JP2008086314A - インテグリン結合キナーゼ（ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｎｋｅｄｋｉｎａｓｅ）、その阻害剤およびこれらの阻害剤を用いる医学的治療の方法、遺伝子治療ならびに偽基質阻害剤 - Google Patents

Abstract

【課題】インテグリン結合キナーゼＩＬＫの単離および精製されたセリン／トレオニンキナーゼの提供。
【解決手段】ＩＬＫは、細胞増殖の調整、細胞接着の調整、細胞移動の調整、および細胞浸潤の調整に用いることができる。ＩＬＫ活性の阻害剤には、（１）ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＩＬＫの構造的成分に向けての遮蔽物、（２）ＩＬＫに対する偽基質阻害剤、および（３）ＩＬＫ活性を特異的に阻害する薬物が含まれる。これらの阻害剤によって治療される疾患には、癌、白血病、固形腫瘍、慢性炎症性疾患、関節炎、骨粗鬆症および心血管疾患が含まれる。ＩＬＫ活性の診断法には、ＩＬＫのヌクレオチド配列に由来するＤＮＡに基づく試薬、およびＩＬＫに対する抗体による生検由来の増幅されたＩＬＫ ＤＮＡの試料、またはＩＬＫ ｍＲＮＡもしくは蛋白質の発現増強の選別が含まれる。また、ＩＬＫ活性を特異的に阻害する薬物をスクリーニングするアッセイ法を提供。
【選択図】なし

Description

背景
細胞外基質（ECM）の蛋白質は、基本的な細胞および組織に作用してその挙動に影響を及ぼす。ECMは細胞の構造、増殖、生存、分化、運動性を調節し、生物体レベルでは適切な発生の調節を行う。ECM蛋白質はインテグリンと呼ばれる1つのクラスの細胞膜貫通性受容体（cell membrane-spanning receptor）を介して細胞と相互作用する。ECMは生物シグナルであり、インテグリン受容体はこのシグナルの（細胞原形質膜の両端にまたがる）特異的な変換器（transducer）である。インテグリンは増殖性疾患においても重要であり、創傷治癒および炎症、血管新生のほかに、腫瘍の転移および浸潤などの過程を媒介する。

ECM-インテグリン相互作用に対する主な生化学的反応は、蛋白質リン酸化として知られる酵素活性の上昇である。リン酸化は成長因子またはホルモンなどの細胞外生物シグナルに対する受容体によって媒介されるシグナル伝達において重要である。例えば、多くの発癌遺伝子（オンコジーン）は、蛋白質リン酸化反応を触媒する酵素であるプロテインキナーゼであるか、リン酸化によって特異的に調節される。さらに、キナーゼはその活性が1つまたはそれ以上の異なるプロテインキナーゼによって調節を受けることができ、それによって特異的なシグナル伝達カスケードがもたらされる。

シグナル伝達に関する長年の研究により、シグナル伝達経路の特異化の基礎をなす主要な機序として、細胞質における直接的な蛋白質-蛋白質相互作用が重要であることは明らかに立証されている。これらの相互作用の一部は、受容体と細胞質プロテインキナーゼとの間、またはプロテインキナーゼとその基質分子との間のものでありうる。

マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）、フォーカルアドヒージョンキナーゼ（FAK）およびプロテインキナーゼC（PKC）などの数多くの既知のプロテインキナーゼのキナーゼ活性はインテグリン-ECM相互作用によって誘発されるが、現時点ではまだ、生理的条件下でインテグリン分子と結合することが示されている細胞性プロテインキナーゼは同定されていない。このような状況であるため、インテグリンと、細胞性蛋白質のECM誘導性リン酸化との間の直接的な分子的関係は不明である。

このような状況であるため、インテグリンと細胞性蛋白質のECM誘導性リン酸化との間の直接的な分子的関係が明らかになれば、この関係を調整（modulate）する製品は有用な治療薬になると考えられる。このような製品は、細胞増殖、細胞接着、細胞移動および細胞浸潤を調整するために使用できると考えられる。仮に特異的なキナーゼがインテグリン機能を調節していることが明らかになれば、そのキナーゼの活性を調節する（例えば阻害する）製品は、癌、白血病、固形腫瘍、慢性炎症性疾患、関節炎および骨粗鬆症をはじめとする適応症の治療に用いられると考えられる。

発明の概要
本発明は、本明細書で「ILK」と称するインテグリン結合キナーゼ（integrin-linked kinase）である、単離および精製されたセリン／トレオニンキナーゼに関する。ILKは生細胞においてβ_１インテグリン分子の細胞質部分と結合し、インテグリンとプロテインキナーゼとの間の相互作用に関する第一の生理学的証拠を提供する。

ILKは、細胞増殖の調整、細胞接着の調整、細胞移動の調整および細胞浸潤の調整に用いることができる。ILKのアミノ酸配列およびそのアミノ酸配列をコードする単離されたヌクレオチド分子は本発明の一部である。この分子は、cDNA、センスDNA、アンチセンスDNA、1本鎖DNA、2本鎖DNAのいずれであってもよい。インテグリン結合キナーゼのmRNAは本発明の一部である。この分子は、セリン／トレオニンキナーゼの欠陥のあるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド分子であってもよい。

ILK活性の阻害剤は本発明の一部である。阻害剤には、(1)アンチセンスILK（すなわち、ILK mRNA相補物を特異的に標的とするように設計された、ILKコード領域の相補的ヌクレオチド配列を含む合成DNAオリゴヌクレオチド）などのDNA、RNAまたはILKの構造的要素に向けた遮蔽物（screen）、(2)ILKに対する基質配列を模したペプチドなどの偽基質阻害剤、および(3)ILK活性を特異的に阻害する薬物が含まれる。これらの薬物は、キナーゼまたはアンキリンリピートドメインのいずれかを指向してもよい。阻害剤には、抗生物質、インテグリン結合キナーゼの天然または模倣性の基質、およびキナーゼの第2のヌクレオチド分子と結合する第1のヌクレオチド分子を含むこともできる。第2のヌクレオチド分子はmRNA、cDNA、センスDNA、アンチセンスDNA、1本鎖DNAおよび2本鎖DNAのいずれでもよい。

本発明には、セリン／トレオニンキナーゼの阻害剤の使用、セリン／トレオニンキナーゼに対する天然もしくは模倣性の基質の使用、またはキナーゼの第2のヌクレオチド分子と結合する第1のヌクレオチド分子の使用によって哺乳動物における疾患を治療する方法が含まれる。この方法には、例えば任意のベクター（ウイルス性または非ウイルス性）による遺伝子またはcDNAの送達などの遺伝子治療を含むこともできる。疾患は、癌、白血病、固形腫瘍、慢性炎症性疾患、関節炎、骨粗鬆症および心血管疾患からなる群より選択されるものであってよい。阻害剤、基質または分子に関する担体は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤であると考えられる。ヌクレオチド分子の場合には、担体はリポソームでもありうる。

ILK活性の診断薬は本発明の一部である。診断薬にはILKのヌクレオチド分子、ILKまたはその阻害剤が含まれる。ILKのヌクレオチド配列に由来するDNAに基づく試薬、およびILKに対する抗体によって、生検由来の増幅されたILK DNAの試料、またはILK mRNAもしくは蛋白質の発現増強が選別される。

ILK活性を特異的に阻害する薬物を選別するアッセイは本発明の範囲内に含まれる。これらのアッセイは、ILKのDNA、mRNAまたはアミノ酸配列に基づくことができる。

本発明には、細胞活性を調整するためにILK活性の阻害剤を担体と合わせて含む医薬品が含まれる。

好ましい態様の詳細な説明
本発明により、本発明者らはインテグリンとILKとの間に物理的な関係があることを示した。より重要なことに、本発明者らは、ILK蛋白質の調節不全性の（dysregulated）発現によってインテグリンの機能が調整されることを示し、これによってILKとインテグリンとの間に生物的関係があることを提供した。ILKの調節不全性の発現により、細胞増殖、細胞接着、細胞移動および細胞浸潤が調整される。このため、ILKの調節不全性発現の活性を阻害する製品は、癌、白血病、固形腫瘍、慢性炎症性疾患、関節炎および骨粗鬆症をはじめとする適応症の治療において治療的な効果を有する。

ILK蛋白質は1.8キロ塩基対のmRNA（1.8 kb mRNA）によってコードされる。このmRNAの配列を用いてこの蛋白質の一次アミノ酸配列を導出したところ、予測される分子量は50キロダルトン（kDa）であった。分析用ポリアクリルアミド電気泳動ゲル上の組換え蛋白質の移動によって示された見かけの分子量は59kDaであり、これは予測されたサイズと大まかに一致した。ILKの配列と最新の蛋白質データベース中に見いだされる配列とを比較した結果、ILK蛋白質（以下ではp59^ＩＬＫと記す）の導出された構造から2つの機能的ドメインが同定された。これらはホスホトランスフェラーゼ活性をもたらす触媒ドメイン（キナーゼドメイン）、および4つの連続したアンキリン類似物を含むアミノ末端の非重複ドメインである。

ILKにおけるアンキリンリピートの機能は、蛋白質-蛋白質相互作用を媒介することである。ILKアンキリンリピートドメインはp59^ＩＬＫのインテグリンとの結合には必要ではなく、これはおそらくp59^ＩＬＫの別の細胞性蛋白質との相互作用を媒介すると思われる。したがって、p59^ＩＬＫは、細胞内蛋白質がECMシグナルに対する細胞の反応の調節作用を有する状態で、インテグリンを原形質膜に架橋する。これらの蛋白質は細胞質内に局在するか、細胞の構造的枠組み（細胞骨格）の一部として局在すると考えられるが、まだ同定されていない。

ILKの新規性は、本酵素の鍵となる構造および機能的な特徴にある。本酵素は構造的には、1つのプロテインキナーゼおよび1つのアンキリンリピートドメインが同一蛋白質内に含まれるという点で非凡な分子的構造を呈する。このキナーゼドメインは現在のデータベースにある他のキナーゼ配列からみて極めて保存性が高く（すなわち、類似しており）、この保存された構造に基づいて典型的なサブドメイン（IからXIまで）に分けることができる。しかし、他のすべてのプロテインキナーゼドメインのサブドメインVIb中に特定の前後関係で存在する1つのアミノ酸は特にILK中には認められない。このような独特な構造的特徴を有するとはいえ、ILKは明らかにプロテインキナーゼとして作用し、このためプロテインキナーゼ分子の新たなサブファミリーの原型（prototype）となるメンバーである可能性がある。

ILKの商業的な可能性の高さは、それがインテグリンサブユニットとの直接的な相互作用を介してインテグリンの細胞外活性（ECM相互作用）を細胞の内側から調節すること（インテグリンの分野では「インサイド・アウト（inside-out）」シグナル伝達として知られる）と直接的に関係している。ILK活性を妨げることによって、他の本質的なシグナル伝達経路には影響を及ぼさずに、インテグリン機能への特異的なターゲティングが可能となる。さらに、細胞内ILK活性レベルを高めることにより、細胞増殖の調節にECMとの接着（すなわち、インテグリンの機能）を要するという正常な要求性が回避される。このため、ILK活性を阻害することによって付着非依存的な（すなわち癌性の）細胞増殖が阻害されると考えられる。

したがって、治療的な観点からは、ILK活性を阻害することには、炎症および癌を含む数多くの増殖性疾患に対する治療的効果がある。阻害は数多くの方法によって達成される：(1)アンチセンスILK（すなわち、ILK mRNA相補物を特異的に標的とするように設計された、ILKコード領域の相補的ヌクレオチド配列を含む合成DNAオリゴヌクレオチド）などの、ILKのDNA、RNAもしくはILKの構造的要素に向けた遮蔽物（screen）によるもの、(2)例えばILKに対する基質の配列を模したペプチドなどの偽基質阻害剤、または(3)例えばインビトロもしくはインビボでのILKキナーゼ活性などのILKに基づく機能アッセイでILK活性の阻害をアッセイすることによるもの。

精製された組換えILK蛋白質の結晶化によって得られるILKの3次元構造に関する知識から、ILK活性を特異的に阻害する低分子薬の合理的な設計が可能となる。これらの薬物は、キナーゼまたはアンキリンリピートドメインのいずれかを指向するものであってもよい。

診断薬の見地からは、例えばPCRプライマー、オリゴヌクレオチド、cDNAプローブなどのILK配列に由来するDNAに基づく試薬ならびにp59^ＩＬＫに対する抗体は、増幅されたILK DNAまたはILK mRNAもしくは蛋白質の発現増強に関して、生検由来の腫瘍または例えば関節炎性滑膜などの炎症試料をスクリーニングするために用いられる。DNAに基づく試薬は、例えば異型接合性の喪失（LOH）に関する試験における使用のためなどの特定の疾患に関係する染色体座の評価、またはILKコード配列に基づくプライマーの設計のために設計される。

ILKの染色体座が領域11p15にあることがマッピングされた段階で、乳癌サブセットは染色体領域11p15.5においてマーカーに関するLOHを呈することが明らかになった。この領域は遺伝性の心不整脈であるQT延長症候群とも関係することが示されている。ILK mRNAの発現レベルが高いことから、心臓組織ではILKにインテグリン非依存的な機能があることが示される。

実施例1 ILKのcDNAおよびILKの単離
部分的cDNAであるBIT-9を、β_１インテグリンサブユニットの細胞質ドメインを発現するおとり（bait）プラスミドを用いるツーハイブリッドスクリーニング^４にて単離した。BIT-9挿入物を用いて、ヒト胎盤cDNAライブラリーからクローンを単離した。1.8kbのクローンであるPlac5がプロテインキナーゼをコードするcDNAと高度の類似性を有することが判明し（図1a〜c）、ノーザンブロットにて広範に発現された1.8kbの転写物が認められた（図1d）。Plac5から導出されたアミノ酸残基186〜451には、多数のプロテインチロシンキナーゼおよびセリン／トレオニンキナーゼの触媒ドメインとの高度の相同性を有するドメインが含まれる（図1b）。残基33〜164は赤血球アンキリンで最初に同定されたモチーフ^５を4回反復して含んでおり（図1c）、これが付加的な蛋白質-蛋白質相互作用^６，７の媒介に関与するドメインを規定すると考えられる。アフィニティ精製された抗ILK抗体（実施例3に記載する方法を参照のこと）を哺乳動物細胞抽出物のウェスタンブロット分析に用い、見かけの分子量が59kDaである保存された蛋白質（p59^ＩＬＫ、図1e）が検出された。

図1は、ILKの酵母ツーハイブリッドクローニング、特徴分析および発現を示している。a、完全長ILK cDNAであるPlac5を、BIT-9挿入物を用いてヒト胎盤ライブラリーから単離した。Plac5は1509bpのオープンリーディングフレームを含み、同時に推定上の開始Met^１７をnt157に有し、ポリアデニル化部位の11bp上流にAAUAAAシグナルを有する。ウサギ網状赤血球溶解物におけるPlac5のインビトロ転写および翻訳により、見かけの分子量が59kDaの蛋白質が得られた（提示せず）。b、PIR蛋白質データベースの探索^１８により、ハンクス（Hanks）^１９らが同定したプロテインキナーゼのサブドメインI〜XIとの相同性が示された。本発明者らは、ILKサブドメインのI、VIbおよびVIIには既知のプロテインキナーゼの触媒ドメインと比較して配列変動がみられることを特記する。サブドメインI（残基199〜213）は、ILK中でこの領域がGlyに富むにもかかわらず、典型的なGXGXXGモチーフを有していない。サブドメインVIbでは、ILKのAsp^３２８は通常は保存的であるAsp^３１９の欠失を補完すると考えられる。サブドメインVIIでは、ILK中にDFGトリプレットは存在しない。インテグリン結合部位はアミノ酸残基293〜451（BIT-9）にマッピングされる。ILKキナーゼドメインはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のCTR1キナーゼと最も高度に関連している（一致率30％、P＜10^−１３）。CTR1、B-raf、YesおよびCskキナーゼドメインはPlac5と並んでいる。c．アミノ酸残基33〜164は、ラックス（Lux）ら^５によって規定された4つの連続したアンキリンリピートを含む。d、さまざまなヒト組織由来のポリA+で選択されたRNA（MNT I、Clontech）のブロットのプローブ標識にはBIT-9を用いた。e、マウス、ラットおよびヒト細胞系（10μg／レーン）の全細胞溶解物を、アフィニティ精製された92-2抗体を用いるウェスタンブロットによって分析した（実施例3における方法の説明を参照のこと）。ILKの配列データは、寄託番号U40282としてジェンバンク（Genbank）から入手可能である。

インテグリンの「おとり」プラスミド^２０を構築するために、β_１のアミノ酸残基738〜798およびα5インテグリンサブユニットの残基1022〜1049をコードする配列を完全長cDNAから増幅した^２１。用いたプライマーは、(a)5'増幅では^５’-GGCCGAATTCGCTGGAATTGTTCTTATTGGC-^３’、および(b)3'増幅では^５’-GGCCGGATCCTCATTTTCCCTCATACTTCGG-^３’である。PCR産物を定方向的にpEG202中にクローニングし、LexA融合おとりプラスミドであるpEG202β_１INTおよびpEG202α_５INTを作製した。pEG202β_１INTおよびpEG202α_５INTは、宿主株EGY48（Massachusetts General HospitalのErica Golemisによって作製されたMATα、his3、trp1、ura3-52、LEU2::pLEU2-LexAop6）において、pJK101からのβ-gal発現をそれぞれ50〜60％および70〜75％抑制し、このことからLexA融合物が核で発現することが裏づけられた。おとりとpSH18-34レポーターとの同時形質転換により、それらが転写的に不活性であることが確認された（提示せず）。ガラクトース誘導性のHela cDNA相互作用物（interactor）ライブラリーはTRP+ベクターであるpJG4-5上に存在していた（MGHのJeno Gyurisが作製したもの）。β_１相互作用トラップのために、酢酸リチウム法^２２を用いて、pEG202β_１INT、pSH18-34およびpJG4-5によってEGY48に順次、形質転換を施した（形質転換効率＝5〜6×10^４／μg）。2×10^６個の一次形質転換株をスクリーニングしたところ、相互作用する49個のクローンが確認された。最も頻度の高かった単離物（31/49）は700bp挿入物であるBIT-9であった。BIT-9、pSH18-64およびpEG202β_１INTによるEGY48の再形質転換によってβ-ガラクトシダーゼの高度の発現が得られ、相互作用が裏づけられた。pEG202α_５INTをおとりとして用いた同じスクリーニングでは、16個の陽性株が分離されたが、いずれも49個の一連のβ_１相互作用株には含まれていなかった。捕捉された挿入物を用いて、標準的な手順^２３により、WM35ヒト悪性黒色腫λgt10およびヒト胎盤λgt11 cDNAライブラリーをスクリーニングした。各ライブラリーからの多数のクローンに関するcDNAシークエンシングはジデオキシチェーンターミネーション法（Sequenase 2.0、U.S. Biochemical）を用いて行った。本発明者らはデータ解析にジェネティクスコンピュータグループ（Genetics Copmputer Group）社のソフトウェアパッケージ（バージョン7.0）を用い、データベース検索は米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）のBLAST^１８サーバーを介して実施した。

実施例2 インビトロでのILKの分析
インビトロでのキナーゼ活性の分析のために、細菌に発現させた融合蛋白質であるGST-ILK^１３２をSDS-PAGEバンドにて精製し、外因性基質であるミエリン塩基性蛋白質の存在下または非存在下において[γ-^３２P]ATPとともにインキュベートした（図2）。これらのアッセイにおいてGST-ILK^１３２は自己リン酸化し、MBPを効率的に標識した（図2a）。PC3細胞溶解物の抗GST-ILK^１３２（抗体91-3）との免疫沈降物を、精製された組換えGST-ILK^１３２を用いて実施した実験と同様に、[γ-^３２P]ATPとともにインキュベートした。ILKの免疫複合体は、p59^ＩＬＫに相当する見かけの分子量59kDaの蛋白質（図2b）、ならびに内因性ILK基質と思われる見かけの分子量32kDaおよび70kDaの細胞性蛋白質を標識した（図2b）。また、本発明者らは、β_１インテグリン特異的免疫複合体キナーゼアッセイにおいて、約32kDaおよび70kDaの細胞リン蛋白質（セリン／トレオニン）も認めている（提示せず）。

ILK免疫複合体キナーゼアッセイにおいて、β_３細胞質ドメインを呈する合成ペプチドはリン酸化されたが、β_３細胞質ドメインを呈する同様のペプチドはp59^ＩＬＫによる検出可能な標識は受けなかった。β_１ペプチドはこれらの反応におけるILKの自己リン酸化を阻害したが（図2b）、これはペプチドとILKとの相互作用が多様であることをさらに示す。内因性ILKによる合成βペプチドのリン酸化を示す以上の結果は、組換えGST-ILK^１３２を用いた際に認められた結果と一致しており（提示せず）、ILKがβ_１の細胞質尾部に対する基質親和性を有する可能性が高いことを示す。しかし、これはILKとβ_３インテグリン細胞質ドメインとの相互作用を必ずしも否定するものではない。免疫複合体キナーゼアッセイによる標識されたp59^ＩＬＫおよびMBPに関するリン酸化アミノ酸分析では、いずれの基質においてもホスホセリンのみが検出され（図2c）、これらの基質をGST-ILK^１３２によってリン酸化した場合も同じであった（提示せず）。β_１ペプチドはセリンおよびトレオニン残基で標識されており、その化学量数はほぼ等しい（図2）。対照物としての同じ溶解物からの抗FAK^８，９免疫複合体をMBPのリン酸化に関して分析したところ、ホスホチロシンが直ちに検出された（提示せず）。

図2は、インビトロおよび免疫複合体のキナーゼアッセイを示している。a、ゲル精製された2μgのGST-ILK^１３２を含めたインビトロキナーゼ反応を、ミエリン塩基性蛋白質（MBP、Upstate Biotechnologies, Inc.）5μgの存在下または非存在下において10％SDS-PAGEを用いて分析した。b、免疫複合体は、アフィニティー精製された91-3抗体を用いて、PC3全細胞溶解物から作製した。β_１もしくはβ_３インテグリン細胞質ドメイン^２４またはMBPを呈する合成ペプチド5μg／反応物の添加および非添加時のキナーゼ活性に関して複合体をアッセイした（提示せず）。産物を15％SDS-PAGE（左側はkDaマーカー）によって分析し、クーマシーブルー染色によってペプチドの移動を確認した。c、bに示した抗ILK免疫複合体キナーゼ反応の^３２P標識産物を単離し、ホスホアミノ酸の含有量に関してアッセイした。抗FAK^８，９免疫複合体キナーゼアッセイではMBP上にホスホチロシンが認められた（提示せず）。

10μCiの[γ-^３２P]ATPを含むキナーゼ反応用緩衝液（50mM HEPES pH7.0、10mM MnCl_２、10mM MgCl_２、2mM NaF、1mM Na_３VO_４）50μl中にてプロテインキナーゼアッセイを実施した。反応物を30℃で20分間インキュベートした後、SDS-PAGE試料用緩衝液を添加して反応を停止させた。組換えILK活性のアッセイに関して、GST-ILK^１３２は細菌溶解物からグルタチオン-アガロースビーズ上に吸着されるか、またはGST-ILK^１３２は10％SDS-PAGEゲルによってバンド精製された。免疫複合体キナーゼアッセイについては、アフィニティ精製された91-3抗ILK抗体（図3、方法）を用いて、PC3細胞のNP-40溶解物（150mM NaCl、1％（v/v）NP-40、0.5％（w/v）デオキシコール酸ナトリウム、50mM HEPES pH7.5、各1μg／mlのロイペプチンおよびアプロチニン、50μg／mlのフェニルメチルスルホニルフルオリド）から免疫沈降物を作製した。キナーゼ反応産物は10〜15％SDS-PAGEゲル上で分離し、PVDFに移行させた後、発表されている手順に従ってホスホアミノ酸分析を実施した^２５。

実施例3 哺乳動物細胞におけるILKとbインテグリンとの会合
免疫蛍光実験により、ILKおよびβインテグリンが限局性の斑の中に共存することが示された（提示せず）。この会合を無損傷の哺乳動物細胞においてさらに試験するために、本発明者らは、インテグリンの発現がすでに詳しく特徴分析されているPC3細胞の溶解物における免疫共沈アッセイを実施した^１０。PC3細胞の溶解物を特異的な抗インテグリン抗体^１３によって免疫沈降させ、抗ILK抗体92-2を用いるウェスタンブロット法によって免疫複合体を分析した。抗ILK抗体の特異性は免疫沈降およびウェスタンブロット法によって試験した（図3a、b）。本発明者らは、抗フィブロネクチン受容体（FNR、α_５/α_３ βインテグリン）および抗ビトロネクチン受容体（VNR、α_ｖβ_３／β_５インテグリン）の各抗体を用いて得られた免疫複合体にてp59^ＩＬＫを検出したが、非免疫性血清を用いて得られたものでは検出されなかった（図3c）。3つの抗β_１モノクローナル抗体もPC3溶解物からのp59^ＩＬＫと免疫共沈を生じ、このことからp59^ＩＬＫの相互作用がβインテグリンに特異的であることが裏づけられた（図3d）。抗VNR免疫複合体中にp59^ＩＬＫが検出されたことから、ILKがβ_３および／またはβ_５インテグリンサブユニットとも相互作用することが示唆される。

図3は、GST-ILK^１３２に対する抗体が、インテグリン免疫共沈においてp59^ＩＬＫを認識することを示している。a、分画化していないポリクローナル抗ILK血清91-3（図示）および92-2は、見かけの分子量が59kDaの代謝的に標識された細胞性蛋白質^３５S-メチオニンを特異的に認識する。フルオログラフを示す（En^３Hance、NEN）。b、アフィニティ精製された92-2抗体は165μgのアガロース共役GST-ILK^１３２またはアガロース-GSTによって吸収され、この2つの調製物はPC3細胞、ジャーカットTリンパ芽球または60kDa GST-ILK^１３２の全細胞溶解物を10μg／レーンで含む平行ウェスタンブロットに用いた。c、PC3細胞由来の表面ビオチン化インテグリンの沈降にはフィブロネクチンおよびビトロネクチン受容体に特異的なポリクローナル抗インテグリン抗体を用い、続いてアフィニティ精製されたビオチン標識92-2抗体を用いるウェスタンブロット法により、p59^ＩＬＫの存在に関して免疫複合体を分析した。この結果は6回の独立した実験の代表例である。d、PC3のNP-40溶解物の共沈分析には抗-β_１モノクローナル抗体を用いた：レーン1、AIIB2；レーン2、抗CD29；レーン3、3S3。アフィニティ精製され、ビオチン化された92-2抗体による抗β_１免疫複合体のウェスタンブロット分析（左）。このブロットを剥がして同一濃度のビオチン化92-2によって再度プローブ標識した後、過剰量のGST-ILK^１３２ビーズに吸収させた（右）。本発明者らの観察では、11種の抗b1モノクローナル抗体を用いた場合にはp59^ＩＬＫの共沈が認められたが、抗CD44モノクローナル抗体によっては認められなかった（提示せず）。p59^ＩＬＫの移動はPC3全細胞NP-40溶解物を含む平行レーンにて確認した。左側はkDaのマーカーである。

ILKのアミノ酸残基132〜451は、大腸菌内でGST融合蛋白質として発現された。組換えGST-ILK^１３２蛋白質を精製し、これを用いてウサギ2匹に注射した。この結果得られた抗血清である91-3および92-2（Research Genetics, Incが作製したもの）を、CNBrセファロースを共役させたGST-ILK^１３２のカラムを通してアフィニティ精製した。PC3細胞をシステイン／メチオニン非含有MEM中に18時間置き、100μCi／mlの[^３５S]メチオニン／[^３５S]システイン（[^３５S]ProMix、1000Ci／mmol、Amersham）による代謝的標識を施した。免疫共沈実験のために、PC3細胞にはNP-40緩衝液中に溶解する前にスルホ-NHS-ビオチン^２６（Pierce Chemicals）によって表面標識を施した。ポリクローナル抗フィブロネクチン受容体抗体（抗FNR、Telios A108）および抗ビトロネクチン受容体抗体（抗VNR、Telios A109）はGibco/BRLから購入した。NP-40溶解物の1〜2mgを、2〜3μl／mlの抗FNRもしくは抗VNR抗血清または2μg／mlの抗β_１モノクローナル抗体AIIB2（C.Damsky, UC, San Francisco）、抗CD29（Upstate Biotecnology, Inc）、および3S3（J. Wilkins, U Manitoba）とともに4℃でインキュベートした。溶解物はあらかじめ清澄化し、プロテインA-セファロースとともに免疫複合体を収集した。ウェスタンブロット法のために、RIPA^２７溶解物または免疫複合体を7.5％または10％のSDS-PAGEにかけ、続いて蛋白質を電気泳動的にポリビニリデンフルオリド膜（Immobilon-P、Millipore）に移行させた。5％脱脂乳／Tris緩衝生理食塩水Tween-20中にて膜をブロックし、0.5μg／mlのアフィニティ精製された抗体とともにインキュベートした。二次インキュベーションには西洋ワサビペルオキシダーゼと共役させたヤギ抗ウサギIgGを用い、続いて強化ケミルミネッセンス系（enhanced chemiluminescence）（ECL、Amersham）によって反応性バンドを検出した。二次抗体を用いずにブロット法を行うために（図3）、アフィニティ精製した92-2抗体を製造者の手順書に従ってビオチンヒドラジド（Immunopure、Pierce Chemicals）によって標識し、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Jackson ImmunoResearch Laboratories）およびECLによって可視化した。再プローブ標識のために、製造者の指示に従って膜を剥がした。

実施例4 ILKの過剰発現は増殖上の利点を提供する
本発明者らは次に、ILKキナーゼ活性のフィブロネクチン依存的な調節について試験した。ラット腸上皮細胞であるIEC-18^１１をフィブロネクチン上に平板培養した場合には、プラスチック上に平板培養した細胞または懸濁液中においた細胞と比べて、免疫複合体キナーゼアッセイにおけるMBPのILKによるリン酸化は低下した（図4a）。このフィブロネクチン依存的なILK活性の低下は、活性化されたH-ras対立遺伝子を発現しているIEC-18細胞では抑止され^１１、これらの細胞ではILK活性のECMによる調節がras形質転換によって破壊されていることが示された。完全長ILKのcDNAを含む発現ベクターであるpCMV-ILKは、IEC-18細胞に安定的にトランスフェクトされた。pCMV-ILKの12個の安定性のクローンのそれぞれおよびベクター対照形質転換株を選択し、p59^ＩＬＫの発現レベルについて特徴を分析した。2つの代表的な過剰発現性のサブクローンであるILK13-A1a3および-A1a4を図示する（図4b）。p59^ＩＬＫの過剰発現によってIEC-18細胞の上皮形態は破壊された。ILK13クローンはより屈折性が高くなり、親細胞およびILK14細胞の典型的な「敷石状」形態とは対照的な星状の形態を呈してLN、FNおよびVN上で増殖した（図4c）。本発明者らは、ILK13-A1a3および-A4aサブクローン、対照形質転換株であるILK14-A2C3および-A2C6、ならびにIEC-18細胞を、さまざまな濃度のインテグリン基質であるラミニン（LN）、フィブロネクチン（FN）およびビトロネクチン（VN）上で平板培養した。ILK14およびIEC-18細胞の接着性は同一であったが、過剰発現性サブクローンのそれはこれらのすべての基質上では有意に低下した（図4d）。免疫沈降分析では、細胞表面インテグリンの発現には影響がないことが示された（図示せず）。付着非依存性の増殖に対するp59^ＩＬＫ過剰発現の影響を、軟アガロースにおけるILK形質転換株のコロニー形成能をアッセイすることによって検討した。IEC-18および形質転換対照株とは著しく対照的に、4つの独立したp59^ＩＬＫ過剰発現性サブクローンであるILK13-A4a、A1a3、A4d3およびA4C12は、これらのアッセイにおいてコロニーを形成した（図4e）。組織培養プラスチック上でのこれらのすべてのクローンの増殖速度は対照速度と同一であった。

図4は、ECMの成分によるILKキナーゼ活性の調整を示している。a、MBPのILKリン酸化を、組織培養プラスチックから回収した後に懸濁液中におくかフィブロネクチン上に再平板培養するかのいずれかの処理を1時間行ったIEC-18腸上皮細胞の溶解物から得たILK免疫複合体にてアッセイした。IEC-18^１１のH-ras形質転換変異株であるRas37（Ras^{Ｖａｌ１２}を含むpRC/CMVベクターによりトランスフェクションを施したもの）を同時にアッセイした。示されているバンドはMBPである。b、ILK発現構築物でトランスフェクションしたIEC-18細胞の2つの代表的なクローン（ILK13）、2つのベクター対照クローン（ILK14）および親IEC-18細胞におけるp59^ＩＬＫの発現レベルを提示する。表示した量（μg／レーン）の全細胞RIPA溶解物を10％SDS-PAGEにかけ、アフィニティ精製した92-2抗体を用いるウェスタンブロット法によってp59^ＩＬＫの発現を分析した。c、代表的なp59^ＩＬＫ過剰発現性クローンであるILK13-A4a、ベクター対照クローンであるILK14-A2C3、および親IEC-18細胞をECM基質であるLN、FNおよびVN上に1時間平板培養した後に固定し、トルイジンブルーによって染色した後に写真を撮影した（倍率40倍）。d、LN、FNおよびVNに対するILK過剰発現性クローンの接着性を定量化した。凡例：IEC-18（黒）、ILK14-A2C6（白）、ILK13-A1a3（濃灰色）、ILK13-A4a（薄灰色）。結果は基質10μg／mlに関して提示し、各基質に関する結果をIEC-18に対する接着率（+/-SD）として示す。一連の濃度のECMにおいて、3種の基質すべてに関してILK13サブクローンの接着性には同様の低下が示され、ILK14-A2C3の接着性はILK14-A2C6のそれと同一であった。表面ビオチン化されたIEC-18、ILK13およびILK14サブクローンの抗FNRおよび抗VNR血清による免疫沈降から、p59^ＩＬＫ過剰発現株におけるα_５／α_３β_１およびα_Ｖβ_３／β_５インテグリンサブユニットの発現には何ら変化がないことが裏づけられた（データは提示せず）。データは2つの独立した実験の代表例である。e、4種類のILK13すなわちp59^ＩＬＫ過剰発現性クローンを軟アガロース中に播き、3週後（実験1）および2週後（実験2）のコロニー増殖に関してアッセイした。親およびベクター対照形質転換株もアッセイし、ras^{Ｖａｌ１２}形質転換クローンであるRas-37を陽性対照として用いた。バーは2回の計測の平均を示す。IEC-18およびILK14細胞における最大コロニー数は1／フィールドであった。

ラット腸上皮細胞系IEC-18、およびpRC/CMVから発現される活性化されたH-ras^{Ｖａｌ１２}対立遺伝子によりトランスフェクションされたこの系列の変異株を、5％血清を含む培地を入れた組織培養プラスチック上にて増殖させ、最小必須培地（MEM）で3回洗浄し、5mM EDTAを用いて回収した。これらを2.5mg／ml BSAを含むMEM中に再懸濁し、37℃で1時間、懸濁液のまま放置するか10μg／mlのフィブロネクチンをコートしたプレート上に平板培養するかのいずれかの処理を行った。これらの細胞のNP-40溶解物（300μg）を、アフィニティ精製した91-3とともに免疫沈降させ、上記の通りに免疫複合体キナーゼアッセイ（MBP基質）を実施した。IEC-18には、CMVプロモーターに対し順方向でPlac5を含む発現ベクターpRC/CMVによるトランスフェクションを施した。安定的なクローンをG418にて選択し、2回の限界希釈の後にサブクローニングした。すべての場合に、12個の各々のILKおよびベクター対照形質転換株のサブクローンが分離された。蛋白質濃度はブラッドフォード（Bradford）試薬（Bio-Rad）を用いて測定した。2つのp59^ＩＬＫ過剰発現株であるILK13-A1a3およびILK13-A4a、ならびに2つのベクター対照形質転換株であるILK14-A2C3および-A2C6を、ECM基質への細胞接着に対するILK過剰発現の影響に関して分析した。接着性は発表されている方法^２８に従って定量化した。コロニー形成アッセイについては、すでに記載されている通り^２９に、3×10^５個の細胞を、0.3％アガロースを入れた35mmウェル中に播いた。Ras-37は2×10^３／ウェルとなるように播いた。コロニーは2個ずつのウェルを用いて算定した上で各フィールド（d＝1cm）ごとに評価し、最少50細胞からなる凝集物と定義した。

これらの結果から、IEC上皮細胞におけるp59^ＩＬＫの過剰発現は、接着によって通常提供される増殖性シグナルがなくとも増殖上の利点を提供することが示される。

インテグリンを介した細胞外基質シグナルの伝達は、そのいずれもがインテグリンの細胞質ドメインと細胞内蛋白質との相互作用を必要とすると考えられる、細胞内（「アウトサイド・イン（outside-in）」）および細胞外（「インサイド・アウト（inside-out）」）の機能に影響を及ぼす^{１２，１３}。ILKとβ_１インテグリンサブユニットとの会合、およびフィブロネクチンとの接着によるそのキナーゼ活性の特異的な調節から、p59^ＩＬＫがインテグリンシグナル伝達のメディエーターであることが示唆される。したがって、アンキリンリピートモチーフは、ILKと下流に位置する細胞質または細胞骨格の蛋白質との相互作用を規定する蛋白質相互作用モジュールである可能性が高いと考えられる。p59^ＩＬＫ過剰発現細胞によるECM接着性の低下は、ILK活性が接着依存的に阻害されるという本発明者らの観察と一致しており、p59^ＩＬＫがインサイド・アウトインテグリンシグナル伝達において一定の役割を果たしていることが示唆される。さらに、p59^ＩＬＫによって誘発される付着非依存的な上皮細胞の増殖は、インテグリンによる細胞内シグナル伝達の媒介におけるILKの役割を示している^{１４〜１６}。

実施例5 細胞移動に対する抗ILKの効果
細胞の運動性におけるILKの役割は、炎症および創傷治癒などの正常な生理過程、ならびに腫瘍の浸潤性および転移性腫瘍の伝播、または骨粗鬆症（骨は本質的には骨芽細胞すなわち造骨細胞が分泌する細胞外基質であり、この沈着はインテグリンの発現レベルおよび機能によって調整される）を含む病的な状態に関して重要な意味がある。細胞の移動性はインテグリン-ECM相互作用に依存する動的な過程である。プロテインキナーゼの「オン-オフ」切り替え機能は、ECM基質に関するインテグリンの親和状態を動的に調節するための理想的な機構を提供する。したがって、本発明者らは現在、極めて特異的な抗ILK抗体（このためILK機能を阻害する）を細胞の細胞質中に微量注入することが細胞移動に及ぼす影響をアッセイしているところである。最初にこれらの影響は固形基質上に播かれた内皮細胞においてアッセイされる予定であるが、ECM蛋白質を含む3次元ゲルを介しての細胞移動の試験にも拡げる予定である。

実施例6 ILK活性を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド
ILK cDNAの配列は、ILK活性の「アンチセンス」阻害のための合成オリゴヌクレオチドの設計および作製のための情報を提供する。この用語は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（AO）として知られる、特異的なメッセンジャーRNAのコード鎖またはセンス鎖の逆相補物を用いるという方策に由来する。その相補的なmRNAと結合することにより、AOはそのmRNAが蛋白質に翻訳されるのを阻害し、それによって細胞内に正常な蛋白質が蓄積することを防止する。mRNAのどの領域が最も効果的に翻訳を阻害するかを予測することはできないが、本発明者らは、それが最もこの目的には成功率の高い試薬を提供するとの理由から、図1に規定した通りの推定上の翻訳開始部位に最も近接しているILK mRNA配列に由来するILK AOを検討する予定である。

AOの構築に用いる実際の化学反応、またはその効率を改善するための抗ILK AOへの修飾にかかわらず、ILKのcDNA配列から、特異的なAOを誘導するための情報が提供される。ILKのcDNA配列は、ILKと構造的に関連したcDNAに関するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づくスクリーニングに使用するために、縮退プライマー（遺伝的コードの縮退による）として知られるオリゴヌクレオチド試薬を設計するために用いられる。同様に、ILK cDNAは、スクリーニング期間中により厳密性の低い（すなわちより穏和な）ハイブリダイゼーション条件を用いることによって、ゲノムまたはcDNAのライブラリーのより好都合なスクリーニングにおいて関連遺伝子をスクリーニングするために用いられる。この方法で、ILKと有意に関連した明瞭なcDNAまたはDNA配列（ヌクレオチド一致率＞50％）を単離し、ILKに関連したキナーゼのファミリーを無作為的でない様式で同定することができる。

実施例7 インプリントされた遺伝子コピーの評価のためのILK染色体座のマッピング
本発明者らが分裂中期の（すなわち、分離されて同定可能な）ヒト染色体への蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）によってILKの染色体座に関するより高解像度のマッピングを実施したところ、ILK遺伝子は染色体11p15に位置していた。FISHは当業者には公知である。より微細な解像度では、この領域にある既知のマーカー遺伝子を用いる。11p15領域は、いくつかの特定の遺伝子（例えば、インスリン様成長因子2すなわちIGF2など）がインプリントされている（すなわち、母性または父性に由来する染色体のいずれかから優先的に発現される）ことが示されている指標である。このインプリントにより、2つの遺伝された遺伝子のコピーのうち1つが機能的欠失すなわち「ノックアウト」が効率的に提供される。このため、インプリントされた対立遺伝子からは補償性活動が得られないことから、インプリントされていない対立遺伝子（コピー）の変異によってより大きな結果が得られる。また、11p15は、乳癌患者のサブセットにおいて、異型接合性喪失すなわちLOHにさらされる領域としても同定されている。LOHは、例えば遺伝子欠失などによって一方の対立遺伝子の喪失をもたらし、さまざまな癌の発生に対する多くの癌抑制遺伝子（例えば乳癌におけるBRCA1、大腸癌におけるDCC、および網膜芽腫におけるRB1）に寄与する根底となる。

このため、乳癌の有意なサブセットにおける診断および予後を示すためのDNA試薬、およびこのような腫瘍の分子的な分類に貢献するこれらの試薬を開発するためにILKのcDNA配列を用いた。上記の通り、QT延長症候群の一部の遺伝性の症例に寄与する11p15上の遺伝子は同定されており、11p15との関連が明らかにされた家系において、この心疾患に対する原因遺伝子としてもILKは候補となっていることがILK遺伝子構造における変化を探索することによって評価されている。

実施例8 ILKの過剰発現によるインビボ腫瘍形成の誘導
ILKの過剰発現は、細胞・細胞間相互作用を媒介する重要な上皮細胞接着分子であるE-カドヘリンのダウンレギュレーションをもたらす（Dedherら、未発表の観察結果）。上皮細胞においてILKの過剰発現によってE-カドヘリンの喪失が誘導されることは、ILKがインビボでの腫瘍形成を促進することを示唆する。この考えを検討するため、本発明者らは、胸腺欠損のヌードマウスに、さまざまなレベルのILKを発現している細胞を、皮下注射した。マウスには、高レベル（ILK13-A1a3およびA4a）または低レベル（IEC-18およびILK14-A2C3）のILK（10^７細胞／マウスをPBS中に含む）を発現している細胞を皮下接種した。3週後に接種部位での腫瘍形成に関してマウスを観測した。ILKを過剰発現するILK13細胞（10^７細胞／マウス）を注入されたマウスの50〜100％では3週間以内に腫瘍が生じたが、ILKの発現レベルがより低いIEC-18またはILK14細胞を同数だけ注入されたマウスには腫瘍はまったく検出されなかった（表I）。したがって、これらの上皮細胞におけるILKの過剰発現によって、インビボでの腫瘍形成は促進される。
表1：ILK過剰発現性のIEC-18細胞の腫瘍形成能
細胞系 3週後の時点で腫瘍を有していたマウスの数
IEC-18 0/6
ILK14-A2C3 0/6
ILK13-A1a3 6/6
ILK13-A4a 3/6

実施例9 ヒト乳癌におけるILKの発現増強
ヒト乳癌におけるインテグリン結合キナーゼの発現は、ヒト乳癌生検標本のパラフィン包埋切片の免疫組織化学染色によって明らかになっている。アフィニティ精製された抗ILKポリクローナル抗体を用い、その後に二次抗体を結合させた。観察された陽性染色は、抗体をILK共役セファロースビーズによって吸収させることで完全に抑止された。顕微鏡写真は、2つの腫瘍試料からの切片を表す。これまでに合計30の試料を検討した。いずれの場合にも、ILKの発現レベルは腫瘍組織では正常な乳管および乳腺小葉と比べて顕著に高くなっている。図5Aは、上皮細胞の単層を有する良好に形成された乳管を呈する正常な領域を示している。ILKの染色は上皮細胞において最も顕著である。間質は陰性と認められる。図5Bは、乳管癌のインサイチュー像（DCIS）を示している。複数の細胞層が存在し、腫瘍細胞におけるILK染色の顕著な増強を伴っている。図5Cおよび5Dには浸潤性の癌が描出されている。図5Aに示されている正常組織と比べてILKの発現が顕著に増強している。

本発明は、本発明を実施するための好ましい態様を含むよう、本発明者らによって発見または提唱された特定の態様について記載している。本開示を鑑みて、本発明の意図した範囲を逸脱することなく、例示された特定の態様において多くの改変や変更が可能であることが当業者には理解されると思われる。例えば、コドン縮退のため、元となるDNA配列を、蛋白質の配列に影響を及ぼさずに変化させることができる。さらに、生物的な機能の等価性を考慮すれば、生物学的作用の種類または量に影響を及ぼさずに蛋白質の構造を変化させることも可能である。このような変更は全て、添付した請求の範囲内に含まれる。

酵母ツーハイブリッドによるILKのクローニング、特徴分析および発現。a、完全長のILK cDNA。 図１ａ−１の続きを示す図である。 図１ａ−２の続きを示す図である。 酵母ツーハイブリッドによるILKのクローニング、特徴分析および発現。b、プロテインキナーゼのサブドメインI〜XIとの相同性。 図１ｂ−１の続きを示す図である。 酵母ツーハイブリッドによるILKのクローニング、特徴分析および発現。c、アンキリンリピートを含むアミノ酸残基。 酵母ツーハイブリッドによるILKのクローニング、特徴分析および発現。d、ヒト組織由来のRNAのプローブ標識に用いたBIT-9。 酵母ツーハイブリッドによるILKのクローニング、特徴分析および発現。e、マウス、ラットおよびヒト細胞系の全細胞溶解物の分析。 インビトロおよび免疫複合体のキナーゼアッセイ。a、インビトロのキナーゼ反応。 インビトロおよび免疫複合体のキナーゼアッセイ。b、免疫複合体。 インビトロおよび免疫複合体のキナーゼアッセイ。c、単離され、リン酸化アミノ酸の含有量に関して分析された^３２P標識産物。 インテグリン免疫共沈においてGST-ILK^１３２に対する抗体はp59^ＩＬＫを認識する。a、分画化していないポリクローナル抗ILK血清は、代謝的に標識された細胞性蛋白質である^３５S-メチオニンを特異的に認識する。 インテグリン免疫共沈においてGST-ILK^１３２に対する抗体はp59^ＩＬＫを認識する。b、アフィニティ精製された（affinity-purified）抗体はGST-ILKアガロース-GSTによって吸収された。 インテグリン免疫共沈においてGST-ILK^１３２に対する抗体はp59^ＩＬＫを認識する。c、PC3細胞由来の表面ビオチン化インテグリンの沈降に用いたポリクローナル抗インテグリン抗体。 インテグリン免疫共沈においてGST-ILK^１３２に対する抗体はp59^ＩＬＫを認識する。d、PC3溶解物の共沈降分析には抗β_１モノクローナル抗体を用いた。 ECMの成分によるILKキナーゼ活性の調整。a、ILKによるMBPのリン酸化をアッセイした。 ECMの成分によるILKキナーゼ活性の調整。b、p59^ＩＬＫの発現レベル。 ECMの成分によるILKキナーゼ活性の調整。c、ECM基質上の代表的なp59^ＩＬＫ過剰発現性クローンILK13-A4a。 ECMの成分によるILKキナーゼ活性の調整。d、ILK過剰発現性クローンのLN、FNおよびVNに対する接着性を定量化した。 ECMの成分によるILKキナーゼ活性の調整。e、p59^ＩＬＫ過剰発現性クローンであるILK13をコロニー増殖性に関してアッセイした。 ECMの成分によるILKキナーゼ活性の調整。e、p59^ＩＬＫ過剰発現性クローンであるILK13をコロニー増殖性に関してアッセイした。 ヒト乳癌におけるILKの発現。a、乳房組織の正常領域。b、インサイチュー乳管癌（ductal carcinoma）。 ヒト乳癌におけるILKの発現。c、d、浸潤性の癌。

Claims (25)

1. インテグリン結合キナーゼである、単離および精製されたセリン／トレオニンキナーゼ。
2. 細胞増殖の調整、細胞接着の調整、細胞移動の調整および細胞浸潤の調整からなる群より選択される用途のための、請求項1記載のセリン／トレオニンキナーゼ。
3. 請求項1記載のキナーゼの単離されたヌクレオチド分子。
4. mRNA、cDNA、センスDNA、アンチセンスDNA、1本鎖DNAおよび2本鎖DNAからなる群より選択される、請求項3記載の分子。
5. インテグリン結合キナーゼであるセリン／トレオニンキナーゼの欠陥のあるアミノ酸配列をコードする単離されたヌクレオチド分子。
6. 請求項1記載のセリン／トレオニンキナーゼの阻害剤。
7. 抗体である、請求項6記載の阻害剤。
8. インテグリン結合キナーゼの天然または模倣性の基質である、請求項6記載の阻害剤。
9. キナーゼの第2のヌクレオチド分子と結合する第1のヌクレオチド分子である、請求項6記載の阻害剤。
10. 第2のヌクレオチド分子が、mRNA、cDNA、センスDNA、アンチセンスDNA、1本鎖DNAおよび2本鎖DNAからなる群より選択される、請求項8記載の阻害剤。
11. セリン／トレオニンキナーゼの阻害剤を用いることによって哺乳動物における疾患を治療する方法。
12. セリン／トレオニンキナーゼの天然または模倣性の基質を用いることによって哺乳動物における疾患を治療する方法。
13. キナーゼの第2のヌクレオチド分子と結合する第1のヌクレオチド分子を用いることによって哺乳動物における疾患を治療する方法。
14. 第2のヌクレオチド分子が、mRNA、cDNA、センスDNA、アンチセンスDNA、1本鎖DNAおよび2本鎖DNAからなる群より選択される、請求項13記載の方法。
15. 細胞活動を調整する方法であって、該細胞活動が、細胞増殖、細胞接着、細胞移動および細胞浸潤からなる群より選択される、請求項10、請求項11、請求項12または請求項13記載の方法。
16. 阻害剤および担体を含む医薬品の哺乳動物への投与をさらに含む、請求項10記載の方法。
17. 疾患が、癌、白血病、固形腫瘍、慢性炎症性疾患、関節炎、骨粗鬆症および心血管疾患からなる群より選択される、請求項10、請求項11、請求項12または請求項13記載の方法。
18. 細胞活動を調整するための、請求項1記載のセリン／トレオニンキナーゼの阻害剤を担体とともに含む医薬品であって、該細胞活動が、細胞増殖、細胞接着、細胞移動および細胞浸潤からなる群より選択される医薬品。
19. 阻害剤が、セリン／トレオニンキナーゼの天然または模倣性の基質である、請求項18記載の医薬品。
20. 細胞活動を調整するための、請求項1記載のセリン／トレオニンキナーゼの第2のヌクレオチド分子と結合する第1のヌクレオチド分子を担体とともに含む医薬品であって、該細胞活動が、細胞増殖、細胞接着、細胞移動および細胞浸潤からなる群より選択される医薬品。
21. 請求項3または請求項4記載のヌクレオチド分子を含む診断用キット。
22. 請求項1記載のセリン／トレオニンキナーゼを含む診断用キット。
23. 請求項6記載の阻害剤を含む診断用キット。
24. 請求項1記載のキナーゼを含む、請求項1記載のセリン／トレオニンキナーゼの阻害剤をスクリーニングするためのアッセイ。
25. 請求項3または4記載のヌクレオチド分子を含む、セリン／トレオニンキナーゼの阻害剤をスクリーニングするためのアッセイ。

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