CN1370238A - 人聚(adp－核酸)聚合酶2的物质和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新的人聚(ADP－核糖)聚合酶(hPARP2)多肽,编码该多肽的多核苷酸,包括所述多核苷酸的表达构建物,以及转化了该表达构建物的宿主细胞。本发明还提供了制备hPARP2多肽以及对hPARP2多肽具有免疫活性抗体的方法。此外,本发明还提供了鉴定hPARP2特异性结合配体的方法,以及多种鉴定可以修饰hPARP2生物活性的结合配体的具体方法。本发明还提供了体外和体内修饰hPARP2生物活性的方法。

Description

人聚(ADP-核糖)聚合酶2的物质和方法
本申请要求1999年6月16日提交的美国临时申请系列号60/139,543的权益。
本发明总体上涉及具有聚(ADP-核糖)聚合酶活性的人多肽，编码该多肽的多核苷酸，以及应用这些物质的方法。
                        发明背景
真核细胞的基因功能调控是通过多种机制发生的。这些机制包括基因转录调控、mRNA翻译调控，以及蛋白质的翻译后修饰。蛋白质的翻译后修饰包括几种方法，如共价改变蛋白质以影响其细胞、亚细胞定位，稳定性，转运，相互作用的特异性，酶活性，以及多种其他特征。
比较常见并得到广泛研究的共价修饰方法包括乙酰化、糖基化和磷酸化。了解较少的一种方法包括在靶蛋白上共价添加ADP-核糖聚合物。该聚合物被定义为“聚(ADP-核糖)”，导致此活性的酶被称为聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)，聚(ADP-核糖)合成酶(PARS)或ADP-核糖转移酶(ADPRT)[Althaus and Richter，ADP-Ribosylation ofProteins：Enzymology and Biochemical Significance，MolecularBiochemistry and Biophysics，Springer-Verlag(1987)]。一种以前鉴定的PARP基因产物(以下称为PARP1)在细胞核中高水平表达，其活化有赖于DNA损伤[Szabo and Dawson，Trends Pharmacol Sci 19(7)：287-98(1998)]。目前的模型假设，PARP1通过DNA结合功能区的氨基末端与断裂的单链或双链DNA结合。这种结合激活了催化功能区的羧基末端，并导致靶分子ADP-核糖聚合物的形成。PARP1本身由于具有位于中央部位的自动修饰功能区而称为聚ADP-核糖化的靶作用底物。PARP1的核糖化导致PARP1分子从DNA上脱离。结合、核糖化和脱离的全过程进行非常迅速。业已显示，PARP1与DNA损伤位点的短暂结合可能导致DNA修复机制的恢复，或者通过抑制重组分子过长来恢复修复机制[Satoh and Lindahl，Nature，356(6367)：356-8(1992)]。
PARP反应的ADP-核糖来源是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。细胞中NAD的合成来源于细胞ATP储备，因此PARP活性的高水平激活可以导致细胞能源储备的迅速耗竭。业已显示，诱导PARP活性可以导致细胞死亡，所述细胞死亡与细胞NAD和ATP储备的耗竭相关[Yamamoto et al.，Nature 294(5838)：284-6(1981)；Sims et al.，Biochemistry 22(22)：5188-94(1983)]。在氧化应激或炎症的多种情况下，可以诱导PARP活性。例如，在缺血组织再灌注过程中，可以产生反应性一氧化氮，而一氧化氮可以导致额外反应性氧化物的产生，所述氧化物包括过氧化氢、过氧化氮和羟基[Szabo，Eur J Pharmacol 350(1)：1-19(1998)]。这些后述氧化物可以直接损伤DNA，而所述损伤可以诱导PARP活性的激活。通常情况下，发生PARP活性的充分激活似乎可以导致细胞能源储备的耗竭，并导致细胞死亡。
相信在炎症过程中也是相似的机制发挥作用，在该过程中，内皮细胞和前炎症细胞合成一氧化氮，导致周围细胞DNA氧化损伤，然后导致PARP活性的激活[Szabo 1998，如上]。在与一过性脑缺血有关的组织损伤中，相信该机制也发挥一定作用，在这种情况下，过量NMDA受体的激活介导了DNA损伤，而DNA损伤则诱导了PARP的过量激活[Lo et al.，Stroke 29：830-6(1998)]。相信由PARP激活导致的细胞死亡是组织损伤程度的主要决定因素，所述组织损伤由缺血/再灌注损伤或炎症导致。
有两个证据提示，在这些过程中，PARP活性是关键因素。首先，业已成功应用PARP活性化学抑制剂降低缺血/再灌注或炎症动物模型的组织损伤。其次，两个PARP1等位基因失能的小鼠(敲除PARP1的小鼠)可以抵抗多种形式的缺血/再灌注损伤和炎症的有害影响。由于这些观察，有效的PARP活性小分子抑制剂作为临床备选药物，在几种适应证中具有很大的应用潜力。
从敲除PARP1小鼠获得的实验资料提示，PARP1功能抑制剂可能具有临床利益。但是，近期的一项报导显示，敲除PARP1小鼠不能避免DNA损伤诱导的PARP活性[Shieh et al.，J Biol Chem 273(46)：30069-72(1998)]。业已显示，一种近期鉴定的基因产物tankyrase，具有聚(ADP)核糖化活性[Smith et al.，Science 282(5393)：1484-7(1998)]。但是，DNA损伤似乎不能诱导tankyrase活性，因此，tankyrase活性可能并不能说明在敲除PARP1小鼠中观察到的活性。业已显示，在敲除PARP1小鼠中，残余DNA损伤诱导的PARP活性可能是由于存在第二个PARP基因的活性，所述第二个基因已在小鼠中得到鉴定，并被命名为鼠PARP2[Shieh et al.(1998)，如上]。哺乳动物中存在多种PARP基因提示，适于人类治疗应用的药物设计需要鉴定其他具有PARP活性的人类基因产物。可与鼠PARP2相比的基因还未在人类中得到鉴定。
考虑到上述事项，很明显，一些现存知识是匮乏的，包括有关细胞DNA修复的机制、由于DNA损伤诱导的细胞死亡和信号、炎症的机制和炎症介导性疾病状态的治疗。因此，本领域存在一种需求，即鉴定其他的人类PARP样分子，用于决定筛选设计用来抑制PARP功能的治疗制剂，以及作为靶底物干预治疗人类疾病。其他PARP基因产物的PARP抑制剂的特征考虑到PARP选择性药物，所述药物对特定适应证有益，可以降低不需要的副作用，或者将治疗制剂定向到所选组织。同样的，hPARP2的鉴定也考虑到hPARP2特异性治疗制剂的研发，所述治疗制剂对某些疾病适应证有益，可以降低不需要的副作用，或者将治疗制剂定向到特定组织。人类hPARP2的鉴定也考虑到药物的研发，所述药物具有抑制两种PARP活性的能力，因而具有治疗利益。本发明的其他目的和优势对本领域具有一般技术的技术人员来说是显而易见的。
                    发明简述
业已发现，这些和其它目的可以通过本发明达成，一方面，本发明是一种纯化分离的hPARP2多肽，所述多肽包括序列2定义的氨基酸序列，或其功能衍生物。本发明还包括由一种多核苷酸编码的hPARP2多肽，所述多核苷酸在严格(中度或高度)条件下可以与序列2公开的多核苷酸互补链杂交，或者该多核苷酸在严格(中度或高度)条件下可以与编码序列1公开的多肽的多核苷酸互补链杂交。
在另一个方面，本发明还进一步提供了编码序列2定义的hPARP2多肽的多核苷酸。优选地，该多核苷酸包括序列1定义的核苷酸序列。此外，编码hPARP2多肽的多核苷酸可以在中等严格的杂交条件下，与序列1多核苷酸的编码链或非编码链杂交，或者能够与编码序列2公开多肽的多核苷酸互补链杂交。在优选情形下，该多核苷酸在严格(中度或高度)的杂交条件下，能够与序列1定义的多核苷酸的互补链杂交，并编码一种具有聚(ADP)聚合酶活性或能与损伤DNA相互作用的蛋白质。本发明的多核苷酸可以是DNA分子，也可以是RNA分子，并可进一步可选地包括一种可检测的标记部分。
在另一个方面，本发明提供了包括hPARP2编码多核苷酸的表达构建物，所述多核苷酸具有序列1定义的核苷酸序列，或者能够与编码序列2公开多肽的多核苷酸互补链杂交。hPARP2编码多核苷酸可以与异源启动子操作性连接。本发明还提供了转化或转染了基于hparp2表达构建物的宿主细胞。本发明还提供了制备具有序列2定义的氨基酸序列的多肽的方法，包括以下步骤：
a)在适于多肽表达的条件下培养表达hPARP2的宿主细胞；并
b)从宿主细胞或培养宿主细胞的培养基中分离多肽。
本发明还进一步提供了可以与本文描述的hPARP2多肽发生特异性免疫反应的抗体。本文应用的“特异性免疫反应”抗体包括那些只识别本发明多肽(或下述抗体)的抗体。所述抗体可以选自单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体(scFv抗体)、嵌合抗体、多功能/多特异性抗体、人源化抗体、人类抗体、CDR-移植物抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、双抗体(diabodies)、线形抗体、单链抗体分子、以及由多个抗体片段构成的多特异性抗体。本发明还提供产生这些抗体的细胞系。与hPARP2特异性抗体发生特异性免疫反应的抗独特型抗体也在考虑之列。
在另一个方面，本发明还提供了鉴定hPARP2多肽特异性结合配体的方法，包括：
a)在一定条件下，将hPARP2多肽与待测化合物混和，所述条件
  允许待测化合物与hPARP2多肽结合；
b)检测待测化合物与hPARP2多肽的结合；并
c)鉴定待测化合物是hPARP2多肽的特异性结合配体。
特异性结合配体优选是一种能够修饰hPARP2多肽生物活性的化合物。因此，特异性结合配体可以是抑制hPARP2多肽生物活性的化合物。此外，特异性结合配体可以是增强hPARP2多肽生物活性的化合物。
在另一个方面，本发明还提供了鉴定hparp2多核苷酸特异性结合配体的方法，包括：
a)在一定条件下，将hparp2多核苷酸与待测化合物混和，所述条
  件允许待测化合物与hparp2多核苷酸结合；
b)检测待测化合物与hparp2多核苷酸的结合；并
c)鉴定待测化合物是hparp2多核苷酸的特异性结合配体。
因此，通过该方法鉴定的特异性结合配体优选是一种可以修饰hPARP2多肽表达的化合物。所述特异性结合配体可以是抑制hPARP2多肽表达的化合物，也可以是增强hPARP2多肽表达的化合物。
而且，在另一个方面，本发明还提供了一种治疗由聚(ADP-核糖)聚合酶介导的人类疾病的方法，包括给研究对象应用有效剂量的hPARP2抑制化合物，该剂量可以有效抑制研究对象的hPARP2活性。该方法进一步包括给研究对象应用有效剂量的hPARP1抑制化合物，该剂量可以有效抑制研究对象的hPARP1活性。
在另一个方面，本发明提供了一种治疗人类疾病的方法，所述疾病选自炎症性疾病、神经病变、心血管疾病和新生组织生长紊乱。疾病优选是一种炎症性疾病，或者与炎症细胞的激活有关。例如，疾病可以是以再灌注损伤为特征的疾病。以再灌注损伤为特征的示例性疾病包括缺血性脑卒中，出血性休克，心肌缺血或心肌梗塞，移植和脑血管痉挛。其他与炎症细胞激活有关并可根据本发明方法治疗的疾病包括类风湿关节炎，骨关节炎，痛风关节炎，脊柱炎；Behcet病；脓毒血症，感染性休克，内毒素性休克，革兰阴性菌脓毒血症，革兰阳性菌脓毒血症，中毒性休克综合征；继发于败血症、创伤或出血的多器官损伤综合征；过敏性结膜炎，春季结膜炎，葡萄膜炎，甲状腺相关性眼病；嗜酸性粒细胞肉芽肿；哮喘，慢性支气管炎，过敏性鼻炎，ARDS，慢性阻塞性肺病，硅肺，肺结节病，胸膜炎，齿槽炎，脉管炎，肺炎，支气管扩张，肺氧毒性；心肌、脑或四肢的再灌注损伤；囊性纤维化；瘢痕疙瘩形成，瘢痕组织形成；动脉硬化；系统性红斑狼疮，自身免疫性甲状腺炎，多发性硬化；雷诺综合征；移植物抗宿主病，同种移植物排斥反应；慢性肾小球性肾炎；炎症性肠病，局限性回肠炎，溃疡性结肠炎，坏死性小肠结肠炎；炎症性皮肤病，接触性皮炎，遗传性过敏性皮炎，银屑病，风疹，感染导致的发热和肌痛；脑膜炎，脑炎，由于轻微损伤导致的脑、脊髓损伤；Sjogren’s综合征；涉及白细胞渗出的疾病；酒精性肝炎；细菌性肺炎；抗原抗体复合物介导的疾病；低血容量性休克；I型糖尿病；急性和迟发性过敏反应；由于白细胞不调或转移导致的疾病状态；热损伤；粒细胞输注相关性综合征；以及细胞因子诱导的毒性。
在另一个方面，本发明还提供了抑制细胞中聚(ADP-核糖)聚合酶活性的方法，包括将所述细胞与有效剂量的hPARP2拮抗剂混和，所述剂量可以有效抑制hPARP2多肽的表达或活性。
本发明的这些和其他特征及优势将由下面公开的细节描述和实施例给予评价。本文提供的细节描述和实施例旨在加深对本发明的理解，而非有意限制本发明的范围。
                    优选实施例详述
通常，本发明涉及先前未知特征的核酸，该核酸编码一种新的人类蛋白，其命名为“人聚(ADP-核糖)聚合酶2”(以下简称为“hPARP2”)。本文例示的hPARP2与已知蛋白都具有聚(ADP-核糖)聚合酶活性。本发明基于以下发现，包括编码hPARP2蛋白的新基因，和核酸序列，寡核苷酸，片段，及其反义分子。
本发明提供的核苷酸序列信息，可以通过本领域熟知的技术和常用方法，使编码的hPARP2多肽大规模表达成为可能。本发明还可通过众所周知的技术，鉴定、分离编码hPARP2相关多肽的多核苷酸，所述技术包括Southern (DNA)和/或northern(mRNA)杂交，以及扩增技术，如聚合酶链反应(PCR)，连接酶链反应(LCR)等。相关多肽的示例包括人类和非人类parp2基因组序列，包括等位基因变异以及多核苷酸，所述多核苷酸编码hPARP2同源多肽，或编码与hPARP2共享一种或多种生物、免疫和/或物理特性的结构相关性多肽。
本发明包括天然和非天然hPARP2多核苷酸及其多肽产物。天然hPARP2产物包括在人类中天然存在的hPARP2种类的多核苷酸和多肽。但是，本发明还包括通过序列同源性分析定义的其他种类的人类hPARP2。本发明还进一步包括在其他种类动物细胞中表达的人类hPARP2同系化合物，优选哺乳动物同系化合物，更优选灵长类动物同系化合物。在每种hPARP2种类中，本发明还进一步提供了剪接变异体，该变异体由相同的基因组DNA编码，但由不同的mRNA转录产物得来。非天然hPARP2产物包括天然hPARP2产物的变异体，如多核苷酸类似物和多肽类似物(即，添加、取代或缺失一个或多个核苷酸)。非天然hPARP2产物还包括共价修饰的hPARP2产物，如水溶性聚合物修饰，糖基化变异体等。
hPARP2多肽和编码该多肽的核酸为正确而迅速的诊断方法提供了基础，所述诊断方法可用于探测和/或定量hPARP2表达，以及诊断与hPARP2活性过量或不足相关的疾病。而且，本文公开的核苷酸序列还可用于探测编码hPARP2的基因畸变，如突变和缺失。例如，本文公开的核苷酸序列可用来鉴定、分离hparp2的基因组序列。PCR引物可以根据基因组hparp2核酸序列的内含子和外显子的多个部分进行设计，这样，可以检测基因组序列的畸变。
本发明进一步提供了应用hPARP2和经基因工程学修饰的表达重组hPARP2的宿主细胞来评价、筛查聚(ADP-核糖)聚合酶活性调节子的方法。这些筛查方法可用来鉴定hPARP2活性的变构类似物和拮抗剂，以及鉴定这种活性的直接作用物(如竞争性抑制剂)。hPARP2蛋白的拮抗剂和抑制剂，如抗hPARP2抗体和hparp2反义分子，为治疗和改善与聚(ADP-核糖)聚合酶活性过强有关的症状提供了药物组合物的基础。而hPARP2的类似物则为治疗和改善与聚(ADP-核糖)聚合酶活性不足有关的症状提供了药物组合物的基础。hparp2多核苷酸
本发明提供了编码人类hPARP2多肽的新的纯化、分离多核苷酸。本发明的多核苷酸包括DNA序列和RNA转录产物，正义链和互补反义链，及其剪接变异体。本发明的DNA序列包括但不限于cDNA和基因组序列。本文应用的小写“hparp2”指核酸序列，而大写“hPARP2”指氨基酸序列。
本文应用的“核酸”是指寡核苷酸或多核苷酸序列，及其片段或部分，以及源于基因组或合成的DNA或RNA，可以是双链，也可以是单链，可以代表正义链，也可以代表反义链。根据本发明的一种示例双链多核苷酸，具有一条编码hPARP2多肽序列的第一条链(即编码链)，以及根据Watson-Crick的DNA碱基配对原则从第一条链推导出的第二条链(即“互补”或“非编码”链)。双链或“双重”结构可以是DNA：DNA，DNA：RNA或RNA：RNA核酸。优选的双链多核苷酸是具有序列1定义的核苷酸序列的cDNA。根据本发明的一种示例单链多核苷酸是编码hPARP2多肽的信使RNA(mRNA)。另一种示例单链多核苷酸是一种寡核苷酸探针或引物，可以与序列1定义的多核苷酸的编码链或非编码链杂交。其他一些核酸结构，如三重结构，也在考虑之列。
本发明的基因组DNA含有hPARP2多肽的蛋白编码区，并包括本发明优选多核苷酸的等位基因变异体，如单核苷酸多态性。本发明基因组DNA与编码非hPARP2多肽的基因组DNAs的区别在于，本发明基因组DNA包括在本发明hparp2 cDNA中发现的hPARP2编码区。基因组DNA可以转录成RNA，获得的RNA转录产物经过一次或多次剪接，除去转录产物中一个或多个内含子(即非编码区)，或“剪除”。通过不同机制进行剪接并导致不同非编码RNA序列被剪除，但仍然编码hPARP2多肽的RNA转录产物，在本领域称为“剪接变异体”，包括在本发明范围之内。因此，本发明所指的剪接变异体由相同的DNA编码，但产生不同的氨基酸序列。这些剪接变异体可以包括阅读框移码区，这样，RNA序列的下游部分翻译发生变化，在最终获得的多肽中，氨基酸序列也发生变化。本领域众所周知，等位基因变异体是野生型(主要)基因序列的修饰形式。这些修饰来源于在染色体分离或暴露于导致基因突变的条件下产生的重组。等位基因变异体与野生型基因一样，是天然序列，与非天然变异体不同，后者是经体外处理获得的。
本发明还包括cDNA，通过逆转录编码hPARP2的RNA多核苷酸，然后合成互补链作为第二条链，最终形成双链DNA。例如，本发明提供了一种cDNA序列，该序列编码具有序列2定义的氨基酸序列的多肽。在一个优选实施方案中，本发明提供了包括序列1定义的核苷酸序列的多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供了编码多肽的多核苷酸，所述多肽包括序列2定义的氨基酸序列的49-583氨基酸，并优选1-583氨基酸。此外，本发明还提供编码多肽的多核苷酸，所述多肽包括序列2定义的氨基酸序列的1-49氨基酸。涉及本发明该方面的示例多核苷酸包括含有序列1定义的核苷酸序列的至少209-1811核苷酸的多核苷酸，优选63-1811核苷酸的多核苷酸。多核苷酸的另一个示例包括序列1定义的核苷酸序列的1-209或63-209核苷酸。优选地，所述多核苷酸编码hPARP2多肽或具有hPARP2催化活性的片段。
应该指出，根据本发明，高度优选的核酸序列被定义为序列1。但是，由于遗传密码在其信息编码方面是冗余或“变性”的，因此，不同的核苷酸序列可以编码相同的多肽序列。因此，本发明包括其他(变性)核苷酸序列，所述序列编码本发明hPARP2多肽，或其功能等价物。例如，本发明包括多种多核苷酸，所述多核苷酸含有与序列1 hparp2序列基本同源的核苷酸序列。更具体的说，本发明包括的多核苷酸，其相应的核苷酸序列与序列1定义的核苷酸序列至少90％一致，优选至少95％一致，更优选至少98％一致，更优选至少99％一致。
本发明多核苷酸变异体还进一步包括序列1定义的核苷酸序列的片段及其同系化合物。编码hPARP2多肽的全长多核苷酸序列的公开，使本领域一般技术人员可以获得全长多核苷酸的每一个可能片段。优选地，本发明多核苷酸片段含有hPARP2编码核苷酸序列的特异序列，因此，可以在高度严格或中度严格的条件下，只(即特异地)与含有该特异序列的编码hPARP2的多核苷酸或其片段杂交。本发明基因组序列的多核苷酸片段不仅包括编码区的特异序列，而且包括全长序列的片段，该全长序列源于内含子、调控区和/或其他非翻译序列。本发明多核苷酸特异序列可以通过与其他已知多核苷酸序列的比较进行识别，并可应用本领域常规使用的计算机软件进行鉴定，所述软件如公共序列数据库中应用的序列对比程序。
本发明还提供片段多核苷酸，该片段多核苷酸保存于hPARP2多肽家族的一个或多个多核苷酸编码成员中。这些片段包括hPARP2多肽家族的特征性序列，又被称为“署名”序列。该保守署名序列可以在与hPARP2家族编码成员多核苷酸进行简单序列比较后进行识别。本发明多核苷酸片段可以一种方式进行标记，使其检测成为可能，标记包括放射性标记和非放射性标记。
杂交可以定义为包括以下过程，即通过互补单链核酸分子之间的序列特异性作用，形成部分或完全的双链核酸分子。因此，本发明还进一步包括核酸种类的应用，所述核酸种类可以与编码hPARP2蛋白的多核苷酸的编码链或非编码链进行杂交。优选杂交种类与序列1定义的核苷酸序列的编码链或非编码链杂交。考虑到遗传密码的冗余性，本发明还包括能够与hPARP2编码多核苷酸杂交的种类，即编码相同氨基酸序列的多核苷酸，但应用不同的密码子。
杂交种类包括，例如，核酸杂交或扩增探针(寡核苷酸)，该探针能够探测编码hPARP2或其紧密相关分子，如等位基因，的核苷酸序列(如基因组序列)。探针的特异性，即它是否来源于高度保守、保守或不保守区或功能区，以及杂交或扩增条件的严格程度(高度、中度或低度)，将决定该探针是否只能鉴定天然hparp2，或其相关序列。用于检测相关核苷酸序列的探针应选自hparp2家族成员的保守或高度保守区，并且这些探针可用于变性探针池。当用于检测完全一致的核苷酸序列，或需要达到最高特异性时，寡核苷酸探针选自hparp2多核苷酸的非保守核苷酸区或特异区。本文应用的术语“非保守核苷酸区”是指本文公开的hparp2特异核苷酸区，而不存在于相关hparp2家族成员中。
杂交特异性的典型特征在于进行杂交的条件的严格性。杂交条件严格性的程度可以定义为核酸结合体的解链温度(Tm)[见，如Berger andKimmel，“Guide to Molecular Cloning Techniques”，Methods inEnzymology，Vol.152，Academic Press，San Diego CA(1987)]。典型的“最严格”条件发生在大约Tm-5℃(比探针Tm低5℃)；“高度严格”比Tm低大约5-10℃；“中度严格”比Tm低大约10-20℃；“低度严格”比Tm低大约20-25℃。
此外，杂交严格性还可定义为在处理过程中应用的理化条件。为了举例说明，示例的中度严格杂交条件为：在3X柠檬酸钠盐水(SSC)，0.1％ sarkosyl，20mM磷酸钠，pH6.8，65℃的条件下杂交；并应用含0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的2X SSC，在65℃洗涤。示例的高度严格杂交条件为：在50％甲酰胺，5X SSC，42℃过夜的条件下杂交；并应用0.5X SSC和0.1％ SDS，在50℃洗涤。应该理解，本领域等价严格条件可以通过改变温度和缓冲液或盐浓度达到[见，Ausubel et al.(Eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons(1994)，at pp.6.0.3-6.4.10]。杂交条件的改良可以凭经验决定，也可通过准确计算决定，后者有赖于寡核苷酸探针的长度和探针含有的鸟嘌呤/胞嘧啶(GC)碱基对的百分比。杂交条件可以根据Sambrook et al.，(Eds.)，Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress：Cold Spring Harbor，New York(1989)，at pp.9.47-9.51所描述的方法进行计算。
技术人员应该理解，在更加严格的条件下进行杂交，可以鉴定与靶序列有高度同源性或一致性的种类。相反，在不严格的条件下进行杂交，能够鉴定虽然与靶序列同源性或一致性较小，但仍然有意义的种类。因此，在本发明范围之内还包括能够在中度(中等)到最高严格条件下，与序列1的核苷酸序列杂交的核酸种类。优选地，杂交种类能够在高度严格的条件下，与序列1定义的编码链或非编码链多核苷酸杂交。优选的多核苷酸包括，在中度严格的条件下，能够与含有序列1定义的1-209核苷酸的核酸序列杂交的种类，或者与该区域互补链杂交的种类，更优选的多核苷酸包括，在高度严格的条件下，能够完成上述杂交的种类。其他优选多核苷酸是在中度严格的条件下，能够与含有序列1定义的63-209核苷酸的核酸序列杂交的种类，或者与该区域互补链杂交的种类，更优选的多核苷酸包括，在高度严格的条件下，能够完成上述杂交的种类。
本发明多核苷酸包括寡核苷酸(即，核酸寡聚体，典型的长度大约为10-60核苷酸)，所述寡核苷酸能够与编码hPARP2氨基酸序列的核酸编码链或非编码链杂交。特别是，本发明包括能够与序列1定义的多核苷酸编码链或非编码链杂交的寡核苷酸。只要它能够与靶核酸分子杂交，寡核苷酸的长度并不是最关键的。但是，较长的核酸分子通常较难制备，而且需要较长的杂交时间。因此，寡核苷酸不应超过必需长度。这样，寡核苷酸应该含有至少10个核苷酸，优选至少15个核苷酸，更优选至少20个核苷酸。通常情况下，寡核苷酸不超过60个核苷酸，优选不超过30个核苷酸，更优选不超过25个核苷酸。这些寡核苷酸可用作本文描述的DNA合成的引物(如，PCR中的引物；“扩增体”)，探测标本中靶DNA存在的探针(如，northern或Southern印迹和原位杂交)，治疗制剂(如，在反义治疗中)，或用于其他目的。寡核苷酸可以是单链，也可以是双链，其中双链形式的一端或两端呈现钝性或阶梯状。
寡核苷酸可以通过众所周知的方法，从自然资源中获得。此外，寡核苷酸也可根据本领域熟知的方法通过合成来制备。这些方法包括，例如，通过任何适宜的方法，进行适宜序列的克隆和限制性内切，或直接化学合成。制备寡核苷酸的多种化学方法是本领域众所周知的，包括磷酸三酯法，磷酸二酯法；二乙基亚磷酰胺法；固相支持物法，和H-膦酸酯法[综述见，Caruthers，Science 230：281-5(1985)；Caruthers et al.，Methods Enzymol 211：3-20(1992)]。典型地，寡核苷酸的制备是在聚合物支持物上进行的自动亚磷酰胺合成。包括100个以上核苷酸的核酸分子也可以通过这些方法制备。
本发明hparp2多核苷酸包括变异体，所述变异体是编码hPARP2或其功能等价物的多核苷酸，可包括核苷酸残基的缺失、插入或取代。本文应用的“缺失”是指核苷酸或氨基酸序列的一种变化，在该变化中，分别缺少一个或多个核苷酸或氨基酸残基。本文应用的“插入”或“添加”是指核苷酸或氨基酸序列的一种变化，该变化分别导致一个或多个核苷酸或氨基酸残基的增加。本文应用的“取代”是指核苷酸或氨基酸序列的一种变化，在该变化中，一个或多个核苷酸或氨基酸分别被不同的核苷酸或氨基酸代替。
在本发明范围内，多核苷酸变异体还包括hparp2的等位基因或其他自然发生的变异形式。等位基因是在基因组核苷酸序列中自然发生的突变的结果，所述突变即缺失、插入或取代，突变可以改变也可以不改变表达多肽的结构或功能。这些基因突变的每一种可以单独发生，也可以与其他突变共同发生，并在给定等位基因序列中发生一次或多次。可以发生单核苷酸多态性(SNPs)，其中，单个碱基的突变可以定义一种改变的多肽，而这种改变的多肽可能与明显的表型变化相关。当然，SNPs也可能是静默的，因为它们可能不改变编码多肽，或它们编码的任何改变对表型没有影响。
本发明还包括人parp2 DNA的天然同系化合物，该天然同系化合物发生在其他动物种类中，优选其他哺乳动物种类，更优选其他灵长类动物种类。这些种类同系化合物通常在蛋白编码区，在核苷酸水平，具有显著同源性。因此，本发明包括与编码人hPARP2多肽的多核苷酸蛋白编码区具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％核苷酸一致性的多核苷酸，所述编码人hPARP2多肽的多核苷酸如序列1所定义的多核苷酸。与本发明多核苷酸的序列“同源”百分比被定义为在序列和引入间隔配比后，候选序列核苷酸碱基与hPARP2编码序列核苷酸一致的百分比，如果需要，可以获得最大序列一致百分比。计算机软件可以用来(通过商业渠道购买或利用公共资源)自动计算一致百分比(如FASTA)。
本发明还包括经工程学选择性修饰的多核苷酸，所述选择性修饰为hPARP2基因产物的克隆、制备和/或表达。可以应用本领域众所周知的技术，如位点指引的突变来引入突变，插入新的限制性位点，改变糖基化模式，或者应用某些表达系统来改变密码子固有的优先选择模式，同时保持对表达多肽产物氨基酸序列的控制。例如，可选择特定原核或真核宿主细胞优先选择的密码子来增加hPARP2的表达率，或产生具有所需性质的重组RNA转录产物，如半衰期较长的产物。
可应用本领域熟知的化学方法全部或部分合成hparp2多核苷酸。本领域应该理解，本文应用的“化学合成”是指与酶法相反的纯粹的制备多核苷酸的化学方法。因此，“全部”化学合成DNA序列是完全由化学方法制备的，而“部分”化学合成DNAs包括那些所得DNA中只有一部分是通过化学方法制备的多核苷酸。
DNA分子可以修饰以增加其细胞内稳定性和半衰期。可能的修饰包括但不限于在分子的5’端和/或3’端增加侧翼序列，或者应用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯与分子的主干连接。
本发明还提供hPARP2多肽核酸(PNA)分子。这些hPARP2 PNAs是具有核碱基中性“肽样”主干的信息分子，所述核碱基允许该分子与hPARP2编码DNA或RNA互补链杂交，而且比相应的寡核苷酸(PerSeptive Biosystems)的亲和力核特异性高。多肽表达系统
有关hPARP2编码DNA序列的知识使技术人员能够修饰细胞，允许或增加hPARP2的表达。因此，通过引入本发明多核苷酸，允许编码hPARP2多肽表达，而使宿主细胞被稳定或暂时修饰，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。本发明还提供了能够自主复制的重组表达构建物，如整合了hPARP2编码序列的质粒和病毒DNA载体。
提供的表达构建物还包括将hPARP2编码多核苷酸操作性连接于内源性或外源性表达调控DNA序列和转录终止子上。表达调控DNA序列包括启动子、增强子和操作子，其选择通常基于表达构建物所用的表达系统。所选的优选启动子和增强子序列通常具有增加基因表达的能力，而所选的优选操作子序列则通常具有调控基因表达的能力。本发明优选构建物还包括在宿主细胞中复制所必需的序列。表达构建物优选用来制备编码hPARP2多肽，但也可用于构建物本身的扩增。
本发明的多核苷酸可以环状质粒部分、或含有分离的蛋白编码区的线形DNA或病毒载体的形式导入宿主细胞。将DNA导入宿主细胞的方法包括转化、转染、电穿孔、核内注射或与载体融合，所述载体如脂质体、胶态离子、ghost细胞和原生质体。本发明的表达系统包括，例如，细菌、酵母、真菌、植物、昆虫、非脊椎动物、两栖类动物和哺乳动物细胞系统。一些适宜的原核宿主细胞包括，例如，大肠杆菌菌株SG-936，HB101，W3110，X1776，X2282，DHI和MRCl，假单胞菌属，杆菌属如枯草杆菌，以及链霉菌属。适宜的真核宿主细胞包括酵母，如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母和其他真菌，昆虫细胞如sf9或sf21细胞(Spodoptera frugiperda)，动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，人类细胞如JY，293和NIH3T3细胞，以及植物细胞如Arabidopsis thaliana细胞。hparp2核苷酸序列或其任意一部分，均可克隆到载体内，以制备mRNA探针。这些载体是本领域众所周知的，并可通过商业渠道购买，并可通过添加标记的核苷酸和一个适宜的RNA聚合酶，如T7，T3或SP6，用于体外合成RNA探针。
宿主细胞的类型，表达hPARP2产物的形式，培养条件等可以根据已知的标准，由技术人员选择。应用哺乳动物宿主细胞预期可以提供这样的翻译后修饰(如糖基化，切断，脂质化，和磷酸化)，即本发明重组表达产物需要赋予最佳生物活性。hPARP2多肽的糖基化形式和非糖基化形式都在包括在本发明范围之内。由重组细胞产生的蛋白质可以分泌到细胞外，也可存在于细胞内，这些有赖于应用的序列和/或载体。本领域技术人员应该理解，包括hparp2的表达载体可以设计成含有信号序列，该信号序列指导hPARP2通过特定的原核细胞或真核细胞膜分泌。
表达构建物可以包括一些序列，这些序列可以使宿主细胞内同源重组更加容易，也可以促进宿主细胞内的同源重组。这一点可以通过以下方式达成，即将全部或部分天然hPARP2的启动子置换成全部或部分异源启动子，这样，细胞就会以更高的水平表达hPARP2。插入的异源启动子应该与hPARP2编码序列操作性连接[见，例如，PCT国际公开号WO 94/12650，WO 92/20808和WO 91/09955]。
本发明的宿主细胞对于大规模生产hPARP2多肽产物非常有用。例如，本发明宿主细胞可以成为研发针对hPARP2多肽具有免疫活性的抗体的有价值的免疫原。另一个实例是，重组hPARP2可以从宿主细胞中产生并分离，用于体外结合试验，如药物筛选试验。在这些方法中，宿主细胞生长于适宜的培养基中，然后从细胞或细胞生长的培养基中分离所需多肽产物。
多肽产物可以通过本领域熟知的纯化方法分离，如常规应用的层析法，包括免疫亲和层析，受体亲和层析，疏水相互作用层析，植物血凝素亲和层析，物质大小排除过滤，阳离子或阴离子交换层析，高效液相层析(HPLC)，反向HPLC等。
其他纯化方法包括那些纯化所需蛋白的方法，该所需蛋白以融合蛋白的形式表达并纯化，在所述融合蛋白中，hPARP2多肽与一个异源氨基酸序列连接。适宜的异源序列可以包括一个特异性标签、标记或螯合部分，所述部分可以被特异性结合配体或物质识别。例如，为在肽文库中筛选hPARP2活性的调节子，可以将表达的hPARP2蛋白融合到所选异源蛋白上，该异源蛋白可以应用探针抗体特异性鉴定。融合蛋白还可经工程学修饰，包括一个位于hPARP2序列和异源蛋白序列之间的裂解位点(如，因子XA或肠激酶敏感序列)，这样，hPARP2蛋白可以从异源蛋白上裂解下来，然后纯化。融合成分的裂解可以产生所需蛋白形式，该蛋白具有来自裂解过程的其他氨基酸残基。
示例的异源肽功能区包括金属螯合肽，如允许纯化固定金属的组氨酸-色氨酸模块[Porath，Protein Expr Purif 3：263-81(1992)]，以及允许纯化固定免疫球蛋白的蛋白A功能区。另一个有用的系统是用于肽延伸/免疫亲和纯化系统的二价阳离子结合功能区和特异性抗体，如美国专利号4,703,004，4,782,137，4,851,431和5,011,912所述。该系统可以从Immunex Corp.(Seattle，WA)公司购买，如FLAG系统。另一种适宜的异源融合体是谷胱甘肽S-转移酶，该酶可应用固定的谷胱甘肽亲和纯化。其他有用的融合体包括免疫球蛋白及其片段，如Fc段。
鉴定表达重组hPARP2的宿主细胞是鉴定适宜表达系统的关键。因此，本发明表达构建物还可以包括编码一个或多个可选择标记物的序列，这些标记物可以用来在操作条件下，鉴定携带构建物的宿主细胞。还应考虑的是，除了插入异源启动子DNA，与异源启动子DNA共同插入的还可以有可扩增标记DNA(如，ada，dhfr和编码氨基甲酰磷酸合成酶、天门冬氨酸氨甲酰转移酶和氨甲酰天冬氨酸脱水酶的多功能CAD基因)和/或内含子DNA。如果与hPARP2编码序列相连，通过标准选择法选择的标记DNA，其扩增会导致细胞内hPARP2编码序列的同时扩增。探测标记基因对诱导或选择的表达反应，通常也提示了hPARP2的表达。此外，如果hparp2多核苷酸插入到标记基因序列之中，含有hparp2的重组细胞就可以通过标记基因功能的丧失来鉴定。
本领域技术人员可以应用多种熟知的其他方法，鉴定含有hPARP2编码序列并表达hPARP2的宿主细胞。这些方法包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA杂交，以及蛋白生物试验或免疫试验技术，包括基于膜、溶液或碎片的探测和/或定量核酸或蛋白的技术。
hparp2多核苷酸序列的存在可以通过下列方法检测，如应用DNA-DNA或DNA-RNA杂交，或者应用序列1公开的hparp2片段作为探针来扩增。基于核酸扩增的试验包括应用基于hparp2序列的寡核苷酸，探测含有hparp2 DNA或RNA的转化体。探测hparp2多核苷酸序列的标记杂交或PCR探针可以通过多种方法制备，包括寡核苷酸标记，缺口翻译，末端标记，或应用标记核苷酸的PCR扩增。
在本发明的一个实施方案中，可以应用hPARP2或其变异体和/或表达hPARP2或其变异体的宿主细胞系筛选抗体、肽或其他分子，如有机或无机分子，所述物质可以作为hPARP2生物或免疫活性的调节子。例如，能够中和hPARP2聚合酶或DNA结合活性的抗hPARP2抗体，可以用来抑制hPARP2介导的细胞死亡。此外，应用组合化学筛查肽文库或有机物文库，选择重组表达的hPARP2或其变异体和/或表达hPARP2或其变异体的宿主细胞系，对于鉴定具有治疗意义的分子非常重要，所述具有治疗意义的分子通过调节hPARP2的生物或免疫活性发挥作用。本领域技术人员可以通过多种常规方法筛选合成化合物、天然产物和其他具有生物活性潜能的物质。例如，编码hPARP2 DNA结合功能区的核苷酸序列可以在宿主细胞中表达，可以用来筛选hPARP2活性的变构调节子，可以是类似物，也可以是拮抗剂。此外，编码hPARP2保守催化功能区的核苷酸序列也可以在宿主细胞中表达，并可用于筛选ADP-核糖聚合反应的抑制剂。hPARP2多肽
本发明还提供了纯化和分离的哺乳动物hPARP2多肽。hPARP2多肽的一个示例具有序列2定义的氨基酸序列。本发明hPARP2多肽可以从天然细胞源中分离，也可以化学合成，但优选应用本发明宿主细胞的重组方法制备。本发明的hPARP2产物可以是全长多肽，也可以是多肽产物的变异体，如保留了hPARP2特异性生物活性的多肽片段、截短的多肽、缺失突变体、以及其他变异体。本文应用的“生物活性”是指具有天然hPARP2蛋白结构、调控或生化功能的hPARP2多肽。具体地说，本发明hPARP2蛋白对细胞内DNA损伤的反应是，能够与DNA结合，并使ADP-核糖亚单位聚合。
本发明的蛋白及其片段可以通过本领域熟知的方法制备。这些方法包括从细胞中直接分离蛋白，分离或合成编码蛋白的DNA并应用该DNA制备重组蛋白，以及应用化学方法，利用氨基酸合成蛋白。
hPARP2多肽可以通过标准方法从生物标本中分离，如溶解的细胞部分。适宜的方法包括沉淀，以及液相层析方法，如离子交换，疏水相互作用，和凝胶过滤[见，如Deutscher(Ed.)，Methods Enzymol(Guide toProtein Chemistry，Section VII)182：309(1990)；Scopes，ProteinPurification，Springer-Verlag，New York(1987)]。此外，还可通过在预先制备的SDS-PAGE凝胶上分离蛋白获得纯化物质，剪去目标带，通过本领域熟知的方法用电洗脱将蛋白从聚丙烯酰胺基质中分离。去污剂SDS可以应用众所周知的方法从蛋白中去除，如通过透析或应用适宜的柱，如Extracti-Gel柱(Pierce)。
本发明hPARP2多肽还可应用本领域众所周知的方法通过化学方法全部或部分合成。适宜的合成蛋白质的方法在本领域有所描述[如，Stuart and Young，Solid Phase Peptide Synthesis，2d ed.，Pierce ChemicalCo.(1984)]。例如，肽可应用固相技术合成，然后从树脂上裂解，并通过预先准备的高效液相层析(HPLC)进行纯化[见，如Roberge et al.，Science 269：202-4(1995)]。例如，按照生产厂家提供的说明书应用ABI431A肽合成仪(Perkin Elmer，Norwalk，CT)可以达到自动合成。合成肽组合物可以通过氨基酸分析或序列分析(如，Edman降解法)来认定。
如上详细所述，重组hPARP2蛋白可以从宿主细胞中产生并分离，所述宿主细胞转化了含有hparp2核苷酸序列的表达载体，并在细胞培养基中生长。本文描述的宿主细胞，可以是原核细胞，也可以是真核细胞，以一种方式稳定或暂时转染(真核细胞)或转化(原核细胞)本发明hPARP2编码多核苷酸，该方式允许hPARP2多肽的表达。在这些方法中，宿主细胞生长于适宜培养基中，所需多肽产物可以从细胞中分离，也可以从细胞生长的培养基中分离。多肽的分离可以通过，例如免疫亲和纯化完成。应用转化宿主细胞优选大规模生产hPARP2多肽。
本发明包括多种多肽，所述多肽含有的氨基酸序列与本文描述的hPARP2多肽序列基本同源。例如，本发明包括的多肽，其相应氨基酸序列与序列2定义的多肽序列至少90％一致，优选至少95％一致，更优选至少98％一致，更优选至少99％一致。
关于本发明优选多肽的序列“同源”百分比可以定义为在序列和引入间隔配比后，候选序列氨基酸残基与hPARP2序列一致的百分比，如果需要，可以获得最大序列一致百分比，并且作为序列一致的一部分，不考虑任何的保守取代。
关于本发明优选多肽的序列“同源”百分比可以定义为在序列和引入间隔配比后，候选序列氨基酸残基与hPARP2序列一致的百分比，如果需要，可以获得最大序列一致百分比，并且作为序列一致的一部分，可以考虑任何的保守取代。
测定两个氨基酸序列是否基本同源可以根据FASTA研究[Pearsonet al.，Proc Natl Acad Sci USA 85：2444-8(1988)]。此外，同源百分比还可按如下百分比计算，即两个序列中较短序列的氨基酸残基与备比序列中氨基酸残基相同的百分比，所述较短序列可以引入4个长度为100的氨基酸间隔，以使配比最大化。见Dayhoff，in Atlas of Protein Sequenceand Structure，Vol.5，National Biochemical Research Foundation，Washington，D.C.(1972)，at p.124。
一种多肽可以认为与本发明hPARP2多肽同源，如果编码这两种多肽的多核苷酸可以彼此杂交。如果杂交可以在更加严格的杂交条件下发生，那么同源程度就更高。本领域技术人员应该知道如何控制杂交条件，以及杂交条件与同源程度的关系。见，如Sambrook et al.(1989)。因此，同源多肽是这样一种多肽，其编码多核苷酸可以在特定严格的杂交条件下，与本发明多肽的编码多核苷酸杂交。
这些结构同源的多肽能够展现同源功能是众所期待的，也就是同源多肽与本发明多肽具有基本相同的功能。例如，如果结构同源多肽能够与相似的配体结合，或显示相似的免疫反应性等，那么，就可以认为它们也有功能同源性。
但是，众所周知，被认为结构基本同源的两种多肽或两种多核苷酸，在功能上可以相差甚远。例如，等位基因中单核苷酸多态性(SNPs)表达的多肽，其功能在一个或多个可检测参数方面具有显著差异，所述参数如抗体或配体结合的亲和力，或酶底物特异性等。其他结构差异，如取代、缺失、剪接变异体等，也可影响其他结构相同或同源多肽的功能。
本发明hPARP2多肽包括序列2定义的hPARP2多肽的功能衍生物。这些功能衍生物包括多肽产物，其拥有的结构特征或生物活性与hPARP2蛋白的结构特征或生物活性基本类似。因此，功能衍生物包括亲本hPARP2蛋白的变异体、片段以及化学衍生物。
本文应用的“变异体”是指这样的分子，其结构和功能与完整的hPARP2分子或其片段基本类似。如果两个分子具有基本类似的结构，或两个分子拥有类似的生物活性，那么一个分子就被认为与另一个分子“基本类似”。因此，如果两个分子拥有类似的活性，它们就被认为是如本文所指的变异体，即使一个分子拥有的一种结构没有在另一个分子中发现，或者其氨基酸残基序列不一致。
在本发明提供的多肽变异体中，变异体含有hPARP2多肽氨基酸序列的一个或多个改变。这些基于序列的改变包括hPARP2序列中的缺失、取代或插入，以及各种改变的组合形式。
hPARP2多肽的缺失变异体是序列中除去至少一个氨基酸残基的多肽。缺失可以通过在蛋白的一端或两端，或者在hPARP2氨基酸序列中去除一个或多个残基来达成。缺失变异体包括，例如，本发明hPARP2多肽的所有不完全片段。本文应用的“片段”是指hPARP2蛋白的任何多肽子集。一种优选片段是纯化分离的hPARP2多肽，含有序列2定义的氨基酸序列的1-49个氨基酸。另一种优选片段包括纯化分离的hPARP2多肽，含有至少一个氨基酸残基，该残基源于含有序列2定义的氨基酸序列的1-49个氨基酸的区域。这些片段包括，例如，含有序列2定义的氨基酸序列的49-583个氨基酸的片段，以及该序列N端延伸的片段，及其C端截短的片段。
具有hPARP2生物活性特征的可溶性(即，非膜结合性)hPARP2片段是众所期待的。可以通过去除任何亲本分子的跨膜区或去除亲水氨基酸残基或以疏水残基取代亲水氨基酸残基来优选生成可溶性片段。这些残基的鉴定是本领域众所周知的。
本发明还提供了取代变异体，包括应用一个替代残基置换hPARP2多肽中至少一个氨基酸残基的多肽。任何取代都可进行，优选保守取代。指导的氨基酸取代可以基于以下条件进行，这些条件包括定义良好的规范和其他氨基酸的理化参数(如大小、形状、极性、电荷、氢键结合力、溶解性、化学反应性、疏水性、亲水性或残基的两性分子特征)以及它们对蛋白质二级、三级结构的作用。取代变异体可以包括含有一个或多个保守氨基酸取代的多肽，即按照需要，一个氨基酸被另一个具有类似理化特征的氨基酸所取代。为了举例说明，按照下述类别，规范氨基酸可以分组：
脂肪族支链：    甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸
芳香族支链：    苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸
脂肪族羟基支链：丝氨酸，苏氨酸
碱性支链：      赖氨酸，精氨酸，组氨酸
酸性支链：      天门冬氨酸，谷氨酸
氨基化合物支链：天门冬酰胺，谷氨酰胺
含硫支链：      半胱氨酸，蛋氨酸
二级氨基：      脯氨酸
当想要控制hPARP2分子的定义特征时，优选按照下表1进行取代。
                        表1
         原来残基                  保守取代示例
丙氨酸                     甘氨酸，丝氨酸
精氨酸                     赖氨酸
天门冬酰胺                 谷氨酰胺，组氨酸
天门冬氨酸                 谷氨酸
半胱氨酸                   丝氨酸
谷氨酰胺                   天门冬酰胺
谷氨酸                     天门冬氨酸
甘氨酸                     丙氨酸，脯氨酸
组氨酸                     天门冬酰胺，谷氨酰胺
异亮氨酸                   亮氨酸，缬氨酸
亮氨酸                     异亮氨酸，缬氨酸
赖氨酸                     精氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸
蛋氨酸                     亮氨酸，酪氨酸，异亮氨酸
苯丙氨酸                   蛋氨酸，亮氨酸，酪氨酸
丝氨酸                     苏氨酸
苏氨酸                                丝氨酸
色氨酸                                酪氨酸
酪氨酸                                色氨酸，苯丙氨酸
缬氨酸                                亮氨酸，异亮氨酸
功能或免疫一致性上的实质改变可以通过选择比表1更加显著的取代完成，即选择的取代残基在维持下述作用方面具有显著差异，(a)取代区主干多肽的结构，例如，折叠片状构型或螺旋状构型；(b)在靶位点分子的电荷或疏水性；或者(c)支链的大小。取代在下述情况下通常更加显著：(a)甘氨酸和/或脯氨酸被其他氨基酸取代，或者缺失或插入；(b)亲水残基被疏水残基取代；(c)半胱氨酸残基被其他残基取代，或半胱氨酸残基取代其他残基；(d)具有正电荷支链的残基被具有负电荷的残基取代，或具有正电荷支链的残基取代具有负电荷的残基；(e)具有较大支链的残基被没有这种支链的残基取代，或具有较大支链的残基取代没有这种支链的残基。最优选的是影响hPARP2溶解性的氨基酸取代。这些取代最优选由亲水性氨基酸取代疏水性氨基酸。
但是，取代变异体还包括应用非规范或非天然氨基酸残基取代原则序列中的氨基酸残基。取代变异体包括引入氨基酸取代的多肽，所述氨基酸取代是通过修饰hPARP2多肽编码多核苷酸达成的。
本发明还提供了插入变异体，在该变异体中，至少有一个氨基酸残基添加到hPARP2氨基酸序列中。插入可以位于多肽的任意一端，也可以位于多肽的两端，还可以位于hPARP2氨基酸序列中。插入变异体还包括融合蛋白，在该融合蛋白中，hPARP2多肽的氨基端或羧基端与另一个多肽融合。这些融合蛋白的示例包括免疫原性多肽，循环半衰期长的蛋白质(如免疫球蛋白恒定区)，标记蛋白(如绿色荧光蛋白)，以及使所需hPARP2多肽的纯化更加容易的蛋白或多肽(如FLAG标签或聚组氨酸序列)。末端插入的另一个示例是在分子的N端融合一种信号序列，使重组宿主分泌衍生物更加容易，该信号序列与宿主细胞可以同源，也可以异源。序列内插入(即在hPARP2分子序列内插入)的范围通常是1-10个残基，更优选1-5个残基。
本发明多肽变异体还包括成熟的hPARP2产物，即去除了前导或信号序列的hPARP2产物，以及具有其他氨基末端残基的产物。在位置-1添加了一个蛋氨酸残基的hPARP2产物(Met-1-hPARP2)也在考虑之列，以及在位置-2和-1添加了蛋氨酸和赖氨酸残基的hPARP2产物(Met-2-Lys-1-hPARP2)。其他的这些变异体对在细菌宿主细胞中制备重组蛋白特别有用。
本发明还包括应用特定表达系统产生的添加了氨基酸残基的hPARP2变异体。例如，应用可以通过商业渠道购买的表达所需多肽，如谷胱甘肽-S转移酶(GST)融合产物的载体，在裂解作用下从所需多肽去除GST组分，可以产生在位置-1添加了甘氨酸残基的所需多肽(Gly-1-hPARP2)。在其他载体系统表达的变异体也在考虑之列。
本发明还进一步提供了hPARP2多肽产物，所述产物是序列2定义的hPARP2多肽的化学衍生物。本文应用的术语“化学衍生物”是指含有其他添加化学部分的分子，所述化学部分并非天然存在的分子的正常部分。这些部分可能会赋予衍生物分子所需的特性，如溶解性、吸收、生物半衰期等增加。该部分也可以降低衍生物分子的毒性，或者消除或减轻衍生物分子的任何不欲副作用。因此，hPARP2多肽的化学衍生物包括经过修饰的多肽，修饰不仅(除了)是氨基酸残基的插入、缺失或取代。优选地，该修饰是天然共价修饰，并包括，例如，与聚合物、脂质、非天然氨基酸、以及其他有机和无机部分的化学连接。本发明衍生物可以制备，以增加hPARP2多肽的循环半衰期，或者可以设计，以改善多肽对所需细胞、组织或器官的定向能力。
例如，修饰一种多肽，使其包括一个或多个水溶性聚合附加基团的方法是本领域众所周知的，所述水溶性聚合附加基团如聚乙烯二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙烯二醇。特别优选的是与聚乙烯二醇(PEG)亚单位共价修饰的hPARP2产物。水溶性聚合物可以在hPARP2的特定位置与其相连，例如，在hPARP2产物的氨基末端，也可以与多肽的一个或多个支链随机粘附。其他衍生物还包括固定在固体支持物、别针微粒状载体或层析树脂上的hPARP2种类，以及经修饰包括一个或多个可探测标记、标签、螯合剂等的hPARP2种类。
与两种功能截然不同的制剂进行衍生反应可用来将TANK2交联到不溶于水的支持基质上。此外，反应性不溶于水的基质如氰溴活化的碳水化合物、和反应性底物可以用来固定蛋白[见，如，美国专利号3,969,287，3,691,016，4,195,128，4,247,642，4,229,537和4,330,440]。
预期hPARP2变异体的表达能够研究野生型hPARP2多肽的生物活性特征。hPARP2变异体可以设计成保留hPARP2的全部特征性生物或免疫性质，也可以设计成使hPARP2的一种或多种特定生物或免疫性质特异性失能。例如，hPARP2的片段或截短的hPARP2可以设计成去除一个与其特定性质相关的功能区，或者取代和缺失也可以设计成使与某特定功能区相关的性质失活。这些变异体(“显性不表达”变异株)的强迫表达(过量表达)可以通过观察与变异株相关的表型来研究这些蛋白的体内功能。
具有高达大约100个残基的hPARP2功能衍生物可以通过体外合成方便地制备。如果需要，这些片段还可应用本领域熟知的方法进行修饰，如通过将纯化蛋白或天然蛋白的靶氨基酸残基与有机衍生剂反应，该有机衍生剂能够与所选支链或末端残基发生反应。获得的共价衍生物可以用来鉴定残基对生物活性的重要性。
具有改变了的氨基酸序列的hPARP2功能衍生物还可通过编码hPARP2的DNA突变来制备。氨基酸缺失、插入和取代的任意组合都可用来产生最终构建物，只要最终构建物拥有所需活性。显然，在编码功能衍生物DNA中引入的突变，序列必须位于阅读框之内，并优选不产生互补区，该互补区可能使mRNA产生二级结构[见EP专利公开号75,444]。
由于在氨基酸序列中引入变异的位点是事先设定的，因而突变本身不必预先决定。例如，为使在给定位点的突变表现最佳化，可以在靶密码子或靶区域进行随机突变形成，如连接扫描突变形成，这样可以创建大量突变衍生物，然后可以表达并筛选所需活性的最佳组合。此外，也可应用位点导向突变形成和其他众所周知的技术，在已知DNA序列的预先设定位点制造突变。
位点导向突变形成技术是本领域众所周知的[如，Sambrook et al.，Supra，and McPherson(Ed.)，Directed Mutagenesis：A Practical Approach，IRL Press，Oxford(1991)]。通过应用编码所需突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列，位点导向突变形成可以产生hPARP2的功能衍生物。位点导向突变形成的方法和材料可以通过商业渠道购买，如从Stratagene(La Jolla，CA)可以购买QuikChangeTM试剂盒。应用该方法，可以生成准确的氨基酸缺失、插入或取代。氨基酸序列的缺失范围通常为1-30个残基，更优选1-10个残基，典型的是邻近缺失。最优选的缺失是那些处理后产生了催化片段或DNA结合片段的缺失。
为增加hPARP2的亲和力而设计的突变可以通过引入氨基酸残基达到目的，所述氨基酸残基存在于其他聚(ADP-核糖)聚合酶蛋白的同源位点。同样，这些突变hPARP2分子也可制备成缺乏某功能区残基的分子，如缺乏催化功能区，从而产生显性不表达蛋白。
推理预测任何特定修饰，如取代、缺失、插入等，将对hPARP2的生物活性产生怎样的具体效应是非常困难的。但是，本领域技术人员应该理解，该效应可以通过常规筛查试验来评价。例如，一个典型的衍生物通常是由编码天然hPARP2分子的DNA通过连接扫描位点导向突变形成技术制备的。衍生物然后在重组宿主中表达，并且，可以选择地，从细胞培养基中纯化，例如，通过免疫亲和层析法。然后，通过适宜的筛查试验筛检细胞溶解液或纯化衍生物的活性，看是否具有所需特征性活性。例如，功能衍生物免疫性质的改变，如对某给定抗体的亲和力，可以通过竞争性免疫试验来测定。表达产物在其他参数方面的改变可以通过适宜的试验方法来测定。抗体
本发明通过了与hPARP2多肽特异性结合的抗体。本文应用的“抗体”定义范围广泛，是一种能够与hPARP2多肽特征性抗原决定簇(抗原决定物质)发生特征性免疫反应的蛋白质。如本文所指，如果抗体特异性识别抗原决定簇并与之结合，那么抗体就被认为与抗原如一种多肽发生“免疫反应”，所述抗原决定簇通过一个或多个可变区或者一个或多个抗体补体决定区(CDRs)成为抗原的特征。
如果两种多肽的每一种都含有定义同一特征性抗原决定簇的共同结构特征，那么能够与其中一种给定多肽发生免疫反应的抗体，也可能与另一种多肽发生交叉反应。在这种相关多肽的情况下，交叉反应性与共同结构特征相关，如序列一致性、同源性或相关多肽间存在的相似性。因此，多肽家族通常可以通过交叉反应抗体来鉴定，即，一种抗体可以与具有共同抗原决定簇的多肽家族的某些或所有成员发生免疫反应。因此，本发明包括与hPARP2多肽家族特定成员发生免疫反应的抗体，所述hPARP2多肽如含有序列2定义的氨基酸序列的多肽，或含有序列2定义的1-49个氨基酸残基的多肽。本发明还进一步包括与hPARP2多肽家族某些或全部成员发生免疫反应的抗体。测定抗体结合特异性的筛查试验是众所周知的，并在本领域经常应用[见Harlow et al.(Eds.)，Antibodies：A Laboratory Manual，Ch.6，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor NY(1988)]。一种抗体与给定多肽抗原的免疫反应特异性与该抗体与其他蛋白的相互作用不同，所述其他蛋白如金黄色葡萄球菌蛋白A或其他用于ELISA技术的抗体，该抗体与其他蛋白的相互作用是通过抗体的其他部位介导的，而不是抗体可变区，特别不是抗体恒定区。
抗体包括例如单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体(scFv抗体)、嵌合抗体、多功能/多特异性(如，两种功能或两种特异性)抗体、人源化抗体、人类抗体、以及CDR移植物抗体(包括含有CDR序列的部分，该CDR序列能够与本发明多肽发生特异性免疫反应)。根据本发明，抗体还包括抗体片段，只要这些片段也具有所需生物活性。“抗体片段”包括一部分全长抗体，通常是全长抗体的抗原结合部位或可变区。抗体片段的示例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、以及Fv片段、双抗体、线形抗体、单链抗体分子、以及由多个抗体片段构成的多特异性抗体。
本发明抗体可以通过本领域任何已知方法制备。例如，根据本领域已知方法，应用蛋白或功能类似物免疫哺乳动物，然后从中分离多克隆抗体。简而言之，多克隆抗体可以通过给哺乳动物宿主(如兔、小鼠、大鼠或山羊)注射免疫原性hPARP2(免疫原)多肽而制备。可以应用佐剂增强免疫反应。提纯从哺乳动物宿主获取的血清，并筛选收获能够与hPARP2多肽发生特异性反应(免疫反应)的多克隆抗体。
优选单克隆抗体(本文也称为“mAbs”)。本文应用的“单克隆抗体”是指从基本同源的抗体中获得的一种抗体，即含有完全相同的抗体，除非含有少量可能天然发生的突变。单克隆抗体是高度特异的(“单特异性”)，只与一个抗原位点发生作用。而且，与传统(多克隆)抗体制备不同，典型的多克隆抗体包括与不同决定物质(抗原决定簇)发生作用的不同抗体，而每种多克隆抗体只与抗原的一种决定物质发生作用。
修正“单克隆”提示，抗体的特性获自基本同源的抗体，而不应理解为通过任何具体方法需要制备的抗体。单克隆抗体可以应用任何适宜的技术制备，所述技术能够生成连续细胞系产生同源抗体。这些方法包括免疫学方法[Kohler and Milstein，Nature 256：495-497(1975)；Campbell，“monoclonal antibody technology，the production andcharacterization of rodent and human hybridomas”in Burdon et al.(Eds.)，Laboratory Techniques in biochemistry and Molecular Biology，Vol.13，Elsevier Science Publishers，Amsterdam(1985)]或其他类似方法。单克隆抗体还可以从噬菌体抗体文库中分离[Clackson et al.，Nature 352：624-8(1991)；Marks et al.，J Mol Biol 222：581-97(1991)]。
举例说明，为产生单克隆抗体，给哺乳动物宿主免疫注射免疫原性hPARP2多肽，然后加强免疫。在最后一次加强免疫后数日，从免疫哺乳动物体内收获脾脏。脾脏细胞悬液与肿瘤细胞系融合，创建一种永生杂交细胞系或“杂交瘤”。通过限制性稀释可以获得单个克隆，然后检测它们产生的抗体的特异性。然后培育被选择的细胞，如通过腹水法，作为所需同源抗体的持续提供源。
抗体还可以经工程学修饰，如应用基因技术产生嵌合抗体，该嵌合抗体包括两种以上种类的蛋白组分。如果抗体用于人类受体体内，还需要进行“人源化”，即抗体经修饰包括源于一个物种的抗原结合区，该物种如啮齿类动物，以及用源于人类免疫球蛋白的序列置换抗体的大部分。在一个方法中，一个非人类物种如小鼠或兔的CDRs，被插入另一个物种如人类的框架序列，或被插入共有框架序列。还可将其他变化引入抗体框架，来修饰工程学抗体的亲和力和免疫原性。在多种细胞类型中诱导工程学抗体表达的方法也是众所周知的，所述多种细胞类型如哺乳动物细胞和微生物细胞。本领域存在多种制备工程学抗体的技术描述[如，Owens and Young，J Immunol Meth 168：149-65(1994)]。
抗体还包括重组多克隆或单克隆Fab片段[如Huse et al.，Science246：1275-81(1989)]。此外，制备单链抗体的技术(如美国专利号4,946,778)也可用来制备hPARP2特异性单链抗体(如单链Fv片段，缩写为“scFv”)。可以采用迅速、大规模生产抗体的重组方法，如噬菌体陈列或核糖体陈列法，随后可以可选地进行亲和突变[见，如Ouwehand et al.，Vox Sang 74(Suppl2)：223-232(1998)；Rader et al.，ProcNatl Acad Sci USA 95：8910-8915(1988)；Dall’Acqua et al.，Curr OpinStruct Biol 8：443-450(1998)]。
特别优选完全人类抗体用于人类治疗，但完全人类抗体难以制备。例如，当免疫原是人类自身抗原时，人类不会针对抗原产生任何典型的免疫反应。业已开发出制备完全人类抗体的方法，这些方法在本领域是众所周知的。因此，完全人类抗体可以应用免疫原性hPARP2多肽免疫经转基因修饰的动物(如小鼠)来制备，该动物至少表达全部人类免疫球蛋白基因的一大部分[见如，Bruggemann et al.，Immunol Today 17：391-7(1996)]。
应该指出，本发明宿主细胞是研发hPARP2特异性免疫反应抗体的免疫原的宝贵资源。为了成为制备多克隆或单克隆抗体的有用免疫原，hPARP2肽片段必须包括足够的氨基酸残基以形成免疫原抗原决定簇。如果片段太短，本身不能成为免疫原，就应该与一个载体分子连接。适宜的载体分子包括，例如锁眼帽贝血蓝蛋白和牛血清白蛋白(BSA)。连接可以应用本领域熟知的方法进行。其中一种方法是将片段的半胱氨酸残基与载体分子的半胱氨酸残基相连。
本发明抗体可用于治疗(通过调节hPARP2活性)、诊断(通过测定样本中的hPARP2)以及hPARP2的纯化。这些抗体对于测定和/或定量hPARP2在下述物质中的定量表达非常有用，如细胞、组织、器官及其裂解液、提取物，以及血清、血浆、脑脊液、尿液、痰液、腹水、胸水或支气管灌洗液。用于本文所述任何目的的含有本发明抗体的试剂盒也在考虑之列。通常，本发明试剂盒还包括一种可与抗体发生免疫反应的对照抗原，还可以包括其他试剂、容器和说明书。
而且，本发明还包括中和抗体，即可以显著抑制或破坏本发明蛋白质或功能类似物的生物活性的抗体。具体地说，中和抗体抑制或破坏hPARP2的聚(ADP-核糖)聚合酶活性。中和抗体对于治疗和诊断应用特别需要。
功能等价物进一步包括抗体的片段，这些抗体片段与完整抗体具有相同的结合特征，或其结合特征可与完整抗体相比。这些片段可以包括一个或两个Fab片段，或F(ab’)2片段。尽管含有少于所有CDRs的片段，如含有3个，4个或5个CDRs的片段，也可能具有功能，但优选包括完整抗体的所有6个补体决定区(CDRs)的抗体片段。片段可应用本领域描述的方法制备[如Lamoyi et al.，J Immunol Meth 56：235-43(1983)；Parham，J Immunol 131：2895-902(1983)]。
而且，应用分离的或重组的hPARP2产物、hPARP2变异体或表达这些产物的细胞可以开发特异性结合蛋白。应用已知的免疫学方法，结合蛋白对于纯化hPARP2产物，测定或定量体液和组织样本中hPARP2产物非常有用。结合蛋白对于调节(即阻断、抑制或刺激)hPARP2多肽的活性也非常有用，特别是涉及信号传导的那些活性。因此，本发明提供了抑制hPARP2多肽活性的中和抗体。特异性抗hPARP2抗体的抗独特型抗体也在考虑之列。可探测的多核苷酸和多肽探针
本发明还提供了一种探测样本中是否存在hPARP2编码多核苷酸或hPARP2多肽的方法。该方法包括应用能够识别样本中定义靶物质的标记探针。该探针可以是能够识别hPARP2多肽的抗体，也可以是能够识别编码hPARP2多肽的多核苷酸的寡核苷酸。
本发明探针可根据本领域已知方法进行可探测标记。通常，探针可以通过连接一个可探测标记(通讯子)部分来修饰，也可通过将可探测标记部分整合其间来制备可探测探针。可探测标记部分可以是任意可探测部分，其中多种是本领域已知的，包括放射性原子、电子密集原子、酶、色原体和有色化合物、荧光团和荧光化合物、特异性结合派对中的成员等。
标记寡核苷酸探针的方法在本领域业已有所描述[见，如Leary et al.，Proc Natl Acad Sci USA 80：4045-49(1983)；Renz and kurz，Nucleic AcidsRes 12：3435-44(1984)；Richardson and Gumport，Nucleic Acids Res 11：6167-84(1983)；Smith et al.，Nucleic Acids Res 13：2399-412(1985)；Meinkoth and Wahl，Anal Biochem 138：267-84(1984)；以及美国专利号4,711,955，4,687,732，5,241,060，5,244,787，5,328,824，5,580,990和5,714,327]。
标记抗体的方法业已有所描述[见，如Hunter et al.，Nature 144：495-6(1962)；David et al.，Biochemistry 13：1014-21(1974)；以及美国专利号3,940,475和3,645,090]。
标记部分可以是放射性物质。一些有用的放射性标记示例包括32P，125I，131I和3H。放射性标记物质的应用业已有所描述[例如，美国专利文件2,034,475以及美国专利号4,358,535和4,302,204]。
一些非放射性标记的示例包括酶、色原体、应用电子显微镜可以探测的原子和分子、以及应用其磁性来探测的金属离子。
一些有用的酶标记包括导致底物发生可探测改变的酶。一些有用的酶(及其底物)包括，例如，辣根过氧化物酶(焦酚和氧苯二胺)，β-牛乳酶(荧光素β-D-牛乳吡喃糖苷)，以及碱性磷酸酶(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/硝基四唑蓝)。酶标记的应用在本领域业已有所描述[见，如英国专利文件2,019,404，欧洲专利文件EP63,879，以及Rotman，ProcNatl Acad Sci USA47：1981-91(1961)]。
有用的通讯子部分包括，例如，荧光、磷光、化学发光和生物发光分子以及染料。本发明有用的一些特异性有色或荧光化合物包括，例如，荧光素、香豆素、若丹明、德州红、藻红蛋白、7-羟基香豆素、Luminol等。色原体或荧光团是这样一些分子，即通过修饰(如氧化)可以成为有色或荧光物质，或改变其颜色或发射光谱，这些分子也能够整合到探针中，在特定条件下发挥通讯子部分的作用。
标记部分可以应用本领域熟知的方法连接到探针上。标记部分可以通过功能基团直接粘附于探针。探针可以包括这样一个功能基团，也可以经由反应导致含有这样一个功能基团。一些适宜的功能基团的示例包括，例如，氨基、羧基、巯基、顺丁烯二酰亚胺、异氰酸盐、异硫氰酸盐。
此外，标记部分如酶和色原体还可以通过配对制剂的方法与抗体或核苷酸相连，所述配对制剂如二醛、碳二酰亚胺、dimaleimides等。
标记部分还可通过以下方法与探针连接，即通过上述方法粘附于探针的配体以及粘附于标记部分的配体的受体。任何已知的配体-受体结合派对组合都是适宜的。一些适宜的配体-受体派对包括，例如生物素-抗生物素蛋白或-链霉抗生物素蛋白，以及抗体-抗原。优选生物素-链霉抗生物素蛋白组合。应用hparp2多核苷酸和hPARP2多肽的方法
本发明公开的DNA和氨基酸序列的科学价值是显而易见的。如系列实施例所示，hparp2 cDNA序列的公开使下述研究成为可能，即通过应用Southern杂交或聚合酶链反应(PCR)，鉴定基因组DNA编码hPARP2的序列，以及hPARP2的表达调控序列。在中度到高度严格的条件下，应用本发明DNA序列进行的DNA/DNA杂交试验，预期有可能分离得到编码hPARP2等位基因变异体的DNAs。同样，应用Southern和/或PCR分析，还可以鉴定编码hPARP2同源蛋白的非人种类基因。此外，互补研究可用于鉴定其他人类hPARP2产物和非人类蛋白，以及具有hPARP2一种或多种生物活性的DNAs编码蛋白。本发明寡核苷酸还可用于测定细胞hPARP2表达能力的杂交试验。本发明多核苷酸还是诊断方法的基础，可用于鉴定hparp2位点的基因变异，该基因变异是一种疾病状态的基础。
这里描述的本发明寡核苷酸还可用于为了多种目的扩增DNA的方法。根据本发明的方法，“扩增”是指为检测痕量特定核酸序列而应用的任何分子生物学技术，该技术指数级扩增模板核酸序列。具体地说，适宜的扩增技术包括如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)及其改良变异的技术。PCR是一种已知的高度敏感的技术，应用广泛[见，例如，Innis et al.，PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications，Academic Press，Inc.，San Diego(1990)；Dieffenbach andDveksler，PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview NY(1995)；以及美国专利号4,683,195，4,800,195和4,965,188]。LCR是一种更近期开发的技术[Landegren et al.，Science 241：1077-80(1988)and Barany et al.，PCR Methods andApplications 1：5-16(1991)；LCR试剂盒可以从Stratagene购买]。众所周知，LCR特异性非常高，可以检测点突变。在特定情况下，需要结合PCR和LCR技术来改善检测的准确性。根据本发明，还可应用其他扩增技术。
寡核苷酸扩增引物通常以配对的单链寡核苷酸形式提供，一个是正义方向(5’→3’)，另一个是反义(3’←5’)方向。这些特定引物对在最佳条件下，可以用来鉴定特定基因或疾病。此外，还可应用相同的引物对、巢式寡聚物、甚至寡聚物变性池，在不严格的条件下，探测和/或定量密切相关的DNA或RNA序列。
这些寡核苷酸还可用于多种本领域熟知的方法，来延长特定核苷酸序列。这些方法允许应用一种已知序列测定其邻近的未知序列，因此，能够探测并测定上游序列，如启动子和调控元件。
例如，限制位点聚合酶链反应是一种应用普遍引物获得已知位点邻近未知序列的直接方法[见，如Gobinda et al.，PCR Methods Applic 2：318-22(1993)]。在该方法中，基因组DNA首次在两种引物的存在下扩增，这两种引物一种与连接序列配对，另一种与已知位点特异性配对。获得的扩增序列再进行第二轮PCR，应用的引物一种是与上一轮相同的连接引物，另一种特异性引物位于上一轮引物之内。每一轮PCR的产物都应用适宜的RNA聚合酶转录，并应用逆转录酶进行序列分析。
反向PCR法应用基于已知区域的分歧引物扩增或延长序列[Trigliaet al.，Nucleic Acids Res 16：8186(1988)]。引物可以应用Oligo 4.0(National Biosciences，Inc.，Plymouth MN)进行设计，长度为22-30个核苷酸，GC含量≥50％，与靶序列的退火温度大约为68℃-72℃。该方法应用几种限制性内切酶，在一个基因的已知区域内形成适宜的片段。该片段通过分子内连接环化，用于PCR的模板。
俘获PCR是扩增人类或酵母(YAC)人工染色体已知序列的邻近DNA片段的PCR方法[Lagerstrom et al.，PCR Methods Applic 1：111-9(1991)]。俘获PCR在进行PCR以前，也需要多种限制性内切酶消化、连接，将一段经工程学修饰的双链序列引入DNA分子的未知部分。游走PCR是以基因游走为靶向的方法，允许获得未知序列[Parker et al.，Nucleic Acids Res 19：3055-60(1991)]。PromoterFinderTM试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)应用PCR、巢式引物和特定文库在基因组DNA中“游走”。该方法不必筛选文库，对于发现内含子/外显子的连接点非常有用。
这些方法可用于探测基因组文库，延长5’序列，并获得内源性hparp2基因组序列，包括元件如启动子、内含子、操作子、增强子、抑制子等。筛选全长cDNAs的优选文库是已经大小选择、并包括大型cDNAs的文库。此外，优选随机备好的文库，因为这些文库可能包括更多含有5’和基因上游区域的序列。
寡核苷酸还可用于描绘内源性基因组序列图。应用众所周知的技术，可以将序列绘于某一染色体上，或某一染色体的具体区域。这些技术包括染色体延展原位杂交[Venna et al.，Human Chromosomes：Amanual ofBasic Technique，Pergamon Press，New York(1988)]，流式分类染色体制备，或人工染色体构建，如YACs、细菌人工染色体(BACs)、细菌P1构建物或单染色体cDNA文库。
在扩展绘制基因图的过程中，染色体制剂杂交和物理绘制技术，如应用已经建立的染色体标记进行连接分析，其价值是无法衡量的。基因绘图的实例见于Science 270：410f(1995)和Science 265：1981f(1994)。通常一个基因在另一种哺乳动物染色体上的位置，可以揭示相关标记，即使尚不知晓该基因位于人类哪条染色体上、或染色体的哪个臂上。应用物理绘制技术，可以将这些序列定位于染色体的某一特定结构区域。这为研究人员应用定位克隆或其他基因发现技术探求疾病基因提供了非常有价值的信息。一旦通过基因连接技术将一种疾病或综合征初步定位于某一基因组区域，任何经基因绘图技术定位于该区域的序列都可能成为进一步研究的相关基因或调控基因[见，如Gatti et al.，Nature 336：577-80(1988)]。本发明的多核苷酸也可用于在正常人、携带者或患病个体中探测由于转位、插入等导致的染色体位置变异。
本发明提供的DNA序列信息还可用于开发不表达hPARP2或表达hPARP2变异体的动物模型，如应用同源重组或“敲除”策略[Capecchi，Science 244：1288-92(1989)]。这些动物可以成为体内研究hPARP2活性及其调控因子的模型。
如本文所述，本发明还提供了可以识别编码hPARP2多核苷酸并与之杂交的反义核酸序列。可以通过设计针对hparp2基因调控区的反义序列来修饰基因表达，所述调控区如启动子、增强子和内含子。优选的寡核苷酸源自转录起始位点，如在前导序列的-10～+10之间。还可将反义RNA和DNA设计成通过抑制与核糖体的结合、防止转录来阻断mRNA翻译。一般技术人员应该理解，本发明的反义分子包括那些能够特异性识别hparp2 DNA并与之杂交的分子(通过比较hparp2 DNA和编码其他已知分子的DNA来测定)。本发明反义分子还包括那些识别编码hPARP2蛋白家族其他成员的DNA并与之杂交的分子。能够与编码hPARP2蛋白家族其他成员的多种DNA杂交的反义多核苷酸可以通过序列比较，鉴别hPARP2蛋白家族的特征性或署名序列来鉴定。因此，这些反义分子与靶hparp2序列优选至少95％一致，更优选至少98％一致，更优选至少99％一致。
反义多核苷酸与表达hparp2 mRNA细胞的hPARP2表达调控特异相关。能够与hparp2表达调控序列或hparp2 RNA特异结合的反义多核苷酸(优选10-20bp寡核苷酸)可以通过如病毒载体、或胶质扩散系统如脂质体，引入细胞。该反义寡核苷酸与细胞内靶hparp2核苷酸序列结合，防止靶序列的转录或翻译。本发明的硫代磷酸酯和甲基磷酸化反义寡核苷酸特别可以考虑用于治疗。反义寡核苷酸还可进一步在其5’端修饰，携带聚-L-赖氨酸、转铁蛋白聚赖氨酸或胆固醇部分[反义技术的近期综述见，Delihas et al.，Nature Biotechnology 15：751-3(1997)]。
本发明还包括应用核糖酶技术调节hPARP2表达的方法[综述见，Gibson and Shillitoe，Mol Biotechnol 7：125-37(1997)]。核糖酶技术可以通过(i)互补RNA与靶mRNA杂交，以及(ii)通过互补RNA固有的核酸内切酶活性裂解杂交mRNA，以序列特异性的方式抑制hparp2 mRNA的翻译。核糖酶可以通过经验性方法鉴定，如应用互补寡核苷酸核糖核酸酶保护试验，但更优选通过扫描靶分子寻求核糖酶裂解位点来特异性设计核糖酶[Bramlage et al.，Trends Biotechnol 16：434-8(1998)]。可以应用本领域众所周知的外源性或内源性导入技术，将核糖酶导入靶细胞。外源性技术包括应用靶脂质体或直接局部注射。内源性方法包括应用病毒载体或非病毒质粒。
当核糖酶被设计成与编码hPARP2多核苷酸独特区互补时，该核糖酶可以特异性调节hPARP2的表达。因此，“特异性调节”意味着，本发明核糖酶只识别编码hPARP2的多核苷酸。同样，核糖酶可以设计成调节全部或部分hPARP2蛋白家族的表达。这一类型的核糖酶可以设计成识别全部或部分编码hPARP2家族成员的多核苷酸的保守核苷酸序列。
本发明还包括通过寡核苷酸指导的三螺旋结构形成(也被称为Hogeboom碱基配对法)来调节hparp2转录的方法[综述见，Lavrovsky etal.，Biochem Mol Med 62：11-22(1997)]。三螺旋结构形成可以通过应用序列特异性寡核苷酸达成，所述寡核苷酸可以在Watson-Crick模型定义的大裂隙与双链DNA杂交。形成的三螺旋杂交体包括原来双螺旋体的能力，如有充分的空间结合聚合酶、转录因子或调节分子。优选的杂交靶序列包括启动子和增强子区域，能够转录调节hPARP2的表达。能够形成三螺旋结构的寡核苷酸还可以与DNA损伤剂结合，然后用于DNA序列的位点特异性共价修饰。见Lavrovsky et al.，supra。
本发明的反义RNA和DNA分子以及核糖酶都可以按照本领域众所周知的RNA分子合成法制备。这些包括化学合成寡核苷酸的技术，如固相亚磷酰胺合成法。此外，RNA分子还可通过体外或体内转录编码反义RNA分子的DNA序列生产。这些DNA序列可以整合到多种含有适宜RNA聚合酶启动子的载体中，所述启动子如T7或SP6。此外，构成或诱导合成反义RNA的反义cDNA构建物也可以引入细胞系、细胞或组织。
导致基因产物正常功能丧失的基因突变可能是导致hPARP2相关性疾病状态的基础。本发明包括恢复hPARP2活性的基因治疗，因此可用于治疗与hPARP2酶相关的以聚(ADP-核糖)聚合酶活性缺乏或丧失为特征的疾病。通过应用载体，特别是病毒载体(如，腺病毒、腺相关病毒或逆转录病毒)，或者活体外应用物理DNA转移方法(如脂质体或化学治疗)，可以在活体外、原位或体内将功能性hparp2基因成功导入适宜细胞[见，如Anderson，Nature 392(6679Suppl)：25-30(1998)]。此外，在其他一些疾病状态也可考虑应用，在这些疾病中，防止hPARP2表达或抑制hPARP2活性可以帮助治疗这些疾病。反义治疗或基因治疗可用于负向调节hPARP2表达。
本发明提供的DNA和氨基酸序列信息还使系统分析hPARP2蛋白的结构和功能成为可能。hPARP2的DNA和氨基酸序列信息还可以鉴定那些与hPARP2多肽可以发生相互作用的分子。调节(即增强、减弱或阻断)hPARP2活性的制剂可以通过下面的方法鉴别，如将假定的调节子与hPARP2共同孵育，然后测定该假定调节子对hPARP2活性的作用。调节hPARP2活性的化合物的选择性可以通过比较该化合物对hPARP2及其他蛋白的调节活性来评价。基于细胞的试验，如二次杂交或三次杂交试验(鉴定编码结合配体DNA)、和分离杂交试验(鉴定抑制hPARP2多肽与众所周知的结合配体相互作用的抑制剂)，以及体外方法，包括固定hPARP2多肽、hparp2多核苷酸或其结合配体的试验、和溶解试验均在本发明考虑之列。
选择性调节子包括，例如与hPARP2多肽或hPARP2编码多核苷酸特异性结合的抗体和其他多肽或蛋白，与hPARP2多肽或hPARP2编码多核苷酸特异性结合的寡核苷酸，以及与hPARP2多肽或hPARP2编码多核苷酸特异性反应的其他非肽化合物物(如分离或合成的有机分子)。调节子还包括上述化合物，但与hPARP2多肽的特异性结合配体相互作用。hPARP2的突变形式，如那些影响野生型hPARP2生物活性或细胞定位的突变形式，也在本发明考虑之列。目前，开发选择性调节子的优选靶物质包括，例如
(1)hPARP2多肽的胞浆或跨膜区，该区域与其他蛋白接触和/或将
   hPARP2定位于细胞内；
(2)hPARP2多肽的细胞外区，该区域与结合配体特异性结合；
(3)与底物结合的hPARP2多肽区；
(4)hPARP2多肽的变构调节位点；
(5)介导multimerization的hPARP2多肽区。
其他选择性调节子包括那些特异性识别hPARP2编码核苷酸序列调控区的因子。hPARP2活性的调节子可以用于治疗多种涉及hPARP2活性异常的疾病和生理病况。
hPARP2编码多核苷酸还可用于诊断由hPARP2表达或活性异常导致的疾病，或与hPARP2表达或活性异常相关的疾病。例如，编码hPARP2的多核苷酸序列可用于生物样本的杂交或PCR试验，检测hPARP2表达的异常，所述生物样本如源于活检或尸检的组织或体液样本或提取物。这些定性或定量方法包括Southern或northern分析，点杂交印迹，或其他基于膜的技术；PCR技术；dipstick，pin或芯片技术；以及ELISA或其他多样本形式技术。这些类型的技术是本领域众所周知的，并可通过购买诊断试剂盒进行测定。
这些试验方法可以根据具体情况来评价一种特定治疗方案的有效性，也可用于动物实验、临床试验或监测某个体患者的治疗。为了提供诊断疾病的基础，必须建立hPARP2表达的正常或标准概况。为了达成这一目的，可以在适宜杂交或扩增的条件下，将从正常受试者获取的生物样本与hparp2多核苷酸结合。标准杂交可以进行量化，方法是在相同的试验条件下，应用已知数量的纯化hparp2多核苷酸，比较正常受试者与系列稀释的阳性对照之间的数值。从正常样本获得的标准值可以同从与患者中获得的样本值进行比较，所述患者的疾病或功能紊乱可能与hPARP2表达相关。标准值与测试值之间的差异说明疾病状态的存在。如果所患疾病被确立，然后给予一种现有治疗制剂，就可以产生治疗效果或治疗值。该试验还可以常规重复进行，以评价测试值是继续发展，还是回复到正常或标准水平。持续的治疗情况可以通过一段时期如数日或数月的治疗效果来显示。
抗hPARP2抗体可以用来诊断以hPARP2多肽异常表达为特征、或与hPARP2多肽异常表达相关的病况、功能紊乱或疾病。hPARP2多肽的诊断试验包括应用标记抗体，探测生物样本中hPARP2多肽的方法，所述生物样本如体液、细胞、组织、切除物或这些材料的提取物。本发明多肽或抗体可以经修饰应用，也可不经修饰就直接应用。优选地，如本文所述，通过与一个可检测标记部分共价或非共价连接，来标记多肽或抗体。
依靠本发明，可以应用基于抗体的方法，探测生物样本中hPARP2多肽的存在。应用抗体探测蛋白质存在的试验以前就有所描述，可以按照已知形式进行，如酶联免疫吸附试验(ELISA)，放射免疫试验(RIA)，以及荧光激活细胞分类技术(FACS)和流式细胞技术，western印迹，夹心试验等。这些方法通常基于将抗体与可疑含有hPARP2蛋白的样本共同孵育，然后检测抗体、蛋白复合物的存在。抗体可以在孵育步骤之前、期间或之后进行标记。抗体的具体浓度、孵育温度和时间、以及这些试验的其他条件，都可由于多种因子而发生变化，这些因子包括样本中抗原的浓度、样本的自然特性等。本领域技术人员可以根据常规试验方法，决定每种试验的具体操作条件和最适试验条件[见，如Hampton etal.，Serological Methods：A Laboratory Manual，APS Press，St Paul，MN(1990)]。
为了提供量化样本中hPARP2蛋白或疾病诊断的基础，必须建立hPARP2多肽表达的正常值或标准值。为了达成这一目的，可以将从正常样本或正常受试者中获得的体液或细胞提取物与hPARP2多肽抗体结合，所述正常受试者可以是人，也可以是动物。在已知数量的抗体与已知浓度的纯化hPARP2多肽结合的情况下，标准复合物形成的量可以通过将其与系列稀释的阳性对照进行比较而量化。这样，就可以将正常样本获得的标准值与受试样本获得的值进行比较，如受试者可能受到hPARP2表达相关性疾病或功能紊乱的困扰。标准值与测试值之间的差异说明疾病状态的存在。鉴定hPARP2活性调节子的方法
hPARP2多肽及其具有生物活性的片段，可以在多种药物筛选技术中用来筛选假定的调节化合物。本文应用的术语“调节子”是指一种化合物，作为hPARP2活性的加强剂或拮抗剂。根据本发明，调节子包括活性的变构调节子以及活性的抑制剂。hPARP2的“加强剂”是一种化合物，可以增强或提高hPARP2所有生物功能的活性。这种加强剂的一个示例是增加hPARP2与损伤DNA或多聚ADP-核糖结合能力的制剂。hPARP2的“拮抗剂”是一种化合物，可以减弱或消除hPARP2所有生物功能的活性。这种拮抗剂的一个示例是抗hPARP2抗体。
因此，本发明提供了一种方法，用于筛选与hPARP2多肽具有特异性亲和力的多种测试化合物，包括提供多种测试化合物；在适宜条件下，在充足的结合时间内，将hPARP2多肽与多种测试化合物的每一种进行结合；并检测hPARP2多肽与每种测试化合物的结合，这样就可以鉴定那些可以与hPARP2特异性结合的测试化合物。
本发明还提供了一种鉴定hPARP2多肽生物活性调节子的方法，包括以下步骤a)将化合物与hPARP2多肽接触，b)在适宜生物活性表现的条件下，将步骤a)的混合物与底物孵育，c)测定生物活性的量；以及d)将步骤c)得出的生物活性量与没有与化合物孵育的hPARP2的生物活性量进行比较，因此可以测定该化合物是否刺激或抑制了hPARP2的生物活性。在该方法的一个实施方案中，hPARP2多肽是来自hPARP2非催化区的片段，提供了一种鉴定hPARP2变构调节子的方法。在另一个实施方案中，hPARP2多肽是来自hPARP2催化区的片段，提供了一种鉴定其生物活性抑制剂的方法。
因此，在这些方法中应用的多肽可以自由溶于溶液中，固定于固体支持物，在细胞表面呈现，或位于细胞内。可以测定对活性的调节或对hPARP2多肽与待测试剂之间结合复合物形成的调节。根据本领域众所周知的方法，hPARP2多肽可以进行生化或基于细胞的高产量筛选(HTS)试验，包括研究受体配体相互作用的载黑素细胞试验系统，基于酵母的试验系统，和哺乳动物细胞表达系统[综述见Jayawickreme andKost，Curr Opin Biotechnol 8：629-34(1997)]。自动或小型HTS试验也在考虑之列[如Houston and Banks，Curr Opin Biotechnol 8：734-40(1997)]。
这些HTS试验可以用于筛选化合物文库，鉴定具有所需特征的特定化合物。任何化合物文库都可应用，包括化学文库，天然产物文库，包括随机或设计寡肽、寡核苷酸或其他有机化合物的组合文库。
化学文库可以包括已知化合物，已知化合物的所有结构类似物，或从天然产物筛选鉴定的化合物。
天然产物文库是从天然材料中分类的物质集合，典型的天然材料包括微生物、动物、植物或海洋生物。天然产物可以通过以下方法从源材料中分离，如通过微生物发酵，然后分离并提取发酵肉汤，或从微生物或组织(植物或动物)中直接提取。天然产物文库包括聚酮化合物，非核糖体肽，及其变异体(包括非天然变异体)[综述见Cane et al.，Science282：63-8(1998)]。
组合文库包括以混合物形式存在的大量相关化合物，如肽、寡核苷酸或其他有机化合物。这些化合物可以通过传统自动合成协议、PCR、克隆或所有合成方法相对简单地设计和制备。具体的目标是肽和寡核苷酸组合文库。
其他目标文库还包括肽文库、蛋白质文库、拟态肽文库、多种类似合成集合文库、重组文库和多肽文库[组合化学和因此创建的文库综述见Myers，Curr Opin Biotechnol 8：701-7(1997)]。
一旦化合物经鉴定显示hPARP2功能调节子活性，就可以进行最优化程序，以提高这种活性的力度和/或选择性。这一结构活性关系(SAR)分析典型地包括一系列重复过程，即对化合物结构的选择性修饰和它们与生化或生物活性的相关性。可以设计显示所需活性的相关化合物家族，家族中的某些成员可以作为治疗备选物质。
本发明还包括应用竞争性药物筛选试验，其中，能够与hPARP2多肽结合的中和抗体与测试化合物，与hPARP2多肽特异性竞争性结合。在这种情况下，抗体可用于检测任何化合物的存在，如与hPARP2多肽具有一个或多个相同抗原决定物质的另一种肽。治疗应用hPARP2编码多核苷酸和hPARP2多肽
本发明提供了一种治疗或预防性抑制hPARP2表达或活性的方法。该方法包括应用有效剂量的hPARP2拮抗剂，抑制hPARP2的表达或活性。本发明还提供了一种治疗组织损伤的方法，所述组织损伤来自于坏死或凋亡导致的细胞损伤或死亡，该方法包括给动物应用有效剂量的化合物，抑制hPARP2活性。这一方法还可用于治疗人类疾病，所述疾病的症状或病理是由hPARP2表达或活性介导的。
该方法还可进一步包括应用另一种聚(ADP-核糖)聚合酶活性的拮抗剂，所述另一种活性如与酶PARP1、tankyrase等相关的活性。在本实施方案中适于应用的PARP1拮抗剂示例包括，例如，Banasik et al.，J Biol Chem 267：1569-75(1992)、PCT专利公开WO 99/11623和WO99/11649中所描述的化合物。此外，hPARP2抑制方法还可应用同时拮抗hPARP2和其他具有PARP活性酶的化合物。
本文应用的“治疗”是指在易患动物中预防一种功能紊乱的发生，尽管经诊断该动物尚未患该病；抑制功能紊乱，即使其停止发展；减轻功能紊乱，即导致其消退，或改善功能紊乱，即减轻功能紊乱相关症状的严重程度。“功能紊乱”包括医学功能紊乱、疾病、病况、综合征等，没有限制。
具体地说，本发明的方法还可用于治疗或预防已经或可能罹患炎症紊乱的人。本发明的一个方面源自hPARP2及其功能衍生物与损伤DNA相互作用、传递信号或诱导细胞死亡的能力。没有任一理论限制，目前认为，因为炎症涉及的过程可能损伤DNA，而在这样的条件下，hPARP2可能不适宜地诱导细胞死亡，因此，hPARP2拮抗剂可以用来抑制炎症相关性损伤。
本文应用的“炎症紊乱”可以指任意一种疾病、功能紊乱或综合征，其中，过激或不受调控的炎症应答导致严重的炎症症状，宿主组织损伤，或组织功能丧失。“炎症紊乱”还可以指由于白细胞和/或中性粒细胞在趋化作用下的流入而介导的病理状态。
本文应用的“炎症”是指由组织损伤或破坏引起的局部保护性反应，可以破坏、稀释或屏蔽(隔绝)损伤物质和损伤组织。应该指出，炎症与在趋化作用下涌入的白细胞和/或中性粒细胞有关。炎症可以由病原微生物和病毒引起的感染导致，也可通过非感染性途经导致，如创伤或心肌梗塞或脑卒中后再灌注，对异体抗原的免疫应答，以及自身免疫反应。因此，与本发明有关的炎症紊乱包括与特异性防御系统反应或非特异性防御系统反应相关的功能紊乱。
本文应用的术语“特异性防御系统”是指与特异性抗原发生反应的免疫系统组分。由特异性防御系统导致的炎症的示例包括对异体抗原的经典反应，自身免疫性疾病，以及T细胞介导的迟发性超敏反应。慢性炎症性疾病，对实体移植组织或器官的排斥反应，如肾脏和骨髓移植，以及移植物抗宿主病(GVHD)也是特异性防御系统炎症反应的示例。
本文应用的术语“非特异性防御系统”是指由不具有免疫记忆的白细胞(如粒细胞，巨噬细胞)介导的炎症紊乱。至少部分由非特异性防御系统反应导致的炎症示例包括与下述疾病相关的炎症，如成人(急性)呼吸窘迫综合征(ARDS)或多器官损伤综合征；再灌注损伤；急性肾小球肾炎；反应性关节炎；急性炎症性组分导致的皮肤病；急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎症紊乱如脑卒中；热损伤；炎症性肠病；粒细胞输注相关性综合征；以及细胞因子诱导的毒性。
本文应用的“自身免疫性疾病”是指任意一组疾病，其中，组织损伤与体液或细胞介导的对机体自身成分的反应有关。本文应用的“过敏性疾病”是指由过敏导致的任何综合征、组织损伤或组织功能丧失。本文应用的“关节炎性疾病”是指由多种原因导致的、以关节炎症性损害为特征的任何一种疾病。本文应用的“皮炎”是指一大类皮肤病中的任意一种，该类皮肤病由多种原因导致，以皮肤炎症为特征。本文应用的“移植物排斥反应”是指针对移植组织(包括器官或细胞(如骨髓))的任何免疫反应，其特征是移植或周围组织的功能丧失、疼痛、肿胀、白细胞增多或血小板减少。
本发明治疗方法包括改善与炎症细胞激活相关的功能紊乱的方法。“炎症细胞激活”是指由刺激(包括但不限于细胞因子、抗原或自身抗体)诱导的细胞增殖反应，可溶性介质的产生(包括但不限于细胞因子、氧基、酶、前列腺素类化合物或血管活性胺)，或在炎症细胞(包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、粒细胞(多形核白细胞包括中性粒细胞、嗜碱细胞和嗜酸细胞)、肥大细胞、树突细胞、Langerhans细胞和内皮细胞)表面表达新的介质或介质表达量增加(包括但不限于主要组织相容性抗原或细胞粘附分子)。本领域技术人员指出，在这些细胞中一种或多种表型的联合激活，可能导致了炎症紊乱的发生、持续存在或恶化。
本发明方法能够治疗多种疾病，如关节炎性疾病，如类风湿关节炎、骨关节炎、痛风关节炎、脊柱炎；Behcet病；脓毒血症，感染性休克，内毒素性休克，革兰阴性菌脓毒血症，革兰阳性菌脓毒血症，以及中毒性休克综合征；继发于败血症、创伤或出血的多器官损伤综合征；眼部疾病如过敏性结膜炎，春季结膜炎，葡萄膜炎，甲状腺相关性眼病；嗜酸性粒细胞肉芽肿；肺或呼吸系统疾病如哮喘，慢性支气管炎，过敏性鼻炎，ARDS，慢性肺炎症性疾病(如慢性阻塞性肺病)，硅肺，肺结节病，胸膜炎，齿槽炎，脉管炎，肺炎，支气管扩张和肺氧毒性；心肌、脑或四肢的再灌注损伤；纤维化如囊性纤维化；瘢痕疙瘩形成或瘢痕组织形成；动脉硬化；自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮(SLE)，自身免疫性甲状腺炎，多发性硬化，某些类型的糖尿病，和雷诺综合征；移植排斥反应如GVHD和同种移植物排斥反应；慢性肾小球性肾炎；炎症性肠病如局限性回肠炎，溃疡性结肠炎和坏死性小肠结肠炎；炎症性皮肤病如接触性皮炎，遗传性过敏性皮炎，银屑病或风疹；感染导致的发热和肌痛；中枢或外周神经系统炎症性疾病如脑膜炎，脑炎，由于轻微损伤导致的脑、脊髓损伤；Sjogren’s综合征；涉及白细胞渗出的疾病；酒精性肝炎；细菌性肺炎；抗原抗体复合物介导的疾病；低血容量性休克；I型糖尿病；急性和迟发性过敏反应；由于白细胞不调或转移导致的疾病状态；热损伤；粒细胞输注相关性综合征；以及细胞因子诱导的毒性。
本方法还可用于治疗已经经历或可能经历再灌注损伤的人，再灌注损伤即组织经历一段时间缺血后再灌注导致的损伤。术语“缺血”是指由于动脉血流阻塞导致的局部组织贫血。短暂缺血后的再灌注可以特征性导致中性粒细胞激活，并通过血管壁内皮细胞进入受累区域。激活中性粒细胞的不断累积反过来导致反应性氧代谢，进一步损伤受累组织或器官。这一“再灌注损伤”现象通常与以下病况有关，如血管性脑卒中(包括全脑缺血和局灶性缺血)，出血性休克，心肌缺血或心肌梗塞，器官移植，以及脑血管痉挛。例如，再灌注损伤会在下述情况下发生，如在心脏搭桥术后或心脏搏动停止期间，即在心脏停止血液供应后开始再灌注时。在这些情况下，抑制hPARP2表达或活性预期可以导致再灌注损伤的减轻。
关于神经系统，全脑缺血可以在全脑血液供应停止一段时间的情况下发生。心脏停止搏动也可导致全脑缺血。当大脑的某部分正常血液供应停止后，可以发生局灶性缺血。脑血管血栓阻塞、创伤性脑损伤、水肿或脑肿瘤可以导致局灶性脑缺血。即使是短暂的脑缺血，包括全脑性缺血和局灶性缺血，也可导致广泛的神经元损伤。尽管神经组织损伤发生在缺血开始后的数小时或甚至数日，一些神经组织的永久损伤可能在大脑停止血供后开始的几分钟就发生了。这种损伤大部分是由于谷氨酸酯的毒性和继发组织再灌注，如由损伤内皮细胞释放的血管活性产物，以及由损伤组织释放的毒性产物，如自由基和白三烯。
缺血还可发生于心脏的心肌梗塞和其他导致冠状动脉阻塞的心血管疾病，冠状动脉阻塞可由动脉硬化、血栓形成或血管痉挛导致。例如，相信本发明方法可用于治疗心肌组织损伤，特别是哺乳动物中由于心肌缺血或再灌注导致的损伤。
本发明还提供一种治疗神经系统功能紊乱的方法，包括应用神经保护性剂量的hPARP2拮抗剂。可应用本发明方法治疗的神经系统功能紊乱包括如由于物理损伤或疾病导致的外周神经病；头部创伤如创伤性脑损伤，脊髓物理损伤，脑卒中相关性脑损伤，如与血管性脑卒中相关的缺氧和脑损伤，全脑性或局灶性脑缺血，以及脑再灌注损伤；脱髓鞘疾病如多发性硬化，以及与神经变性相关的神经系统功能紊乱。神经系统功能紊乱的示例进一步包括但不限于，三叉神经痛；舌咽神经痛；Bell’s瘫痪；重症肌无力；肌营养不良；肌萎缩性(脊髓)侧索硬化(ALS)；进行性肌萎缩；遗传性进行性延髓肌萎缩；herniated，ruptured orprolapsed invertebrate disk symdrome；颈椎关节强直；神经丛功能紊乱；胸腔出口综合征；周围神经病，如由铅、氨苯砜、扁虱、卟啉症或格林巴利综合征导致的周围神经病；Alzheimer’s病；Huntington’s病和帕金森病。术语“神经变性疾病”包括Alzheimer’s病，帕金森病，Huntington’s病和ALS。
本文应用的“神经保护性”是指能够减轻、停止或改善神经侵害的效果，或者是指能够保护、复苏或恢复受到神经侵害的神经组织的效果。
本文应用的“神经组织”是指构成神经系统的多种组分，包括但不限于神经元，神经支持细胞，Schwann神经胶质细胞，这些结构包括的脉管系统，或者支持这些结构的脉管系统，中枢神经系统，脑，脑干，脊髓，中枢神经系统和外周神经系统的连接部分，外周神经系统，以及所有关联结构。
本文应用的“神经侵害”是指任何对于神经组织的损伤，以及由此导致的任何神经失能或死亡。导致神经侵害的原因可以是代谢性、毒性、神经毒性、医源性、热或化学性损伤，包括但不限于血管脑卒中，全脑或局灶性脑缺血，缺氧，脑血管意外，创伤，手术，压力，质量效应，出血，放射，血管痉挛，神经变性疾病，感染，帕金森病，ALS，髓鞘形成/脱髓鞘疾病，癫痫，认知障碍，谷氨酸酯异常及其继发影响。
“预防神经变性”包括预防患者变性的能力，所述患者已确诊罹患神经变性疾病，或者该患者有罹患神经变性疾病的风险。该术语还包括在已经罹患神经变性疾病或具有神经变性疾病症状的患者中，预防神经变性的进一步发展。
本文应用的“神经功能”是指神经系统的多种功能，包括提供机体内部和外部环境的认知，并使对多种感受的主动和反射活动成为可能。机体的结构元件、以及机体对环境反应的平衡发生了变化。
根据本发明，还提供了一种方法，包括给人应用hPARP2拮抗剂，应用剂量足以影响神经元功能，特别是不通过NMDA神经毒性介导的拮抗剂。这些神经元活性可能包括刺激损伤的神经元，促进神经元再生，预防神经变性，并治疗神经系统功能紊乱。
本发明还涉及治疗动物心血管功能紊乱的方法，包括给动物应用治疗有效剂量的抑制hPARP2活性的化合物。本文应用的“心血管功能紊乱”是指任何可以导致心脏缺血或由心脏再灌注导致的功能紊乱。示例包括但不限于冠状动脉性疾病，心绞痛，心肌梗塞，由心脏停止搏动导致的心血管组织损伤，由心脏搭桥导致的心血管组织损伤，心源性休克，以及本领域一般技术人员熟知的相关病况，或者涉及心脏或脉管系统的功能障碍或组织损伤，特别是，但不限于与PARP激活相关的组织损伤。本发明方法在治疗急性形式的上述心血管功能紊乱时特别有益。
本发明还涉及治疗动物肿瘤组织，如癌症，生长的方法，包括给动物应用治疗有效剂量的抑制hPARP2活性的化合物。在本实施方案中，该方法可能还包括同时给予化疗或抗肿瘤药物治疗和/或放疗。
瘤或肿瘤包括组织新生，在此过程中，细胞不受控制地进行性扩增。这种生长一些是良性的，但其他是“恶性的”，可以导致机体的死亡。恶性肿瘤或“癌症”与良性增生的区别在于，癌症除了快速细胞增殖外，还侵犯周围组织，并转移。而且，恶性肿瘤的特征在于它们显著丧失分化特性(表现为显著“未分化”)，同时丧失彼此之间、及与周围组织之间的相对组织结构。这一特征又称为“间变”。
可以应用本发明治疗的肿瘤包括实体肿瘤，即癌和肉瘤。癌包括那些源自上皮细胞的恶性肿瘤，趋向于周围组织浸润(侵犯)和转移。腺癌是源自腺组织的癌，或者肿瘤细胞形成可识别的腺结构。另一大类癌症包括肉瘤，肉瘤细胞通常存在于纤维或均质物质中，如胚胎结缔组织。本发明还能够治疗骨髓或淋巴系统的癌症，包括白血病，淋巴瘤和其他癌症，所述癌症不呈现典型的肿瘤实体，而是广泛分布于血管或淋巴网状系统。
根据本发明可以治疗的癌症或肿瘤细胞类型包括，例如，产ACTH肿瘤，急性淋巴细胞性白血病，急性非淋巴细胞白血病，肾上腺皮质肿瘤，膀胱癌，脑癌，乳腺癌，宫颈癌，慢性淋巴细胞白血病，慢性髓细胞白血病，结直肠癌，皮肤T细胞淋巴瘤，子宫内膜癌，食管癌，Ewing’s肉瘤，胆囊癌，毛细胞白血病，头颈部肿瘤，何杰金淋巴瘤，Kaposi’s肉瘤，肾癌，肝癌，肺癌(小细胞和非小细胞)，恶性腹水，恶性胸水，黑色素瘤，间皮瘤，多发性骨髓瘤，成神经细胞瘤，神经胶质瘤，非何杰金淋巴瘤，骨肉瘤，卵巢癌，卵巢(生殖细胞)癌，胰腺癌，阴茎癌，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，皮肤癌，软组织肉瘤，鳞细胞癌，胃癌，睾丸癌，甲状腺癌，滋养细胞肿瘤，子宫癌，阴道癌，外阴癌，以及Wilm’s肿瘤。
本发明还涉及肿瘤细胞的放射致敏作用。本文应用的术语“放射致敏剂”定义为一种分子，优选低分子量分子，当给予人类或其他动物有效治疗剂量的该分子时，可以增加细胞对电磁辐射的敏感性和/或促进可以应用电磁辐射治疗的疾病的疗效。应用电磁辐射可以治疗的疾病包括肿瘤性疾病，良性和恶性肿瘤，以及肿瘤细胞。本文没有列出的其他可以应用电磁辐射治疗的疾病也在本发明考虑之列。本文应用的术语“辐射”包括但不限于电磁辐射，波长范围为10-20-100米。本发明优选实施方案采用γ射线(米)，X射线(10-12-10-9)，紫外线(10nm-400nm)，可见光(400nm-)，红外线(700nm-1.0mm)，或微波辐射(1.0mm-30cm)。
已知放射致敏剂可以增加肿瘤细胞对电磁辐射毒性作用的敏感性。在文献中描述了几种放射致敏剂的作用机制，包括：缺氧细胞放射致敏剂(如2-硝基咪唑化合物，以及苯并三嗪二氧化合物)可以促进缺氧组织的再次氧供应和/或催化有害的氧自由基的产生；非缺氧细胞放射致敏剂(如卤代嘧啶)可以作为DNA碱基类似物，优先整合到肿瘤细胞DNA中，并因此促进离子诱导的DNA分子辐射断裂和/或预防正常DNA修复机制；其他多种可能的作用机制也假定，放射致敏剂可以用于疾病的治疗。
目前，很多癌症治疗协议都采用通过X线电磁辐射激活的放射致敏剂。X线激活的放射致敏剂示例包括但不限于以下物质：甲硝唑，甲氧甲基硝基咪唑乙醇，desmethylmisonidazole，pimonidazole，etanidazole，nimorazole，丝裂霉素C，RSU 1069，SR 4233，EO9，RB 6145，烟碱，5-溴脱氧尿嘧啶(BUdR)，5-碘脱氧尿嘧啶(IUdR)，溴脱氧胞嘧啶，氟脱氧尿嘧啶(FudR)，羟基脲，顺铂，及其治疗有效的类似物和衍生物。
肿瘤的光力学治疗(PDT)采用可见光作为致敏剂的放射激活剂。光力学放射致敏剂的示例包括但不限于：血卟啉衍生物，Photofrin，苯并卟啉衍生物，Npe6，锡本卟啉(SnET2)，pheoborbide-a，细菌叶绿素-a，naphthalocyanines，酞菁染料，锌酞菁染料，及其治疗有效的类似物和衍生物。
放射致敏剂还可以与其他治疗有效剂量的一种或多种化合物联合应用，其他化合物包括但不限于：促进放射致敏剂整合到靶细胞中的化合物；对肿瘤有治疗作用的化疗药物，合并或不合并放疗；或其他可以有效治疗肿瘤或其他疾病的化合物。可以与放射致敏剂联合应用的其他治疗药物示例包括但不限于：5-氟尿嘧啶，甲酰四氢叶酸，5’-氨基-5’-脱氧胸腺嘧啶氧，卡波金，红细胞输注，全氟碳(如Fluosol-DA)，2，3-DPG，BW12C，钙通道阻滞剂，己酮可可碱，抗血管生成化合物，肼苯哒嗪和L-BSO。可以与放射致敏剂联合应用的化疗药物示例包括但不限于：阿霉素，喜树碱，卡铂，顺铂，正定霉素，docetaxel，阿霉素，干扰素(α，β，γ)，白细胞介素2，irinotecan，紫杉醇、托普替堪，及其治疗有效的类似物和衍生物。
本发明还涉及在下述方法中应用hPARP2拮抗剂：
a)治疗或预防组织损伤，所述组织损伤来自于坏死或凋亡导
  致的细胞损伤或死亡，与之相关的病况和疾病包括但不限于肾
  功能衰竭，恶病质，视网膜缺血，皮肤老化，骨关节炎，骨质
  疏松，慢性疼痛，急性疼痛，神经性疼痛，肌营养不良或其他
  涉及复制衰退的骨骼肌变性疾病，年龄相关性视网膜黄斑变
  性，AIDS和其他免疫能力减退的疾病，以及癌症；
b)延长细胞的预期寿命和增殖能力；
c)改变衰老细胞的基因表达，如增加细胞特异性青春基因表
  达和/或降低衰老细胞特异性基因表达，来延长或增加细胞的预
  期寿命和增殖能力；以及
d)治疗由细胞衰老诱导或加重的疾病或病况，如皮肤老化。
本发明提供的hparp2多核苷酸还可用于治疗性应用，如应用这些多核苷酸治疗本文描述的疾病和功能紊乱，所述疾病和功能紊乱的病因涉及hPARP2表达或激活。例如，hparp2反义分子可能为治疗多种异常病况提供了基础，所述病况涉及聚(ADP-核糖)聚合酶活性过量或不欲表达。此外，编码hparp2的多核苷酸序列可能为治疗多种异常病况提供了基础，所述病况涉及聚(ADP-核糖)聚合酶活性的不足。
可以应用来自逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒或牛痘病毒，或者细菌质粒的表达载体，将重组hparp2正义或反义分子导入靶细胞。可以应用本领域技术人员熟知的方法构建含有hparp2的重组载体[见，例如Sambrook et al.，supra，and Ausubel et al.，supra]。此外，重组hparp2还可应用脂质体导入靶细胞。
全长cDNA序列，和/或其调控元件，使研究人员可以应用正义[Youssoufian and Lodish，Mol Cell Biol 13：98-104(1993)]或反义[Eguchiet al.，Annu Rev Biochem 60：631-52(1991)]hparp2多核苷酸作为工具，研究基因功能。可以应用根据从基因组DNA获得的cDNA或调控序列设计的寡核苷酸，体外或体内抑制表达。这些技术是本领域众所周知的，而且正义或反义寡核苷酸或更大片段可以沿编码或调控区的多个位点进行设计。
此外，可以通过应用表达载体转染细胞或组织来调节hPARP2表达，所述表达载体在优选阻断hPARP2生物活性的情况下，可以表达高水平hparp2多核苷酸。这些携带不可翻译的正义或反义序列的构建物充满细胞。即使在未能整合到DNA的情况下，这些载体也可以持续转录RNA分子，直至所有拷贝的载体都在内源性核酸酶的作用下失能。通过应用非复制载体或整合了适宜复制元件的载体，可以达到暂时表达的目的。
将载体导入细胞或组织的方法包括本文论及的那些方法。此外，几种转化或转染方法也同样适用于活体外治疗。而且，本文披露的hparp2多核苷酸序列还可用于尚未开发的分子生物学技术，这些新技术有赖于目前已知的核苷酸序列性质，这些性质包括但不限于，如遗传密码三个一组，以及碱基对的特异性相互作用。药用组合物
本发明还涉及药用组合物，所述组合物包括一种具有活性的化学或生物化合物(制剂)以及生物兼容的药用载体、佐剂或介质，所述化学或生物化合物是hPARP2表达或活性的调节子。药用组合物中的活性制剂可以选自全部或部分hparp2多核苷酸序列，hparp2反义分子，hPARP2多肽，蛋白，肽或hPARP2生物活性的有机调节子，如抑制剂、拮抗剂(包括抗体)或类似物。优选地，该制剂具有治疗疾病的活性，所述疾病通过hPARP2表达或激活介导，或者以hPARP2表达或激活为特点。组合物可以包括该制剂作为唯一活性部分，也可以包括该制剂与其他核苷酸序列、多肽、药物或激素，并与赋形剂或其他药用载体混和。
制备和应用药用组合物的技术见Remington’s PharmaceuticalSciences，18thEd.，Mack Publishing Co，Easton PA，1990。本发明药用组合物可以应用传统方法生产，如混和、溶解、制粒、包裹糖衣、水磨制粉、乳化、装入胶囊、俘获、熔融纺丝、喷雾干燥、或冻干方法。但是，本领域技术人员应根据药物使用方法和所需剂量，决定最优化药物制备方法。这些制备方法可能影响所用药物的物理状态、稳定性、体内释放率和体内清除率。根据将要治疗的疾病状况，这些药用组合物可以系统应用，也可局部应用，可以制备成系统应用的形式，也可制备成局部应用的形式。
药用组合物可以通过任何一种传统方法给予受试者，这些方法包括肠外应用和肠内应用技术。肠外应用方式包括那些通过胃肠道以外途经给予组合物的方法，例如，静脉内、动脉内、腹腔内、髓内、肌内、关节内、鞘内和心室内注射。肠内给药方式包括，例如口服(包括口腔和舌下)和直肠给药。经上皮给药方式包括，例如经粘膜给药和经真皮给药。经粘膜给药包括，例如肠道给药以及经鼻、吸入和肺内深部给药；阴道给药；以及直肠给药。经真皮给药包括被动或主动经真皮或经皮方式，包括例如，膏药、离子电渗疗法装置以及糊剂、药膏或油膏的局部外用。外科技术包括植入补给(储备)组合物、渗透泵等。治疗炎症的优选给药途经是，如果炎症是局部炎症，如关节炎，可以通过局部或外用给药方式给药；如果是再灌注损伤或系统性疾病，如败血症，可以通过静脉内给药方式给药。
药用组合物可以制备成含有适宜的药用载体，并可选地包括赋形剂和辅助剂，所述赋形剂和辅助剂使活性化合物制成可以药用的制剂的过程更加容易。给药方式通常会决定载体的性质。例如，应用肠外方式给予的制剂应包括以水溶形式存在的活性化合物水溶液。用于肠外给药的适宜载体可以选自盐水、缓冲盐溶液、葡萄糖、水和其他生理可兼容溶液。用于肠外给药的优选载体是生理可兼容缓冲液，如Hank’s溶液，Ringer’s溶液，或生理缓冲盐水。对于组织或细胞应用，可以在制剂中应用能够穿过特定屏障的适宜渗透剂。这些渗透剂在本领域是众所周知的。对于含有蛋白质的制剂，配方应包括稳定物质，如多羟基化合物(如蔗糖)和/或表面活性剂(如非离子表面活性剂)等。
此外，肠外应用的制剂还可包括活性化合物的悬液，制备成适于注射的油性悬液。适宜的亲脂溶剂或载体包括脂肪油，如芝麻油，以及合成脂肪酸酯，如油酸乙酯，或甘油三酯，或脂质体。水溶性注射悬液可以包括增加悬液粘性的物质，如羧甲基纤维素钠，山梨醇，或右旋糖苷。可以选择地，该悬液还可以包括适宜的稳定剂或增加化合物溶解性的物质，这样，制出的制剂可以是高浓度溶液。还可应用乳剂，如水包油或油包水制剂，可以选择性应用乳化剂或分散剂(表面活性物质，表面活性剂)使其稳定。含有活性物质的脂质体也可用于肠外给药。
此外，含有适于口服剂量的活性物质的药用组合物可以应用本领域熟知的药用载体进行制备。制成口服的制剂可以是片剂、丸剂、胶囊、扁形胶囊剂、糖衣剂、锭剂、液体、凝胶、糖浆、浆、悬液或粉剂。例如，制备口服应用的药用制剂可以包括以下过程，混和活性化合物与固体赋形剂，可选择性研磨该混合物，然后将化合物制粒，如果需要，在加入适宜辅助剂后，可以获得片剂或糖衣剂的核心。需要指出，口服制剂也可以应用液体载体，其类型与那些肠外应用的描述相似，如缓冲水溶液、悬液等。
优选的口服制剂包括片剂、糖衣剂和凝胶胶囊。这些制剂可以包括一种或多种赋形剂，所述赋形剂包括但不限于：
a)稀释剂如糖类，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；
b)结合剂如硅酸镁铝，玉米、小麦、水稻、马铃薯淀粉等；
c)纤维素物质如甲基纤维素，羟丙甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，
  聚乙烯吡咯烷酮，树胶如阿拉伯树胶和黄芪胶，以及蛋白质如
  白明胶和胶原；
d)分解剂或增溶剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮，淀粉，琼脂，褐藻
  酸或其盐类、如褐藻酸钠，或泡腾组分；
e)润滑剂如硅土，滑石，硬脂酸或其镁盐、钙盐，以及聚乙烯二
  醇；
f)食用香料和甜料；
g)着色剂或色素，如为鉴定产品或表现活性化合物量(剂量)的
  特征；以及
h)其他成分如防腐剂，稳定剂，膨胀剂，乳化剂，溶解启动剂，
  调节渗透压的盐类以及缓冲液。
凝胶胶囊包括由白明胶制成的推入配合胶囊，以及由白明胶制成的软密封胶囊，外被如甘油或山梨醇衣。推入配合胶囊可以含有(多种)活性成分，以及填充剂、结合剂、润滑剂和/或稳定剂等。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮于适宜的液体中，如脂肪油，液体石蜡，或液体聚乙烯二醇，可以含有稳定剂，也可以不含稳定剂。
糖衣核心可以外被适宜的衣，如浓缩糖溶液，该溶液还可包括阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol胶、聚乙烯二醇和/或二氧化钛、漆用溶液以及适宜的有机溶剂或溶剂混合物。
药用组合物还可以活性物质的盐的形式提供，可以与很多种类的酸作用形成，所述酸包括但不限于盐酸，硫酸，醋酸，乳酸，酒石酸，苹果酸，琥珀酸等。盐类在水或其他质子溶剂中更易溶解，所述溶剂是相应的自由碱形式。
为了达到调节中枢神经系统的有效治疗目的，用于本发明方法中的物质在外周给药时，应该能够穿过血脑屏障。这些药物代谢动力学和药效学信息可以通过体外和体内的临床预试验获得，最终在人类临床试验中获得确证。因此，用于本发明方法的任意化合物，其治疗有效剂量可以从最开始的生化和/或基于细胞的试验结果来估算。然后，将剂量应用于动物模型，获得调节hPARP2表达或活性所需的循环浓度范围。在进行人类试验时，还会出现有关治疗多种疾病和病况的适宜剂量水平和疗程的其他信息。
这些化合物的毒性和治疗有效性可以通过在细胞培养或实验动物中进行的标准药理试验进行测定，如测定LD50(50％的致死剂量)和(50％治疗有效剂量)。毒性和治疗有效性的剂量比为“治疗指数”，典型的表达方式为LD50/ED50。优选治疗指数大的化合物。从这些细胞培养试验和其他动物研究中获得的数据可以用于换算人类应用的剂量范围。这些化合物的剂量优选位于循环浓度范围之内，所述循环浓度包括没有毒性或毒性很小的ED50。
对本发明方法来说，可以应用任何调节给药时间和剂量顺序的有效给药方案。制剂剂量优选包括药物剂量单位，该单位含有有效量的制剂。本文应用的“有效量”是指通过给予受试者一剂或多剂药物剂量单位，得到的足以调节hPARP2表达或活性的剂量，和/或在受试者中获得可以测量的生理参数改变的剂量。
人类受试者应用的示例剂量水平大约为0.001mg活性物质/kg体重(mg/kg)-100mg/kg。典型地，根据适应证、给药途经等，活性物质剂量单位包括大约0.01mg-10,000mg，优选0.1mg-1,000mg。根据给药途经，适宜的剂量可以根据体重、体表面积或器官大小来计算。最终的剂量方案应由主治医生在综合考虑良好的医疗实践、多种可能修饰药物作用的因素后决定，所述多种可能修饰药物作用的因素如物质的特异活性、疾病的严重程度、患者的反应性、患者的年龄、疾病状态、体重、性别、患者的饮食、任何感染的严重程度等。其他应该考虑的因素还包括给药时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗的耐受性/反应。涉及本文述及的制备过程中对治疗适宜剂量的进一步细微修饰，可以由本领域技术人员按常规进行，特别是按照公开的剂量信息和方法，以及在人类临床试验中得到的药物代谢动力学数据。适宜的剂量可以应用已经建立的试验方法以及剂量反应数据确认，所述试验方法可以测定物质在体液或其他样本中的浓度。
给药频率有赖于制剂的药物代谢动力学参数和给药途经。应用的剂量和给药方法应该调整到可以保证活性部分的充足水平或可以维持所需效果。因此，为了维持制剂所需的最低水平，药物组合物可以单剂给药，多次分散给药，连续输注，储备持续释放，或联合应用上述方法。短效药用组合物(即半衰期短)可以每日给药一次，也可每日给药多次(如每日两次、三次或四次)。长效药用组合物可以每3-4天、每周或每两周给药一次。优选给药泵连续输注，所述给药泵如皮下、腹腔内或硬膜下泵。
存在于药用载体中的含有本发明化合物的组合物可以在适宜的容器中制备、储存，并可贴上标签用于治疗某种适应疾病。在标签上标示的适应疾病可包括治疗炎症性疾病，肿瘤，神经组织损伤等。试剂盒也在考虑之列，其中，试剂盒包括一个剂量形式的药物组合物和一张产品说明书，说明书上包括在治疗疾病时，该组合物的用法说明。
提供的下述实施例有助于进一步理解本发明。实施例中所用的具体材料和条件只是为了示例本发明的某些方面，不应认为是对本发明合理范围的限制。
这些实施例假设，本领域一般技术人员理解那些众所周知的传统方法，这些方法是实施例采用的，如构建载体和质粒，将编码多肽的基因插入这些载体和质粒，或将载体或质粒导入宿主细胞。这些方法在多篇文献中有详细描述，如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Ausubel et al.，(Eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.(1994)；and Ausubel et al.，(Eds.)，Short Protocols in Molecular Biology，4thed.，John Wiley & Sons，Inc.(1999)。
实施例1鉴定人EST相关鼠parp2
应用鼠parp2核苷酸序列[国立生物技术信息中心(NCBI)GenBank准入号AJ007780(序列22)]，搜索NCBI表达序列标签(EST)数据库，研究与鼠PARP2基因同源的人类基因存在的可能性。EST数据库提供源于多种组织的cDNA克隆的5’和/或3’核苷酸序列。可以应用NCBI BLASTn(基础局部排列搜索工具——核苷酸)程序，将可疑鼠PARP2核苷酸序列与核苷酸序列数据库进行比较，并在人EST序列数据库中鉴定与鼠PARP2显著同源的DNA序列。这一BLASTs搜索鉴定了一个克隆自人类结肠的EST序列，并被命名为AA568817(序列3)。与鼠parp2核酸序列同源的EST区域被鉴定。特别是AA568817的119-284核苷酸与鼠parp2的1536-1701核苷酸的反义互补序列基本同源，166个核苷酸中有150个完全相同(90％一致)。而且，AA568817反义链的128-283核苷酸决定的氨基酸序列，相当于鼠PARP2蛋白(序列23)包括508-559氨基酸(aa508-559)的区域，其中，蛋白质在52个氨基酸位点上，有48个完全相同(92％一致)。
为了鉴定源于相同基因的其他EST序列，应用AA568817和NCBIUniGene程序，在GenBank数据库中进行检索。UniGene程序将GenBank序列组合成非冗余系列基因导向簇，每个簇含有来自相同基因的一组序列。应用AA568817和UniGene，在人类GenBank数据库中鉴定了34个属于相同基因簇AA568817的人类EST序列。这些人类ESTs中被命名为R28358的一个序列(序列4)，克隆自人类胎盘，并含有源自I.M.A.G.E(基因组表达联盟整合分子分析)克隆的命名为133650的3’序列。I.M.A.G.E是由Lawrence Livermore NationalLaboratory(Livermore，CA)协作的联盟，致力于cDNAs序列分析，并使分析结果可以通过美国典型培养物保藏中心(ATCC；Rockville，MD)公开获得。应用R28358检索ATCC数据库，鉴定了EST R28562(序列5)，作为I.M.A.G.E克隆133650的5’序列。
比较R28358与鼠parp2反义序列。发现R28358的nt110-240与鼠parp2的nt1563-1692显著同源(128个核苷酸中有108个完全相同；84％一致)。翻译R28358(nt110-160)的反义链，将预计蛋白与鼠PARP2蛋白比较(nt1642-1692，翻译成aa543-559)。比较后发现，两种蛋白在17个相应氨基酸位点上有16个相同(94％一致)。
比较R28562与鼠parp2发现，R28562的核苷酸4-186与鼠parp2nt952-1134具有同源性(183个核苷酸中有159个相同；84％一致)。当R28562 nt4-186翻译后，将预计蛋白与鼠PARP2蛋白的相应区域进行比较(nt952-1134，翻译成aa313-373)，发现，两种蛋白在61个相应氨基酸位点上有54个相同(89％一致)。
实施例2分离全长hPARP2编码多核苷酸
为了克隆人hparp25’端，应用人类MarathonTM-Ready脾脏和睾丸cDNA文库(Clontech)作为模板进行5’RACE分析。合成与EST R28562(序列6)反义链相对应的引物，并与AP1引物(Clontech，序列7)共同用于聚合酶链反应，所述AP1引物被设计成与MarathonTMcDNA接头(adapter)退火，所述接头连接于cDNA文库末端。
R28562反义链
GTGTTGGTCCAATGGGTGTTCTGGGCTTTGTAGCTCTG(序列6)
AP1  CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC(序列7)
PCR反应包括5uL人脾脏或睾丸MarathonTM-Ready cDNA，20uM每种引物，0.20mM dNTPs，1×PCR缓冲液，以及1uL AdvantagecDNATaq聚合酶混合物(Clontech)。反应在GeneAmp系统9700PCR仪(PEApplied Biosystems，Norwalk，CT)上进行，包括以下4个步骤：1)94℃1分钟，1轮；2)94℃ 30秒，5轮，72℃ 4分钟；3)94℃ 30秒，5轮，70℃ 4分钟；以及4)94℃ 30秒，25轮，60℃ 4分钟。根据生产厂商说明书，应用凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)分离被命名为5’-hPARP2的PCR片段。
根据生产厂商说明书，将5’-hPARP2直接克隆到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)上。由于Taq聚合酶的错误率为8.0×10-6突变/碱基对[Cline et al.，Nucleic Acids Res 24(18)：3546-51(1996)]，因此，需要对4个独特克隆进行序列分析、比较，以消除5’-hPARP2序列中由Taq聚合酶诱导的错误可能性。这4个克隆通过它们不同的长度来测定其独特性。这4个克隆的长度差异提示，他们扩增来自MarathonTM文库的独特克隆。
应用引物对5’-hPARP2的4个独特克隆进行序列分析，所述引物可以与载体DNA杂交：
M13前导引物  TGTAAAACGACGGCCAGT(序列8)
M13反转引物  GGAAACAGCTATGACCATG(序列9)
设计与cDNA序列退火的引物：
3-P2-SEQ1  GGCTGTACACTCTGGGTCCACAGGAGC(序列10)
3-P2-SEQ2  CTTCCATGAGAGCTCGTCCATGCTGGCC(序列11)
5-P2-SEQ2  GGCCAGCATGGACGAGCTCTCATGGAAG(序列12)
这4个独立核苷酸序列被编辑整合成一个被命名为5’-hPARP2的共有核苷酸序列(序列13)。在5’-hPARP2的共有核苷酸序列中，每个相应位置的碱基对出现在4个独特克隆中的3个中，除了共有序列的625、632和881核苷酸，它们只在4个独特克隆中的2个中出现。
为了证实5’-hPARP2共有序列中的625、632和881核苷酸是正确的，进行了两次分离的PCR反应，应用MarathonTM-Ready人类睾丸cDNA文库(Clontech)作为模板。在上述条件下，应用与5’-hPARP2正义链对应的引物(5-P2-序列1，序列14)以及与EST R28358(命名为hPARP2L1(序列15))和hPARP2L2(序列16)相对应的引物进行PCR反应。
5-P2-SEQ1  GCTCCTGTGGACCCAGAGTGTACAGCC(序列14)
hPARP2L1  ACATTCACCACAGCTGAAGG(序列15)
hPARP2L2  CCACAGCTGAAGGAAATTAAAC(序列16)
根据生产厂商说明书，应用凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)分离被命名为P2-1(应用5-P2-序列1和hPARP2 L1扩增)和P2-9(应用5-P2-序列1和hPARP2L2扩增)的PCR片段。
根据生产厂商说明书，将P2-1和P2-9直接克隆到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)上。然后应用能够与载体DNA杂交的M13前导引物和M13反转引物(分别为序列8和9)对P2-1和P2-9进行序列分析，并且，P2-1和P2-9的部分序列分别如序列17和序列18所示。5’-hPARP2共有序列中的625、632和881核苷酸经测定存在于克隆P2-1和P2-9中(分别为核苷酸267、274和523)，因此，共有序列中的核苷酸是正确的。经测定，5’-hPARP2具有一个始于核苷酸63的开放阅读框架(ORF)，共有1080个核苷酸。从5’-hPARP2核苷酸63-1142推导出的氨基酸序列如序列19所示。
为了克隆人hparp2的3’端，应用人类MarathonTM-Ready睾丸cDNA文库(Clontech)作为模板进行两次分离的PCR反应。在上述条件下，应用与5’-hPARP2正义链相对应的引物(5-P2-序列2，序列14)以及与EST R28358反义链相对应的引物(hPARP2L1，序列15；hPARP2L，序列16)进行PCR反应。根据生产厂商说明书，应用凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)分离被命名为3’-hPARP2-L1(应用5-P2-序列2和hPARP2 L1扩增)和3’-hPARP2-L2(应用5-P2-序列2和hPARP2L2扩增)的PCR片段。
根据生产厂商说明书，将3’-hPARP2-L1和3’-hPARP2-L2直接克隆到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)上。如上所述，应用能够与载体DNA杂交的引物(序列8和序列9)，对4个克隆的3’-hPARP2-L1和3个克隆的3’-hPARP2-L2进行序列分析，以消除3’-hPARP2序列中由Taq聚合酶诱导的错误可能性。将7个核苷酸序列编辑整合成一个共有序列，并被命名为3’-hPARP2，如序列20所示。
3’-hPARP2共有核苷酸序列中的每个碱基对，都出现在用于编辑共有序列的7个克隆中的至少6个中，除了nt856-864，只在7个克隆的至少3个克隆中出现过。但是，3’-hPARP2共有序列的nt856-864存在于EST R28358中，因此可以断定，这一序列是正确的。经测定，3’-hPARP2的核苷酸1-193与5’-hPARP2(nt951-1143)重叠。3’-hPARP2在重叠区(nt194-864)的3’端还有671个核苷酸。3’-hPARP2经测定有一个始于nt1、含有861个核苷酸的ORF，终止密码子始于nt862。从3’-hPARP2 nt1-861推导出的氨基酸序列如序列21所示。
将5’-hPARP2(nt1-1143)与3’-hPARP2(nt194-864)连接，获得的多核苷酸序列被命名为“hparp2”(人parp2)，该序列如序列1所示。比较hparp2与鼠parp2(序列22)发现，hparp2的nt306-728与鼠parp2的nt199-621基本同源(423个核苷酸中有374个完全相同；88％一致)。此外，hparp2的nt744-1814与鼠parp2的nt625-1695基本同源(1071个核苷酸中有943个完全相同；88％一致)。
经测定，hparp2具有一个始于nt63、含有1789个核苷酸的ORF，并有一个始于nt1812的终止密码子。始于nt63的ATG经测定是起始蛋氨酸密码子，位于框架终止子的上游。从hparp2 nt63-1811推导出的氨基酸序列如序列2所示。hPARP2和鼠PARP2(序列23)，在558个氨基酸残基中有489个相同(88％一致)。在序列对比中存在26个氨基酸残基的缺口：hPARP2的氨基酸残基8，14，45-48，58，68-81和223-226与鼠PARP2不一致；鼠PARP2残基34与hPARP2不一致。
人parp1基因(序列24)编码蛋白hPARP1(序列25)，包括一个46kDa的氨基末端DNA结合功能区(序列25的aa1-373)，所述功能区包括两个锌指结构和一个核定位信号[见Molinete et al.，“Structureand function of the human poly(ADP-ribose)polymerase”，ADP-Ribosylation Reactions，Poirier and Moreau(Eds.)，Springer-Verlag，NewYork，1992，at pp.3-13]。hPARP2不包括明显的锌指DNA结合功能区，但可能包括一个不同的、至今尚未鉴定的DNA结合功能区。hPARP2还可以通过与DNA结合蛋白结合，而与DNA发生间接相互作用。也有可能，就是hPARP2与DNA既不发生直接相互作用，也不发生间接相互作用。
hPARP1包括一个中央22kDa的自动修饰功能区(序列25的aa373-525)，该功能区含有15个谷氨酸残基位点，这些位点的一些或全部可以作为自动修饰位点[Pieper et al.，Trends Pharmacol Sci 20：171-81(1999)]。hPARP1的自动修饰功能区与hPARP2不同，但hPARP2确实包括44个谷氨酸残基，可以作为自动修饰位点。
hPARP1包括一个40kDa的羧基末端催化功能区(序列25的aa655-1014)[Molinete et al.，supra]。当将hPARP2(序列2)的aa224-583与hPARP1的aa655-1014排列时，364个氨基酸中有145个相同(40％一致)。涉及催化活性的“G-X-X-X-G-K-G”结构在hPARP1(序列25的aa888-894)与hPARP2(序列2的aa454-460)之间也是保守的。
实施例3hPARP2生物活性的测定
PARP1具有内源性聚(ADP)聚合酶活性，当PARP1与损伤DNA结合时，被激活。由于在hPARP1中存在自动修饰功能区，激活可以容易地检测[见，如Nishikimi et al.，J Biol Chem 257：6102-5(1982)]。hPARP2与hPARP1的结构相似性提示，hPARP2可能也具有聚(ADP)聚合酶活性。但是，两种分子氨基末端部分的结构差异使下述问题不能确定，即hPARP2是否1)被损伤DNA激活，或者2)是自动修饰的靶物质。
DNA激活hPARP2可以通过采用下述方法容易地检测，所述方法在有或没有DNA的情况下，测定PARP1的聚合酶活性[见，如Benjaminand Gill，J Biol Chem 255：10502-8(1980)；Yoshihara，Biochem BiophysRes Commun 47：119-25(1972)]。制备的DNA样本可以含有单链或双链DNA，环状闭合DNA，或线形DNA，具有钝性末端，3’缩进末端或5’缩进末端。应用已经建立的PARP1方法，hPARP2的自动修饰可以通过检测ADP-核糖与hPARP2蛋白共价结合的形式来测定[例如，Banasiket al.，supra]。
此外，在缺乏有关DNA结合活性或自动修饰活性的信息时，一种测定hPARP2催化活性的方法是用hPARP1 cDNA中的hPARP1催化区取代hPARP2的催化区。这一点可通过应用分子生物学标准工具实现。这种嵌合蛋白的表达和纯化允许在没有hPARP2特异性激活或底物的情况下，对hPARP2催化活性进行评价。在这种情况下，hPARP1的DNA结合功能区允许DNA依赖性hPARP2催化功能区的激活。同样，hPARP1的自动修饰功能区可以作为hPARP2介导的ADP-核糖化靶物质。
如果无论hPARP2是天然多肽形式，还是嵌合多肽形式，hPARP2的自动修饰能力都不可检测或很难检测，可以采用另一种方法，即加入预期作为ADP-核糖化靶物质的异源蛋白质[见，Tsopanakis et al.，Eur JBiochem 90：337-45(1978)]。
hPARP2生物活性的其他特征可以通过hPARP2多肽的异位表达获得。异位表达可以包括，例如，转染hPARP2表达载体到培养细胞系中。分析暂时或稳定转染细胞系表型可以用来测定其生物功能。这些试验在本领域非常常见[见，如Fritz et al.，Mutation Res 308：127-33(1994)]。相反，例如，通过应用基因激活、反义寡核苷酸或hPARP2特异性化学抑制剂，特异性干扰hPARP2的表达或活性，可以用来鉴定hPARP2特异性生物功能。构建杆状病毒表达质粒
hparp2的一级结构提示，与hPARP1类似，hPARP2具有聚(ADP-核糖)聚合酶活性。hPARP2的PARP活性，或其亚结构，可以通过下述能力来测定，所述能力是物质将来自NAD的ADP-核糖亚单位整合成与蛋白底物连结的ADP-核糖聚合体的能力。在给定底物的情况下，这种活性的显示可以由技术人员很容易地实现[见，例如Smith et al.，Science 282：1484-1487(1998)]。
被命名为PARP1A/PARP2B的融合蛋白，包括hPARP1(序列25)的aa1-662与hPARP2(序列2)的aa230-583上游融合，可用于测定hPARP2的聚(ADP-核糖)聚合酶活性。PARP1A/PARP2B包括hPARP1的DNA结合功能区(序列25的aa1-373)和自动修饰功能区(序列25的aa373-525)，以及hPARP2(序列2的aa224-583)的假定催化功能区。
融合蛋白的PARP1A片段可以通过PCR扩增，在PCR中，应用对应于hparp1多核苷酸序列正义链(序列24的nt1-30)的引物(Sal-PARP1；序列26)，以及对应于hparp1多核苷酸序列反义链(序列24的nt1957-1985)的引物(revMlu-PARP1；序列27)。
Sal-PARP1
CGTCGACCCATGGCGGAGTCTTCGGATAAGCTCTATCGA(序列26)
revMlu-PARP1
GGAAACGCGTTTGGTGCCAGGATTTACTGTCAGCTTCTT(序列27)
PCR反应包括5uL人胸腺或睾丸QUICK-CloneTMcDNA(Clontech)，0.25uM每种引物，0.20mM dNTPs，1×PCR缓冲液，以及1uL Clontech Advantage聚合酶混合物。反应在GeneAmp系统9700PCR仪(PE Applied Biosystems，Norwalk，CT)上进行，包括以下步骤：1)94℃ 1分钟，1轮；2)94℃ 30秒，30轮，60℃ 2分钟，以及72℃ 2分钟；3)72℃ 7分钟，1轮。根据生产厂商说明书，应用凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)分离PCR片段(被命名hparp1A)。然后根据生产厂商说明书，将hparp1A亚克隆到pTrcHis2TM-TOPOTM载体(Invitrogen)上。应用SalI和MluI将hparp1A从pTrcHis2TM-TOPOTM上消化下来，应用凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)分离该片段，并保存，如下所述，进行进一步亚克隆。
融合蛋白的PARP2B片段通过PCR扩增，PCR中应用与hparp2多核苷酸序列正义链(序列1的nt750-776)相对应的引物(forMlu-PARP2，序列28)，和与hparp2多核苷酸序列反义链(序列1的nt1771-1811)相对应的引物(PARP2-Strep-Not，序列29)。
forMlu-PARP2
TTGAAACGCGTTCCAGAGTCACAGCTAGATCTTCGGGTA(序列28)
PARP2-Strep-Not
CTCCACGCCCACAGCTGAAGGAAATTAAACTGAACCTTTAAAAGGTACC(序列29)
PCR反应包括100ng hparp2 cDNA，0.25uM每种引物，0.20mMdNTPs，1×PCR缓冲液，以及1uL Clontech Advantage聚合酶混合物。反应在GeneAmp系统9700PCR仪(PE Applied Biosystems，Norwalk，CT)上进行，包括以下步骤：1)94℃ 1分钟，1轮；2)94℃ 30秒，30轮，60℃ 2分钟，以及72℃ 2分钟；3)72℃ 7分钟，1轮。根据生产厂商说明书，应用凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)分离PCR片段(被命名hparp2B)。然后根据生产厂商说明书，将hparp2B克隆到pcDNA3.1/NT-GFP-TOPOTM载体(Invitrogen)上。
应用MluI和NotI将hparp2B从pcDNA3.1/NT-GFP-TOPOTM上消化下来，并与应用SalI和MluI消化的hparp1A(如前述)一起亚克隆到pFASTBAC载体(Gibco BRL，Rockville，MD)上，所述pFASTBAC载体事先已经MluI和NotI消化。获得的质粒被命名为pFB-PARP1A-PARP2B。
应用经设计与载体序列(序列30和31)发生退火反应的引物和与cDNA序列(序列6，11，32-45)发生退火反应的引物，对pFB-PARP1A-PARP2B进行序列分析。pFB-PARP1A-PARP2B的载体引物
FastBac for  TTTGTTCGCCCAGACTC(序列30)
FastBac rev  TATGTTTCAGGTTCAGGGGGAG(序列31)pFB-PARP1A-PARP2B的cDNA引物
P1  GCGGAAGCTGGAGGAGTGAC(序列32)
P2  GTCACTCCTCCAGCTTCCGC(序列33)
P3  AAGCCCTGAAGAAGCAGCTC(序列34)
P4  GAGCTGCTTCTTCAGGGCTT(序列35)
P5  CAGACACCCAACCGGAAGGA(序列36)
P6  TCCTTCCGGTTGGGTGTCTG(序列37)
P7  TCCGCCTCCACCAAGAGCCT(序列38)
P8  AGGCTCTTGGTGGAGGCGGA(序列39)
P9  TGGCCTGGTGGACATCGTTA(序列40)
P10  TAACGATGTCCACCAGGCCA序列41)
3-P2-SEQ2  CTTCCATGAGAGCTCGTCCATGCTGGCC(序列11)
3-PARP2GTGTTGGTCCAATGGGTGTTCTGGGCTTTGTAGCTCTG(序列6)
AA#5  GTATTCTTTAGGCGAGAGGC(序列42)
H23985-5  TGACGAAGTGGGCAGAACTG(序列43)
PARP2U2 REV  GAGCACCCCCTGGACCAGCAC(序列44)
AA#3  ACAGCGACTAGACCATGACC(序列45)
PARP1A/PARP2B的核苷酸序列在序列46中给出，PARP1A/PARP2B的氨基酸序列在序列47中给出。PARP1A/PARP2B包括以下区域：在aa1-36是一个组氨酸标签前导区；aa37-698是hPARP1区；氨基酸699-700是间隔区；aa701-1054是hPARP2区；aa1055-1063是Strep标签区。
除了PARP1A/PARP2B，还构建了融合到聚组氨酸标签上的全长hPARP2蛋白(FB-hPARP2)，用来检测hPARP2的聚(ADP-核糖)聚合酶活性。FB-hPARP2的构建如下所述。
应用SalI和SacI消化pFB-PARP1A/PARP2B质粒去除hPARP1区，分离hparp2的羧基区。应用凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)分离该hPARP2区(pFB-PARP2B-Sal/Sac)，并保存，如下所述，进行进一步亚克隆。
通过PCR扩增hPARP2的氨基末端区，PCR应用与hparp2多核苷酸序列正义链(序列1的nt63-92)相对应的引物(Sal-PARP2，序列48)，以及与hparp2多核苷酸序列反义链(序列1的nt720-748)相对应的引物(revMlu-PARP2)。
Sal-PARP2CGTCGACCCATGGCGGCGCGGCGGCGACGGAGCACCGGC(序列48)
revMlu-PARP2TGGAACGCGTTTCAAGGGAGATTTAAGAGATTCCTCTTT(序列49)
PCR反应包括100ng hparp2 cDNA，0.25uM每种引物，0.20mMdNTPs，1×PCR缓冲液，以及1uL Clontech Advantage聚合酶混合物。反应在GeneAmp系统9700PCR仪(PE Applied Biosystems，Norwalk，CT)上进行，包括以下步骤：1)94℃ 1分钟，1轮；2)94℃ 30秒，30轮，60℃ 2分钟，以及72℃2分钟；3)72℃ 7分钟，1轮。根据生产厂商说明书，应用凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)分离PCR片段(被命名hparp2-Sal/Mlu)。然后根据生产厂商说明书，将hparp2-Sal/Mlu亚克隆到pTrcHis2TM-TOPOTM载体(Invitrogen)上。将获得的重组质粒pTrcHis2-hparp2-Sal/Mlu应用SalI和AvaII消化，并应用凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)分离hparp2片段(被命名为hparp2-Sal/Ava)，并保存，如下所述，进行进一步亚克隆。
应用AvaII和SacI消化，从hparp2 cDNA中分离hparp2的中央区。应用凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)分离该片段(被命名为hparp2-Ava/Sac)。
将pFB-PARP2B-Sal/Sac，hparp2-Sal/Ava和hparp2-AVa/Sac连接形成pFB-hparp/Strep-tag。应用KpnI消化pFB-hparp/Strep-tag，去除Strep-tag，产生被命名为pFB-hparp/Kpn的质粒。KpnI消化还去除了hPARP2的最后14个氨基酸。为了置换这一缺失区域，应用PCR扩增一个片段，PCR中应用与hparp2多核苷酸序列正义链(序列1的nt1757-1776)相对应的引物(5-P2-Kpn，序列50)，以及与hparp2多核苷酸序列反义链(序列1的nt1799-1814)相对应的引物(3-P2-Kpn，序列51)。
5-P2-Kpn  CCAGGTCCGTATGCGGTACC(序列50)
3-P2-KpnGCCACGATGGGTACCGCGGCCGCTCACCACAGCTGAAGG(序列51)
PCR反应包括100ng hparp2 cDNA，0.5uM每种引物，0.25mMdNTPs，1×PCR缓冲液，以及2.5U PfuTurbo聚合酶混合物(Stratagene)。反应在GeneAmp系统9700PCR仪(PE AppliedBiosystems，Norwalk，CT)上进行，包括以下步骤：1)94℃1分钟，1轮；2)94℃ 30秒，25轮，55℃ 30秒，以及72℃ 30秒；3)72℃ 7分钟，1轮。PCR片段应用KpnI消化，然后应用凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)分离，并与pFB-hparp/Kpn连接以形成pFB-hparp2。
应用设计成能够与载体序列(序列30和31)发生退火反应的引物和设计成能够与cDNA序列(序列11，12，42，52-57)发生退火反应的引物，进行pFB-hparp2序列分析。
3-P2-SEQ2  CTTCCATGAGAGCTCGTCCATGCTGGCC(序列11)
5-SEQ-2  GGCCAGCATGGACGAGCTCTCATGGAAG(序列12)
AA#5  GTATTCTTTAGGCGAGAGGC(序列42)
AA#1  GGTGACGAAGTGGGCAGAAC(序列52)
AA#2  TTCTGCCCACTTCGTCACCC(序列53)
AA#4  CGCAAGGCACAATGTAGGTT(序列54)
AA#6  GCCTCTCGCCTAAAGAATAC(序列55)
H2  AAGCAATCCTTCGGCCTTAG(序列56)
H6  AGTTCTGCCCACTTCGTCAC(序列57)
pFB-hparp2的核苷酸序列在序列58中给出，FB-hPARP2的相应氨基酸序列则在序列59中给出。FB-hPARP2包括一个位于aa1-36的组氨酸标签前导区。FB-hPARP2的氨基酸37-619代表全长hPARP2。重组病毒库的产生和蛋白质纯化
PARP1A/PARP2B和FB-hPARP2重组病毒库分别按照生产厂家提供的协议应用FastBac系统(Gibco BRL)生产，蛋白质表达则按如下步骤进行。Sf9细胞在27℃生长于CCM3培养基(Hyclone，Logan，UT)中，所述培养基包括50U/mL青霉素和50ug/mL硫酸链霉素(GibcoBRL)。指数生长的细胞以每孔大约0.5病毒多样性感染，并孵育48小时。以1000Xg离心15分钟收集细胞，冷冻沉淀，并在-80℃冻存直至应用。
蛋白质纯化的试剂除非有明确指示，否则均来自Sigma(St.Louis，MO)。通过超声降解法将细胞在裂解缓冲液(25mM Tris-HCl，pH9.0，50mM葡萄糖，10mM EDTA，1mM 2-巯基乙醇，1mM PMSF，100uM镇痛剂，以及2ug/mL抑肽酶)中裂解。在裂解缓冲液中添加Igepal CA-630(终浓度为0.2％)，Tween-20(终浓度为0.2％)，以及NaCl(终浓度为0.5M)，样本在4℃搅动30分钟。以20,000Xg在4℃离心20分钟后，收集上清，当时应用1mg/mL硫酸鱼精蛋白处理上清，然后在4℃搅动1小时。以4,000Xg在4℃离心20分钟后，收集上清，并在当时应用70％硫酸铵在4℃处理1小时，沉淀蛋白。以20,000Xg在4℃离心15分钟收集蛋白沉淀，并应用再悬缓冲液(100mM Tris-HCl，pH7.4，0.5mM EDTA，10％甘油，1mM PMSF，和12mM 2-巯基乙醇)将蛋白沉淀再次悬浮。
根据生产厂家的说明书，通过组氨酸标签应用TALONTM Superflow金属亲和树脂(Clontech)首次纯化蛋白质，并应用200mM咪唑(Clontech)洗脱。然后按照文献所述[D’Amours et al.，Anal Biochem 249：106-8(1997)]，应用3-氨基苯氨化合物Affi-Gel基质(Bio-RadLaboratories)纯化蛋白洗脱液。应用溶于洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，0.3MNaCl，10mM 2-巯基乙醇，1mM PMSF，100uM镇痛剂，以及2ug/mL抑肽酶)中的10mM 3-甲氧基苯甲酰胺洗脱蛋白。在1L透析缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0，1mM dithiothreitol，4mM MgCl2，10mMEDTA，1mM PMSF，以及2ug/mL抑肽酶)中4X透析蛋白质。加入甘油至终浓度10％，然后将蛋白质冻存于-80℃。聚(ADP-核糖)聚合酶活性
检测聚(ADP-核糖)聚合酶活性试验所用试剂，除非有明确指示，否则均来自Sigma。PARP1A/PARP2B(250ng)或FB-hPARP2(25ng)蛋白在试验缓冲液(总容量20uL)中室温孵育10分钟，所述试验缓冲液包括100mM Tris，pH8.0，1mM MgCl2，10％甘油，1.5mM dithiothreitol(Boehringer Mannheim/Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)，2.5uM未标记NAD+，16.7ug/mL大肠杆菌菌株B DNA，以及0.33uCiγ-[32P]-NAD+(NEN，Boston，MA)。通过在SDS流动缓冲液中煮沸停止反应，并通过SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。应用放射自显影技术使标记蛋白显现。在蛋白底物中加入聚(ADP-核糖)聚合物，可以导致蛋白质分子量的增加，并随后导致蛋白在SDS-PAGE中跑得更高。同样，加入蛋白底物的聚(ADP-核糖)聚合物水平可以根据每个单个蛋白分子而不同，导致标记蛋白分子量不同，在放射自显影胶片上呈现阶梯状或涂片状[例如，见Smith et al.(1998)，supra]。PARP1A/PARP2B和FB-hPARP2都具有内在聚(ADP-核糖)聚合酶活性，表现在它们产生聚(ADP-核糖)聚合物的能力。PARP1A/PARP2B的聚(ADP-核糖)聚合酶反应产生的阶梯状标记蛋白大约为174-200kDa。FB-hPARP2的聚(ADP-核糖)聚合酶反应产生的阶梯状标记蛋白大约为136-250kDa。
实施例4制备与能够与hPARP2多肽发生免疫活性反应的抗体
本发明提供了hPARP2多肽的特异性抗体。针对hPARP2的抗体可以通过本领域任何已知的方法制备，典型地包括，例如，应用纯化天然hPARP2、纯化重组hPARP2、纯化重组hPARP2的肽片段、或根据推测的hPARP2氨基酸序列合成的肽制剂免疫实验动物。为了使获得的抗体与hPARP2发生特异性反应的可能性最大化，用作免疫原的多肽区域应该根据hPARP1和hPARP2之间的差异来选择。例如，氨基酸残基1-86是hPARP1和hPARP2之间差异较大的区域，因此，这一区域可以作为截短的多肽在适宜的表达系统中表达，用作免疫原或检测多克隆或单克隆抗体制剂。相似的方法还可用于hPARP2多肽的其他区域。同样，合成肽也可以根据所选hPARP2相应区域进行合成，而且可以通过本领域熟知的方法，利用这些肽制备特异性多克隆或单克隆抗体[见，例如Harlow et al.，supra]。
在开发抗体的时候，hPARP2羧基区的两个区域(被命名为hPARP2U1和hPARP2 U2)被选择作为免疫原。通过PCR扩增hparp2 U1，在PCR中应用与hparp2多核苷酸序列正义链(序列1的nt1074-1093)相对应的引物(5-PARP2 U1，序列60)，以及与hparp2多核苷酸序列反义链(序列1的nt1790-1811)相对应的引物(PARP2 L2，序列16)。通过PCR扩增hparp2 U2，在PCR中应用与hparp2多核苷酸序列正义链(序列1的nt1125-1145)相对应的引物(5-PARP2 U2，序列61)，以及用于hparp2 U1的相同的反义引物(PARP2 L2，序列16)。
5-PARP2 U1  GGAGACATTGAAATTGCTAT(序列60)
5-PARP2 U2  GAACACCCATTGGACCAACAC(序列61)
PCR反应包括100ng hparp2 cDNA，0.5uM每种引物，0.25mMdNTPs，1×PCR缓冲液，以及2.5U PfuTurbo聚合酶混合物(Stratagene)。反应在GeneAmp系统9700PCR仪(PE AppliedBiosystems，Norwalk，CT)上进行，包括以下步骤：1)94℃1分钟，1轮；2)94℃ 30秒，25轮，55℃ 2分钟，以及72℃ 2分钟；3)72℃ 7分钟，1轮。根据生产厂商说明书，将获得的PCR片段亚克隆到pTrcHis2TM-TOPOTM载体(Invitrogen)上。应用能够与载体(序列62和63)发生退火反应的引物进行hparp2 U1和hparp2 U2序列分析。
PTrcHis  前导引物  GAGGTATATATTAATGTATCG(序列62)
pTrcHis  反转引物  GATTTAATCTGTATCAGG(序列63)
hparp2 U1的多核苷酸序列在序列64中给出，氨基酸序列(hPARP2U1)在序列65中给出。hPARP2 U1包括hPARP2(序列2)的aa338-583。hparp2 U2的多核苷酸序列在序列66中给出，氨基酸序列(hPARP2 U2)在序列67中给出。hPARP2 U2包括hPARP2(序列2)的aa355-583。
hPARP2 U1和hPARP2 U2的聚组氨酸融合蛋白在大肠杆菌中分别表达，并在37℃应用1mM IPTG诱导。根据生产厂商的说明书，应用B-PERTM细菌蛋白提取试剂(Pierce，Rockford，IL)从包含体中分离hPARP2 U1和hPARP2 U2蛋白。
5只6-12周龄Balb/c小鼠在第0天预采血，并每只小鼠注射30ug溶于Freund′s完全佐剂中的hPARP2 U1和hPARP2 U2混和物。随后的加强免疫在第21天和第63天进行，免疫原溶于Freund′s不完全佐剂。第73天给小鼠采血，血液应用标准ELISA方法进行筛检，平板被覆PARP1A/PARP2B(如上述)。特异性抗体应用羊抗鼠IgG(fc)辣根过氧化物酶进行检测。
ELISA反应性鼠血清再应用标准Western分析法进行检测。在Western分析中对FB-hPARP2具有反应性的小鼠，取其脾脏，并应用标准方法与NS-1细胞融合[Harlow and Lane，Antibodies，a LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]，制备单克隆抗体。
本文引用的所有文献和专利文件，全文在此引入，作为参考。
本发明具体描述的那些优选实施方案是为了便于阐述和理解，本领域技术人员应该理解，在本发明下述权利要求范围内可以进行进一步的变化和改良。因此，除了在权利要求中特别陈述的那些要求，不应该对本发明施加任何的限制。
                           序列表<110>Christenson，Erik(E.克里斯滕森)
 DeMaggio，Anthony J(A.J.德马吉奥)
 Goldman，Phyllis S(P.S.戈尔德曼)
 McElligott，David L(D.L.麦埃利戈特)<120>人聚(ADP-核糖)聚合酶2的物质和方法<130>hparp2<140><141><150>60/139,543<151>1999-06-16<160>67<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1814<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><220><221>CDS<222>(63)..(1811)<400>1gcctagtgac actgggcccg cgattccttg gagcgggttg atgacgtcag cgttcgaatt 60cc atg gcg gcg cgg cgg cga cgg agc acc ggc ggc ggc agg gcg aga    107Met Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser Thr Gly Gly Gly Arg Ala Arg
 1               5                  10                  15gca tta aat gaa agc aaa aga gtt aat aat ggc aac acg gct cca gaa   155Ala Leu Asn Glu Ser Lys Arg Val Asn Asn Gly Asn Thr Ala Pro Glu
             20                  25                  30gac tct tcc cct gcc aag aaa act cgt aga tgc cag aga cag gag tcg   203Asp Ser Ser Pro Ala Lys Lys Thr Arg Arg Cys Gln Arg Gln Glu Ser
         35                  40                  45aaa aag atg cct gtg gct gga gga aaa gct aat aag gac agg aca gaa   251Lys Lys Met Pro Val Ala Gly Gly Lys Ala Asn Lys Asp Arg Thr Glu
     50                  55                  60gac aag caa gat ggt atg cca gga agg tca tgg gcc agc aaa agg gtc   299Asp Lys Gln Asp Gly Met Pro Gly Arg Ser Trp Ala Ser Lys Arg Val
 65                  70                  75tct gaa tct gtg aag gcc ttg ctg tta aag ggc aaa gct cct gtg gac   347Ser Glu Ser Val Lys Ala Leu Leu Leu Lys Gly Lys Ala Pro Val Asp80                  85                  90                  95cca gag tgt aca gcc aag gtg ggg aag gct cat gtg tat tgt gaa gga   395Pro Glu Cys Thr Ala Lys Val Gly Lys Ala His Val Tyr Cys Glu Gly
            100                 105                 110aat gat gtc tat gat gtc atg cta aat cag acc aat ctc cag ttc aac   443Asn Asp Val Tyr Asp Val Met Leu Asn Gln Thr Asn Leu Gln Phe Asn
        115                 120                 125aac aac aag tac tat ctg att cag cta tta gaa gat gat gcc cag agg   491Asn Asn Lys Tyr Tyr Leu Ile Gln Leu Leu Glu Asp Asp Ala Gln Arg
    130                 135                 140aac ttc agt gtt tgg atg aga tgg ggc cga gtt ggg aaa atg gga cag   539Asn Phe Ser Val Trp Met Arg Trp Gly Arg Val Gly Lys Met Gly Gln
145                 150                 155cac agc ctg gtg gct tgt tca ggc aat ctc aac aag gcc aag gaa atc   587His Ser Leu Val Ala Cys Ser Gly Asn Leu Asn Lys Ala Lys Glu Ile160                 165                 170                 175ttt cag aag aaa ttc ctt gac aaa acg aaa aac aat tgg gaa gat cga   635Phe Gln Lys Lys Phe Leu Asp Lys Thr Lys Asn Asn Trp Glu Asp Arg
            180                 185                 190gaa aag ttt gag aag gtg cct gga aaa tat gat atg cta cag atg gac   683Glu Lys Phe Glu Lys Val Pro Gly Lys Tyr Asp Met Leu Gln Met Asp
        195                 200                 205tat gcc acc aat act cag gat gaa gag gaa aca aag aaa gag gaa tct   731Tyr Ala Thr Asn Thr Gln Asp Glu Glu Glu Thr Lys Lys Glu Glu Ser
    210                 215                 220ctt aaa tct ccc ttg aag cca gag tca cag cta gat ctt cgg gta cag   779Leu Lys Ser Pro Leu Lys Pro Glu Ser Gln Leu Asp Leu Arg Val Gln
225                 230                 235gag tta ata aag ttg atc tgt aat gtt cag gcc atg gaa gaa atg atg   827Glu Leu Ile Lys Leu Ile Cys Asn Val Gln Ala Met Glu Glu Met Met240                 245                 250                 255atg gaa atg aag tat aat acc aag aaa gcc cca ctt ggg aag ctg aca   875Met Glu Met Lys Tyr Asn Thr Lys Lys Ala Pro Leu Gly Lys Leu Thr
            260                 265                 270gtg gca caa atc aag gca ggt tac cag tct ctt aag aag att gag gat   923Val Ala Gln Ile Lys Ala Gly Tyr Gln Ser Leu Lys Lys Ile Glu Asp
        275                 280                 285tgt att cgg gct ggc cag cat gga cga gct ctc atg gaa gca tgc aat   971Cys Ile Arg Ala Gly Gln His Gly Arg Ala Leu Met Glu Ala Cys Asn
    290                 295                 300gaa ttc tac acc agg att ccg cat gac ttt gga ctc cgt act cct cca   1019Glu Phe Tyr Thr Arg Ile Pro His Asp Phe Gly Leu Arg Thr Pro Pro
305                 310                 315cta atc cgg aca cag aag gaa ctg tca gaa aaa ata caa tta cta gag   1067Leu Ile Arg Thr Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Ile Gln Leu Leu Glu320                 325                 330                 335gct ttg gga gac att gaa att gct att aag ctg gtg aaa aca gag cta   1115Ala Leu Gly Asp Ile Glu Ile Ala Ile Lys Leu Val Lys Thr Glu Leu
            340                 345                 350caa agc cca gaa cac cca ttg gac caa cac tat aga aac cta cat tgt   1163Gln Ser Pro Glu His Pro Leu Asp Gln His Tyr Arg Asn Leu His Cys
        355                 360                 365gcc ttg cgc ccc ctt gac cat gaa agt tac gag ttc aaa gtg att tcc   1211Ala Leu Arg Pro Leu Asp His Glu Ser Tyr Glu Phe Lys Val Ile Ser
    370                 375                 380cag tac cta caa tct acc cat gct ccc aca cac agc gac tat acc atg   1259Gln Tyr Leu Gln Ser Thr His Ala Pro Thr His Ser Asp Tyr Thr Met
385                 390                 395acc ttg ctg gat ttg ttt gaa gtg gag aag gat ggt gag aaa gaa gcc   1307Thr Leu Leu Asp Leu Phe Glu Val Glu Lys Asp Gly Glu Lys Glu Ala400                 405                 410                 415ttc aga gag gac ctt cat aac agg atg ctt cta tgg cat ggt tcc agg   1355Phe Arg Glu Asp Leu His Asn Arg Met Leu Leu Trp His Gly Ser Arg
            420                 425                 430atg agt aac tgg gtg gga atc ttg agc cat ggg ctt cga att gcc cca   1403Met Ser Asn Trp Val Gly Ile Leu Ser His Gly Leu Arg Ile Ala Pro
        435                 440                 445cct gaa gct ccc atc aca ggt tac atg ttt ggg aaa gga atc tac ttt   1451Pro Glu Ala Pro Ile Thr Gly Tyr Met Phe Gly Lys Gly Ile Tyr Phe
    450                 455                 460gct gac atg tct tcc aag agt gcc aat tac tgc ttt gcc tct cgc cta   1499Ala Asp Met Ser Ser Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Phe Ala Ser Arg Leu
465                 470                 475aag aat aca gga ctg ctg ctc tta tca gag gta gct cta ggt cag tgt   1547Lys Asn Thr Gly Leu Leu Leu Leu Ser Glu Val Ala Leu Gly Gln Cys480                 485                 490                 495aat gaa cta cta gag gcc aat cct aag gcc gaa gga ttg ctt caa ggt   1595Asn Glu Leu Leu Glu Ala Asn Pro Lys Ala Glu Gly Leu Leu Gln Gly
            500                 505                 510aaa cat agc acc aag ggg ctg ggc aag atg gct ccc agt tct gcc cac   1643Lys His Ser Thr Lys Gly Leu Gly Lys Met Ala Pro Ser Ser Ala His
        515                 520                 525ttc gtc acc ctg aat ggg agt aca gtg cca tta gga cca gca agt gac   1691Phe Val Thr Leu Asn Gly Ser Thr Val Pro Leu Gly Pro Ala Ser Asp
    530                 535                 540aca gga att ctg aat cca gat ggt tat acc ctc aac tac aat gaa tat   1739Thr Gly Ile Leu Asn Pro Asp Gly Tyr Thr Leu Asn Tyr Asn Glu Tyr
545                 550                 555att gta tat aac ccc aac cag gtc cgt atg cgg tac ctt tta aag gtt   1787Ile Val Tyr Asn Pro Asn Gln Val Arg Met Arg Tyr Leu Leu Lys Val560                 565                 570                 575cag ttt aat ttc ctt cag ctg tgg tga                               1814Gln Phe Asn Phe Leu Gln Leu Trp
            580<210>2<211>583<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser Thr Gly Gly Gly Arg Ala Arg Ala1               5                  10                  15Leu Asn Glu Ser Lys Arg Val Asn Asn Gly Asn Thr Ala Pro Glu Asp
         20                  25                  30Ser Ser Pro Ala Lys Lys Thr Arg Arg Cys Gln Arg Gln Glu Ser Lys
     35                  40                  45Lys Met Pro Val Ala Gly Gly Lys Ala Asn Lys Asp Arg Thr Glu Asp
 50                  55                  60Lys Gln Asp Gly Met Pro Gly Arg Ser Trp Ala Ser Lys Arg Val Ser65                  70                  75                  80Glu Ser Val Lys Ala Leu Leu Leu Lys Gly Lys Ala Pro Val Asp Pro
             85                  90                  95Glu Cys Thr Ala Lys Val Gly Lys Ala His Val Tyr Cys Glu Gly Asn
        100                 105                 110Asp Val Tyr Asp Val Met Leu Asn Gln Thr Asn Leu Gln Phe Asn Asn
    115                 120                 125Asn Lys Tyr Tyr Leu Ile Gln Leu Leu Glu Asp Asp Ala Gln Arg Asn
130                 135                 140Phe Ser Val Trp Met Arg Trp Gly Arg Val Gly Lys Met Gly Gln His145                 150                 155                 160Ser Leu Val Ala Cys Ser Gly Asn Leu Asn Lys Ala Lys Glu Ile Phe
            165                 170                 175Gln Lys Lys Phe Leu Asp Lys Thr Lys Asn Asn Trp Glu Asp Arg Glu
        180                 185                 190Lys Phe Glu Lys Val Pro Gly Lys Tyr Asp Met Leu Gln Met Asp Tyr
    195                 200                 205Ala Thr Asn Thr Gln Asp Glu Glu Glu Thr Lys Lys Glu Glu Ser Leu
210                 215                 220Lys Ser Pro Leu Lys Pro Glu Ser Gln Leu Asp Leu Arg Val Gln Glu225                 230                 235                 240Leu Ile Lys Leu Ile Cys Asn Val Gln Ala Met Glu Glu Met Met Met
            245                 250                 255Glu Met Lys Tyr Asn Thr Lys Lys Ala Pro Leu Gly Lys Leu Thr Val
        260                 265                 270Ala Gln Ile Lys Ala Gly Tyr Gln Ser Leu Lys Lys Ile Glu Asp Cys
    275                 280                 285Ile Arg Ala Gly Gln His Gly Arg Ala Leu Met Glu Ala Cys Asn Glu
290                 295                 300Phe Tyr Thr Arg Ile Pro His Asp Phe Gly Leu Arg Thr Pro Pro Leu305                 310                 315                 320Ile Arg Thr Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Ile Gln Leu Leu Glu Ala
            325                 330                 335Leu Gly Asp Ile Glu Ile Ala Ile Lys Leu Val Lys Thr Glu Leu Gln
        340                 345                 350Ser Pro Glu His Pro Leu Asp Gln His Tyr Arg Asn Leu His Cys Ala
    355                 360                 365Leu Arg Pro Leu Asp His Glu Ser Tyr Glu Phe Lys Val Ile Ser Gln
370                 375                 380Tyr Leu Gln Ser Thr His Ala Pro Thr His Ser Asp Tyr Thr Met Thr385                 390                 395                 400Leu Leu Asp Leu Phe Glu Val Glu Lys Asp Gly Glu Lys Glu Ala Phe
            405                 410                 415Arg Glu Asp Leu His Asn Arg Met Leu Leu Trp His Gly Ser Arg Met
        420                 425                 430Ser Asn Trp Val Gly Ile Leu Ser His Gly Leu Arg Ile Ala Pro Pro
    435                 440                 445Glu Ala Pro Ile Thr Gly Tyr Met Phe Gly Lys Gly Ile Tyr Phe Ala
450                 455                 460Asp Met Ser Ser Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Phe Ala Ser Arg Leu Lys465                 470                 475                 480Asn Thr Gly Leu Leu Leu Leu Ser Glu Val Ala Leu Gly Gln Cys Asn
            485                 490                 495Glu Leu Leu Glu Ala Asn Pro Lys Ala Glu Gly Leu Leu Gln Gly Lys
        500                 505                 510His Ser Thr Lys Gly Leu Gly Lys Met Ala Pro Ser Ser Ala His Phe
    515                 520                 525Val Thr Leu Asn Gly Ser Thr Val Pro Leu Gly Pro Ala Ser Asp Thr
530                 535                 540Gly Ile Leu Asn Pro Asp Gly Tyr Thr Leu Asn Tyr Asn Glu Tyr Ile545                 550                 555                 560Val Tyr Asn Pro Asn Gln Val Arg Met Arg Tyr Leu Leu Lys Val Gln
            565                 570                 575Phe Asn Phe Leu Gln Leu Trp
        580<210>3<211>472<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><400>3tttttttttt ttttttttag acctgtacag tttttattac ataaaatatc acaaaattca 60caagtacaac actgcttatt ttcttgcttg aagatcagat ctctggttta tttaagatca 120acattcacca cagctgaagg aaattaaact gaacctttaa aaggtaccgc atacggacct 180ggttggggtt atatacaata tattcattgt agttgagggt ataaccatct ggattcagaa 240ttcctgtgtc acttgctggt cctaatggca ctgtactccc attcctgcca aatggaaaaa 300aagtgtgtca acatcagtct ctggttcaga agctgcaata gagaacgtag tcttatctgg 360ccaaaaggag tcttctagtc ctcctggttc tgagtactta cagggtgacg aagtgggcag 420aactgggagc catcttgccc agccccttgg ggctatgttt accttgaagc aa         472<210>4<211>476<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><400>4aganctgtac agtttttatt acataaaata tcacaaaatt cacaagtaca cactgcttat 60tttcttgctt gaagatcaga tctctggttt atttaatatc aacattcacc acagctgaag 120gaaattaaac tgaaccttta aaaggtaccg catacggacc tgggttgggg ttatatacaa 180tatattcatt gtagttgagg gtataacatc tgggattcag aattcctgtg tcacttgctg 240ggncctaatg ggcactgtac tcccattcag gggtgacgag tgggggcagg aactggggag 300gccatcttgc ccaggcccct tgggngctat ggtttacctt gaaggcaatc cttcgggcct 360tagggattgg gcctctagta gttcattaca ctggacctag gggctacctc tggtaggggc 420agcagtcccg tattttttag ggcnagaggg naaagcagtt attngggcan ttttgg     476<210>5<211>416<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><400>5gctttgggag acattgaaat tgctattaag ctggtgaaaa cagagctaca aagcccagaa 60cacccattgg accaacacta tagaaaccta cattgtgcct tgcgccccct tgaccatgaa 120agttatgagt tcaaagtgat ttcccagtac ctacaatcta cccatgctcc cacacacagc 180gactattacc atggaccttg ctgggatttg tttgaagtgg gaggaaggga tgggtgagga 240aaggaaggcc tttcaggagg agggaccttt cattaacagg gatgctttct atggggcatg 300ggttccaggg gttgaggtaa ctggggttgg ggantctttg aggccntggg gttttcggan 360tttgccccca ccttggaagg ntccccntca cagggtttac atgtttttgg gggaaa     416<210>6<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><220><223>人工序列说明：引物<400>6gtgttggtcc aatgggtgtt ctgggctttg tagctctg                 38<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><220><223>人工序列说明：引物<400>7ccatcctaat acgactcact atagggc                             27<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><220><223>人工序列说明：引物<400>8tgtaaaacga cggccagt                                       18<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><220><223>人工序列说明：引物<400>9ggaaacagct atgaccatg                                       19<210>10<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><220><223>人工序列说明：引物<400>10ggctgtacac tctgggtcca caggagc                              27<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><220><223>人工序列说明：引物<400>11cttccatgag agctcgtcca tgctggcc                             28<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><220><223>人工序列说明：引物<400>12ggccagcatg gacgagctct catggaag                            28<210>13<211>1143<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><400>13gcctagtgac actgggcccg cgattccttg gagcgggttg atgacgtcag cgttcgaatt 60ccatggcggc gcggcggcga cggagcaccg gcggcggcag ggcgagagca ttaaatgaaa 120gcaaaagagt taataatggc aacacggctc cagaagactc ttcccctgcc aagaaaactc 180gtagatgcca gagacaggag tcgaaaaaga tgcctgtggc tggaggaaaa gctaataagg 240acaggacaga agacaagcaa gatggtatgc caggaaggtc atgggccagc aaaagggtct 300ctgaatctgt gaaggccttg ctgttaaagg gcaaagctcc tgtggaccca gagtgtacag 360ccaaggtggg gaaggctcat gtgtattgtg aaggaaatga tgtctatgat gtcatgctaa 420atcagaccaa tctccagttc aacaacaaca agtactatct gattcagcta ttagaagatg 480atgcccagag gaacttcagt gtttggatga gatggggccg agttgggaaa atgggacagc 540acagcctggt ggcttgttca ggcaatctca acaaggccaa ggaaatcttt cagaagaaat 600tccttgacaa aacgaaaaac aattgggaag atcgagaaaa gtttgagaag gtgcctggaa 660aatatgatat gctacagatg gactatgcca ccaatactca ggatgaagag gaaacaaaga 720aagaggaatc tcttaaatct cccttgaagc cagagtcaca gctagatctt cgggtacagg 780agttaataaa gttgatctgt aatgttcagg ccatggaaga aatgatgatg gaaatgaagt 840ataataccaa gaaagcccca cttgggaagc tgacagtggc acaaatcaag gcaggttacc 900agtctcttaa gaagattgag gattgtattc gggctggcca gcatggacga gctctcatgg 960aagcatgcaa tgaattctac accaggattc cgcatgactt tggactccgt actcctccac 1020taatccggac acagaaggaa ctgtcagaaa aaatacaatt actagaggct ttgggagaca 1080ttgaaattgc tattaagctg gtgaaaacag agctacaaag cccagaacac ccattggacc 1140aac                                                               1143<210>14<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><220><223>人工序列说明：引物<400>14gctcctgtgg acccagagtg tacagcc                             27<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><220><223>人工序列说明：引物<400>15acattcacca cagctgaagg                                     20<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><220><223>人工序列说明：引物<400>16ccacagctga aggaaattaa ac                                  22<210>17<211>550<212>DNA<213>人工序列<220><220><223>人工序列说明：P2-1(hPARP2片段)<400>17agccaaggtg gggaaggctc atgtgtattg tgaaggaaat gatgtctatg atgtcatgct 60aaatcagacc aatctccagt tcaacaacaa caagtactat ctgattcagc tattagaaga 120tgatgcccag aggaacttca gtgtttggat gagatggggc cgagttggga aaatgggaca 180gcacagcctg gtggcttgtt caggcaatct caacaaggcc aaggaaatct ttcagaagaa 240attccttgac aaaacgaaaa acaattggga agatcgagaa aagtttgaga aggtgcctgg 300aaaatatgat atgctacaga tggactatgc caccaatact caggatgaag aggaaacaaa 360gaaagaggaa tctcttaaat ctcccttgaa gccagagtca cagctagatc ttcgggtaca 420ggagttaata aagttgatct gtaatgttca gg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         20                  25                  30Ser Ser Pro Ala Lys Lys Thr Arg Arg Cys Gln Arg Gln Glu Ser Lys
     35                  40                  45Lys Met Pro Val Ala Gly Gly Lys Ala Asn Lys Asp Arg Thr Glu Asp
 50                  55                  60Lys Gln Asp Gly Met Pro Gly Arg Ser Trp Ala Ser Lys Arg Val Ser65                  70                  75                  80Glu Ser Val Lys Ala Leu Leu Leu Lys Gly Lys Ala Pro Val Asp Pro
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        100                 105                 110Asp Val Tyr Asp Val Met Leu Asn Gln Thr Asn Leu Gln Phe Asn Asn
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130                 135                 140Phe Ser Val Trp Met Arg Trp Gly Arg Val Gly Lys Met Gly Gln His145                 150                 155                 160Ser Leu Val Ala Cys Ser Gly Asn Leu Asn Lys Ala Lys Glu Ile Phe
            165                 170                 175Gln Lys Lys Phe Leu Asp Lys Thr Lys Asn Asn Trp Glu Asp Arg Glu
        180                 185                 190Lys Phe Glu Lys Val Pro G1y Lys Tyr Asp Met Leu Gln Met Asp Tyr
    195                 200                 205Ala Thr Asn Thr Gln Asp Glu Glu Glu Thr Lys Lys Glu Glu Ser Leu
210                 215                 220Lys Ser Pro Leu Lys Pro Glu Ser Gln Leu Asp Leu Arg Val Gln Glu225                 230                 235                 240Leu Ile Lys Leu Ile Cys Asn Val Gln Ala Met Glu Glu Met Met Met
            245                 250                 255Glu Met Lys Tyr Asn Thr Lys Lys Ala Pro Leu Gly Lys Leu Thr Val
        260                 265                 270Ala Gln Ile Lys Ala Gly Tyr Gln Ser Leu Lys Lys Ile Glu Asp Cys
    275                 280                 285Ile Arg Ala Gly Gln His Gly Arg Ala Leu Met Glu Ala Cys Asn Glu
290                 295                 300Phe Tyr Thr Arg Ile Pro His Asp Phe Gly Leu Arg Thr Pro Pro Leu305                 310                 315                 320Ile Arg Thr Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Ile Gln Leu Leu Glu Ala
            325                 330                 335Leu Gly Asp Ile Glu Ile Ala Ile Lys Leu Val Lys Thr Glu Leu Gln
        340                 345                 350Ser Pro Glu His Pro Leu Asp Gln
    355                 360<210>20<211>864<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><400>20gctctcatgg aagcatgcaa tgaattctac accaggattc cgcatgactt tggactccgt 60actcctccac taatccggac acagaaggaa ctgtcagaaa aaatacaatt actagaggct 120ttgggagaca ttgaaattgc tattaagctg gtgaaaacag agctacaaag cccagaacac 180ccattggacc aacactatag aaacctacat tgtgccttgc gcccccttga ccatgaaagt 240tacgagttca aagtgatttc ccagtaccta caatctaccc atgctcccac acacagcgac 300tataccatga ccttgctgga tttgtttgaa gtggagaagg atggtgagaa agaagccttc 360agagaggacc ttcataacag gatgcttcta tggcatggtt ccaggatgag taactgggtg 420ggaatcttga gccatgggct tcgaattgcc ccacctgaag ctcccatcac aggttacatg 480tttgggaaag gaatctactt tgctgacatg tcttccaaga gtgccaatta ctgctttgcc 540tctcgcctaa agaatacagg actgctgctc ttatcagagg tagctctagg tcagtgtaat 600gaactactag aggccaatcc taaggccgaa ggattgcttc aaggtaaaca tagcaccaag 660gggctgggca agatggctcc cagttctgcc cacttcgtca ccctgaatgg gagtacagtg 720ccattaggac cagcaagtga cacaggaatt ctgaatccag atggttatac cctcaactac 780aatgaatata ttgtatataa ccccaaccag gtccgtatgc ggtacctttt aaaggttcag 840tttaatttcc ttcagctgtg gtga                                        864<210>21<211>287<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><400>21Ala Leu Met Glu Ala Cys Asn Glu Phe Tyr Thr Arg Ile Pro His Asp1               5                  10                  15Phe Gly Leu Arg Thr Pro Pro Leu Ile Arg Thr Gln Lys Glu Leu Ser
         20                  25                  30Glu Lys Ile Gln Leu Leu Glu Ala Leu Gly Asp Ile Glu Ile Ala Ile
     35                  40                  45Lys Leu Val Lys Thr Glu Leu Gln Ser Pro Glu His Pro Leu Asp Gln
 50                  55                  60His Tyr Arg Asn Leu His Cys Ala Leu Arg Pro Leu Asp His Glu Ser65                  70                  75                  80Tyr Glu Phe Lys Val Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Ser Thr His Ala Pro
             85                  90                  95Thr His Ser Asp Tyr Thr Met Thr Leu Leu Asp Leu Phe Glu Val Glu
        100                 105                 110Lys Asp Gly Glu Lys Glu Ala Phe Arg Glu Asp Leu His Asn Arg Met
    115                 120                 125Leu Leu Trp His Gly Ser Arg Met Ser Asn Trp Val Gly Ile Leu Ser
130                 135                 140His Gly Leu Arg Ile Ala Pro Pro Glu Ala Pro Ile Thr Gly Tyr Met145                 150                 155                 160Phe Gly Lys Gly Ile Tyr Phe Ala Asp Met Ser Ser Lys Ser Ala Asn
            165                 170                 175Tyr Cys Phe Ala Ser Arg Leu Lys Asn Thr Gly Leu Leu Leu Leu Ser
        180                 185                 190Glu Val Ala Leu Gly Gln Cys Asn Glu Leu Leu Glu Ala Asn Pro Lys
    195                 200                 205Ala Glu Gly Leu Leu Gln Gly Lys His Ser Thr Lys Gly Leu Gly Lys
210                 215                 220Met Ala Pro Ser Ser Ala His Phe Val Thr Leu Asn Gly Ser Thr Val225                 230                 235                 240Pro Leu Gly Pro Ala Ser Asp Thr Gly Ile Leu Asn Pro Asp Gly Tyr
            245                 250                 255Thr Leu Asn Tyr Asn Glu Tyr Ile Val Tyr Asn Pro Asn Gln Val Arg
        260                 265                 270Met Arg Tyr Leu Leu Lys Val Gln Phe Asn Phe Leu Gln Leu Trp
    275                 280                 285<210>22<211>1707<212>DNA<213>Mus musculus<220><221>CDS<222>(16)..(1695)<400>22ctcgagtcaa gagcg atg gcg ccg cgg cgg cag aga tca ggc tct gga agg  51
             Met Ala Pro Arg Arg Gln Arg Ser Gly Ser Gly Arg
               1               5                  10cga gtg cta aat gaa gcc aag aaa gtt gat aat ggc aac aaa gca aca   99Arg Val Leu Asn Glu Ala Lys Lys Val Asp Asn Gly Asn Lys Ala Thr
     15                  20                  25gaa gac gac tct cct cct ggc aag aag atg cgc acg tgc cag aga aaa   147Glu Asp Asp Ser Pro Pro Gly Lys Lys Met Arg Thr Cys Gln Arg Lys
 30                  35                  40ggg cct atg gct gga ggg aag gac gca gac agg aca aaa gac aat cga   195Gly Pro Met Ala Gly Gly Lys Asp Ala Asp Arg Thr Lys Asp Asn Arg45                  50                  55                  60gac tct gtg aag acc ttg ctg tta aag ggc aaa gcc cct gtg gac cca   243Asp Ser Val Lys Thr Leu Leu Leu Lys Gly Lys Ala Pro Val Asp Pro
             65                  70                  75gag tgt gca gcc aag ctg gga aag gct cat gtg tat tgt gaa gga gat   291Glu Cys Ala Ala Lys Leu Gly Lys Ala His Val Tyr Cys Glu Gly Asp
         80                  85                  90gat gtc tat gat gtc atg cta aat caa acc aat ctc cag ttc aac aac   339Asp Val Tyr Asp Val Met Leu Asn Gln Thr Asn Leu Gln Phe Asn Asn
     95                 100                 105aac aag tac tac ctt att cag ctg tta gaa gat gat gcc cag agg aac   387Asn Lys Tyr Tyr Leu Ile Gln Leu Leu Glu Asp Asp Ala Gln Arg Asn
110                 115                 120ttc agt gtt tgg atg agg tgg ggc cga gtt gga aag acg ggg cag cac   435Phe Ser Val Trp Met Arg Trp Gly Arg Val Gly Lys Thr Gly Gln His125                 130                 135                 140agc ttg gtg act tgt tct ggt gac ctc aac aaa gca aaa gaa ata ttt   483Ser Leu Val Thr Cys Ser Gly Asp Leu Asn Lys Ala Lys Glu Ile Phe
            145                 150                 155cag aaa aaa ttc ctt gac aaa act aaa aac aat tgg gag gac cgt gag   531Gln Lys Lys Phe Leu Asp Lys Thr Lys Asn Asn Trp Glu Asp Arg Glu
        160                 165                 170aac ttt gaa aaa gta cct gga aaa tac gac atg tta cag atg gac tat   579Asn Phe Glu Lys Val Pro Gly Lys Tyr Asp Met Leu Gln Met Asp Tyr
    175                 180                 185gct gcc agc acg cag gat gaa agt aaa aca aaa gaa gag gaa act ttg   627Ala Ala Ser Thr Gln Asp Glu Ser Lys Thr Lys Glu Glu Glu Thr Leu
190                 195                 200aag cct gag tct cag ctg gat ctt cga gtc cag gag ctg cta aag ttg   675Lys Pro Glu Ser Gln Leu Asp Leu Arg Val Gln Glu Leu Leu Lys Leu205                 210                 215                 220atc tgt aac gtg cag acc atg gaa gaa atg atg att gag atg aag tat   723Ile Cys Asn Val Gln Thr Met Glu Glu Met Met Ile Glu Met Lys Tyr
            225                 230                 235gac acc aag aga gcc ccg ctt gga aag ctg aca gtg gcg caa atc aag   771Asp Thr Lys Arg Ala Pro Leu Gly Lys Leu Thr Val Ala Gln Ile Lys
        240                 245                 250gcc ggt tac cag tct ctc aag aag att gag gac tgc atc cgc gct ggc   819Ala Gly Tyr Gln Ser Leu Lys Lys Ile Glu Asp Cys Ile Arg Ala Gly
    255                 260                 265cag cat ggg cga gcg ctt gtt gaa gcg tgc aat gaa ttc tac acc agg   867Gln His Gly Arg Ala Leu Val Glu Ala Cys Asn Glu Phe Tyr Thr Arg
270                 275                 280atc cct cat gac ttt gga ctc tcc atc cct cca gta atc cgg aca gag   915Ile Pro His Asp Phe Gly Leu Ser Ile Pro Pro Val Ile Arg Thr Glu285                 290                 295                 300aag gaa ctg tca gac aaa gta aaa ctg cta gag gca ttg gga gac att   963Lys Glu Leu Ser Asp Lys Val Lys Leu Leu Glu Ala Leu Gly Asp Ile
            305                 310                 315gaa att gcc ctt aaa ctg gtg aag tca gag cgc caa ggc cta gaa cac   1011Glu Ile Ala Leu Lys Leu Val Lys Ser Glu Arg Gln Gly Leu Glu His
        320                 325                 330cca ctg gac caa cac tat aga aac cta cac tgt gct ttg cgt cct ctg   1059Pro Leu Asp Gln His Tyr Arg Asn Leu His Cys Ala Leu Arg Pro Leu
    335                 340                 345gac cat gaa agt aat gag ttt aag gtg att tct cag tac cta cag tct   1107Asp His Glu Ser Asn Glu Phe Lys Val Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Ser
350                 355                 360acg cat gct cct aca cac aag gac tat act atg acc ttg ctg gat gtt   1155Thr His Ala Pro Thr His Lys Asp Tyr Thr Met Thr Leu Leu Asp Val365                 370                 375                 380ttc gaa gta gag aag gaa ggg gag aaa gag gcc ttc agg gag gac ctt   1203Phe Glu Val Glu Lys Glu Gly Glu Lys Glu Ala Phe Arg Glu Asp Leu
            385                 390                 395cct aac agg atg ctg ctc tgg cat gga tcc agg ctg agt aac tgg gtg   1251Pro Asn Arg Met Leu Leu Trp His Gly Ser Arg Leu Ser Asn Trp Val
        400                 405                 410ggg atc ctg agc cac ggg ctt aga gtt gcc cca cct gag gct ccc atc   1299Gly Ile Leu Ser His Gly Leu Arg Val Ala Pro Pro Glu Ala Pro Ile
    415                 420                 425aca ggt tat atg ttt gga aaa gga atc tac ttt gct gac atg tcc tcc   1347Thr Gly Tyr Met Phe Gly Lys Gly Ile Tyr Phe Ala Asp Met Ser Ser
430                 435                 440aag agt gcc aat tac tgc ttt gcc tct cgc cta aag aat aca gga ttg   1395Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Phe Ala Ser Arg Leu Lys Asn Thr Gly Leu445                 450                 455                 460ctt ctt ctg tca gag gta gct cta ggt cag tgt aat gaa cta ctg gag   1443Leu Leu Leu Ser Glu Val Ala Leu Gly Gln Cys Asn Glu Leu Leu Glu
            465                 470                 475gcc aat cct aaa gca caa gga ttg ctt cgg ggc aag cat agc acc aag   1491Ala Asn Pro Lys Ala Gln Gly Leu Leu Arg Gly Lys His Ser Thr Lys
        480                 485                 490ggg atg gga aag atg gct ccc agc cct gcc cac ttc atc acc ctg aat   1539Gly Met Gly Lys Met Ala Pro Ser Pro Ala His Phe Ile Thr Leu Asn
    495                 500                 505ggg agt aca gtg ccc tta gga cca gca agt gac aca gga att ctc aat   1587Gly Ser Thr Val Pro Leu Gly Pro Ala Ser Asp Thr Gly Ile Leu Asn
510                 515                 520cca gag ggg tac acc ctc aac tac aat gag ttt att gtt tat agc ccc   1635Pro Glu Gly Tyr Thr Leu Asn Tyr Asn Glu Phe Ile Val Tyr Ser Pro525                 530                 535                 540aac cag gtc cgt atg cga tac ctt cta aag att caa ttt aac ttc ctg   1683Asn Gln Val Arg Met Arg Tyr Leu Leu Lys Ile Gln Phe Asn Phe Leu
            545                 550                 555cag cta tgg tga atgttgctcg ag                                     1707Gln Leu Trp
        560<210>23<211>559<212>PRT<213>Mus musculus<400>23Met Ala Pro Arg Arg Gln Arg Ser Gly Ser Gly Arg Arg Val Leu Asn1               5                  10                  15Glu Ala Lys Lys Val Asp Asn Gly Asn Lys Ala Thr Glu Asp Asp Ser
         20                  25                  30Pro Pro Gly Lys Lys Met Arg Thr Cys Gln Arg Lys Gly Pro Met Ala
     35                  40                  45Gly Gly Lys Asp Ala Asp Arg Thr Lys Asp Asn Arg Asp Ser Val Lys
 50                  55                  60Thr Leu Leu Leu Lys Gly Lys Ala Pro Val Asp Pro Glu Cys Ala Ala65                  70                  75                  80Lys Leu Gly Lys Ala His ValTyr Cys Glu Gly Asp Asp Val Tyr Asp
             85                 90                  95Val Met Leu Asn Gln Thr Asn Leu Gln Phe Asn Asn Asn Lys Tyr Tyr
        100                 105                 110Leu Ile Gln Leu Leu Glu Asp Asp Ala Gln Arg Asn Phe Ser Val Trp
    115                 120                 125Met Arg Trp Gly Arg Val Gly Lys Thr Gly Gln His Ser Leu Val Thr
130                 135                 140Cys Ser Gly Asp Leu Asn Lys Ala Lys Glu Ile Phe Gln Lys Lys Phe145                 150                 155                 160Leu Asp Lys Thr Lys Asn Asn Trp Glu Asp Arg Glu Asn Phe Glu Lys
            165                 170                 175Val Pro Gly Lys Tyr Asp Met Leu Gln Met Asp Tyr Ala Ala Ser Thr
        180                 185                 190Gln Asp Glu Ser Lys Thr Lys Glu Glu Glu Thr Leu Lys Pro Glu Ser
    195                 200                 205Gln Leu Asp Leu Arg Val Gln Glu Leu Leu Lys Leu Ile Cys Asn Val
210                 215                 220Gln Thr Met Glu Glu Met Met Ile Glu Met Lys Tyr Asp Thr Lys Arg225                 230                 235                 240Ala Pro Leu Gly Lys Leu Thr Val Ala Gln Ile Lys Ala Gly Tyr Gln
            245                 250                 255Ser Leu Lys Lys Ile Glu Asp Cys Ile Arg Ala Gly Gln His Gly Arg
        260                 265                 270Ala Leu Val Glu Ala Cys Asn Glu Phe Tyr Thr Arg Ile Pro His Asp
    275                 280                 285Phe Gly Leu Ser Ile Pro Pro Val Ile Arg Thr Glu Lys Glu Leu Ser
290                 295                 300Asp Lys Val Lys Leu Leu Glu Ala Leu Gly Asp Ile Glu Ile Ala Leu305                 310                 315                 320Lys Leu Val Lys Ser Glu Arg Gln Gly Leu Glu His Pro Leu Asp Gln
            325                 330                 335His Tyr Arg Asn Leu His Cys Ala Leu Arg Pro Leu Asp His Glu Ser
        340                 345                 350Asn Glu Phe Lys Val Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Ser Thr His Ala Pro
    355                 360                 365Thr His Lys Asp Tyr Thr Met Thr Leu Leu Asp Val Phe Glu Val Glu
370                 375                 380Lys Glu Gly Glu Lys Glu Ala Phe Arg Glu Asp Leu Pro Asn Arg Met385                 390                 395                 400Leu Leu Trp His Gly Ser Arg Leu Ser Asn Trp Val Gly Ile Leu Ser
            405                 410                 415His Gly Leu Arg Val Ala Pro Pro Glu Ala Pro Ile Thr Gly Tyr Met
        420                 425                 430Phe Gly Lys Gly Ile Tyr Phe Ala Asp Met Ser Ser Lys Ser Ala Asn
    435                 440                 445Tyr Cys Phe Ala Ser Arg Leu Lys Asn Thr Gly Leu Leu Leu Leu Ser
450                 455                 460Glu Val Ala Leu Gly Gln Cys Asn Glu Leu Leu Glu Ala Asn Pro Lys465                 470                 475                 480Ala Gln Gly Leu Leu Arg Gly Lys His Ser Thr Lys Gly Met Gly Lys
            485                 490                 495Met Ala Pro Ser Pro Ala His Phe Ile Thr Leu Asn Gly Ser Thr Val
        500                 505                 510Pro Leu Gly Pro Ala Ser Asp Thr Gly Ile Leu Asn Pro Glu Gly Tyr
    515                 520                 525Thr Leu Asn Tyr Asn Glu Phe Ile Val Tyr Ser Pro Asn Gln Val Arg
530                 535                 540Met Arg Tyr Leu Leu Lys Ile Gln Phe Asn Phe Leu Gln Leu Trp545                 550                 555<210>24<211>3045<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(3045)<400>24atg gcg gag tct tcg gat aag ctc tat cga gtc gag tac gcc aag agc   48Met Ala Glu Ser Ser Asp Lys Leu Tyr Arg Val Glu Tyr Ala Lys Ser1               5                  10                  15ggg cgc gcc tct tgc aag aaa tgc agc gag agc atc ccc aag gac tcg   96Gly Arg Ala Ser Cys Lys Lys Cys Ser Glu Ser Ile Pro Lys Asp Ser
         20                  25                  30ctc cgg atg gcc atc atg gtg cag tcg ccc atg ttt gat gga aaa gtc   144Leu Arg Met Ala Ile Met Val Gln Ser Pro Met Phe Asp Gly Lys Val
     35                  40                  45cca cac tgg tac cac ttc tcc tgc ttc tgg aag gtg ggc cac tcc atc   192Pro His Trp Tyr His Phe Ser Cys Phe Trp Lys Val Gly His Ser Ile
 50                  55                  60cgg cac cct gac gtt gag gtg gat ggg ttc tct gag ctt cgg tgg gat   240Arg His Pro Asp Val Glu Val Asp Gly Phe Ser Glu Leu Arg Trp Asp65                  70                  75                  80gac cag cag aaa gtc aag aag aca gcg gaa gct gga gga gtg aca ggc   288Asp Gln Gln Lys Val Lys Lys Thr Ala Glu Ala Gly Gly Val Thr Gly
             85                  90                  95aaa ggc cag gat gga att ggt agc aag gca gag aag act ctg ggt gac   336Lys Gly Gln Asp Gly Ile Gly Ser Lys Ala Glu Lys Thr Leu Gly Asp
        100                 105                 110ttt gca gca gag tat gcc aag tcc aac aga agt acg tgc aag ggg tgt   384Phe Ala Ala Glu Tyr Ala Lys Ser Asn Arg Ser Thr Cys Lys Gly Cys
    115                 120                 125atg gag aag ata gaa aag ggc cag gtg cgc ctg tcc aag aag atg gtg   432Met Glu Lys Ile Glu Lys Gly Gln Val Arg Leu Ser Lys Lys Met Val
130                 135                 140gac ccg gag aag cca cag cta ggc atg att gac cgc tgg tac cat cca   480Asp Pro Glu Lys Pro Gln Leu Gly Met Ile Asp Arg Trp Tyr His Pro145                 150                 155                 160ggc tgc ttt gtc aag aac agg gag gag ctg ggt ttc cgg ccc gag tac   528Gly Cys Phe Val Lys Asn Arg Glu Glu Leu Gly Phe Arg Pro Glu Tyr
            165                 170                 175agt gcg agt cag ctc aag ggc ttc agc ctc ctt gct aca gag gat aaa   576Ser Ala Ser Gln Leu Lys Gly Phe Ser Leu Leu Ala Thr Glu Asp Lys
        180                 185                 190gaa gcc ctg aag aag cag ctc cca gga gtc aag agt gaa gga aag aga   624Glu Ala Leu Lys Lys Gln Leu Pro Gly Val Lys Ser Glu Gly Lys Arg
    195                 200                 205aaa ggc gat gag gtg gat gga gtg gat gaa gtg gcg aag aag aaa tct   672Lys Gly Asp Glu Val Asp Gly Val Asp Glu Val Ala Lys Lys Lys Ser
210                 215                 220aaa aaa gaa aaa gac aag gat agt aag ctt gaa aaa gcc cta aag gct   720Lys Lys Glu Lys Asp Lys Asp Ser Lys Leu Glu Lys Ala Leu Lys Ala225                 230                 235                 240cag aac gac ctg atc tgg aac atc aag gac gag cta aag aaa gtg tgt   768Gln Asn Asp Leu Ile Trp Asn Ile Lys Asp Glu Leu Lys Lys Val Cys
            245                 250                 255tca act aat gac ctg aag gag cta ctc atc ttc aac aag cag caa gtg   816Ser Thr Asn Asp Leu Lys Glu Leu Leu Ile Phe Asn Lys Gln Gln Val
        260                 265                 270cct tct ggg gag tcg gcg atc ttg gac cga gta gct gat ggc atg gtg   864Pro Ser Gly Glu Ser Ala Ile Leu Asp Arg Val Ala Asp Gly Met Val
    275                 280                 285ttc ggt gcc ctc ctt ccc tgc gag gaa tgc tcg ggt cag ctg gtc ttc   912Phe Gly Ala Leu Leu Pro Cys Glu Glu Cys Ser Gly Gln Leu Val Phe
290                 295                 300aag agc gat gcc tat tac tgc act ggg gac gtc act gcc tgg acc aag   960Lys Ser Asp Ala Tyr Tyr Cys Thr Gly Asp Val Thr Ala Trp Thr Lys305                 310                 315                 320tgt atg gtc aag aca cag aca ccc aac cgg aag gag tgg gta acc cca   1008Cys Met Val Lys Thr Gln Thr Pro Asn Arg Lys Glu Trp Val Thr Pro
            325                 330                 335aag gaa ttc cga gaa atc tct tac ctc aag aaa ttg aag gtt aaa aag   1056Lys Glu Phe Arg Glu Ile Ser Tyr Leu Lys Lys Leu Lys Val Lys Lys
        340                 345                 350cag gac cgt ata ttc ccc cca gaa acc agc gcc tcc gtg gcg gcc acg   1104Gln Asp Arg Ile Phe Pro Pro Glu Thr Ser Ala Ser Val Ala Ala Thr
    355                 360                 365cct ccg ccc tcc aca gcc tcg gct cct gct gct gtg aac tcc tct gct   1152Pro Pro Pro Ser Thr Ala Ser Ala Pro Ala Ala Val Asn Ser Ser Ala
370                 375                 380tca gca gat aag cca tta tcc aac atg aag atc ctg act ctc ggg aag   1200Ser Ala Asp Lys Pro Leu Ser Asn Met Lys Ile Leu Thr Leu Gly Lys385                 390                 395                 400ctg tcc cgg aac aag gat gaa gtg aag gcc atg att gag aaa ctc ggg   1248Leu Ser Arg Asn Lys Asp Glu ValLys Ala Met Ile Glu Lys Leu Gly
            405                410                 415ggg aag ttg acg ggg acg gcc aac aag gct tcc ctg tgc atc agc acc   1296Gly Lys Leu Thr Gly Thr Ala Asn Lys Ala Ser Leu Cys Ile Ser Thr
        420                 425                 430aaa aag gag gtg gaa aag atg aat aag aag atg gag gaa gta aag gaa   1344Lys Lys Glu Val Glu Lys Met Asn Lys Lys Met Glu Glu Val Lys Glu
    435                 440                 445gcc aac atc cga gtt gtg tct gag gac ttc ctc cag gac gtc tcc gcc   1392Ala Asn Ile Arg Val Val Ser Glu Asp Phe Leu Gln Asp Val Ser Ala
450                 455                 460tcc acc aag agc ctt cag gag ttg ttc tta gcg cac atc ttg tcc cct   1440Ser Thr Lys Ser Leu Gln Glu Leu Phe Leu Ala His Ile Leu Ser Pro465                 470                 475                 480tgg ggg gca gag gtg aag gca gag cct gtt gaa gtt gtg gcc cca aga   1488Trp Gly Ala Glu Val Lys Ala Glu Pro Val Glu Val Val Ala Pro Arg
            485                 490                 495ggg aag tca ggg gct gcg ctc tcc aaa aaa agc aag ggc cag gtc aag   1536Gly Lys Ser Gly Ala Ala Leu Ser Lys Lys Ser Lys Gly Gln Val Lys
        500                 505                 510gag gaa ggt atc aac aaa tct gaa aag aga atg aaa tta act ctt aaa   1584Glu Glu Gly Ile Asn Lys Ser Glu Lys Arg Met Lys Leu Thr Leu Lys
    515                 520                 525gga gga gca gct gtg gat cct gat tct gga ctg gaa cac tct gcg cat   1632Gly Gly Ala Ala Val Asp Pro Asp Ser Gly Leu Glu His Ser Ala His
530                 535                 540gtc ctg gag aaa ggt ggg aag gtc ttc agt gcc acc ctt ggc ctg gtg   1680Val Leu Glu Lys Gly Gly Lys Val Phe Ser Ala Thr Leu Gly Leu Val545                 550                 555                 560gac atc gtt aaa gga acc aac tcc tac tac aag ctg cag ctt ctg gag   1728Asp Ile Val Lys Gly Thr Asn Ser Tyr Tyr Lys Leu Gln Leu Leu Glu
            565                 570                 575gac gac aag gaa aac agg tat tgg ata ttc agg tcc tgg ggc cgt gtg   1776Asp Asp Lys Glu Asn Arg Tyr Trp Ile Phe Arg Ser Trp Gly Arg Val
        580                 585                 590ggt acg gtg atc ggt agc aac aaa ctg gaa cag atg ccg tcc aag gag   1824Gly Thr Val Ile Gly Ser Asn Lys Leu Glu Gln Met Pro Ser Lys Glu
    595                 600                 605gat gcc att gag cag ttc atg aaa tta tat gaa gaa aaa acc ggg aac   1872Asp Ala Ile Glu Gln Phe Met Lys Leu Tyr Glu Glu Lys Thr Gly Asn
610                 615                 620gct tgg cac tcc aaa aat ttc acg aag tat ccc aaa aag ttt tac ccc   1920Ala Trp His Ser Lys Asn Phe Thr Lys Tyr Pro Lys Lys Phe Tyr Pro625                 630                 635                 640ctg gag att gac tat ggc cag gat gaa gag gca gtg aag aag ctc aca   1968Leu Glu Ile Asp Tyr Gly Gln Asp Glu Glu Ala Val Lys Lys Leu Thr
            645                 650                 655gta aat cct ggc acc aag tcc aag ctc ccc aag cca gtt cag gac ctc   2016Val Asn Pro Gly Thr Lys Ser Lys Leu Pro Lys Pro Val Gln Asp Leu
        660                 665                 670atc aag atg atc ttt gat gtg gaa agt atg aag aaa gcc atg gtg gag   2064Ile Lys Met Ile Phe Asp Val Glu Ser Met Lys Lys Ala Met Val Glu
    675                 680                 685tat gag atc gac ctt cag aag atg ccc ttg ggg aag ctg agc aaa agg   2112Tyr Glu Ile Asp Leu Gln Lys Met Pro Leu Gly Lys Leu Ser Lys Arg
690                 695                 700cag atc cag gcc gca tac tcc atc ctc agt gag gtc cag cag gcg gtg   2160Gln Ile Gln Ala Ala Tyr Ser Ile Leu Ser Glu Val Gln Gln Ala Val705                 710                 715                 720tct cag ggc agc agc gac tct cag atc ctg gat ctc tca aat cgc ttt   2208Ser Gln Gly Ser Ser Asp Ser Gln Ile Leu Asp Leu Ser Asn Arg Phe
            725                 730                 735tac acc ctg atc ccc cac gac ttt ggg atg aag aag cct ccg ctc ctg   2256Tyr Thr Leu Ile Pro His Asp Phe Gly Met Lys Lys Pro Pro Leu Leu
        740                 745                 750aac aat gca gac agt gtg cag gcc aag gtg gaa atg ctt gac aac ctg   2304Asn Asn Ala Asp Ser Val Gln Ala Lys Val Glu Met Leu Asp Asn Leu
    755                 760                 765ctg gac atc gag gtg gcc tac agt ctg ctc agg gga ggg tct gat gat   2352Leu Asp Ile Glu Val Ala Tyr Ser Leu Leu Arg Gly Gly Ser Asp Asp
770                 775                 780agc agc aag gat ccc atc gat gtc aac tat gag aag ctc aaa act gac   2400Ser Ser Lys Asp Pro Ile Asp ValAsn Tyr Glu Lys Leu Lys Thr Asp785                 790                795                 800att aag gtg gtt gac aga gat tct gaa gaa gcc gag atc atc agg aag   2448Ile Lys Val Val Asp Arg Asp Ser Glu Glu Ala Glu Ile Ile Arg Lys
            805                 810                 815tat gtt aag aac act cat gca acc aca cac agt gcg tat gac ttg gaa   2496Tyr Val Lys Asn Thr His Ala Thr Thr His Ser Ala Tyr Asp Leu Glu
        820                 825                 830gtc atc gat atc ttt aag ata gag cgt gaa ggc gaa tgc cag cgt tac   2544Val Ile Asp Ile Phe Lys Ile Glu Arg Glu Gly Glu Cys Gln Arg Tyr
    835                 840                 845aag ccc ttt aag cag ctt cat aac cga aga ttg ctg tgg cac ggg tcc   2592Lys Pro Phe Lys Gln Leu His Asn Arg Arg Leu Leu Trp His Gly Ser
850                 855                 860agg acc acc aac ttt gct ggg atc ctg tcc cag ggt ctt cgg ata gcc   2640Arg Thr Thr Asn Phe Ala Gly Ile Leu Ser Gln Gly Leu Arg Ile Ala865                 870                 875                 880ccg cct gaa gcg ccc gtg aca ggc tac atg ttt ggt aaa ggg atc tat   2688Pro Pro Glu Ala Pro Val Thr Gly Tyr Met Phe Gly Lys Gly Ile Tyr
            885                 890                 895ttc gct gac atg gtc tcc aag agt gcc aac tac tac cat acg tct cag   2736Phe Ala Asp Met Val Ser Lys Ser Ala Asn Tyr Tyr His Thr Ser Gln
        900                 905                 910gga gac cca ata ggc tta atc ctg ttg gga gaa gtt gcc ctt gga aac   2784Gly Asp Pro Ile Gly Leu Ile Leu Leu Gly Glu Val Ala Leu Gly Asn
    915                 920                 925atg tat gaa ctg aag cac gct tca cat atc agc agg tta ccc aag ggc   2832Met Tyr Glu Leu Lys His Ala Ser His Ile Ser Arg Leu Pro Lys Gly
930                 935                 940aag cac agt gtc aaa ggt ttg ggc aaa act acc cct gat cct tca gct   2880Lys His Ser Val Lys Gly Leu Gly Lys Thr Thr Pro Asp Pro Ser Ala945                 950                 955                 960aac att agt ctg gat ggt gta gac gtt cct ctt ggg acc ggg att tca   2928Asn Ile Ser Leu Asp Gly Val Asp Val Pro Leu Gly Thr Gly Ile Ser
            965                 970                 975tct ggt gtg ata gac acc tct cta cta tat aac gag tac att gtc tat   2976Ser Gly Val Ile Asp Thr Ser Leu Leu Tyr Asn Glu Tyr Ile Val Tyr
        980                 985                 990gat att gct cag gta aat ctg aag tat ctg ctg aaa ctg aaa ttc aat   3024Asp Ile Ala Gln Val Asn Leu Lys Tyr Leu Leu Lys Leu Lys Phe Asn
    995                1000                1005ttt aag acc tcc ctg tgg taa                                     3045Phe Lys Thr Ser Leu Trp1010                1015<210>25<211>1014<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>25Met Ala Glu Ser Ser Asp Lys Leu Tyr Arg Val Glu Tyr Ala Lys Ser1               5                  10                  15Gly Arg Ala Ser Cys Lys Lys Cys Ser Glu Ser Ile Pro Lys Asp Ser
         20                  25                  30Leu Arg Met Ala Ile Met Val Gln Ser Pro Met Phe Asp Gly Lys Val
     35                  40                  45Pro His Trp Tyr His Phe Ser Cys Phe Trp Lys Val Gly His Ser Ile
 50                  55                  60Arg His Pro Asp Val Glu Val Asp Gly Phe Ser Glu Leu Arg Trp Asp65                  70                  75                  80Asp Gln Gln Lys Val Lys Lys Thr Ala Glu Ala GIy Gly Val Thr Gly
             85                  90                  95Lys Gly Gln Asp Gly Ile Gly Ser Lys Ala Glu Lys Thr Leu Gly Asp
        100                 105                 110Phe Ala Ala Glu Tyr Ala Lys Ser Asn Arg Ser Thr Cys Lys Gly Cys
    115                 120                 125Met Glu Lys Ile Glu Lys Gly Gln Val Arg Leu Ser Lys Lys Met Val
130                 135                 140Asp Pro Glu Lys Pro Gln Leu Gly Met Ile Asp Arg Trp Tyr His Pro145                 150                 155                 160Gly Cys Phe Val Lys Asn Arg Glu Glu Leu Gly Phe Arg Pro Glu Tyr
            165                 170                 175Ser Ala Ser Gln Leu Lys Gly Phe Ser Leu Leu Ala Thr Glu Asp Lys
        180                 185                 190Glu Ala Leu Lys Lys Gln Leu Pro Gly Val Lys Ser Glu Gly Lys Arg
    195                 200                 205Lys Gly Asp Glu Val Asp Gly Val Asp Glu Val Ala Lys Lys Lys Ser
210                 215                 220Lys Lys Glu Lys Asp Lys Asp Ser Lys Leu Glu Lys Ala Leu Lys Ala225                 230                 235                 240Gln Asn Asp Leu Ile Trp Asn Ile Lys Asp Glu Leu Lys Lys Val Cys
            245                 250                 255Ser Thr Asn Asp Leu Lys Glu Leu Leu Ile Phe Asn Lys Gln Gln Val
        260                 265                 270Pro Ser Gly Glu Ser Ala Ile Leu Asp Arg Val Ala Asp Gly Met Val
    275                 280                 285Phe Gly Ala Leu Leu Pro Cys Glu Glu Cys Ser Gly Gln Leu Val Phe
290                 295                 300Lys Ser Asp Ala Tyr Tyr Cys Thr Gly Asp Val Thr Ala Trp Thr Lys305                 310                 315                 320Cys Met Val Lys Thr Gln Thr Pro Asn Arg Lys Glu Trp Val Thr Pro
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370                 375                 380Ser Ala Asp Lys Pro Leu Ser Asn Met Lys Ile Leu Thr Leu Gly Lys385                 390                 395                 400Leu Ser Arg Asn Lys Asp Glu Val Lys Ala Met Ile Glu Lys Leu Gly
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        420                 425                 430Lys Lys Glu Val Glu Lys Met Asn Lys Lys Met Glu Glu Val Lys Glu
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450                 455                 460Ser Thr Lys Ser Leu Gln Glu Leu Phe Leu Ala His Ile Leu Ser Pro465                 470                 475                 480Trp Gly Ala Glu Val Lys Ala Glu Pro Val Glu Val Val Ala Pro Arg
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        500                 505                 510Glu Glu Gly Ile Asn Lys Ser Glu Lys Arg Met Lys Leu Thr Leu Lys
    515                 520                 525Gly Gly Ala Ala Val Asp Pro Asp Ser Gly Leu Glu His Ser Ala His
530                 535                 540Val Leu Glu Lys Gly Gly Lys Val Phe Ser Ala Thr Leu Gly Leu Val545                 550                 555                 560Asp Ile Val Lys Gly Thr Asn Ser Tyr Tyr Lys Leu Gln Leu Leu Glu
            565                 570                 575Asp Asp Lys Glu Asn Arg Tyr Trp Ile Phe Arg Ser Trp Gly Arg Val
        580                 585                 590Gly Thr Val Ile Gly Ser Asn Lys Leu Glu Gln Met Pro Ser Lys Glu
    595                 600                 605Asp Ala Ile Glu Gln Phe Met Lys Leu Tyr Glu Glu Lys Thr Gly Asn
610                 615                 620Ala Trp His Ser Lys Asn Phe Thr Lys Tyr Pro Lys Lys Phe Tyr Pro625                 630                 635                 640Leu Glu Ile Asp Tyr Gly Gln Asp Glu Glu Ala Val Lys Lys Leu Thr
            645                 650                 655Val Asn Pro Gly Thr Lys Ser Lys Leu Pro Lys Pro Val Gln Asp Leu
        660                 665                 670Ile Lys Met Ile Phe Asp Val Glu Ser Met Lys Lys Ala Met Val Glu
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690                 695                 700Gln Ile Gln Ala Ala Tyr Ser Ile Leu Ser Glu Val Gln Gln Ala Val705                 710                 715                 720Ser Gln Gly Ser Ser Asp Ser Gln Ile Leu Asp Leu Ser Asn Arg Phe
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    755                 760                 765Leu Asp Ile Glu Val Ala Tyr Ser Leu Leu Arg Gly Gly Ser Asp Asp
770                 775                 780Ser Ser Lys Asp Pro Ile Asp Val Asn Tyr Glu Lys Leu Lys Thr Asp785                 790                 795                 800Ile Lys Val Val Asp Arg Asp Ser Glu Glu Ala Glu Ile Ile Arg Lys
            805                 810                 815Tyr Val Lys Asn Thr His Ala Thr Thr His Ser Ala Tyr Asp Leu Glu
        820                 825                 830Val Ile Asp Ile Phe Lys Ile Glu Arg Glu Gly Glu Cys Gln Arg Tyr
    835                 840                 845Lys Pro Phe Lys Gln Leu His Asn Arg Arg Leu Leu Trp His Gly Ser
850                 855                 860Arg Thr Thr Asn Phe Ala Gly Ile Leu Ser Gln Gly Leu Arg Ile Ala865                 870                 875                 880Pro Pro Glu Ala Pro Val Thr Gly Tyr Met Phe Gly Lys Gly Ile Tyr
            885                 890                 895Phe Ala Asp Met Val Ser Lys Ser Ala Asn Tyr Tyr His Thr Ser Gln
        900                 905                 910Gly Asp Pro Ile Gly Leu Ile Leu Leu Gly Glu Val Ala Leu Gly Asn
    915                 920                 925Met Tyr Glu Leu Lys His Ala Ser His Ile Ser Arg Leu Pro Lys Gly
930                 935                 940Lys His Ser Val Lys Gly Leu Gly Lys Thr Thr Pro Asp Pro Ser Ala945                 950                 955                 960Asn Ile Ser Leu Asp Gly Val Asp Val Pro Leu Gly Thr Gly Ile Ser
            965                 970                 975Ser Gly Val Ile Asp Thr Ser Leu Leu Tyr Asn Glu Tyr Ile Val Tyr
        980                 985                 990Asp Ile Ala Gln Val Asn Leu Lys Tyr Leu Leu Lys Leu Lys Phe Asn
    995                1000                1005Phe Lys Thr Ser Leu Trp1010<210>26<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>26cgtcgaccca tggcggagtc ttcggataag ctctatcga                       39<210>27<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>27ggaaacgcgt ttggtgccag gatttactgt cagcttctt                       39<210>28<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>28ttgaaacgcg ttccagagtc acagctagat cttcgggta                        39<210>29<211>88<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>29gtctcgaaag cggccgctta gcctccgaac tgtggatgcc tccacgccca cagctgaagg 60aaattaaact gaacctttaa aaggtacc                                    88<210>30<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>30tttgttcgcc cagactc                                                17<210>31<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>31tatgtttcag gttcaggggg ag                                          22<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>32gcggaagctg gaggagtgac                                     20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>33gtcactcctc cagcttccgc                                     20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>34aagccctgaa gaagcagctc                                     20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>35gagctgcttc ttcagggctt                                     20<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>36cagacaccca accggaagga                                     20<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>37tccttccggt tgggtgtctg                                     20<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>38tccgcctcca ccaagagcct                                     20<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>39aggctcttgg tggaggcgga                                     20<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>40tggcctggtg gacatcgtta                                     20<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>41taacgatgtc caccaggcca                                     20<210>42<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>42gtattcttta ggcgagaggc                                     20<210>43<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>43tgacgaagtg ggcagaactg                                     20<210>44<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>44gagcaccccc tggaccagca c                                   21<210>45<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>45acagcgacta taccatgacc                                     20<210>46<211>3200<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：hPARP1/hPARP2
 Fusion<400>46atgagaggct cccatcacca tcaccatcac gattacgata tcccaacgac cgaaaacctg 60tattttcagg gcgccatgga tccggaattc aaaggcctac gtcgacccat ggcggagtct 120tcggataagc tctatcgagt cgagtacgcc aagagcgggc gcgcctcttg caagaaatgt 180agcgagagca tccccaagga ctcgctccgg atggccatca tggtgcagtc gcccatgttt 240gatggaaaag tcccacactg gtaccacttc tcctgcttct ggaaggtggg ccactccatc 300cggcaccctg acgttgaggt ggatgggttc tctgagcttc ggtgggatga ccagcagaaa 360gtcaagaaga cagcggaagc tggaggagtg acaggcaaag gccaggatgg aattggtagc 420aaggcagaga agactctggg tgactttgca gcagagtatg tcaagtccaa cagaagtacg 480tgcaaggggt gtatggagaa gatagaaaag ggccaggtgc gcctgtccaa gaagatggtg 540gacccggaga agccacagct aggcatgatt gaccgctggt accatccagg ctgctttgtc 600aagaacaggg aggagctggg tttccggccc gagtacagtg cgagtcagct caagggcttc 660agcctccttg ctacagagga taaagaagcc ctgaagaagc agctcccagg agtcaagagt 720gaaggaaaga gtaaaggcga tgaggtggat ggagtggatg aagtggcgaa gaagaaatct 780aaaaaagaaa aagacaagga tagtaagctt gaaaaagccc taaaggctca gaacgacctg 840atctggaaca tcaaggacga gctaaagaaa gtgtgttcaa ctaatgacct gaaggagcta 900ctcatcttca acaagcagca agtgccttct ggggagtcgg cgatcttgga ccgagtagct 960gatggcatgg tgttcggtgc cctccttccc tgcgaggaat gctcgggtca gctggtcttc 1020aagagcgatg cctattactg cactggggac gtcactgcct ggaccaagtg tatggtcaag 1080acacagacac ccaaccggaa ggagtgggta accccaaagg aattccgaga aatctcttac 1140ctcaagaaat tgaaggttaa aaagcaggac cgtatattcc ccccagaaac cagcgcctcc 1200gtggcggcca cgcctccgcc ctccacagcc tcggctcctg ctgctgtgaa ctcctctgct 1260tcagcagata agccattatc caacatgaag atcctgactc tcgggaagct gtcccggaac 1320aaggatgaag tgaaggccat gattgagaaa ctcgggggga agttgacggg gacggccaac 1380aaggcttccc tgtgcatcag caccaaaaag gaggtggaaa agatgaataa gaagatggag 1440gaagtaaagg aagccaacat ccgagttgtg tctgaggact tcctccagga cgtctccgcc 1500tccaccaaga gccttcagga gttgttctta gcgcacatct tgtccccttg gggggcagag 1560gtgaaggcag agcctgttga agttgtggcc ccaagaggga agtcaggggc tgcgctctcc 1620aaaaaaagca agggccaggt caaggaggaa ggtatcaaca aatctgaaaa gagaatgaaa 1680ttaactctta aaggaggagc agctgtggat cctgattctg gactggaaca ctctgcgcat 1740gtcctggaga aaggtgggaa ggtcttcagt gccacccttg gcctggtgga catcgttaaa 1800ggaaccaact cctactacaa gctgcagctt ctggaggacg acaaggaaaa caggtattgg 1860atattcaggt cctggggccg tgtgggtacg gtgatcggta gcaacaaact ggaacagatg 1920ccgtccaagg aggatgccat tgagcacttc atgaaattat atgaagaaaa aaccgggaac 1980gcttggcact ccaaaaattt cacgaagtat cccaaaaagt tctaccccct ggagattgac 2040tatggccagg atgaagaggc agtgaagaag ctgacagtaa atcctggcac caaacgcgtt 2100ccagagtcac agctagatct tcgggtacag gagttaataa agttgatctg taatgttcag 2160gccatggaag aaatgatgat ggaaatgaag tataatacca agaaagcccc tcttgggaag 2220ctgacagtgg cgcaaatcaa ggcaggttac cagtctctta agaagattga ggattgtatt 2280cgggctggcc agcatggacg agctctcatg gaagcatgca atgaattcta caccaggatt 2340ccgcatgact ttggactccg tactcctcca ctaatccgga cacagaagga actgtcagaa 2400aaaatacaat tactagaggc tttgggagac attgaaattg ctattaagct ggtgaaaaca 2460gagctacaaa gcccagaaca cccattggac caacactata gaaacctaca ttgtgccttg 2520cgcccccttg accatgaaag ttacgagttc aaagtgattt cccagtacct acaatctacc 2580catgctccca cacacagcga ctataccatg accttgctgg atttgtttga agtggagaag 2640gatggtgaga aagaagcctt cagagaggac cttcataaca ggatgcttct atggcatggt 2700tccaggatga gtaactgggt gggaatcttg agccatgggc ttcgaattgc cccacctgaa 2760gctcccatca caggttacat gtttgggaaa ggaatctact ttgctgacat gtcttccaag 2820agtgccaatt actgctttgc ctctcgccta aagaatacag gactgctgct cttatcagag 2880gtagctctag gtcagtgtaa tgaactacta gaggccaatc ctaaggccga aggattgctt 2940caaggtaaac atagcaccaa ggggctgggc aagatggctc ccagttctgc ccacttcgtc 3000accctgaatg ggagtacagt gccattagga ccagcaagtg acacaggaat tctgaatcca 3060gatggttata ccctcaacta caatgaatat attgtatata accccaacca ggtccgtatg 3120cggtaccttt taaaggttca gtttaatttc cttcagctgt gggcgtggag gcatccacag 3180ttcggaggct aagcggccgc                                             3200<210>47<211>1063<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：hPARP1/hPARP2
 Fusion<400>47Met Arg Gly Ser His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr1               5                  10                  15Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Lys Gly
         20                  25                  30Leu Arg Arg Pro Met Ala Glu Ser Ser Asp Lys Leu Tyr Arg Val Glu
     35                  40                  45Tyr Ala Lys Ser Gly Arg Ala Ser Cys Lys Lys Cys Ser Glu Ser Ile
 50                  55                  60Pro Lys Asp Ser Leu Arg Met Ala Ile Met Val Gln Ser Pro Met Phe65                  70                  75                  80Asp Gly Lys Val Pro His Trp Tyr His Phe Ser Cys Phe Trp Lys Val
             85                  90                  95Gly His Ser Ile Arg His Pro Asp Val Glu Val Asp Gly Phe Ser Glu
        100                 105                 110Leu Arg Trp Asp Asp Gln Gln Lys Val Lys Lys Thr Ala Glu Ala Gly
    115                 120                125Gly Val Thr Gly Lys Gly Gln Asp Gly Ile Gly Ser Lys Ala Glu Lys
130                 135                 140Thr Leu Gly Asp Phe Ala Ala Glu Tyr Val Lys Ser Asn Arg Ser Thr145                 150                 155                 160Cys Lys Gly Cys Met Glu Lys Ile Glu Lys Gly Gln Val Arg Leu Ser
            165                 170                 175Lys Lys Met Val Asp Pro Glu Lys Pro Gln Leu Gly Met Ile Asp Arg
        180                 185                 190Trp Tyr His Pro Gly Cys Phe Val Lys Asn Arg Glu Glu Leu Gly Phe
    195                 200                 205Arg Pro Glu Tyr Ser Ala Ser Gln Leu Lys Gly Phe Ser Leu Leu Ala
210                 215                 220Thr Glu Asp Lys Glu Ala Leu Lys Lys Gln Leu Pro Gly Val Lys Ser225                 230                 235                 240Glu Gly Lys Ser Lys Gly Asp Glu Val Asp Gly Val Asp Glu Val Ala
            245                 250                 255Lys Lys Lys Ser Lys Lys Glu Lys Asp Lys Asp Ser Lys Leu Glu Lys
        260                 265                 270Ala Leu Lys Ala Gln Asn Asp Leu Ile Trp Asn Ile Lys Asp Glu Leu
    275                 280                 285Lys Lys Val Cys Ser Thr Asn Asp Leu Lys Glu Leu Leu Ile Phe Asn
290                 295                 300Lys Gln Gln Val Pro Ser Gly Glu Ser Ala Ile Leu Asp Arg Val Ala305                 310                 315                 320Asp Gly Met Val Phe Gly Ala Leu Leu Pro Cys Glu Glu Cys Ser Gly
            325                 330                 335Gln Leu Val Phe Lys Ser Asp Ala Tyr Tyr Cys Thr Gly Asp Val Thr
        340                 345                 350Ala Trp Thr Lys Cys Met Val Lys Thr Gln Thr Pro Asn Arg Lys Glu
    355                 360                 365Trp Val Thr Pro Lys Glu Phe Arg Glu Ile Ser Tyr Leu Lys Lys Leu
370                 375                 380Lys Val Lys Lys Gln Asp Arg Ile Phe Pro Pro Glu Thr Ser Ala Ser385                 390                 395                 400Val Ala Ala Thr Pro Pro Pro Ser Thr Ala Ser Ala Pro Ala Ala Val
            405                 410                 415Asn Ser Ser Ala Ser Ala Asp Lys Pro Leu Ser Asn Met Lys Ile Leu
        420                 425                 430Thr Leu Gly Lys Leu Ser Arg Asn Lys Asp Glu Val Lys Ala Met Ile
    435                 440                 445Glu Lys Leu Gly Gly Lys Leu Thr Gly Thr Ala Asn Lys Ala Ser Leu
450                 455                 460Cys Ile Ser Thr Lys Lys Glu Val Glu Lys Met Asn Lys Lys Met Glu465                 470                 475                 480Glu Val Lys Glu Ala Asn Ile Arg Val Val Ser Glu Asp Phe Leu Gln
            485                 490                 495Asp Val Ser Ala Ser Thr Lys Ser Leu Gln Glu Leu Phe Leu Ala His
        500                 505                 510Ile Leu Ser Pro Trp Gly Ala Glu Val Lys Ala Glu Pro Val Glu Val
    515                 520                 525Val Ala Pro Arg Gly Lys Ser Gly Ala Ala Leu Ser Lys Lys Ser Lys
530                 535                 540Gly Gln Val Lys Glu Glu Gly Ile Asn Lys Ser Glu Lys Arg Met Lys545                 550                 555                 560Leu Thr Leu Lys Gly Gly Ala Ala Val Asp Pro Asp Ser Gly Leu Glu
            565                 570                 575His Ser Ala His Val Leu Glu Lys Gly Gly Lys Val Phe Ser Ala Thr
        580                 585                 590Leu Gly Leu Val Asp Ile Val Lys Gly Thr Asn Ser Tyr Tyr Lys Leu
    595                 600                 605Gln Leu Leu Glu Asp Asp Lys Glu Asn Arg Tyr Trp Ile Phe Arg Ser
610                 615                 620Trp Gly Arg Val Gly Thr Val Ile Gly Ser Asn Lys Leu Glu Gln Met625                 630                 635                 640Pro Ser Lys Glu Asp Ala Ile Glu His Phe Met Lys Leu Tyr Glu Glu
            645                 650                 655Lys Thr Gly Asn Ala Trp His Ser Lys Asn Phe Thr Lys Tyr Pro Lys
        660                 665                 670Lys Phe Tyr Pro Leu Glu Ile Asp Tyr Gly Gln Asp Glu Glu Ala Val
    675                 680                 685Lys Lys Leu Thr Val Asn Pro Gly Thr Lys Arg Val Pro Glu Ser Gln
690                 695                 700Leu Asp Leu Arg Val Gln Glu Leu Ile Lys Leu Ile Cys Asn Val Gln705                 710                 715                 720Ala Met Glu Glu Met Met Met Glu Met Lys Tyr Asn Thr Lys Lys Ala
            725                 730                 735Pro Leu Gly Lys Leu Thr Val Ala Gln Ile Lys Ala Gly Tyr Gln Ser
        740                 745                 750Leu Lys Lys Ile Glu Asp Cys Ile Arg Ala Gly Gln His Gly Arg Ala
    755                 760                 765Leu Met Glu Ala Cys Asn Glu Phe Tyr Thr Arg Ile Pro His Asp Phe
770                 775                 780Gly Leu Arg Thr Pro Pro Leu Ile Arg Thr Gln Lys Glu Leu Ser Glu785                 790                 795                 800Lys Ile Gln Leu Leu Glu Ala Leu Gly Asp Ile Glu Ile Ala Ile Lys
            805                 810                 815Leu Val Lys Thr Glu Leu Gln Ser Pro Glu His Pro Leu Asp Gln His
        820                 825                 830Tyr Arg Asn Leu His Cys Ala Leu Arg Pro Leu Asp His Glu Ser Tyr
    835                 840                 845Glu Phe Lys Val Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Ser Thr His Ala Pro Thr
850                 855                 860His Ser Asp Tyr Thr Met Thr Leu Leu Asp Leu Phe Glu Val Glu Lys865                 870                 875                 880Asp Gly Glu Lys Glu Ala Phe Arg Glu Asp Leu His Asn Arg Met Leu
            885                 890                 895Leu Trp His Gly Ser Arg Met Ser Asn Trp Val Gly Ile Leu Ser His
        900                 905                 910Gly Leu Arg Ile Ala Pro Pro Glu Ala Pro Ile Thr Gly Tyr Met Phe
    915                 920                 925Gly Lys Gly Ile Tyr Phe Ala Asp Met Ser Ser Lys Ser Ala Asn Tyr
930                 935                 940Cys Phe Ala Ser Arg Leu Lys Asn Thr Gly Leu Leu Leu Leu Ser Glu945                 950                 955                 960Val Ala Leu Gly Gln Cys Asn Glu Leu Leu Glu Ala Asn Pro Lys Ala
            965                 970                 975Glu Gly Leu Leu Gln Gly Lys His Ser Thr Lys Gly Leu Gly Lys Met
        980                 985                 990Ala Pro Ser Ser Ala His Phe Val Thr Leu Asn Gly Ser Thr Val Pro
    995                1000                1005Leu Gly Pro Ala Ser Asp Thr Gly Ile Leu Asn Pro Asp Gly Tyr Thr1010                1015                1020Leu Asn Tyr Asn Glu Tyr Ile Val Tyr Asn Pro Asn Gln Val Arg Met1025               1030                1035                1040Arg Tyr Leu Leu Lys Val Gln Phe Asn Phe Leu Gln Leu Trp Ala Trp
           1045                1050                1055Arg His Pro Gln Phe Gly Gly
       1060<210>48<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>48cgtcgaccca tggcggcgcg gcggcgacgg agcaccggc                39<210>49<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>49tggaacgcgt ttcaagggag atttaagaga ttcctcttt                39<210>50<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>50ccaggtccgt atgcggtacc                                     20<210>51<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>51gccacgatgg gtaccgcggc cgctcaccac agctgaagg                39<210>52<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>52ggtgacgaag tgggcagaac                                     20<210>53<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>53ttctgcccac ttcgtcaccc                                     20<210>54<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>54cgcaaggcac aatgtaggtt                                     20<210>55<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>55gcctctcgcc taaagaatac                                     20<210>56<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>56aagcaatcct tcggccttag                                     20<210>57<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>57agttctgccc acttcgtcac                                     20<210>58<211>1874<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：hPARP2+His标志<400>58atgagaggct cccatcacca tcaccatcac gattacgata tcccaacgac cgaaaacctg 60tattttcagg gcgccatgga tccggaattc aaaggcctac gtcgacccat ggcggcgcgg 120cggcgacgga gcaccggcgg cggcagggcg agagcattaa atgaaagcaa aagagttaat 180aatggcaaca cggctccaga agactcttcc cctgccaaga aaactcgtag atgccagaga 240caggagtcga aaaagatgcc tgtggctgga ggaaaagcta ataaggacag gacagaagac 300aagcaagatg gtatgccagg aaggtcatgg gccagcaaaa gggtctccga atctgtgaag 360gccttgctgt taaagggcaa agctcctgtg gacccagagt gtacagccaa ggtggggaag 420gctcatgtgt attgtgaagg aaatgatgtc tatgatgtca tgctaaatca gaccaatctc 480cagttcaaca acaacaagta ctatctgatt cagctattag aagatgatgc ccagaggaac 540ttcagtgttt ggatgagatg gggccgagtt gggaaaatgg gacagcacag cctggtggct 600tgttcaggca atctcaacaa ggccaaggaa atctttcaga agaaattcct tgacaaaacg 660aaaaacaatt gggaagatcg agaaaagttt gagaaggtgc ctggaaaata tgatatgcta 720cagatggact atgccaccaa tactcaggat gaagaggaaa caaagaaaga ggaatctctt 780aaatctccct tgaagccaga gtcacagcta gatcttcggg tacaggagtt aataaagttg 840atctgtaatg ttcaggccat ggaagaaatg atgatggaaa tgaagtataa taccaagaaa 900gcccctcttg ggaagctgac agtggcgcaa atcaaggcag gttaccagtc tcttaagaag 960attgaggatt gtattcgggc tggccagcat ggacgagctc tcatggaagc atgcaatgaa 1020ttctacacca ggattccgca tgactttgga ctccgtactc ctccactaat ccggacacag 1080aaggaactgt cagaaaaaat acaattacta gaggctttgg gagacattga aattgctatt 1140aagctggtga aaacagagct acaaagccca gaacacccat tggaccaaca ctatagaaac 1200ctacattgtg ccttgcgccc ccttgaccat gaaagttacg agttcaaagt gatttcccag 1260tacctacaat ctacccatgc tcccacacac agcgactata ccatgacctt gctggatttg 1320tttgaagtgg agaaggatgg tgagaaagaa gccttcagag aggaccttca taacaggatg 1380cttctatggc atggttccag gatgagtaac tgggtgggaa tcttgagcca tgggcttcga 1440attgccccac ctgaagctcc catcacaggt tacatgtttg ggaaaggaat ctactttgct 1500gacatgtctt ccaagagtgc caattactgc tttgcctctc gcctaaagaa tacaggactg 1560ctgctcttat cagaggtagc tctaggtcag tgtaatgaac tactagaggc caatcctaag 1620gccgaaggat tgcttcaagg taaacatagc accaaggggc tgggcaagat ggctcccagt 1680tctgcccact tcgtcaccct gaatgggagt acagtgccat taggaccagc aagtgacaca 1740ggaattctga atccagatgg ttataccctc aactacaatg aatatattgt atataacccc 1800aaccaggtcc gtatgcggta ccttttaaag gttcagttta atttccttca gctgtggtga 1860gcggccgcgg tacc                                                   1874<210>59<211>619<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：hPARP2+His标志<400>59Met Arg Gly Ser His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr1               5                  10                  15Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Lys Gly
         20                  25                  30Leu Arg Arg Pro Met Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser Thr Gly Gly Gly
     35                  40                  45Arg Ala Arg Ala Leu Asn Glu Ser Lys Arg Val Asn Asn Gly Asn Thr
 50                  55                  60Ala Pro Glu Asp Ser Ser Pro Ala Lys Lys Thr Arg Arg Cys Gln Arg65                  70                  75                  80Gln Glu Ser Lys Lys Met Pro Val Ala Gly Gly Lys Ala Asn Lys Asp
             85                  90                  95Arg Thr Glu Asp Lys Gln Asp Gly Met Pro Gly Arg Ser Trp Ala Ser
        100                 105                 110Lys Arg Val Ser Glu Ser Val Lys Ala Leu Leu Leu Lys Gly Lys Ala
    115                 120                 125Pro Val Asp Pro Glu Cys Thr Ala Lys Val Gly Lys Ala His Val Tyr
130                 135                 140Cys Glu Gly Asn Asp Val Tyr Asp Val Met Leu Asn Gln Thr Asn Leu145                 150                 155                 160Gln Phe Asn Asn Asn Lys Tyr Tyr Leu Ile Gln Leu Leu Glu Asp Asp
            165                 170                 175Ala Gln Arg Asn Phe Ser Val Trp Met Arg Trp Gly Arg Val Gly Lys
        180                 185                 190Met Gly Gln His Ser Leu Val Ala Cys Ser Gly Asn Leu Asn Lys Ala
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210                 215                 220Glu Asp Arg Glu Lys Phe Glu Lys Val Pro Gly Lys Tyr Asp Met Leu225                 230                 235                 240Gln Met Asp Tyr Ala Thr Asn Thr Gln Asp Glu Glu Glu Thr Lys Lys
            245                 250                 255Glu Glu Ser Leu Lys Ser Pro Leu Lys Pro Glu Ser Gln Leu Asp Leu
        260                 265                 270Arg Val Gln Glu Leu Ile Lys Leu Ile Cys Asn Val Gln Ala Met Glu
    275                 280                 285Glu Met Met Met Glu Met Lys Tyr Asn Thr Lys Lys Ala Pro Leu Gly
290                 295                 300Lys Leu Thr Val Ala Gln Ile Lys Ala Gly Tyr Gln Ser Leu Lys Lys305                 310                 315                 320Ile Glu Asp Cys Ile Arg Ala Gly Gln His Gly Arg Ala Leu Met Glu
            325                 330                 335Ala Cys Asn Glu Phe Tyr Thr Arg Ile Pro His Asp Phe Gly Leu Arg
        340                 345                 350Thr Pro Pro Leu Ile Arg Thr Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Ile Gln
    355                 360                 365Leu Leu Glu Ala Leu Gly Asp Ile Glu Ile Ala Ile Lys Leu Val Lys
370                 375                 380Thr Glu Leu Gln Ser Pro Glu His Pro Leu Asp Gln His Tyr Arg Asn385                 390                 395                 400Leu His Cys Ala Leu Arg Pro Leu Asp His Glu Ser Tyr Glu Phe Lys
            405                 410                 415Val Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Ser Thr His Ala Pro Thr His Ser Asp
        420                 425                 430Tyr Thr Met Thr Leu Leu Asp Leu Phe Glu Val Glu Lys Asp Gly Glu
    435                 440                 445Lys Glu Ala Phe Arg Glu Asp Leu His Asn Arg Met Leu Leu Trp His
450                 455                 460Gly Ser Arg Met Ser Asn Trp Val Gly Ile Leu Ser His Gly Leu Arg465                 470                 475                 480Ile Ala Pro Pro Glu Ala Pro Ile Thr Gly Tyr Met Phe Gly Lys Gly
            485                 490                 495Ile Tyr Phe Ala Asp Met Ser Ser Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Phe Ala
        500                 505                 510Ser Arg Leu Lys Asn Thr Gly Leu Leu Leu Leu Ser Glu Val Ala Leu
    515                 520                 525Gly Gln Cys Asn Glu Leu Leu Glu Ala Asn Pro Lys Ala Glu Gly Leu
530                 535                 540Leu Gln Gly Lys His Ser Thr Lys Gly Leu Gly Lys Met Ala Pro Ser545                 550                 555                 560Ser Ala His Phe Val Thr Leu Asn Gly Ser Thr Val Pro Leu Gly Pro
            565                 570                 575Ala Ser Asp Thr Gly Ile Leu Asn Pro Asp Gly Tyr Thr Leu Asn Tyr
        580                 585                 590Asn Glu Tyr Ile Val Tyr Asn Pro Asn Gln Val Arg Met Arg Tyr Leu
    595                 600                 605Leu Lys Val Gln Phe Asn Phe Leu Gln Leu Trp
610                 615<210>60<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>60ggagacattg aaattgctat                                         20<210>61<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>61gaacacccat tggaccaaca c                                            21<210>62<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>62gaggtatata ttaatgtatc g                                            21<210>63<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>63gatttaatct gtatcagg                                                18<210>64<211>738<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：hPARP2片段+c-末端His标志<400>64ggagacattg aaattgctat taagctggtg aaaacagagc tacaaagccc agaacaccca  60ttggaccaac actatagaaa cctacattgt gccttgcgcc cccttgacca tgaaagttac 120gagttcaaag tgatttccca gtacctacaa tctacccatg ctcccacaca cagcgactat 180accatgacct tgctggattt gtttgaagtg gagaaggatg gtgagaaaga agccttcaga 240gaggaccttc ataacaggat gcttctatgg catggttcca ggatgagtaa ctgggtggga 300atcttgagcc atgggcttcg aattgcccca cctgaagctc ccatcacagg ttacatgttt 360gggaaaggaa tctactttgc tgacatgtct tccaagagtg ccaattactg ctttgcctct 420cgcctaaaga atacaggact gctgctctta tcagaggtag ctctaggtca gtgtaatgaa 480ctactagagg ccaatcctaa ggccgaagga ttgcttcaag gtaaacatag caccaagggg 540ctgggcaaga tggctcccag ttctgcccac ttcgtcaccc tgaatgggag tacagtgcca 600ttaggaccag caagtgacac aggaattctg aatccagatg gttataccct caactacaat 660gaatatattg tatataaccc caaccaggtc cgtatgcggt accttttaaa ggttcagttt 720aatttccttc agctgtgg                                               738<210>65<211>275<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：hPARP2片段+C-末端His标志<400>65Gly Asp Ile Glu Ile Ala Ile Lys Leu Val Lys Thr Glu Leu Gln Ser1               5                  10                  15Pro Glu His Pro Leu Asp Gln His Tyr Arg Asn Leu His Cys Ala Leu
         20                  25                  30Arg Pro Leu Asp His Glu Ser Tyr Glu Phe Lys Val Ile Ser Gln Tyr
     35                  40                  45Leu Gln Ser Thr His Ala Pro Thr His Ser Asp Tyr Thr Met Thr Leu
 50                  55                  60Leu Asp Leu Phe Glu Val Glu Lys Asp Gly Glu Lys Glu Ala Phe Arg65                  70                  75                  80Glu Asp Leu His Asn Arg Met Leu Leu Trp His Gly Ser Arg Met Ser
             85                  90                  95Asn Trp Val Gly Ile Leu Ser His Gly Leu Arg Ile Ala Pro Pro Glu
        100                 105                 110Ala Pro Ile Thr Gly Tyr Met Phe Gly Lys Gly Ile Tyr Phe Ala Asp
    115                 120                 125Met Ser Ser Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Phe Ala Ser Arg Leu Lys Asn
130                 135                 140Thr Gly Leu Leu Leu Leu Ser Glu Val Ala Leu Gly Gln Cys Asn Glu145                 150                 155                 160Leu Leu Glu Ala Asn Pro Lys Ala Glu Gly Leu Leu Gln Gly Lys His
            165                 170                 175Ser Thr Lys Gly Leu Gly Lys Met Ala Pro Ser Ser Ala His Phe Val
        180                 185                 190Thr Leu Asn Gly Ser Thr Val Pro Leu Gly Pro Ala Ser Asp Thr Gly
    195                 200                 205Ile Leu Asn Pro Asp Gly Tyr Thr Leu Asn Tyr Asn Glu Tyr Ile Val
210                 215                 220Tyr Asn Pro Asn Gln Val Arg Met Arg Tyr Leu Leu Lys Val Gln Phe225                 230                 235                 240Asn Phe Leu Gln Leu Trp Lys Gly Glu Phe Glu Ala Tyr Val Glu Gln
            245                 250                 255Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His
        260                 265                 270His His His
    275<210>66<211>687<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：hPARP2片段+C-末端His标志<400>66gaacacccat tggaccaaca ctatagaaac ctacattgtg ccttgcgccc ccttgaccat 60gaaagttacg agttcaaagt gatttcccag tacctacaat ctacccatgc tcccacacac 120agcgactata ccatgacctt gctggatttg tttgaagtgg agaaggatgg tgagaaagaa 180gccttcagag aggaccttca taacaggatg cttctatggc atggttccag gatgagtaac 240tgggtgggaa tcttgagcca tgggcttcga attgccccac ctgaagctcc catcacaggt 300tacatgtttg ggaaaggaat ctactttgct gacatgtctt ccaagagtgc caattactgc 360tttgcctctc gcctaaagaa tacaggactg ctgctcttat cagaggtagc tctaggtcag 420tgtaatgaac tactagaggc caatcctaag gccgaaggat tgcttcaagg taaacatagc 480accaaggggc tgggcaagat ggctcccagt tctgcccact tcgtcaccct gaatgggagt 540acagtgccat taggaccagc aagtgacaca ggaattctga atccagatgg ttataccctc 600aactacaatg aatatattgt atataacccc aaccaggtcc gtatgcggta ccttttaaag 660gttcagttta atttccttca gctgtgg                                     687<210>67<211>258<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：hPARP2片段+C-末端His标志<400>67Glu His Pro Leu Asp Gln His Tyr Arg Asn Leu His Cys Ala Leu Arg1               5                  10                  15Pro Leu Asp His Glu Ser Tyr Glu Phe Lys Val Ile Ser Gln Tyr Leu
         20                  25                  30Gln Ser Thr His Ala Pro Thr His Ser Asp Tyr Thr Met Thr Leu Leu
     35                  40                  45Asp Leu Phe Glu Val Glu Lys Asp Gly Glu Lys Glu Ala Phe Arg Glu
 50                  55                  60Asp Leu His Asn Arg Met Leu Leu Trp His Gly Ser Arg Met Ser Asn65                  70                  75                  80Trp Val Gly Ile Leu Ser His Gly Leu Arg Ile Ala Pro Pro Glu Ala
             85                  90                  95Pro Ile Thr Gly Tyr Met Phe Gly Lys Gly Ile Tyr Phe Ala Asp Met
        100                 105                 110Ser Ser Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Phe Ala Ser Arg Leu Lys Asn Thr
    115                 120                 125Gly Leu Leu Leu Leu Ser Glu Val Ala Leu Gly Gln Cys Asn Glu Leu
130                 135                 140Leu Glu Ala Asn Pro Lys Ala Glu Gly Leu Leu Gln Gly Lys His Ser145                 150                 155                 160Thr Lys Gly Leu Gly Lys Met Ala Pro Ser Ser Ala His Phe Val Thr
            165                 170                 175Leu Asn Gly Ser Thr Val Pro Leu Gly Pro Ala Ser Asp Thr Gly Ile
        180                 185                 190Leu Asn Pro Asp Gly Tyr Thr Leu Asn Tyr Asn Glu Tyr Ile Val Tyr
    195                 200                 205Asn Pro Asn Gln Val Arg Met Arg Tyr Leu Leu Lys Val Gln Phe Asn
210                 215                 220Phe Leu Gln Leu Trp Lys Gly Glu Phe Glu Ala Tyr Val Glu Gln Lys225                 230                 235                 240Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His
            245                 250                 255His His

Claims (32)

1.一种纯化、分离的hPARP2多肽，包括序列2定义的氨基酸序列或其功能衍生物。
2.编码权利要求1的hPARP2多肽的多核苷酸。
3.权利要求2的多核苷酸，包括序列1定义的核苷酸序列。
4.编码hPARP2多肽的多核苷酸，选自：
a)权利要求2的多核苷酸
b)权利要求3的多核苷酸，以及
c)在中度严格的杂交条件下，能够与a)或b)多核苷酸互补序列
  杂交的多核苷酸序列。
5.权利要求4的多核苷酸编码的hPARP2多肽。
6.权利要求4的多核苷酸，可以是DNA分子，也可以是RNA分子。
7.权利要求6的多核苷酸，还进一步包括可检测标记部分。
8.一种表达构建物，包括权利要求4的多核苷酸。
9.应用权利要求8的表达构建物转化或转染的宿主细胞。
10.权利要求4的多核苷酸，其中多核苷酸可以与异源启动子操作性连接。
11.  包括权利要求10多核苷酸的宿主细胞。
12.制备具有序列2定义的氨基酸序列的多肽的方法，包括以下步骤：
a)在适宜多肽表达的条件下，培养权利要求9或11的宿主细
  胞；以及
b)从宿主细胞中或宿主细胞生长的培养基中分离多肽。
13.能够与权利要求1的多肽发生特异性免疫反应的抗体。
14.权利要求13的抗体，其中抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体(scFv抗体)、嵌合抗体、多功能/多特异性抗体、人源化抗体、人类抗体、CDR-移植物抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、双抗体、线形抗体、单链抗体分子、以及由多个抗体片段构成的多特异性抗体。
15.产生权利要求13的抗体的细胞系。
16.能够与权利要求14的抗体发生特异性免疫反应的抗独特型抗体。
17.鉴定权利要求1的hPARP2多肽特异性结合配体的方法，包括：
a)在一定条件下，将hPARP2多肽与待测化合物混和，所述条
  件允许hPARP2多肽与待测化合物结合；
b)检测待测化合物与hPARP2多肽的结合；并
c)确定待测化合物是hPARP2多肽的特异性结合配体。
18.权利要求17的方法，其中所述特异性结合配体可以调节hPARP2多肽的生物活性。
19.权利要求18的方法，其中所述特异性结合配体抑制hPARP2多肽的生物活性。
20.权利要求18的方法，其中所述特异性结合配体增强hPARP2多肽的生物活性。
21.鉴定权利要求2的hparp2多核苷酸特异性结合配体的方法，包括：
a)在一定条件下，将hparp2多核苷酸与待测化合物混和，所述
  条件允许hparp2多核苷酸与待测化合物结合；
b)检测待测化合物与hparp2多核苷酸的结合；并
c)确定待测化合物是hparp2多核苷酸的特异性结合配体。
22.权利要求21的方法，其中所述特异性结合配体可以调节hPARP2多肽的表达。
23.权利要求21的方法，其中所述特异性结合配体抑制hPARP2多肽的表达。
24.权利要求21的方法，其中所述特异性结合配体增强hPARP2多肽的表达。
25.一种治疗人类疾病的方法，该疾病由聚(ADP-核糖)聚合酶活性介导，方法包括给所述患病个体治疗有效剂量的hPARP2拮抗剂，抑制权利要求1的多肽的表达或活性。
26.权利要求25的方法，其中hPARP1拮抗剂抑制hPARP1。
27.权利要求25的方法，其中所述疾病选自炎症性疾病，神经系统疾病，心血管系统疾病，以及肿瘤组织生长性疾病。
28.权利要求27的方法，其中所述疾病是一种炎症性疾病。
29.权利要求25的方法，其中所述疾病以再灌注损伤为特征。
30.权利要求29的方法，其中所述疾病选自缺血性脑卒中，出血性休克，心肌缺血或梗塞，移植以及脑血管痉挛。
31.权利要求28的方法，其中所述疾病选自类风湿关节炎，骨关节炎，痛风关节炎，脊柱炎；Behcet病；脓毒血症，感染性休克，内毒素性休克，革兰阴性菌脓毒血症，革兰阳性菌脓毒血症，中毒性休克综合征；继发于败血症、创伤或出血的多器官损伤综合征；过敏性结膜炎，春季结膜炎，葡萄膜炎，甲状腺相关性眼病；嗜酸性粒细胞肉芽肿；哮喘，慢性支气管炎，过敏性鼻炎，ARDS，慢性阻塞性肺病，硅肺，肺结节病，胸膜炎，齿槽炎，脉管炎，肺炎，支气管扩张，肺氧毒性；心肌、脑或四肢的再灌注损伤；囊性纤维化；瘢痕疙瘩形成，瘢痕组织形成；动脉硬化；系统性红斑狼疮，自身免疫性甲状腺炎，多发性硬化；雷诺综合征；移植物抗宿主病，同种移植物排斥反应；慢性肾小球性肾炎；炎症性肠病，局限性回肠炎，溃疡性结肠炎，坏死性小肠结肠炎；炎症性皮肤病，接触性皮炎，遗传性过敏性皮炎，银屑病，风疹，感染导致的发热和肌痛；脑膜炎，脑炎，由于轻微损伤导致的脑、脊髓损伤；Sjogren’s综合征；涉及白细胞渗出的疾病；酒精性肝炎；细菌性肺炎；抗原抗体复合物介导的疾病；低血容量性休克；I型糖尿病；急性和迟发性过敏反应；由于白细胞不调和转移导致的疾病状态；热损伤；粒细胞输注相关性综合征；以及细胞因子诱导的毒性。
32.在细胞中抑制聚(ADP-核糖)聚合酶活性的方法，包括使所述细胞与有效剂量的hPARP2拮抗剂混和，抑制权利要求1的多肽的表达或活性。
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