci IKB 105 s TPL-2. V přihlášce označuje termín TPL-2 krysí TPL2 a lidský TPL-2 homolog COT, pokud není uvedeno jinak. Je také třeba si uvědomit, že jakýkoliv TPL-2 homolog, výhodně savčí TPL-2 homolog, spadá do rozsahu předkládaného vynálezu. Termín NFKB, pokud není definováno jinak, označuje jakýkoliv protein (nebo jeho fragment) nebo proteinový komplex, mající vazebnou aktivitu NFKB, jak je v oboru známá. Takový protein nebo proteinový komplex může být ve formě homodimeru, heterodimeru nebo multimeru. Obvykle může takový komplex zahrnovat například rel A, rel B, p50, p52, p65, c-Rel, v-Rel a/nebo dorsal.
Jak je uvedeno dále, je TPL-2 odpovědná ža degradaci pl05 a následné uvolnění Rel podjednotky. V souladu s tím předkládaný vynález poskytuje TPL-2 specifický regulátor degradace pl05 a tak modulátor zánětlivé odpovědi, které se účastní p50 Rel.
V prvním aspektu předkládaný vynález poskytuje použití TPL2 v modulaci aktivity NFKB tak, že je dosaženo takové modulace NFKB. Ve výhodném provedení probíhá taková modulace prostřednictvím pl05.
Ve druhém aspektu předkládaný vynález poskytuje způsob pro identifikaci sloučenin schopných, přímo nebo nepřímo, modulovat proteolýzu pl05 a tak jeho inhibiční aktivitu, kde uvedený způsob zahrnuje kroky:
(a) inkubaci TPL-2 molekuly s testovanou sloučeninou nebo • ·
.sloučeninami;
(b) identifikaci těch sloučenin, které ovlivňuji aktivitu TPL-2 molekuly.
Jak je uvedeno dále, bylo zjištěno, že TPL-2 je odpovědná za přímou nebo nepřímou fosforylaci pl05, která vede přímo k jeho degradaci a translokaci asociované Rel podjednotky do jádra, ve formě homodimeru nebo heterodimeru s jiným Rel monomerem. Proto jsou sloučeniny, které jsou schopné modulovat přímo nebo nepřímo interakci mezi TPL-2 a pl05, buď vazbou na TPL-2, modulací aktivity TPL-2 nebo ovlivněním interakce mezi TPL-2 a pl05 nebo s jinými polypeptidy účastnícími se fosforylace pl05, schopné modulace aktivace NFkB prostřednictvím pl05.
Dále vynález poskytuje způsoby pro produkci polypeptidů schopných modulovat aktivitu TPL-2, včetně exprese sekvencí nukleových kyselin kódujících takové polypeptidy,' způsobů modulace aktivity NFkB v buňkách in vivo a způsobů pro léčbu stavů spojených s NFkB nebo u kterých je žádoucí indukovat nebo potlačovat zánětlivou reakci.
V dalším aspektu vynález poskytuje použití TPL-2 pro modulaci aktivity faktoru nekrosy nádorů v nebo na buňkách. Jak je uvedeno dále, aktivace genové transkripce TNF může být blokována použitím antagonisty TPL-2, TPL-2(A270).
Je známo, že TNF-α může stimulovat degradaci pl05 a aktivaci genové transkripce indukované NFkB. Vynález se proto týká způsobu pro modulaci TNF aktivační dráhy pl05. Ve výhodném provedení vynález poskytuje způsob pro identifikaci základních sloučenin pro farmacii, který zahrnuje:
- inkubaci testovaných sloučenin s TPL-2 molekulou a faktorem nekrosy nádorů (TNF), za podmínek - za současné přítomnosti testovaných sloučenin - indukuje interakce TNF a TPL-2 měřitelný chemický nebo biologický efekt;
- určení schopnosti TNF interagovat, přímo nebo nepřímo, s
TPL-2, ve vztahu k indukci měřitelného chemického nebo biologického efektu za přítomnosti testovaných sloučenin; a
- selekci těch sloučenin, které modulují interakci TNF a TPL-
2.
Ve výhodném provedení vynález poskytuje způsob pro identifikaci základních sloučenin pro farmacii, který zahrnuj e:
- poskytnutí přečištěné TPL-2 molekuly;
- inkubaci TPL-2 molekuly se substrátem, o kterém je známo, že je fosforylován TPL-2, a testovanou sloučeninou nebo sloučeninami; a
- identifikaci testované sloučeniny nebo sloučenin, které modulují fosforylaci substrátu.
Volitelně může být identifikovaná testovaná sloučenina podrobena testování in vivo pro stanovení jejích účinků na TNF/plO5 signální dráhu.
V jiném aspektu vynález poskytuje způsob pro identifikaci sloučenin regulujících zánětlivou odpověď zprostředkovanou TPL-2, který zahrnuje kontaktování reakční směsi obsahující TPL-2 polypeptid nebo jeho fragment, s testovanou sloučeninou a stanovení vlivu testované sloučeniny na indikátor aktivity NFKB, což umožní identifikaci sloučenin regulujících aktivitu
NFKB zprostředkovanou TPL-2.
V příbuzném aspektu vynález poskytuje způsob pro identifikaci sloučenin, které regulují aktivitu NFKB zprostředkovanou TPL-2.
V dalším aspektu vynález poskytuje způsob pro identifikaci sloučenin regulujících přenos signálu prostřednictvím TPL-2, který zahrnuje kontaktování reakční směsi obsahující TPL-2 polypeptid nebo jeho fragment, s testovanou sloučeninou a stanovení vlivu testované sloučeniny na indikátor přenosu signálu TPL-2 polypeptidem v reakční směsi, což umožní identifikaci sloučenin regulujících přenos signálu prostřednictvím TPL-2.
V ještě jiném aspektu vynález poskytuje způsob pro identifikaci sloučenin modulujících interakci TPL-2 polypeptidu s cílovou složkou pro TPL-2, který zahrnuje kontaktování reakční směsi obsahující TPL-2 polypeptid nebo jeho fragment, a cílovou skupinu pro TPL-2, s testovanou sloučeninou, za podmínek, při kterých TPL-2 polypeptid nebo jeho fragment specificky interagují s cílovou složkou při referenční hladině. Tento způsob umožňuje měření změny úrovně interakce za přítomnosti testované sloučeniny, kde rozdíl ukazuje na to, že testovaná sloučenina moduluje interakci TPL2 polypeptidu, nebo jeho fragmentu, s cílovou skupinou pro TPL-2. Ve výhodném provedení je cílovou skupinou pl05, IKB-A, ΐκΒ-β, ΐκΒ-β, MEK-1, SEK-1 nebo NFKB, a výhodně, přečištěný polypeptid.
Ve výhodném provedení výše uvedeného aspektu způsob zahrnuje použiti TPL-2 polypeptidu, výhodně rekombinantniho polypeptidu, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci majici alespoň 75% identitu s aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO: 4.
V jiném výhodném provedeni výše uvedeného aspektu způsob zahrnuje použiti TPL-2 polypeptidu, výhodně rekombinantniho polypeptidu, který je kódovaný molekulou nukleové kyseliny, která hybridizuje za vysoce přísných podmínek s molekulou nukleové kyseliny mající sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 3.
V jiném výhodném provedení výše uvedeného aspektu způsob zahrnuje použití bezbůněčných směsí nebo buněčných směsí a takové směsi mohou být získány z rekombinantních buněk, výhodně rekombinantních buněk obsahujících heterologní nukleovou kyselinu kódující TPL-2 polypeptid. Ve výhodném provedení může bezbuněčná směs využívat přečištěný TPL-2 polypeptid. V jiném provedení způsob zahrnuje určení signálu, který vede k expresi TNF. V příbuzném provedení obsahuje rekombinantní buňka reporterový genový konstrukt, který je operabilně spojený s transkripční regulační sekvencí sensitivní na intracelulární signály přenášené TPL-2 nebo NFKB. Ve výhodném provedení je transkripční regulační sekvence TNF transkripční regulační sekvence.
V jiném výhodném provedení výše uvedeného aspektu způsob zahrnuje použití aktivity TPL-2 jako kinasové aktivity, vazebné aktivity a/nebo signalizační aktivity.
V ještě jiném výhodném provedení výše uvedených aspektů • · způsob zahrnuje měřeni apoptosy buněk, proliferace buněk nebo imunitní reakce.
V ještě jiném výhodném provedení výše uvedeného aspektu způsob zahrnuje použití testované sloučeniny na bázi proteinu, uhlovodanu, lipidu, nukleové kyseliny, přirozené organické sloučeniny, syntetické organické sloučeniny nebo protilátky.
V jiném výhodném provedení vynález poskytuje sloučeniny identifikované způsobem podle výše uvedených aspektů, kde takové sloučeniny jsou vhodné pro léčbu onemocnění jako je roztroušená sklerosa (MS), zánětlivá onemocnění střevní (IBD), diabetes mellitus závislý na inzulínu (IDDM), sepse, psoriasa, rejekce transplantátu, chybná regulace exprese TNF, nebo výhodně - revmatoidní artritida.
V jiném aspektu vynález poskytuje způsob léčby imunitního systému u jedince prostřednictvím modulace aktivity TPL-2, který zahrnuje podání farmaceutického prostředku modulujícího TPL-2 v množství dostatečném pro modulování imunitní reakce u pacienta.
V příbuzném aspektu vynález poskytuje způsob léčby stavu zprostředkovaného TPL-2 u jedince, který zahrnuje podání farmaceutického prostředku modulujícího TPL-2 v množství dostatečném pro modulování stavu zprostředkovaného TPL-2 u pacienta.
V jiném aspektu vynález poskytuje způsob pro modulování regulace NFkb prostřednictvím TPL-2 u jedince, který zahrnuje podání účinného množství farmaceutického prostředku pro takovou modulaci jedinci.
V jiném aspektu vynález poskytuje způsob pro modulováni regulace NFKB prostřednictvím TPL-2 v buňce, který zahrnuje podání prostředku modulujícího TPL-2 buňce v takovém množství, že je dosaženo změny regulace NFKB zprostředkované TPL-2.
Ve výhodném provedení výše uvedených aspektů je léčeným stavem roztroušená sklerosa (MS), zánětlivé onemocnění střevní (IBD), diabetes mellitus závislý na inzulínu (IDDM), sepse, psoriasa, rejekce transplantátu, chybná regulace exprese TNF, nebo - výhodně - revmatoidní artritida.
Ve jiném výhodném provedení výše uvedených aspektů obsahuje podaný prostředek sloučeninu vybranou ze skupiny zahrnující NI- [4 - (4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrroi>[2,3-d] pyrimidin-5-yl) -2-chlorfenyl]-1-benzensulfonamid, ethyl 5-oxo-4-[4-(fenylsulfanyl)anilino]-5,6,7,8-tetrahydro-3-chinolinkarboxylat, 3-(4-pyridyl)-4,5-dihydro-2H-benzo[g]indazolmethansulfonat, a 2-chlorbenzo[1][1,9]fenanthrolin7-karboxylat sodný.
V jiném aspektu vynález poskytuje způsob pro léčbu chybné regulace TNF, který zahrnuje podání terapeuticky účinného množství modulátoru TPL-2 jedinci s rizikem chybné regulace TNF.
V jiném aspektu vynález poskytuje způsob pro léčbu revmatoidní artritidy, který zahrnuje podání terapeuticky účinného množství modulátoru TPL-2 jedinci s rizikem vývoje revmatoidní artritidy.
·· · ·*·
9 9 999 9 999
9 9 9 9 9 9 9 9· • · · · · ·«···«· 99
9 9 9 9 9 9 99
9 »9 9 9 · ··9 99
Ve výhodném provedeni předchozích aspektů je modulátorem TPL-2 Nl- [4- (4-amino-7-cyklopentyl-7H-pyrrol?[2,3-d] pyrimidin5-yl)-2-chlorfenyl]-1-benzensulfonamid, ethyl 5-oxo-4-[4- (fenylsulfanyl)anilino]-5,6,7,8-tetrahydro-3-chinolinkarboxylat, 3-(4-pyridyl)-4,5-dihydro-2H-benzo[g]indazolmethansulfonat, a 2-chlorbenzo[1][1,9]fenanthrolin7-karboxylat sodný.
V ještě jiném provedeni, kde je léčeným stavem arthritida, například revmatoidní artritida, není použitým modulátorem TPL-2 3-(4-pyridyl)-4,5-dihydro-2Hbenzo[g]indazolmethansulfonat.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1. C-konec TPL-2 je nutný pro interakci s NFKB1 pl05 in vitro
A) TPL-2 deleční mutanty. Jsou uvedeny pozice myc a TSP3 epitopů (Salmeron, A., et al., (1996) EMBO J. 15, 817-826).
M30 odpovídá alternativními iniciačnímu místu pro TPL-2 (Aoki, M., et al., (1993) J. Biol. Chem. 268, 22723-22732).
B) TPL-2ÁC nevytváří stabilní komplex s pl05. pl05 (Blank, et al., (1991) EMBO J. 10, 4159-4167) je syntetizován a značen [35S]-Met in vitro bezbuněčnou translací buď samostatně, nebo společně s TPL-2 nebo TPL-2ÁC (Salmeron, et al., 1996). Vhodné translační směsi se potom imunosráží s anti-TPL-2 protilátkou +/- kompetujícím peptidem. Izolované proteiny se separují na 10% SDS-PAGE a zobrazí se fluorografií (panel vpravo). Levý
panel, značené lyzáty, ukazuje expresi TPL-2 a pl05 v translačni směsi z lyzátu celých králičích retikulocytů. pl05 translatovaný in vitro generuje nízké hladiny p50 (dráha 3), které jsou viditelné pouze při nadměrné expozici filmu (data nejsou uvedena).
C) N-konec TPL-2 není nutný pro vazbu na pl05. Uvedené TPL-2 proteiny (všechny s navázaným myc-epitopem na N-konci) jsou translatovány in vitro s pl05 jako v bodě B a potom jsou imunosráženy s anti-Myc Mab. [35S]-Met značené proteiny jsou vizualizovány fluorografií po 10% SDS-PAGE. Dolní panel ukazuje expresi pl05 v lyzátech.
Obr. 2. TPL-2 interaguje s C-koncem NFKB1 pl05 in vitro
A) pl05 deleční mutanty (Fan et al., (1991), Nátuře 354: 395-
398). Jsou uvedeny pozice domény homologní s Rel (Ghosh et al., (1998), Annu. Rev. Immunol. 16: 225-260), regionu bohatého na glycin (GRR) (Lin et al., (1996), Mol. Cell. Biol.
16: 2248-2254) a protilátkové epitopy myc a NFKB1(N). Prázdné šipky ukazují pozici p50 C-konce. Plné šipky ukazují N-koncová start místa různých NFKB dvouhybridních klonů interagujících s TPL-2, které všechny pokračují k C-konci proteinu.
B) TPL-2 interaguje s C-koncem pl05. TPL-2 se translatuje in vitro s uvedenými mutanty pl05. Tvorba komplexů se analyzuje 8% SDS-PAGE anti-TPL-2 imunosraženin (pravé panely) a fluorografií. Levé panely ukazují expresi TPL-2 a pl05 mutantů v lyzátech. Šipky v (B) ukazují pozici p48.
Obr. 3. TPL-2 je asociovaná s NFKB1 pl05 in vivo a aktivuje reporterový gen dependentní na NFKB po přechodné expresi.
• ·
A) TPL-2 je asociován s pl05 in vivo. Lyzáty HeLa buněk se imunosráži uvedenými protilátkami +/- kompetujicim peptidem. Izolované proteiny se rozdělí 10% SDS-PAGE a potom se provede sekvenční westernová hybridizace pro uvedené proteiny.
B) Většina TPL-2 je in vivo v komplexu s pl05. Lyzáty HeLa buněk se sériově imunosráži třikrát anti-NFKBl protilátkou. Westernová hybridizace buněčných lyzátů potvrdila depleci pl05/p50, ale ne α-tubulinu. Obsah TPL-2 v NFKB-depletovaných lyzátech se určí sondování skvrn ve westernově hybridizaci lyzátů a anti-TPL-2 imunosraženin z lyzátů, anti-TPL-2 antisérem.
C) Exprese TPL-2 aktivuje luciferasový reporterový gen dependentní na NFKB. Jurkat T-lymfocyty se transfektují 0,5 pg uvedených expresních vektorů plus 2 gg reporterového konstruktu (celková DNA je upravena na 4 gg prázdným pcDNA3 vektorem). Luciferasové testy se provedou dvojmo a jsou vyjádřeny jako průměrný stimulační index vzhledem k prázdnému vektoru (+/SE). TPL-2ÁC data jsou normalizována podle úrovně exprese, stanovené westernovou hybridizaci, vzhledem k TPL-2, kde se použije hodnota 1. TPL-2(A270) je bodová mutace TPL-2 bez kinasové aktivity.
D) Současná exprese C-koncového pl05 fragmentu blokuje NFKB aktivaci prostřednictvím TPL-2. Jurkat T-lymfocyty se transfektovaly 0,5 pg uvedených expresních vektorů a buď 2 μg prázdného vektoru nebo 3'NN konstruktu plus 2 μg NFkb luciferasového reporterového konstruktu. Testy na luciferasovou aktivitu provedené dvojmo jsou vyjádřeny jako průměrný stimulační index vzhledem k prázdným vektorům (+/SE). Westernův přenos potvrdil, že exprese 3'NN neovlivňuje expresi současně transfektované TPL-2 (data nejsou uvedena).
Obr. 4. Současná exprese TPL-2 s myc-pl05 indukuje jadernou translokaci aktivního mycp50.
A) TPL-2 indukuje jadernou translokaci současně exprimovaného NFKB1. 3T3 buňky se dočasně transfektovaly 0,5 μg každého z uvedených expresních vektorů a barvily se pro nepřímou imunofluorescenci za použití anti-myc Mab (zelená; znázorněna jako světlé tečkování) pro lokalizaci myc-pl05/myc-p50; a anti- TPL-2_ sérem (červená, znázorněna jako tmavé tečkování). Uvedené obrázky jsou konfokální řezy representativními transfektovanými buňkami. Také jsou uvedena fázově kontrastní zobrazení.
B) TPL-2 indukuje translokaci myc-p50 do jádra. Z buněk transfektovaných uvedenými vektory se připravily cytoplasmatické a jaderné extrakty. Myc-pl05/myc-p50 se zobrazily sondováním westernových skvrn anti-myc imunoprecipitátů anti-NFKBl(N) antisérem. Srovnání s lyzáty celých buněk ukázalo, že myc-p50 je neúčinně extrahován z jaderné frakce a je proto podhodnocen.
C) Jaderný NFKB1 indukovaný TPL-2 je biologicky aktivní. Vazebná aktivita NFKB na DNA v jaderných extraktech připravených z 3T3 buněk transfektovaných uvedenými expresními vektory (0,5 μg každý; Watanabe et al., (1997), EMBO J., 16: 3609-3620), se analyzuje EMSA (Alkalay, I. et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15: 1294-1301). Plné šipky ukazují pozici dvou detekovaných NFkB komplexů. Prázdné šipky ukazují pozici protilátkou posunutých NFkB komplexů (dráhy 6 a 7). V dráze 8 prokazuje kompetice se 100-násobkem neznačeného KB oligonukleotidu specificitu detekovaných NFKB komplexů.
Obr. 5. TPL-2 podporuje jadernou translokaci p50 nezávisle na
zpracováni pl05.
3T3 buňky se dočasně transfektuji vektory kódujícími HA-p50 (0,4 pg), buď TPL-2(A270) nebo TPL-2(0,2 μς) a myc-plO5AGRR nebo prázdným vektorem (0,4 μς). Po 24 hodinové kultivaci se buňky barvily se pro nepřímou imunofluorescenci za použití anti-HA Mab pro lokalizaci HA-p50 (zelená; znázorněna jako světlé tečkování) ; a anti-TPL-2 antisérem (červená, znázorněna jako tmavé tečkování). Uvedené obrázky jsou konfokální řezy representativními transfektovanými buňkami. Také jsou uvedena fázově kontrastní zobrazení.
Obr. 6. TPL-2 stimuluje proteolýzu současně exprimovaných mycpl05.
A) Efekt TPL-2 současné exprese na proteolýzu pl05. 3T3 buňky se dočasně transfektuji vektory kódujícími myc-pl05 a TPL-2 (TPL-2) nebo myc-pl05 a prázdným vektorem (kontrola). Po 24 hodinové kultivaci se buňky metabolicky značí [35S]-Met/[35S]-Cys během 30 minut a potom se sledují po uvedenou dobu. Značené proteiny se imunosráží z buněčných lyzátů za použití anti-myc Mab, separují se 8% SDS-PAGE a vizualizují se fluorografií. Plné šipky ukazují pozici současně imunovysrážených TPL-2. Prázdné šipky ukazují posun elektroforetické mobility myc-pl05 způsobený současnou expresí TPL-2.
B) a C) Imunovysrážené myc-pl05 a myc-p50 v panelu A se kvantifikují laserovou densitometrií a data jsou prezentována v grafu tak, aby ukazovala obrat myc-pl05 (B) a poměr mycp50/myc-pl05 (C).
D) 3T3 se dočasně transfektuji vektory kódujícími myc-plO5AGRR a TPL-2 (TPL-2) nebo myc-p!05AGRR a žádným insertem • ·
(kontrola). Obrat myc-pl05 se urči stejně jako v (B).
E) 3T3 se dočasně transfektuji vektory kódujícími myc-pl05 společně s vektorem kódujícím TPL-2(A270) nebo prázdným vektorem (kontrola). Obrat myc-pl05 se určí stejně jako v (B).
F) Proteolýza pl05 indukovaná TPL-2 je blokována inhibitorem proteasomu. 3T3 buňky se transfektuji jako v (A). MG132 inhibitor proteasomu (201IM) nebo DMSO vehikulum (kontrola) se přidají před pulsním značením a ponechají se po celou dobu sledování. Značený myc-pl05 se izoluje imunosrážením jako v (A) a kvantifikuje se laserovou densitometrií. Data jsou uvedena v grafu tak, aby ukazovala efekt léku na proteolýzu myc-pl05 indukovanou TPL-2. MG132 kompletně blokuje produkci myc-p50 během sledování buněk ko-transfektovaných TPL-2 (data nejsou uvedena).
G) 3T3 buňky se transfektuji uvedenými vektory jako v (a), dvojmo. Rovnovážné hladiny myc-p50/myc-pl05 se určí za 24 hodin sondováním westernových skvrn buněčných lyzátů anti-myc antisérem. Ko-transfekce TPL-2 zvyšuje absolutní koncentrace myc-p50 ve srovnání s kontrolou. Tak může být myc-p50 stabilnější v buňkách ko-exprimujících TPL-2, pravděpodobně z důvodu jaderné lokalizace, protože celková rychlost produkce myc-p50 z myc-pl05 není zvýšena (obr. 6A).
Obr. 7. Aktivita TPL-2 je nutná pro degradaci pl05 indukovanou TNF-a.
A) Kinasa-inaktivní TPL-2 blokuje degradaci pl05 indukovanou TNF-α. Jurkat T-lymfocyty se transfektuji tak, aby stabilně exprimovaly kinasa-inaktivní TPL-2(A270), jak se určí westernovým přenosem. Kontrolní buňky, které jsou stabilně transfektovány prázdným vektorem, a dva nezávisle získané • · • i ··· ······· · · ··· ··· ··· ····· ·· ♦ ·· ··· klony exprimující TPL-2(A270), se metabolicky značí [35S]Met/[35S]-Cys po dobu 30 minut a potom se sledují po uvedenou dobu za přítomnosti TNF-cc (20 ng/ml) nebo kontrolního media, jak je uvedeno, značený pl05 se imunosráží z buněčných lyzátů za použití anti-NFKBl(N) antiséra), separuje se SDS-PAGE a vizualizuje se fluorografií. Imunovysrážený pl05 se kvantifikuje laserovou densitometrií a data jsou uvedena ve grafu.
B) TPL-2 indukuje fosforylaci současně exprimovaného myc-pl05.
3T3 buňky se přechodně transfektují vektory kódujícími mycpl05 a uvedené proteiny nebo kontrolami bez insertu (0). Mycpl05 se izoluje imunosrážením s anti-myc Mab a potom se zpracuje kontrolním pufrem (1), fosfatasou (2) nebo fosfatasou a inhibitory fosfatasy (3). Izolovaný protein se separuje 8% SDS-PAGE a westernovým přenosem s anti-NFKBl(N) antisérem.
Šipky ukazují posun elektroforetické mobility myc-pl05 způsobený současnou expresí TPL-2.
Obr. 8. Dominantně negativní TPL-2 moduluje transkripci reporterového genu indukovaného TNF.
Jurkat T-lymfocyty se transformují postupem podle obr. 7A, s vektorem exprimujícím luciferasový reporterový gen pod kontrolou TNF-indukovatelného promotorového systému reagujícího na NFKB. Současná exprese TPL-2 KD (bez kinasové aktivity) nebo TPL-2 Cter (C-terminální zkrácení) vede ke snížení aktivace způsobené TNF.
Obr. 9. Je znázorněna chemická struktura sloučeniny N-(6-fenoxy-4-chinolyl)-N-[4-(fenylsulfanyl) fenyljaminu, která může inhibovat aktivitu TPL-2 kinasy o 50% při koncentraci 50 μΜ.
4 44
4 4 44
4444 444
4 44
Obr. 10. Je znázorněna chemická struktura sloučeniny ethyl-5-oxo-5-[4- (fenylsulfanyl) anilino]-5, 6, 7,8-tetrahydro-3-chinolinkarboxylatu, která může inhibovat aktivitu TPL-2 kinasy o 50% při koncentraci 10 μΜ.
Obr. 11. Je znázorněna chemická struktura sloučeniny 3—(4— -pyridyl)-4,5-dihydro-2H-benzo[g]indazol-2-ium methansulfonatu, která může inhibovat aktivitu TPL-2 kinasy o 50% při koncentraci 100 μΜ.
Obr. 12. Je znázorněna chemická struktura sloučeniny 2 -chlorobenzo[1][1,9]fenanthrolin-7-karboxylatu sodného, která může inhibovat aktivitu TPL-2 kinasy o 50% při koncentraci 100 μΜ.
Obr. 13. Je uveden autoradiograf ukazující inhibiční .aktivitu několika různých sloučenin ve snížení hladiny TPL-2 autofosforylace (FLAG-COT (30-397) a fosforylace cílového polypeptidu, t.j. GST -ΐκΒ-α (dráha 1, 3-(4-pyridyl)-4,5dihydro-2H-benzo[g]indazole; dráha 2, ethyl-5-oxo-4-[4-(fenylsulfanyl)anilino]-5,6,7,8-3--chinolinkarboxylat; dráha 3, N-(6-fenoxy-4-chinolyl)-N-[4—(fenylsulfanyl)fenyl]amin; dráha 4, staurosporin; dráha 5, SB 203580; dráha 6, PD 098059; dráha 7, FLAG-COT (30-397) a pouze vehikulum (DMSO); a dráha 8, FLAG-COT (30-397), GST-lKB-oc a pouze vehikulum (DMSO); pro další podrobnosti viz text).
Obr. 14 ukazuje strukturu jádra chinol/n Ί·1ύ vyck tď.
• * ·
Podrobný popis vynálezu
TPL-2 (lokus 2 progrese nádorů je MAP kinasa kinasa kinasa prvně izolovaná v souvislosti s Moloneyho virem myší leukemie. Gen (tpl-2) kóduje polypeptid, který je asociovaný s progresí nádorů a tumorigenesí v mnoha systémech a který se dá být aktivovaný v nádorech prostřednictvím C-koncového zkrácení (Makris et al., (1993) J Virol. 67:1286-1291; Patrotis et al., (1993) PNAS (USA) 90:2251-2255; Makris et al., (1993) J. Virol 67:4283-4289,- Patrotis et al. , (1994) PNAS (USA) 91: 97559759; Salmeron et al. (1996) EMBO J., 15: 817-526; Ceci et al., (1997) Genes. Dev. 11: 688-700). Kompletní nukleokyselinové a aminokyselinové sekvence krysí TPL-2. jsou dostupné z GenBank pod přírůstkovým č. M94454. Sekvence nukleové kyseliny a aminokyselinová sekvence pro lidský homolog TPL-2 označovaný jako COT (cancer Osaka thyroid) jsou dostupné z GenBank pod přírůstkovým č. NM_005204 a 729884 (viz též, např., Miyoshi et al., Mol. Cell. Biol. 11(8), 4088-4096 (1991)) .
1. TPL-2 je regulátor NFKB
V prvním aspektu se vynález týká použití TPL-2 molekuly pro modulaci aktivity NFKB.
la. Použití TPL-2 molekuly
Vynález zahrnuje, například, použití TPL-2 molekul pro modulaci aktivity NFKB v testech in vitro a/nebo in vivo, a zejména pro fosforylaci pl05 v takových testovacích systémech; použití TPL-2 molekuly pro modulaci aktivity NFKB v buňkách in • · vivo, například za účelem indukce nebo prevence imunitní reakce nebo zánětlivé reakce. Ve výhodném provedení se vynález týká použití TPL-2 molekuly při léčbě onemocnění spojených s deregulovanou expresí NFKB.
Ve výhodném provedení je molekula TPL-2 podle předkládaného vynálezu použitelná pro modulování transkripce genů pod kontrolou NFKB kontrolního elementu, buď in vivo nebo, například, v testech prováděných in vitro nebo v buňkách, například buněčných kulturách.
TPL-2 molekula pro použití v testech nebo způsobech popsaných výše může být navržena tak, aby indukovala nebo bránila fosforylaci a proteolýze pl05. Tak může být, například, molekula TPL-2 mající biologickou aktivitu přirozeného TPL-2 a schopná vazby na a fosforylace pl05 použita pro indukci degradace pl05 a/nebo zánětlivé reakce. Dále, může být použit konstitutivně aktivní mutant TPL-2, což způsobí oddělení jeho aktivity od ostatních buněčných kontrolních mechanismů.
V dalším aspektu vynálezu může být dominantně negativní mutant s vyřazenou kinasovou aktivitou TPL-2 použit k inhibici fosforylace TPL-2, kompeticí s endogenní přirozenou TPL-2 o vazbu na pl05, ale bez fosforylace cílové molekuly. Mutant s vyřazenou kinasovou aktivitou je výhodně připraven mutací TPL2 v kinasové doméně, například v pozici 270. Mutace může být provedena náhodně a může být vybrána podle hodnocení schopnosti TPL-2 fosforylovat artificiální substrát nebo může být navržena podle modelování aktivního místa a potom místně cílenou mutagenesí vedoucí ke snížení nebo eliminaci kinasové aktivity. Výhodnými mutanty s vyřazenou kinasovou aktivitou jsou TPL-2(A270) a TPL-2(R167). Oba tyto známé mutanty byly
určeny podle homologií sekvence ve struktuře TPL-2.
lb. Molekula TPL-2
Termín molekula TPL-2, jak je zde použit, označuje polypeptid mající alespoň jednu biologickou aktivitu TPL-2. Termín proto zahrnuje fragmenty TPL-2, které si zachovávají alespoň jednu strukturální determinantu TPL-2.
Výhodná molekula TPL-2 má strukturu uvedenou v GenBank (přírůstkové č. M94454). Tento polypeptid, krysí TPL-2, je kódovaný sekvencí nukleové kyseliny uvedenou také pod přírůstkovým č. M94454. Mohou být navrženy alternativní sekvence kódující polypeptid M94454, s ohledem na degeneraci genetického kódu, jak je známo odborníkům v oboru. Kromě toho, vynález zahrnuje TPL-2 polypeptidy, které jsou kódovány sekvencemi významně homologickými se sekvencí nukleové kyseliny uvedenou v M94454. Termín významná homologie, kde homologie označuje identitu sekvence, označuje více než 40% identitu sekvence, výhodně více než 45% identitu sekvence, lépe více než 55% identitu sekvence, výhodně více než 65% identitu sekvence a nejlépe identitu sekvence více než 75%, jak je stanovena přímým seřazením sekvence a srovnáním.
Například, termín molekula TPL-2 označuje COT, lidský homolog TPL-2 (přírůstkové č. NM 005204). COT je z 90% identická s TPL-2.
Homologie sekvence (nebo identita) může být také stanovena za použití jakéhokoliv vhodného algoritmu pro stanovení homologie, za použití parametrů. Výhodně je použit
BLAST algoritmus, s parametry pro íttwý-ítcWw hodnoty. BLAST algoritmus je podrobně popsán na • · ···· http://www.nchi.nih.gov/BLAST/blast_help.html, což je zde uvedeno jako odkaz. Vyhledávací parametry jsou definovány následovně a jsou výhodně použity s definovanými rc/p,.
parametry.
Výraz významně homologní, při hodnocení BLAST, označuje sekvence, které si odpovídají s EXPECT hodnotou alespoň 7, výhodně alespoň 9 a nejlépe alespoň 10 nebo více. Práh chyb pro EXPECT v BLAST vyhledávání je obvykle 10.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) je heuristický vyhledávací algoritmus použitý v programech blastp, blastn, blastx, tblastn a tblastx; tyto programy přiřazují signifikanci svým zjištěním podle statistických metod dle Karlina a Altschula (viz http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html) s několika posíleními, BLAST programy jsou určeny pro srovnávání identity sekvencí, například pro identifikaci homologů k dané sekvenci. Programy nejsou obvykle použitelné pro vyhledávání motivů. Pro diskusi o záklc|aních postupech při vyhledávání podobnosti v databázích sekvencí viz Altschul et al. (1994) Nátuře Genetics 6: 119-129.
Pět BLAST programů dostupných na http://www.ncbi.nih.gov provádí následující srovnání:
blastp srovnává danou aminokyselinovou sekvenci s databází proteinových sekvencí;
blastn srovnává danou nukleotidovou sekvenci s databází nukleotidových sekvencí;
blastx srovnává produkty translace dané nukleotidové sekvence z »4 · • * ·
• · · <· ·· « · ···· · ·· • Φ · ·· šesti možných rámců (oba řetězce) s databázi proteinových sekvencí;
tblastn srovnává danou proteinovou sekvenci s databází nukieotidových sekvencí dynamicky translatovanou ve všech šeti čtecích rámcích (oba řetězce);
tblastx srovnává translace dané nukleotidové sekvence z šesti možných rámců s translacemi databáze nukieotidových sekvencí z šesti možných rámců.
BLAST využívá následující vyhledávací parametry:
HISTOGRAM - zobrazuje histogram skóre pro každé vyhledávání; standard je ano (viz parametr H v BLAST manuálu).
DESCRIPTIONS - omezuje počet krátkých odpovídajících sekvencí na určený počet; standardní limit je 100 odpovídajících sekvencí (viz parametr V v manuálu). Viz též EXPECT a CUTOFF.
ALIGNMENTS - omezuje sekvence databáze na uvedený počet, pro který jsou popisovány páry segmentů s vysokým skóre (HSP); standardní limit je 50. Pokud splňuje práh statistické významnosti více sekvencí databáze (viz EXPECT a CUTOFF, dále), jsou uvedeny pouze shody s nejvyšší statistickou významností (viz parametr B v BLAST manuálu).
EXPECT - práh statistické významnosti pro spárování se sekvencemi v databázi; standardní hodnota je 10, takže se přepokládá, že 10 shod se může vyskytnout náhodně, podle stochastického modelu dle Karlina a Altschula (1990). Pokud je statistická významnost vyšší než EXPECT práh, nebude shoda popsána. Nižší EXPECT prahy jsou méně přísné, což vede k větší pravděpodobnosti popisu shody. Frakční hodnoty jsou přijatelné (viz parametr E v BLAST manuálu).
CUTOFF - hraniční skóre pro popis párových segmentů s vysokým skóre. Standardní hodnota je vypočtena z EXPECT hodnoty (viz výše) . HSP jsou popsány pro sekvence z databáze pouze tehdy, pokud jejich statistická významnost je alespoň tak vysoká, jako hodnota pro jeden HSP mající skóre rovné CUTOFF hodnotě. Vyšší CUTOFF hodnoty jsou přísnější, což vede k nižší pravděpodobnosti popisu shody. (Viz parametr S v BLAST manuálu). Obvykle mohou být prahy statistické významnosti intuitivně určeny podle EXPECT.
MATRIX - určuje alternativní skórovací matrici pro BLASTP, BLASTX, TBLASTN a TBLASTX. Standardní matrice je BLOSUM62 (Henikoff and Henikoff, 1992). Mezi alternativní volby patří: PAM40, PAM120, PAM250 a IDENTITY. Pro BLASTN nejsou dostupné žádné alternativní skórovací matrice; specifikování MATRIX v BLASTN vyžaduje návrat k chybné odpovědi.
STRAND - omezuje TBLASTN prohledávání na horní nebo dolní řetězce sekvencí v databázi; nebo omezuje BLASTN, BLASTX nebo TBLASTX na čtecí rámce na horním nebo na dolním řetězci hledané sekvence.
FILTER - demaskuje segmenty dané sekvence, které mají nízkou komplexnost, jak je určena SEG programem podle Wooton and Federhen (1993), Computers and Chemistry 17: 149-163, nebo segmenty skládající se z vnitřních repetitivních sekvencí z krátkou periodicitou, jak jsou určeny XNU programem podle Claverie and States (1993) Computers and Chemistry 17: 191-201, nebo, pro BLASTN, DUST programem podle Tatusov and Lipman (viz http://www.nchi.nlm.nih.gov). Filtrování může eliminovat • ··· ······· · • · · · · · · • · · · · · · statisticky významné, ale biologicky nezajímavé popisy v blast (například běžné acidické, bazické regiony nebo regiony bohaté na prolin), což ponechává biologicky zajímavější regiony dané sekvence pro specifické párování se sekvencemi v databázi.
Sekvence s nízkou komplexitou zjištěné filtrovacím programem se substituují písmenem N v nukleotidové sekvenci (například NNNNNNNNNNNNN) a písmenem X v proteinové sekvenci (například XXXXXXXXXXX).
Filtrování se používá pouze pro danou sekvenci (nebo její translační produkty), nikoliv pro sekvence v databázích. Pro jiné programy je filtrování SEG, DUST pro BLASTN.
Filtrování nepřináší vždy efekt při aplikaci SEG, XNU nebo obou na sekvence ve SWISS-PROT. Dále, někdy jsou sekvence maskovány úplně, což naznačuje, že statisticky významná shoda jakýchkoli odpovídajících párování proti nefiltrované dané sekvenci by měla být podezřelá.
NCBI-gi - způsobuje uvedení NCBI identifikátorů ve výstupu, společně s přístupovým a /nebo lokusovým názvem.
Nejlépe je srovnání sekvencí provedeno za použití prostého BLAST vyhledávacího algoritmu uvedeného v http://www.nebi.nih.gov/BLAST.
Vynález dále zahrnuje polypeptidy kódované sekvencemi nukleové kyseliny schopnými hybridizace na sekvenci nukleové kyseliny uvedenou v GenBank M94454 za nízké, střední nebo vysoké přísnosti.
Přísnost hybridizace označuje podmínky, za kterých jsou ·· ·· · ·· · ·♦ 4·· ···· ·· ···· · · · • ··· ······· · * • · · · · ··· ·· ·· · ·· ··· hybridy polynukleotidových kyselin stálé. Takové podmínky jsou známé odborníkům v oboru. Jak je odborníkům v oboru známo, stabilita hybridů se odráží v teplotě tání (t.t.) hybridů, která se snižuje o přibližně 1 až 1,5 °C s každým 1% snížení homologie sekvence. Obecně je stabilita hybridu funkcí koncentrace sodíkového iontu a teploty. Obvykle je hybridizační reakce provedena za podmínek vysoké přísnosti, a potom následuje promytí při různé přísnosti.
Termín vysoká přísnost, jak je zde použit, označuje hybridizaci těch sekvencí nukleových kyselin, které tvoří stabilní hybridy při 1 M Na+ při 65-68 °C. Podmínky vysoké přísnosti jsou, například, hybridizace ve vodném roztoku obsahujícím 6x SSC, 5x Denhartův roztok, 1% SDS (dodecylsíran sodný), 0,1 pyrofosforečnan sodný a 0,1 mg/ml denaturovaná lososí spermatická DNA jako nespecifický kompetitor. Po hybridizaci mohou být výplachy s vysokou přísností provedeny v několika krocích, s posledním výplachem (přibližně 30 minut) při hybridizační teplotě v 0,2-0,1 x SSC, 0,1% SDS.
Střední přísnost označuje stav ekvivalentní hybridizaci ve výše uvedeném roztoku, ale při 60-62 °C. V tomto případě je poslední výplach proveden při hybridizační teplotě v lx SSC, 0,1% SDS.
Nízká přísnost označuje stav ekvivalentní hybridizaci ve výše uvedeném roztoku, ale při 50-52 °C. V tomto případě je poslední výplach proveden při hybridizační teplotě v 2x SSC, 0,1% SDS.
Je třeba si uvědomit, že tyto podmínky mohou být upraveny a nahrazeny změnou pufrů, například použitím formamidových pufrů, a změnou teplot. Denhartův roztok a SSC jsou dobře • · · · · · · · • · · · ······· · známé odborníkům v oboru, stejně jako jiné vhodné hybridizační pufry (viz Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, nebo Ausubel et al., ed., (1990), Current Protocols in Molecular Biology, Jahn Wiley and Sons, lne.). Optimální hybridizační podmínky mul·/ být určeny empiricky, pWZrP 2- Cdélka a obsah GC v sondě mají také význam.
Výhodně vynález také poskytuje sekvence nukleové kyseliny, které mohou hybridizovat, za přísných podmínek, na fragment sekvence nukleové kyseliny uložený v GenBank pod č. M94454 nebo NM 005204 (viz, v příslušném pořadí, SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 3) Výhodně má fragment délku 15 až 50 baží, nejlépe přibližně 25 baží.
Podle zde uvedeného návodu je možno nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu získat za použití metod dobře známých v oboru. Například, DNA podle předkládaného vynálezu je možno získat chemickou syntézou, za použití polymerasové řetězové reakce (PCR) nebo vyšetřováním genomové knihovny nebo vhodné cDNA knihovny připravené ze zdroje, o kterém se předpokládá, že obsahuje TPL-2 a exprimuje TPL-2 v detekovatelné koncentraci.
Chemické metody pro syntézu požadovaných nukleových kyselin jsou známé v oboru a patří mezi ně, například, triesterová, fosfitová, fosforoamiditová a H-fosfonatová metoda. PCR a jiné auto-iniciované metody, stejně jako oligonukleotidová syntéza na pevných nosičích. Tyto metody mohou být použity tehdy, když je celé sekvence nukleové kyseliny známá, nebo tehdy, je-li dostupná sekvence nukleové kyseliny komplementární ke kódujícímu řetězci. Alternativně, pokud je známá cílová aminokyselinová sekvence, je možno určit sekvence nukleové • · · ·· · · · · • · « · 9 9 9 9 99 9
9 9 9 9 9 9 9 99
999 9 9999 9 9 99
9 9 9 9 9 9 99
99999 9 9 9 99999 kyseliny za použiti známých a preferovaných kódujících zbytků pro každý aminokyselinový zbytek.
Alternativním způsobem pro izolaci genu kódujícího TPL-2 je použití PCR techniky, jak je popsána, například, v kapitole 14, Sambrook et al., 1989. Tato metoda vyžaduje použití oligonukleotidových sond, které hybridizují na TPL-2 nukleovou kyselinu. Strategie pro výběr oligonukleotidů jsou popsány dále.
Knihovny se vyšetřují sondami nebo analytickými prostředky navrženými pro identifikaci vybraného genu nebo proteinu kódovaného genem. Pro cDNA expresní knihovny jsou vhodnými prostředky monoklonální a polyklonální protilátky, které rozpoznávají a specificky se váží na TPL-2; oligonukleotidy délky přibližně 20 až 80 baží, které kódují známou nebo předpokládanou TPL-2 cDNA ze stejného nebo jiného druhu; a/nebo komplementární nebo homologní cDNA nebo její fragmenty, které kódují stejný nebo hybridizující gen. Vhodnými sondami pro vyšetřování genomových cDNA knihoven jsou, například, oligonukleotidy, cDNA nebo její fragmenty, které kódují stejnou nebo hybridizující DNA; a/nebo homologní genomové DNA nebo jejich fragmenty.
Nukleová kyselina kódující TPL-2 může být izolována vyšetřováním vhodných cDNA nebo genomových knihoven za vhodných hybridizačních podmínek sondou, například nukleovou kyselinou podle předkládaného vynálezu obsahující oligonukleotidy získané ze sekvencí uvedených v GenBank pod č. M94454 nebo NM 005204 (viz,v příslušném pořadí, SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 3. Vhodné knihovny jsou komerčně dostupné nebo mohou být připraveny, například, z buněčných linií, vzorků tkáně a podobně.
• ·· ·· · ·· · ···· · · · · φ φφ • · · φ φ φ φ ·· · • · · · · φ φ φ φ · · φ φ φ ··· ·· ·· · ·· ···
Termín sonda, jak je zde použit, označuje například jednořetězcovou DNA nebo RNA tvořenou sekvencí oligonukleotidů obsahujících 10 až 50, lépe 15 až 30 a nejlépe alespoň přibližně 20, sousedních baží, které jsou stejné jako (nebo komplementární k) ekvivalentnímu nebo většímu počtu sousedních baží v M94454. 20 sekvencí nukleových kyselin vybraných jako sondy by mělo mít dostatečnou délku a měly by být dostatečně jednoznačné, aby byly minimalizovány falešně pozitivní výsledky. Nukleotidové sekvence jsou obvykle založeny na konzervovaných nebo vysoce homologních nukleotidových sekvencích nebo regionech TPL-2. Nukleové kyseliny použité jako sondy mohou být degenerované v jedné nebo více pozicích. Použití degenerovaných oligonukleotidů může být zejména, významné tehdy, je-li knihovna vyšetřována z druhu, ve kterém není známo preferenční využití kodonů.
Mezi výhodné regiony, ze kterých mohou být připraveny sondy, patří 5' a /nebo 3' kódující sekvence, sekvence, o kterých se předpokládá, že kódují vazebná místa pro ligand, a podobně. Například, zde popsaný kompletní cDNA klon nebo jeho fragmenty mohou být použity jako sondy. Výhodně jsou nukleokyselinové sondy podle předkládaného vynálezu značeny vhodným značkovacím činidlem pro snadnou detekci po hybridizaci. Vhodným značícím činidlem je například radioaktivní značkovací činidlo. Výhodným způsobem značení DNA fragmentu je inkorporace 32P dATP pomocí Klenow fragmentu DNA polymerasy v náhodné iniciační reakci, jak je dobře známo v oboru. Oligonukleotidy jsou obvykle na konci značeny a-32P-značeným ATP a polynukleotid kinasou. Nicméně, pro značení fragmentů oligonukleotidů mohou být použity také jiné metody (například neradioaktivní), včetně enzymového značení, fluorescentního značení vhodným fluoroforem a biotinylace.
• ·· ·· · ·· ♦ · · * · · · · · · • · ♦ ···· ··
Po vyšetřováni knihovny, například částí DNA obsahující v podstatě celou sekvenci kódující TPL-2, nebo vhodnou oligonukleotidovou částí uvedené DNA, se pozitivní klony identifikují detekcí hybridizačního signálu; identifikované klony se charakterizují restrikčním mapováním a/nebo analýzou sekvence DNA a potom se vyšetřují, například srovnáním se sekvencemi podle předkládaného vynálezu pro zjištění toho, zda obsahují DNA kódující kompletní TPL-2 (tj. zda obsahují translační iniciační a terminační kodony). Pokud jsou vybrané klony nekompletní, mohou být použity pro opětovné vyšetření stejné nebo jiné knihovny pro získání překrývajících se klonů. Pokud je knihovna genomová, potom mohou překrývající se klony obsahovat exony a introny. Pokud je knihovnou cDNA knihovna, potom mohou překrývající se klony obsahovat otevřený čtecí rámec. V obou případech mohou být kompletní klony identifikovány srovnání s DNA a odvozenými aminokyselinovými sekvencemi podle předkládaného vynálezu.
Termín strukturální determinanta označuje to, že daný derivát si zachovává alespoň jednu strukturální vlastnost TPL2. Mezi strukturální vlastnosti patří přítomnost strukturálního motivu, který může replikovat alespoň jednu biologickou aktivitu přirozeného TPL-2 polypeptidu. TPL-2, jak je poskytnuta v předkládaném vynálezu, tedy zahrnuje varianty s alternativním sestřihem kódované mRNA generovanou alternativním sestřihem primárního transkriptu, aminokyselinové mutanty, glykosylační varianty nebo jiné kovalentní deriváty TPL-2, které si zachovávají alespoň jednu fyziologickou a/nebo fyzikální vlastnost TPL-2. Příklady derivátů jsou molekuly, ve kterých je protein podle předkládaného vynálezu kovalentně modifikován substitucí, chemickým, enzymatickým nebo jiným způsobem, skupiny jiné než ···· ··· · · ·· ··· · · · · · · · • · ··· ······· · · je přirozená aminokyselina. Takovou skupinou může být detekovatelná skupina, jako je enzym nebo radioaktivní izotop. Dále jsou zahrnuty přirozené varianty TPL-2 z jiných druhů, výhodně savčích. Taková varianta může být kódovaná příbuzným genem stejné rodiny genů, může se jednat o alelickou variantu určitého genu nebo se může jednat o variantu TPL-2 genu s alternativním sestřihem.
Bylo zjištěno, že C-konec TPL-2 je nutný pro interakci s pl05. Tak si TPL-2 molekula podle předkládaného vynálezu výhodně zachovává C-koncovou část přirozeného TPL-2. Výhodně si TPL-2 molekula podle předkládaného vynálezu zachovává alespoň aminokyseliny 398-468 přirozeného TPL-2, například TPL-2,jak je uveden v M94454.
Výhodně obsahuje molekula TPL-2 podle předkládaného vynálezu aminokyseliny 350-468 TPL-2; lépe aminokyseliny 300-468 TPL-2; ještě lépe aminokyseliny 250-468 TPL-2; ještě lépe aminokyseliny 200-468 TPL-2; a nejlépe aminokyseliny 131-468 TPL-2.
Alternativně obsahuje molekula TPL-2 podle předkládaného vynálezu alespoň jeden ze sedmi exonů TPL-2, jak jsou uvedeny v M94454. Výhodně proto obsahuje TPL-2 molekula aminokyseliny 425-468 (exon 7); výhodně obsahuje aminokyseliny 343-424 (exon 6); výhodně obsahuje aminokyseliny 256-342 (exon 5); výhodně obsahuje aminokyseliny 169-255 (exon 4); výhodně obsahuje aminokyseliny 113-168 (exon 3); výhodně obsahuje aminokyseliny 1-112 (exon 2); nebo jakoukoliv kombinaci výše uvedených možností.
Dále předkládaný vynález zahrnuje homology takových fragmentů, jak byly definovány výše.
·· · • · · · ··· ·· • · · · · · ··· • · · ♦ · ········ • ♦ · ··· ·· • · · · · ·· · · ·
Deriváty, které si zachovávají obecné strukturální determinanty, jak byly uvedeny výše, mohou být fragmenty TPL2. Fragmenty TPL-2 zahrnují jednotlivé domény TPL-2, stejně jako menší polypeptidy odvozené od domén. Výhodně definují menší polypeptidy odvozené od TPL-2 podle předkládaného vynálezu jedinou funkční doménu, která je charakteristická pro TPL-2. Fragmenty mohou mít teoreticky jakoukoliv velikost, pokud si zachovávají jednu charakteristiku TPL-2. Výhodně mají fragmenty délku 4 až 300 aminokyselin. Delší fragmenty jsou považovány za zkrácené formy TPL-2 a jsou zahrnuty v termínu TPL-2.
Mezi deriváty TPL-2 také patří jeho mutanty, které mohou obsahovat aminokyselinové delece, adice nebo substituce, s podmínkou, že si zachovávají alespoň jednu charakteristiku TPL-2. Tak mohou být připraveny konzervativní aminokyselinové substituce bez alterace charakteru TPL-2, stejně jako zkrácení na N-konci. Delece a substituce mohou být’také připraveny ve fragmentech TPL-2 zahrnutých v předkládaném vynálezu. TPL-2 mutanty mohou být produkovány z DNA kódující TPL-2, která byla zpracována mutagenesí in vitro vedoucí, například, k adici, výměně a/nebo deleci jedné nebo více aminokyselin. Například, substituční, deleční nebo inserční varianty TPL-2 mohou být připraveny rekombinantními způsoby a mohou být vyšetřovány na zkříženou imunoreaktivitu s přirozenými formami TPL-2.
Fragmenty, mutanty nebo jiné deriváty TPL-2 si výhodně zachovávají významnou homologii s TPL-2. Termín homologie, jak je zde použit, označuje, že dvě entity sdílejí dostatečné množství charakteristik, že může být určeno, zda mají podobný původ nebo funkci. Výhodně je termín homologie použit pro označení identity sekvence a tato homologie je určena způsobem
uvedeným vtj-šé.
V jednom provedeni různé formy TPL-2 proteinu zahrnují, například, různé aminokyselinové regiony lidského TPL-2 homologu označovaného jako COT a konkrétně zahrnují, například, lidský TPL-2 polypeptid reprezentující aminokyselinové zbytky 30 až 397 (tj. COT (30-397)), lidský TPL-2 polypeptid reprezentující aminokyselinové zbytky 1 až 397 (tj. COT (1-397)), a lidský TPL-2 polypeptid reprezentující aminokyselinové zbytky 1 až 467 (tj. COT (1467)). Tyto různé formy TPL-2 polypeptidu mohou být fúzovány na různé immuno- nebo afinitní koncovky známé v oboru pro usnadnění přečištění daného polypeptidu. Mezi koncovky patří, například, FLAG koncovka, GST (glutathion-S-transferasa), a poly-histidinová koncovka, například Hise. Kromě toho vynález také zahrnuje polypeptidy upravené tak, aby obsahovaly, například, požadovaná štěpící místa pro proteasy, která mohou být insertována do sousedství výše uvedených koncovek pro jejich snadnější odstranění po přečištění proteinu.
V souladu s tím mohou být TPL-2 polypeptidy podle předkládaného vynálezu exprimovány a přečištěny imunoprecipitací z, například, transfektovaných lidských 293A buněk nebo z bakulovirem infikovaných hmyzích buněk, jak je zde popsáno. Bakulovirem infikované hmyzí buňky umožňují přečištění větších množství rekombinantně exprimovaného proteinu vhodného pro masový skríning chemických knihoven. Další metody pro přípravu TPL-2 molekuly jsou popsány dále.
lc. Příprava TPL-2 molekuly
Předkládaný vynález zahrnuje produkci TPL-2 molekul pro použití při modulaci aktivity pl05, jak bylo popsáno výše.
·· ·
Výhodně jsou TPL-2 molekuly produkovány rekombinantní DNA technologii, pomocí které může být nukleová kyselina kódující TPL-2 molekulu inkorporována do vektoru pro vhodnou manipulaci. Termín vektor (nebo plasmid), jak je zde použit, označuje samostatný prvek, který může být použit pro vkládání heterologní DNA do buněk pro její expresi nebo replikaci. Výběr a použití takových vehikul jsou dobře známé v oboru. Je dostupno mnoho vektorů a výběr vhodného vektoru závisí na zamýšleném použití vektoru, tj. na tom, zda je použit pro amplifikaci nebo expresi DNA, na velikosti DNA, která je insertována do vektoru, a na hostitelské buňce, která má být transformována vektorem. Každý vektor obsahuje různé složky podle své funkce (amplifikace DNA nebo exprese DNA) a podle hostitelské buňky, se kterou je kompatibilní. Mezi složky vektoru patří, například: element rozpoznávající počátek replikace, jeden nebo více markerových genů, zesilovač transkripce, promotor, transkripční terminační sekvence a signální sekvence.
Jak expresní, tak klonovací vektory obvykle obsahují sekvence nukleové kyseliny, které umožňují replikaci vektoru v jedné nebo více vybraných hostitelských buňkách. Typicky je v klonovacích vektorech touto sekvencí taková sekvence, která umožňuje replikaci vektoru nezávisle na chromosomální DNA hostitele, a zahrnuje sekvence rozpoznávající počátek replikace nebo autonomně se replikující sekvence. Takové sekvence jsou dobře známé pro mnoho bakterií, kvasinek a virů. Sekvence rozpoznávající počátek replikace z plasmidu pBR322 je vhodná pro většinu Gram-negativních bakterií, 2p plasmidová sekvence rozpoznávající počátek replikace je vhodná pro kvasinky a různé virové sekvence rozpoznávající počátek replikace (například SV4 0, polyomové, adenovirové) jsou použitelné pro klonování vektorů v savčích buňkách. Obecně, • ·*«44 ·· »9 · «· · » · · ·«4«
999 9 9999
9 9 9 99
999 99 99« ·· • ·9 •9
99
919 sekvence rozpoznávající počátek replikace nejsou nutné pro savčí expresní vektory, pokud nejsou tyto vektory použity v savčích buňkách kompetentních pro replikaci DNA ve vysoké úrovni, jako jsou například COS buňky.
Většina expresních vektorů jsou kyvadlové vektory, tj. jsou použitelné pro replikaci v alespoň jedné třídě organismů, ale mohou být transfektovány do jiné třídy organismů za účelem exprese. Například, vektor je klonován do E. coli a potom je stejný vektor transfektován do kvasinek nebo do savčích buněk, i když není schopen replikace nezávislé na chromosomech hostitelské buňky. DNA může být také replikována insercí do genomu hostitele. Nicméně, získávání genomové DNA kódující TPL-2 je komplexnější než DNA pro exogenně replikující se vektory, protože pro excidování TPL-2 DNA je nutné restrikční trávení. DNA může být amplifikována PCR a může být přímo transfektována do hostitelských buněk bez jakékoliv replikační složky.
Výhodně mohou expresní a klonovací vektory obsahovat selekční gen také označovaný jako selektovatelný márker. Tento gen kóduje protein nutný pro přežití nebo růst transformovaných hostitelských buněk kultivovaných v selektivním kultivačním mediu. Hostitelská buňka netransformovaná vektorem obsahujícím selekční gen nebude přežívat v kultivačním mediu, typické selekční geny kódují proteiny, které udílejí resistenci na antibiotika nebo jiné toxiny, například na ampicilin, neomycin, methothrexat nebo tetracyklin, doplňují auxotrofní deficience nebo dodávají zásadní živiny nedostupné z komplexního media.
Jako selektivní markér vhodný pro kvasinky může být použit jakýkoliv markér, který usnadňuje selekci transformantů
44444 4 4 fenotypovou expresi markerového genu. Vhodnými markéry pro kvasinky jsou, například, geny udílející resistenci na antibiotikum G418, hycjromycin nebo bleomycin, nebo způsobují prototrofii u auxotrofních mutantních kvasinek, jako je například URA3, LEU2, LYS2, TRPÍ nebo HIS3 gen.
Protože je replikace vektorů nejčastěji prováděna v E. coli, obsahují vektory výhodně genetické markéry pro E. coli a sekvence rozpoznávající počátek replikace v E. coli. Tyto sekvence mohou být získány z E. coli plasmidů, jako je pBR322, Bluescript0 vektor nebo pUC plasmid, například pUC18 nebo pUC19, které oba obsahují E. coli sekvence rozpoznávající počátek replikace a E. coli genetický markér pro resistenci na antibiotika, například na ampicilin.
Vhodné selektovatelné markéry pro savčí buňky jsou ty markéry, které umožňují identifikaci buněk kompetentních k vychytávání TPL-2 nukleové kyseliny, jako je gen pro dihydrofolat reduktasu (DHFR, resistence na methothrexat), thymidin kinasu, nebo geny způsobující resistenci na G418 nebo hygromycin. Transformované savčí buňky se umístí do selekčního tlaku, pod kterým mohou přežívat pouze ty transformanty, které vychytávají a exprimují markér. V případě DHFR nebo glutaminsynthasového markéru (GS) může být selekčního tlaku dosaženo kultivací transformantů za podmínek, při kterých je tlak progresivně zvyšován, což vede k amplifikaci (a chromosomální integraci) jak selekčního genu, tak na něj navázané DNA kódující TPL-2. Amplifikace je proces, ve kterém jsou geny významné pro produkci proteinu zásadního pro růst, společně s těsně asociovanými geny, které mohou kódovat požadovaný protein, opakovány v tandemu v chromosomech rekombinantních buněk. Z takto amplifikované DNA se obvykle syntetizují větší množství požadovaného proteinu.
• · · ···4 4 · • · · · 4 4 4 4 44 4 • 4 4 4 4 4 4 ··4 •4 · 4 4 4444444 44
444 444444
44444 44 4 44 444
Expresní a klonovací vektory mohou obvykle obsahovat promotor, který je rozpoznáván hostitelským organismem a který je operativně navázán na DNA kódující TPL-2. Takový promotor může být indukovatelný nebo konstitutivní. Promotory jsou operativně navázané na DNA kódující TPL-2 tak, že promotor se odstraní z původní DNA trávením restrikčními enzymy a inseruje se do vektoru. Pro řízení amplifikace a/nebo exprese TPL-2 DNA mohou být použity jak přirozené TPL-2 promotorové sekvence, tak mnoho heterologních promotorů. Termín operativně navázaný označuje takovou pozici, ve které jsou uvedené složky ve vztahu umožňujícím zamýšlenou funkci. Kontrolní sekvence operativně navázaná na kódující sekvenci je ligována tak, že exprese kódující sekvence je prováděna za podmínek kompatibilních s kontrolními sekvencemi.
Mezi promotory vhodné pro prokaryotické hostitele patří, například, β-laktamasové nebo laktosové promotorové systémy, promotorové systémy alkalické fosfatasy, tryptofanu (trp) a hybridní promotory, jako je tac promotor. Jejich nukleotidové sekvence byly publikovány, což umožňuje provedení operativní ligace na DNA kódující TPL-2, za použití spojovacích sekvencí a adaptérů pro dodání jakýchkoliv nutných restrikčních míst. Promotory pro použití v bakteriálních systémech budou také obvykle obsahovat Shine-Delgarnovu sekvenci operativně navázanou na DNA kódující TPL-2.
Výhodnými expresními vektory jsou bakteriální expresní vektory obsahující bakteriofágový promotor, jako je phagex nebo T7, které jsou schopné fungovat v bakteriích. V jednom z nejpoužívanějších expresních systémů může být nukleová kyselina kódující fúsní protein transkribována vektoru T7 RNA polymerasou (Studier et al., Methods in Enzymology 185: 60-89, • ·· ·· · ·· ···· · · · ··· ··· ···· · · • · ··· ·*····· ·
1990). V E. coli BL21 (DE3) použitém spolu s pET vektory, je T7 RNA polymerasa produkována z /-lysogen DE3 v hostitelské bakterii a její exprese je pod kontrolou lac UV5 promotoru indukovatelného IPTG. Tento systém byl úspěšně použit pro produkci mnoha proteinů. Alternativně může být polymerasový gen vložen do lambda fágu infekcí int-fágem, jako je CE6 fág, který je komerčně dostupný (Novagen, Madison, USA). Dalšími vektory jsou vektory obsahující lambda PL promotor, jako je PLEX (Invitrogen, NL), vektory obsahující trc promotory, jako je pTrcHisExpressTm (Invitrogen) nebo pTrc99 (Pharmacia Biotech, SE), nebo vektory obsahující tac promotor, jako je pKK223-3 (Pharmacia Biotech) nebo PMAL (New England Biolabs, MA, USA).
Dále, TPL-2 gen podle předkládaného vynálezu výhodně obsahuje sekreční sekvenci pro usnadnění sekrece polypeptidu z bakteriálních hostitelů, takže je místo v inklusních tělískách peptid produkován jako solubilní nativní peptid. Peptid může· být získán z periplasmatického prostoru bakterií nebo z kultivačního media, jak je vhodné.
Vhodné promotorové sekvence pro použití ve kvasinkách mohou být regulovatelné nebo konstitutivní a jsou výhodně získány z vysoce exprimovaných kvasinkových genů, jako jsou geny Saccharomyces cerevisiae. Tak může být použit promotor TRPÍ genu, ADH1 nebo ADHII genu, genu kyselé fosfatasy (PH05), promotor kvasinkových genů pro pohlavní feromony kódujících anebo a-faktor nebo promotor genu kódujícího glykolytický enzym, jako je promotor pro enolasu, glyceraldehyd—3-fosfat dehydrogenasu (GAP), 3-fosfoglycerat kinasu (PGK), hexokinasu, pyruvatdekarboxylasu, fosfofruktokinasu, glukosa-6-fosfat isomerasu, 3~fosfoglyceratmutasu, pyruvatkinasu, triosafosfat isomerasu, fosfoglukosa isomerasu nebo glukokinasu, S.
• ·· ··· ·· • · · · · · · · · · • · · · · · · · · • · ··· ······· · cerevisiae GAL4 genu, S.pombe nmt 1 genu nebo promotor z TATA vazebného proteinu (TBP). Dále je možno použít hybridních promotorů obsahujících přední aktivační sekvence (UAS) kvasinkového genu a zadní promotorové elementy včetně funkčního TATA boxu z jiného kvasinkového genu, například hybridní promotor obsahující UAS kvasinkového PH05 genu a zadní promotorové elementy obsahující funkční TATA box kvasinkového GAP genu (PH05-GAP hybridní promotor). Vhodný konstitutivní PH05 promotor je například zkrácený PH05 promotor kyselé fosfatasy neobsahující přední regulační elementy (UAS), jako je PH05 (-173) promotorový element začínající nukleotidem -173 a končící nukleotidem -9 PH05 genu.
Transkripce TPL-2 genu z vektorů v savčích hostitelských buňkách může být kontrolována promotory odvozenými z virových genomů, například z genomu polyoma viru, adenoviru, drůbežího pox viru, hovězího papiloma viru, viru ptačího sarkomu, cytomegaloviru (CMV), retroviru a opičího viru 40 (SV40), heterologními savčími promotory jako je aktinový promotor nebo velmi silný promotor, například promotor ribosomálního proteinu, nebo promotory normálně asociovanými s TPL-2 sekvencí, s podmínkou, že takové promotory jsou kompatibilní se systémy hostitelské buňky.
Transkripce DNA kódující TPL-2 ve vyšších eukaryoteú·/? může být zesílena insercí sekvencí zesilujících transkripci do vektoru. Zesilovače transkripce mají relativní orientaci a nejsou závislé na pozici. Ze savčích genů (například pro elastasu nebo globin) je známo mnoho sekvencí zesilujících transkripci. Nicméně, obvykle se použije zesilovač transkripce z viru pro eukaryotické buňky. Příklady jsou SV40 zesilovač transkripce na zadní straně sekvence • ·
.....
rozpoznávající počátek replikace (bp 100-270) CMV časného promotoru - zesilovače transkripce. Zesilovač transkripce může být také vložen do vektoru v pozici 5' nebo 3' k TPL-2 DNA, ale výhodně je v pozici 5' k promotoru.
Výhodně může eukaryotický expresní vektor kódující TPL-2 obsahovat lokusový kontrolní region (LCR). LCR může řídit vysoce účinnou expresi nezávislou na místu integrace transgenů integrovaných do chromatinu hostitele, což je významné zejména tehdy, je-li TPL-2 gen exprimován v kontextu permanentnětransfektované eukaryotické buněčné linie, ve které proběhla integrace vektoru do chromosomu, ve vektorech určených pro genovou terapii nebo u transgenních zvířat.
Eukaryotické expresní vektory budou také obsahovat sekvence nutné pro ukončení transkripce a pro stabilizaci mRNA. Takové sekvence jsou běžně dostupné z 5' nebo 3' netranslatovaných regionů eukaryotických nebo virových DNA nebo cDNA. Tyto regiony obsahují nukleotidové segmenty transkribované jako polyadenylované fragmenty v netranslatovaných částech mRNA kódující TPL-2.
Expresním vektorem je jakýkoliv vektor schopný exprese nukleové kyseliny TPL-2, který je operativně spojen s regulačními sekvencemi, jako jsou promotory, které mohou řídit expresi takové DNA. Proto termín expresní vektor označuje rekombinantní DNA nebo RNA konstrukty, jako jsou plasmidy, fágy, rekombinantní viry nebo jiné vektory, které po vložení do vhodného hostitele způsobí expresi klonované DNA. Vhodné expresní vektory jsou známé odborníkům v oboru a patří mezi ně ty, které jsou replikovatelné v eukaryotických a/nebo prokaryotických buňkách a ty, které zůstávají episomální nebo které se integrují do genomu hostitelské buňky. Například, DNA • ·· ·· · · · • · · · · · 4 4 4· ··· · ♦ · · ·· • · · · ♦ ······· · 4 4 · 4 4 4 ·· ····· ·· · ·· · kódující TPL-2 může být insertována do vektoru vhodného pro expresi cDNA v savčích buňkách, například do vektoru na bázi CMV - zesilovače transkripce, jako je pEVRF (Matthias et al., (1989), NAR 17: 6418).
Pro předkládaný vynález jsou zejména výhodné expresní vektory, která umožňují dočasnou expresi DNA kódující TPL-2 v savčích buňkách. Přechodná exprese obvykle vyžaduje použití expresního vektoru, který se může účinně replikovat v hostitelské buňce tak, že se v ní akumuluje mnoho kopií expresního vektoru a tato hostitelská buňka nakonec syntetizuje velká množství TPL-2. Pro předkládaný vynález jsou přechodné expresní systémy použitelné například pro identifikaci TPL-2 mutantů, pro identifikaci potenciálních fosforylačních míst nebo pro charakterizaci funkčních domén proteinu.
Konstrukce vektorů podle předkládaného vynálezu zahrnuje konvenční ligační techniky. Izolované plasmidy nebo’fragmenty DNA se štěpí, upraví a religují se v požadované formě za vzniku požadovaných plasmidů. Pokud je to žádoucí, provede se známým způsobem analýza pro potvrzení správnosti sekvencí v připravených plasmidech. Vhodné metody pro konstrukci expresních vektorů, přípravu in vitro transkriptů, vkládání DNA do hostitelských buněk, a provádění analýz pro hodnocení exprese TPL-2 jsou známé v oboru. Přítomnost genu, amplifikace a/nebo exprese mohou být měřeny, například, běžným southernovým přenosem, northernovým přenosem pro kvantifikace transkripce mRNA, tečkovou hybridizací (analýzou DNA nebo RNA), nebo hybridizací in šitu, za použití vhodně značené sondy, která může být připravena podle sekvence podle předkládaného vynálezu. Odborníkům v oboru bude jasné, jak mohou být tyto metody modifikovány.
Vynález tedy obsahuje hostitelské buňky transformované vektory kódujícími heterologní TPL-2 molekulu. Termín heterologní TPL-2 molekula, jak je zde použit, označuje mutovanou formu endogenní TPL-2 nebo mutovanou nebo přirozenou formu exogenní TPL-2.
TPL-2 může být výhodně exprimován v hmyzích buňkách. Hmyzími buňkami použitelnými ve způsobu podle předkládaného vynálezu jsou, obecně, hmyzí buňky, které mohou být transformovány expresním vektorem a které mohou exprimovat heterologní proteiny kódované vektory. Konkrétně, výhodné je použití Sf buněčných linií, jako je buněčná linie Spodoptera frugiperda IPBL-SF-21 AE (Vaughn et al., (1977) In vitro, 13: 213-217).
Zejména výhodná je odvozená buněčná linie Sf9 (Kurstack and Marmorosch, (1976) Invertebrate Tissue Culture Applications in Medicine, Biology and Agriculture, Academie Press, New York, USA). Tyto buněčné linie, stejně jako jiné hmyzí buněčné linie vhodné pro použití v předkládaném vynálezu, jsou komerčně dostupné (například od Stratagene, La Jolla, CA, USA).
Stejně jako expresi ve hmyzích buňkách v kultuře vynález také zahrnuje expresi TPL-2 proteinů v celých hmyzích organismech. Použití virových vektorů, jako je bakulovirus, umožňuje infekci celých hmyzích jedinců, kteří se v některých případech kultivují lépe než buňky, protože mají menší požadavky na speciální kultivační podmínky. Mnoho druhů hmyzu, jako jsou například bourci morušoví, umožňují vysoký výtěžek heterologního proteinu. Proteiny mohou být také extrahovány z hmyzu pomocí běžných extrakčních technik.
Expresní vektory vhodné pro použití v předkládaném vynálezu jsou všechny vektory, které mohou exprimovat cizorodé proteiny • · · ·· · ·· · • · · · · · ····· • · · · · · · ··· • · · · · ······· ·· • · · ··· « ·« ····· ·· · ·· ··· ve hmyzích buněčných liniích. Obecně, vektory, které jsou použitelné pro savčí nebo jiné eukaryotické buňky, jsou také použitelné pro hmyzí buněčné kultury. Bakulovirové vektory, konkrétně určené pro kultury hmyzích buněk, jsou zejména výhodné a jsou komerčně dostupné (například od Invitrogen a Clontech). Jsou známé také další virové vektory, které mohu být použity pro infekci hmyzích buněk, jako je Sindbis virus (Hahn et al., (1992), PNAS (USA) 89: 2679-2683). Bakulovirovým vektorem volby (přehled je uveden v Miller (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42: 177-199) je virus mnohotné jaderné polyhedrosy Autographa californica, AcMNPV.
Obvykle nahrazuje heterologní gen alespoň část polyhedrinového genu AcMNPV, protože polyhedrin není nutný pro produkci viru. Pro inserci heterologního viru se výhodně použije přenosový vektor. Přenosové vektory se připraví v Ě. coli a DNA insert se potom přenese do AcMNPV homologní rekombinací.
2. TPL-2 je cíl pro vývoj léků
Podle předkládaného vynálezu je molekula TPL-2 použita jako cíl pro identifikaci sloučenin, například základních sloučenin pro farmacii, které mohou modulovat aktivitu NFKB cestou proteolýzy pl05 a uvolňování RelA podjednotky. V souladu s tím se předkládaný vynález týká testu a poskytuje způsob pro identifikaci sloučenin, které jsou schopné - přímo nebo nepřímo - modulovat aktivitu pl05, kde uvedený způsob zahrnuje kroky:
(a) inkubaci TPL-2 molekuly s testovanou sloučeninou nebo sloučeninami; a <· ♦ (b) identifikaci těch sloučenin, které ovlivňují aktivitu TPL-2 molekuly.
2a. Sloučeniny vážící se na TPL-2
V prvním provedení předkládaného vynálezu je test konfigurován tak, aby detekovat polypeptidy, které se váží přímo na molekulu TPL-2.
Předkládaný vynález poskytuje způsob pro identifikaci modulátoru aktivity NFKB, kde uvedený způsob zahrnuje kroky:
(a) inkubaci TPL-2 molekuly s testovanou sloučeninou nebo sloučeninami; a (b) identifikaci těch sloučenin, které se váží na TPL-2 molekulu.
Výhodně způsob dále zahrnuje krok:
(c) hodnocení sloučenin, které se váží na TPL-2, na jejich schopnost modulovat aktivitu NFKB v buněčném testu.
Vazba na TPL-2 může být hodnocena jakoukoliv technikou známou odborníkům v oboru.
Příkladem vhodného testu je dvouhybridový testovací systém, který měří interakce in vivo, testy provedené afinitní chromatografií, například obsahující vazbu na polypeptidy imobilizované na kolonu, fluorescenční testy, ve kterých je vazba sloučeniny a TPL-2 spojena se změnou fluorescence jedné nebo obou složek v páru, a podobně. Výhodně jsou testy provedeny v buňkách in vivo, jak je tomu ve dvouhybridním testu.
• · « • · « • · · 4* • · • · * 9 · • • • 9 • 9 9 9 • 9 • 9 • 9 9 9 9 • ·
·· «· • 9 • 9 9 • 9
Ve výhodném aspektu tohoto provedeni poskytuje vynález způsob pro identifikaci základních sloučenin pro farmaceutické použití při léčbě onemocnění, na kterých se podílí zánětlivá reakce, kde uvedený způsob zahrnuje inkubaci testovaných sloučenin s TPL-2 molekulou a pl05, za podmínek, za kterých se TPL-2 a pl05 asociují s referenční afinitou;
stanovení vazebné afinity TPL-2 k pl05 za přítomnosti testované sloučeniny nebo sloučenin; a selekci těch sloučenin, které modulují vazebnou afinitu TPL2 k pl05 ve srovnání s referenční vazebnou afinitou.
Výhodně je tedy test podle předkládaného vynálezu kalibrován za nepřítomnosti testované sloučeniny nebo sloučenin, nebo za přítomnosti referenční sloučeniny, jejíž vazebná afinita k TPL-2 je známá nebo jinak dosažitelná pro stanovení referenční hodnoty. Například, ve dvouhybridovém systému může být referenční hodnota získána za nepřítomnosti jakékoliv sloučeniny. Přidání sloučeniny nebo sloučenin, které zvyšují vazebnou afinitu TPL-2 k pl05, zvyšuje výsledek testu nad referenční hodnotu, zatímco přidání sloučeniny nebo sloučenin, které snižují tuto afinitu, vede ke snížení výsledků testu pod referenční hodnotu.
2b. Sloučeniny, které modulují funkční interakce plO5/TPL-2
Ve druhém provedení může být test podle předkládaného vynálezu konfigurován tak, aby detekovat funkční interakce mezi sloučeninou nebo sloučeninami a TPL-2. Takové interakce mohou probíhat na úrovni regulace TPL-2, takže tato kinasa je sama aktivována nebo inaktivována v reakci na testované sloučeniny, nebo na úrovni modulace biologických účinků TPL-2 na pl05. Termíny aktivace a inaktivace, jak jsou zde • ·» ·· · «« ··♦· * · · α ·· • · 4 ···· ·4 • · · · · · ···» 4«« • · · · · · 44 ·♦« ♦· ·· 4«4 4 použity, zahrnují modulaci aktivity, enzymatické nebo jiné, sloučeniny, stejně jako modulaci rychlosti její produkce, například aktivací represe exprese polypeptidu v buňkách. Termíny zahrnují přímé působení na transkripci genu pro modulování exprese genového produktu.
Testy, které detekují modulaci funkčních interakcí mezi TPL2 a pl05, jsou výhodně buněčné testy. Například mohou být založeny na hodnocení stupně fosforylace pl05, který je ukazatelem stupně aktivace NFKB v důsledku interakce TPL-2pl05.
Ve výhodných provedeních je nukleová kyselina kódující TPL-2 ligována do vektoru a je vložena do vhodných hostitelských buněk za vzniku transformovaných buněčných linií exprimujících TPL-2 molekulu. Vzniklé buněčné linie mohou být potom použity pro reprodukovatelnou kvalitativní a/nebo kvantitativní analýzu efektu sloučenin na funkci TPL-2. Tak mohou být buňky exprimující TPL-2 použity pro identifikaci sloučenin, zejména sloučenin s nízkou molekulovou hmotností, které modulují funkci TPL-2. Tak jsou hostitelské buňky exprimující TPL-2 použitelné pro vyhledávání léků a dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob pro identifikaci sloučenin modulujících aktivitu TPL-2, kde uvedený způsob zahrnuje expozici buněk obsahujících heterologní DNA kódující TPL-2, kde uvedené buňky produkují funkční TPL-2, působení alespoň jedné sloučeniny nebo směsi sloučenin nebo signálu, jehož schopnost modulovat aktivitu uvedené TPL-2 má být určena, a potom sledování změn způsobených uvedenou modulací v buňkách. Takové testy umožňují identifikaci modulátorů, jako jsou agonisté, antagonisté a alosterické modulátory, TPL-2. Termín sloučenina nebo signál modulující aktivitu TPL-2 označuje sloučeniny, které mění aktivitu TPL-2 tak, že aktivita TPL-2 • · · · · · ···· ··♦· ··· ♦···· • · ··· ······· • · · · · ·· • · · ·· · · · ve smyslu aktivace pl05 se liší za přítomnosti sloučeniny nebo signálu (ve srovnání se situací za nepřítomnosti uvedené sloučeniny nebo signálu).
Buněčné vyhledávací testy mohou být pomocí přípravy buněčných linií, ve kterých je exprese reporterového proteinu, tj. snadno testovatelného proteinu, jako je β-galaktosidasa, chloramfenikolacetyltransferasa (CAT) nebo luciferasa, dependentní na aktivaci pl05 TPL-2. Například, reporterový gen kódující jeden z polypeptidů uvedených výše může být umístěn pod kontrolu elementu reagujícího na NFKB, který je specificky aktivován p50. Pokud je element aktivován p50 heterodimery, musí být dána podmínka exprese alternativních Rel monomerů v předpověditelné úrovni. Takové testy umožňují detekci sloučenin, které přímo modulují funkci TPL-2, jako jsou sloučeniny antagonizující fosforylaci pl05 TPL-2 nebo sloučeniny, které inhibují nebo potencují jiné buněčné funkce nutné pro aktivitu TPL-2.
Alternativními testovacími formáty jsou testy, které přímo hodnotí zánětlivou odpověď v biologických systémech. Je známo, že konstitutivní exprese neregulovaného p50 vede ke vzniku zánětlivého fenotypu u zvířat. Buněčné systémy, jako jsou systémy závislé na uvolňování cytokinů nebo na proliferaci buněk, mohou být použity pro hodnocení aktivity p50.
Ve výhodném aspektu tohoto provedení předkládaného vynálezu je poskytnuta metoda pro identifikaci základních sloučenin pro farmacii použitelných v léčbě onemocnění obsahujících nebo způsobujících zánětlivou reakci, zahrnuje:
inkubaci testovaných sloučenin s TPL-2 molekulou a pl05, za podmínek, za kterých TPL-2 způsobuje přímo nebo nepřímo fosforylaci pl05 s referenční fosforylační účinností;
··· · · · · · • · · · · #······ • · · · · · · ····· ·· · stanovení schopnosti TPL-2 způsobovat fosforylaci, přímo nebo nepřímo, pl05 za přítomnosti testované sloučeniny nebo sloučenin; a selekci těch sloučenin, které modulují schopnost TPL-2 fosforylovat pl05 ve srovnání s referenční fosforylační účinností.
V případě, že TPL-2 nepřímo fosforyluje cílový polypeptid, například pl05, se mohou dějů účastnit další kinasy a tak může být test podle předkládaného vynálezu navržen tak, aby nepřímo detekoval cílový polypeptid nebo fosforylaci pl05 způsobenou TPL-2.
V dalším výhodném aspektu se předkládaný vynález týká způsobu pro identifikaci základních sloučenin pro farmacii, kde uvedený způsob zahrnuje:
- poskytnutí TPL-2 molekuly;
- inkubaci TPL-2 molekuly se substrátem, o kterém je známo, že je fosforylován TPL-2, a testovanou sloučeninou nebo sloučeninami; a
- identifikaci testované sloučeniny nebo sloučenin, které modulují fosforylaci substrátu.
Substrátem pro TPL-2 fosforylaci je MEK (EMBO J. 15: 817826, 1996). Výhodně je proto MEK použit jako substrát pro monitorování sloučenin schopných modulovat aktivitu TPL-2 kinasy. V jiném provedení může být vhodných testovacím substrátem jakýkoliv vhodný cílový polypeptid TPL-2, jako je, například, MEK-1, SEK-1, 1ΚΒ-α, 1κΒ-β, NFKBlplO5, NFkB a TPL2/COT. Konkrétně vynález poskytuje rekombinantní, fúsní proteinové konstrukty pro přípravu těchto substrátů, jako jsou vhodné modelové fúsní proteiny. Ve výhodném provedení mezi • · ·φ · · • · · · · · · φ φ φ φ φ φ ·· · • · · φ · φ φφφφ φ φ · ~Λ φφφφφφ··
Í)U φφφφφ φφ ··· modelové fúsni proteiny patři, například, GST-ΐκΒ-α(150), tj. aminokyselinové zbytky 1 až 50 IkB-oc fúsované na GST, a GSTpl05Ndel.498 (obsahující zbytky 498-969 pl05). Jiné peptidové substráty pro TPL-2/COT mohou být odvozeny z těchto proteinových substrátů a patří mezi ně například peptid odvozený od iKB-cc - NH2-DDRHDSGLDSMKDKKK-COOH (kde serinový zbytek uvedený tučně odpovídá serinovému zbytku 32 ΐκΒ-α) a peptid odvozený od MEK - NH2-QLIDSMANSFVGVTKKK-COOH (kde serinový zbytek uvedený tučně odpovídá serinovému zbytku 217 mek-1). Tyto a jiné TPL-2 cílové polypeptidy umožňují přímé vyšetřování na modulátory kinasy. Výhodně jsou modulátory kinasy (TPL-2) inhibitory.
Volitelně může být identifikovaná testovaná sloučenina podrobena testování in vivo pro stanoveních jejích účinků na TNF/plO5 signalizační dráhu, například jak bylo uvedeno v předešlém provedení.
2c. Sloučeniny modulující aktivitu TPL-2
Termín aktivita TPL-2, jak je zde použit, může označovat jakoukoliv aktivitu TPL-2, včetně jeho vazebné aktivity, ale zejména se týká fosforylační aktivity TPL-2. V souladu s tím může být způsob podle předkládaného vynálezu navržen tak, aby detekoval fosforylaci cílových sloučenin TPL-2, a týká se modulace této aktivity potenciálním terapeutickými činidly.
Příklady sloučenin, které modulují fosforylační aktivitu TPL-2, jsou dominantně negativní mutanty TPL-2. Takové sloučeniny soutěží o cílové skupiny s TPL-2, což snižuje aktivitu TPL-2 v biologickém nebo artificiálním systému.
Vynález se dále týká sloučenin schopných modulovat fosforylačni aktivitu TPL-2.
3. Sloučeniny
V ještě dalším aspektu se vynález týká sloučeniny nebo sloučenin identifikovatelných testy podle předkládaného vynálezu. V souladu s tím je zde poskytnuto použití sloučeniny identifikovatelné testem podle předkládaného vynálezu pro modulaci aktivity NFKB.
Sloučeniny, které ovlivňují interakci TPL-2/NFKB, zahrnují sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností, včetně organických sloučenin, které mohou být lineární, cyklické, polycyklické nebo kombinované, peptidů, polypeptidů včetně protilátek nebo proteinů. Obecně, termíny peptidy, polypeptidy a proteiny jsou zde považovány za rovnocenné.
3a. Protilátky
Termín protilátky, jak je zde použit, označuje kompletní protilátky nebo fragmenty protilátek schopné vazby na daný cíl, včetně Fv, ScFv, Fab' a F(ab')2, monoklonálních a polyklonálních protilátek, upravených protilátek včetně chimérických protilátek, protilátek s přeneseným CDR a artificiálně selektovaných protilátek produkovaných fágovou zobrazovací a jinými technikami. Malé fragmenty, jako jsou Fv a ScFv, mají výhodné vlastnosti pro diagnostické a terapeutické aplikace vzhledem k jejich malé velikosti a následné lepší tkáňové distribuci.
Protilátky podle předkládaného vynálezu jsou zejména určeny pro diagnostické a terapeutické účely. V souladu s tím to mohou být pozměněné protilátky obsahující efektorový protein, jako je toxin nebo značkovací skupina. Zejména výhodné jsou značkovací skupiny umožňující zobrazení distribuce protilátek in vivo. Takovými značkovacími činidly mohou být radioaktivní činidla nebo rentgen-kontrastní činidla, jako jsou kovové částice, které jsou snadno vizualizovatelné v těle pacienta. Dále se může jednat o fluorescentní činidla nebo jiná značkovací činidla, která jsou vizualizovatelná ve vzorcích tkáně odebraných od pacienta.
Technologie rekombinantní DNA může být použita pro zlepšení protilátek podle předkládaného vynálezu. Mohou být připraveny chimérické protilátky, pro snížení jejich imunogenicity v diagnostických a terapeutických aplikacích. Dále, imunogenicita může být minimalizována humanizací protilátek přenosem CDR (viz Evropská patentová přihláška 0239400 (Winter)) a volitelně, modifikací pracovního rámce (viz Mezinárodní patentová přihláška WO 90/07861 (Protein Design Labs.)).
Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být získány ze zvířecího séra nebo - v případě monoklonálních protilátek nebo jejich fragmentů, mohou být produkovány v buněčné kultuře. Technologie rekombinantní DNA může být použita pro produkci protilátek běžnými postupy, v bakteriální nebo lépe savčí buněčné kultuře. Vybraná buněčná kultura výhodně secernuje produkované protilátky.
Tak zahrnuje předkládaný vynález způsob pro produkci • · · · ·· • · · · · ·· ··· ······· · * · · · ·· • 9 ··· protilátky podle předkládaného vynálezu zahrnující kultivaci hostitele, například E: coli nebo savčí buňky, který byl transformován hybridním vektorem obsahujícím expresní kazetu obsahující promotor operativně navázaný na první DNA sekvenci kódující signální peptid navázaný ve správném čtecím rámci na druhou DNA sekvenci kódující uvedený protein, a izolaci uvedeného proteinu.
Dělení hybridomních buněk nebo savčích hostitelských buněk in vitro se provádí ve vhodném kultivačním mediu, jako jsou standardní kultivační media, například Dulbeccovo modifikované Eaglovo medium (DMEM) nebo RPMI 1640 medium, volitelně doplněné savčím sérem, například fetálním telecím sérem, nebo stopovými prvky a doplňky zpomalujícími růst, například současně kultivovanými buňkami, jako jsou normální buňky z myší peritoneální tekutiny, buňky sleziny, makrofágy kostní dřeně, 2-aminoethanol, insulin, transferin, lipoprotein o nízké densitě, kyselina olejová a podobně. Dělení hostitelských buněk, kterými jsou bakteriální buňky nebo kvasinky, se provádí podobně ve vhodném kultivačním mediu známém v oboru, například pro bakterie v mediu LB, NZCYM, NZYM, NZM, Terrific Broth, SOB, SOC, 2xYT nebo v M9 minimálním mediu, a pro kvasinky v mediu YPD, YEPD, Minimálním mediu nebo Complete Minimal Dropout Medium.
Při produkci in vitro se získají relativně čisté protilátkové přípravky a je možno získat velká množství požadovaných protilátek. Techniky pro kultivaci bakteriálních buněk, kvasinek nebo savčích buněk jsou dobře známé v oboru a patří mezi ně homogenní suspenzní kutura, například ve vzdušném reaktoru nebo v reaktoru s kontinuálním míšením, • 9 • ·
nebo imobilizovaná nebo zachycená kultura, například v dutých vláknech, mikrokapslích, na agarosových mikrokorálcích nebo na keramických patronách.
Velká množství požadovaných protilátek mohou být také získána dělením savčích buněk in vivo. Pro tento účel jsou hybridomní buňky produkující požadované protilátky injikovány histokompatibilním savcům za vzniku nádorů produkujících protilátky. Volitelně jsou zvířata před injekcí podpořena uhlovodíkem, konkrétně minerálními oleji jako je přistaň (tetramethyl-pentadekan). Po jednom až třech týdnech se protilátky izolují z tělesných kapalin těchto savců. Například, hybridomní buňky získané fúsí vhodných myelomových buněk s buňkami sleziny produkujícími protilátky od Balb/c myší, nebo transfektované buňky odvozené od hybridomní buněčné linie Sp2/0, které produkují požadované protilátky, se injikují intraperitoneálně Balb/c myším volitelně předléčeným přistáném, a potom se, po jednom až třech týdnech, odebírá od zvířat ascitická kapalina.
Výše uvedené a další techniky jsou popsány v, například, Kohler and Milstein, (1975), Nátuře, 256: 495-497; US 4376110; Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor, které jsou zde uvedeny jako odkazy. Techniky pro přípravu rekombinantních protilátek jsou popsány ve výše uvedených odkazech a také v, například, EP 0623679; EP 0368684 a EP 0436597, které jsou zde uvedeny jako odkazy.
Supernatanty buněčných kultur se vyšetřují na požadované protilátky, výhodně imunofluorescenčním barvením buněk exprimujících TPL-2 imunopřenosem, enzymovým imunotestem, • · · · · · · • · · · · · ♦ ··· ··♦···· · • *·· · ·· · například sandwichovým testem nebo testem na skvrnách, nebo radioimunotestem.
Pro izolaci protilátek mohou být imunoglobuliny v supernatantech kultur nebo v ascitické kapalině koncentrovány, například vysrážením se síranem amonným, dialýzou proti hygroskopickému materiálu jako je polyethylenglykol, filtrací přes selektivní membrány a podobně. Pokud je to nutné nebo žádoucí, jsou protilátky přečištěny běžnými chromatografickými metodami, jako je například gelová filtrace, iontoměničová chromatografie, chromatografie na DEAE-celulose a/nebo (imuno-)afinitní chromatografie, například chromatografie s TPL-2 molekulou nebo s proteinem A.
Vyná lez se dále týká hybridomních buněk secernujících monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu. Výhodné hybridomní buňky podle předkládaného vynálezu jsou geneticky stabilní, secernují monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu požadované specificity a mohou být aktivovány z hluboce zmrazených kultur rozmražením a reklonováním.
Vynález se také týká způsobu přípravy hybridomní buněčné linie secernující monoklonální protilátky k TPL-2 molekule, ve kterém je vhodný savec, například Balb/c myš, imunizován přečištěnou molekulou TPL-2, antigenním nosičem obsahujícím přečištěnou molekulu TPL-2 nebo buňkami nesoucími TPL-2, buňky produkující protilátky od imunizovaného savce jsou fúsovány s buňkami vhodné myelomové buněčné linie, hybridní buňky získané fúsí se klonují a buněčné klony secernující požadované • · · ···· · ·
-, ···*«···· 56 .···· ··· ····· protilátky se selektují. Například, buňky sleziny od Balb/c myší imunizovaných buňkami nesoucími TPL-2 se fúsují s buňkami myelomové buněčné linie PAI nebo myelomové buněčné linie Sp2/0-Agl4, získané hybridní buňky se vyšetřují na sekreci požadovaných protilátek a pozitivní hybridomní buňky se klonují.
Výhodný je proces pro přípravu hybridomních buněčných linií, ve kterém jsou Balb/c myši imunizovány podkožně a/nebo intraperitoneálně přibližně 107 až 108 buňkami z lidského nádoru, které exprimují TPL-2 s vhodným adjuvans, například 46-krát během několika měsíců, například 2-4, a buňky sleziny od imunizovaných myší se odeberou dva až čtyři dny po poslední injekci a fúsují se s buňkami myší myelomové linie PAI za přítomnosti fúzního promotoru, výhodně polyethylenglykolu. Výhodně jsou myelomové buňky fúsovány s troj- až dvanáctinásobným nadbytkem buněk sleziny od imunizovaných myší v roztoku obsahujícím přibližně 30% až přibližně 50% polyethylenglykolu o molekulové hmotnosti asi 4000. Po fúsi se buňky expandují ve vhodném kultivačním mediu jak bylo popsáno výše, doplňovaném o selekční medium, například HAT medium, ve vhodných intervalech, aby se zabránilo normálním myelomovým buňkám přerůst hybridomové buňky.
Vynález se také týká rekombinantní DNA obsahující insert kódující variabilní doménu těžkého řetězce a/nebo variabilní doménu lehkého řetězce protilátek namířených proti TPL-2 molekule, jak byly popsány výše. Podle definice takové DNA zahrnují jednořetězcové DNA, dvouřetězcové DNA obsahující uvedené kódující DNA a DNA komplementární k takovým DNA, nebo takové komplementární DNA samotné.
·· ·
Dále, DNA kódující variabilní doménu těžkého řetězce a/nebo variabilní doménu lehkého řetězce protilátek namířených proti TPL-2 molekule může být enzymaticky nebo chemicky syntetizovaná DNA obsahující autentickou DNA kódující variabilní doménu těžkého řetězce a/nebo variabilní doménu lehkého řetězce, nebo její mutant. Mutant autentické DNA je DNA kódující variabilní doménu těžkého řetězce a/nebo variabilní doménu lehkého řetězce uvedených protilátek, ve kterém je jedna nebo více aminokyselin deletovaná nebo substituovaná za jednu nebo více jiných aminokyselin. Výhodně jsou uvedené modifikace mimo CDR variabilní domény těžkého řetězce a/nebo variabilní domény lehkého řetězce protilátky. Takovou mutantní DNA je také silentní mutant, ve kterém jsou jeden nebo více nukleotidů nahrazeny jinými nukleotidy za vzniku nových kodonů kódujících stejné aminokyseliny. Takovou mutantní sekvencí je také degenerovaná sekvence. Degenerované sekvence jsou degenerované ve smyslu genetického kódu v tom, že neomezená množství nukleotidů jsou nahrazena jinými nukleotidy bez změny původně kódované aminokyselinové sekvence. Takové degenerované sekvence mohou být výhodné pro svá odlišná restrikční místa a/nebo frekvenci jednotlivých kodonů, které jsou přednostně využívány určitým hostitelem, například E. coli, pro získání optimální exprese variabilní domény myšího těžkého řetězce a/nebo variabilní domény myšího lehkého řetězce.
Termín mutant zahrnuje DNA mutanty získané mutagenezí autentické DNA in vitro za použití způsobů známých v oboru.
Pro sestavení kompletních tetramerních imunoglobulinových
44 4· · «·4 • 4 · · · ♦ 4 4 444
4 4 4 4 · 4 4 ·4 «4 444 4 4444 4444
4·· 444444
444 4· 44 · ····· molekul a expresi chimérických protilátek jsou rekombinantni
DNA inserty kódující variabilní domény těžkého a lehkého řetězce fúsovány s příslušnými DNA kódující konstantní domény těžkého a lehkého řetězce a potom jsou přeneseny do vhodných hostitelských buněk, například po inkorporaci do hybridních vektorů.
Vynález se také týká rekombinantních DNA obsahujících insert kódující variabilní doménu těžkého řetězce myší protilátky proti TPL-2 fušovanou na lidskou konstantní doménu gamma, například γΐ, γ2, γ3 nebo γ4, výhodně γΐ nebo γ4. Podobně se vynález týká rekombinantních DNA obsahujících insert kódující variabilní doménu lehkého řetězce myší protilátky proti TPL-2 fúsovanou na lidskou konstantní doménu κ nebo λ, výhodně κ.
i
V jiném provedení se vynález týká rekombinantni DNA kódující rekombinantni polypeptid, ve kterém jsou variabilní doména těžkého řetězce a lehkého řetězce spojeny oddělovací skupinou, volitelně obsahující signální sekvenci usnadňující zpracování protilátky hostitelskou buňkou a/nebo DNA kódující peptid usnadňující přečištění protilátky a/nebo štěpící místo a/nebo peptidovou oddělovací skupinu a/nebo efektorovou molekulu.
DNA kódující efektorovou molekulu je DNA kódující efektorové molekuly použitelné v diagnostických nebo terapeutických aplikacích. Zejména vhodné jsou efektorové molekuly, které jsou toxiny nebo enzymy, zejména enzymy katalyzující aktivaci proléčiv. DNA kódující takovou efektorovou molekulu má sekvenci DNA kódující přirozený enzym nebo toxin nebo jeho mutant, a může být připravena způsobem známým v oboru.
Protilátky a protilátkové fragmenty podle předkládaného vynálezu jsou použitelné v diagnostice a v terapii. Proto vynález poskytuje prostředky pro diagnostiku nebo terapii obsahující protilátky podle předkládaného vynálezu.
V případě diagnostických prostředků je protilátka výhodně dodána spolu s prostředkem pro detekci protilátky, kterým může být enzym, fluorescenční činidlo, radioizotop a nebo jiný prostředek. Protilátka a detekční prostředek mohou být určeny pro simultánní, simultánně separované nebo sekvenční použití, v diagnostickém kitu určeném pro diagnostiku.
3b.Peptidy
Peptidy podle předkládaného vynálezu jsou odvozeny od TPL2, pl05 nebo jiného polypeptidu účastnícího se funkční interakce TPL-2/plO5. Výhodně jsou peptidy odvozeny od domén TPL-2 nebo pl05, které jsou odpovědné za interakci plO5/TPL-2. Například Thornberry et al., (1994), Biochemistry 33: 39343940, a Milligan et al. (1995) Neuron 15: 385-393, popisují použití modifikovaných tetrapeptidů pro inhibici ICE proteasy. Analogicky, peptidy odvozené od TPL-2, pl05 nebo interagujícího proteinu, mohou být modifikovány, například aldehydovou skupinou, chlormethylketonem, (acyloxy)methylketonem nebo CHžOC(0)-DCB skupinou pro inhibici interakce TPL-2/plO5.
Pro usnadnění dodání peptidů do buněk mohou být peptidy
• 4«) 44 4 >4 4
• 4 4 4 · 4 4 4 4 44
• · · 4 4 4 4 4 4 4
• · 4 4 4 4 444« 4 4 4 4
• · » · 4 4 4 4 4
4·· 44 44 4 44 444
modifikovány tak, aby byla zlepšena jejich schopnost překonávat buněčnou membránu. Například, US 5149782 popisuje použití fusogenních peptidů, peptidů vytvářejících iontové kanály, membránových peptidů, mastných kyselin s dlouhým řetězcem a jiných činidel mísitelných s membránami,pro zvýšení přenosu proteinu přes buněčnou membránu. Tyto a další metody jsou také popsány ve WO 97/37016 a US 5108921, které jsou zde uvedeny jako odkazy.
Mnohé sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být výchozími sloučeninami pro vývoj léků. Použitelnými výchozími sloučeninami jsou zejména protilátky a peptidy a zejména intracelulární protilátky exprimované v buňkách při genové terapii, což může být použito jako model pro vývoj peptidových terapeutických činidel nebo terapeutických činidel s nízkou molekulovou hmotností. Ve výhodném aspektu vynálezu mohou být výchozí sloučenina a TPL-2/plO5 nebo jiný cílový peptid současně krystalizovány pro usnadnění vývoje vhodných sloučenin s nízkou molekulovou hmotností, které napodobují interakce pozorované pro výchozí sloučeninu.
Krystalizace vyžaduje přípravu krystalizačního pufru, například smísením roztoku peptidů nebo peptidového komplexu se zásobním pufrem, výhodně v poměru 1:1, s nižší koncentrací srážecího činidla, než je koncentrace nutná pro tvorbu krystalů. Pro tvorbu krystalů se koncentrace srážecího činidla zvýší, například přidáním srážecího činidla, například titrací, nebo se nechá koncentrovat srážecí činidlo pro dosažení rovnováhy difusí mezi krystalizačním pufrem a zásobníkovým pufrem. Za vhodných podmínek probíhá taková difuse srážecího činidla po směru gradientu srážecího činidla, φ · · například ze zásobníkového pufru majícího vyšší koncentraci srážecího činidla do krystalizačního majícího nižší koncentraci srážecího činidla. Difuse může být dosažena například difuse v páře umožňující difusi v běžné plynné fázi. Známými technikami jsou, například, difuse v páře, jako je padající kapky nebo nanesené kapky. Při technice difuse v páře se kapka krystalizačního pufru obsahující protein umístí nad nebo do mnohem většího zásobník zásobního pufru. Alternativně může být balancování srážecího činidla dosaženo pomocí semipermeabilní membrány, která odděluje krystalizační pufr od zásobního pufru a brání ředění proteinu do zásobního pufru.
V krystalizačním pufru má peptid nebo komplex peptid/vazebný partner výhodně koncentraci do 30 mg/ml, lépe od přibližně 2 mg/ml do přibližně 4 mg/ml.
Tvorba krystalů může být dosažena za různých podmínek, které jsou dány následujícími parametry: pH, přítomnost solí a pomocných složek, srážecí činidlo, koncentrace proteinu a teplota. pH může být v rozmezí 4,0-9,0. Koncentrace a typ pufru jsou dosti nevýznamné, a proto variabilní, například v závislosti na požadovaném pH. Vhodnými pufrovacími systémy jsou fosfátové, acetatové, citratové, Tris, MES a HEPES pufry. Mezi vhodné soli a pomocná činidla patří například chloridy, sírany a jiné soli známé odborníkům v oboru. Pufr obsahuje srážecí činidlo vybrané ze skupiny zahrnující organická rozpouštědla mísitelná s vodou, výhodně polyethylenglykol mající molekulovou hmotnost mezi 100 a 20000, lépe mezí 4000 a 10000, nebo vhodné soli, jako jsou sírany, zejména síran amonný, chlorid, citrát nebo vinan.
• ·
Krystal peptidu nebo komplexu peptid/vazebný partner podle předkládaného vynálezu může být chemicky modifikován, například derivatizací těžkým atomem. Stručně, taková derivatizace se provede ponořením krystalu do roztoku obsahujícího sůl těžkého kovu nebo organokovovou sloučeninu, například chlorid olova, thiomalat zlata, thimerosal nebo uranylacetat, které mohou difundovat krystalem a mohou se vázat na povrch proteinu. Umístění atomu těžkého kovu může být určeno rentgenovou difrakcí ponořených krystalů a tato informace může být použita, například, pro konstrukci trojrozměrného modelu peptidu.
Trojrozměrný model je možno získat, například, z derivátu krystalu s těžkým kovem a/nebo z úplných nebo částečných strukturálních dat získaných při krystalizaci. Výhodně obsahuje tvorba takových modelů modelování homologů a/nebo molekulové nahrazování.
Předběžný homologní model může být vytvořen kombinování přiřazování sekvence k jakékoliv MAPKK kinase nebo NFKB, která je známá (včetně IKBa, Baurle et al., (1988)·, Cell 95: 729731), predikcí sekundární struktury a vyšetřování strukturálních knihoven. Například, sekvence TPL-2 a testovaného peptidu mohou být přiřazeny za použití vhodného softwarového programu.
Software může být použit pro predikci sekundární struktury peptidu nebo peptidového komplexu. Peptidové sekvence mohou být vloženy do struktury TPL-2. Inkoherentnosti struktury, například strukturální fragmenty okolo insercí/delecí, mohou ··· ···· · • · ··· ···♦··· • c · · · · · ·*··· ·» ♦ · ’ 63 být modelovány pomoci skríningu knihovny na peptidy požadované délky a vhodné konformace. Pro predikci konformace vedlejšího řetězce může být použita rotamerová knihovna vedlejších řetězců.
Konečný homologický model se použije pro určení struktury krystalu peptidu pomocí molekulových náhrad za použití vhodného počítačového softwaru. Homologický model se umístí podle výsledků molekulových náhrad a potom se dále upravuje podle výpočtů molekulových dynamik a modelování inhibitoru použitého pro krystalizaci do elektronové density.
3a. Jiné sloučeniny
Ve výhodném provedení je výše uvedený test použit pro identifikaci peptidových, ale také nepeptidových testovaných sloučenin, které mohou modulovat TPL-2 aktivitu, například kinasovou aktivitu, interakce s cílovým polypeptidem nebo signalizační aktivitu. Testované sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být získány jakoukoliv z mnoha metod zahrnujících metody kombinatoriálních knihoven, včetně: biologických knihoven, prostorově určených paralelních knihoven v pevné nebo kapalné fázi; způsobů využívajících syntetických knihoven vyžadujících dekonvoluci; metodu knihoven jeden korálek - jedna sloučenina; a metody syntetických knihoven využívající selekce afinitní chromatografií. Tyto metody je možno použít pro peptidy, nepeptidové oligomery nebo knihovny sloučenin s malou molekulou (Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).
Příklady metod pro syntézu molekulových knihoven jsou uvedeny například v: De Witt et al. (1993) Proč. Nati. Acad • · 4 • ·«
Sci., USA, 90:6909; Erb et al. (1994) Proč. Nati. Acad. Sci.
USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994), J. Med. Chem. 37:2678;
Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994)
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33 :2059; Carell et al. (1994)
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33 :2061; a v Gallop et al. (1994)
J. Med. Chem. 37: 1233
Knihovny sloučenin mohou být připraveny v roztoku (např. Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), nebo na korálkách (Lam (1991) Nátuře 354:82-84), čipech (Fodor (1993) Nátuře 364:555-556), bakteriích (Ladner USP 5,223,409), sporách (Ladner USP '409), plasmidech (Culí et al. (1992) Proč. Nati.
Acad. Sci. USA 89:1865-1869) nebo na fágách (Scott and Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science 249:404406); (Cwirla et al. (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. 87:63786382); (Felici (1991) J Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner výše).
Pokud je to žádoucí, mohou být knihovny sloučenin rozděleny do preselektovaných knihoven obsahujících sloučeniny mající, například, danou chemickou strukturu nebo danou aktivitu, například inhibiční aktivitu vzhledem ke kinase. Preselekce knihovny sloučenin může dále zahrnovat provedení jakéhokoliv v oboru známého molekulového modelování pro identifikaci konkrétních sloučenin nebo skup n nebo kombinací sloučenin, u kterých je pravděpodobné, že budou mít danou aktivitu, reaktivní místo nebo jinou požadovanou chemickou funkci. V jednom provedení jsou modulátory TPL-2 preselektovány za použití molekulového modelování navrženého pro identifikaci sloučenin majících, nebo pravděpodobně majících, inhibiční aktivitu vzhledem ke kinase.
Vhodné metody, jak jsou známy v oboru, mohou být použity pro
• • · • ·· • • • • • ♦ · • ·
« A • · • • · · · • · •
• « • * • •
• ·* • « «
selekci určitých skupin pro interakci s určitou doménou TPL-2 nebo cílové složky, například pl05. Například může být použito vizuální prohlížení trojrozměrných modelů. Výhodně je počítačový modelovací program nebo software použit pro selekci jedné nebo více skupin, které mohou interagovat s určitou doménou. Mezi vhodné počítačové modelovací programy patří QUANTA (Molecular Simulations, lne., Burlington, MA (1992)), SYBYL (Tripos Associates, lne., St. Louis, MO (1992)), AMBER (Weiner et al., 1. Am. Chem. Soc. 106 : 765 784 (1984)) a CHARMM (Brooks et al., J. Comp. Chem. 4 : 187-217 (1983)). Dalšími programy, které mohou být použity pro selekci interagujících skupin, jsou GRID (Oxford University, U.K.; Goodford et al., J. Mod. Chem. 28 : 849-857 (1985)); MCSS (Molecular Simulations, lne., Burlington, MA; Miranker, A. a M. Karplus, Proteins: Structure, Function and Genetics II : 29-34 (1991)); AUTODOCK (Scripps Research Institute, La Jolla, CA; Goodsell et al., Proteins: Structure, Function and Genetics : 195-202 (1990)); a DOCK (University of California, San Francisco, CA; Kuntz et al., J. Mol. Biol. 161: 269-288 (1982).
Po selekci potenciálně interagujících skupin mohou být tyto skupiny navázány na skelet, který je zpřístupňuje vhodným způsobem pro interakci s vybranými doménami. Vhodné skelety a prostorová distribuce interagujících skupin na skeletech mohou být vizualizovány, například za použití fyzikálních nebo počítačových trojrozměrných modelů, nebo za použití vhodného počítačového programu, jako je CAVEAT (University of California, Berkeley, CA; Bartlett et al., v Molecular Recognition of in Chemical and Biological Problems, Speciál Pub., Royal Chemical Society 78 : 182-196 (1989)); trojrozměrných databází, jako je MACCS-3D (MDL Information Systems, San Leandro, CA (Martin, Y.C., J. Mod. Chem. 35:
• · ·
2145-2154 (1992)); a HOOK (Molecular Simulations, lne.). Mezi další počítačové programy, které mohou být použity pro vývoj a/nebo hodnocení potenciálních inhibitorů TPL-2, patří: LUDI (Biosym Technologies, San Diego, CA; Bohrn, H.J., J. Comp. Aid. Molec. Design: 61-78 (1992)), LEGEND {Molecular Simulations, lne.; Nishibata et al., Tetrahedron 47: 89858990 (1991)), a LeapFrog (Tripos Associates, lne.).
Dále, různé techniky pro modelování interakcí protein-lék jsou známé v oboru a mohou být použity ve způsobech podle předkládaného vynálezu (Cohen et al., J. Med. Chem. 33: 883894 (1994); Navia et al., Current Opinions in Structural Biology 2: 202-210 (1992); Baldwin et al., J. Mod. Chem. 32: 2510-2513 (1989); Appelt et al.; J. Mod. Chem. 34: 1925-1934 (1991); Ealick et al., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 88: 1154011544 (1991)).
Tak mohou být připraveny knihovny sloučenin, například sloučenin na bázi proteinů, uhlovodanů, lipidů, nukleových kyselin, přirozených organických sloučenin, syntetických organických sloučenin nebo protilátek a tyto knihovny mohou být podrobeny, pokud je to žádoucí, další preselekci využívající jakékoliv výše uvedené modelovací techniky. Vhodné sloučeniny určené pomocí těchto modelovacích technik jako modulátory TPL-2 mohou být potom vybrány ze zdrojů známých v oboru, jako jsou například komerční zdroje, nebo mohou být syntetizovány technikami známými v oboru tak, aby obsahovaly požadovanou skupinu, která způsobuje podle molekulového modelování inhibici TPL-2. Tyto sloučeniny mohou být potom použity, například, pro přípravu menších nebo více cílených knihoven sloučenin pro vyšetřování pomocí testů podle předkládaného vynálezu.
« · • · ··« ······· v · • « · · ♦ · · · · ··· e· · · 9 ·.· ·♦·
V souladu s tím může testovaná knihovna inhibitorů TPL-2 kinasy obsahovat, například, sloučeninu N-(6-fe a o < y -chinolyl)-N-[4-(fenylsulfanyl)fenyl]amin. Obecná syntéza 4—(4— -fenylthio-anilino)chinolylových derivátů se provede následujícím způsobem. Do 0,1 M roztoku ethyl 4-hydroxy-5-oxo-
5.6.7.8- tetrahydro-3-chinolinkarboxylatu ve směsi (1:1, obj./obj.) 1,2-dimethoxyethanu a dichlorethanu se přidá tetrachlormethan (10 mol. ekv.) a trifenylfosfin navázaný na polymer (3 až 6 ekv., Fluka). Směs se potom zahřívá za třepání v uzavřené zkumavce při 80 °C po dobu 36 hodin. Přidá se 4- (fenylthio)anilin (2-6 mol. ekv.; 0,5 M v terc-butanolu) a směs se zahřívá za třepání v uzavřené zkumavce při 90 °C po dobu 24 hodin. Potom se polymerová pryskyřice odfiltruje a promyje se methanolem. Filtrát a výplachy se zahustí ve vysokém vakuu a zbytek se zpracuje RP-HPLC. Podle analytické RP-HPLC (0-100% acetonitril/pH 4,5, 50 mM NH4OAC, při 3,5 ml/min na Perkin Elmer Pecosphere koloně (4,6 mm x 3 cm)) má 5-oxo-4-[4- (fenylsulfanyl) anilino]-5, 6,7,8-tetrahydro-3chinolinkarboxylat retenční čas 3,85 min a MH+ při m/z 419.
Pro přípravu N-(6-fenoxy-4-chinolyl)-N-[4-(fenylsulfanyl)fenyljaminu (anal. RP-HPLC RT: 4,32 min.; MS: MH+ 421) se provede postup uvedený výše za použití 4-hydroxy-6-fenoxychinolinu a 4-(fenylthio)anilinu.
Příbuzná sloučenina, 5-oxo-4-[4-(fenylsulfanyl) anilino]-
5.6.7.8- tetrahydro-3-chinolinkarboxylat, a/nebo jeho varianty mohou být také vybrány pro knihovnu a tato sloučenina může být připravena standardním způsobem následovně: 10 ekvivalentů tetrachlormethan a 3-6 ekv. trifenylfosfinu navázaného na pryskyřici se přidají do 0,1 M roztoku 4-hydroxy-5-5,6,7,8tetrahydro-3-chinolinkarboxylatu ve směsi (1:1) ethylenglykoldimethyletheru a dichlorethanu. Směs se potom « «· ·· · ·· · ···· · * · ···· • · · ···· · · · • « · β « «««···· · · «·· · · · · · · ·*·«· · · < ·· ·· · zahřívá při 80 °C po dobu 36 hodin. Přidá se nadbytek thiofenyanilinu (2-6 ekvivalentů) ve 250 ml terc-butanol a směs se zahřívá při 90° C po dobu 24 h. Polymerová pryskyřice se potom odfiltruje, promyje se methanolem a zbývající rozpouštědla se odstraní ve vysokém vakuu za zisku požadované testované sloučeniny.
Předpokládá se, že 4-(4-fenylthio-anilino)-chinolyl (a jeho deriváty) představuje chemickou třídu obsahujíc)'' sloučeniny vhodné pro inhibici kinas, například serin/threonin kinas, jako je například COT. Proto vynález zahrnuje všechny sloučeniny obsahující skelet znázorněný na obr. 14. V jednom provedení může být kruhovým systémem například dihydrochinolylový nebo tetrahydrochinolylový systém (viz obr. 14, tečkované čáry). Dále, skupiny R a R' mohou být nezávisle vybrány z následujících skupin: hydroxy, halogen,
-NHC(O)alkyl, -COOH, -C(O)O-alkyl, C(O)NH-alkyl, Ci-C6alkenyl, Ci-C6-alk/pyl, Ci-C6-alkyl, Ci-C6~alkoxy, aryloxy, substituovaná aryloxy, Ci~C6-alkylthio, Ci-Ce-alkylamino, kyano, perhalogenmethyl, perhalogenmethoxy, amino, mono nebo dialkylamino, aryl, substituovaný aryl, ara-alkyl a araalkoxy. Dále, je třeba si uvědomit, že R' může také znamenat (R’)n, kde n = 0, 1, 2, atd., takže jsou možné například mnohotné substituce R'. Je také třeba si uvědomit, že alkylové, alkenylové a/nebo alk i nylové skupiny mohou mít přímý nebo rozvětvený řetězec. Dále předkládaný vynález zahrnuje jakoukoliv sůl nebo analog, volnou bázi, tautomer, enantiomerický racemat, nebo kombinaci, obsahující nebo odvozenou od generické struktury znázorněné na obr. 14.
Jinou vhodnou sloučeninou pro testované knihovny je 3—(4— -pyridyl)-4,5-dihydro-2H-benzo[g]indazolmethansulfonat, a/nebo jeho varianta, a tato sloučenina je dostupná od Aldrich • «· · · ·· · 4 · · ♦ 4·· ® ·· · • · · « · · · · ·· • « · ♦ · · ··»· · · »» ·«· » · · · *· •·· «· ·» 4 ·· ···
Chemical Co., Inc. (katal. č. 80997-85-9).
Knihovna může také obsahovat sloučeninu 2chlorbenzo[1] [1, 9]- fenanthrolin-7-karboxylat sodný, a/nebo jeho varianta, a tato sloučenina může být může být připraveny standardními technikami a za použití struktury uvedené na obr. 12.
Odborníkům v oboru bude jasné, že požadované standardní modifikace sloučenin uvedených výše mohou být provedeny za použití různých v oboru známých technik a že takové modifikované sloučeniny spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.
V jednom provedení je testem buněčný nebo bezbuněčný test, ve kterém jsou buď buňky exprimující například TPL-2 polypeptid nebo buněčný lyzát nebo přečištěný protein obsahující TPL-2 kontaktovány s testovanou sloučeninou a měří se schopnost testované sloučeniny měnit aktivitu TPL-2, například kinasovou aktivitu, interakce s cílovým polypeptidem nebo signalizační aktivitu.
Jakýkoliv buněčný test může využívat, například, eukaryotické nebo prokaryotické buňky. Určení schopnosti vazby testované sloučeniny na TPL-2 nebo na cílový polypeptid TPL-2 může být provedeno, například, navázáním testované sloučeniny na radioizotop nebo enzymatické značkovací činidlo tak, že detekcí značkovacího činidla v komplexu může být stanovena vazba testované sloučeniny na polypeptid. například mohou být testované sloučeniny značeny 125I, 35S, 14C, 33P, 32P, nebo 3H, buď přímo, nebo nepřímo, a radioizotop může být detekován přímým počítáním radioemisí nebo scintilačním měřením. Alternativně mohou být testované sloučeniny značeny • «· · · 4· ·
4 4 4 4 4 4 4 44 ·«· »44· 44 • « · 4 4 «444444« • 4 · » f 4 44 « 4 4 9 4 *4 4«4 4 enzymaticky, například křenovou peroxidasou, alkalickou fosfatasou nebo luciferasou, a značkovací enzym může být detekován podle konverze vhodného substrátu na produkt.
Předkládaný vynález také zahrnuje určování schopnosti testované sloučeniny interagovat s cílovým polypeptidem bez značení jakéhokoliv z interagujících činidel. Například, mikrofyziometr může být použit pro detekci interakce testované sloučeniny s TPL-2 nebo cílovým polypeptidem bez značení kterékoliv z testovaných sloučenin, TPL-2 nebo cílového polypeptidu (McConneJl, H.M. et al., (1992) Science 257: 19061912). V ještě jiném provedení je testem podle předkládaného vynálezu bezbuněčný tes, ve kterém jsou, například, TPL-2 a cílový polypeptid kontaktovány s testovanou sloučeninou a určuje se schopnost testované sloučeniny měnit interakci. Tato interakce může a nemusí dále zahrnovat fosforylaci TPL-2 a/nebo cílového polypeptidu pro TPL-2. Vazba testované sloučeniny na cílový polypeptid může být určena přímo nebo nepřímo. Stanovení schopnosti vazby testované sloučeniny na polypeptid může být také provedeno za použití technik jako je Biomolecular Interaction Analysis (BIA) v reálním čase (Sjolander, S. and Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63: 23382345 a Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699705). Termín BIA označuje techniku pro studování bispecifických interakcí v reálném čase, bez značení kteréhokoliv z interagujících činidel (například BIAcore ) . Změny povrchové plasmonové resonance (SPR) mohou být použity jako ukazatel rekce mezi biologickými molekulami v reálném čase.
V mnoha postupech pro vyhledávání léků, které testují knihovny sloučenin a přirozených extraktů, jsou žádoucí vysoce výkonné testy pro maximalizaci počtu sloučenin vyšetřených za • ·· ·· · · · · 4 · ·· • · · · · · ·4 · · 4 · «······ • · 4 · · ·· »·* ·»4 * ♦ určitou dobu. Testy, které jsou prováděny v bezbuněčných systémech a které mohou být provedeny za použití přečištěných nebo semi-přečištěných proteinů, jsou často použity jako primární prohledávání, protože mohou být připraveny tak, aby umožňovaly rychlý vývoj a relativně snadnou detekci změny molekulového cíle, která je způsobena testovanou sloučeninou. Kromě toho, efekty jako je buněčná toxicita a/nebo biologická dostupnost testované sloučeniny mohou být v systémech in vitro ignorovány, protože test je primárně zaměřen na efekt léku na molekulový cíl ve smyslu alterace vazebné afinity na předchozí nebo následné elementy. Proto je v příkladném skríningovém testu podle předkládaného vynálezu vybraná sloučenina kontaktována s TPL-2 polypeptidem s nebo bez cílového polypeptidu pro TPL-2, například pl05 (Kieran et al., 1990, Cell 62: 1007-1018, viz též přír. č.' M37492) nebo ΐκΒ-α (Zabel et al., 1990, Cell 61: 255-265) a detekce a kvantifikace fosforylace TPL-2 a/nebo cílového polypeptidu se provede hodnocením účinnosti sloučeniny v inhibici tvorby fosforylovaného TPL-2 a/nebo fosforylovaného cílového polypeptidu pro TPL-2, například za použití radioaktivního izotopu. Účinnost testované sloučeniny může být hodnocena určením křivky dávka-odpověď z dat získaných za použití různých koncentrací testované sloučeniny. Dále může být proveden také kontrolní test pro získání základních hodnot pro srovnání. V jiném provedení jsou potenciální sloučeniny testovány a srovnávány s kontrolními sloučeninami se známou aktivitou, například s inhibitory majícími známou obecnou aktivitu, nebo alternativně, specifickou aktivitu, takže může být určena specificita testované sloučeniny. Tak mohou být použity obecné inhibitory kinas, například staurosporin (viz například Tamaoki et al., 1986, Biochem, Biophys. Res. Comm. 135: 397-402; Meggio et al., 1995, Eur. J. Biochem. 234: 317322) nebo, například specifické inhibitory kinas, jako jsou '· ·
99 ·· ·99
9 9 9 ··· 9 99 • 9 · · 9 · 999* 9 · 9 ·
9 9 9··* 9 · • 9' 9 9 9 9 » 9 · · 999 komerčně dostupné inhibitory PD 98059 (účinný inhibitor MEK, viz např. Dudley et al., 1995, PNAS 92: 7686-7689) a SB 203580 (účinný inhibitor p38 MAP kinasy, viz Cuenda et al., 1995, FEBS Lett. 364: 229-233).
Ve více provedeních testů podle předkládaného vynálezu může být žádoucí imobilizovat cílový polypeptid pro usnadnění separace komplexovaných nebo nekomplexovaných forem nebo pro umožnění automatizace testu (viz například příklad 4). Fosforylace nebo vazba TPL-2 a cílového polypeptidu za přítomnosti nebo nepřítomnosti testované sloučeniny může být provedena v jakémkoliv prostředku vhodném pro použitá činidla. Příklady takových prostředků jsou mikrotitrační plotny, testovací zkumavky a mikrocentrifugační zkumavky. V jednom provedení může být připraven fúsní protein, který obsahuje doménu umožňující navázání jednoho nebo obou proteinů na matrici. Například, glutáhion-S-transferasa/cílový polypeptid fúsní proteiny mohou být adsorbovány na glutathionsepharosové korálky (Sigma Chemical, St. Louis, MO) nebo na glutathionem derivatizované mikrotitrační plotny, které se potom konknují s testovanou sloučeninou a inkubují se za podmínek umožňujících fosforylaci nebo tvorbu komplexů (například při fyziologických podmínkách z hlediska solí a pH) . Po inkubaci se korálky nebo mikrotitrační plotny promyjí pro odstranění všech nenavázaných složek, v případě korálků se imobilizuje matrice, a komplexy se určí přímo nebo nepřímo, jak je popsáno, například, dále. Alternativně mohou být komplexy disociovány z matrice a úroveň vazby na cílový polypeptid nebo fosforylační aktivita mohou být měřeny standardními způsoby. Pro imobilizaci proteinů na matricích ve skríningových testech podle předkládaného vynálezu mohou být použity také jiné techniky.
• «
V ještě jiném aspektu vynálezu mohou být TPL-2 a cílový polypeptid použity jako zachycovací proteiny ve dvouhybridním testu nebo ve troj hybridním testu (viz např. US patent č. 5283317; Zervos et al., (1993), Cell 72: 223-232; Madura et al., (1993) J. Biol. chem. 268: 12046-12054; Bartel et al., (1993), Biotechniques 14: 920-924; Iwabuchi et al., (1993), Oncogene 8: 1693-1696; a Brent WO 94/10300), pro identifikaci jiných proteinů nebojsloučenin, které se váží na nebo interagují s TPL-2 a /nebo cílovým polypeptidem pro TPL2 .
Vynález se dále týká nových činidel identifikovaných výše uvedenými skríningovými testy a způsobů přípravy takových činidel za použití těchto testů. V souladu s tím obsahuje v jednom provedení vynález sloučeniny nebo činidla získatelná způsobem zahrnujícím kroky jakéhokoliv z výše uvedených skríningových testů (například buněčných testů nebo bezbuněčných testů). V jednom provedení vynález sloučeniny nebo činidla získatelná jakýmkoliv zde popsaným způsobem.
Vynález dále zahrnuje použití činidel, například molekuly TPL-2 nebo sloučeniny identifikované v předkládaném vynálezu, ve vhodném zvířecím modelu. Například, činidlo identifikované způsobem podle předkládaného vynálezu může být použito ve zvířecím modelu pro stanovení účinnosti, toxicity nebo vedlejších účinků léčby takovým činidlem. Alternativně může být činidlo identifikované způsobem podle předkládaného vynálezu použito ve zvířecím modelu pro stanovení mechanismu účinku takového činidla. Dále, pokud se takové činidlo jeví jako vhodné, může být podáno člověku, výhodně člověku s rizikem zánětlivého onemocnění.
Vynález dále zahrnuje použití nových činidel identifikovaných výše uvedenými skriningovými metodami pro diagnostiku, určení prognosy a léčbu jakéhokoliv ze zde uvedených onemocnění. Proto předkládaný vynález zahrnuje vývojt přípravu, syntézu, výrobu a/nebo produkci léku nebo farmaceutického prostředku pro diagnostiku, určení prognosy a léčbu jakéhokoliv ze zde uvedených onemocnění.
4. Farmaceutické prostředky
Ve výhodném provedení vynález poskytuje farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu nebo sloučeniny identifikovatelné jakoukoliv testovací metodou uvedenou v předešlých aspektech vynálezu.
Farmaceutický prostředek podle předkládaného vynálezu je prostředek obsahující sloučeninu nebo sloučeniny schopné modulovat pl05-fosforylační aktivitu TPL-2 jako aktivní složku. Obvykle je sloučenina ve formě farmaceuticky přijatelné soli, nebo ve formě analogu, volné baze, tautomeru, enantiomerického racematu nebo jejich kombinací. Aktivní složky farmaceutického prostředku obsahujícího aktivní složku podle předkládaného vynálezu by měly mít vynikající terapeutickou aktivitu, například při léčbě nádorů nebo jiných onemocnění spojených s proliferací buněk, infekcí a zánětlivých stavů, kdy jsou podány v dávce závisející na určitém případu. Například, vynález zahrnuje jakoukoliv sloučeninu, která ovlivňuje TPL-2 signalizaci. V jednom provedení může sloučenina inhibovat aktivitu TPL-2, která vede k chybné regulaci genů účastnících se zánětlivé reakce. Například, sloučenina, která inhibuje aktivitu TPL-2 a tak snižuje expresi genu pro TNF, je výhodnou sloučeninou pro léčbu, například, zánětlivých onemocnění. V jednom provedení mohou být sloučeniny identifikované způsoby podle ♦
•« v·
99 • · · · · předkládaného vynálezu použity pro léčbu zánětlivých onemocnění, jako je, například, revmatoidní artritida, roztroušená sklerosa (MS), zánětlivé onemocnění střevní (IBD), diabetes mellitus závislý na inzulínu (IDDM), sepse, psoriasa, rejekce transplantátu a onemocnění zprostředkované TNF. V jiném provedení může být jedna nebo více sloučenin podle předkládaného vynálezu použita v kombinaci se známou sloučeninou vhodnou pro léčbu určitého uvedeného onemocnění. V souladu s tím mohou být jedna nebo více sloučenin podle předkládaného vynálezu kombinovány s jednou nebo více známými sloučeninami pro léčbu výše uvedených kombinací tak, že může být jedinci podán jeden prostředek.
Dávkování může týt upraveno pro dosažení optimální terapeutické odpovědi. Například může být denně podáno několik dávek nebo může být dávka poměrně snižována podle terapeutické situace.
Aktivní složka může být podána běžným způsobem, například orálně, intravenosně (pokud je rozpustná ve vodě), intramuskulárně, podkožně, intranasálně, intradermálně nebo ve formě čípků nebo implantačně (například za použití molekul se zpomaleným uvolňováním). Podle způsobu podání může být aktivní složka potažena materiálem určeným pro chránění uvedené složky před působením enzymů, kyselin a jiných vlivů, které mohou inaktivovat uvedenou složku.
Pro podání aktivní složky jiným než parenterálním způsobem může být potažena nebo podána společně s materiálem bránícím její inaktivaci. Například může být aktivní složka podána v adjuvans, současně s inhibitory enzymů nebo v liposomech. termín adjuvans je použit v nej širším významu a zahrnuje jakoukoliv imunostimulační sloučeninu jako je interferon. Mezi φφ φ • · · φ φ φ φ φ ·· φ φ φ · φ φ φφφφ φ φ ·· φ φ φ · φ φ φ φφ φφφ φφ φφ · ····· zahrnutá adjuvans patří resorcinoly, neionické surfaktanty jako je polyoxyethylenoleylether a hexadecylpolyethylenether. Mezi enzymové inhibitory patří pankreatický trypsin.
Liposomy zahrnují CGF emulse voda-v-oleji-ve vodě, stejně jako běžné liposomy.
Aktivní složky může být také podána parenterálně nebo intraperitoneálně. Také mohou být připraveny disperze v glycerolu, kapalných polyethylenglykolech a jejich směsích a v olejích. Pro skladování a použití tyto prostředky také obsahují konzervační činidla zabraňující růstu mikroorganismů.
Mezi farmaceutické formy vhodné pro injekční použití patří sterilní vodné roztoky (pokud je složka rozpustná ve vodě) nebo disperze a sterilní prášky pro přípravu sterilních injekčních roztoků nebo disperzí před použitím. Ve všech případech musí být prostředek sterilní a musí být natolik tekutý, že ho lze snadno podat injekčně. Musí být stabilní za podmínek skladování a výroby a musí být zabráněno kontaminaci mikroorganismy, jako jsou bakterie a houby. Nosičem může být rozpouštědlo nebo disperzní medium, jako je, například, voda, ethanol, polyol (například glycerol, propylenglykol a kapalný polyethylenglykol a podobně), jejich vhodné směsi a rostlinné oleje. Vhodná tekutost může být udržována, například, pomocí potahů jako je lecitin, udržování vhodné velikosti částic v případě disperzí a pomocí surfaktantů.
Prevence působení mikroorganismů může být provedena pomocí různých antibakteriálních a antimykotických činidel, jako jsou, například, parabeny, chlorbutanol, fenol, kyselina sorbová, thimerosal a podobně. V mnoha případech bude žádoucí použití činidla upravujícího izotonicitu, například cukru nebo ·· · · « ♦ · ·· • · * ···♦ ·· • · « · · · ·♦·· · ··
9·· · ♦ · ♦♦ ··· ·· ·· · ·· chloridu sodného. Prodloužená absorpce injekčního prostředku může být dosažena pomocí činidel zpomalujících absorpci, jako je například monostearan hlinitý a želatina.
Sterilní injekční roztoky se připraví inkorporací aktivního činidla v požadovaném množství do vhodného rozpouštědla s různými dalšími přísadami uvedenými výše, a potom se provede sterilizace. Obecně, disperze se připraví inkorporací sterilizovaného aktivního činidla do sterilního vehikula, které obsahuje základní disperzní medium a požadované další složky, jak byly uvedeny výše. V případě sterilních prášků pro přípravu sterilních injekčních roztoků jsou výhodnými způsoby přípravy sušení ve vakuu a lyofilizace, při kterých se získá prášek tvořený aktivní složkou a dalšími vybranými složkami z jejich roztoku předem sterilizovaného filtrací.
Když je aktivní složka vhodným způsobem chráněna, jak bylo popsáno výše, může být podána orálně, například s inertním ředidlem nebo s asimilovatelným poživatelným nosičem, nebo může být uzavřena v kapslích z měkké nebo tuhé želatiny, nebo může být lisována do tablet, nebo může být inkorporována přímo do potravy. Pro orální terapeutické podání může být aktivní složka smísena s přísadami a může být použita pro přípravu tablet, bukálních tablet, pastilek, kapslí, elixírů, suspenzí, sirupů, medicinálních oplatek a podobně. Množství aktivní složky v takovém terapeuticky použitelném prostředku bude obvykle takové, že bude dosaženo vhodné dávky.
Tablety, pastilky, pilulky, kapsle a podobně mohou také obsahovat následující složky: pojivá jako je tragant, arabská klovatina, kukuřičný škrob nebo želatina; přísady jako je fosforečnan vápenatý; činidla podporující rozpadavost jako je kukuřičný škrob, bramborový škrob, kyselina alginová a
4 4 4 · · 4 4 44
444 4 · 4 44 · ·
444 · 4444 4444
44····444
444 44 ·♦ · ····· podobně; kluzná činidla jako je stearan horečnatý; a sladidla jako je sacharosa, laktosa nebo sacharin nebo chuťová korigens jako je pepermht, mátový olej nebo třešňová příchuť. Když je dávkovou jednotkou kapsle, může také obsahovat - kromě materiálů uvedených výše - kapalný nosič.
Různé jiné materiály mohou být přítomné jako potahy nebo pro modifikaci fyzikální formy dávkové jednotky. Například, tablety, pilulky nebo kapsle mohou být potaženy šelakem, cukrem nebo oběma materiály. Sirup nebo elixír mohou obsahovat aktivní složku, sacharosu jako sladidlo, methyl- a propylparabeny jako konzervační činidla, barvivo a chuťové korigens, jako je třešňová nebo pomerančová příchuť. Je samozřejmé, že jakýkoliv materiál použitý v přípravě jakékoliv dávkové jednotky musí být farmaceuticky čistý a v podstatě netoxický v použitém množství. Dále může být aktivní složka inkorporována do přípravků a prostředků se zpomaleným uvolňováním.
Termín farmaceuticky přijatelný nosič a/nebo ředidlo zahrnuje jakákoliv a všechna rozpouštědla, disperzní media, potahy, antibakteriální a antimykotická činidla, činidla upravující izotonicitu a zpomalující absorpci a podobně. Použití takových medií a činidel pro farmaceuticky aktivní substance je známé v oboru. Pokud není běžné medium nebo činidlo inkompatibilní s aktivní složkou, může být použito v terapeutické prostředku podle předkládaného vynálezu. Prostředek může také obsahovat doplňková aktivní činidla.
Je zejména výhodné připravit parenterální prostředky ve formě dávkových jednotek, což usnadňuje podání a uniformitu dávky. Dávková jednotka je fyzikálně samostatná jednotka vhodná pro podání léčenému savci; každá jednotka obsahuje ··♦· předem určené množství aktivního materiálu vypočítané pro dosažení požadovaného terapeutického účinku, společně s vybraným farmaceutickým nosičem. Specifikace pro dávkové jednotky podle předkládaného vynálezu jsou určeny: (a) jedinečnými charakteristikami aktivního materiálu a požadovaným terapeutickým účinkem; a (b) omezeními v přípravě prostředků obsahujících aktivní materiál pro léčbu jedinců s onemocněním, u kterých je celkový zdravotní stav narušen.
Základní aktivní složky jsou použity v prostředcích pro vhodné a účinné podání v účinných množstvích a společně s vhodnými farmaceuticky přijatelnými nosiči, ve formě dávkové jednotky. V případě prostředků obsahujících doplňková aktivní činidla jsou jejich dávky určeny podle běžných dávek a způsobu podání uvedených činidel.
V dalším aspektu vynález poskytuje aktivní činidlo podle předkládaného vynálezu pro použití při léčbě onemocnění buď samostatně, nebo v kombinaci se sloučeninami vhodnými pro léčbu daného onemocnění. Proto vynález poskytuje použití aktivní složky podle předkládaného vynálezu pro výrobu léku použitelného pro léčbu onemocnění spojených s indukcí nebo represí NFKB.
Dále vynález poskytuje způsob léčby onemocnění spojených s indukcí nebo represí NFkB, který zahrnuje podání terapeuticky účinného množství sloučeniny nebo sloučenin identifikovaných testy uvedenými výše jedinci.
Vynález je dále popsán, pro ilustraci, v následujících příkladech.
Příklady provedeni vynálezu
Přiklad 1: Identifikace interakcí mezi TPL-2 a pl05
Pro identifikaci možných cílů pro TPL-2 se provedlo dvouhybridové vyšetřování za použití zlepšené párovací strategie (Fromont-Racine et al., (1997) Nátuře Gene. 16:277282). TPL-2 cDNA, subklonovaná do pAS2AA vektoru, se použila jako návnada pro vyšetřování lidské jaterní cDNA knihovny (od Dr. Legrain, Pasteur Institute, Paris).
Z 22 x 106 diploidních kvasinkových kolonií se získalo 68 klonů pozitivních na HIS3 selekci a expresi LacZ. Interagující proteiny se identifikovaly DNA sekvencováním a potvrdily se retransformací do kvasinek.
z 68 pozitivních klonů kódovalo ΐκΒ-podobný C-konec NFKB1 pl05 (obr. 2a). Současné imunosrážení pl05 s TPL-2, syntetizovaným bezbuněčnou translací, potvrdilo, že dva proteiny interagují při vysoké stochiometrii (obr. lb). TPL-2 a pl05 se syntetizovaly společně a značily se [35S]-Met (Amersham Pharmacia Biotech), bezbuněčnou translací za použití Promega TNT vázaného králičího retikulocytového systému. Translatované proteiny se naředily v lyzačním pufru A (Salmeron, A., et al. (1996) EMBO.l 15: 817-826) plus 0,1 mg/ml BSA a imunosrážely se způsobem popsaným ve výše uvedeném odkazu. Izolované proteiny se separovaly SDS-PAGE a vizualizovaly se fluorografií.
V pokusech, ve kterých je pl05 translatován s nadbytkem TPL-2, byla stechiometrie komplexu TPL-2/plO5, izolovaného pomocí anti-TPL-2 protilátky, přibližně 1:1. Kinasa-inaktivní ·· · mutant TPL-2 se asociuje s p 105 s přibližně stejnou stechiometrií.
Pro potvrzení TPL-2/plO5 interakcí in vivo se endogenní proteiny imunosrážely z HeLa buněk. Imunosrážení a westernová hybridizace endogenních proteinů z buněčných lyzátů konfluentních HeLa buněk (90 mm disky; GibcoBRL), se provedly popsaným způsobem (Kabouridis, et al., (1997) EMBO. J.
16:4983-4998), po extrakci v pufru A a odstředění při 100000 x g po dobu 15 minut. Anti-TPL-2 protilátka, TSP3, byla již také popsána (Salmeron, A., et al. (1996) EMBO J. 15: 817-826).
Protilátky k NF-KB1(N) (Biomol. Research Labs), Rel-A (Santa Cruz) a c-Rel (Santa Cruz) se získaly od uvedených dodavatelů. Anti-myc Mab, 9E10 (Dr. G. Evan, ICRF, London), se použila pro imunosrážení a imunofluorescenci myc-pl05/myc-p50, zatímco anti-myc antisérum (Santa Cruz) se použilo pro imunopřenos. Anti-HA Mab, 12CA5, se použila pro imunofluorescenční barvení HA-p50.
Westernová hybridizace jasně prokázala specifické současné imunosrážení pl05 s TPL-2 (obr. 3a). p50, RelA a c-Rel se také specificky imunosráží s TPL-2. Nicméně, in vitro pokusy selhaly v detekci jakékoliv přímé asociace mezi TPL-2 a p50 (generované z p48 mutantu; obr. 2b, dráha 14), Rel-A nebo cRel. Proto je pl05 asociovaný s TPL-2 in vivo pravděpodobně v komplexu s Rel podjednotkami prostřednictvím N-koncové Rel homologické domény (RHD) pl05 (Ghosh et al., (1998) Annu. Rev. Immunol. 16: 225-260).
Stechiometrie interakce TPL-2 s pl05 in vivo je zkoumána imunodeplecí lyzátů HeLa buněk pomocí anti-NFKBl(N) antiséra).
• «· • ·· ·
• · • • • • • * • • ·
• • • • • • 9 • • •
• • • 9 · • ···♦ • · • •
• • • • • • • •
«« * 99 ·· • • · ·
Westernová hybridizace anti-TPL-2 imunosraženin prokázala, že v podstatě veškerý detekovatelný TPL-2 je odstraněn z NFkBI depletovaných buněčných lyzátů (obr. 3b, dolní panel). Imunodeplece TPL-2 odstraňuje přibližně 50% celkového buněčného pl05. Tak je v HeLa buňkách v podstatě všechen TPL-2 v komplexu s velkou frakcí celkového pl05, což je v soouladu s daty získanými in vitro naznačujícími interakce s vysokou stochiometrií (obr. 1, bac).
Příklad 2: Analýza mutantů TPL-2 a pl05
A. Deleční mutanti
TPL-2 deleční konstrukty byly subklonovány do pcDNA 3 expresního vektoru (Invitrogen). Adice N-koncového myc epitopu k TPL-2 cDNA, tvorba TPL-2 delečních mutantů (obr. la) a TPL2(A270) kinasa-inaktivních mutantů (bez koncovky) se provedly PCR s vhodnými oligonukleotidy a potvrdily se DNA sekvencováním. Kompletní TPL-2 se použil bez koncového mycepitopu, pokud není v legendě k obrázku uvedeno jinak. Mycpl05 deleční mutanti a HA-p50, subklonované buď do pcDNAl (Invitrogen) nebo do pEF-BOS expresních vektorů, byly popsány dříve (Watanabe et al., (1997), EMBO J. 16: 3609-3620; Fan et al., (1991), Nátuře 354: 395-398) s výjimkou myc-NÁ-plO5, který byl připraven PCR a byl subklonován do pcDNA3. V pokusech uvedených na obr. 1 se pl05 cDNA bez koncovky, subklonovaná do pRc-CMV expresního vektoru (Invitrogen), použila pro translaci pl05 (Blank et al., (1991) EMBO J., 10: 4159-4167) .
Imunoprecipitační pokusy provedené způsobem podle příkladu
• ·* ·· • ·· •
<· · · • · • v • ··
• · · 1 · • · • • •
• · · • · · ···· • · • •
• · · • · • • • •
·· • 4· ···
s delečními mutanty TPL-2 a pl05 odhalily, že tyto dva proteiny interagují prostřednictvím svých C-konců (obr. 1 a 2). Zejména zajímavé bylo že onkogenní mutant TPL-2, TPL-2AC (Salmeron, A., et al., (1996) EMBO J., 15:817-826), který neobsahuje C-konec, není účinné imunoprecipitován s pl05 (obr. lb, dráhy 5 a 6). Dále, GAL4 fúze na C-koncových 92 aminokyselin TPL-2 interaguje s pl05 C-koncem (zbytky 459-969) ve kvasinkovém dvouhybridovém testu. In vitro se zdá, že TPL-2 interaguje se dvěma regiony na C-konci pl05 (obr,. 2b, pravý panel), jedním v posledních 89 aminokyselinách a jiným mezi zbytky 545 a 777. Izolovaný C-konec pl05 je dostatečný pro tvífobu stabilních komplexů s TPL-2 (obr. 2c).
B. Dominantně negativní TPL-2
Je důležité určit, zda efekty exprese TPL-2 na proteolýzu pl05 (viz dále) odrážejí jeho normální fyziologickou funkci. Proto byl kinasa inaktivní TPL-2(A270) testován na svou schopnost agonistou indukovanou degradaci pl05. 1 x 107 Jurkat T-lymfocytů se současně transfektuje, elektroporací, TPL2(A270) cDNA subklonovanou do PMT2 vektoru (5 pg), a selekčním vektorem, J6-hygro (0,5 pg). Kontrolní buňky se současně transfektují PMT2 kontrolním vektorem a J6 hygro. Transfektované buňky se klonovaly limitním ředěním a selektovaly se podle resistence na hygromycin (0,5 mg/ml). Exprese TPL-2(A270) v připravených klonech se určila westernovou hybridizací. Pulsní metabolické značení Jurkat klonů se provedlo jako pro 3T3 buňky, za použití 8 x 106 buněk na bod.
V Jurkat T lymfocytech stabilně exprimujících kontrolní prázdný vektor nebo v netransfektovaných původních buňkách ♦ · · · · · · • · · · · · · • · ··· · · · • · · 9 ······ 9 · stimuluje TNF-a degradaci pl05 (obr. 7a), což je v souladu s dřívějšími studiemi (Mellits et al., (1993), Nuc. Acid. Res. 21: 5095-5066). Nicméně, stimulace Jurkat T lymfocytů, které jsou transfektovány tak, aby exprimovaly TPL-2(A270), TNF-a, má malý vliv na obrat pl05 (obr. 7a). Proto je aktivita TPL-2 pro TNF-a pro indukci degradace pl05 a aktivita TPL-2 může být blokována expresí jeho dominantně negativního mutantu.
Tento výsledek byl potvrzen v dalším pokusu, který prokázal inhibici transkripčního aktivačního potenciálu pl05/TNF dominantně negativním TPL-2. Jurkat T lymfocyty byly transfektovány způsobem uvedeným výše, za použití reporterového konstruktu indukovaného TNF řídícího luciferasový gen. Současná exprese kinasa-inaktivního TPL-2 nebo zkráceného C-konce TPL-2, který neobsahuje kinasovou doménu, znatelně snižovala expresi luciferasového genu (viz obr. 8).
Příklad 3: Funkční interakce pl05 a TPL-2 (A) Aktivace NFkB
Pro výzkum toho, zda TPL-2 aktivuje NFKB cestou pl05 se dočasně transfektovaný TPL-2 nejprve testoval na svou schopnost aktivovat NFkB reporterový gen. Pro test na NFKB reporterový gen se Jurkat T lymfocyty současně transfektovaly (Kabouridis et al., (1997) EMBO J. 16: 4983-4998) 2 gg plasmidu obsahujícího 5 tandemových repetitivních sekvencí konvenčního NFKB zesilovače transkripce před luciferasovým genem (Invitrogen) spolu s uvedeným množstvím vhodných expresních vektorů. TPL-2 a NIK cDNA se všechny subklonovaly do pcDNA3 vektoru Salmeron et al., 1996; malinin et al., 1997, Nátuře 385: 540-544). Množství transfektované DNA se udržovalo konstantní doplňování prázdným pcDNA3 vektorem. Luciferasové pokusy (Kabouridis et al., 1997) se provedly alespoň třikrát za zisku podo^bných výsledků.
Exprese TPL-2 aktivuje reporterový gen více než 140-krát (obr. 3c), což je podobná úroveň, jako při indukci NIK, příbuzného MAP 3K enzymu, který aktivuje NFKB stimulací degradace Ικ B-a (Malinin et al., 1997; May, M.J. and Ghosh, S:, 1998, Immunol. Today, 19: 80-88. Kinasa - inaktivní bodová mutace, TPL-2(A270), nemá vliv na indukci NFKB. Exprese TPL2AC, který netvoří stabilní komplex s pl05 ani in vitro (obr. lb), ani in vivo, vede k pouze velmi slabé aktivaci (12násobné) NFKB ^rporteru (obr. 3c). Pro potvrzení toho, že TPL-2 musí být pro účinnou aktivaci NFKB v komplexu s pl05 se Ckoncový fragment pl05, 3NN' (obr. 2a) současně exprimoval s TPL-2. Tento C-koncový fragment interaguje se současně transfektovaným TPL-2 in vivo a soutěží o vazbu s endogenním pl05. Současná exprese 3NN' dramaticky inhibuje aktivaci NFKB reportéru TPL-2, ale ne NIK (obr. 3d). Dohromady tato data naznačují, že transfektovaný TPL-2 účinně aktivuje NFKB a zdá se, že tento účinek vyžaduje přímou interakci s pl05. Toto naznačuje, že TPL-2 může přímo aktivovat pl05.
(B) Jaderná translokace NFKB
Pokud exprese TPL-2 aktivuje pl05, může v důsledku toho dojít k jaderné translokaci NFKB1. Pro zkoumání tohoto děje se použit imunofluorescenční test na 3T3 fibroblastech, ve kterých je odlišení mezi cytoplasmou a jádrem snadné. Stručně, 3T3 buňky se dočasně transfektovaly uvedenými vektory a kultivovaly se na krycích sklíčkách po dobu 24 hodin. Buňky se potom fixovaly, permeabilizovaly se a barvily se uvedenými ♦ ·· ·· · ·· · ««·· ··· ···· ··· · · · · P · · • · · · · ·«····* · · • · · · · · ··· ····· · · « ·· ··· protilátkami a vhodně fluorescenčně značenými sekundárními protilátkami, jak bylo popsáno dříve (Huby et al. (1997) J. Cell. Biol. 137: 1639-1649). Leica TCS NT konfokální mikroskop se použil pro Vizualizaci jednotlivých optických řezů barvených transfektovaných buněk.
V buňkách transfektovaných myc samostatně nebo společně s kinasa-inaktivním TPL-2(A270) bylo anti-myc barvení omezeno na cytoplasmu (obr. 4a, horní panely), což je v souladu s funkcí pl05 jako IKB. Nicméně, současná exprese s TPL-2 indukuje kvantitativní posun anti-myc barvení do jádra (obr. 4a, dolní panely). Frakcionace buněk westernová hybridizace potvrdily, že jaderný NFKB signál v buňkách transfektovaných TPL-2 je myc-p50 místo myc-pl05, který je omezen na cytoplasmu (obr. 4b). Tato data naznačují, že exprese TPL-2 indukuje jadernou translokaci myc-p50 v důsledku buď zvýšeného zpracování současně transfektovaného myc-pl05 na myc-p50, nebo jeho degradace pro uvolnění asociovaného myc-p50.
Pro stanovení toho, zda musí TPL-2 indukovat proteolytické zpracování pl05 pro navození jaderné translokace p50 byly 3T3 buňky transfektovány vektory kódujícími myc-plO5AGRR, který nemůže být zpracován na myc-p50, spolu s HA-p50 na separovaném plasmidu. HA-p50 se lokalizuje do jádra, je-li současně exprimován s TPL-2(A270) (obr. 5, horní panely) nebo prázdným vektorem. Myc-plO5ÁGRR zachovává HA-p50 v cytoplasmě buněk současně transfektovaných s TPL-2(A270) (obr. 5, střední panely). Nicméně, současná exprese TPL-2 s myc-plO5ÁGRR indukuje kvantitativní posun HA-p50 barvení do jádra (obr. 5, dolní panely). Proto TPL-2 aktivace jaderné translokace p50 nevyžaduje stimulaci zpracování pl05 na p50. Tato data podporují teorii, že TPL-2 indukuje degradaci pl05 za uvolňování asociovaného p50, nebo jiných asociovaných Rel
• ♦ · • · • 9 9 » · • 9 9 9 9
•« · • ·
• e · • 9999 • · 9 •
• · • · • 9 • 9 •
··· • · b ♦ 9 • * »
podjednotek, a jejich translokace do jádra a tak generování aktivního NFKB.
(C) Biologická aktivita NFKB
Test posunu elektroforetické mobility (EMSA) se provedl způsobem popsaným dříve (Alkalay, I. et al., 1995, Mol. Cell Biol. 15: 1294-1301), za použití radioaktivně značeného dvouřetězcového oligonukleotidu (Promega), který koresponduje NFKB vazebnému místu v myším IgK zesilovači transkripce (Lenardo, M.J., and Baltimore, D, 1989, Cell 58: 227-229), pro potvrzení toho, že jaderný myc-p50 produkovaný z myc-pl05 v buňkách současně exprimujících TPL-2 je biologicky aktivní.
Exprese TPL-2 vede k jasnému zvýšení dvou KB-vazebných komplexů (obr. 4, dráha 2), což odpovídá aktivaci NFKB reporterového genu v Jurkat T lymfocytech (obr. 3c) . Myc-pl05 exprese samotná mírně zvyšuje vazebnou aktivitu spodního KB komplexu (obr. 4c, dráha 3). Nicméně, současná exprese mycpl05 s TPL-2 vede k synergnímu zvýšení vazebné aktivity dolního KB komplexu (obr. 4c, dráha 4). Kinasa-inaktivní TPL2(A270) nemá vliv na vazebnou aktivitu KB (obr. 4c, dráha 5). Zpracování deficientního mutantu pl05, myc-plO5AGRR (Watanabe et al., 1997, EMBO J., 16: 3609-3620), také selhává ve vyvolání KB vazebné aktivity za přítomnosti nebo nepřítomnosti současně exprimovaného TPL-2 (obr. 4c, dráhy 6 a 7).
Anti-myc Mab silně reagují s indukovaným dolním kb komplexem v buňkách současně transfektovaných TPL-2 a myc-pl05, což způsobuje superposun (obr. 4c, dráha 8). Toto potvrzuje přítomnost zpracovaného myc-p50 v tomto komplexu. Indukovaný dolní komplex nereaguje s protilátkami k Rel-A (obr. 4c, dráha
9) nebo c-Rel. Proto současná exprese TPL-2 s myc-pl05 stimuluje produkci aktivních komplexů NFKB, primárně obsahujících dimery myc-p50, které jsou nadměrně produkovány v buňkách transfektovaných myc-pl05. Analýzy superposunů jaderných extraktů z buněk transfektovaných TPL-2 samotným (obr. 4c, dráha 2) ukázaly, že hlavní indukovaný endogenní NFKB komplex je složen z p50/Rel-A dimerů (obr. 4c, dráha 9).
(D) Biologické účinky TPL-2 na pl05
Pulsní metabolické značení se provedlo pro určení toho, zda TPL-2 reguluje proteolýzu myc-pl05 ve 3T3 fibroblastech. Pro pulsní metabolické značení se NIH-3T3 fibroblasty přechodně transfektovaly za použití LipofecAMINE (Gibco-BRL) (Huby et al., 1997, J. Cell. Biol. 137: 1639-1649). Příprava cytoplasmatických a jaderných frakcí se provedla popsaným způsobem (Watanabe et al., 1997, EMBO J., 16: 3609-3620). Pro pulsní metabolické značení se 2,7 x ΙΟ5 3T3 buněk na 60 mm disk (Nunc) transfektovalo uvedenými expresními vektory. Po 24 hodinách se buňky promyly a kultivovaly se v mediu bez Met/Cys po dobu 1 hodiny. Buňky se potom značily 145 Mbq [35SJMet/[35S]-Cys (Pro-Mix, Amersham, Pharmacia Biotech) na disk po dobu 30 minut a po promytí se sledovaly v kompletním mediu po uvedené doby. Buňky se lyžovaly v pufru A (Salmeron et al.) doplněném 0,1% SDS a 0,5% deoxycholatem (RIPA pufr) a imunosrážené proieiny se vizualizovaly fluorografií. MG132 proteasomový inhibitor (Biomol Research labs) se přidal v koncentraci 201 M během alespoň 15 minutové periody bez Met/Cys a tato jeho koncentrace se udržovala během sledování. Značené proužky se kvantifikovaly laserovou densitometrií za použití Molecular Dynamics Personál Densitometer. Všechny pulsní pokusy se provedly alespoň dvakrát s podobnými výsledky.
·«· · · ··· 4 • · · 4 · · · 4 ·· · • · · 4 4 4 4 4 44 • 4 · · 4 44444*4 ·4 • 44 · · ·«44
4 4 4 4 ·4 4 4 · 44 4
Současná exprese TPL-2 snižuje poločas myc-pl05 z přibližně 5,5 na 1,8 hodiny (obr. 5 a a b). Srovnání rychlosti snižování myc-pl05 s produkcí myc-p50 naznačuje, že většina myc-pl05 je prostě degradována, spíše než konvertována na myc-p50 (obr. 6a), jak bylo předpokládáno dříve (Lín et al., (1998), Cell
92: 819-828). Nicméně, současná exprese TPL-2 nemění celkovou rychlost produkce myc-p50, který je v těchto buňkách vytvářen především posttranslačně z myc-pl05 (obr. 6a), spíše než nedávno popsaným ko-translačním mechanismem (Lín et al., 1998). Protože je myc-p50 vytvářen podobnou rychlostí v buňkách současně transfektovaných TPL-2 a v kontrolních buňkách, ale z progresivně se snižujících množství myc-pl05 (obr. 6c), lze předpokládat, že TPL-2 dramaticky zvyšuje účinnost zpracování myc-pl05. Současná exprese TPL-2 podporuje degradaci myc-plO5AGRR (obr. 6d), podobně jako přirozeného pl05 (obr. 6b). Kinasa-inaktivní TPL-2(A270) nemá, nicméně, žádný detekovatelný vliv ani na degradaci (obr. 6e), ani na zpracování současně exprimovaného myc-pl05.
Efekt aldehydu peptidu MG132, účinného inhibitoru proteasomu, se určí testováním toho, zda je proteolýza mycpl05 indukovaná TPL-2 zprostředkována proteasomem. Přidání MG132 blokuje zvýšený obrat myc-pl05 (obr. 6f) a zcela brání produkci myc-p50 v buňkách současně exprimujících TPL-2. Závěrem, testy s pulsním metabolickým značením ukázaly, že hlavním efektem exprese TPL-2 je zvýšení rychlosti degradace myc-pl05 proteasomem. Nicméně, ve stejnou dobu není celková produkce myc-p50 z myc-pl05 v proteasomu alterována.
Pro stanovení efektu exprese TPL-2 na rovnovážný stav mycpl05/myc-p50 byly 3T3 buňky přechodně současně transfektovány uvedenými vektory a byly lyžovány v RIPA pufru po 24 hodinách.
* * · ·· · ·9 «··· · ♦ · ··· * · · · · · · • · ·*« *
Westernové přenosy buněčných lyzátů se potom sondovaly antimyc antisérem. Proužky se kvantifikovaly laserovou densitometrii. Westernové přenosy lyzátů z dočasně transfektovaných 3T3 buněk prokázaly, že rovnovážný poměr mycp50/myc-pl05 se významně zvyšuje při současné expresi TPL-2 ve srovnání s kontrolou (obr. 6g).
Tak je v buňkách transfektovaných TPL-2 myc-p50 exprimován ve větším molárním nadbytku než myc-pl05 (myc-p50/myc-pl05 = 10,3 + SE 1,3; n = 2), zatímco v kontrolních buňkách jsou mycpl05 a myc-p50 téměř ekvimolární (myc-p50/myc-pl05 = 0,93 ± SE 0,07; n = 2)Myc-p50 se translokuje do jader buněk současně transfektovaných TPL-2 proto, že je zde nedostatek myc-pl05 pro jeho zachování v cytoplasmě.
NIK fosforyluje a aktivuje dvě příbuzné kinasy, označené
IKK-a (IKK-1) a ΙΚΚ-α (IKK-2), které potom fosforylují regulační šeřiny v N-konci ΐκΒ-α. Toto spouští ΐκΒ-α ubikvitinaci a degradaci proteasoemm. Pro zkoumání toho, zda fosforylace způsobuje posun mobility v myc-pl05 současně exprimovaném s TPL-2, se promyté anti-myc imunosraženiny resuspendovaly v pufru obsahujícím 50 mM Tris, pH 7,5, 0,03% Brij-96, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA. Ke vhodným vzorků se přidala telecí střevní fosfatasa (CIP; Bohringer Mannheim) v koncentraci 400 U/ml s nebo bez inhibitorů fosfatasy ortovanadatu sodného (1 mM), fluoridu sodného (5 mM) a kyseliny okadové (0,1 μπι) . Po inkubaci při 37 °C po dobu 1 hodiny se imunoprecipitovaný protein zpracoval westernovou hybridizací a sondoval se anti-NFKBl(N) antisérem.
TPL-2 stimulace degradace myc-pl05 vyžaduje jeho kinasovou aktivitu (obr. 6b a e), což naznačuje, že fosforylace je nutná pro tento účinek. Myc-pl05 současně exprimovaný s TPL-2 « * · · · 44 • * · · · · · 94 ·
9 9 9 9 9 9 9 99
4 9 9 9 9999999 ··
9 9 9 9 9 9 99
9 99 9 9 9 99999 migruje pomaleji v SDS-PAGE (obr. 6a). Tento posun mobility indukovaný TPL-2 je způsoben fosforylaci myc-pl05, jak bylo zjištěno podle citlivosti na in vitro ošetření fosfatasou (obr. 7b). Naopak, kinasa-inaktivní TPL-2(A270) neindukuje posun mobility v současně exprimovaných myc-pl05 (obr. 7b). Proto TPL-2 stimulace myc-pl05 proteolýzy koreluje s jeho indukovanou fosforylaci. Analogicky s iKB-a, je pravděpodobné, že TPL-2 indukovaná fosforylace pl05 navozuje jeho ubikvitinaci a tak stimuluje pl05 proteolýzu proteasomem.
TPL-2 je proto složkou nové signální dráhy, která aktivuje
NFkB stimulací proteasomem zprostředkované proteolýzy inhibičního proteinu NFKB, pl05. TPL-2 zvyšuje degradaci pl05 a zároveň udržuje celkovou produkci p50 (obr. 6a). Tak se asociované Rel podjednotky buď přesouvají do jádra samostatně (pravděpodobně jako dimery) nebo v komplexu s p50. Protože se TPL-2 specificky imunosráží s p50, Rel-A a c-Rel (obr. 3a), může regulovat proteolýzu všech hlavních pl05 komplexů přítomných v buňkách (Rice et al., 1992, Cell 71: 243-253;
Mercurio et al., 1993, Genes. Devel. 7: 705-718). Je zajímavé, že TPL-2 je nejvíce homologická kinasa k NIK (malinin, 1997), která reguluje indukovatelnou degradaci ΐκΒ-α. Tak jsou dvě signální dráhy vedoucí k aktivaci NFKB regulovány příbuznými enzymy MAP 3K rodiny.
Konečně, tato data naznačují potenciální mechanismus pro onkogenní aktivaci TPL-2, který vyžaduje deleci jeho C-konce (Ceci et al., 1997, Gene Devel. 11: 688-700). C-koncová delece může tedy jak zvyšovat expresi TPL-2, tak jej uvolňovat ze stechiometrické interakce s pl05 (obr. lb) , což může dohromady navozovat fosforylaci nevhodných cílových proteinů. Mezi tyto příjoeiny patří MEK, která je onkogenní, je-li aktivována mutací (Cowley et al·., 1994, Cell 77: 841-852) a která je ««· ·» · ·· · 4·*· · · · * · 4 « « · « · · · · · » · • · · · · ···«·»· * « ··*»·· · · » • · · ·· 4 · « « · ··« silně aktivována TPL-2 (Salmeron et al., 1996, EMBO J., 15:
817-826).
Příklad 4: Skríningové testy pro identifikaci modulátorů TPL2/COT (A) TPL-2/COT kinasový test za použití COT proteinu imunitně vysráženého z transfektovaných savčích buněk
V příkladu byly použity následující materiály, pokud není uvedeno jinak.
Materiály a metody
Exprese COT polypeptidu v savčích buňkách
COT protein s FLAG koncovkou byl exprimován v 293A buňkách transfekcí.Obvykle byly 24 hodin před transfekcí lidské 293A buňky (Quantum) umístěny na plotny v hustotě 2 x 106 buněk na 10 cm plotnu. Připravila se transfekční směs obsahující 60 μΐ Lipofectaminu (Gibco) a 800 μΐ Optimemu (Gibco) v 15 ml zkumavce. V samostatné zkumavce se 8 pg DNA kódující COT(30397) gen opatřený FLAG koncovkou v pCDNA vektoru přidalo k 800 μΐ Optimemu. Obsah každé zkumavky se potom opatrně promísil pipetou a inkuboval se při teplotě okolí po dobu 25 minut. Buňky se promyly jednou Optimem a inkubovaly se s transfekční směsí a 6, ml Optimem a inkubace probíhala po dobu 5 hodin při 37 °C a v 5% CO2· Buňky se potom inkubovaly s 8 ml DMEM + 10% FBS + L-glutaminem v den 1, s DMEM + 10% FBS + L-glutaminem v den 2 a sklízely se 48 hodin po transfekcí.
··♦ · * · · · · ♦·· <9909 » * · • · · · · >····»* v · • · · · · f» » 9· 999
Imunosráženi COT proteinu opatřeného FLAG koncovkou
Transfektované 293A buňky exprimující FLAG-COT(30-397) se lyžovaly na ledu po dobu 15 minut v lyzačnim pufru (1% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 20 mM NaF, 10 mM Na4P2<07, 50 mM Na3VO4 plus kompletní inhibitory proteas (Boehringer) a lysáty se odstředily (14000 rpm po dobu 10 minut při 4 °C) a odebraly se supernatanty. Imunosráženi se provedla za použití FLAG Ab gelu /Sigma) při 50 μg Ab na ml lyzátu po dobu 3 hodin při 4 °C za míšení. Gelové korálky se promyly při 4 °C dvakrát lyzačnim pufrem a potom dvakrát promývacím pufrem (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EGTA a 1 mM DTT). Gelové korálky se potom resuspendovaly v promývacím pufru a v podílech se rozdělily do zkumavek pro různé kinasové reakce.
TPL-2/COT kinasový test a skríning inhibitorů
TPL-2/COT kinasový test se použil pro vyhledávání různých kandidátů na inhibitory TPL-2/COT kinasy. Kinasový test se provedl následujícím způsobem. TPL-2 kinasa (tj. FLAG-COT(30397) navázaná na gelové korálky se inkubovala se 2 μg cílového polypeptidového substrátu (tj. GST ΐκβ-α(1-50) (Boston Biologicals) v kinasovém pufru (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgC12, 1 mM EGTA, 2 mM DTT a 0,01% Brij 35), za přítomnosti vhodné radioaktivní značky (30 μΜ ATP a 5 μθί γ-32Ρ-ΑΤΡ (Amersham)) po dobu 10 minut při 25 °C. Reakce se provedly za přítomnosti a za nepřítomnosti potenciálních sloučenin s inhibiční aktivitou, které byly připraveny jako 10 mM zásobní roztoky v 1000 DMSO. Testované sloučeniny se přidaly do kinasové reakční směsi bezprostředně před přidáním γ-32ΡATP. Reakce se ukončily adicí 5 x SDS vzorkového pufru, • · 4 « · « * · * zahříváním při 100 °C po dobu 3 minut a supernatanty se odebraly odstředěním. Autofosforylace COT a fosforylace cílového polypeptidu, tj. GST-IKB-a, se analyzovaly gelovou elektroforesou (10% SDS-PAGE) následovanou přenosem na nitrocelulosové membrány a autoradiografií. Jako kontrola pro potvrzení ekvivalentních hladin FLAG-COT(30-397) a GST-Ikbcc proteinů použitých v různých kinasových reakcích a také ekvivalentních náplní gelu se provedly imunopřenosy s antiFLAG a anti-GST protilátkami, v příslušném pořadí, na stejných membránách, které byly použity pro autoradiografii. Inhibice aktivity Cot kinasy, buď autofosforylační aktivity nebo fosforylace cílového polypeptidu, GST-ΐκΒ-α, byla kvantifikována skenováním autoradiografů (obr. 13).
Sloučeniny, které měnily úrovně těchto aktivit, byly dále analyzovány způsobem popsaným dále.
TPL-2/COT kinasový test za použití rekombinantního COT proteinu exprimovaného pomocí bakuloviru
Podobně, jako bylo popsáno výše, byl TPL-2 polypeptid exprimovaný ve hmyzích buňkách testován na kinasovou aktivitu za použití cílového polypeptidu za přítomnosti nebo za nepřítomnosti testované sloučeniny. V tomto testu se TPL-2 kinasa, tj. COT(30~397), připravila ze hmyzích buněk infikovaných bakulovirem exprimujících COT kinasu za použití standardních technik. TPL-2 kinasa (100 ng při 5 gg/ml v 50 mM Tris-HCl pH 8,0) se inkubovala s cílovým polypeptidem obsahujícím modelový pl05 protein (tj. 1 μg GST-plO5Ai-497 při 1,4 mg/ml v PBS) za přítomnosti nebo za nepřítomnosti testované sloučeniny a za nepřítomnosti radioaktivního značkovacího činidla ([33Ρ]-γ-ΑΤΡ 3x zásobní roztok; 60 μΜ ATP s 50 μθί/ιη1 [33Ρ]-γ-ΑΤΡ) v kinasovém testovacím pufru (50 mM Tris* ·· 9· 9 Φ· « Φ · Φ φ Φ Φ · •9 999 9 9999 9 9
9? ··· ·· 9 9 Φ ΦΦ
HC1, ρΗ 7,5, 10 mM MgC12, 1 mM EGTA, 2 mM DTT, 0,01% Brij 35, 5 mM β-fosfoglycerol). Dále se tento test provedl za nepřítomnosti cílového polypeptidu (tj. modelového pl05 polypeptidu) pro stanovení toho, zda mění jakákoliv testovaná sloučenina autofosforylační aktivitu TPL-2.
Test se provedl v 96 jamkové plotně proto, aby se umožnilo účinné vyhledávání velkého počtu sloučenin. Například, v jedné jamce se obvykle inkubovalo 10 μΐ kinasy a substrátu za přítomnosti 10 μΐ sloučeniny, 10 μΐ [33Ρ]-γ-ΑΤΡ a inkubace se provedla při 25 °C po dobu 30 minut. Reakce se ukončila 100 μΐ 5 mM ATP v 75 mM H3PO4. Potom se provedl přenos 120 μΐ každé reakční směsi do 96-jamkových fosfocelulosových membránových filtračních ploten, provedla se inkubace při 25 °C po dobu 30 minut, plotny se promyly (6x 100 μΐ 75 mM H3PO4 na jamku) a testovaly se (za použití 25 μΐ scintilační směsi) na výslednou kinasovou aktivitu jako funkci získaného značeného proteinu, jak se měřil ve scintilačním čítači.
Pomocí testů uvedených výše bylo identifikováno několik sloučenin schopných modulovat aktivitu TPL-2 kinasy z chemické knihovny vybrané molekulovým modelováním tak, aby sloučeniny v této knihovně obsahovaly potenciální ATP-kompetitivní inhibitory TPL-2 kinasy. Identifikované sloučeniny ovlivňovaly fosforylaci ΐκΒ-α cílového peptidu representovaného GST-lKB-a zprostředkovanou COT.
Modulátory TPL-2/COT kinasy
Sloučeniny vykazující vliv na TPL-2 byly nejprve testovány na inhibici kinasové aktivity při koncentraci 100 μΜ ve dvojím provedení. Příklad dat pro vyhledávání inhibitoru TPL-2 kinasy pro vybrané sloučeniny je uveden na obr. 13. Pro stanovení toho, zda jsou testované sloučeniny specifickými inhibitory TPL-2 nebo obecnými inhibitory kinas byly paralelně také testovány inhibitory se známou specificitou. Obecný inhibitor kinas, staurosporin, MEK inhibitor PD98059 a p38 MAP kinasový inhibitor SB 203580 vykazovaly slabou nebo žádnou aktivitu vzhledem k autofosforylaci COT a fosforylaci cíle pro COT (tj. ΐκΒ-α). Naopak, každá z testovaných sloučenin vykazovala různé úrovně specifické inhibiční aktivity (viz obr. 13). Aktivní sloučeniny, které inhibovaly TPL-2 aktivitu >50% při 100 μΜ, ve srovnání s kontrolní kinasovou reakcí obsahující pouze DMSO vehikulum (5% konečná koncentrace) , byly retestovány ve třech koncentracích, 100 μΜ, 10 μΜ a 1 μΜ, pro stanovení IC50 hodnot pro inhibici TPL-2. Mezi identifikované inhibitory TPL-2 patří N-(6-fenoxy-4-chinolyl)-N-[4-(fenylsulfanyl)fenyl]amin s IC50 = 50 μΜ, ethyl 5-oxo-4-[4-(fenylsulfanyl)anilino]-5,6,7,8-tetrahydro-3-chinolinkarboxylat s IC50 = 10 μΜ, 3-(4-pyridyl)-4,5-dihydro-2H-benzo[g]indazolmethansulfonat s IC50 = 100 μΜ a 2-chlorbenzo[Z][1,9]fenanthrolin-7-karboxylat sodný s IC50 = 100 μΜ. Chemická struktura pro každou z těchto sloučenin je uvedena na obr. 9-12.
Ekvivalenty
Odborníkům v oboru budou zřejmé, nebo je budou schopni zjistit běžným experimentováním, mnohé ekvivalenty specifických provedení předkládaného vynálezu. Takové ekvivalenty spadají do rozsahu připojených patentových nároků.
• · • ·
SEZNAM SEKVENCÍ <110> MRC and BASF <12O> tpl-2/cot kinasA A ZPŮSOBY JEJÍHO POUŽITÍ <130> BBI-110CPPC <14O>
<141>
<160> 4 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2720 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>
<221> CDS <222> (318) . . (1742) <400> 1
ggaatttccc atcgcggggg ctcgggtgtt ctgggccagc cggcaggccc tttctgttta 60
cggagagaaa ggggaaatgg aaaaggcggg gaggacgctg gcgtcggcta cgccgccccg 120
gggccagttc agacgccgag agtccggggc tgcagcgtac cgctcctccc gctgcggatc 180
gcccggcctt tggtcggccg ccggtcgtcc ggacgcccgt acgtctggct cccgctggca 240
agccacccgc tgcccaccaa gcccgagctc cgggcgggca cacggaacac tcagactccc 300
cagcaggcac cacagtg atg gag tac atg agc acc gga agc gac gag aaa 350
Met Glu Tyr Met Ser Thr Gly Ser Asp Glu Lys
1 5 10
gaa gag att gat tta tta att aac cat tta aac gtg tcg gaa gtc ctg 398
Glu Glu Ile Asp Leu Leu Ile Asn His Leu Asn Val Ser Glu Val Leu
15 20 25
gac atc atg gag aac ctt tat gca agt gaa gag cct gca gtg tat gag 446
Asp Ile Met Glu Asn Leu Tyr Ala Ser Glu Glu Pro Ala Val Tyr Glu
30 35 40
ccc agt ctg atg acc atg tgt cca gac agc aat caa aac aag gaa cat 494
Pro Ser Leu Met Thr Met Cys Pro Asp Ser Asn Gin Asn Lys Glu His
45 50 55
tca gag tcg ctg ctt cgg agt ggc cag gag gtg ccc tgg ttg tcg tet 542
Ser Glu Ser Leu Leu Arg Ser Gly Gin Glu Val Pro Trp Leu Ser Ser
60 65 70 75
gtc aga tat ggg act gtg gag gat ctg ctt gca ttt gca aac cat atc 590
Val Arg Tyr Gly Thr Val Glu Asp Leu Leu Ala Phe Ala Asn His Ile
80 85 90
tcg aat acg aca aag cat ttt tac aga tgt cgg ccc caa gaa tet ggg 638
Ser Asn Thr Thr Lys His Phe Tyr Arg Cys Arg Pro Gin Glu Ser Gly
95 100 105
att tta tta aat atg gta atc agt ccc cag aat ggt ege tac caa atc 686
Ile Leu Leu Asn Met Val Ile Ser Pro Gin Asn Gly Arg Tyr Gin Ile
5 110 115 120
gac tcg gat gtt ctc ctt gtc ccg tgg aag ctg acg tac agg age att 734
Asp Ser Asp Val Leu Leu Val Pro Trp Lys Leu Thr Tyr Arg Ser Ile
125 130 135
10 ggt tet ggt ttc gtt cct cgg ggg gcc ttt gga aaa gtg tac tta gca 782
Gly Ser Gly Phe Val Pro Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Tyr Leu Ala
140 145 150 155
caa gac atg aag aca aag aaa aga atg gca tgt aaa ctg atc cct gta 830
15 Gin Asp Met Lys Thr Lys Lys Arg Met Ala Cys Lys Leu Ile Pro Val
160 165 170
gat cag ttt aag cca tea gat gtg gaa atc cag gcc tgc ttc cgg cac 878
Asp Gin Phe Lys Pro Ser Asp Val Glu Ile Gin Ala Cys Phe Arg His
20 175 180 185
gag aac att gcc gag tta tac ggt gcg gtc cta tgg ggc gac act gtc 926
Glu Asn Ile Ala Glu Leu Tyr Gly Ala Val Leu Trp Gly Asp Thr Val
190 195 200
25
cat ctc ttc atg gaa gcc ggc gag gga ggg tet gtc ctg gag aag ctg 974
His Leu Phe Met Glu Ala Gly Glu Gly Gly Ser Val Leu Glu Lys Leu
205 210 215
30 gag age tgt ggg ccc atg aga gaa ttt gaa att atc tgg gtg aca aag 1022
Glu Ser Cys Gly Pro Met Arg Glu Phe Glu Ile Ile Trp Val Thr Lys
220 225 230 235
cac gtt ctc aag gga ctt gat ttt ctg cac tcc aag aaa gtc atc cac 1070
35 His. Val Leu Lys Gly Leu Asp Phe Leu His Ser Lys Lys Val Ile His
240 245 250
cac gat atc aaa cct age aac att gta ttc atg tet acg aaa gct gtg 1118
His Asp Ile Lys Pro Ser Asn Ile Val Phe Met Ser Thr Lys Ala Val
40 255 260 265
ttg gta gat ttt ggc ctg agt gtt caa atg aca gaa gat gtc tat ctc 1166
Leu Val Asp Phe Gly Leu Ser Val Gin Met Thr Glu Asp Val Tyr Leu
270 275 280
45
ccc aag gac ctc cgg gga aca gag atc tac atg age cct gag gtg att 1214
Pro Lys Asp Leu Arg Gly Thr Glu Ile Tyr Met Ser Pro Glu Val Ile
2Θ5 290 295
50 ctg tgc agg ggc cat tcc aca aaa gca gac atc tac age ctt gga gcc 1262
Leu Cys Arg Gly His Ser Thr Lys Ala Asp Ile Tyr Ser Leu Gly Ala
300 305 310 315
acg ctc att cac atg cag aca ggc acc cca ccc tgg gtg aag ege tac 1310
55 Thr Leu Ile His Met Gin Thr Gly Thr Pro Pro Trp Val Lys Arg Tyr
320 325 330
cct ega tcg gcc tat ccc tcc tac ctg tac ata atc cac aag cag gca 1358
Pro Arg Ser Ala Tyr Pro Ser Tyr Leu Tyr Ile Ile His Lys Gin Ala
60 335 340 345
cct ccc ctg gaa gat att gct ggt gac tgc agt cca ggc atg agg gag 1406
• · · ·♦ · • · · · · · · • · · « · · * 9 « 9 Λ · ··♦♦·»
z • · · ·« · ««»<··· · ♦ ·
Pro Pro Leu 350 Glu Asp Ile Ala Gly 355 Asp Cys Ser Pro Gly 360 Met Arg Glu
ctg ata gaa gcc gcc ctg gag agg aac ccc aac cac ege cca aaa gca 1454
Leu Ile Glu Ala Ala Leu Glu Arg Asn Pro Asn His Arg Pro Lys Ala
365 370 375
gca gac cta ctg aaa cac gaa gcc ctg aat ccc cca aga gag gac cag 1502
Ala Asp Leu Leu Lys His Glu Ala Leu Asn Pro Pro Arg Glu Asp Gin
380 385 390 395
cca cgg tgt cag agt ctg gac tet gcc ctc ttt gac cgg aag agg ctg 1550
Pro Arg Cys Gin Ser Leu Asp Ser Ala Leu Phe Asp Arg Lys Arg Leu
400 405 410
ctg agc agg aag gag cta gaa ctt cct gag aac att gct gat tea tea 1598
Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Leu Pro Glu Asn Ile Ala Asp Ser Ser
415 420 425
tgc aca 99a agc acc gag gag tet gaa gtg ctc agg aga cag cgt tcc 1646
Cys Thr Gly Ser Thr Glu Glu Ser Glu Val Leu Arg Arg Gin Arg Ser
430 435 440
ctc tac att gat ctc gga gct ctg gct ggc tac ttc aat att gtt cgt 1694
Leu Tyr Ile Asp Leu Gly Ala Leu Ala Gly Tyr Phe Asn Ile Val Arg
445 450 455
ggt cca cca acc ctg gaa tat ggc tga tgg atg act cta ttg gca aca 1742
Gly Pro Pro Thr Leu Glu Tyr Gly
460 465
r
gtagggcgga tatttetete ctggatgttg gtttcacaga tcctacacag cagctctgga 1802
tagtgaattt tacccaattt ttttaggaag cagggaggag gtcťctagtg acacaagaat 1862
gtcaaagccc tggccccctt tgtgaagctc ctctggcatg ttccagagcc caaggttctc 1922
atttctcagg tggtgggact ggacaaaagg gagtggtgag ctcaggaaag aatcatttct 1982
gatgacaatt ctattcactt tgcactttaa tggacattaa aaaatagctc tcacaagata 2042
gtaacctaaa atacctgttt ttggttctta tataaccatg ggttcttcat tcaactcaga 2102
agacctgatc tgtgtatata tttgtgtgta ttatatggta actctttgta ccttggttgg 2162
tagagtctag tataagttta gttaatagta ttttgggtgg atagaacaac tetaatatta 2222
cagcaattca ctggactagt gtctcacaaa tgactgattt actcagagcc attaagcagc 2282
aggccactag tgagagtttc tgttatgttc ctatggaaac actgtgtatt gtacgtgcta 2342
tgcttaaaac atttaaaaca caatgtttta aatgtggaca gaactgtgta aaccacataa 2402
tttctgtaca tcccaaagga tgagaaatgt gaccttcaag aaaatggaaa catttgtaaa 2462
ttctttgtag tgataccttt gtaattaatg aaactatttt tctttaaagt gtttctatat 2522
taaaaatagc atactgtgta tgttttattc caaaattcct tcatgaatct tteatatata 2582
tatgtgtata tattttaaca ttgtaaagta tgagtattct tatttaaagt atatttttac 2642
attatgcaaa tgaacttcaa cgttttagtc caatgtgact ggtcaaataa accaaataaa 2702 /(Π)
Z ctgagtattt tgtcttaa
2720 <210> 2 <211> 467 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 2
Met 1 Glu Tyr Met Ser 5 Thr Gly Ser Asp Glu Lys Glu Glu 10 Ile Asp 15 Leu
Leu Ile Asn His Leu Asn Val Ser Glu Val Leu Asp Ile Met Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Ala Ser Glu Glu Pro Ala Val Tyr Glu Pro Ser Leu Met Thr
35 40 45
Met Cys Pro Asp Ser Asn Gin Asn Lys Glu His Ser Glu Ser Leu Leu
50 55 60
Arg Ser Gly Gin Glu Val Pro Trp Leu Ser Ser Val Arg Tyr Gly Thr
65 70 75 80
Val Glu Asp Leu Leu Ala Phe Ala Asn His Ile Ser Asn Thr Thr Lys
85 90 95
His Phe Tyr Arg Cys Arg Pro Gin Glu Ser Gly Ile Leu Leu Asn Met
100 105 110
Val Ile Ser Pro Gin Asn Gly Arg Tyr Gin Ile Asp Ser Asp Val Leu
115 120 125
Leu Val Pro Trp Lys Leu Thr Tyr Arg Ser Ile Gly Ser Gly Phe Val
130 135 140
Pro Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Tyr Leu Ala Gin Asp Met Lys Thr
145 150 155 160
Lys Lys Arg Met Ala Cys Lys Leu Ile Pro Val Asp Gin Phe Lys Pro
165 170 175
Ser Asp Val Glu Ile Gin Ala Cys Phe Arg His Glu Asn Ile Ala Glu
180 185 190
Leu Tyr Gly Ala Val Leu Trp Gly Asp Thr Val His Leu Phe Met Glu
195 200 205
Ala Gly Glu Gly Gly Ser Val Leu Glu Lys Leu Glu Ser Cys Gly Pro
210 215 220
Met Arg Glu Phe Glu Ile Ile Trp Val Thr Lys His Val Leu Lys Gly
225 230 235 240
Leu Asp Phe Leu His Ser Lys Lys Val Ile His His Asp Ile Lys Pro
245 250 255
Ser Asn Ile Val Phe Met Ser Thr Lys Ala Val Leu Val Asp Phe Gly
4 4· 4♦ 4 «4 4444 444 44 444 4444 44
•x • 4 444 4444444 .4 4*4 44 4 44 44444 4 4 4 44
260 265 270
Leu Ser Val Gin Met Thr Glu Asp Val Tyr Leu Pro Lys Asp Leu Arg
275 280 285
Gly Thr Glu Ile Tyr Met Ser Pro Glu Val Ile Leu Cys Arg Gly His
290 295 300
Ser Thr Lys Ala Asp Ile Tyr Ser Leu Gly Ala Thr Leu Ile His Met
305 310 315 320
Gin Thr Gly Thr Pro Pro Trp Val Lys Arg Tyr Pro Arg Ser Ala Tyr
325 330 335
Pro Ser Tyr Leu Tyr Ile Ile His Lys Gin Ala Pro Pro Leu Glu Asp
340 345 350
Ile Ala Gly Asp Cys Ser Pro Gly Met Arg Glu Leu Ile Glu Ala Ala
355 360 365
Leu Glu Arg Asn Pro Asn His Arg Pro Lys Ala Ala Asp Leu Leu Lys
370 375 380
His Glu Ala Leu Asn Pro Pro Arg Glu Asp Gin Pro Arg Cys Gin Ser
385 390 395 400
Leu Asp Ser Ala Leu Phe Asp Arg Lys Arg Leu Leu Ser Arg Lys Glu
405 410 415
Leu Glu Leu Pro Glu Asn ile Ala Asp Ser Ser Cys Thr Gly Ser Thr
420 425 430
Glu Glu Ser Glu Val Leu Arg Arg Gin Arg Ser Leu Tyr Ile Asp Leu
435 440 445
Gly Ala Leu Ala Gly Tyr Phe Asn Ile Val Arg Gly Pro Pro Thr Leu
450 455 460
Glu Tyr Gly
465 <210> 3 <211> 2763 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (367)..(1770) <400> 3
ggatcccagt ggcccggcgt gctcggctcc cacaggcctg cagccagcat cgcaccgaac 60
cttcgggggg ccgcggctgg agcgctcggc cggcgtggga gcgcaaggcc gcagatgcaa 120
tcttcttacc gcgaagaagc caggggaata ggtagccaca tcttgtttgc agataagaaa 180
ggaagctaac gcagtatctg caaagccagg agtctgactc agtacttttc tcactcatgc 240 atacaagcag ctaaaaatga cacagcttat ttaccatgcc cctgacactg cactgagcac 300 tttatgagct tgaactctgt taatctcacg accacctcat gagactctcc agaaagagca 360 acagta atg gag tac atg agc act gga agt gac aat aaa gaa gag att 408
Met Glu Tyr Met Ser Thr Gly Ser Asp Asn Lys Glu Glu Ile
10
gat Asp 15 tta Leu tta att aaa cat His 20 tta aat gtg Val tet Ser gat gta ata gac Asp att Ile atg Met 30 456
Leu Ile Lys Leu Asn Asp 25 Val Ile
gaa aat ctt tat gca agt gaa gag cca gca gtt tat gaa ccc agt cta 504
Glu Asn Leu Tyr Ala Ser Glu Glu Pro Ala Val Tyr Glu Pro Ser Leu
35 40 45
atg acc atg tgt caa gac agt aat caa aac gat gag cgt tet aag tet 552
Met Thr Met Cys Gin Asp Ser Asn Gin Asn Asp Glu Arg Ser Lys Ser
50 55 60
ctg ctg ctt agt ggc caa gag gta cca tgg ttg tea tea gtc aga tat 600
Leu Leu Leu Ser Gly Gin Glu Val Pro Trp Leu Ser Ser Val Arg Tyr
65 70 75
gga act gtg gag gat ttg ctt get ttt gca aac cat ata tcc „ac act 648
Gly Thr Val Glu Asp Leu Leu Ala Phe Ala Asn His Ile Ser Asn Thr
80 85 90
gca aag cat ttt tat gga caa ega cca cag gaa tet gga att tta tta 696
Ala Lys His Phe Tyr Gly Gin Arg Pro Gin Glu Ser Gly Ile Leu Leu
95 100 105 110
aac atg gtc atc act ccc caa aat gga cgt tac caa ata gat tcc gat 744
Asn Met Val Ile Thr Pro Gin Asn Gly Arg Tyr Gin Ile Asp Ser Asp
115 120 125
gtt ctc ctg atc ccc tgg aag ctg act tac agg aat att ggt tet gat 792
Val Leu Leu Ile Pro Trp Lys Leu Thr Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Asp
130 135 140
ttt att cct cgg ggc gcc ttt gga aag gta tac ttg get caa gat ata 840
Phe Ile Pro Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Tyr Leu Ala Gin Asp Ile
145 150 155
aag a cg aag aaa aga atg gcg tgt aaa ctg atc cca gta gat caa ttt 888
Lys Thr Lys Lys Arg Met Ala Cys Lys Leu Ile Pro Val Asp Gin Phe
160 165 170
aag cca tet gat gtg gaa att cag get tgc ttc cgg cac gag aac atc 936
Lys Pro Ser Asp Val Glu Ile Gin Ala Cys Phe Arg His Glu Asn Ile
175 180 185 190
gca gag ctg tat ggc gca gtc ctg tgg ggt gaa act gtc cat ctc ttt 984
Ala Glu Leu Tyr Gly Ala Val Leu Trp Gly Glu Thr Val His Leu Phe
195 200 205
atg gaa gca ggc gag gga ggg tet gtt ctg gag aaa ctg gag agc tgt 1032
Met Glu Ala Gly Glu Gly Gly Ser Val Leu Glu Lys Leu Glu Ser Cys
210 215 220
gga cca atg aga gaa ttt gaa att att tgg gtg aca aag cat gtt ctc 1080
Gly Pro Met Arg Glu Phe Glu Ile Ile Trp Val Thr Lys His Val Leu
/«Ί
225
230
235
aag Lys gga Gly 240 ctt Leu gat Asp ttt Phe cta Leu cac His 245 tea Ser aag Lys aaa Lys gtg Val atc Ile 250 cat His cat His gat Asp att Ile 1128
aaa cct agc aac att gtt ttc atg tcc aca aaa gct gtt ttg gtg gat 1176
Lys Pro Ser Asn Ile Val Phe Met Ser Thr Lys Ala Val Leu Val Asp
255 260 265 270
ttt ggc cta agt gtt caa atg acc gaa gat gtc tat ttt cct aag gac 1224
Phe Gly Leu Ser Val Gin Met Thr Glu Asp Val Tyr Phe Pro Lys Asp
275 280 285
ctc ega gga aca gag att tac atg agc cca gag gtc atc ctg tgc agg 1272
Leu Arg Gly Thr Glu Ile Tyr Met Ser Pro Glu Val Ile Leu Cys Arg
290 295 300
ggc cat tea acc aaa gca gac atc tac agc ctg ggg gcc acg ctc atc 1320
Gly His Ser Thr Lys Ala Asp Ile Tyr Ser Leu Gly Ala Thr Leu Ile
305 310 315
cac atg cag acg ggc acc cca ccc tgg gtg aag ege tac cct ege tea 1368
His Met Gin Thr Gly Thr Pro Pro Trp Val Lys Arg Tyr Pro Arg Ser
320 325 330
gcc tat ccc tcc tac ctg tac ata atc cac aag caa gca cct cca ctg 1416
Ala Tyr Pro Ser Tyr Leu Tyr Ile Ile His Lys Gin Ala Pro Pro Leu
335 340 345 350
gaa gac att gca gat gac tgc agt cca ggg atg aga gag ctg ata gaa 1464
Glu Asp Ile Ala Asp Asp Cys Ser Pro Gly Met Arg Glu Leu Ile Glu
355 360 365
gct tcc ctg gag aga aac ccc aat cac ege cca aga gcc gca gac cta 1512
Ala Ser Leu Glu Arg Asn Pro Asn His Arg Pro Arg Ala Ala Asp Leu
370 375 380
cta aaa cat gag gcc ctg aac ccg ccc aga gag gat cag cca ege tgt 1560
Leu Lys His Glu Ala Leu Asn Pro Pro Arg Glu Asp Gin Pro Arg Cys
385 390 395
acg agt ctg gac tet gcc ctc ttg gag ege aag agg ctg ctg agt agg 1608
Thr Ser Leu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Arg Lys Arg Leu Leu Ser Arg
400 405 410
aag gag ctg gaa ctt cct gag aac att gct gat tet tcg tgc aca gga 1656
Lys Glu Leu Glu Leu Pro Glu Asn Ile Ala Asp Ser Ser Cys Thr Gly
415 420 425 430
agc acc gag gaa tet gag atg ctc aag agg caa ege tet ctc tac atc 1704
Ser Thr Glu Glu Ser Glu Met Leu Lys Arg Gin Arg Ser Leu Tyr Ile
435 440 445
gac ctc gg<= gct ctg gct ggc tac ttc aat ctt gtt cgg gga cca cca 1752
Asp Leu Gly Ala Leu Ala Gly Tyr Phe Asn Leu Val Arg Gly Pro Pro
450 455 460
acg ctt gaa tat ggc tga aggatgccat gtttgcctct aaattaagac Thr Leu Glu Tyr Gly
465
1800
• · · • · · · * « · · · • · · « · « « * · • · · · · • * · ♦ · • · · • · · · • · • · ♦
agcattgatc tcctggaggc tggttctgct gcctctacac aggggcccgt tacagtgaat 1860
ggtgccattt tcgaaggagc agtgtgacct cctgtgaccc atgaatgtgc ctccaagcgg 1920
ccctgtgCgt ttgácatgtg aagctatttg atatgcacca ggtctcaagg ttctcatttc 1980
tcaggtgacg tgattctaag gcaggaattt gagagttcac agaaggatcg tgtctgctga 2040
ctgtttcatt cactgtgcac tttgctcaaa attttaaaaa taccaatcac aaggataata 2100
gagtagccta aaattactat tcttggttct tatttaagta tggaatattc attttactca 2160
gaatagcctg ttttgtgtat attggtgtat attatataac tctttgagcc tttattggta 2220
aattctggta tacattgaat tcattataat ttgggtgact agaacaactt gaagattgta 2280
gcaataagct ggactagtgt cctaaaaatg gctaactgat gaattagaag ccatctgaca 2340
gacggccact agtgacagtt tcttttgtgt tcctatggaa acattttata ctgtacatgc 2400
tatgctgaag acattcaaaa cgtgatgttt tgaatgtgga taaaactgtg taaaccacat 2460
aattttgtac atccaaggat gaggtgtgac ctttaagaaa aatgaaaact tttgtaaatt 2520
attgatgatt ttgtaattct tatgactaaa ttttctttta agcatttgta tattaaaata 2580
gcatactgtg tatgttttat atcaaatgcc ttcatgaatc tttcatacat atatatattt 2640
gtaacatgta aagtatgtga gtagtcttat gtaaagtatg tttttacatt atgcaaataa 2700
aacccaatac ttttgtccaa tgtggttggt caaatcaact gaataaattc agtattttgc 2760
Ctt 2763 <210> 4 <211> 467 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Met Glu Tyr Met 1 Ser 5 Thr Gly Ser Asp Asn 10 Lys Glu Glu Ile Asp 15 Leu
Leu Ile Lys His Leu Asn Val Ser Asp Val Ile Asp Ile Met Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Ala Ser Glu Glu Pro Ala Val Tyr Glu Pro Ser Leu Met Thr
35 40 45
Met Cys Gin Asp Ser Asn Gin Asn Asp Glu Arg Ser Lys Ser Leu Leu
50 55 60
Leu Ser Gly Gin Glu Val Pro Trp Leu Ser Ser Val Arg Tyr Gly Thr
65 70 75 80
Val Glu Asp Leu Leu Ala Phe Ala Asn His Ile Ser Asn Thr Ala Lys
85 90 95
His Phe Tyr Gly Gin Arg Pro Gin Glu Ser Gly Ile Leu Leu Asn Met
100 105 110
♦ · • 4 · 4 · 4 4
Val Ile Thr Pro 115 Gin Asn Gly Arg Tyr Gin 120 Ile Asp Ser 125 Asp Val Leu
Leu Ile Pro Trp Lys Leu Thr Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Asp Phe Ile
5 130 135 140
Pro Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Tyr Leu Ala Gin Asp Ile Lys Thr
145 150 155 160
10 Lys Lys Arg Met Ala Cys Lys Leu Ile Pro Val Asp Gin Phe Lys Pro
165 170 175
Ser Asp Val Glu Ile Gin Ala Cys Phe Arg His Glu Asn Ile Ala Glu
180 185 190
15
Leu Tyr Gly Ala Val Leu Trp Gly Glu Thr Val His Leu Phe Met Glu
195 200 205
Ala Gly Glu Gly Gly Ser Val Leu Glu Lys Leu Glu Ser Cys Gly Pro
20 210 215 220
Met Arg Glu Phe Glu Ile Ile Trp Val Thr Lys His Val Leu Lys Gly
225 230 235 240
25 Leu Asp Phe Leu His Ser Lys Lys Val Ile His His Asp Ile Lys Pro
245 250 255
Ser Asn Ile Val Phe Met Ser Thr Lys Ala Val Leu Val Asp Phe Gly
260 265 270
30
Leu Ser Val Gin Met Thr Glu Asp Val Tyr Phe Pro Lys Asp Leu Arg
275 280 285
Gly Thr Glu Ile Tyr Met Ser Pro Glu Val Ile Leu Cys Arg Gly His
35 290 295 300
Ser Thr Lys Ala Asp Ile Tyr Ser Leu Gly Ala Thr Leu Ile His Met
305 310 315 320
40 Gin Thr Gly Thr Pro Pro Trp Val Lys Arg Tyr Pro Arg Ser Ala Tyr
325 330 335
Pro Ser Tyr Leu Tyr Ile Ile His Lys Gin Ala Pro Pro Leu Glu Asp
340 345 350
45
Ile Ala Asp Asp Cys Ser Pro Gly Met Arg Glu Leu Ile Glu Ala Ser
355 360 365
Leu Glu Arg Asn Pro Asn His Arg Pro Arg Ala Ala Asp Leu Leu Lys
50 370 375 380
His Glu Ala Leu Asn Pro Pro Arg Glu Asp Gin Pro Arg Cys Thr Ser
385 390 395 400
55 Leu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Arg Lys Arg Leu Leu Ser Arg Lys Glu
405 410 415
Leu Glu Leu Pro Glu Asn Ile Ala Asp Ser Ser Cys Thr Gly Ser Thr
420 425 430
60
Glu . Glu . Ser Glu Met Leu Lys Arg Gin Arg Ser Leu Tyr Ile Asp Leu
435 440 445
fot y!·
Gly Ala Leu Ala Gly Tyr Phe Asn Leu Val Arg Gly Pro Pro Thr Leu 450 455 460
Glu Tyr Gly

Claims (5)

PATENTOVÉ NÁROKY
1. Použiti složky regulace NFkB pro modulování aktivity NFkB kontaktováním molekuly TPL-2 se složkou regulace NFkB tak, že dojde k modulaci aktivity NFkB.
2.
12. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že je proveden v buňce in vivo.
13. Způsob identifikace základních sloučenin pro farmacii vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
- poskytnutí přečištěné TPL-2 molekuly;
- inkubaci TPL-2 molekuly se substrátem, o kterém je známo, že je fosforylován TPL-2, a testovanou sloučeninou nebo sloučeninami; a
- identifikaci testované sloučeniny nebo sloučenin, které modulují fosforylaci substrátu.
14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že substrátem je MEK.
15. Sloučenina identifikovatelná způsobem podle jakéhokoliv z nároků 6 až 14, která může modulovat přímou nebo nepřímou interakci TPL-2 a pl05.
16. Sloučenina podle nároku 15, kterou je protilátka.
17. Sloučenina podle nároku 16, která je specifická pro TPL-2.
18. Sloučenina podle nároku 15, kterou je polypeptid.
19. Polypeptid podle nároku 18, kterým je TPL-2 molekula.
20. Polypeptid podle nároku 19, kterým je konstitutivně aktivní mutant nebo dominantně negativní mutant TPL-2.
21. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 15 až 20 pro modulování aktivity pl05 v buňkách.
22. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje, jako aktivní složku, terapeuticky účinné množství sloučeniny podle jakéhokoliv z nároků 15 až 20.
23. Použití sloučeniny podle jakéhokoliv z nároků 15 až 20 pro léčbu stavů asociovaných s indukcí nebo represí NFkB.
24. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 15 až 20 pro pro léčbu stavů spojených s indukcí nebo represí NFkB.
25. Způsob identifikace sloučenin regulujících zánětlivou odpověď zprostředkovanou TPL-2 vyznačující se tím, že zahrnuje:
- kontaktování reakční směsi obsahující TPL-2 polypeptid nebo jeho fragment, s testovanou sloučeninou; a
- stanovení vlivu testované sloučeniny na indikátor aktivity NFkB, což umožní identifikaci sloučenin regulujících aktivitu NFkB zprostředkovanou TPL-2.
26. Způsob identifikace sloučenin regulujících aktivitu NFkB zprostředkovanou TPL-2 vyznačující se tím, že zahrnuje:
_z ·····« · · ·
101 · · · · · x · ·«· · · · ·» · · · ·
- kontaktování reakční směsi obsahující TPL-2 polypeptid nebo jeho fragment, s testovanou sloučeninou; a
- stanovení vlivu testované sloučeniny na indikátor aktivity NFkB, což umožní identifikaci sloučenin regulujících aktivitu NFkB zprostředkovanou TPL-2.
27. Způsob identifikace sloučenin regulujících přenos signálu zprostředkovaný TPL-2 vyznačující se tím, že zahrnuje:
kontaktování reakční směsi obsahující TPL-2 polypeptid nebo jeho fragment, s testovanou sloučeninou; a
- stanovení vlivu testované sloučeniny na indikátor přenosu signálu TPL-2 polypeptidem v reakční směsi, což umožní identifikaci sloučenin regulujících přenos signálu zprostředkovaný TPL-2.
28. Způsob identifikace sloučenin.modulujících interakci TPL-2 polypeptidu s cílovou složkou TPL-2 modulace vyznačující se tím, že zahrnuje:
- kontaktování reakční směsi obsahující TPL-2 polypeptid nebo jeho fragment, s cílovou složkou uvedené modulace TPL-2 a s testovanou sloučeninou, za podmínek, za kterých - při nepřítomnosti testované sloučeniny - uvedený TPL-2 polypeptid nebo jeho fragment specificky interaguje s uvedenou cílovou složkou v referenční úrovni, a stanovení změny interakce za přítomnosti testované sloučeniny, kde tato změna naznačuje, že uvedená testovaná sloučenina moduluje interakci TPL-2 polypeptidu, nebo jeho fragmentu, s cílovou složkou TPL-2 modulace.
29. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 25, 26, 27 a 28 vyznačují, cí se tím, že TPL-2 polypeptid. obsahuje aminokyselinovou sekvenci mající alespoň 75% identitu s polypeptidem vybraným ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2 a 4.
30. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 25, 26, 27 a 28 vyznačující se tím, že TPL-2 polypeptid je kódovaný molekulou nukleové kyseliny, která hybridizuje za vysoce přísných podmínek s molekulou nukleové kyseliny vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1 a
2. Použití podle nároku TPL-2. 1, kde TPL-2 molekula je přirozená 3. Použití podle nároku 1, kde TPL-2 molekula si zachovává pl05-fosforylační aktivitu přirozené TPL-2. 4. Použití podle nároku 1/ kde TPL-2 molekula je dominantně negativní TPL-2 mutant. 5. Použití podle nároku 1, kde TPL-2 molekula si zachovává C- konec přirozené TPL-2.
6. Způsob identifikace sloučenin schopných přímo nebo nepřímo modulovat aktivitu pl05, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
(a) inkubaci TPL-2 molekuly s testovanou sloučeninou nebo sloučeninami;
(b) identifikaci těch sloučenin, které ovlivňují aktivitu TPL-2 molekuly.
7. Způsob podle nároku 6vyznačující se tím, že sloučenina nebo sloučeniny se váží na TPL-2 molekulu.
8. Způsob podle nároků 6 nebo 7vyznačující se tím, že dále zahrnuje:
(c) hodnocení sloučenin, které se váži na TPL-2, na jejich • · · 9·
9 ·· ·· · • · ·· • · · · ·· • ·· •··® ··«ν· schopnost modulovat aktivitu NFkB v buněčném testu.
9. Způsob identifikace základních sloučenin pro farmacii použitelných při léčbě onemocnění zahrnuj ících nebo využívajících zánětlivou odpověď v y z n a č u jící se t i m, že zahrnuje:
inkubaci testované sloučeniny nebo sloučenin s TPL-2 molekulou a pl05, za podmínek, za kterých se
- při nepřítomnosti testované sloučeniny nebo sloučenin - TPL-2 asociuje s p!05 s referenční afinitou;
stanovení vazebné afinity TPL-2 pro pl05 za přítomnosti testované sloučeniny nebo sloučenin; a selekci těch sloučenin, které modulují vazebnou afinitu TPL2 pro pl05 s ohledem na referenční vazebnou afinitu.
10. Způsob identifikace základních sloučenin pro farmacii použitelných při léčbě onemocnění zahrnujících nebo využívajících zánětlivou odpověď v y z n a č u jící se tím, že zahrnuje:
inkubaci testované sloučeniny nebo sloučenin s TPL-2 molekulou a pl05, za podmínek, za kterých se
- při nepřítomnosti testované sloučeniny nebo sloučenin - TPL-2 asociuje s pl05 s referenční afinitou;
stanovení vazebné afinity TPL-2 pro pl05 za přítomnosti testované sloučeniny nebo sloučenin; a selekci těch sloučenin, které modulují vazebnou afinitu TPLpro NFkB s ohledem na referenční vazebnou afinitu.
11.
Způsob identifikace základních sloučenin pro farmacii značující se tím, že zahrnuje:
inkubaci testované sloučeniny nebo sloučenin s TPL-2 molekulou a faktorem nekrosy nádorů (TNF), za podmínek, za kterých - za nepřítomnosti testovaných sloučenin - indukuje interakce TNF a TPL-2 měřitelný chemický nebo biologický efekt;
- určení schopnosti TNF interagovat, přímo nebo nepřímo, s TPL-2 za indukce měřitelného chemického nebo biologického efektu za přítomnosti testované sloučeniny nebo sloučenin; a
- selekci těch sloučenin, které modulují interakci TNF a TPL-
3.
31. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 25, 26, 27 a 28 vyznačující se tím, že reakční směs je bezbuněčná směs.
32. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 25, 26, 27 a 28 vyznačující se tím, že reakční směs je buněčná směs.
33. Způsob podle nároku 32 vyznačující se tím, že reakční směsí jsou rekombinantní buňky.
34. Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že uvedené rekombinantní buňky obsahují heterologní nukleovou kyselinu kódující TPL-2 polypeptid.
35. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 25, 26, 27 a 28 vyznačující se tím, že uvedené stanovení zahrnuje měření aktivity TPL-2 vybrané ze skupiny zahrnující kinasovou aktivitu, vazebnou aktivitu a signalizační aktivitu.
36. Způsob podle nároku 35 vyznačující se tím, že uvedená aktivita TPL-2 je kinasová aktivita.
37. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 25, 26, 27 a 28 vyznačující se tím, že rekombinantní buňky obsahují reportérovy genový konstrukt obsahující reporterový gen v operativní vazbě s transkripční regulační sekvencí sensitivní na intracelulární signály přenášené TPL-2 nebo NFkB.
38. Způsob podle nároku 37 vyznačující se tím, že uvedená transkripční regulační sekvence obsahuje TNF transkripční regulační sekvenci.
39. Způsob podle nároku 28 vyznačující se tím, že uvedená cílová složka je vybrána ze skupiny zahrnující pl05, ΙκΒ-α, ΙκΒ-β, MEK-1, SEK-1 a NFkB.
40. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 25, 26, 27 a 28 vyznačující se tím, že uvedená TPL-2 molekula je rekombinantní polypeptid.
41. Způsob podle nároku 40 vyznačující se tím, že uvedený TPL-2 polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 2 a
4.
42. Způsob podle nároku 35 vyznačující se tím, že uvedená signalizace zahrnuje expresi TNF.
43. Způsob podle nároku 37 vyznačující se tím, že uvedené rekombinantní buňky obsahující reporterový gen citlivý na přenos signálu z TPL-2.
44. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 25, 26, 27 a 28 vyznačující se tím, že uvedené stanovení zahrnuje měření apoptosy buněk.
45. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 25, 26, 27 a 28 vyznačující se tím, že uvedené stanovení zahrnuje měření proliferace buněk.
46. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 25, 26, 27 a 28 vyznačující se tím, že uvedené stanovení zahrnuje měření imunitní odpovědi.
47. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 25, 26, 27 a 28 vyznačující se tím, že TPL-2 polypeptidem je přečištěný TPL-2 polypeptid.
48. Způsob podle nároku 28 vyznačující se tím, že uvedená cílová složka je poskytnuta jako přečištěný polypeptid.
49. Způsob podle nároku 28 vyznačující se tím, že uvedená cílová složka je polypeptid nebo jeho fragment, vybraný ze skupiny zahrnující pl05, ΙκΒ-α, ΙκΒ-β, MEK-1, SEK-1 a NFkB.
50. Způsob podle nároku 49 vyznačující se tím, že uvedenou cílovou složkou je IkB-oc.
51. Způsob podle nároku 49 vyznačující se tím, že uvedenou cílovou složkou je pl05.
52. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 25, 26, 27 a 28 vyznačující se tím, že uvedená testovaná sloučenina je vybrána ze skupiny skládající se z proteinových, uhlovodanových, lipidových, nukleokyselinových, přirozených
9 9 9 ·
9 9 9 9
9 9 9
9 999 9
9 ·
9999 99 organických, syntetických organických sloučenin a protilátek.
53. Sloučenina, identifikovaná způsobem podle kteréhokoliv z nároků 25, 26, 27 a 28.
54. Sloučenina identifikovaná způsobem podle kteréhokoliv z nároků 25, 26, 27 a 28, kde uvedená sloučenina je vhodná pro léčbu stavu vybraného ze skupiny zahrnující revmatoidní artritidu, roztroušenou sklerosu (MS), zánětlivá onemocnění střevní (IBD), diabetes mellitus závislý na inzulínu (IDDM), sepsi, psoriasu, rejekci transplantátu a chybnou regulaci exprese TNF.
55. Sloučenina identifikovaná způsobem podle kteréhokoliv z nároků 25, 26, 27 a 28, kde uvedená sloučenina je vhodná pro léčbu revmatoidní artritidy.
56. Sloučenina identifikovaná způsobem podle kteréhokoliv z nároků 25, 26, 27 a 28, kde uvedená sloučenina je vhodná pro léčbu chybné regulace exprese TNF.
57. Použití farmaceutického prostředku schopného modulace TPL-2 pro léčbu onemocnění imunitního systému u jedince modulováním aktivity TPL-2.
58. Použití farmaceutického prostředku schopného modulace TPL-2 pro léčbu onemocnění zprostředkovaného TPL-2 u jedince.
59. Použití farmaceutického prostředku pro modulování regulace NFkB zprostředkované TPL-2 u jedince.
60. Použití farmaceutického prostředku schopného modulace TPL-2
106 • « 4 · · ··· · • ·· ♦ * * ·« · ♦'· ♦ • · · · * · ··
0 ···· · · · · ·· • * · · · ·· ««·· ·♦ ♦«· ··» ·· ··· pro modulováni regulace NFkB zprostředkované TPL-2 v buňkách.
61. Použití podle kteréhokoliv z nároků 57 a 58, kde uvedený stav je vybrán ze skupiny zahrnující revmatoidní artritidu, roztroušenou sklerosu (MS), zánětlivá onemocnění střevní (IBD), diabetes mellitus závislý na inzulínu (IDDM), sepsi, psoriasu, rejekci transplantátu a chybnou regulaci exprese TNF.
62. Použití podle nároku 61, kde uvedeným stavem je revmatoidní artritida.
63. Použití podle nároku 61, kde uvedeným staven je chybná regulace exprese TNF.
64. Použití podle kteréhokoliv z nároků 57-59, kde uvedený prostředek je vybrán ze skupiny zahrnující N-(6-fenoxy-4chinolyl)-N-[4-
-(fenylsulfanyl)fenyljamin, ethyl 5-oxo-4-[4-(fenylsulfanyl)anilino]-5, 6, 7,8-te-trahydro-3-chinolinkarboxylat, 3-(4-pyridyl)-4,5-dihydro-2H-benzo[g]indazolmethansulfonat, a 2-chlorbenzo[1][1,9]fenanthrolin-7-karboxylat sodný.
65. Použití modulátoru TPL-2 pro léčbu chybné regulace TNF.
66. Použití podle nároku 65, kde uvedený modulátor TPL-2 je vybrán ze skupiny zahrnující
N- ( 6-fenoxy-4-chinolyl) -N-[4- ( fenylsulfanyl) fenyljamin, ethyl 5-ΟΧΟ-4-[4-(fenylsulfanyl)anilino]-5,6,7,8-tetrahydro-3-chinolinkarboxylat, 3-(4-pyridyl)-4,5-dihydro-2H-benzo[g]indazolmethansulfonat, a 2-chlorbenzo[1] [1,9]fenanthrolin-7-karboxylat sodný.
67. Použití modulátoru TPL-2 pro léčbu revmatoidní artritidy.
68. Použití podle nároku 67, kde uvedený modulátor TPL-2 je vybrán ze skupiny zahrnující
N- ( 6-fenoxy-4-chinolyl) -N-[4- (fenylsulfanyl) fenyljamin, ethyl
5-ΟΧΟ-4-[4-(fenylsulfanyl)anilino]-5,6,7,8-tetrahydro-3-chinolinkarboxylat, 3-(4-pyridyl)-4,5-dihydro-2H-benzo[g]indazolmethansulfonat, a 2-chlorbenzo[1][1,9]fenanthrolin-7-karboxylat sodný.
CZ2001625A 1998-08-18 1999-08-13 TPL-2/COT kinasa a způsoby jejího pouľití CZ2001625A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9817930.2A GB9817930D0 (en) 1998-08-18 1998-08-18 Pathway
GBGB9827712.2A GB9827712D0 (en) 1998-12-16 1998-12-16 Pathway

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2001625A3 true CZ2001625A3 (cs) 2002-02-13

Family

ID=26314223

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2001625A CZ2001625A3 (cs) 1998-08-18 1999-08-13 TPL-2/COT kinasa a způsoby jejího pouľití

Country Status (22)

Country Link
US (1) US20020099169A1 (cs)
EP (1) EP1105501A2 (cs)
JP (1) JP4719831B2 (cs)
KR (1) KR20010085407A (cs)
CN (1) CN1323346A (cs)
AU (1) AU767973B2 (cs)
BG (1) BG105345A (cs)
BR (1) BR9913070A (cs)
CA (1) CA2339036A1 (cs)
CZ (1) CZ2001625A3 (cs)
HK (1) HK1041901A1 (cs)
HU (1) HUP0103797A2 (cs)
ID (1) ID28955A (cs)
IL (1) IL141355A0 (cs)
MX (1) MXPA01001747A (cs)
NO (1) NO20010786L (cs)
NZ (1) NZ510313A (cs)
PL (1) PL347137A1 (cs)
RU (1) RU2001107122A (cs)
SK (1) SK2242001A3 (cs)
TR (2) TR200103840T2 (cs)
WO (1) WO2000011191A2 (cs)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6660906B1 (en) 2000-03-08 2003-12-09 Thomas Jefferson University Tpl2 transgenic knockout mice
US7033790B2 (en) 2001-04-03 2006-04-25 Curagen Corporation Proteins and nucleic acids encoding same
GB0402661D0 (en) * 2004-02-06 2004-03-10 Medical Res Council TPL2 and its expression

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5514505A (en) * 1995-05-15 1996-05-07 Xerox Corporation Method for obtaining improved image contrast in migration imaging members
UA71889C2 (uk) * 1996-04-02 2005-01-17 Йєда Рісерч Енд Дівелопмент Ко. Лтд. Модулятори зв'язаного з рецептором tnf фактора (traf), їх одержання та застосування

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0103797A2 (hu) 2003-10-28
US20020099169A1 (en) 2002-07-25
ID28955A (id) 2001-07-19
BG105345A (en) 2001-12-31
WO2000011191A2 (en) 2000-03-02
JP4719831B2 (ja) 2011-07-06
NO20010786L (no) 2001-04-17
MXPA01001747A (es) 2003-06-06
KR20010085407A (ko) 2001-09-07
EP1105501A2 (en) 2001-06-13
NZ510313A (en) 2003-11-28
SK2242001A3 (en) 2001-10-08
AU5563399A (en) 2000-03-14
CN1323346A (zh) 2001-11-21
CA2339036A1 (en) 2000-03-02
PL347137A1 (en) 2002-03-25
BR9913070A (pt) 2001-05-08
AU767973B2 (en) 2003-11-27
NO20010786D0 (no) 2001-02-16
WO2000011191A3 (en) 2000-06-08
RU2001107122A (ru) 2003-04-20
IL141355A0 (en) 2002-03-10
TR200103840T2 (tr) 2002-06-21
JP2002531058A (ja) 2002-09-24
TR200100624T2 (tr) 2001-08-21
HK1041901A1 (zh) 2002-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6025758B2 (ja) Ｎｆａｔの制御因子
US7220723B2 (en) Inhibitors of the interaction between HMGB polypeptides and toll-like receptor 2 as anti-inflammatory agents
US6232081B1 (en) Method for the detection of NF-κB regulatory factors
US7696169B2 (en) Inhibitors of the interaction between HMGB polypeptides and toll-like receptor 2 as anti-inflammatory agents
US6596473B1 (en) Active survival domains of IGF-IR and methods of use
US20040101879A1 (en) Srebp pathway modulation through targeting hisrs
Obermeier et al. Transforming potentials of epidermal growth factor and nerve growth factor receptors inversely correlate with their phospholipase C gamma affinity and signal activation.
JP4719831B2 (ja) Ｔｐｌ−２／ｃｏｔキナーゼおよび使用方法
US8809500B2 (en) Complexes comprising mammalian raptor polypeptide and mammalian mTOR polypeptide
US20030219427A1 (en) TPL-2/COT kinase and methods of use
ZA200102200B (en) TPL-2/cot kinase and methods of use.
US7537911B2 (en) ATM related kinase, ATX, nucleic acids encoding same and methods of use
US20080199469A1 (en) Regulation and function of TPL-2
AU2014348780B2 (en) Biomarker for MELK activity and methods of using same
US6653074B1 (en) Methods for identifying agents which affect cellular morphology, locomotion and death
Swarts Identification and Biochemical Characterization of the Phosphotyrosine-and ShcA-binding Protein STS-1
CHENGCHEN Study of the Associated Proteins of STAT3 and Characterization of their Functions: Roles of GRIM-19 and PIN1 in the Regulation of STAT3 Activity
Summy Functional domain contributions to signaling specificity between the non-receptor tyrosine kinases c-Src and c-Yes
JP2000135100A (ja) 抗ウイルス剤を同定するためのアッセイ法
WO2003104475A2 (en) Atm related kinase atx, nucleic acids encoding same and methods of use
WO2004019994A1 (ja) Ａｒｋ５