WO2004019994A1 - Ａｒｋ５ - Google Patents

Ａｒｋ５ Download PDF

Info

Publication number
WO2004019994A1
WO2004019994A1 PCT/JP2003/010435 JP0310435W WO2004019994A1 WO 2004019994 A1 WO2004019994 A1 WO 2004019994A1 JP 0310435 W JP0310435 W JP 0310435W WO 2004019994 A1 WO2004019994 A1 WO 2004019994A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
ark5
test sample
tumor
cell
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/010435
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroyasu Esumi
Atsushi Suzuki
Original Assignee
Japan As Represented By Director General Of Agency Of National Cancer Center
Pharmaceuticals And Medical Devices Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan As Represented By Director General Of Agency Of National Cancer Center, Pharmaceuticals And Medical Devices Agency filed Critical Japan As Represented By Director General Of Agency Of National Cancer Center
Priority to AU2003257542A priority Critical patent/AU2003257542A1/en
Publication of WO2004019994A1 publication Critical patent/WO2004019994A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to the use of AMPK-related phosphorylase 5.
  • AMPK sucrose-non- fermenting protein kinase
  • SNF-1 sucrose-non- fermenting protein kinase
  • AMPK sucrose-non- fermenting protein kinase
  • It is well proven to be active in cells (Carlson, Curr. Op in. Microbiol. 1999, 2, 202-20 7; Hardie et al., Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 821- 855).
  • SNF-1 / AMPK family is highly conserved in several species including mammals (Becker et al., Eur. J. Biochem. 1996, 235, 736-743; Gardner et al., Genomics 2000, 63, 46-59; Heyer et al., Mol.
  • the tumor suppressor gene ATM was isolated during the study of ataxia teleangiectasia, a human genetic disorder with neurological degeneration and cancer predisposition (Lavin, Nat. Cell Biol. 2000, 2, 215-217; Lavin and Shiloh, Annu. Rev. Immunol. 1 997, 15, 177-202; Savitsly et al., Science 1995, 268, 1749-1753).
  • ATM Belongs to the phosphatidinoreinocytokinase family and activates the tumor suppressor gene p53 via phosphorylation at its Ser 15 and Ser 2Q during cellular responses to DNA double-strand breaks.
  • Akt serine / threonine protein kinase Akt has been identified as a cell survival factor (Datta et al., Genes Dev. 1999, 13, 2905-2927).
  • Akt which is activated by PI-3K in cell survival signaling, is Bad (Datta et al., Cell 1997, 91, 231-241; Peso et al., Science 1997, 278, 687-689) , Caspase 9 (Cardone et al., Science 1998, 282, 1318-1321), Forkhead (Brunet et al., Cell 1999, 96, 857-868), and Mdm2 (Mayo and Dormer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001, 98, 11598-11603) is known to be phosphorylated. Disclosure of the invention
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to identify a protein belonging to the AMPK family and its function, and to provide a method for using the protein. More specifically, the purpose is to provide use of AMPK-related phosphate enzyme 5.
  • the present inventors identified a novel human AMP K family member encoding 661 amino acids with an estimated molecular weight of 74 kDa, and named it ARK5 (PK-Related Kinase 5).
  • ARK5 is estimated at 595-600aa. It has been found that Ser 6QQ has a chief and is phosphorylated by active Akt, thereby activating kinase activity against SAMS-peptide, a common AMPK substrate. Furthermore, it was found that phosphorylates ARK5 force ATM activated by Aktl. In addition, during nutrient starvation, ARK5 was found to support cell survival in an Akt-dependent manner.
  • the PANC-1 cell line P / ARK cell line in which ARK5 was stably transfected with PANC-1 was
  • the P / ARK cell line shows more than a 10-fold increase in tumor growth 12 weeks after transplantation, and the necrotic area within the transplanted tumor nest is the parental PANC-1 cell in the P / ARK cell line There was a significant decrease compared to. Furthermore, muscle infiltration and mesenteric metastasis were markedly observed in nude mice transplanted with the P / ARK cell line.
  • ARK5 can be used as a drug that protects cells from stress that leads to cell death such as nutrient starvation. It was also found that ARK5 inhibitors can be used for the treatment and prevention of diseases such as tumors. Furthermore, it was found that using ARK5 as an index, it is possible to test diseases such as B serious ulcer.
  • the present invention provides the following [1] to [19] regarding the use of ARK5.
  • a drug that imparts stress resistance to cells containing any of the following (a) to (c) as an active ingredient.
  • Tumor, neurodegenerative disease, muscular degenerative disease, or ataxia teleangie containing, as an active ingredient, a nucleotide, nucleotide derivative for suppressing the expression of AMP K-related phosphorylase 5 or a vector containing the same Drugs for treating or preventing ctasia.
  • test sample confers stress resistance to cells, or whether it suppresses tumors, neuropathy'I 1 live diseases, muscle degenerative diseases, or ataxia teleangiectasia Because
  • test sample When the number of cells in which cell death is induced is increased compared to when the test sample is not contacted, the test sample is determined to suppress tumor, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia teleangiectasia, A method in which the test sample is judged to confer stress tolerance to cells if it decreases.
  • [5] A method for evaluating whether or not a test sample confers stress resistance on cells, or whether it suppresses tumor, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia teleangiectasia. ,
  • the number of migrated cells is higher than when the test sample is not contacted
  • test sample confers stress tolerance on cells, or whether it can suppress tumor, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia teleangiectasia
  • test sample When the amount of AM PK-related phosphorylase 5 activity or the amount of activated AMP K-related phosphorylase 5 is increased compared to when the test sample is not contacted, the test sample is stress resistant to the cells.
  • a method in which the test sample is determined to suppress tumor, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia t eleangiectasia when it is determined to be given and decreases.
  • test sample is capable of imparting stress tolerance to cells, or whether it suppresses tumor, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia teleangiectasia,
  • the test sample When the expression level of the reporter gene is higher than when the test material is not contacted, the test sample is determined to confer stress resistance to the cells, and when the test sample decreases, the test sample is tumor, neurodegenerative Disease, muscle degeneration It is determined that the disease or ataxia teleangiectasia is suppressed.
  • [8] A method for evaluating whether a test sample confers stress tolerance on cells, or whether it suppresses tumors, neurodegenerative diseases, muscular alterations, or ataxia teleangiectasia. ,
  • test sample (b) a step of detecting the binding between AMP K-related phosphorylase 5 and A kt, and when the binding is promoted compared to when the test sample is not contacted, the test sample exhibits stress resistance to the cells.
  • a step of selecting, from a plurality of test samples, a sample evaluated to confer stress resistance to cells, or a sample evaluated to suppress tumor, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia teleangiectasia [10] Screening of a sample that imparts stress tolerance to cells, or a sample that suppresses tumor, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia teleangiectasia, including the following steps (a) to (e) Method.
  • test sample that binds to the AMPK-related phosphorylase 5 is conferring stress resistance to cells by the evaluation method according to any one of [4] to [8], or a tumor, The process of evaluating whether to suppress neurodegenerative diseases, muscle degenerative diseases, or ataxia teleangiectasia
  • a sample evaluated to further confer stress tolerance to cells, or evaluated to suppress tumor, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia teleangiectasia A method for producing a pharmaceutical composition comprising the step of mixing the prepared sample and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a method for testing tumor, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia teleangiectasia comprising a step of measuring the activity of AM PK-related phosphorylase 5 or the amount of active AM PK-related phosphorylase 5 .
  • a step of comparing the amount of PK-related kinase 5 with the control Tumor, neurodegenerative disease, muscle alteration 'I 1 live disease, which includes a step of measuring the expression level of AM PK-related phosphate enzyme 5 or DNA encoding AMP ⁇ -related kinase 5 Or, ataxia teleangiectasia screening method.
  • the inspection method according to [14] comprising the following steps (a) to (c):
  • a test agent for tumor, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia teleangiectasia comprising an oligonucleotide that hybridizes to DNA encoding AMPK-related phosphorylase 5 and has a chain length of at least 15 nucleotides.
  • a screening reagent for JB tumor, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia teleangiectasia comprising an antibody that binds to AMP K-related phosphorylase 5.
  • the present inventors belong to the AMP-activated protein kinase (AMPK) family.
  • AMPK-related phosphorylase 5 (ARK5) was isolated and the function of the ARK5 was identified. The present invention is based on this knowledge.
  • the present invention provides a drug that confers stress resistance to cells, containing DNA encoding ARK5, DNA encoding ARK5 and dominant active Akt, or a vector containing these DNAs as an active ingredient.
  • the stress is preferably stress that induces cell death.
  • stress that induces cell death is not particularly limited, and examples thereof include hypoxic stress, hypotrophic stress, metabolic stress, heat stress, and ischemic stress.
  • diseases to which a drug imparting stress tolerance to the cells of the present invention can be applied include diseases involving hypoxic stress, hypotrophic stress, metabolic stress, heat stress, or ischemic stress, for example. Is mentioned. More specifically, examples include, but are not limited to, ischemic brain diseases such as myocardial infarction and cerebral thrombosis.
  • the agent for imparting stress resistance to the cells of the present invention can also be used as a protective agent for organs for transplantation.
  • the biological species from which ARK5 contained in the agent for imparting stress resistance to cells in the present invention is not limited to a specific biological species, for example, human, sanore, mouse, rat, guinea pig, pig , Usushi, Goat, Hedge and so on.
  • the DNA encoding ARK5 in the present invention includes DNA encoding a protein functionally equivalent to ARK5 (for example, SEQ ID NO: 2).
  • DNA encoding ARK5 mutants, alleles, variants, homologs, and the like include DNA encoding ARK5 mutants, alleles, variants, homologs, and the like.
  • “functionally equivalent” means a protein having the same biological function or biochemical function (activity) as the target DNA force ARK5 (eg, SEQ ID NO: 2). It means DNA that encodes quality.
  • DNA encoding a protein having a stress resistance equivalent to ARK5 is included in the DNA encoding ARK5 of the present invention.
  • Whether or not the DNA of interest has a stress resistance equivalent to that of ARK5 is determined by, for example, evaluating the degree of resistance to glucose starvation of cells into which the DNA has been introduced. be able to.
  • whether or not the DNA of interest has the same phosphoric acid activity as ARK5 is, for example, the phosphorylation activity against ATM by the protein encoded from the DNA, or This can be determined by evaluating phosphorylation activity against SAMS peptides.
  • a method of introducing a mutation into the protein is known.
  • a person skilled in the art can perform site-directed mutagenesis (Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol.
  • Amino acid mutations can also occur in nature.
  • DNA comprising an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are mutated in the amino acid sequence of ARK5 (eg, SEQ ID NO: 2) and coding for a protein functionally equivalent to the protein is also included. It is also included in the DNA encoding ARK5 of the present invention.
  • amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid that preserves the properties of the amino acid side chain.
  • amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids with aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids with hydroxyl group-containing side chains (S, ⁇ , ⁇ )
  • C amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino groups with base-containing side chains (R, K, ⁇ ), aromatic-containing side chains
  • amino acids ⁇ , F, Y, W
  • a protein in which a plurality of amino acid residues are added to the amino acid sequence of ARK5 includes a fusion protein containing these proteins.
  • a fusion protein is a fusion of these proteins with other peptides.
  • the DNA encoding ARK5 in the present invention is a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA encoding ARK5 (eg, SEQ ID NO: 1), and encodes a protein functionally equivalent to ARK5. DNA is also included.
  • a DNA encoding ARK5 eg, SEQ ID NO: 1
  • DNA is also included.
  • Those skilled in the art can appropriately select hybridization conditions for isolating DNA encoding a protein functionally equivalent to ARK5.
  • An example of the hybridization condition is a low stringent condition. Low stringent conditions are, for example, 42 ° C, 5 XSSC, 0.1% SDS, and preferably 50 ° C, 5 XSSC, 0.1% SDS in the washing after high pre-hydration. It is a condition. More preferable hybridization conditions include highly stringent conditions.
  • High stringency conditions are, for example, 65 ° C, 0.1 XSSC and 0.1% SDS. Under these conditions, it can be expected that DNA having high homology can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, multiple factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art will realize the same stringency by appropriately selecting these factors. Is possible.
  • a gene amplification method using primers synthesized based on the sequence information of DNA encoding ARK5 for example, DNA encoding a protein functionally equivalent to AR 5 using the polymerase chain reaction (PCR) method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Proteins functionally equivalent to ARK5 encoded by DNA isolated by these hybridization techniques and gene amplification techniques usually have high homology in amino acid sequence with ARK5.
  • the DNA encoding ARK5 of the present invention includes DNA that is functionally equivalent to ARK5 (for example, SEQ ID NO: 2) and strongly encodes a protein having high homology with the amino acid sequence of the protein.
  • High homology usually means at least 50% identity, preferably 75% identity, more preferably 85% identity, more preferably 95% identity at the amino acid level. Point to.
  • Akt means serine / threonine protein kinase Akt.
  • nucleotide sequence of the Akt cDNA and the amino acid sequence of the protein encoded by the cDNA are shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively.
  • dominant active Akt can be obtained by, for example, literature (Cross, DA et al., Nature 378: 785-789 (1995); Kohn, AD et al., J. Biol. Chem. 2 71: 31372- 31378 (1996)) and the like.
  • DNA encoding ARK5 or dominant active Akt is incorporated into a vector that guarantees the expression of the DNA in vivo.
  • retrovirus method eg, pAdexlcw
  • a retrovirus vector eg, pZIP neo
  • the procedure for inserting DNA encoding ARK5 or dominant-type Akt into a vector can be performed according to a conventional method (Molecular Cloning, 5. 61-5. 63). Administration into a living body may be ex 'TO method or in ⁇ ⁇ method.
  • gene therapy for conferring stress tolerance on cells can be performed by the above method.
  • the present invention also includes a tumor, a neurodegenerative disease, a muscle degenerative disease, or an ataxia teleangiectasia (capillary vasodilatation) containing a nucleotide, a nucleotide derivative for inhibiting the expression of ARK5, or a vector containing them as an active ingredient.
  • the tumor preferably includes a metastatic tumor, but is not limited thereto. When the tumor is a metastatic tumor, the drug is used to suppress invasion or metastasis of the metastatic tumor.
  • the nucleotide or nucleotide derivative for suppressing the expression of ARK5 is not particularly limited, and examples thereof include an antisense oligonucleotide or a derivative thereof.
  • Antisense oligonucleotides include, for example, antisense oligonucleotides that hybridize to any position in a DNA sequence encoding ARK5 (eg, SEQ ID NO: 1).
  • This antisense oligonucleotide is preferably an antisense oligonucleotide for at least 15 or more consecutive nucleotides in the DNA sequence of ARK5. More preferably, it is an antisense oligonucleotide in which at least 15 or more consecutive nucleotides contain a translation initiation codon.
  • An example of such an antisense oligonucleotide is shown in SEQ ID NO: 7, but is not limited thereto.
  • antisense oligonucleotides derivatives or modifications thereof can be used.
  • modifications include lower alkyl phosphonate modifications such as methyl phosphonate type or ethyl phosphonate type, phosphorothioate modification, phosphoramidate modification, and the like.
  • Antisense oligonucleotides not only have nucleotides corresponding to nucleotides constituting a predetermined region of DNA or mRNA, but also DNA or mRNA and oligonucleotides are specifically hybridized to DNA sequences. If possible, includes those with one or more nucleotide mismatches It is.
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention acts on ARK5 producing cells to bind to DNA or mRNA encoding the ARK5, thereby inhibiting transcription or translation, or promoting degradation of mRNA.
  • suppressing the expression of ARK5 has the effect of suppressing the action of ARK5 as a result.
  • the antisense oligonucleotides and derivatives thereof of the present invention can be mixed with a suitable base that is inactive to them to make external preparations such as coating agents and poultices. If necessary, add excipients, tonicity agents, solubilizers, stabilizers, preservatives, soothing agents, etc. and add tablets, powders, granules, capsules, ribosome capsules, It can be used as a lyophilizing agent, such as propellants, liquids, and nasal drops. These can be prepared according to conventional methods.
  • the antisense oligonucleotide or derivative thereof of the present invention is applied to a patient so that it can reach the affected part by force applied directly to the affected part of the patient or administered into the blood vessel. Furthermore, it is possible to use an antisense encapsulating material that enhances durability and membrane permeability. Examples include ribosome, poly-L-lysine, lipid, cholesterol, lipofectin, or derivatives thereof.
  • the dosage of the antisense oligonucleotide or derivative thereof of the present invention can be appropriately adjusted according to the patient's condition, and a preferred amount can be used.
  • the present invention as the c such cells to provide an artificially modified cells as expression of ARK5 increases were DNA Gashirube input encoding H / ARK5 (ARK5 described in Example HepG2 Cells) and P / ARK5 (PANC-1 cells into which DNA encoding ARK5 has been introduced), but are not limited thereto.
  • the cells artificially modified so that the expression of ARK5 in the present invention is increased can be prepared by introducing DNA encoding ARK5 into the cells. It can also be prepared by introducing a mutation into the promoter region of the gene encoding endogenous ARK5.
  • the cell species from which AR 5 introduced into the cell is derived is not limited to a specific species. For example, humans, monkeys, mice, rats, guinea pigs, pigs, sushi, hidges, goats and the like.
  • DNA encoding ARK5 When introducing DNA encoding ARK5 into a cell, it is preferable to incorporate DNA encoding ARK5 into an expression vector.
  • an expression vector for example, for expression in animal cells such as HepG2 cells, PANC-1 cells, PC-10 cells, A549 cells, ASPC-1 cells, HLF cells, HF cells, CH0 cells, COS cells, NIH3 T3 cells.
  • promoters required for expression in cells such as SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (197 9) 277, 108), MMLV-LTR promoter, EFla promoter (Mizushima et al., Nuolic Acids Res.
  • CMV promoter etc.
  • drug resistance gene that can be distinguished by a gene (eg, neomycin, G418, etc.) for selecting transformation into cells.
  • examples of such a vector include p ⁇ , pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, p0P13, pSV2neo, pcDNA I, and pCD8.
  • the CH0 cell lacking the nucleic acid synthesis pathway has a DHFR gene that captures it.
  • a method of introducing a vector (for example, pCHOI) and amplifying with methotrexate (MTX) can be used.
  • MTX methotrexate
  • a gene expressing the SV40 T antigen must be selected.
  • An example is a method in which COS cells possessed on chromosomes are transformed with vectors having an SV40 replication origin (such as pcD).
  • the replication origins are also poliovirus, adenovirus, W
  • the expression vectors are selected as selectable markers: aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine lysate (TK) gene, large B recruitment fungus xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogp t) gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene and the like.
  • the present invention provides a method for evaluating whether or not a test sample confers stress resistance on cells, or whether it suppresses tumor, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia teleangiectasia. .
  • test sample in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include single compounds such as natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, peptides, compound libraries, expression products of gene libraries, Examples include cell extract, cell culture supernatant, fermented microorganism product, marine organism extract, plant extract, prokaryotic cell extract, eukaryotic single cell extract or animal cell extract.
  • the test sample can be appropriately labeled and used as necessary. Examples of the label include a radiolabel and a fluorescent label.
  • the cell and the test sample can be contacted, for example, by adding the test sample to the cell culture medium.
  • the test sample is a protein
  • a vector containing DNA encoding the protein can be introduced into cells artificially modified so that the expression of ARK5 is increased.
  • the cell is then stressed to induce cell death.
  • the stress that induces cell death is not particularly limited, and examples thereof include hypoxic stress, hypotrophic stress, metabolic stress, heat stress, and ischemic stress.
  • the number of cells in which cell death has been induced is then measured. Determine.
  • a method known to those skilled in the art can be used as a method for measuring the number of cells in which cell death has been induced.
  • evaluation can be performed by Hoechst 33342 / PI staining described in Examples, but is not limited to this method.
  • the test sample when the number of cells in which the cell death has been induced is increased as compared to when the test sample is not contacted, the test sample is a tumor, a neurodegenerative disease, a muscle degenerative disease, or If it is determined to suppress ataxia teleangiectasia and decreases, it is determined that the test sample confers stress tolerance on the cells.
  • a cell artificially modified so that the expression of ARK5 is increased is provided.
  • the test sample is contacted with the cells.
  • the number of migrated cells is measured.
  • the number of migrated cells can be measured by a method well known to those skilled in the art. For example, Matrigel- Coated Invati on Chamber (Becton—Dickinson Company, Franklin Lakes, NJ) /
  • the number of cells that move to the bottom of the lower chamber through the gel layer can be measured using a phase contrast microscope, but is not limited to this method.
  • the test sample when the number of migrated cells increases compared to when the test sample is not contacted, the test sample is determined to confer stress resistance to the cells and decreases. In addition, it is determined that the test sample suppresses tumor, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia teleangiectasia.
  • ARK5 used in another embodiment of the evaluation method of the present invention, first, a test sample is brought into contact with ARK5.
  • the state of ARK5 used is not particularly limited, and may be, for example, a purified state, a state expressed in a cell, a state expressed in a cell extract, or the like.
  • the biological species from which ARK5 used in the evaluation method of the present invention is derived is not limited to a specific biological species. For example, humans, monkeys, mice, rats, guinea pigs, pigs, ushi, Higgies, goats, etc.
  • Cells expressing ARK5 include cells that express endogenous ARK5, or cells that express exogenous ARK5. Cell.
  • Examples of the cells expressing endogenous ARK5 include, but are not limited to, cultured cells.
  • the above-mentioned cells expressing foreign ARK5 can be prepared, for example, by introducing into a cell a vector containing DNA encoding ARK5. Introduction of a vector into a cell can be performed by a method common to those skilled in the art.
  • the cells having the exogenous ARK5 can be prepared, for example, by inserting a DNA encoding ARK5 into a chromosome by a gene transfer method using homologous recombination.
  • the biological species from which the cells into which such exogenous ARK5 is introduced is not particularly limited, as long as the technology for expressing the foreign protein in the cells is established.
  • Examples of the cell extract in which ARK5 is expressed include a cell extract contained in an in vitro transcription / translation system and a vector containing DNA encoding ARK5 added thereto.
  • the in vitro transcription / translation system is not particularly limited, and a commercially available in vitro transcription / translation kit can be used.
  • “contact” is performed according to the state of ARK5.
  • ARK5 if ARK5 is in a purified state, it can be performed by adding a test sample to the purified sample. Moreover, if it is a state expressed in a cell or a state extracted in a cell extract, it can be carried out by adding a test sample to the cell culture solution or the cell extract, respectively.
  • the test sample is a protein
  • a vector containing DNA encoding the protein is introduced into cells expressing ARK5, or the vector is added to a cell extract expressing ARK5. It is also possible to do this. Further, for example, a two-hybrid method using yeast or animal cells can be used.
  • the activity of ARK5 or the amount of active ARK5 is then measured.
  • the method for measuring the activity of ARK5 has already been described.
  • the test sample when the amount of ARK5 activity or activated ARK5 is increased compared to when the test sample is not contacted, the test sample is If it is determined to confer stress tolerance to the cell and decreases, the test sample is determined to suppress tumor, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia teleangiectasia.
  • a cell or a cell extract having DNA to which a reporter gene is operably linked downstream of the promoter region of the ARK5 gene is provided.
  • “functionally linked” means that the promoter region of the ARK5 gene and the reporter gene are such that expression of the reporter gene is induced by binding of a transcription factor to the promoter region of the ARK5 gene. It means being connected. Therefore, even when the reporter ⁇ "gene is linked to another gene and forms a fusion protein with another gene product, the fusion factor is bound by the transcription factor binding to the promoter region of the ARK5 gene. Any expression that induces protein expression is included in the meaning of “functionally linked”.
  • the reporter gene is not particularly limited as long as its expression can be detected.
  • a CAT gene a lacZ gene, a luciferase gene, a J3 -daluronidase gene (GUS) and a GFP that are commonly used in the art. Genes etc. can be mentioned.
  • the reporter gene also includes DNA encoding ARK5.
  • test sample is then brought into contact with the cells or the cell extract.
  • expression level of the reporter gene in the cell or the cell extract is measured.
  • the expression level of the reporter gene can be measured by methods known to those skilled in the art depending on the type of reporter gene used. For example, when the reporter gene is a CAT gene, the expression level of the reporter gene can be measured by detecting the chloramphenicol acetylation by the gene product.
  • the reporter gene is the lacZ gene
  • the gene expression product By detecting the color development of the dye compound by catalysis, and in the case of the luciferase gene, by detecting the fluorescence of the fluorescent compound catalyzed by the gene expression product, and by -glucuronidase gene (GUS)
  • GUS -glucuronidase gene
  • ICN Glucuron
  • X-Glue 5-color-3-chloro-3-indolyl-j3-glucurode
  • the expression level of the reporter gene can be measured by detecting fluorescence from the GFP protein.
  • the expression level of the gene can be measured by methods known to those skilled in the art.
  • the transcription level of the gene can be measured by extracting the mRNA of the gene according to a standard method and performing the Northern hybridization method or RT-PCR method using the mRNA as a cage. You can.
  • the expression level of the gene can be measured using DNA array technology.
  • the fraction containing ARK5 encoded by the gene can be collected according to a standard method, and the translation level of the gene can be measured by detecting the expression of the ARK5 by electrophoresis such as SDS-PAGE. . Further, it is also possible to measure the translation level of a gene by performing a Western plotting method using an antibody against ARK5 and detecting the expression of the ARK5.
  • test sample when the expression level of the reporter gene is increased compared to when the test sample is not contacted, it is determined that the test sample confers stress resistance to the cells and decreases. In this case, it is determined that the test sample suppresses tumor, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia teleangiectasia.
  • ARK5 and Akt are contacted in the presence of a test sample.
  • the ARK5 and Akt used may be in a purified state, a state expressed in cells, a state expressed in cell extracts, and the like. Akt can be purified by methods well known to those skilled in the art.
  • the binding between ARK5 and Akt is then detected. For example, in the presence of a test sample, cells expressing ARK5 and Akt are cultured, and after recovering the cells, the complex is recovered with an antibody against one of the proteins, and then the other protein is recovered with the protein. By detecting using an antibody against the protein, the binding of both proteins can be evaluated.
  • ARK5 and Akt are incubated in a test tube in the presence of a test sample, and the complex is recovered with an antibody against one of the proteins or an antibody against a tag fused to these proteins.
  • the binding between the two proteins can be evaluated.
  • one protein is bound to the support, the other protein is bound, and the test sample is applied thereto. The effect of the test sample can also be evaluated by detecting whether or not the bound protein is dissociated.
  • the test sample when the binding is promoted compared to when the test sample is not contacted, the test sample is determined to impart stress resistance to the cell, and when the test sample is suppressed, the test sample Is determined to suppress tumors, neurodegenerative diseases, muscle degenerative diseases, or at axia teleangiectasia.
  • the present invention provides a method for efficiently screening a sample that confers stress tolerance to cells, or a sample that suppresses tumor, neurodegenerative disease, muscle change '!' Live disease, or ataxia teleangiectasia.
  • the evaluation method described above Is used to evaluate whether or not to confer stress tolerance on cells, or whether to suppress tumor, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia teleangiectasia. Samples that were evaluated to confer stress resistance to cells from tumor samples, or tumors, neurodegenerative diseases, muscles Select samples evaluated to inhibit degenerative disease or ataxia teleangiectasia.
  • a plurality of test samples are contacted with ARK5.
  • the binding between ARK5 and the test sample is detected.
  • a test sample that binds to ARK5 is then selected.
  • ARK5 As a method of screening for a polypeptide that binds to ARK5, many methods known to those skilled in the art can be used. Such screening can be performed, for example, by immunoprecipitation. Specifically, this can be done as follows.
  • the DNA encoding ARK5 is inserted into a vector for expression of foreign genes such as pMAM, pDR2, pBK-RSV, BK-CMV, pOPRSV, p0P13, pSV2neo, pcDNA I, and pCD8 in animal cells. Express the gene. Any promoter that can be generally used as a plug motor for expression may be used.
  • the electroporation method Cho, G.
  • ARK5 can be expressed as a fusion polypeptide having a monoclonal antibody recognition site by introducing a monoclonal antibody recognition site (epitope) with a known specificity into the N-terminus or C-terminus of ARK5.
  • a commercially available epitope antibody system can be used (Experimental Medicine 13, 85-90 (1995)).
  • 3-galactosida Betaers that are capable of expressing fusion polypeptides with lysase, maltose binding protein, glutathione S-transferase, green fluorescent protein (GFP), etc. are commercially available.
  • polyhistidine His-tag
  • influenza agglutinin HA human C—myc, FLAG, Vesicular stomatitis Winores glycoprotein (VSV—GP)
  • VSV—GP Vesicular stomatitis Winores glycoprotein
  • T7-tag human simple herpes Epitopes such as viral glycoproteins (HS V-tag) and E-tags (epitopes on monoclonal phages) and monoclonal antibodies that recognize them can be used as epitopic antibodies for screening of polypeptides that bind to ARK5. Available (Experimental Medicine 13, 85-90
  • an immune complex is formed by adding these antibodies to a cell lysate prepared using an appropriate surfactant.
  • This immune complex consists of ARK5, a polypeptide capable of binding to it, and an antibody.
  • immunoprecipitation can also be performed using an antibody against ARK5.
  • an antibody against ARK5 for example, a gene encoding ARK5 is introduced into an appropriate E. coli expression vector, expressed in E. coli, the expressed polypeptide is purified, and this is used for rabbits, mice, rats, goats, It can be prepared by immunizing a chicken or the like. It can also be prepared by immunizing the above animal with the synthesized partial peptide of ARK5.
  • the immune complex can be precipitated using Protein A Sepharose or Protein G Sepharose.
  • ARK5 was prepared as a fusion polypeptide with an epitope such as GST, an antibody of ARK5 was used using a substance that specifically binds to such an epitope such as glutathione-Sepharose 4B. As in the case of forming immune complexes. Can do.
  • SDS-PAGE is generally used for analysis of immunoprecipitated polypeptides, and by using a gel with an appropriate concentration, it is possible to analyze polypeptides that have been bound by the molecular weight of the polypeptide.
  • the polypeptide bound to ARK5 is generally difficult to detect by the usual staining method of polypeptide such as Kumashi-staining or silver staining.
  • an element 3 - Mechionin and 3 3 ⁇ 4 - cells were cultured in Shisuti containing emissions culture, labeling the polypeptides in said cell, it is possible to improve the detection sensitivity by detecting this.
  • the desired polypeptide can be purified directly from an SDS-polyacrylamide gel and its sequence determined.
  • ARK5 or its partial peptide is fused with the SRF DNA binding region or GAL4 DNA binding region and expressed in yeast cells to express a polypeptide that binds to ARK5.
  • a cDNA library that can be expressed in a form fused with the VP16 or GAL4 transcriptional activation region, and introduced it into the yeast cell. (If a polypeptide that binds to ARK5 is expressed in yeast cells, the binding of the two activates the reporter gene, and positive clones can be confirmed).
  • a polypeptide encoded by the cDNA can be obtained. This makes it possible to prepare a polypeptide that binds to ARK5 or its gene.
  • reporter genes used in 2-hybrid systems include for example, the Ade2 gene, LacZ gene, CAT gene, luciferase gene, PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor typel) gene, etc. other than the HIS3 gene S can be mentioned, but not limited thereto. Screening by the two-hybrid method can be performed using yeast or mammalian cells.
  • Screening for a compound that binds to ARK5 can also be carried out using an affinity matrix.
  • ARK5 is immobilized on a carrier of an affinity column, and a test sample that is expected to express a polypeptide that binds to ARK5 is applied here.
  • test samples in this case include cell extracts and cell lysates. After applying the test sample, the column can be washed to prepare a polypeptide bound to ARK5.
  • the obtained polypeptide is analyzed for its amino acid sequence, synthesized oligo DNA based on the amino acid sequence, and screened for the cDNA library using the DNA as a probe. Can be obtained.
  • a method for isolating a compound that binds to ARK5 is not limited to a polypeptide.
  • a synthetic compound, a natural product puncture, or a random phage peptide display library is allowed to act on immobilized ARK5 and bind to ARK5 Screening methods using high-throughput technology using combinatorial chemistry technology (Wrighton NC; Farrell FX; Chang R; Kashyap AK; Barbone FP; Mulcahy LS; Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK; Dower WJ., Small peptides as potent mimetics of the protein hormone eryt hropoietin, Science (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 p458- 64, Verdine G L., The combinatorial chemistry of nature.Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 pll-13, Hogan JC Jr., Directed combinatorial chemistry. Nature (ENGLA D) Nov 7 1996, 3
  • a biosensor using the surface plasmon resonance phenomenon can also be used as a means for detecting or measuring the bound sample.
  • the biosensor using the squeaking phenomenon can observe the interaction between ARK5 and the test sample in real time as a surface plasmon resonance signal using a small amount of polypeptide and without labeling.
  • a biosensor such as BIAcore.
  • a means for detecting or measuring the bound sample for example, it can be performed by using a label attached to the protein. Examples of the type of label include a fluorescent label and a radiolabel.
  • the test sample that binds to ARK5 obtained by the above method whether or not to impart stress resistance to the cells by the evaluation method of the present invention, or a tumor, a neurodegenerative disease, Evaluate whether to suppress muscle degenerative diseases or ataxia t eleangiectasia.
  • a sample evaluated to confer stress tolerance on cells, or fl serious tumor, neurodegenerative disease, muscle alteration 'I 1 live disease, or ataxia teleangiectasia is evaluated as being suppressed. Select the titered sample.
  • the present invention provides a method for producing a pharmaceutical composition.
  • a sample evaluated to confer stress tolerance to cells by the above screening method or a sample evaluated to suppress tumor, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia teleangiectasia Mix with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier include surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrating agents, lubricants, fluidity. Accelerators, flavoring agents and the like can be mentioned, but the present invention is not limited to these, and other commonly used carriers can be appropriately used.
  • the present invention also includes a step of measuring the amount of ARK5 activity or active ARK5, or the expression level of DNA encoding ARK5 or ARK5, tumor, neurodegenerative disease, muscle alteration 'I " Providing a test method for live diseases or ataxia teleangiectasia, which can be used to determine tumor malignancy (eg metastatic potential), anti-tumor agent chemotherapy and radiotherapy. Judgment of performance, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia teleangiectasia can be confirmed.
  • the inspection method of this invention is not limited to those methods.
  • the control means a tumor, a neurodegenerative disease, a muscle degenerative disease, or an unaffected person of ataxia teleangiectasia.
  • a protein sample is prepared from a subject.
  • a protein sample from a subject is, for example, a sample containing a lesion, such as a tumor, muscle, or nerve of the subject, and a blood cell component such as lymphocytes or leukocytes. It can be prepared by known methods.
  • the activity of ARK5 or the amount of active ARK5 contained in the protein sample is then measured.
  • the measured activity of ARK5 or the amount of active ARK5 is then compared to a control.
  • a protein sample is first prepared from a subject. Next, the amount of ARK5 contained in the protein sample is measured. The amount of ARK5 measured is then compared to the control.
  • Examples of such methods include methods well known to those skilled in the art, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), double monoclonal antibody S. Germanis immunoassay (US Pat. No. 4, 376, 110), Monoclonal polyclonal antibody Sandwich method (Edited by Wide et al., Kirkham and Hunter, “Radioi unoassay” ⁇ ⁇ and S. Livingstone, Yejinpara, (1970)) , Immunofluorescence, western blotting, dot blotting, immunoprecipitation, protein chip analysis (protein nucleic acid enzyme Vol. 47 No. 5 (2002), protein nucleic acid enzyme Vol. 47 No. 8 (2002 )) Examples include two-dimensional electrophoresis and SDS polyacrylamide electrophoresis, but the above-described detection methods are not limited to these.
  • an RNA sample is prepared from a subject.
  • the amount of RNA encoding ARK5 contained in the RNA sample is measured.
  • the amount of RNA measured is then compared to a control.
  • a cDNA sample is prepared from a subject.
  • the amount of 'cDNA encoding ARK5 contained in the cDNA sample is measured.
  • the amount of cDNA measured is then compared to a control.
  • An RNA sample or cDNA sample from a subject is obtained from, for example, a sample containing a lesion, such as a tumor, muscle, or nerve, and a blood cell component such as lymphocyte or leukocyte of the subject. It can be prepared by a well-known method.
  • Examples of such methods include methods well known to those skilled in the art, such as Northern blotting, RT-PCR, and DNA array.
  • the present invention also provides a test agent used for a test method for tumor, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia teleang i ectasia.
  • a test drug include a test drug containing an oligonucleotide that is hybridized to DNA encoding ARK5 and has a chain length of at least 15 nucleotides, or an antibody that binds to ARK5.
  • the antibody is not particularly limited as long as it is an antibody that can be used for testing, and examples thereof include the anti-SNARK antibody described in the present Example. The antibody is labeled as necessary.
  • the oligonucleotide specifically hybridizes to DNA encoding ARK5 (for example, SEQ ID NO: 1). Specific hybrids If possible, the oligonucleotide need not be completely complementary to the DNA encoding ARK5.
  • test agent containing the oligonucleotide examples include a probe (which may be in the form of a substrate on which the probe is fixed) and a primer that can be used in the test method of the present invention.
  • a probe which may be in the form of a substrate on which the probe is fixed
  • a primer that can be used in the test method of the present invention.
  • its length is usually 15 bp to 100 bp, preferably 17 bp to 30 bp.
  • the primer is not particularly limited as long as it can increase at least a part of the DNA of the present invention.
  • the probe is not particularly limited as long as it specifically hybridizes to DNA encoding ARK5.
  • the probe may be a synthetic oligonucleotide and usually has a chain length of at least 15 bp.
  • the oligonucleotide of the present invention can be produced by, for example, a commercially available oligonucleotide synthesizer.
  • the probe can also be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment or the like.
  • T4 polynucleotide kinase is used for labeling by phosphorylating the 5 and ends of the oligonucleotide with 32 P
  • a DNA polymerase such as Klenow enzyme
  • Klenow enzyme is used for random hexamer oligonucleotide.
  • examples thereof include a method of incorporating a substrate base labeled with an isotope such as 32 P using a nucleotide or the like, a fluorescent dye, or piotin (such as a random prime method).
  • oligonucleotide antibody for example, sterile water, physiological saline, vegetable oil, surfactant, lipid, solubilizer, buffer, protein stabilizer (BSA and gelatin) Etc.
  • Preservatives and the like may be mixed as necessary.
  • Figure 1 is a photograph showing the cross-reactivity of an unknown protein with an anti-SNARK antibody. From several cell lines (lung: lung cancer PC-10 and A549, knee: knee cancer PANC-1 and ASPC-1; liver: liver cancer He P G2 and HLE; and fibroblasts: HF) The cell extracts were immunoblotted with a polyclonal antibody against human SN ARK. The asterisk indicates the location of an unknown 74 kDa protein.
  • FIG. 2 shows the deduced amino acid sequences of KIM0537 (top) and human SNARK (bottom) (described in SEQ ID NOs: 2 and 12, respectively).
  • Box A shows the region of the putative catalytic domain
  • Box B shows the amino acid sequence used to prepare the polyclonal antibody against human SNARK.
  • Figure 3 is a photograph showing a novel AMPK-related protein kinase.
  • FIG. 4 is a photograph showing the SAMS peptide phosphorylation activity of ARK5.
  • Figure 5 is a diagram showing the involvement of ARK5 in resistance to glucose starvation c (A) containing glucose (+) or without (-) in HepG2 cells or H / ARK cells exposed for 24 hours the medium, using Hoechst 33342 / PI staining analysis to determine the cell death induction.
  • the cell death induction ratio is shown as the average of three experiments, and par represents the SE value.
  • An asterisk indicates statistical significance p ⁇ 0. 01 (t test).
  • FIG. 6 is a photo of the ARK5 activation by Akt.
  • FIG. 7 shows a comparison of the amino acid sequences of putative Akt phosphorylation sites of ARK5 and other known Akt substrates.
  • the shaded box and the black box in the schematic model of ARK5 protein are the putative catalytic domain region and the Akt phosphorylation motif region, respectively.
  • the amino acid sequences in the figure are described in SEQ ID NOs: 13-30.
  • FIG. 8 is a diagram showing mutation analysis of the Akt phosphorylation site of ARK5.
  • ARK5 ARK5 / SA was incubated in in ro in the presence (+) or absence (-) of active Aktl. After incubation, ARK5 by scintillation counting
  • FIG. 9 is a photograph showing the interaction between Akt and ARK5.
  • FIG. 10 shows that (A) ARK5, dominant active Akt, dominant negative Akt, ARK5 deletion mutant, and Z or ARK-SA mutant were transiently transfected or transfected.
  • FIG. 6 shows that glucose-starvation was performed on HepG2 cells that were not present for 24 hours. After incubation, cell death induction was measured using Hoechst33342 / PI staining analysis. Cell death induction ratios are shown as the average of three experiments, and bars represent SE values.
  • FIG 11 is a picture showing the phosphorylation of ATM by ARK5.
  • A Each consensus sequence is shown in a box.
  • a schematic model of the phosphate chain by AMPK (top) or A kt (bottom) is indicated by an arrow on the ATM sequence.
  • Each consensus sequence is shown in a box.
  • FIG. 12 is a photo of an in iro tumor metastasis assay using an invasion chamber with a Matrigel coating.
  • PANC-1 cell line (ARK5-) and P / ARK cell line (ARK5 +) are seeded in the upper chamber and in the presence (+) or absence (-) of 20 / i M LY294002 for 4 ⁇ hours Incubated. After incubation, the cells that had migrated to the bottom of the lower chamber were counted. The number of metastatic cells is shown as the average of three experiments, with par representing SE values.
  • Fig. 13 is a photograph showing the secretion and expression of sputum.
  • PANC-1 cell line (ARK5-) and P / ARK cell line (ARK5 +) were cultured in serum-free medium for 48 hours in 6-well plates with or without Matrigel coating (-) did. After culture, concentrate culture medium to detect secretion of ⁇ -2 and ⁇ -9, and investigate MT1- ⁇ expression. Therefore, cell extracts were collected.
  • FIG. 14 shows tumorigenicity of PAC-1 cell line and P / ARK cell line in nude mice.
  • the PANC-1 cell line (white) and the P / ARK cell line (black) were transplanted into nude mice (5 mice each), and the tumor volume was measured over 12 weeks. Tumor volume is shown as the average of 5 data, with par representing SE values.
  • FIG. 15 shows photographs and figures showing histological observation of tumors formed by PANC-1 cell line and P / ARK cell line in nude mice. Twelve weeks after transplantation, small (A) and large (B) tumor foci formed by the PAN C-1 cell line and P / ARK cell line were extracted and stained with HE. The necrotic area is shown as “N”. In addition, the central area of each tumor nest has been magnified 300 times.
  • Figure 16 is a photograph showing muscle invasion (A) and mesenteric metastasis (B).
  • M muscle; T : tumor; ML: muscle layer; Int .: intestine.
  • ARK5 with FLAG tag is LA PCR (Takara Biomedicals, Kyoto, Japan); Upstream primer: 5 '-MGCTTATGGATTATAAAGATGATGATGATAAAGMGGGGCCGCCGCGCCTGTGG CGGGG-3' (SEQ ID NO: 8); Downstream primer: 5 '-TCTAGACTAGTTGAGCTTGCTGCAGAT CTCCAG-3 No. 9) was prepared from the pBluescript II SK + vector ligated with the full-length KI M0537 provided by Kazusa DNA Laboratory.
  • the PCR product was ligated into the pT7-Blue T vector for subcloning, and the cDNA inserted digested with Hindlll and Xbal was then reconstituted into the pcDNA3.1 (+) expression vector. Ligated. The inserted cDNA was also ligated into the pcDNA3.1 (-) expression vector for the preparation of the antisense vector.
  • the human hepatoma cell line HepG2 was maintained in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 10% urine fetal serum (FCS: Sigma Chemical Co., Ltd., M0). For transfer, seed cells in 6-well plates at 2.5 x 10 5 wells and then transfect using TransFast Transfection Reagent (5 ⁇ g DNA / well: Promega Corporation, WI) with some modification. Faction was carried out. Forty-eight hours later, G418 selection was performed at lmg / ml for the preparation of hydride ARK5 expressing clones.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • FCS urine fetal serum
  • Monoclonal antibodies against FLAG, anti-FLAG binding Agarosu, recombinant activated Ak tl s and dominant negative ⁇ Pi dominant active Aktl expression vector was purchased from Upstate Biotechnology (NY).
  • Hoechst 33342 / PI staining were purchased from Molecular Probes. After treatment, the cells were collected, stained with Hoechst 33342 and PI, and then observed with a fluorescence microscope. The ratio of cells bearing nuclei stained with PI to the total number of cells (approximately 1000 cells) indicates the cell induction ratio.
  • Proteins with a FLAG tag were isolated from cell lysates with anti-FLAG conjugated agarose and suspended in kinase buffer containing 25 mM Tris (pH 7.5), 2 mM DTT, 10 mM MgCl 2 . Subsequently, ⁇ ⁇ ⁇ - the [ ⁇ 32 ⁇ ] ⁇ (20 ⁇ Ci) and recombinant activated Aktl, it was added to kinase buffer containing the recombinant proteins were incubated for 30 min at 30 ° C.
  • FCS fetal serum
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • PANC-1 cell lines and P / ARK cell lines were seeded on 6-well culture plates at 2.5 ⁇ 10 5 cells / well. After 24 hours, the medium was replaced with serum-free DMEM, and serum-free culture was performed for 48 hours. After culture, the medium was collected and concentrated by centriprep (Millipore Corporation, Bedford, Mass.), And the cells were lysed by PBS-1% NP-40. The concentrated medium and cell extract separated by SDS-PAGE were transferred to a nitrocellulose membrane by a semi-dry plotting system.
  • Membranes were probed with PBS containing 5% (w / v) skim milk (Beet on- Dickinson Co.) for 1 hour at room temperature and mixed with PBS and 0.05% Tween20 (Sigma, Tween-PBS) And then incubated overnight at room temperature with a PBS dilution of antibody to MMP-2, MMP-9, or MT1-MMP (Fuji 'Chemical Co., Ltd., Toyama, Japan). After washing with TVeen-PBS, the membrane was stained with 2000-fold diluted HRP-conjugated anti-mouse IgG antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA). The membrane was washed with Tween-PBS and then ECL system (Amersham Pharm acia Biotech KK, UK).
  • the present inventors isolated human cDNA encoding AMPK family single gene SNARK from human testis single-stranded DNA, and prepared a polyclonal antibody against this protein. SNARK in several human cell lines, lung cancer PC-10 and A549, pancreatic cancer PANC-1 and ASPC-1, liver cancer He P G2 and HLE, and fibroblast HF The endogenous expression of was investigated. As shown in Figure 1, immunoblotting revealed the expression of an unknown 74 kDa cross-reactive protein in some of the cell lines tested (strong: PC-10, PANC-1, ASPC-1, and HL E; weak: A549 and HF; none: HepG2).
  • the present inventors have determined that this 74 kDa by BLAST search analysis using human SNARK amino acid sequences, or peptide sequences used to prepare anti-human SNARK antibodies, and a human protein database from the National Cancer Institute (USA).
  • An unknown protein encoded by the KIM0537 cDNA clone (Nagase et al. DNA Res 1998, 28, 31-39) was found.
  • the putative catalytic domain of SNARK and KIM0537 protein showed 84% similarity, and the peptide sequence used to prepare the anti-human SNARK antibody also showed high similarity to KIM0537 protein. .
  • This KIM0537 cDNA clone is an unknown 74kDa
  • the present inventors prepared KIM0537 cDNA having a FLAG tag.
  • the cDNA is expressed in HepG2
  • immunoblotting using an anti-FLAG monoclonal antibody and an anti-SNARK polyclonal antibody gives a common 74 kDa panda, which allows KIM0537 cDN A to bind to the previously mentioned unknown 74 kDa protein. (Fig. 3A).
  • ARK5 PPK -Related Kinase 5: Named AMPK-related kinase 5
  • Homology search analysis of the ARK5 amino acid sequence revealed that ARK5 has 55.0% overall homology with human SNARK (FIG. 3B).
  • ARK5 showed 47%, 45.8%, and 42.4% homology with AMPK-al, AMPK- ⁇ 2, and MELK, respectively (FIG. 3B).
  • Total AMPK activity measured as GST-SAMS phosphorylation, increased slightly during lhr glucose starvation in HepG2, but increased dramatically during similar lhr glucose starvation in H / ARK cells ( Figure 6 A). Since the ARK5 expression vector is driven by the cytomegalovirus (CMV) promoter, the ARK5 mRNA level did not change during lhr glucose starvation, and the ARK5 protein did not change ( Figure 6A).
  • CMV cytomegalovirus
  • Akt protein kinase Akt is activated immediately after nutrient starvation in HepG2 cells (Izuishi et al., Cancer Res. 2000, 60, 6201- 6207). As is clear from Fig. 6B, Akt was rapidly phosphorylated (Fig. 6B). Therefore, the present inventors have determined that ARK5 is between Akt and ARK5. It was determined whether there was any interaction that resulted in activation.
  • ARK5 is Ser e by Akt. This suggests that it is activated by phosphorylation at ° C. This possibility was examined directly in vitro.
  • Ser By substituting Ser with Ala, an ARK5 Ser 6m) point mutation was constructed, and an expression vector having a FLAG tag was constructed (ARK5 / SA). Both wild type and ARK5 / SA were transfected into HepG2 cells, and ARK5 and ARK5 / SA with FLAG tag were purified by immunoprecipitation with anti-FLAG antibody-conjugated agarose.
  • Serine Z threonine protein kinase AMPK is a mammalian homologue of yeast SNF-1 (Hardie et al., Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 821-855; Mitchel Hill et al., J. Biol. Chem. 1994, 269, 2361-2364; Woods et al., J. Biol. Chem. 1994, 269, 19509-19515), enzyme activity under metabolic stress, hypoxia, heat shock, and ischemia Induced by increasing AMP: ATP ratio in cells (Carlson, Curr. Opin. Microbiol. 1999, 2, 202-207; Hardie et al., Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 821-855).
  • a MPK may be a tumor cell survival factor.
  • a novel AMPK family gene SNARK was identified from a rat cDNA library (Lefebvre et al., Biochem. J. 2001, 355, 297-305), and the present inventors identified the human homologue (Su zuki et al., in press) 0
  • ARK5 Like other AMPK family members, including AMPK ⁇ 1 and ⁇ 2 subunits, and SNARK, ARK5 showed phosphorylation activity against SAMS peptides. Furthermore, the phosphorylation activity of ARK5 is promoted in the presence of AMP, and therefore we propose that ARK5 is a new member of the AMPK family. Of the AMPK family, ARK5 showed the highest similarity to SNARK, and the putative catalytic domain of ARK5 showed 84% similarity to that of SNARK.
  • Akt and AMPK are thought to be closely involved in resistance induced by hypoxia (Hashimoto et al., Biochera. Biophys. Res. Commun. 200 2, in press; Esumi et al., J Biol. Chem., In press).
  • Akt signaling pathway Akt signaling pathway
  • AMPK signal transmission pathway AMPK signal transmission pathway
  • ARK5 The consensus sequence of the Akt phosphorylation motif observed in some species is RXRXXS / T (SEQ ID NO: 5) (Mayo and Donner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001, 98, 115 98-11603 ) Is established.
  • ARK5 contains its consensus sequence at 595-600 amino acids and was demonstrated to be directly activated by Akt by i 7 'iro phosphorylation in this example. This observation strongly indicates that ARK 5 is a novel target for Akt.
  • ARK5 slightly promoted cell death during glucose starvation. In HepG2 cells, ARK5 may be expressed at low levels, and this amount of ARK5 may have responded to dominant active Aktl. ARK5 promotes cell viability and the reversal of cell viability induced by dominant active Aktl by ARK5 mutants supports the idea that ARK5 acts as a tumor cell survival factor downstream of Akt in HepG2 ing.
  • ARK5 interacts with AMPK- "1 and ⁇ 2, but ARK5 may function as ⁇ -kinase. Based on these results, the present invention They suggest that ARK5 is a novel substrate for Akt and that ARK activated by Akt is closely associated with tumor resistance to nutrient starvation.
  • Akt is an upstream effector of ARK5 and attempted to identify a target factor for ARK5 during glucose starvation.
  • Ataxia teleangiectasia a human hereditary disease, is characterized by neurological degeneration and cancer predisposition, but ATM is a missing gene in this syndrome (Lavin, Nat. Cell Biol. 2000, 2, 215- 217; Lavin and Shi loh, Annu. Rev. Immunol.
  • ATM is a member of the phosphatidylinositol kinase family (Lavin, Nat. Cell Biol. 2000, 2, 215-217; Lavin and S hiloh, Annu. Rev. Immunol. 1997, 15, 177-202; Savitsly et al., Science 1 995, 268, 1749-1753), Gl / S check via p53 phosphorylation in response to radiation exposure Activate points (Banin et al., Science 1998, 281, 1674-1677; Canman et al., Science 1998).
  • ATM In response to DNA damage, activated ATM phosphorylates p53 directly at Ser 15 and indirectly at Ch 2 at Ser 2 °, causing cell cycle arrest or cell death ( Banin et al., Science 1998, 281, 1674-1677; Canman et al., Science 1998; Sheih et al., Cell 1997, 91, 32 5-334).
  • ATM has also been suggested to be a sensor for oxidative stress (Rotman and Shiloh, Cancer Surv. 1997, 29, 285-304; Pearce and Humphrey, Trends Cell Biol. 2001) , 11, 426-433).
  • ATM is a downstream effector of ARK5 in glucose starvation conditions. Activation of ATM by this pathway would add further pathways to the proposed post-insulin treatment scheme (Yang and Kastan, Nat Cell Biol. 2001, 2, 89 3-898; Lavin, Nat Cell Biol. 2000, 2, 215-217).
  • ARK5 as a novel member of human AMPK family.
  • ARK5 activation was regulated by Akt, and activated ARK5 then phosphorylated ATM during glucose starvation.
  • Phosphorylated ATM induces arrest in the G1 phase of the cell cycle through phosphorylation and accumulation of p53 (Banin et al., Science 1998, 281, 1674-1677; Canman et al., Science 1998; Shei h et al., Cell 1997, 91, 325-334), this finding is consistent with our previous report that the AMPK family is involved in p53 accumulation during darcos starvation (Imamura et al., Biochem. Biophys. Res. Cons.
  • Akt activation has been demonstrated in cells sensitive to insulin or insulin-like growth factor (IGF), and insulin and IGF are essential for cell proliferation (Lawlor and Alessi, J. Cell Sci. 2001, 114). , 2903-2910).
  • IGF insulin-like growth factor
  • the human knee cancer cell line shows expression of ARK5 but not human normal spleen cells (official data for KIAA0537 on the Kazusa DNA Research Institute website). Therefore, this discrepancy is thought to be due to the distribution of ARK5 cells.
  • the inventors propose that ARK5 plays a critical role in tumor resistance to nutrient starvation associated with tumor malignancy. Therefore, ARK5 can be a novel target for cancer treatment.
  • tumor migration activity is one of the essential requirements. Recently, it has been reported that tumor migration is caused as a result of Akt activity (Kim D et al., FASEB J 2001, 15, 1953-1962; Higuchi M et al., Cur Biol 2001, 11, 1958-19 62) The molecular mechanism by which Akt induces tumor migration remains unclear. Since ARK5 is a substrate for Akt during nutrient starvation, we investigated whether ARK5 induces tumor migration.
  • tumor cell metastasis detected in the P / ARK cell line is a potent and specific inhibitor of the phosphatidylinositol-3 kinase / Akt pathway LY294002 (Vlahos CJ et al., J Biol Chem 1994, 269 , 5241-5248.) was completely suppressed.
  • ARK5 is closely involved in the secretion and activation of MP.
  • MT1-masking identified as a membrane-bound matrix metabolite proteinase is involved in the activation of MMP-2 and masking-9 by proteolysis of membrane anchoring domains (Okada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 2730-273; Koshikawa et al., J. Cell Biol. 2000, 148, 615-624).
  • MT1-MMP expression was almost undetectable in the PANC-1 cell line but increased dramatically in P / ARK
  • the findings in this example are in good agreement with the above findings. Therefore, the present inventors measured the necrotic area in the tumor nest formed by the PANC-1 cell line and the P / ARK cell line. As shown in Figure 15 C, P / ARK tumors contained about 20% of the dead area, whereas PANC-1 tumors showed about 60% area of necrosis. . Tumor mortality is determined by the balance between oxygen's nutrient supply and energy demand, and the tumor's resistance to intrinsic starvation. Blood supply was assumed by tumor microvessel density. These results strongly suggest that cells expressing ARK5 at high levels retain high resistance to necrosis within the tumor nest.
  • ARK5 stimulated tumor cell metastasis in an in w'ro experiment.
  • the P / ARK cell line shows a 2-fold increase in metastatic activity compared to PANC-1 cells and is active Was dependent on Akt.
  • ARK5 also showed activation of MMP-2 and MMP-9, which are central factors of tumor metastasis.
  • MMP-2 and MMP-9 activator
  • MT1-MMP membrane type— 1 matrix metalloproteinase / reference
  • ARK5 newly induces the expression of MT1-MMP.
  • in vitro observed tumor cell metastasis occurred as follows. ARK5 induces MT1-MMP expression by stimulating Akt activity. The newly induced MT1-MMP then proteolyzes the membrane-bound domains of Hidden-2 and P-9 and secretes them into the medium. The released MP-2 and MMP-9 lyse the matrigel and P / ARK cells migrate through the pores to the bottom of the lower chamber.
  • tumor metastasis by ARK5 was demonstrated both in vitro and in vitro. Most cells in the central area of the tumor nest are necrotic due to nutrient starvation as a result of tumor overgrowth. However, some tumor cells, such as knee cancer cells, are highly resistant to nutrient starvation, which is due to the activity of Akt and AMPK.
  • Akt and AMPK a tumor cell that has been reconstituted.
  • knee cancer metastasis is the escape of tumor cells from an unfavorable microenvironment to a more favorable environment. Based on this assumption, the present inventors hypothesized that knee cancer metastasis by both the Akt and AMPK families was as follows. As a result of tumor overgrowth, tumor cells in the central region are subject to cellular stress due to reduced nutrition.
  • the present invention it is possible to provide a drug that imparts stress resistance to cells and a drug for treating or preventing tumors, neurodegenerative diseases, muscle degenerative diseases, or ataxia teleangiectasia. Further, it has become possible to provide a test method for fl serious ulcer, neurodegenerative disease, muscle degenerative disease, or ataxia teleangiectasia and a test drug that can be used in the test method.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

新規なヒトAMPKファミリーのメンバーを同定し、それをARK5（AMPK-Related Kinase 5：AMPK関連リン酸化酵素5）と名付けた。栄養飢餓中、ARK5は、Akt依存に細胞の生存を支持した。また、ヒト膵臓癌細胞系PANC-1と比較して、PANC-1に対しARK5が安定的にトランスフェクトされたPANC-1細胞系（P/ARK細胞系）は、in　vitro転移活性の2倍超の増加を示した。ヌードマウスにおいて、P/ARK細胞系は、移植から12週間後に腫瘍増殖の10倍超の増加を示し、移植された腫瘍巣内の壊死区域が、P/ARK細胞系においては親PANC-1細胞と比較して有意に減少していた。さらに、P/ARK細胞系を移植されたヌードマウスには、筋肉浸潤及び腸管膜転移が顕著に観察された。

Description

AR K 5 技術分野
本発明は、 AMPK関連リン酸化酵素 5の用途に関する。 背景技術
細胞ホメォスタシスは、 細胞増殖と細胞死と細胞生存との間に絶妙のパランス で存在し、 従って、 腫瘍形成は、 細胞ホメォスタシスのパランス崩壊の所産であ ると考えられる （Wyllie et al. , Int. Rev. Cytol. 1980, 68, 251-306) 。 fl重 瘍の細胞増殖及び細胞生存はいずれも、 基本的には、 血中から供給される栄養、 特にグルコースと、 酸素とによって維持されており、 従って、 アンパランスな栄 養供給及ぴ無秩序な腫瘍細胞增殖により、 腫瘍組織の中心では壌死性の細胞死が 誘発される (Dang and Semenza. , Trends Biochem. Sci. 1999, 24， 68 - 71 ; Helm linger et al.， Nat. Med. 1997, 3, 177 - 182； Southerland, Science 1988, 24 0, 178-184) 。 最近、 本発明者らは、 ヒト肝癌細胞系及ぴヒト正常繊維芽細胞系 を含む大部分の細胞系が、 グルコース飢餓条件下で細胞死を起こすことを証明し た （Izuishi et al. , Cancer Res. 2000， 60, 6201 - 6207； Esumi et al. , J. Bi ol. Chem. , in press； Kato et al. , Oncogene in press) 。 興味深いことに、 脖臓癌細胞系 PA C- 1のようないくつかの腫瘍細胞が、 臨床的血管造影における 低血管 （hypovascular) 所見と一致して、 グルコース飢餓に対する高い抵抗性を 示すことが証明され （Izuishi et al. , Cancer Res. 2000, 60, 6201-6207) 、 そしてその抵抗性は AMPK活性に依存していることが見出された （Hashimoto et al.， Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002， in press) 0 さらに、 抵抗性は低 酸素条件によっても開始し、 それも AMPK活性に依存している （Esumi et al. , J. Biol. Chem. , in press) 。
AMPKは、 セリン/ /トレオニンプロテインキナーゼファミリーに属する SNF- 1 、sucrose—non— fermenting protein kinase) のヒ トホモロクでめり、 代 l スト レス、 低酸素、 熱ショック、 及ぴ虚血の下にある細胞において活性ィ匕されること 力 よく証明されている （Carlson, Curr. Op in. Microbiol. 1999, 2, 202-20 7； Hardie et al.， Annu. Rev. Biochem. 1998， 67, 821-855) 。 SNF— 1/AMPKフ アミリーは、 哺乳動物を含むいくつかの種において高度に保存されており （Beck er et al. , Eur. J. Biochem. 1996， 235, 736 - 743； Gardner et al.， Genomics 2000， 63， 46-59； Heyer et al. , Mol. Reprod. Dev. 1997， 47, 148-156； Ing lis et al.， Mamm. Genome 1993, 4， 401 - 403； Ruiz et al.， Mech. Devel. 199 4, 48, 153-164； Wang et al. , FEBS Lett. 1999, 453, 135—139) 、 AMPKの en サブュニットが触媒サプュニットであることが既知である （Hardie et al. , Ann u. Rev. Biochem. 1998, 67, 821-855) 。 現在までに、 4種のタンパク質、 AMP K - a l及ぴ ct 2 (Aguan et al. , Gene 1994, 149, 345-350； Carl ing et al. , Eu r. J. Biochem. 1989, 186, 129—136； Davies et al. , Eur. J. Biochem. 1989， 186, 123-128； Stapleton et al. , J. Biol. Chem. 1996， 611-614) 、 MELK (マウスタンパク質/ Heyer et al. , Mol. Reprod. Dev. 1997, 47， 148—156) 、 及ぴ SNARK (ラットタンパク質 ZLefebvre et al. , . Biochem. J. 2001， 355， 297-305) が AMPKフアミリーの触媒サブュニットとして同定されている。 AMPK 活' I"生ィ匕は Thr172のリン酸化により,開始することが報告されているが （Hawley et al. , J. Biol. Chem. 1996， 271, 27879-27887) 、 いかにしてリン酸化が開始す るかは、 未だ不明である。
癌抑制遺伝子 ATMは、 神経学的変性及ぴ癌素因を伴うヒト遺伝性疾患、 ataxia teleangiectasia (毛細血管拡張性運動失調） の研究中に単離された （Lavin, N at. Cell Biol. 2000, 2, 215-217； Lavin and Shiloh, Annu. Rev. Immunol. 1 997， 15, 177-202； Savitsly et al.， Science 1995, 268， 1749—1753) 。 ATM は、 ホスファチジノレイノシト一ノレキナーゼファミリーに属し、 DNA二本鎖切断に 対する細胞応答中に、 その Ser15及ぴ Ser2Qにおけるリン酸化を介して癌抑制遺伝 子 p53を活性ィヒするという特徴を有する （Banin et al. , Science 1998, 281， 1 674-1677； Canman et al.， Science 1998； Sheih et al. , Cell 1997, 91, 325- 334) 。 いくつかの研究により、 DNA損傷による細胞応答に ATM/p53経路が密接 に関与していることが報告されているが、 ATM/p53経路の制御の分子的メカニズ ムは解明されていない。 例えば ATM活性ィ匕は、 遺伝学的損傷及ぴ非遺伝学的損傷 の両方による細胞応答に関与しているが、 いかなる因子が ATMリン酸化を刺激す るのかは不明である。
細胞生存も、 腫瘍細胞維持に不可欠の系の一つであり、 セリン/トレオニンプ 口ティンキナーゼ Aktが、 細胞生存因子として同定されている （Datta et al. , Genes Dev. 1999， 13, 2905-2927) 。 細胞生存シグナル伝達において、 PI - 3Kに より活性化が開始する Aktは、 Bad (Datta et al.， Cell 1997, 91， 231-241； P eso et al. , Science 1997, 278, 687—689) 、 カスパーゼ 9 (Cardone et al. , Science 1998, 282, 1318 - 1321) 、 Forkhead (Brunet et al. , Cell 1999， 96, 857-868) 、 及ぴ Mdm2 (Mayo and Dormer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001， 98， 11598-11603) をリン酸化することが知られている。 発明の開示
本発明は、 このような状況に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 AMPK ファミリーに属するタンパク質およびその機能を同定し、 該タンパク質の利用方 法を提供することにある。 より詳細には、 AMPK関連リン酸ィ匕酵素 5の用途を提 供することを目的とする。
本発明者らは、 推定分子量 74kDaの 661アミノ酸をコードする新規なヒト AMP Kファミ リーのメンパーを同定し、 それを ARK5 ( PK-Related Kinase 5： AMPK 関連リン酸化酵素 5) と名付けた。 ARK5は、 595〜600aaに推定 Aktリン酸化モ チーフを有し、 Ser6QQが活性型 Aktによりリン酸ィ匕され、 それにより共通の AMPK 基質である SAMS -ぺプチドに対するキナーゼ活性が活性化されることが見出され た。 さらに、 Aktlにより活性化された ARK5力 ATMをリン酸化することも判明 した。 また、 栄養飢餓中、 ARK5は、 Akt依存に細胞の生存を支持することが判明 した。 一方、 ヒト膝臓癌細胞系 PANC - 1と比較して、 PANC - 1に対し ARK5が安定 的にトランスフエクトされた PANC-1細胞系 （P/ARK細胞系） は、 in
Figure imgf000006_0001
活性の 2倍超の増加を示した。 また、 in w ro転移活性は、 ホスファチジル ィノシトール - 3キナーゼ /Akt経路に依存していることが見出された。 P/ARK細 胞系においては、 有意に高い栄養飢餓に対する抵抗性、 並びに活性型の匪 P-2及 び MMP- 9の培地中への分泌の増加が観察されたが、 PANC- 1細胞系においては観 察されなかった。 さらに、 P/ARK細胞系は、 MT1 - MMP の発現を示し、 それにより、 浸潤における MMPの重要な役割が示された。 ヌードマウスにおいて、 P/ARK細胞 系は、 移植から 12週間後に腫瘍増殖の 10倍超の増加を示し、 移植された腫瘍巣 内の壊死区域が、 P/ARK細胞系においては親 PANC- 1細胞と比較して有意に減少 していた。 さらに、 P/ARK細胞系を移植されたヌードマウスには、 筋肉浸潤及ぴ 腸管膜転移が顕著に観察された。
以上の結果から、 ARK5は、 栄養飢餓などの細胞死を導くストレスから細胞を 保護する薬剤として利用できることが判明した。 また、 ARK5阻害剤は、 腫瘍な どの疾患の治療や予防に使用できることが判明した。 さらに、 ARK5を指標とす ることで、 B重瘍などの疾患の検査が可能になることが判明した。
即ち、 本発明は、 ARK5の用途に関し、 以下の 〔1〕 〜 〔1 9〕 を提供するも のである。
〔1〕 以下の （a ) 〜 （c ) のいずれかを有効成分として含有する、 細胞にス トレス耐性を賦与する薬剤。
( a ) AMP K関連リン酸化酵素 5をコードする D NA
( b ) AMP K関連リン酸ィ匕酵素 5およびドミナントアクティブ型の A k tをコードする DNA
(c) (a) または （b) に記載の DNAを含むベクター
〔2〕 AMP K関連リン酸化酵素 5の発現を抑制するためのヌクレオチド、 ヌ クレオチド誘導体、 または、 それらを含むベクターを有効成分として含有 する、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia teleangie ctasiaを治療または予防するための薬剤。
〔3〕 AMPK関連リン酸化酵素 5の発現が上昇するように人為的に改変され た細胞。
〔4〕 被験試料が、 細胞にス トレス耐性を賦与するか否か、 または、 腫瘍、 神 経変' I1生疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制 するか否かを評価する方法であって、
(a) 〔3〕 に記載の細胞を提供する工程、
(b) 該細胞に被験試料を接触させる工程、
(c) 該細胞にス トレスを与え、 細胞死を誘導する工程、
(d) 細胞死が誘導された細胞数を測定する工程、
を含み、 上記細胞死が誘導された細胞数が、 被験試料を接触させないとき に比べ上昇する場合に、 被験試料が腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 または、 ataxia teleangiectasiaを抑制すると判定され、 減少する場合 に、 被験試料が細胞にス トレス耐性を賦与すると判定される方法。
〔5〕 被験試料が、 細胞にス トレス耐性を賦与するか否力 または、 腫瘍、 神 経変十生疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制 するか否かを評価する方法であって、
(a) 〔3〕 に記載の細胞を提供する工程、
(b) 該細胞に被験試料を接触させる工程、
(c) 移動した細胞数を測定する工程、
を含み、 上記移動した細胞数が、 被験試料を接触させないときに比べ上昇 する場合に、 被験試料が細胞にス トレス耐性を賦与すると判定され、 減少 する場合に、 被験試料が腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 または、 at axia teleangiectasiaを抑制すると判定される方法。 .
〔6〕 被験試料が、 細胞にストレス耐性を賦与するカゝ否か、 または、 腫瘍、 神 経変性疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制 する力否かを評価する方法であって、
( a ) AM P K関連リン酸ィ匕酵素 5に被験試料を接触させる工程、
( ) 該 AM P K関連リン酸化酵素 5の活性または活性型 AM P K関連リ ン酸化酵素 5の量を測定する工程、
を含み、 上記 AM P K関連リン酸化酵素 5の活性または活性型 AMP K関 連リン酸化酵素 5の量が、 被験試料を接触させないときに比べ上昇する場 合に、 被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、 減少する場 合に、 被験試料が腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 または、 ataxia t eleangiectasiaを抑制すると判定される方法。
〔7〕 被験試料が、 細胞にストレス耐性を賦与する力否か、 または、 腫瘍、 神 経変性疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制 するか否かを評価する方法であって、
( a ) .AMP K関連リン酸化酵素 5遺伝子のプロモーター領域の下流にレ ポーター遺伝子が機能的に結合した D N Aを有する細胞または細胞 抽出液を提供する工程、
( ) 該細胞または該細胞抽出液に被験試料を接触させる工程、
( c ) 該細胞または該細胞抽出液における該レポータ一遺伝子の発現レべ ルを測定する工程、
を含み、 上記レポーター遺伝子の発現レベルが、 被験 料を接触させない ときに比べ上昇する場合に、 被験試料が細胞にス トレス耐性を賦与すると 判定され、 減少する場合に、 被験試料が腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾 患、 または、 ataxia teleangiectasiaを抑制すると判定される方法。
〔8〕 被験試料が、 細胞にストレス耐性を賦与するか否か、 または、 腫瘍、 神 経変性疾患、 筋肉変†生疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制 するか否かを評価する方法であって、
( a ) 被験試料の存在下で、 AMP K関連リン酸化酵素 5と A k tとを接 触させる工程、
( b ) AMP K関連リン酸化酵素 5と A k tとの結合を検出する工程、 を含み、 上記結合が、 被験試料を接触させないときに比べ促進される場合 に、 被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、 抑制される場 合に、 被験試料が腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 または、 ataxia t eleangiectasiaを抑制すると判定される方法。
〔9〕 以下の （a ) および （b ) の工程を含む、 細胞にス トレス耐性を賦与す る試料、 または、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制する試料のスクリ一二ング方法。
( a ) 〔4〕 〜 〔8〕 のいずれかに記載の評価方法により、 複数の被験試 料について、 細胞にス トレス耐性を賦与するか否か、 または、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変' I1生疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasia を抑制するか否かを評価する工程
( b ) 複数の被験試料から、 細胞にス トレス耐性を賦与すると評価された 試料、 または、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ata xia teleangiectasiaを抑制すると評価された試料を選択する工程 〔1 0〕 以下の （a ) 〜 （e ) の工程を含む、 細胞にストレス耐性を賦与する 試料、 または、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制する試料のスクリーユング方法。
( a ) AM P K関連リン酸ィ匕酵素 5に複数の被験試料を接触させる工程
( b ) 該 AMP K関連リン酸化酵素 5と被験試料との結合を検出するェ (c) 該 AMPK関連リン酸化酵素 5と結合する被験試料を選択するェ 程
(d) 〔4〕 〜 〔8〕 のいずれかに記載の評価方法により、 該 AMPK 関連リン酸化酵素 5と結合する被験試料について、 細胞にストレ ス耐性を賦与するか否か、 または、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変 性疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制するか否かを 評価する工程
(e) 該 AMPK関連リン酸化酵素 5と結合する被験試料から、 細胞に ストレス耐性を賦与すると評価された試料、 または、 腫瘍、 神経 変十生疾患、 筋肉変' I1生疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを 抑制すると評価された試料を選択する工程
〔11〕 〔9〕 または 〔10〕 に記載の工程に、 さらに細胞にストレス耐性を 賦与すると評価された試料、 または、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾 患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制すると評価された試料 と医薬上許容される担体とを混合する工程を含む、 医薬組成物の製造方 法。
〔12〕 AM P K関連リン酸化酵素 5の活性または活性型 AM P K関連リン酸 化酵素 5の量を測定する工程を含む、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾 患、 または、 ataxia teleangiectasiaの検査方法。
〔13〕 以下の （a) 〜 （c) の工程を含む、 〔12〕 に記載の検查方法。
(a) 被検者からタンパク質試料を調製する工程
(b) 該タンパク質試料に含まれる AMPK関連リン酸ィ匕酵素 5の活性 または活性型 AMP K関連リン酸化酵素 5の量を測定する工程 ( c ) 測定された AMP K関連リン酸化酵素 5の活性または活性型 AM
P K関連リン酸化酵素 5の量を対照と比較する工程 〔14〕 AM PK関連リン酸ィ匕酵素 5、 または、 該 AMP Κ関連リン酸化酵素 5をコードする DNAの発現量を測定する工程を含む、 腫瘍、 神経変性 疾患、 筋肉変 'I1生疾患、 または、 ataxia teleangiectasiaの検查方法。 〔15〕 以下の （a) 〜 （c) の工程を含む、 〔14〕 に記載の検査方法。
(a) 被検者からタンパク質試料を調製する工程
(b) 該タンパク質試料に含まれる AMP K関連リン酸化酵素 5の量を 測定する工程
(c) 測定された AMPK関連リン酸化酵素 5の量を対照と比較するェ 程
〔16〕 以下の （a) 〜 （c) の工程を含む、 〔14〕 に記載の検查方法。
(a) 被検者から RNA試料を調製する工程
(b) 該 RNA試料に含まれる AMPK関連リン酸化酵素 5をコードする RNAの量を測定する工程
(c) 測定された RNAの量を対照と比較する工程
〔17〕 以下の （a) 〜 （c) の工程を含む、 〔14〕 に記載の検査方法。
(a) 被検者から cDNA試料を調製する工程
( b ) 該 cDNA試料に含まれる AM P K関連リン酸化酵素 5をコードする cDNAの量を測定する工程
(c) 測定された cDNAの量を対照と比較する工程
〔18〕 AMPK関連リン酸化酵素 5をコードする DNAにハイブリダィズし、 少なくとも 15 ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 または、 ataxia teleangiectasia の検査薬。
〔19〕 AMP K関連リン酸化酵素 5に結合する抗体を含む、 JB瘍、 神経変性 疾患、 筋肉変性疾患、 または、 ataxia teleangiectasiaの検查試薬。 本発明者らは、 AMP活性化タンパク質リン酸化酵素 （AMPK) ファミリーに属す る AMPK関連リン酸化酵素 5 (ARK5) を単離し、 該 ARK5の機能を同定した。 本発 明は、 この知見に基づくものである。
本発明は、 ARK5をコードする DNA、 ARK5およびドミナントアクティブ型の Akt をコードする DNA、 または、 それら DNAを含むベクターを有効成分として含有す る、 細胞にストレス耐性を賦与する薬剤を提供する。
上記ストレスとしては、 好ましくは、 細胞死を誘導するストレスである。 この ような細胞死を誘導するストレスとしては、 特に制限はなく、 低酸素ストレス、 低栄養ストレス、 代謝ストレス、 熱ストレス、 または、 虚血ス トレスなどが例示 できる。
本発明の細胞にストレス耐性を賦与する薬剤が適用可能な疾患としては、 例え ば低酸素ス トレス、 低栄養ストレス、 代謝ス トレス、 熱ストレス、 または、 虚血 ス トレスなどが関与している疾患が挙げられる。 より具体的には、 心筋梗塞、 脳 血栓等による虚血性脳疾患などが例示できるが、 これらに限定されるものではな い。 また、 本発明の細胞にストレス耐性を賦与する薬剤は、 移植用臓器の庇護剤 としても使用しうる。
本発明における細胞にストレス耐性を賦与する薬剤に含有される ARK5が由来 する生物種としては、 特定の生物種に限定されるものではなく、 例えば、 ヒ ト、 サノレ、 マウス、 ラット、 モルモット、 ブタ、 ゥシ、 ャギ、 ヒッジなどが挙げられ る。
ヒ ト ARK5の cDNAの塩基配列およぴ該 cDNAによりコードされるタンパク質の アミノ酸配列の一例を、 それぞれ、 配列番号： 1および配列番号： 2に示す。 本発明における ARK5をコードする DNAには、 ARK5 (例えば配列番号： 2 ) と 機能的に同等なタンパク質をコードする DNAも含まれる。 このような DNAとして は、 例えば、 ARK5の変異体、 ァレル、 バリアント、 ホモログ等をコードする DNA が挙げられる。 ここで 「機能的に同等」 とは、 対象'となる DNA力 ARK5 (例えば 配列番号： 2 ) と同等の生物学的機能や生化学的機能 （活性） を有するタンパク 質をコードする DNAであることを意味する。 例えば、 ARK5 (例えば配列番号： 2 ) と同等なス トレス耐性能ゃリン酸ィ匕活性を有するタンパク質をコードする D NAは、 本発明の ARK5をコードする DNAに含まれる。
対象となる DNAが ARK5 (例えば配列番号： 2 ) と同等なストレス耐性能を有 するか否かは、 例えば、 該 DNAが導入された細胞のグルコース飢餓への耐性度を 評価することで判定することができる。 また、 対象となる DNAが ARK5 (例えば 配列番号： 2 ) と同等なリン酸ィ匕活性を有する力否かは、 例えば、 該 DNAからコ ードされるタンパク質による ATMに対するリン酸化活性、 または、 SAMSベプチ ドに対するリン酸化活性を評価することで判定することができる。
ある DNAからコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードす る DNAを調製するための、 当業者によく知られた方法としては、 タンパク質に変 異を導入する方法が知られている。 例えば、 当業者であれば、 部位特異的変異誘 発法 （Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、 Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468—500、 Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12， 9441—9456、 Kramer W， and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、 Kunkel, TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、 Kunk el (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) などを用いて、 ARK5 (例えば配列 番号： 2 ) のアミノ酸に適宜変異を導入することにより、 該タンパク質と機能的 に同等なタンパク質をコードする DNAを調製することができる。
また、 アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。 このように、 ARK5 (例え ば配列番号： 2 ) のアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が変異し たァミノ酸配列からなり、 該タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコ一ドす る DNAもまた本発明の ARK5をコードする DNAに含まれる。
変異するアミノ酸残基においては、 アミノ酸側鎖の性質が保存されている別の アミノ酸に変異されることが望ましい。 例えばアミノ酸側鎖の性質としては、 疎 水性アミノ酸 （A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V) 、 親水性アミノ酸 （R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T) 、 脂肪族側鎖を有するアミノ酸 （G、 A、 V、 L、 I、 P) 、 水酸 基含有側鎖を有するアミノ酸 （S、 Τ、 Υ) 、 硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸
(C、 M) 、 カルボン酸及ぴアミド含有側鎖を有するアミノ酸 （D、 N、 E、 Q) 、 塩 基含有側鎖を有するアミノ離 （R、 K、 Η) 、 芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 （Η、 F、 Y、 W) を挙げることができる （括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表 す） 。
あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、 付加及び Z又 は他のアミノ酸による置換により修飾されたァミノ酸配列を有するタンパク質が その生物学的活性を維持することはすでに知られている （Mark, D. F. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81， 5662-5666、 Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10， 6487—6500、 Wang, A. et al.， Scien ce 224, 1431-1433、 Dalbadie- McFarland, G. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413) 。
ARK5のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加されたタンパク質には、 これらタンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。 融合タンパク質は、 これら タンパク質と他のぺプチドゃポリぺプチドとが融合したものである。
また、 ある DNAからコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコ 一ドする DNAを調製する当業者によく知られた他の方法としては、 ハイプリダイ ゼーシヨン技術 (Sambrook, J et al. , Molecular Cloning 2nd ed.， 9. 47-9. 58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989) を利用する方法が挙げられる。 即ち、 当業者においては、 ARK5をコードする DNA配列 （例えば配列番号： 1 ) もしく はその一部を利用して、 これと相同性の高い DNAを単離することは、 周知の技術 である。
また、 本発明における ARK5をコードする DNAには、 ARK5をコードする DNA (例えば配列番号： 1 ) とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする DNA であって、 ARK5と機能的に同等なタンパク質をコードする DNAも含まれる。 ARK5と機能的に同等なタンパク質をコードする DNAを単離するためのハイブ リダイゼーションの条件は、 当業者であれば適宜選択することができる。 ハイブ リダイゼーションの条件としては、 例えば、 低ストリンジヱントな条件が挙げら れる。 低ストリンジェントな条件とは、 ハイプリダイゼーション後の洗浄におい て、 例えば 42°C、 5 XSSC、 0. 1%SDSの条件であり、 好ましくは 50°C、 5 XSSC、 0. 1%SDS の条件である。 より好ましいハイブリダィゼーシヨンの条件としては、 高ストリンジェントな条件が挙げられる。 高ストリンジェントな条件とは、 例え ば 65°C、 0. 1 XSSC及ぴ 0. 1%SDSの条件である。 これらの条件において、 温度を 上げる程に高い相同性を有する DNAが効率的に得られることが期待できる。 但し、 ハイブリダィゼーションのストリンジエンシーに影響する要素としては温度や塩 濃度など複数の要素が考えられ、 当業者であればこれら要素を適宜選択すること で同様のストリンジエンシーを実現することが可能である。
また、 ARK5をコードする DNAの配列情報を基に合成したプライマーを用いる 遺伝子増幅法、 例えば、 ポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) 法を利用して、 AR 5と機 能的に同等なタンパク質をコードする DNAを単離することも可能である。
これらハイプリダイゼーシヨン技術や遺伝子増幅技術により単離される DNAが コードする、 ARK5と機能的に同等なタンパク質は、 通常、 ARK5とアミノ酸配列 において高い相同性を有する。 本発明の ARK5をコードする DNAには、 ARK5 (例 えば配列番号： 2 ) と機能的に同等であり、 力っ該タンパク質のアミノ酸配列と 高い相同性を有するタンパク質をコードする DNAも含まれる。 高い相同性とは、 アミノ酸レベルにおいて、 通常、 少なくとも 50%以上の同一性、 好ましくは 7 5%以上の同一性、 さらに好ましくは 85%以上の同一性、 さらに好ましくは 95% 以上の同一生を指す。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、 Karlin and Altschulによるァルゴリズ ム BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 5873 - 5877, 1993)によって決定する ことができる。 このアルゴリズムに基づいて、 BLASTNや BLASTXと呼ばれるプロ グラムが開発されている（Altschul et al. J. Mol. Biol. 215 : 403- 410， 1990)。 BLASTに基づいて BLASTNによつて塩基配列を解析する場合には、 パラメーター はたとえば score = 100、 wordlength = 12とする。 また、 BLASTに基づいて BLA STXによってァミノ酸配列を解析する場合には、 パラメータ一はたとえば score = 50、 wordlength = 3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合 には、 各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。 これらの解析方法の具 体的な手法は公知である（http：〃 ww. ncbi. nlm. nih. gov. )。
また、 本発明における Aktとは、 セリン/トレォニンプロテインキナーゼ Akt を意味する。 Aktの cDNAの塩基配列および該 cDNAによりコードされるタンパク 質のアミノ酸配列の一例を、 それぞれ、 配列番号： 3および配列番号： 4に示す。 本発明において、 ドミナントアクティブ型の Aktは、 例えば、 文献 （Cross, D. A. et al. , Nature 378： 785-789 (1995)； Kohn, A. D. et al. , J. Biol. Chem. 2 71： 31372-31378 (1996) ) 等に記載の方法に従って作製できる。 ドミナントァク ティブ型の Aktの cDNAの塩基配列およぴ該 cDNAによりコードされるタンパク質 のアミノ酸配列の一例を、 それぞれ、 配列番号： 5および配列番号： 6に示す。 本発明において、 ARK5またはドミナントアクティブ型の Aktをコードする DNA を、 生体内で該 DNAの発現を保証するベクターに組み込み、 例えば、 レトロウイ ルス法、 リボソーム法、 カチォニックリボソーム法、 アデノウイルス法などによ り生体内に導入することができる。 用いられるベクターとしては、 例えば、 アデ ノウィルスベクター （例えば pAdexlcw) やレトロウイルスベクター（例えば pZIP neo)などが挙げられるが、 これらに制限されない。 ARK5またはドミナントァク ティブ型の Aktをコードする DNAをべクターへ挿入する操作は、 常法に従って行 うことが可能である （Molecular Cloning, 5. 61-5. 63) 。 生体内への投与は、 ex 'TO法であっても、 in τ ο法であってもよい。 本発明においては、 上記の方 法により、 細胞にストレス耐性を賦与するための遺伝子治療を行うことが可能で ある。 また、 本発明は、 ARK5の発現を抑制するためのヌクレオチド、 ヌクレオチド 誘導体、 または、 それらを含むベクターを有効成分として含有する、 腫瘍、 神経 変性疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasia (毛細血管拡張性 運動失調） を治療または予防するための薬剤を提供する。 ここで、 腫瘍としては、 好ましくは転移性腫瘍が挙げられるが、 これに限定されるものではない。 腫瘍が 転移性腫瘍の場合、 上記薬剤は、 該転移性腫瘍の浸潤または転移を抑制するため に使用される。
本発明において、 ARK5の発現を抑制するためのヌクレオチドまたはヌクレオ チド誘導体としては、 特に制限はなく、 例えば、 アンチセンスオリゴヌクレオチ ドまたはその誘導体が挙げられる。
ァンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、 例えば、 ARK5をコードする DNA 配列 （例えば配列番号： 1 ) 中のいずれかの箇所にハイブリダィズするアンチセ ンスオリゴヌクレオチドが含まれる。 このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 好ましくは ARK5の DNA配列中の連続する少なくとも 15個以上のヌクレオチドに 対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。 さらに好ましくは、 連続する少 なくとも 15個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴ ヌクレオチドである。 このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの一例を、 配 列番号： 7に示すが、 これに限定されるものではない。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、 それらの誘導体や修飾体を使用す ることができる。 修飾体として、 例えばメチルホスホネート型又はェチルホスホ ネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、 ホスホロチォエート修飾体 又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、 DNA又は mRNAの所定の領域を構成する ヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相捕配列であるもののみならず、 DN Aまたは mRNAとオリゴヌクレオチドとが DNA配列に特異的にハイプリダイズで きる限り、 1 又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含ま れる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、 ARK5の産生細胞に作用 して、 該 ARK5をコードする DNA又は mRNAに結合することにより、 その転写又は 翻訳を阻害したり、 mR Aの分解を促進したりして、 ARK5の発現を抑制すること により、 結果的に ARK5の作用を抑制する効果を有する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体は、 それらに対して不 活性な適当な基剤と混和して塗布剤、 パップ剤等の外用剤とすることができる。 また、 必要に応じて、 賦形剤、 等張化剤、 溶解補助剤、 安定化剤、 防腐剤、 無 痛化剤等を加えて錠剤、 散財、 顆粒剤、 カプセル剤、 リボソームカプセル剤、 注 射剤、 液剤、 点鼻剤など、 さらに凍結乾燥剤とすることができる。 これらは常法 にしたがって調製することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体は患者の患部に直接適 用する力、 又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者 に適用する。 さらには、 持続性、 膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用い ることもできる。 例えば、 リボソーム、 ポリ- L-リジン、 リピッド、 コレステロ ール、 リポフエクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体の投与量は、 患者の状 態に応じて適宜調製し、 好ましい量を用いることができる。
本発明は、 ARK5 の発現が上昇するように人為的に改変された細胞を提供する c このような細胞としては、 実施例に記載の H/ARK5 (ARK5をコードする DNA が導 入された HepG2細胞） や P/ARK5 (ARK5をコードする DNA が導入された PANC- 1 細胞） が挙げられるが、 これらに限定されるものではない。 本発明における ARK 5の発現が上昇するように人為的に改変された細胞は、 被験試料が、 細胞にス ト レス耐性を賦与するか否か、 または、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 もし くは、 ataxia teleangiectasiaを抑制するか否かを評価する方法、 およぴ、 該 評価方法を利用したスクリ一ユング方法に使用することができる有用な細胞であ る。
本発明における ARK5の発現が上昇するように人為的に改変された細胞は、 ARK 5をコードする DNAを細胞に導入することで作製することができる。 また、 内因 性の ARK5をコードする遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することで作製 することも可能である。 細胞ゃ該細胞に導入される AR 5が由来する生物種とし ては、 特定の生物種に限定されるものではなレ、。 例えば、 ヒト、 サル、 マウス、 ラット、 モルモット、 ブタ、 ゥシ、 ヒッジ、 ャギなどが挙げられる。
ARK5をコードする DNAを細胞に導入する場合、 ARK5をコードする DNAは、 発 現ベクターに組み込むことが好ましい。 例えば、 HepG2細胞、 PANC- 1細胞、 PC - 1 0細胞、 A549細胞、 ASPC-1細胞、 HLF細胞、 HF細胞、 CH0細胞、 COS細胞、 NIH3 T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、 細胞内で発現させるため に必要なプロモーター、 例えば SV40プロモーター （Mulliganら， Nature (197 9) 277, 108) 、 MMLV-LTRプロモーター、 EFl aプロモーター （Mizushimaら， Nu oleic Acids Res. (1990) 18, 5322) 、 CMVプロモーターなどを持っていること が不可欠であり、 細胞への形質転換を選抜するための遺伝子 （例えば、 薬剤 （ネ ォマイシン、 G418など） により判別できるような薬剤耐性遺伝子） を有すれば さらに好ましい。 このような特性を有するベクターとしては、 例えば、 p匪、 pD R2、 pBK-RSV, pBK - CMV、 pOPRSV, p0P13、 pSV2neo、 pcDNA I、 pCD8などが挙げら れる。
さらに、 遺伝子を安定的に発現させ、 かつ、 細胞内での遺伝子のコピー数の增 幅を目的とする場合には、 核酸合成経路を欠損した CH0細胞にそれを相捕する D HFR遺伝子を有するベクター （例えば、 pCHOIなど） を導入し、 メトトレキセー ト （MTX) により増幅させる方法が挙げられ、 また、 遺伝子の一過性の発現を目 的とする場合には、 SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を 用いて SV40の複製起点を持つベクター （pcDなど） で形質転換する方法が挙げ られる。 複製開始点としては、 また、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 ゥ W
- 1 8 - シパピローマウィルス （BPV) 等の由来のものを用いることもできる。 さらに、 宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、 発現ベクターは選択マーカーとして、 アミノグリコシドトランスフェラーゼ （APH) 遺伝子、 チミジンキ^ "一ゼ （TK) 遺伝子、 大 B募菌キサンチングァニンホスホリボシ トランスフェラーゼ （Ecogp t) 遺伝子、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むことができる。
本発明は、 被験試料が、 細胞にス トレス耐性を賦与するか否カゝ、 または、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制する か否かを評価する方法を提供する。
本発明の評価方法の一つの態様としては、 まず、 ARK5の発現が上昇するよう に人為的に改変された細胞を提供する。 次いで、 該細胞に被験試料を接触させる。 本発明における 「被検試料」 としては、 特に制限はなく、 例えば、 天然化合物、 有機化合物、 無機化合物、 タンパク質、 ペプチド等の単一化合物、 並びに、 化合 物ライブラリー、 遺伝子ライブラリーの発現産物、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 発酵微生物産生物、 海洋生物抽出物、 植物抽出物、 原核細胞抽出物、 真核単細胞 抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。 上記被験試料は必要に 応じて適宜標識して用いることができる。 標識としては、 例えば、 放射標識、 蛍 光標識等を挙げることができる。
本発明において、 細胞と被験試料との接触は、 例えば、 細胞の培養液に被験試 料を添加することにより行うことができる。 被験試料がタンパク質の場合には、 例えば、 該タンパク質をコードする DNAを含むベクターを、 ARK5の発現が上昇 するように人為的に改変された細胞へ導入することも可能である。
本発明の評価方法の一つの態様では、 次いで、 該細胞にス トレスを与え、 細胞 死を誘導する。 このような細胞死を誘導するス トレスとしては、 特に制限はなく、 低酸素ス トレス、 低栄養ス トレス、 代謝ス トレス、 熱ストレス、 または、 虚血ス トレスなどが例示できる。
本発明の評価方法の一つの態様では、 次いで、 細胞死が誘導された細胞数を測 定する。 本発明において、 細胞死が誘導された細胞数を測定する方法としては、 当業者に周知の方法を使用することが可能である。 例えば、 実施例に記載の Hoe chst 33342/PI染色などで評価することが可能であるが、 この方法に限定される ものではない。
本発明の評価方法の一つの態様では、 上記細胞死が誘導された細胞数が、 被験 試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、 被験試料が腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 または、 ataxia teleangiectasiaを抑制すると判定され、 減少 する場合に、 被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定される。
本発明の評価方法の別の態様においては、 まず、 ARK5の発現が上昇するよう に人為的に改変された細胞を提供する。 次いで、 該細胞に被験試料を接触させる。 次いで、 移動した細胞数を測定する。 本発明において、 移動した細胞数は、 当業 者に周知の方法で測定することが可能である。 例えば、 Matrigel- Coated Invati on Chamber (Becton— Dickinson Company, Franklin Lakes, NJ) ίこお！/ヽて、 マ卜リ ゲル層を通り下方のチャンパ一の底へ移動する細胞数を、 位相差顕微鏡を用いて 計測することが可能であるが、 この方法に制限されるものではない。
本発明の評価方法の別の態様では、 上記移動した細胞数が、 被験試料を接触さ せないときに比べ上昇する場合に、 被験試料が細胞にス トレス耐性を賦与すると 判定され、 減少する場合に、 被験試料が腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 ま たは、 ataxia teleangiectasiaを抑制すると判定される。
本発明の評価方法の別の態様においては、 まず、 ARK5に被験試料を接触させ る。 用いられる ARK5の状態としては、 特に制限はなく、 例えば、 精製された状 態、 細胞内に発現した状態、 細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。 また、 本発明の評価方法に用いられる ARK5が由来する生物種としては、 特定 の生物種に限定されるものではなく、 例えば、 ヒト、 サル、 マウス、 ラット、 モ ルモッ ト、 ブタ、 ゥシ、 ヒッジ、 ャギなどが挙げられる。 ARK5が発現している 細胞としては、 内在性の ARK5を発現している細胞、 または外来性の ARK5を発現 している細胞が挙げられる。 上記内在性の ARK5を発現している細胞としては、 培養細胞などを挙げることができるが、 これに限定されるものではない。 また、 上記外来 '[·生の ARK5を発現している細胞は、 例えば、 ARK5をコードする DNAを含 むベクターを細胞に導入することで作製できる。 ベクターの細胞への導入は、 当 業者に一般的な方法によって実施することができる。 また、 上記外来性の ARK5 を有する細胞は、 例えば、 ARK5をコードする DNAを、 相同組み換えを利用した 遺伝子導入法により、 染色体へ揷入することで作製することができる。 このよう な外来性の ARK5 が導入される細胞が由来する生物種としては、 特に限定されず、 外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよ 、。 また、 ARK5が発現している細胞抽出液は、 例えば、 試験管内転写翻訳系に含 まれる細胞抽出液に、 ARK5をコードする DNAを含むベクターを添加したものを 挙げることができる。 該試験管内転写翻訳系としては、 特に制限はなく、 市販の 試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。
また、 本発明において 「接触」 は、 ARK5の状態に応じて行う。 例えば、 ARK5 が精製された状態であれば、 精製標品に被験試料を添加することにより行うこと ができる。 また、 細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であ れば、 それぞれ、 細胞の培養液または該細胞抽出液に被験試料を添加することに より行うことができる。 被験試料がタンパク質の場合には、 例えば、 該タンパク 質をコードする DNAを含むベクターを、 ARK5が発現している細胞へ導入する、 または該ベクターを ARK5が発現している細胞抽出液に添加することで行うこと も可能である。 また、 例えば、 酵母または動物細胞等を用いた 2ハイブリッド法 を利用することも可能である。
本発明の評価方法の別の態様では、 次いで、 ARK5の活性または活性型 ARK5の 量を測定する。 ARK5の活性おょぴその測定方法は、 既述している。
本発明の評価方法の別の態様では、 次いで、 上記 ARK5の活性または活性型 AR K5の量が、 被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、 被験試料が細 胞にストレス耐性を賦与すると判定され、 減少する場合に、 被験試料が腫瘍、 神 経変性疾患、 筋肉変性疾患、 または、 ataxia teleangiectasiaを抑制すると判 定される。
本発明の評価方法の別の態様においては、 まず、 ARK5遺伝子のプロモーター 領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した DNAを有する細胞または細胞 抽出液を提供する。
本発明において、 「機能的に結合した」 とは、 ARK5遺伝子のプロモーター領 域に転写因子が結合することにより、 レポーター遺伝子の発現が誘導されるよう に、 ARK5遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していること をいう。 従って、 レポータ^"遺伝子が他の遺伝子と結合しており、 他の遺伝子産 物との融合タンパク質を形成する場合であっても、 ARK5遺伝子のプロモーター 領域に転写因子が結合することによって、 該融合タンパク質の発現が誘導される ものであれば、 上記 「機能的に結合した」 の意に含まれる。
上記レポーター遺伝子としては、 その発現が検出可能なものであれば特に制限 されず、 例えば、 当業者において一般的に使用される CAT遺伝子、 lacZ遺伝子、 ルシフェラーゼ遺伝子、 J3 -ダルクロニダーゼ遺伝子 （GUS) および GFP遺伝子等 を挙げることができる。 また、 上記レポーター遺伝子には、 ARK5をコ ドする D NAもまた含まれる。
本発明の評価方法の別の態様では、 次いで、 上記細胞または上記細胞抽出液に 被験試料を接触させる。 次いで、 該細胞または該細胞抽出液における上記レポ一 タ一遺伝子の発現レベルを測定する。
レポーター遺伝午の発現レベルは、 使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、 当業者に公知の方法により測定することができる。 例えば、 レポーター遺伝子が CAT遺伝子である場合には、 該遺伝子産物によるクロラムフエニコールのァセチ ル化を検出することによって、 レポーター遺伝子の発現レベルを測定することが できる。 レポーター遺伝子が lacZ遺伝子である場合には、 該遺伝子発現産物の 触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、 また、 ルシフェラーゼ 遺伝子である場合には、 該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を 検出することにより、 また、 -グルクロニダーゼ遺伝子 （GUS) である場合には、 該遺伝子発現産物の触媒作用による Glucuron (ICN社） の発光や 5-プ口モ- 4 -ク ロロ- 3-インドリル - j3 -グルクロ-ド （X- Glue) の発色を検出することにより、 さらに、 GFP遺伝子である場合には、 GFPタンパク質による蛍光を検出すること により、 レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
また、 ARK5 遺伝子をレポーターとする場合、 該遺伝子の発現レベルの測定は、 当業者に公知の方法によって行うことができる。 例えば、 該遺伝子の mRNAを定 法に従って抽出し、 この mRNA を铸型としたノーザンハイブリダィゼーシヨン法、 または RT- PCR法を実施することによつて該遺伝子の転写レベルの測定を行うこ とができる。 さらに、 DNAアレイ技術を用いて、 該遺伝子の発現レベルを測定す ることも可能である。
また、 該遺伝子からコードされる ARK5を含む画分を定法に従って回収し、 該 ARK5の発現を SDS- PAGE等の電気泳動法で検出することにより、 遺伝子の翻訳レ ベルの測定を行うこともできる。 また、 ARK5に対する抗体を用いて、 ゥエスタ ンプロッテイング法などを実施し、 該 ARK5の発現を検出することにより、 遺伝 子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。
本宪明の評価方法の別の態様では、 上記レポーター遺伝子の発現レベルが、 被 験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、 被験試料が細胞にストレス耐 性を賦与すると判定され、 減少する場合に、 被験試料が腫瘍、 神経変性疾患、 筋 肉変性疾患、 または、 ataxia teleangiectasiaを抑制すると判定される。
本発明の評価方法の別の態様においては、 まず、 被験試料の存在下で、 ARK5 と Aktとを接触させる。 用いられる ARK5と Aktは、 精製された状態、 細胞内に 発現した状態、 細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。 Akt の精製は、 当業者に周知の方法で行うことができる。 本発明の評価方法の別の態様では、 次いで、 ARK5 と Akt との結合を検出する。 例えば、 被検試料の存在下で、 ARK5と Aktとを発現する細胞を培養し、 細胞を 回収後、 一方のタンパク質に対する抗体等で複合体を回収したのち、 他方のタン パク質を、 そのタンパク質に対する抗体等を用いて検出することにより、 両者の タンパク質の結合を評価することができる。 また、 例えば被検試料の存在下で、 ARK5 と Akt とを試験管内でインキュベートし、 一方のタ ^パク質に対する抗体、 またはこれらのタンパク質に融合させたタグに対する抗体等で複合体を回収した のち、 他方のタンパク質を、 そのタンパク質に対する抗体または該タンパク質に 付加したタグに対する抗体等を用いて検出することにより、 両者のタンパク質の 結合を評価することができる。 また、 一方のタンパク質を支持体に結合させてお き、 他方のタンパク質を結合させ、 そこに被検試料を適用する。 結合していたタ ンパク質が解離するか否かを検出することにより被検試料の効果を評価すること もできる。
本発明の評価方法の別の態様では、 上記結合が、 被験試料を接触させないとき に比べ促進される場合に、 被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、 抑制される場合に、 被験試料が腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 または、 at axia teleangiectasiaを抑制すると判定される。
さらに、 本発明は、 細胞にストレス耐性を賦与する試料、 または、 腫瘍、 神経 変性疾患、 筋肉変'!"生疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制する試料 を効率的にスクリ一ユングする方法を提供する。 本発明の細胞にストレス耐性を 賦与する試料、 または、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制する試料のスクリーユング方法の一^ 3の態様において は、 上記評価方法を利用して、 複数の被験試料について、 細胞にストレス耐性を 賦与するか否か、 または、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 atax ia teleangiectasiaを抑制するか否かを評価し、 複数の被験試料から、 細胞に ス トレス耐性を賦与すると評価された試料、 または、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉 変性疾患、 もしくは、. ataxia teleangiectasiaを抑制すると評価された試料を 選択する。
上記スクリーニング方法の他の態様においては、 まず、 ARK5に複数の被験試 料を接触させる。 次いで、 ARK5と被験試料との結合を検出する。 次いで、 ARK5 と結合する被験試料を選択する。
ARK5を用いて、 これに結合するポリペプチドをスクリーユングする方法とし ては、 当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。 このようなスクリ 一ユングは、 例えば、 免疫沈降法により行うことができる。 具体的には、 以下の ように行うことができる。 ARK5をコードする DNAを、 pMAM、 pDR2、 pBK- RSV、 B K- CMV、 pOPRSV、 p0P13、 pSV2neo、 pcDNA I、 pCD8などの外来遺伝子発現用のベ クターに揷入することで動物細胞などで該遺伝子を発現させる。 発現に用いるプ 口モーターとして 一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。 動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、 エレク トロポレーシヨン法 （Chu， G. et al. Nucl. Acid Res. 15, 1311-1326 (1987) )、 リン酸カルシウム法 (Chen, C and Okayama, H. Mol. Cell. Biol. 7, 2745-275 2 (1987) )、 DEAEデキストラン法 （Lopata, M. A. et al. Nucl. Acids Res. 12, 5707 - 5717 (1984)； Sussman, D. J. and Milman, G. Mol. Cell. Biol. , 164 2-1643 (1985) )、 リポフエクチン法 (Derijard, B. Cell 7, 1025-1037 (1994)； Lamb, B. T. et al. Nature Genetics 5， 22-30 (1993)； Rabindran, S. K. et al. Science 259, 230-234 (1993) )等の方法があるが、 いずれの方法によって もよい。
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位 （ェピトープ） を ARK5の N末または C末に導入することにより、 モノクローナル抗体の認識部位 を有する融合ポリぺプチドとして ARK5を発現させることができる。 用いるェピ トーブー抗体系としては市販されているものを利用することができる （実験医学 13, 85-90 (1995) ) 。 マルチクローニングサイトを介して、 ]3—ガラクトシダ ーゼ、 マルトース結合タンパク質、 グルタチオン S-トランスフェラーゼ、 緑色 蛍光タンパク質 （GFP) などとの融合ポリペプチドを発現することができるベタ ターが市販されている。 また、 融合ポリペプチドにすることにより ARK5の性質 をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる 小さなェピトープ部分のみを導入して、 融合ポリペプチドを調製する方法も報告 されている。 例えば、 ポリヒスチジン （His - tag) 、 インフルエンザ凝集素 HA、 ヒ ト C— myc、 FLAG、 Vesicular stomatitis ウイノレス糖タンパク質 （VSV— GP) 、 T 7 genelO タンパク質 （T7-tag) 、 ヒト単純へルぺスウィルス糖タンパク質 （HS V- tag) 、 E-tag (モノクローナルファージ上のェピトープ） などのェピトープと それを認識するモノクローナル抗体を、 ARK5に結合するポリべプチドのスクリ 一ユングのためのェピトープー抗体系として利用できる （実験医学 13, 85-90
(1995) ) 。
免疫沈降においては、 これらの抗体を、 適当な界面活性剤を利用して調製した 細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。 この免疫複合体は A RK5、 それと結合能を有するポリペプチド、 および抗体からなる。 上記ェピトー プに対する抗体を用いる以外に、 ARK5に対する抗体を利用して免疫沈降を行う ことも可能である。 ARK5に対する抗体は、 例えば、 ARK5をコードする遺伝子を 適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、 発現させたポリぺプ チドを精製し、 これをゥサギやマウス、 ラット、 ャギ、 ニヮトリなどに免疫する ことで調製することができる。 また、 合成した ARK5の部分ペプチドを上記の動 物に免疫することによって調製することもできる。
免疫複合体は、 例えば、 抗体がマウス IgG抗体であれば、 Protein A Sepharo seや Protein G Sepharoseを用いて沈降させることができる。 また、 ARK5を、 例えば、 GSTなどのェピトープとの融合ポリべプチドとして調製した場合には、 グルタチオン - Sepharose 4Bなどのこれらェピトープに特異的に結合する物質を 利用して、 ARK5の抗体を利用した場合と同様に、 免疫複合体を形成させること ができる。
免疫沈降の一般的な方法については、 例えば、 文献 （Harlow, E. and Lane, D.： Antibodies, pp. 511—552， Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988) ) 記載の方法に従って、 または準じて行えばよい。
免疫沈降されたポリぺプチドの解析には SDS- PAGEが一般的であり、 適当な濃 度のゲルを用いることでポリぺプチドの分子量により結合していたポリぺプチド を解析することができる。 また、 この際、 一般的には ARK5に結合したポリぺプ チドは、 クマシ一染色や銀染色といったポリべプチドの通常の染色法では検出す ることは困難であるので、 放射 1~生同位元素である 3 -メチォニンや3 ¾ -システィ ンを含んだ培養液で細胞を培養し、 該細胞内のポリペプチドを標識して、 これを 検出することで検出感度を向上させることができる。 ポリぺプチドの分子量が判 明すれば直接 SDS -ポリアクリルアミドゲルから目的のポリぺプチドを精製し、 その配列を決定することもできる。
また、 本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、 細胞を用いた 2-ハ ィプリッドシステムを用いて行う方法が挙げられる。
2 -ハイブリッドシステムにおいては、 ARK5またはその部分ペプチドを SRF DNA 結合領域または GAL4 DNA結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、 ARK5 と結合するポリぺプチドを発現していることが予想される細胞より、 VP16また は GAL4転写活性化領域と融合する形で発現するような cDNAライブラリ一を作製 し、 これを上記酵母細胞に導入し、 検出された陽性クローンからライブラリ一由 来 cDNAを単離する （酵母細胞内で ARK5と結合するポリペプチドが発現すると、 両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、 陽性のクローンが確認でき る） 。 単離した cDNAを大腸菌に導入して発現させることにより、 該 cDNAがコー ドするポリペプチドを得ることができる。 これにより ARK5に結合するポリぺプ チドまたはその遺伝子を調製することが可能である。
2-ハイブリツドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、 例え ば、 HIS3遺伝子の他、 Ade2遺伝子、 LacZ遺伝子、 CAT遺伝子、 ルシフェラーゼ 遺伝子、 PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor typel) 遺伝子等力 S挙げられ るが、 これらに制限されない。 2ハイブリッド法によるスクリーニングは、 酵母 の他、 哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
ARK5と結合する化合物のスクリーニングは、 ァフィ二テイク口マトグラフィ 一を用いて行うこともできる。 例えば、 ARK5をァフィ二ティーカラムの担体に 固定し、 ここに ARK5と結合するポリペプチドを発現していることが予想される 被検試料を適用する。 この場合の被検試料としては、 例えば細胞抽出物、 細胞溶 解物等が挙げられる。 被検試料を適用した後、 カラムを洗浄し、 ARK5に結合し たポリぺプチドを調製することができる。
得られたポリペプチドは、 そのアミノ酸配列を分析し、 それを基にオリゴ DNA を合成し、 該 DNAをプローブとして cDNAライブラリーをスクリーユングするこ とにより、 該ポリぺプチドをコ一ドする DNAを得ることができる。
また、 ポリペプチドに限らず、 ARK5に結合する化合物を単離する方法として は、 例えば、 固定した ARK5に、'合成化合物、 天然物パンク、 もしくはランダム ファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、 ARK5に結合する分子 をスクリーニングする方法や、 コンビナトリァルケミストリー技術によるハイス ループットを用いたスクリーユング方法 （Wrighton NC; Farrell FX; Chang R; Kashyap AK; Barbone FP ; Mulcahy LS ; Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK; Dower WJ. , Small peptides as potent mimetics of the protein hormone eryt hropoietin, Science (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 p458- 64、 Verdine G L. , The combinatorial chemistry of nature. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 pll- 13、 Hogan JC Jr. , Directed combinatorial chemistry. Nature (ENGLA D) Nov 7 1996， 384 pl7 - 9) が当業者に公知である。
本発明において、 結合した試料を検出又は測定する手段として表面プラズモン 共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。 表面プラズモン共 鳴現象を利用したバイオセンサーは、 ARK5と被験試料との間の相互作用を微量 のポリぺプチドを用いてかつ標識することなく、 表面プラズモン共鳴シグナルと してリアルタイムに観察することが可能である （例えば BIAcore、 Pharmacia 製） 。 したがって、 BIAcore等のバイオセンサーを用いることにより ARK5と被 験試料との結合を評価することが可能である。 また、 結合した試料を検出又は測 定する手段としては、 例えばタンパク質に付した標識を利用することにより行う ことができる。 標識の種類は、 例えば、 蛍光標識、 放射標識等が挙げられる。 本発明のスクリーニング方法においては、 上記方法により得られた ARK5と結 合する被験試料について、 本発明の評価方法により、 細胞にス トレス耐性を賦与 するか否か、 または、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia t eleangiectasiaを抑制するか否かを評価する。 次いで、 ARK5と結合する被験試 料から、 細胞にス トレス耐性を賦与すると評価された試料、 または、 fl重瘍、 神経 変性疾患、 筋肉変' I1生疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制すると評 価された試料を選択する。
さらに、 本発明においては、 医薬組成物の製造方法を提供する。 該製造方法に おいては、 上記スクリーニング方法によって、 細胞にストレス耐性を賦与すると 評価された試料、 または、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 atax ia teleangiectasiaを抑制すると評価された試料と医薬上許容される担体とを 混合する。 該担体としては、 例えば界面活性剤、 賦形剤、 着色料、 着香料、 保存 料、 安定剤、 緩衝剤、 懸濁剤、 等張化剤、 結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 流動性促進 剤、 矯味剤等が挙げられるが、 これらに制限されず、 その他常用の担体を適宜使 用することができる。 具体的には、 軽質無水ケィ酸、 乳糖、 結晶セルロース、 マ ンニトーノレ、 デンプン、 カノレメロースカノレシゥム、 力ノレメロースナトリウム、 ヒ ドロキシプロピルセルロース、 ヒドロキシプロピルメチルセルロース、 ポリビニ ルァセタールジェチルァミノアセテート、 ポリビュルピロリ ドン、 ゼラチン、 中 鎖脂肪酸トリダリセライド、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 60、 白糖、 カル ボキシメチルセ^^ロース、 コーンスターチ、 無機塩類等を挙げることができる。 また、 本発明は、 ARK5の活性もしくは活性型 ARK5の量、 または、 ARK5もしく は該 ARK5をコードする DNAの発現量を測定する工程を含む、 腫瘍、 神経変性疾 患、 筋肉変' I"生疾患、 または、 ataxia teleangiectasiaの検査方法を提供する。 このような検査方法によって、 腫瘍の悪性度 （例えば転移能など） の判定、 抗腫 瘍剤による化学療法や放射線治療に対しての腫瘍耐性能の判定、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 または、 ataxia teleangiectasiaの確定診断が可能になるもの と考えられる。
以下に本発明の検査方法の具体的な態様を記載するが、 本発明の検査方法は、 それらの方法に限定されるものではない。 なお、 本発明の検査において、 対照と は、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 または、 ataxia teleangiectasiaの 非罹患者を意味する。
本発明の ARK5の活性または活性型 ARK5の量を測定する工程を含む検査方法の 一つの態様としては、 まず、 被検者からタンパク質試料を調製する。 本発明にお いて、 被検者からのタンパク質試料は、 例えば、 被検者の腫瘍、 筋肉、 神経など の病変部と、 リンパ球、 白血球などの血球成分などを含む試料から、 当業者に周 知の方法で調製することができる。
本発明の方法においては、 次いで、 該タンパク質試料に含まれる ARK5の活性 または活性型 ARK5の量を測定する。 次いで、 測定された ARK5の活性または活性 型 ARK5の量を対照と比較する。
また、 本発明の ARK5または該 ARK5をコードする DNAの発現量を測定する工程 を含む検查方法の一つの態様としては、 まず被検者からタンパク質試料を調製す る。 次いで、 該タンパク質試料に含まれる ARK5の量を測定する。 次いで、 測定 された ARK5の量を対照と比較する。
このような方法としては、 当業者に周知の方法、 例えば、 酵素結合免疫測定法 (ELISA)、 二重モノクローナル抗体サンドイツチイムノアツセィ法 (米国特許第 4， 376, 110号）、 モノクローナルポリクローナル抗体サンドィツチアツセィ法 (Wide ら、 Kirkham及ぴ Hunter編集、 「ラジオィムノアツセィ法 (Radioi unoassa y) 」 Ε· and S. Livingstone, ェジンパラ、 （1970) )、 免疫蛍光法、 ゥエスタ ンブロッテイング法、 ドットブロッテイング法、 免疫沈降法、 プロテインチップ による解析法 （蛋白質核酸酵素 Vol. 47 No. 5 (2002) 、 蛋白質核酸酵素 Vol. 47 No. 8 (2002) ) 2次元電気泳動法、 SDSポリアクリルアミド電気泳動法が挙 げられるが、 上記検查方法は、 これらに限定されない。
本発明の検査方法の別の態様としては、 まず、 被検者から RNA試料を調製する。 次いで、 該 RNA試料に含まれる ARK5をコードする RNAの量を測定する。 次いで、 測定された RNAの量を対照と比較する。 その他の態様としては、 まず、 被検者か ら cDNA試料を調製する。 次いで、 該 cDNA試料に含まれる ARK5をコードする' cD NAの量を測定する。 次いで、 測定された cDNAの量を対照と比較する。 被検者か らの RNA試料や cDNA試料は、 例えば、 被検者の被検者の腫瘍、 筋肉、 神経など の病変部と、 リンパ球、 白血球などの血球成分などを含む試料から、 当業者に周 知の方法で調製することができる。
このような方法としては、 当業者に周知の方法、 例えばノーザンブロッテイン グ法、 RT-PCR法、 DNAァレイ法等を挙げることができる。
本発明はまた、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 または、 ataxia teleang i ectasiaの検査方法に使用される検査薬を提供する。 このような検査薬として は、 ARK5をコードする DNAにハイプリダイズし、 少なくとも 15ヌクレオチドの 鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む検查薬、 または、 ARK5に結合する抗体 を含む検査薬が挙げられる。 ここで、 該抗体は、 検査に用いることが可能な抗体 であれば、 特に制限はないが、 例えば本実施例において記載されている抗 SNARK 抗体が挙げられる。 抗体は必要に応じて標識される。
また、 上記ォリゴヌクレオチドは、 ARK5をコードする DNA (たとえば配列番 号： 1 ) に特異的にハイブリダィズするものである。 特異的なハイブリダィズが 可能であれば、 該オリゴヌクレオチドは、 ARK5をコードする DNAに対し、 完全 に相補的である必要はない。
上記オリゴヌクレオチドを含む検査薬としては、 上記本発明の検査方法に使用 しうるプローブ （該プローブが固定された基板の形態であってもよい） やプライ マーが挙げられる。 上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、 そ の長さは、 通常 15bp〜100bpであり、 好ましくは 17bp〜30bpである。 プライマ 一は、 本発明の DNAの少なくとも一部を增幅しうるものであれば、 特に制限され ない。
また、 上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、 該プロープは、 ARK5をコードする DNAに特異的にハイブリダィズするものであれば、 特に制限 されない。 該プローブは、 合成オリゴヌクレオチドであってもよく、 通常少なく とも 15bp以上の鎖長を有する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、 例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機によ り作製することができる。 プローブは、 制限酵素処理等によって取得される二本 鎖 DNA断片として作製することもできる。
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、 適宜標識して用 いることが好ましい。 標識する方法としては、 T4ポリヌクレオチドキナーゼを 用いて、 オリゴヌクレオチドの 5，端を 32Pでリン酸化することにより標識する方 法、 およぴクレノウ酵素等の DNAポリメラーゼを用い、 ランダムへキサマーオリ ゴヌクレオチド等をプライマーとして32 P等のアイソトープ、 蛍光色素、 または ピオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法 （ランダムプライム 法等） を例示することができる。
上記の検查薬においては、 有効成分であるオリゴヌクレオチドゃ抗体以外に、 例えば、 滅菌水、 生理食塩水、 植物油、 界面活性剤、 脂質、 溶解補助剤、 緩衝剤、 タンパク質安定剤 （BSAやゼラチンなど） 、 保存剤等が必要に応じて混合されて いてもよい。 図面の簡単な説明
図 1は、 未知タンパク質の抗 SNARK抗体との交差反応を示す写真である。 数種 類の細胞系 （肺：肺癌 PC- 10及ぴ A549、 膝臓：膝臓癌 PANC- 1及び ASPC- 1；肝 臓：肝癌 HePG2及ぴ HLE；並びに繊維芽細胞： HF) からの細胞抽出物を、 ヒ ト SN ARKに対するポリクローナル抗体によりィムノブロットした。 アステリスクは、 未知の 74kDaのタンパク質の位置を示す。
図 2は、 KIM0537 (上） 及ぴヒト SNARK (下） の推定アミノ酸配列 (それぞれ 配列番号： 2および 1 2に記載） を示す図である。 ボックス Aは推定触媒ドメィ ンの領域を、 ボックス Bはヒト SNARKに対するポリクローナル抗体の調製に使用 したアミノ酸配列を示している。
図 3は、 新規 AMPK関連プロティンキナーゼを示す写真おょぴ図である。
(A) FLAG- KIAA0537の発現ベクターでトランスフエタトされた （+) 又は トランスフエタトされていない （-） HepG2細胞からの細胞抽出物を、 抗 FLAGモ ノクローナノレ抗体又は抗 SNARKポリクローナノレ抗体によりィムノブロットした。
(B ) AMPKフアミリ一に属する分子の進化系統樹及ぴ概略モデルを示して いる。
図 4は、 ARK5の SAMSぺプチドリン酸化活性を示す写真おょぴ図である。
(A) ヒト SNARKに対するポリクローナル抗体によるィムノブロッテイング 分析を、 HepG2細胞又は H/ARK細胞に由来する細胞抽出物又は抗 FLAGモノク口 ーナル抗体による免疫沈降物に対して実施した。
(B ) 200 μ Μ ΑΜΡの存在下 （+) 又は非存在下 （-) において、 細胞抽出物 (HepG2及ぴ H/ARK) 又は組換え FLAG-ARK5 (rARK5) による SAMSリン酸化を測 定した。 酵素活性は、 3回の実験の平均として示されており、 バーは SE値を表 している。 アステリスクは、 統計学的有意性 pく 0. 01 (t検定） を示す。
図 5は、 グルコース飢餓に対する抵抗性における ARK5 の関与を示す図である c (A) グルコースを含む （+) 又は含まない （-） 培地に 24時間さらされた HepG2細胞又は H/ARK細胞において、 Hoechst33342/PI染色分析を使用して、 細 胞死誘導を測定した。 細胞死誘導比は、 3回の実験の平均として示されており、 パーは SE値を表している。 アステリスクは、 統計学的有意性 p<0. 01 (t検定） を示す。
( B ) ARK5に対するアンチセンス RNA発現ベクターでトランスフエク トさ れた （黒） 又はトランスフヱクトされていない （白） HePG2細胞を、 正常酸素
(21%) 又は低酸素 （1%) の酸素圧下で、 24時間、 グルコースを含む （+) 又 は含まない （-） 培地にさらした。 インキュベーション後、 Hoechst33342/PI染 色分析を使用して、 細胞死誘導を測定した。 細胞死誘導比は、 3回の実験の平均 として示されており、 パーは SE値を表している。 アステリスクは、 統計学的有 意性 pく 0. 01 (t検定) を示す。
図 6は、 Aktによる ARK5の活性化を示す図おょぴ写真である。
(A) グルコースを含む （+) 又は含まない （-) 培地中で 1時間培養された HepG2細胞又は H/ARK細胞に由来する細胞抽出物の SAMSリン酸化活 ^~生を測定し た。 酵素活性は、 3回の実験の平均として示されており、 パーは SE値を表して いる （上グラフ） 。 酵素活性の測定に使用された細胞抽出物における ARK5発現 も、 調査した （下パネル） 。
(B ) 写真中に示した時間、 グルコース飢餓を施された HepG2細胞又は H/A RK細胞に由来する細胞抽出物を、 Ser473においてリン酸化された Akt又は全 Akt に対するポリク口ーナル抗体によりィムノブロットした。
図 7は、 ARK5及び他の既知の Akt基質の推定 Aktリン酸化部位のァミノ酸配 列の比較を示す図である。 ARK5タンパク質の概略モデル中の斜線のボックス及 ぴ黒塗りボックスは、 それぞれ、 推定触媒ドメイン領域及び Aktリン酸化モチー フ領域である。 図中のアミノ酸配列は、 配列番号： 1 3〜2 0に記載している。 図 8は、 ARK5の Aktリン酸化部位の突然変異分析を示す図である。 ARK5及ぴ ARK5/SAを、 in ' roで活性型 Aktlの存在下 （+) 又は非存在下 （-） でインキ ュペートした。 インキュベーション後、 シンチレーシヨン計数により、 ARK5
(上） 又は SAMS (下） のリン酸化を測定した。 32P取り込みは、 3回の実験の平 均として示されており、 パーは SE値を表している。 アステリスクは、 統計学的 有意性 pく 0. 01 (t検定） を示す。
図 9は、 Aktと ARK5との相互作用を示す写真である。
(A) H/ARK細胞を、 グルコースを含む （G+) 又は含まない （G-) 培地中で 1時間培養し、 次いで抗 FLAGモノクローナル抗体 （ARK) 、 又は Ser473において リン酸化された Aktに対するポリクローナル抗体 （pAkt) による免疫蛍光実験を 実施した。
(B ) H/ARK細胞に、 0〜60分間、 グルコース飢餓又はィンスリン刺激を施 し、 全細胞抽出物又は FLAG又は Akt に対する抗体による免疫沈降物を、 全 Akt、 リン酸化された Akt、 又は FLAGに対する抗体によりプロットした。
図 1 0は、 （A) ARK5、 ドミナントアクティブ Akt、 ドミナントネガティブ Akt、 ARK5欠失変異体、 及ぴ Z又は ARK- SA変異体で一過性トランスフエタトさ れた、 又はトランスフエタトされていない HepG2細胞に、 グルコース飢餓を 24 時間施したことを示す図である。 インキュベーション後、 Hoechst33342/PI染色 分析を使用して、 細胞死誘導を測定した。 細胞死誘導比は、 3回の実験の平均と して示されており、 バーは SE値を表している。
(B ) ドミナントアクティブ Akt又はドミナントネガティブ Aktで一過性ト ランスフエクトされた、 又はされていない H/ARK細胞に、 LY294002 (20 μ Μ) の 存在下又は非存在下で、 24時間グルコース飢餓を施したことを示す図である。 ィンキュベーシヨン後、 Hoechst33342/PI染色分析を使用して、 細胞死誘導を測 定した。 細胞死誘導比は、 3回の実験の平均として示されており、 パーは SE値 を表している。
図 1 1は、 ARK5による ATMのリン酸化を示す図おょぴ写真である。 (A) 各コンセンサス配列がボックス内に示されている。 AMPK (上） 又は A kt (下） によるリン酸ィ匕部位の概略モデルが、 ATM配列上に矢印により示されて いる。 各コンセンサス配列が、 それぞれボックス内に示されている。
( B ) 5 μ Μ CdCl2の添カ卩により 16時間 ATM発現が誘導された P/ATM細胞 （Z hang et al.， 1997) に、 ARK5又は ARK5/ASを 24時間トランスフエタトした、 又 はトランスフエクトしなかった。 トランスフエクション後、 32Pの in vivoW を実施し、 細胞をグルコースを含む又は含まない培地中で 1時間ィンキュベート した。 His- ATMへの32 P取り込みを、 Ni-ァガロース収集により検出し、 5 %SDS - P AGEにより可視化した。
( C ) PDK1により活性化された Aktl (2 μ g) の存在下又は非存在下で、 Hi s- ATM (2 μ g) を Α?ίΚ5と反応させた、 又は反応させなかつた。 His-ATMへの 32P 取り込みを、 Ni-ァガロース収集により検出し、 5 %SDS- PAGE により可視化した。 図 1 2は、 マトリゲルコーティングが施された浸潤チャンパ一を使用した in iro腫瘍転移ァッセィを示す図おょぴ写真である。
(A) PANC- 1細胞系 （ARK5- ) 及ぴ P/ARK細胞系 （ARK5+) を上方チャンバ 一に播き、 20 /i M LY294002の存在下 （+) 又は非存在下 （-） で 4δ時間インキュ ペートした。 インキュベーション後、 下方チャンパ一の底へと転移した細胞を計 数した。 転移細胞の数は、 3回の実験の平均として示されており、 パーは SE値 を表している。
( B ) PANC-1細胞系及ぴ P/ARK細胞系を浸潤チヤンバーで 48時間培養し、 次いで、 48時間後、 下方チャンパ一の底へと転移した細胞を位相差顕微鏡で観 察した。
図 1 3は、 ΜΜΡの分泌及ぴ発現を示す写真である。 PANC- 1細胞系 （ARK5- ) 及 ぴ P/ARK細胞系 （ARK5+) を、 マトリゲルコーティングが施された （+) 又は施さ れていない （-） 6穴プレートにおいて、 無血清培地で 48時間培養した。 培養後、 ΜΜΡ-2及ぴ ΜΜΡ- 9の分泌の検出のため培養培地を濃縮し、 MT1- ΜΜΡ発現の調査の ため細胞抽出物を収集した。
図 1 4は、 ヌードマウスにおける PA C- 1細胞系及ぴ P/ARK細胞系の腫瘍形成 性を示す図である。 PANC-1細胞系 （白） 及ぴ P/ARK細胞系 （黒） をヌードマウ ス （各 5匹） へと移植し、 腫瘍容積を 12週間にわたり測定した。 腫瘍容積は、 5 個のデータの平均として示されており、 パーは SE値を表している。
図 1 5は、 ヌードマウスにおいて PANC- 1細胞系及び P/ARK細胞系により形成 された腫瘍の組織学的観察を示す写真および図である。 移植から 12週間後、 PAN C - 1細胞系及ぴ P/ARK細胞系により形成された小型 （A) 及ぴ大型 （B ) 腫瘍巣 を抽出し、 HE染色した。 壊死領域は 「N」 として示されている。 さらに、 各腫瘍 巣の中心領域が、 それぞれ 300倍に拡大されている。
( C) 各腫瘍巣内の壊死領域を測定し、 壊死領域の比率を 5個のデータの平 均として示した。 パーは SE値を表している。
図 1 6は、 筋肉浸潤 （A) 及び腸管膜転移 (B ) を示す写真である。 M :筋 肉； T :腫瘍； ML：筋肉層； Int. ：腸管。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により、 さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施 例に制限されるものではない。
( 1 ) FLAF-TAG ARK5の調製
FLAGタグを有する ARK5は、 LA PCR (Takara Biomedicals, Kyoto, Japan) ；上 流プライマー： 5' - MGCTTATGGATTATAAAGATGATGATGATAAAGMGGGGCCGCCGCGCCTGTGG CGGGG-3' (配列番号： 8 ) ；下流プライマー： 5' -TCTAGACTAGTTGAGCTTGCTGCAGAT CTCCAG - 3， （配列番号： 9 ) を用いて、 かずさ DNA研究所より提供された全長 KI M0537がライゲートした pBluescript II SK+ベクターより調製した。 PCR産物 をサブクローニングのため pT7 - Blue Tベクターへとライゲートさせ、 次いで Hi ndlll及ぴ Xbalにより消化された揷入 cDNAを pcDNA3. 1 (+)発現べクタ一へと再 ライゲートさせた。 アンチセンスベクターの調製のため、 pcDNA3. 1 ( -）発現べク ターへも挿入 cDNAをライゲートさせた。
( 2 ) 細胞系及ぴトランスフエクシヨン
ヒト肝癌細胞系 HepG2は、 10%ゥシ胎児血清 (FCS ： Sigma Chemical Co.， Ltd.， M0) が補足されたダルベッコ改変イーグル培地 （DMEM) において維持した。 トラ ンスフエクシヨンのため、 細胞を 2. 5 X 105ノウエルで 6穴プレートに播き、 次 いである程度修飾された TransFast Transfection Reagent (5 μ g DNA/ゥェ ル： Promega Corporation, WI) を使用してトランスフエクションを実施した。 48 時間後、 ヒド ARK5発現クローンの調製のため、 G418選択を lmg/mlで実施した。
( 3 ) 抗体及び組換えタンパク質
FLAGに対するモノクローナル抗体、 抗 FLAG結合ァガロース、 組換え活性型 Ak tl s 並びにドミナントネガティブ及ぴドミナントアクティブ Aktl発現ベクター は、 Upstate Biotechnology (NY) より購入した。
( 4 ) 細胞死誘導アツセィ
細胞死誘導は、 以前に記載されたような Hoechst 33342/PI染色法 （Hasegawa et al. , Cancer Res. 1996, 56， 1713—1718； Shimizu et al.， Oncogene 1996， 12, 2045-2050) により評価した。 Hoechst 33342及ぴ PIは、 Molecular Probes より購入した。 処理後、 細胞を収集し、 Hoechst 33342及ぴ PIで染色し、 次い で蛍光顕微鏡により観察した。 PIで染色された核を保持する細胞の、 全細胞 (約 1000個） に対する比により、 細胞誘導比を示した。
( 5 ) Aktl in vitroリン酸ィ匕ァッセィ
FLAGタグを有するタンパク質を、 抗 FLAG結合ァガロースにより細胞溶解物か ら単離し、 25mMトリス （pH7. 5) 、 2mM DTT、 10mM MgCl2を含有するキナー ゼ緩衝液に懸濁させた。 続いて、 ΙΟΟ μ Μ [ γ -32Ρ]ΑΤΡ (20 ^ Ci) 及び組換え活性 型 Aktlを、 組換えタンパク質を含有するキナーゼ緩衝液に添加し、 30°Cで 30分 間インキュベートした。 インキュベーション後、 ァガロースを 0. 1% NP- 40を含 有する PBSで 6回洗浄し、 PBSに再懸濁させ、 放射性同位体活性をシンチレーシ ヨン計数器 (Beckman Coulter, Inc. , CA) で測定した。 さらに、 測定された試料 を、 ォートラジォグラフィ一のため 7. 5% SDS-PAGE上で分離した。
( 6 ) 細胞系及び細胞培養
ヒト膝臓癌細胞系 PANC- 1に対し ARK5が安定的にトランスフエクトされた PAN C-1 細胞系 (P/ARK) を、 10%ゥシ胎児血清 (FCS： Sigma Chemical Co. , Ltd. , St. Louis, MO) が補足されたダルベッコ改変イーグル培地 （DMEM) において維持した。
( 7 ) In o腫瘍転移アツセィ
In 2' _rc>fl重瘍早移アツセィは、 Matrigel - Coated Invation Chamber (Becton- Dickinson Company, Franklin Lakes, N J) を用いて実施した。 細胞 （5 X 104個 チャンパ一） を培養培地を含む各チャンパ一に播き、 次いで内側チャンパー及ぴ 外側チャンパ一の培地を 6週間後に交換した。 48時間後、 浸潤した細胞を、 位 相差顕微鏡下で計数した。
( 8 ) 匿発現に関するウェスタンブロッテイング分析
PANC-1細胞系及ぴ P/ARK細胞系を 2. 5 X 105個/ゥエルで 6穴培養プレート上 に播いた。 24時間後、 培地を無血清 DMEMに交換し、 無血清培養を 48時間実施 した。 培養後、 培地を収集し、 centriprep (Millipore Corporation, Bedford, M A) により濃縮し、 細胞を PBS - 1% NP-40により溶解させた。 SDS-PAGEにより分 離した濃縮培地及ぴ細胞抽出物を、 半乾燥プロッティングシステムによりニトロ セルロース膜へと転写した。 膜を、 室温で 1時間、 5% (w/v)スキムミルク （Beet on- Dickinson Co. ) を含有する PBSでプロッキングし、 PBSと 0. 05%Tween20と の混合物 （Sigma, Tween-PBS) で洗浄し、 次いで MMP - 2、 MMP- 9、 又は MT1- MMP に対する抗体 （Fuji' Chemical Co.， Ltd. , Toyama, Japan) の PBS希釈物と共に室 温で一夜インキュベートした。 TVeen- PBSで洗浄した後、 膜を、 2000倍希釈の H RP結合抗マウス IgG抗体 （Santa Cruz Biotechnology, Inc.， CA) と共にィンキ トした。 膜を Tween- PBSで洗浄し、 次いで ECLシステム （Amersham Pharm acia Biotech K. K. , UK) により可視化した。
( 9 ) I w腫瘍形成性アツセィ
PANC-1細胞系及ぴ P/ARK細胞系の腫瘍形成性は、 5 X 106個の細胞を、 6週齢雄 BALBん nu/nuマウスの背部へ皮下移植することにより調査した。 12週間にわた り、 各腫瘍の長さ （L) 及び幅 （W) の直径を測定し、 腫瘍容積を次式により計算 した。 腫瘍容積= 072) ズ ^/2) 2ズ 兀 （4/3)。 移植後 12週間後に、 マウスを屠 殺し、 組織をホルムアルデヒド固定、 パラフィン包埋し、 8 μ πιの連続切片を調 製した。 切片を、 Delafieldのへマトキシリン Ζェォシンで染色した。
[実施例 1 ] ARK5の同定
本発明者らは、 ヒト精巣一本鎖 DNAから、 AMPKファミリ一遺伝子 SNARKをコ ードするヒト cDNAを単離し、 このタンパク質に対するポリクローナル抗体を調 製した。 その抗体を使用して、 いくつかのヒ ト細胞系、 肺癌 PC- 10及ぴ A549、 腌臓癌 PANC- 1及ぴ ASPC- 1、 肝癌 HePG2及ぴ HLE、 並びに繊維芽細胞 HFにおける SNARKの内因性の発現を調査した。 図 1に示されるように、 ィムノブロッテイン グにより、 試験された細胞系のうちのいくつかにおいて、 74kDaの未知の交差反 応性タンパク質の発現が明らかとなった （強： PC - 10、 PANC - 1、 ASPC-1、 及ぴ HL E；弱： A549及び HF；無： HepG2) 。
本発明者らは、 ヒト SNARKアミノ酸配列、 又は抗ヒト SNARK抗体を調製するた めに使用したペプチド配列、 及ぴ National Cancer Institute (米国） のヒトタ ンパク質データベースを使用した BLAST検索分析により、 この 74kDaの未知のタ ンパク質を同定することを試み、 KIM0537 cDNAクローン （Nagase et al. DNA Res 1998, 28, 31-39) によりコードされる推定タンパク質を見出した。 図 2に 示されるように、 SNARK及ぴ KIM0537タンパク質の推定触媒ドメインは、 84% の類似性を示し、 抗ヒト SNARK抗体の調製に使用したペプチド配列も、 KIM0537 タンパク質との高い類似性を示した。
この KIM0537 cDNAクローンが SNARK抗体により検出された未知の 74kDaタン パク質をコードしているか否かを調査するため、 本発明者らは、 FLAGタグを有 する KIM0537 cDNAを調製した。 その cDNAを HepG2において発現させると、 抗 FLAGモノクローナル抗体及ぴ抗 SNARKポリクローナル抗体を使用したィムノプ ロッテイングが、 共通の 74kDaのパンドを与え、 そのことにより、 KIM0537 cDN Aが、 前述の未知の 74kDaタンパク質をコードしていることが示唆された （図 3 A) 。
4種の因子、 AMPK- a l、 ΑΜΡΚ- α 2、 MELK、 及ぴ SNARKが AMPKファミリーの触 媒サブユニットとして同定されているため （図 3 B ) 、 本発明者らは、 KIM0537 を ARK5 (PPK-Related Kinase 5： AMPK関連リン酸化酵素 5) と名付けた。 ARK5 了ミノ酸配列 （配列番号： 2 ) の相同性検索分析により、 ARK5がヒト SNARKと 5 5. 0%の全体相同性を有することが明らかとなった （図 3 B ) 。 ARK5は、 AMPK- a l、 AMPK- α 2, MELKとも、 それぞれ 47%、 45. 8%、 42. 4%の相同性を示した (図 3 B ) 。 これらのデータは、 ARK5が AMPにより活性ィ匕されるセリン Zトレ ォニンプロテインキナーゼであることを強く示唆している。
74kDa のパンドに関する抗 SNARKとの交差反応を示さない HePG2細胞に、 ARK5 発現ベクターをトランスフエクト （H/ARK) することにより、 直接、 この可能性 を検討した （図 1及ぴ図 4 A) 。 図 4 Aに示されるように、 H/ARKは、 抗 SNARK 抗血清を使用したウェスタンプロット上に 74kDaの明瞭なパンドを示した。 これ は、 免疫沈降法によりさらに確認された。 まず、 親 HePG2細胞系及ぴ H/ARK系か らの細胞抽出物を、 抗 FLAG抗体で免疫沈降させ、 上清及ぴ免疫沈降物の両方を 抗 SNARK抗血清を使用したゥエスタンプロット分析にかけた。 H/ARK細胞由来の 免疫沈降物のみが、 強い反応性を与えた （図 4 A) 。 基質として GST- SAMSぺプ チドを使用した in vitroのキナーゼ活性は、 トランスフエクション後、 明らか な増加を示した。 その活性は、 200 /z M AMP (図 4 B ) の存在下でさらに刺激され、 従って、 ARK5がヒト AMPKファミリーの新規メンバーであることが強く示された。
[実施例 2 ] ARK5はグルコース飢餓に対する抵抗性を媒介する 本発明者らは、 栄養飢餓に対する抵抗性が腫瘍悪性度の決定因子の一つである こと (Hashimoto et a丄. , Biocnem. Biophys. Res. Commun. 2002, in press；丄 zuishi et al.， Cancer Res. 2000, 60, 6201-6207； Esumi et al.， J. Biol. C hem. , in press) 、 グルコース飢餓に対する抵抗性が AMPKの活性ィ匕 （Hashimoto et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002， in press) 又は低酸素条件 (Esumi et al. , J. Biol. Chem. , in press) により誘導されうることを提唱し た。 これに関して、 グルコース飢餓に対する抵抗性のメカニズムにおける ARK5 の関与を調査した。 ヒト肝癌細胞系 HePG2に定常状態酸素圧 （21%02) 下でダル コース飢餓を施した場合、 24時間の処理中、 細胞の 90%超が壊死性の細胞死を 起こしたが、 同様の処理中に細胞死を示した H/ARK細胞は 40%のみであった
(図 5 A) 。 1%酸素圧において細胞にグルコース飢餓を施した場合、 HepG2の 9 0%超が生存したが、 ARK5に対するアンチセンス RNA発現ベクターを HepG2細胞 にトランスフエタトした場合には約 50%の細胞が死滅した （図 5 B ) 。 これら の結果は、 ARK5が、 グルコース飢餓に対する抵抗性に関与していることを明白 に示している。
[実施例 3 ] ARK5は Aktによる Ser6fleのリン酸ィヒにより活性化される
GST-SAMSリン酸化として測定される全 AMPK活性は、 HepG2においては、 lhr のグルコース飢餓中わずかに増加したが、 H/ARK細胞においては、 同様の lhrの グルコース飢餓中、 劇的に増加した （図 6 A) 。 ARK5発現ベクターは、 サイト メガロウィルス （CMV) プロモーターにより駆動されるため、 ARK5の mRNAレべ ルは、 lhrのグルコース飢餓中、 変化せず、 ARK5タンパク質も変化を示さなかつ た （図 6 A) 。
本発明者らは、 HepG2細胞において、 もう一つのプロテインキナーゼ Aktが栄 養飢餓の直後に活性ィヒされることを以前に見出した （Izuishi et al. , Cancer R es. 2000, 60， 6201-6207) 。 図 6 Bより明らかなように、 Aktは、 迅速にリン 酸化された （図 6 B ) 。 従って、 本発明者らは、 Aktと ARK5との間に、 ARK5の 活性化をもたらす何らかの相互作用が存在するか否かを決定した。
ARK5のアミノ酸配列分析より、 図 7に示されるように、 完全に保存された推 定 Aktリン酸ィ匕部位が C末端部分に存在することが明らかとなった。 これらの観 察は、 ARK5が Aktによる Sere。°のリン酸化により活性化されることを示唆して いる。 この可能†生を in vitroで直接検討した。 Serを Alaに置換することによ り、 ARK5の Ser6m)点突然変異を構築し、 FLAGタグを有する発現ベクターを構築 した （ARK5/SA) 。 野生型及ぴ ARK5/SAの两方を HepG2細胞へとトランスフエク トし、 FLAGタグを有する ARK5及び ARK5/SAを、 抗 FLAG抗体結合ァガロースに よる免疫沈降により精製した。 GST- SAMSリン酸化活性及ぴ ARK5リン酸化の両方 を、 PDK1により活性化された Aktlの存在下又は非存在下での in vitroでのィ ンキュベーションの後、 調査した。 図 8の結果は、 ARK5のみが Aktにより活性 化され、 同時にリン酸化されることを明白に示した。
Aktによる ARK5の活十生化をさらに調査するため、 in 'TOでのこれらの成分の 生理学的相互作用を調査した。 ARK5及ぴリン酸化 Aktの細胞内局在の免疫蛍光 実験により、 これらの 2個の成分が主に細胞質に局在していることが明らかとな つた （図 9 A) 。 Aktは、 HepG2細胞において、 グルコース飢餓又はインスリン 処理のいずれかにより活性化される。 これらの条件下で、 ARK5及ぴ Aktの共免 疫沈降を調査した。 その結果、 ARK5及ぴ Aktは相互に会合しているが、 ダルコ ース飢餓又はィンスリン処理のいずれかによる Akt活性ィ匕の直後に解離すること が明白に示された （図 9 B ) 。 これらの結果より、 ARK5は細胞質において Akt と会合しているが、 Aktが何らかの刺激により活性化されると、 ARK5が SerMQに おいてリン酸ィヒされ、 酵素的活性化及ぴ Aktからの解離がもたらされることが示 された。
前述のように、 HePG2細胞における ARK5の過剰発現は、 グルコース飢餓に対 する抵抗性をもたらす。 ARK5の酵素的活性ィヒがグルコース飢餓に対する抵抗性 にとつて実際に必要であるか否かを決定するため、 グルコース飢餓中の H印 G2生 存に対する、 AR 5変異体、 並びにドミナントアクティブ型及ぴドミナントネガ ティブ型の Aktのトランスフエクシヨン、 そして Akt活性ィ匕の化学的阻害剤の効 果を、 調査した。 図 1 O Aに示されるように、 24時間のグルコース飢餓中、 Hep G2細胞の 90%超が壊死性細胞死を起こした。 野生型 ARK5をトランスフエタトす ることにより壊死性細胞死は約 40%にまで抑制されたが、 ARK5/SA又は Aktリン 酸化部位を含む C末端領域の 66ァミノ酸を欠く ARK5のトランスフエクションに よっては抑制されなかった。 ドミナントアクティブ Aktを HePG2細胞へとトラン スフェクトした場合にも、 細胞死誘導が有意に抑制されたが、 ドミナントネガテ ィプ Aktでは抑制されなかつた。 ARK5とドミナントアクティブ Aktとの組み合 わせ発現は、 さらに約 20%にまで細胞死を抑制したが、 ドミナントネガティブ A kt及び/又は ARK5変異体は、 抑制することができなかった （図 1 0 A) 。 これ らの結果は、 活性型 Aktにより活性化される ARK5 1S HepG2細胞におけるダル コース飢餓に対する抵抗性にとって不可欠であることを明白に示している。
これらの観察は、 H/ARK細胞を使用することによりさらに確認された （図 1 0 B ) 。 ドミナントアクティブ Aktを H/ARK細胞へと導入した場合、 細胞死は顕著 に抑制された。 しかしながら、 ドミナントネガティブ Aktを使用した場合には、 より大きく細胞死の誘導が起こった （図 1 0 B) 。 PI- 3Kの阻害剤、 LY294002を 含めた場合、 Aktの活性ィ匕は明白に阻害され、 同時に細胞死が増加した。 これら の結果は、 一過性トランスフエクシヨンの結果と一致している。 さらに、 ダルコ —ス飢餓による Akt活性化は、 LY294002に対する感受性を有することが既知で ある （Izuishi et al. , Cancer Res. 2000, 60， 6201-6207) 。
[実施例 4 ] ATMは ARK5標的候補である
本発明者らは、 HepG2細胞系において、 グルコース飢餓中の p53リン酸ィ匕によ り、 細胞周期の進行が、 G1期で遅れること、 及ぴ ATM遺伝子産物がこの過程に 関与していることを見出した （Kusakai et al.，発表予定） 。 細胞生存及び細胞 周期進行が、 グルコース飢餓中、 AMPKにより調節されることが見出されたため (Hashimoto et al.， Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, in press； Imamu ra et al. , Biochem. Biophys. Res. Comun. 2001， 287， 562-567) 、 本発明者 らは、 ATMが AMPKの標的であると推測した。 図 1 1 Aに示されるように、 アミ ノ酸配列分析により、 ATM力 Akt (2部位： RXRXXS/T (配列番号： 1 0 ) ； Mayo and Donner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001, 98， 11598-11603) 及び AMP K (23部位： XM/I/L/F/VXXXXS/TXXXL/M/I/F/V (配列番号： 1 1 ) ； Hardie and Carling, Eur. J. Biochem. 1997, 246, 259-273) のためのいくつかの推定リン 酸化部位を含有することが明らかとなった。
Hisタグを有する ATM (Zhang et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 8021-8026) が安定的に発現されている PANC-1細胞 （P/ATM) を使用して、 32Ρ _ζ' n 'ra標識実験を実施した。 通常の培地中で培養された P/ATM細胞において、 H is - ATMへの32 P取り込みが検出され、 P/ATM細胞にグルコース飢餓を施すと、 AT Mリン酸ィ匕の増加が検出された （図 1 1 B ) 。 興味深いことに、 ARK5に対するァ ンチセンス RNA発現ベクターの一過性発現により ATMリン酸化は完全に抑制され、 ARK5を一過性発現する細胞においては ATMのリン酸化の増加が検出された （図 1 1 B ) 。 このことは、 ARK5が、 グルコース飢餓中 ATMをリン酸化することを 示唆している。 この可能性をさらに確認するため、 ゴ2 ' roリン酸化を調査し た。 図 1 1 Cに示されるように、 ARK5、 又は PDK1により活性化された Aktlは、 単独では、 ATMをリン酸化しなかったが、 ARK5及ぴ活性型 Aktlの両方の存在下 では ATMリン酸化が検出され （図 1 1 C ) 、 従って、 ARK5が ATMをリン酸化す ることが直接示された。
セリン Zトレオニンプロテインキナーゼ AMPKは、 酵母 SNF- 1の哺乳動物ホモ 口グであり （Hardie et al. , Annu. Rev. Biochem. 1998， 67, 821—855； Mitche lhill et al. , J. Biol. Chem. 1994, 269, 2361-2364； Woods et al. , J. Biol. Chem. 1994, 269, 19509-19515) 、 酵素活性ィヒは、 代謝ストレス、 低酸素、 熱 ショック、 及び虚血の下にある細胞において AMP ： ATP比の上昇により誘発され る (Carlson, Curr. Opin. Microbiol. 1999， 2, 202-207； Hardie et al.， Ann u. Rev. Biochem. 1998, 67， 821 - 855) 。 最近、 本発明者らは、 AMPK活性化が、 栄養飢餓中の細胞死に対する腫瘍の抵抗性に関与していることを証明した （Hash imoto et al.， Biocnem. Biophys. Res. Commun. 2002, m press) 0 従って、 A MPKは、 腫瘍細胞生存因子である可能性がある。 最近、 新規 AMPKファミリー遺 伝子 SNARKがラット cDNAライブラリーより同定され （Lefebvre et al. , Bioche m. J. 2001, 355， 297-305) 、 本発明者らは、 そのヒトホモログを同定した （Su zuki et al.， in press) 0
SNARKに関する研究中、 いくつかの組織に由来する腫瘍細胞系において未知の 免疫交差反応性の 74kDaタンパク質が観察され、 本発明者らは、 それが ARK5で あることを見出した。 AMPKの α 1及ぴ α 2サブュニット、 並びに SNARKを含む他 の AMPKファミリ一のメンパーと同様に、 ARK5は、 SAMSぺプチドに対するリン酸 化活性を示した。 さらに、 ARK5のリン酸化活性は、 AMPの存在下で促進され、 従 つて、 本発明者らは、 ARK5が AMPKファミリーの新規メンバーであることを提唱 する。 AMPKファミリーの中で、 ARK5は SNARKに対して最も高い類似性を示し、 A RK5の推定触媒ドメインは、 SNARKのそれと 84%の類似性を示した。
酸素及び栄養、 特にグルコースの供給は、 腫瘍細胞の増殖及び生存にとって不 可欠であり、 これらの成分の欠乏は、 腫瘍細胞に重大な損傷を引き起こす （Dang and Seraenza, Trends Biochem. Sci. 1999， 24, 68 - 71； Helmlinger et al.， N at. Med. 1997, 3， 177 - 182； Izuishi et al.， Cancer Res. 2000, 60， 6201-62 07； Southerland, Science 1988, 240, 178-184) 。 栄養飢餓は、 腫瘍細胞の過 剰増殖により引き起こされた供給一需要パランスの崩壊により、 いくつかの腫瘍 領域において病態生理学的に引き起こされ、 そのような領域内の細胞は壊死性の 細胞死を起こす (Dang and Semenza, Trends Biochem. Sci. 1999, 24, 68-71； Helmlinger et al.， Nat. Med. 1997, 3， 177 - 182； Izuishi et al. , Cancer Re s. 2000， 60， 6201-6207； Southerland, Science 1988， 240, 178 - 184) 。 従つ て、 血液供給の増加、 即ち腫瘍血管形成は、 腫瘍の進展にとっての中枢であると 考えられており、 実際、 腫瘍悪性度は、 多くの場合に腫瘍血管形成と高度に相関 していることが見出されている (Forkman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001， 98， 398-400； Folkman, Adv. Cancer Res. 1974, 19, 331-358) 。 しかしなが ら、 本発明者らは、 最近、 栄養飢餓に対する抵抗性が様々な癌細胞系の間で大き く異なっており、 臨床的に低血管 （hypovascular) であることが既知の脖臓癌に は、 強い抵抗性が観察されることを見出した （IzuisM et al. , Cancer Res. 20 00, 60, 6201-6207) 。 これらの観察から、 本発明者らは、 栄養飢餓に対する抵 抗性が、 腫瘍進展のためのもう一^ 3の決定因子であるという仮説を立てた。 Akt 及ぴ AMPK力 抵抗性メカニズムに関与していることが見出された （Hashimoto e t al. , Biocnem. Biophys. Res. Commun. 2002, in press；丄 zuishi et al. , Ca ncer Res. 2000, 60, 6201-6207； Kato et al.， Oncogene in press) 。 さらに、 元来はグルコース飢餓に対する感受性が極めて高い正常ヒト繊維芽細胞及ぴヒト 肝癌細胞系 HepG2において、 低酸素により、 グルコース飢餓に対する抵抗性が誘 導されうる。 Akt及ぴ AMPKは、 低酸素により誘導される抵抗性に密接に関与し ていると考 られる (Hashimoto et al. , Biochera. Biophys. Res. Commun. 200 2, in press； Esumi et al. , J. Biol. Chem.， in press) 。
これらの所見を考え合わせ、 本発明者らは、 Aktシグナル伝達経路と AMPKシ グナル伝達経路、 特に ARK5との間に関連が存在すると推測した。 いくつかの種 において観察される Aktリン酸化モチーフのコンセンサス配列は、 RXRXXS/T (配 列番号： 5 ) (Mayo and Donner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001, 98， 115 98-11603) であることが確立されている。 興味深いことに、 ARK5は、 595〜600 アミノ酸にそのコンセンサス配列を含有しており、 Aktにより直接活性ィ匕される ことが本実施例における i 7 'iroリン酸化により証明された。 この観察は、 ARK 5が Aktの新規標的であることを強く示している。 本実施例において、 ドミナン トアクティブ Aktlも、 細胞をグルコース飢餓から救済したが、 ARK5発現は HepG 2細胞においてィムノブロッテイングレベルでは検出されなかった。 ARK5に対す るアンチセンス RNA発現ベクターは、 グルコース飢餓中の細胞死をわずかに促進 した。 HepG2細胞においては ARK5が低レベルに発現しているのかもしれず、 こ の量の ARK5がドミナントアクティブ Aktlに応答したのかもしれない。 ARK5に より細胞生存活性が促進され、 ドミナントアクティブ Aktlにより誘導された細 胞生存が ARK5変異体により取り消されたことは、 ARK5力 HepG2において Akt の下流の腫瘍細胞生存因子として作用するという考え方を裏付けている。 以前の 研究において、 本発明者らは、 AMPK- 及ぴ α 2サブュュットに対するアンチセ ンス RNA発現ベクターが、 HepG2細胞における低酸素により誘導されるダルコ一 ス飢餓に対する抵抗性 （Esumi et al.， J. Biol. Chem. , in press) 及ぴ PANC- 1細胞における構成性の抵抗性 (Kato et al, , Oncogene in press) を抑制する ことを見出した。 ARK5と、 AMPK- " 1及ぴ α 2とが相互作用するか否かは現在の ところ明らかでないが、 ARK5が ΑΜΡΚ-キナーゼとして機能する可能性はある。 こ れらの結果に基づき、 本発明者らは、 ARK5力 Aktの新規基質であること、 Akt により活性ィ匕された ARK5が栄養飢餓に対する腫瘍の抵抗性と密接に関与してい ることを提唱する。
最近、 本発明者らは、 AMPKファミリーが、 p53蓄積を介した細胞周期停止に関 与して ヽることを した (Imamura et al.， Biochem. Biophys. Res. Comun. 2001， 287， 562-567) 。 本実施例において、 本発明者らは、 Aktが ARK5の上流 エフェクターであることを証明し、 グルコース飢餓中の ARK5の標的因子を同定 することを試みた。 ヒト遺伝性疾患である ataxia teleangiectasiaは、 神経学 的変性及ぴ癌素因により特徴付けられるが、 ATMはこの症候群において欠損して いる遺伝子である （Lavin, Nat. Cell Biol. 2000, 2， 215-217； Lavin and Shi loh， Annu. Rev. Immunol. 1997, 15， 177 - 202； Savitsly et al. , Science 199 5, 268, 1749-1753)。 ATMは、 ホスファチジルイノシトールキナーゼファミリ 一のメンバーであり （Lavin， Nat. Cell Biol. 2000, 2， 215-217； Lavin and S hiloh, Annu. Rev. Immunol. 1997， 15, 177 - 202； Savitsly et al. , Science 1 995， 268, 1749-1753) 、 放射線曝露に応答して、 p53リン酸化を介して Gl/Sチ エックポイントを活性化する （Banin et al.， Science 1998， 281, 1674-1677 ; Canman et al.， Science 1998) 。 DNA損傷に応答して、 活性化された ATMは、 p 53を Ser15においては直接的に、 Ser2°においては Chk2により間接的にリン酸ィ匕 し、 細胞周期停止又は細胞死を引き起こす (Banin et al. , Science 1998, 281， 1674-1677； Canman et al.， Science 1998； Sheih et al.， Cell 1997, 91, 32 5-334) 。 DNA損傷のセンサーとしての機能に加え、 ATMは酸化ストレスのセンサ 一でもあることが示唆されている （Rotman and Shiloh, Cancer Surv. 1997， 29, 285-304； Pearce and Humphrey, Trends Cell Biol. 2001, 11, 426-433) 。 A- T細胞及ぴ Atm遺伝子破壊マウスにおける増加した酸ィ匕ストレスの証拠がこれを 支持している （Barlow et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999， 96, 9915- 9919； Gatei et al. , Oncogene. 2001, 20, 289-294) 。 ARK5がグルコース飢餓 に応答して vitroJkl^ in >oで ATMをリン酸化するという本発明者らの観 察は、 グルコース欠乏中の細胞生存の維持における ATM/p53経路の関与 （Kusaka i et al. , in press) と共に、 細胞内シグナル伝達における ATMのより全般的な 役割をさらに支持する。 アミノ酸配列分析より、 ATM力 AMPK (23部位） 及ぴ A kt (2部位）によるリン酸化のためのコンセンサス配列を含有していることが明ら かとなった。 Aktlにより活性化された ARK5は、 ATMをリン酸化したが、 活性型 Aktlは単独ではリン酸化しなかった。 それは、 おそらく、 コンフオメーシヨン の拘束又は ATMと複合体を形成する他のタンパク質の存在のためであろう。 非損 傷シグナル伝達において、 ATMが何らかの役割を果たしているという他の証拠と しては、 Yang and Kastan, 2001により提供された、 インスリンにより活性化さ れた ATMキナーゼが、 タンパク質合成の制御因子 4E- BPI (PHAS-1) をリン酸化 することが挙げられる。 本明細書に記載された結果は、 その報告と適合しており、 本発明者らは、 ィンスリン処理が Aktを活性化し、 次に Aktが ARK5を活性化し、 それにより、 ATMの活性ィヒがもたらされうることを証明した。 ATMがグルコース 飢餓条件における ARK5 の下流エフェクターであることも、 本発明者らは示した。 この経路による ATMの活性化は、 提唱されているインスリン処理後スキームにさ らに経路を追カ卩するであろう （Yang and Kastan, Nat Cell Biol. 2001, 2, 89 3—898； Lavin, Nat Cell Biol. 2000, 2, 215 - 217)。
本実施例において、 本発明者らは、 ヒ ト AMPKフアミリーの新規メンパーとし て ARK5を同定した。 ARK5活性化は、 Aktにより制御され、 活性化された ARK5は、 次に、 グルコース飢餓中、 ATMをリン酸化した。 リン酸化された ATMは、 p53の リン酸化及び蓄積を介して細胞周期の G1期における停止を誘導するため （Banin et al. , Science 1998, 281, 1674-1677； Canman et al.， Science 1998； Shei h et al. , Cell 1997， 91, 325-334) 、 本所見は、 AMPKファミリーがダルコ一 ス飢餓中の p53蓄積に関与しているという本発明者らの以前の報告と一致してい る (Imamura et al.， Biochem. Biophys. Res. Comun. 2001， 287, 562-567) 。 Akt活性化はィンスリン又はィンスリン様増殖因子 （IGF) に対する感受性を有 する細胞において証明されており、 インスリン及ぴ IGFは細胞増殖に不可欠であ る （Lawlor and Alessi, J. Cell Sci. 2001, 114, 2903 - 2910) 。 興味深いこと に、 ヒト膝臓癌細胞系は、 ARK5の発現を示すが、 ヒト正常脾臓細胞は示さない (かずさ DNA研究所ホームページ上の KIAA0537の公式データ） 。 従って、 この 矛盾は、 ARK5細胞の分布によると考えられる。 本実施例の結果に基づき、 本発 明者らは、 ARK5が腫瘍悪性度と関連した栄養飢餓に対する腫瘍の抵抗性におい て重大な役割を果たしていることを提唱する。 従って、 ARK5は癌治療のための 新規の標的になりうる。
[実施例 5 ] ARK5は in vitroで腫瘍転移を誘導した
腫瘍転移においては、 腫瘍移動活性が必須要件の一つであり、 最近、 腫瘍移動 が Akt活性ィ匕の結果として引き起こされることが報告されたが （Kim D et al. , FASEB J 2001， 15， 1953- 1962 ; Higuchi M et al. , Cur Biol 2001， 11， 1958—19 62) 、 Aktが腫瘍移動を誘導する分子メカニズムは未だ不明である。 ARK5は栄養 飢餓中の Aktの基質であるため、 本発明者らは、 ARK5が腫瘍移動を誘導するか 否かを調査した。
PANC-1 細胞系をマトリゲルコーティングを施された浸潤チャンパ一に播くと、 48時間で約 150個の細胞が、 マトリゲル層を通り下方チャンパ一の底へと転移 した （図 1 2 A) 。 しかしながら、 転移した細胞の大部分がチャンパ一の底に付 着することができず、 図 1 2 Bに示されるように重度の損傷を示した。 対照的に、 P/ARK細胞系は 400個超が転移を示し、 大部分がチヤンパーの底に付着し生存可 能であった （図 1 2 及ぴ ） 。 従って、 ARK5が腫瘍細胞の移動を刺激し、 転 移細胞の生存を支持することが示された。 しかしながら、 P/ARK細胞系において 検出された腫瘍細胞転移は、 ホスファチジルイノシト一ル- 3キナーゼ /Akt経路 の強力かつ特異的な阻害剤 LY294002 (Vlahos CJ et al. , J Biol Chem 1994, 2 69, 5241-5248. ) の添加により、 完全に抑制された。 これらの所見は、 ARK5カ A ktの刺激の下で腫瘍転移を誘導することを強く示唆している。
[実施例 6 ] ARK5により誘導されたマトリックスメタ口プロティナ一ゼ産生 マトリックスメタ口プロティナーゼ （MMP) は、 細胞一細胞マトリックス及ぴ 基底膜マトリックスの分解による腫瘍転移に密接に関与しているため （Liotta e t al.， Nature 1980， 284, 67 - 68) 、 本発明者らは、 2つの細胞系の MMP産生を 比較した。 RT - PCR分析により、 P/ARK細胞系においては、 匪 P-2 (ゼラチナーゼ A) 及ぴ MMP- 9 (ゼラチナーゼ B) の mRNAレベルが顕著に增加しているが、 MMP - 3 (ストロメライシン- 1) (データは示していない） は増加していないことが明ら かとなり、 ウェスタンプロッティング分析によってもこれらの酵素の明白な増加 が示された （図 1 3 ) 。 これは、 これらの酵素の不活型について特に当てはまり、 従って、 ARK5が M Pの分泌及ぴ活性化に密接に関与していることが示された。 膜結合型マトリックスメタ口プロティナーゼとして同定された MT1 -匿は、 膜固 定ドメインのタンパク質分解による MMP- 2及ぴ匿 - 9の活性化に関与している (Okada et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995， 92, 2730-273 ;Koshikawa et al. , J. Cell Biol. 2000, 148, 615-624) 。 MT1-MMP発現は PANC- 1細胞系 においてはほぼ検出不可能であつたが、 P/ARKにおいては劇的に増加していた
(図 1 3 ) 。 従って、 ARK5が MT1- MMP産生を介して MMP- 2及び MMP- 9の分泌及 ぴ活性化を誘導することが示唆された。 さらに、 これらの MMP産生は、 P/ARK細 胞をマトリゲル上で培養した場合、 より強くなつた （図 1 3 ) 。
[実施例 7 ] ARK5による腫瘍形成増加及び壊死抑制
in ' ro実験より、 ARK5が腫瘍形成、 浸潤、 及ぴ転移を刺激しうることが強 く示唆された。 そこで、 PANC-1細胞系及ぴ P/ARK細胞系をヌードマウスに移植 した。 図 1 4に示されるように、 移植から 12週間後、 P/ARK細胞系は、 PANC - 1 細胞系と比較して 10倍の腫瘍容積の増加を示した （表 1 ) 。
所見 PANC - 1 P/ARK
腫瘍消失 1/5 0/5
壊死型 中心' (5/5) なし (小型腫瘍巣: 1/5)
断片 (大型腫瘍巣: 4/5)
移植から 12週間後、 PANC- 1により形成された腫瘍巣の全てが、 中心の壊死を 示した （図 1 5 A) 。 対照的に、 P/ARK細胞系は、 小型腫瘍巣 (1/5) 及ぴ大型 腫瘍巣 (4/5) という 2つの型の腫瘍巣を形成した。 小型 P/ARK腫瘍巣において は、 壊死領域は観察されず、 中心領域の腫瘍細胞は生存していた （図 1 5 A) 。 興味深いことに、 大型 P/ARK腫瘍巣は、 断片的 （piece meal-like) 壊死を示し たが、 大規模な中心壌死は示さなかった （図 1 5 B ) 。 これらの所見より、 P/AR K により形成された腫瘍巣が壊死誘導に対して抵抗性を有することが推測された。 一方、 ARK5はグルコース飢餓により引き起こされる細胞死に対する抵抗性を示 す所見が得られている。 従って、 本実施例における所見は、 上記所見とよく一致 している。 そこで、 本発明者らは、 PANC- 1細胞系及び P/ARK細胞系により形成 された腫瘍巣内の壊死領域を測定した。 図 1 5 Cに示されるように、 P/ARK腫瘍 は、 わず力約 20%の壌死領域を含有していたが、 PANC- 1の腫瘍では約 60%の領 域が壊死を示した。 腫瘍壌死は、 酸素'栄養供給とエネルギー需要とのパランス、 及び内因的な飢餓に対する腫瘍の抵抗性により決定される。 血液供給は、 腫瘍微 小血管密度により仮定された。 これらの結果は、 ARK5を高レベルに発現してい る細胞が、 腫瘍巣内の壊死に対する高い抵抗性を保持していることを強く示唆し ている。
[実施例 8 ] ARK5により誘導された筋肉浸潤及び腸管膜転移
ARK5の ώ o効果をさらに解明するため、 病理学的観察を実施した。 図 1 6 A及ぴ表 2に示されるように、 P/ARK由来の腫瘍巣 （3/5) は筋肉層への浸潤 を示したが、 PANC - 1由来の腫瘍巣 （0/5) は示さなかった。 PANC-1細胞系 （1/ 5) 及ぴ P/ARK細胞系 （1/5) の両方が、 肝臓転移を示した （表 2 ) 。
所見 PANC - 1 P/ARK
筋肉層への浸潤 0/5 3/5
肝臓転移 1/5 1/5
腸間膜転移 0/5 1/5
しかしながら、 興味深いことに、 P/ARK細胞系 （1/5) を移植されたヌードマ ウスにおいては、 転移が観察された。 図 1 6 Bに示されるように、 転移巣が腸管 膜に観察され、 腫瘍細胞が筋肉層及び腸管上皮層へと浸潤していた。
本実施例において、 ARK5 は、 in w' ro実験において腫瘍細胞転移を刺激した。 P/ARK細胞系は、 PANC- 1細胞と比べて 2倍の転移活性の増加を示し、 そして活性 は Aktに依存していた。 さらに、 ARK5は、 腫瘍転移の中心的因子である MMP - 2 及び MMP - 9の活性化も示した。 最近、 MMP - 2及ぴ MMP- 9を分泌する因子 （活性化 因子) 力 |pjfe'され、 MT1-MMP (membrane type— 1 matrix metalloproteinase/ 照 (Okada et al. , Proc. Natl. Acad. Sci USA 1995, 92， 2730 - 2734) ) と名 付けられた。 そして、 本発明者らの結果は、 ARK5が MT1-MMPの発現を新たに誘 導することを証明した。 これらの結果に基づき、 本発明者らは、 in vitro : 察された腫瘍細胞転移が以下のようにして起こったと提唱する。 ARK5が Akt活 性ィ匕の刺激により MT1-MMP発現を誘導する。 新たに誘導された MT1 - MMPが、 続い て、 匿 - 2及ぴ丽 P- 9の膜結合ドメインをタンパク質分解し、 それらを培地中へ 分泌する。 放出された MP-2及ぴ MMP- 9がマトリゲルを溶解させ、 P/ARK細胞が 孔を通って下方チャンパ一の底へと転移する。
ARK5により誘導された腫瘍の進展及ぴ転移は、 in vivoでも証明された。 PAN C - 1細胞系及ぴ P/ARK細胞系をヌードマゥスに移植すると、 P/ARK細胞系が移植 されたマウスにおいては、 腫瘍容積の 10倍超の增加が観察された。 さらに、 P/A RK細胞系により形成された腫瘍巣においては、 進行中の壊死性細胞死が有意に 抑制されていた。 腫瘍巣内の細胞の生存及び増殖は、 栄養及び酸素により維持さ れており、 従って、 腫瘍巣の中心の細胞は、 グルコース及ぴ酸素の不足により、 壊死性細胞死を起こす （Dang et al. , Trends Biochem. Sci. 1999, 24, 68-71 ; Southerland, Science 1988, 240, 178-184;Helmlinger et al. , Nat. Med. 199 7， 3， 177-182) 。 ARK5は、 in vitroで、 栄養飢餓により誘導される細胞死に対 する抵抗性を示した。 従って、 ここでの 所見は、 in 'iro観察と相関 している。
さらに、 本実施例において、 P/ARK細胞系により形成された腫瘍巣においては、 独特の壌死パターンが観察された。 一般的には、 大部分の腫瘍巣が、 中心壌死パ ターンを示し、 本実施例において PANC-1細胞系により形成された腫瘍巣も、 そ の一般的なパターンを示した。 しかしながら、 興味深いことに、 P/ARK由来腫瘍 巣内の壊死領域は、 いくつかの部分に分離されており、 それは、 「島」 ではなく 「群島」 のようであった。 本実施例において、 本発明者らは、 それを 「虫食い状 壊死 （piece- meal like necrosis) 」 として評価した。 各断片的壊死領域は、 PA NC-1細胞系により形成された腫瘍巣内の壊死領域よりも有意に小さく、 領域を 全て合わせたとしても、 有意に小さかった。 従って、 本発明者らは、 この独特の 壊死パターンも、 ARK5により誘導された抵抗性によるものと推測する。
本実施例においては、 ARK5による腫瘍転移が、 in vitrof^ in w'raの両方 で証明された。 腫瘍巣の中心領域に存在する大部分の細胞は、 腫瘍過剰増殖の結 果としての栄養飢餓により壊死を起こしている。 しかしながら、 膝臓癌細胞のよ うないくつかの腫瘍細胞は、 栄養飢餓に対する高い抵抗性を示し、 その抵抗性は Akt及ぴ AMPKの活性による。 本発明者らは、 腫瘍転移は、 不都合な微小環境か ら、 より好都合な環境への腫瘍細胞の逃避行為であると推測している。 その推測 に基づき、 本発明者らは、 Akt及ぴ AMPKファミリーの両方による膝臓癌転移を 以下のように仮定した。 腫瘍過剰増殖の結果として、 中心領域の腫瘍細胞が栄養 減少による細胞ストレスを受ける。 この栄養飢餓がまず Akt活性化を引き起こし、 活性化された Aktが続いて ARK5をリン酸化する。 活性型 Aktの刺激により、 活 性化された ARK5が、 MT1-MMP発現を誘導し、 誘導された MT1 - MMPが、 MMP - 2及び MMP-9を活性ィ匕する。 このようにして、 ARK5を高レベルに発現している腫瘍細胞 は、 MMP - 2及ぴ MMP-9を使用して、 他の組織へと転移する。 産業上の利用の可能' [■生
本発明によって、 細胞にストレス耐性を賦与する薬剤、 および、 腫瘍、 神経変 十生疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを治療または予防 するための薬剤の提供が可能になった。 さらに、 fl重瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性 疾患、 または、 ataxia teleangiectasiaの検査方法および該検査方法に使用可 能な検査薬の提供が可能になつた。

Claims

請求の範囲
1. 以下の （a) 〜 （c) のいずれかを有効成分として含有する、 細胞にスト レス耐性を賦与する薬剤。
(a) AMPK関連リン酸ィ匕酵素 5をコードする DNA
(b) AMP K関連リン酸ィ匕酵素 5およびドミナントアクティブ型の A k t をコードする DNA
(c) (a) または （b) に記載の DNAを含むベクター
2. AMP K関連リン酸化酵素 5の発現を抑制するためのヌクレオチド、 ヌク レオチド誘導体、 または、 それらを含むベクターを有効成分として含有する、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasia を治療または予防するための薬剤。
3. AMP K関連リン酸化酵素 5の発現が上昇するように人為的に改変された 細胞。
4. 被験試料が、 細胞にス トレス耐性を賦与するか否か、 または、 腫瘍、 神経 変性疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制する か否かを評価する方法であって、
(a) 請求項 3に記載の細胞を提供する工程、
(b) 該細胞に被験試料を接触させる工程、
(c) 該細胞にストレスを与え、 細胞死を誘導する工程、
(d) 細胞死が誘導された細胞数を測定する工程、
を含み、 上記細胞死が誘導された細胞数が、 被験試料を接触させないときに 比べ上昇する場合に、 被験試料が腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 また は、 ataxia teleangiectasiaを抑制すると判定され、 減少する場合に、 被 験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定される方法。
5. 被験試料が、 細胞にス トレス耐性を賦与するか否か、 または、 腫瘍、 神経 変性疾患、 筋肉変'!1生疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制する 力否かを評価する方法であって、
( a ) 請求項 3に記載の細胞を提供する工程、
( b ) 該細胞に被験試料を接触させる工程、
( c ) 移動した細胞数を測定する工程、
を含み、 上記移動した細胞数が、 被験試料を接触させないときに比べ上昇す る場合に、 被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、 減少する 場合に、 被験試料が腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 または、 ataxia t eleangiectasiaを抑制すると判定される方法。
6 . 被験試料が、 細胞にス トレス耐性を賦与するか否か、 または、 腫瘍、 神経 変性疾患、 筋肉変'性疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制する か否かを評価する方法であって、
( a ) AM P K関連リン酸化酵素 5に被験試料を接触させる工程、
( b ) 該 AMP K関連リン酸化酵素 5の活性または活性型 AMP K関連リン 酸化酵素 5の量を測定する工程、
を含み、 上記 AM P K関連リン酸化酵素 5の活性または活性型 AM P K関連 リン酸化酵素 5の量が、 被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、 被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、 減少する場合に、 被 験試料が腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 または、 ataxia teleangiect asiaを抑制すると判定される方法。
7 . 被験試料が、 細胞にス トレス耐性を賦与する力否か、 または、 fl重瘍、 神経 変十生疾患、 筋肉変'！ "生疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制する か否かを評価する方法であって、
( a ) AM P K関連リン酸化酵素 5遺伝子のプロモーター領域の下流にレポ —ター遺伝子が機能的に結合した D NAを有する細胞または細胞抽出 液を提供する工程、 ( b ) 該細胞または該細胞抽出液に被験試料を接触させる工程、
( c ) 該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベル を測定する工程、
を含み、 上記レポーター遺伝子の発現レベルが、 被験試料を接触させないと きに比べ上昇する場合に、 被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定 され、 減少する場合に、 被験試料が腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 ま たは、 ataxia teleangiectasiaを抑制すると判定される方法。
被験試料が、 細胞にストレス耐性を賦与する力否か、 または、 fl重瘍、 神経 変性疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制する か否かを評価する方法であって、
( a ) 被験試料の存在下で、 AM P K関連リン酸化酵素 5と A k tとを接触 させる工程、
( b ) AMP K関連リン酸化酵素 5と A k t との結合を検出する工程、 を含み、 上記結合が、 被験試料を接触させないときに比べ促進される場合に、 被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、 抑制される場合に、 被験試料が腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 または、 ataxia teleangie ctasiaを抑制すると判定される方法。
以下の （a ) および （b ) の工程を含む、 細胞にストレス耐性を賦与する 試料、 または、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia tel eangiectasiaを抑制する試料のスクリ一ユング方法。
( a ) 請求項 4〜 8のいずれかに記載の評価方法により、 複数の被験試料に ついて、 細胞にストレス耐性を賦与するか否か、 または、 腫瘍、 神経 変性疾患、 筋肉変 '("生疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制 するか否かを評価する工程
( b ) 複数の被験試料から、 細胞にス トレス耐性を賦与すると評価された試 料、 または、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制すると評価された試料を選択する工程
10. 以下の （a) 〜 （e) の工程を含む、 細胞にストレス耐性を賦与する試 料、 または、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia tel eangiectasiaを抑制する試料のスクリ一ユング方法。
(a) AMPK関連リン酸化酵素 5に複数の被験試料を接触させる工程
(b) 該 AMPK関連リン酸化酵素 5と被験試料との結合を検出する工程
(c) 該 AMPK関連リン酸化酵素 5と結合する被験試料を選択する工程
(d) 請求項 4〜 8のいずれかに記載の評価方法により、 該 AMPK関連 リン酸化酵素 5と結合する被験試料について、 細胞にストレス耐性 を賦与するか否か、 または、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制するか否かを評価するェ
(e) 該 AMPK関連リン酸化酵素 5と結合する被験試料から、 細胞にス トレス耐性を賦与すると評価された試料、 または、 腫瘍、 神経変性 疾患、 筋肉変性疾患、 もしくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制す ると評価された試料を選択する工程
請求項 9または 10に記載の工程に、 さらに細胞にストレス耐性を賦与 すると評価された試料、 または、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変' ι·生疾患、 も しくは、 ataxia teleangiectasiaを抑制すると評価された試料と医薬上 許容される担体とを混合する工程を含む、 医薬組成物の製造方法。
2 AMP K関連リン酸化酵素 5の活性または活性型 AMP K関連リン酸化 酵素 5の量を測定する工程を含む、 fl重瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 まには、 ataxia teleangiectasiaの検查方法。
3 以下の （a) 〜 （c) の工程を含む、 請求項 12に記載の検査方法。
(a) 被検者からタンパク質試料を調製する工程
(b) 該タンパク質試料に含まれる AMPK関連リン酸ィヒ酵素 5の活性ま たは活性型 AMPK関連リン酸化酵素 5の量を測定する工程
(c) 測定された AMPK関連リン酸ィ匕酵素 5の活性または活性型 AMP K関連リン酸ィヒ酵素 5の量を対照と比較する工程
14. AMPK関連リン酸化酵素 5、 または、 該 AMPK関連リン酸化酵素 5 をコードする DNAの発現量を測定する工程を含む、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 または、 ataxia teleangiectasiaの検查方法。
15. 以下の （a) 〜 （c) の工程を含む、 請求項 14に記載の検査方法。
(a) 被検者からタンパク質試料を調製する工程
(b) 該タンパク質試料に含まれる AMPK関連リン酸ィ匕酵素 5の量を測 定する工程
( c ) 測定された AMP K関連リン酸化酵素 5の量を対照と比較する工程
16. 以下の （a) 〜 （c) の工程を含む、 請求項 14に記載の検査方法。
(a) 被検者から RNA試料を調製する工程
(b) 該 RNA試料に含まれる AM P K関連リン酸化酵素 5をコードする RN Aの量を測定する工程
(c) 測定された RNAの量を対照と比較する工程
17. 以下の （a) 〜 （c) の工程を含む、 請求項 14に記載の検査方法。
( a ) 被検者から cDNA試料を調製する工程
(b) 該 cDNA試料に含まれる AMPK関連リン酸化酵素 5をコードする c DNAの量を測定する工程
(c) 測定された cDNAの量を対照と比較する工程
18. AMPK関連リン酸化酵素 5をコードする DN Aにハイブリダイズし、 少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、 腫瘍、 神経変性疾患、 筋肉変性疾患、 または、 ataxia teleangiectasia の検查薬。
19. AMP K関連リン酸化酵素 5に結合する抗体を含む、 腫瘍、 神経変性疾 患、 筋肉変性疾患、 または、 ataxia teleangiectasiaの検査試薬。
PCT/JP2003/010435 2002-08-27 2003-08-19 Ａｒｋ５ WO2004019994A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2003257542A AU2003257542A1 (en) 2002-08-27 2003-08-19 Ark5

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002247761A JP4279524B2 (ja) 2002-08-27 2002-08-27 Ａｒｋ５
JP2002-247761 2002-08-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004019994A1 true WO2004019994A1 (ja) 2004-03-11

Family

ID=31972484

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/010435 WO2004019994A1 (ja) 2002-08-27 2003-08-19 Ａｒｋ５

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JP4279524B2 (ja)
AU (1) AU2003257542A1 (ja)
WO (1) WO2004019994A1 (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001059081A2 (en) * 2000-02-09 2001-08-16 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for using 20893, a human protein kinase

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001059081A2 (en) * 2000-02-09 2001-08-16 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for using 20893, a human protein kinase

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ATSUSHI SUZUKI ET AL.: "ARK5 suppresses the cell death induced by nutrient starvation and death receptors via inhibition of caspase 8 activation, but not by chemotherapeutic agents of UV irradiation", ONCOGENE, vol. 22, 2003, pages 6177 - 6182, XP002974607 *
ATSUSHI SUZUKI ET AL.: "Identification of a novel protein kinase mediatin akt survival singaling to the ATM protein", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 278, no. 1, 3 January 2003 (2003-01-03), pages 48 - 53, XP002974606 *
HIROYASU ESUMI ET AL.: "Hypoxia and nitric oxide treatment confer tolerance to glucose starvation in a 5'-AMP-activated protein kinase-dependent manner", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 277, no. 36, 2002, pages 32791 - 32798, XP002974605 *
KUNIHIKO IZUISHI ET AL.: "Remarkable tolerance of tumor cells to nutrient deprivation: possible new biochemical target for cancer therapy", CANCER RESEARCH, vol. 60, 2000, pages 6201 - 6207, XP002974604 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP4279524B2 (ja) 2009-06-17
AU2003257542A1 (en) 2004-03-19
AU2003257542A8 (en) 2004-03-19
JP2004083494A (ja) 2004-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4921522B2 (ja) 非小細胞肺癌の診断のための方法
KR100529270B1 (ko) 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제
US20050216961A1 (en) Cancer associated protein kinases and their uses
WO2004070062A2 (en) Compositions and methods for diagnosing and treating cancers
CZ65698A3 (cs) Geny kontrolující buněčný cyklus
KR100553300B1 (ko) 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제 방법
TW200922626A (en) Cancer-related genes, CDCA5, EPHA7, STK31 and WDHD1
US20040101879A1 (en) Srebp pathway modulation through targeting hisrs
JP2004524021A (ja) ＨｉｓＲＳをターゲッティングすることによるＳＲＥＢＰ経路の調節
AU2001263952B2 (en) Tumour suppressor and uses thereof
JP2010529843A (ja) バイオマーカーおよび薬物標的としての、転写因子複合体の構成要素のがん関連アイソフォーム
JP2002508961A (ja) 内皮細胞の形態および細胞骨格編成に影響を与える、ヒトリンパ節由来のｇｔｐアーゼ
JP2004514425A (ja) 癌関連プロテインキナーゼおよびその使用方法
CA2391908A1 (en) Novel polypeptides and nucleic acids encoding same
KR20040088077A (ko) 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제
EP1263939B1 (en) 18477, a human protein kinase and uses therefor
US7153664B2 (en) Signal transduction protein TAB2
WO2004019994A1 (ja) Ａｒｋ５
JP2002511735A (ja) アダプター蛋白質ｆｒｓ２および関連する物質および方法
JP2005500813A (ja) インスリン受容体シグナル伝達の調節
JP2004522413A (ja) 単離ヒトキナーゼタンパク質、ヒトキナーゼタンパク質をコード化する核酸分子及びその使用
JP2004503211A (ja) ヒトｎｉｍ１キナーゼ
AU767973B2 (en) TPL-2/COT kinase and methods of use
ES2350089T3 (es) Un miembro de la familia de las proteína quinasas humanas y usos de la misma.
WO2001000879A9 (en) Novel kinases and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase