FR2801318A1 - Nouvelle kinase liee aux integrines ilk-2 - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne l'isolement et la caractérisation d'une nouvelle isoforme de la kinase liée aux intégrines, désignée ILK-2, qui est surexprimée dans les cellules cancéreuses à fort potentiel invasif. L'invention a trait à un procédé permettant la détection et/ou la quantification d'ILK-2 dans un échantillon biologique par la technique RFLP et/ou PCR-SSP.

Description

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La présente invention concerne l'isolement et la caractérisation d'une nouvelle isoforme de la kinase liée aux intégrines, désignée ILK-2, qui est surexprimée dans les cellules cancéreuses à fort potentiel invasif. L'invention a trait à un procédé permettant la détection et/ou la quantification d'ILK-2 dans un échantillon biologique par la technique RFLP et/ou PCR-SSP.

Un autre aspect concerne un procédé de criblage de composés susceptibles d'inhiber ILK-2, et l'utilisation desdits composés dans le cadre du traitement de diverses pathologies, en particulier dans le cancer pour empêcher et/ou prévenir les métastases.

La métastase des cellules tumorales est souvent associée à une production accrue de facteurs de croissance qui agissent comme des médiateurs autocrines ou paracrines impliqués dans de nombreux aspects du processus métastatique des cellules cancéreuses tels que la transformation maligne, les modifications des interactions adhésives des cellules tumorales (Matsumoto et al., 1995), la surproduction de matrice extracellulaire et de stroma fibreux (Grégoire et Lieubeau, 1995), la sécrétion de métalloprotéinases matricielles, ainsi que l'angiogenèse (Liotta, 1991). Parmi les nombreux facteurs de croissance identifiés, les TGF-P sont particulièrement intéressants car les TGF-p biologiquement actifs contrôlent la prolifération et la différentiation des cellules, favorisent la motilité cellulaire et l'angiogenèse, stimulent l'expression des intégrines et des protéines matricielles, ainsi que la transition épithéliale-mésenchymateuse lors de l'embryogenèse et de la cicatrisation des plaies (Alevizopoulos et Mermod, 1997). Toutefois, le mécanisme intracellulaire qui commande ces processus dépendant des TGF-ss au cours du processus métastatique des cellules tumorales reste largement inconnu.

La kinase liée aux intégrines (ILK) est une sérine thréonine kinase récemment identifiée comme interagissant avec la queue cytoplasmique des sous-unités ss1, (32 et ss3 des intégrines. Elle joue un rôle clé dans les aspects cellulaires impliqués dans la métastase des cellules tumorales en agissant comme effecteur des intégrines et des

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récepteurs des facteurs de croissance [Hannigan, 1996]. ILK régule la survie, la prolifération et la différentiation des cellules en modulant l'adhésion cellulaire dépendante des intégrines, l'expression de la cadhérine E, l'expression de la fibronectine matricielle péricellulaire, ainsi que la progression du cycle cellulaire dépendante de l'adhésion cellulaire [revue dans Dedhar, 1999, et décrite dans WO 97/23625]. La surexpression d'ILK dans les cellules épithéliales active la voie de signalisation impliquant le complexe Lef 1/ss-cat. (Novak, 1998), induisant une croissance cellulaire indépendante de l'ancrage (Hannigan, 1996) et une transformation oncogénique (Wu, 1998). L'activité kinase d'ILK est régulée par l'adhésion cellulaire et par l'insuline d'une manière dépendante de la phosphoinositide-3-OH-kinase (Delcommenne, 1998). Les cibles en aval pour la transphosphorylation d'ILK comprennent la protéine kinase B (PKB/AKT) et la glycogène synthétase kinase 3 (GSK-3) (Delcommenne, 1998). Il a également été démontré qu'ILK interagit avec la protéine PINCH (Rearden, 1994), ce qui suggère que cette protéine, qui fonctionne comme une protéine d'adaptation, pourrait relier ILK et les intégrines aux composants des kinases des récepteurs des facteurs de croissance par l'intermédiaire des petites protéines G. (Tu, 1999).

Il a été montré récemment que la stimulation de la lignée cellulaire de mélanome humain HT-144 avec du TGF-ss1 biologiquement actif régule positivement l'expression des intégrines et d'ILK et induit la translocation de la ss-caténine du cytoplasme vers le noyau (Janji, 1999).

Dans le cadre de la présente invention, on a isolé un ADNc codant pour une protéine, ci-après désignée ILK-2, fortement homologue de la protéine ILK, ci-après désignée ILK-1 qui est décrite dans les références susmentionnées, en effectuant une RT-PCR sur l'ARNm provenant de cellules HT-144 stimulées par le TGF-ss. Le séquençage de l'ADNc complet (1359 bases) et la translation polypeptidique révèlent que cette protéine, ci-après désignée ILK-2, diffère d'ILK-1connue par quatre acides aminés seulement. Néanmoins, la séquence de l'ADNc diffère de 102 nucléotides, ce qui exclut qu'ILK-2 soit une variante allélique d'ILK-1. On a observé une expression tissulaire de l'ARNm d'ILK-2 par RT-PCR et RFLP dans les lignées de cellules tumorales fortement invasives, mais pas dans les tissus humains normaux. De plus, la stimulation par le TGF-0 des cellules HT-144 induit une surexpression d'ILK-2 et une

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régulation négative concomitante d'ILK-1. La protéine de fusion GST-ILK-2 exprimée dans les bactéries est capable de s'autophosphoryler et de phosphoryler la protéine basique de la myéline de même que la protéine de fusion GST-P3 comprenant la partie cytoplasmique de l'intégrine ss3. La surexpression d'ILK-2 recombinante dans la lignée cellulaire de mélanome non métastatique SK-Mel-2, qui exprime exclusivement ILK-
1, induit une croissance cellulaire indépendante de l'ancrage et une prolifération cellulaire, comme le démontre la croissance des cellules en gélose molle, d'une part et en suspension, d'autre part. Ainsi, on a trouvé de manière surprenante l'existence d'une nouvelle isoforme d'ILK-1, appelé ILK-2, qui est exprimée préférentiellement dans les cellules tumorales fortement métastatiques.

Description La présente invention concerne un acide nucléique purifié ou isolé, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléique choisie parmi le groupe de séquences suivantes : a) la séquence SEQ ID No. 1 ; b) un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs (par exemple 16, 20, 25 ou 50 nucléotides consécutifs) de la séquence SEQ ID No. 1; c) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 93 %,
95% ou de préférence 99% après alignement optimal avec une séquence telle que définie en a) ou b) ; d) la séquence complémentaire ou la séquence de l'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b) ou c).

De manière avantageuse, cette séquence comporte un seul site de restriction Hindi en position 409 de l'ADNc d'ILK-2. Cette caractéristique permet de différencier ILK-2 et ILK-1, et dès lors de pouvoir prédire le potentiel invasif d'une tumeur. De préférence, la séquence comporte la séquence SEQ ID N 1 (Voir figure 1).

Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui

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seront employés indifféremment dans la présente description, on entendra désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADNs. Un nucléotide naturel d'acide nucléique se définit en ce que la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, et la thymine. Un nucléotide peut être modifié au niveau des bases. On peut citer notamment l'inosine, la méthyl-5- désoxycytidine, désoxyuridine, la dimétylamino-5- désoxyuridine, la diamino-2,6- purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation.

Il doit être compris que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié.

Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2 : 482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48 : 443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman

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(1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) et (DNASIS,Version 2. 5 pour Windows ; Hitachi Software Engineering Co., Ltd, South San Francisco, CA, en utilisant les paramètres standards décrits dans le manuel du fabriquant).

Dans ce contexte, les séquences et les pourcentages d'identité peuvent également être obtenus en utilisant les ressources informatiques internet. On peut citer les programmes Blast (WWW.ncbi.nlm.nih.gov) et le programme FastDB avec les paramètres suivants Mismatch penalty 1.00 ; Penalty 1.00 ; Size Penalty 0.33 ; joining penalty 30. 0. Ces algorithmes sont présentés dans Current Methods in Sequencing and synthesis Mehtods and Applications, pages 127-149,1988, Ala R.

Liss, Inc.

Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.

Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 93 %, de préférence 95 % ou 99 %, après alignement optimal avec une séquence de référence, on entendra désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une substitution, notamment

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ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 93 %, de préférence 95 %, ou 99 %, d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence. Il s'agit de préférence de séquences dont les séquences complémentaires sont susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID No. 1 de l'invention. De préférence, les conditions d'hybridation spécifiques ou de forte stringence seront telles qu'elles assurent au moins 93 %, de préférence 95 % ou 99 % d'identité après alignement entre l'une des deux séquences et la séquence complémentaire de l'autre.

Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes.

L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCI + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e. : 42 C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20 C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20 C en 0,1x SSC + 0,1% SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1x SSC + 0,1% SDS pendant 30 minutes à 60 C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie, seront adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989) aux paragraphes Il.1à 11.61.

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Parmi les séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 93 %, de préférence 95 % ou 99 %, après alignement optimal avec la séquence selon l'invention, on préfère également les séquences nucléiques variantes de la séquence nucléique SEQ ID No. 1, ou de ses fragments, c'est-à-dire l'ensemble des séquences nucléiques correspondant à des variants alléliques, c'est-à-dire des variations individuelles de la séquence nucléique SEQ ID No. 1. Ces séquences mutées naturelles correspondent à des polymorphismes présents chez les mammifères, en particulier chez l'être humain et, notamment, à des polymorphismes pouvant conduire à la survenue d'une pathologie. De préférence, la présente invention concerne les séquences nucléiques variantes dans lesquelles les mutations conduisent à une modification de la séquence d'acides aminés du polypeptide, ou de ses fragments, codé par la séquence normale de séquence SEQ ID No. 1.

L'acide nucléique selon l'invention peut comprendre au moins 15 nucléotides consécutifs (par exemple 16, 20,25 ou 50 nucléotides consécutifs) d'une séquence décrite ci-dessus ou d'une séquence capable de s'hybrider avec une séquence dérivée du gène ILK-2. De préférence, cet acide nucléique se caractérise en ce qu'il est sélectionné parmi les acides nucléiques comprenant un nucléotide en 3' qui est spécifique d'ILK-2 et absent dans ILK-1, notamment un acide nucléique de SEQ ID N 5 à 8. Les acides nucléiques évoqués précédemment sont utiles notamment comme sonde, amorce, ou oligonucléotide antisens.

Un autre aspect de l'invention porte sur un polypeptide, comprenant une séquence peptidique ayant au moins 80% , de préférence 90%, 95% ou 99% d'identité avec ILK- 2 après alignement optimal, qui possède une alanine en position 197, une sérine en position 214, une alanine en position 259, et une sérine en position 437. Avantageusement , il comporte la séquence SEQ ID N 2 (Voir figure 2). Ce polypeptide possède une activité sérine/thréonine kinase et est impliqué dans le contrôle de la croissance, de l'adhésion, de la migration cellulaire, en particulier dans le processus d'invasion des cellules tumorales.

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L'invention concerne également un vecteur comprenant une séquence telle que décrite ci-dessus ou une séquence codant pour un polypeptide mentionné précédemment.

Ladite séquence est de préférence fusionnée à un promoteur efficace dans les cellules eucaryotes et/ou procaryotes, et le vecteur peut comporter en outre un gène de sélection. Par exemple, le vecteur de l'invention peut comprendre une séquence antisens capable d'inhiber l'expression de ILK-2.

Un autre aspect de l'invention a trait à un anticorps capable de se lier spécifiquement à un polypeptide décrit ci-dessus.

Ainsi, un autre aspect porte sur un procédé de détection et/ou de quantification d'une séquence explicitée précédemment caractérisé en ce qu'il met en #uvre un oligonucléotide selon l'invention.

Le procédé de détection et/ou de quantification d'une séquence selon l'invention peut comprendre les étapes suivantes : a) Obtention d'ADNc de ILK à partir des ARNm totaux contenu dans un échantillon par RT-PCR, b) Analyse RFLP de l'ADNc obtenu à l'étape a) en utilisant Hindi pour produire deux fragments d'environ 411 et 948 bases dans le cas d'ILK-2 d'une longueur d'environ 1359 nucléotides.

En ce qui concerne ce procédé, par ILK , on entend aussi bien ILK-2 que ILK-1.

Par échantillon on entend tout extrait purifié ou non provenant de la biopsie d'un tissu d'un individu ou de cellules cancéreuses de toute origine.

Dans ce procédé, on peut effectuer une amplification spécifique à l'aide d'au moins une amorce telle que décrite ci-dessus. Bien entendu toute technique d'amplification équivalente à la RT-PCR et conduisant à des résultats essentiellement de même nature est visée. Il en est de même pour la technique RFLP.

Le procédé selon l'invention permet également de calculer du ratio ILK-2 / ILK-1 En ce sens, on utilise Hindi et BahmHI pour produire deux fragments d'environ 411 et

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948 bases caractéristiques de ILK-2 (1359 bases) et deux fragments d'environ 536 et 823 bases caractéristiques de ILK-1 (1359 bases). Il est donc possible de réaliser un diagnostic du potentiel invasif de cellules cancéreuses.

Une illustration de mise en #uvre de ce procédé est détaillé dans l'exemple 1 qui suit.

Le procédé de détection et/ou de quantification d'une séquence selon l'invention peut également être mise en #uvre à l'aide des sondes et/ou amorces selon l'invention en utilisant toute technique du type PCR, de préférence la technique PCR-SSP expliquée ci-après. Ainsi , le procédé de détection et/ou de quantification d'une séquence selon l'invention peut comprendre une étape d'amplification du type PCR-SSP à l'aide d'une amorce sélective d'ILK-2 (ce procédé est explicité plus en détail ci-après).

Une sonde se définie, dans le sens de l'invention, comme étant un fragment nucléotidique comprenant par exemple de 15 à 100 nucléotides, notamment de 15 à 35 nucléotides, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique cible. Les sondes selon l'invention, qu'elles soient spécifiques ou non-spécifiques, peuvent être immobilisées, directement ou indirectement, sur un support solide ; on parle alors de sonde de capture . Par ailleurs, lesdites sondes peuvent porter un agent marqueur permettant leur détection ; on parle alors de sonde de détection .

Une sonde de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, par exemple par covalence, par adsorption, ou par synthèse directe sur un support solide. Ces techniques sont notamment décrites dans la demande de brevet WO 92/10092. La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de différents tissus ou de cellules en culture sur un support (tels que la nitrocellulose, le nylon, le polystyrène) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont

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détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde). On peut citer également comme support solide, les puces à ADN, notamment les puces commercialisées par Affymetrix, Cis Bio International/ LETI.

Une sonde de détection peut être marquée au moyen d'un marqueur choisi par exemple parmi les isotopes radioactifs, des enzymes, en particulier des enzymes susceptibles d'agir sur un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent (notamment une peroxydase ou une phosphatase alcaline), des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de base nucléotitiques, et des ligands tels que la biotine. Le marquage des amorces ou des sondes selon l'invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives. Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 33P, le 35S, le 3H ou le 1251. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, l'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémiluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents.

Ainsi, les acides nucléiques de l'invention sélectionnés parmi les acides nucléiques comprenant un nucléotide en 3' qui est spécifique d'ILK-2 (c'est à dire un nucléotide absent dans ILK-1), notamment un acide nucléique de SEQ ID N 5 à 8, sont particulièrement utiles pour mettre en #uvre la technique PCR-SSP décrite dans Cavanagh G. et al, Transfusion Medecine, 1997,7, 41-45 et dans Skogen B. et al, Transfusion, 1994, Vol 34, N 11955 : 960.

Les polynucléotides selon l'invention peuvent ainsi être utilisés comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre notamment la technique de PCR (réaction en chaîne à la polymérase) (Erlich, 1989 ; Innis et al., 1990, et Rolfs et al., 1991). Cette technique nécessite le choix de paires d'amorces oligonucléotidiques encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite

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dans le brevet américain U.S. N 4,683,202. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions, puis séquences. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée en utilisant comme amorce les séquences nucléotidiques de polynucléotides de l'invention comme matrice, des plasmides contenant ces séquences ou encore les produits d'amplification dérivés. Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés. En règle général, selon la longueur des oligonucléotides utilisés, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 25 et 65 C, en particulier entre 35 et 65 C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,8 à 1 M. En ce qui concerne les sondes spécifiques, l'appariement peut s'effectuer à des températures supérieures à 50 C pour 1 à 2 mM MgCI2. La température d'hybridation d'un oligonucléotide étant calculée sur la base de 2 C par A ou T et de 4 C pour G ou C ; un oligonucléotide constitué par exemple d'une combinaison de 7 A et 5 C s'hybride à 34 C. Cette règle bien connue par l'homme du métier permet de calculer la température d'hybridation envisageable pour tous les oligonucléotides selon l'invention.

D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR (PCR-like) à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Par PCR-like on entendra désigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues, en général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription reverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique

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d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992), la technique TAS (Transcription-based Amplification System) décrite par Kwoh et al. en 1989, la technique 3SR (Self-Sustained Sequence Replication) décrite par Guatelli et al. en
1990, la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) décrite par Kievitis et al. en 1991, la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite par Landegren et al. en 1988 et perfectionnée par Barany et al. en 1991, qui emploie une ligase thermostable, la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par Segev en 1992, la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par Duck et al. en 1990, la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase décrite par Miele et al. en 1983 et perfectionnée notamment par Chu et al. en 1986 et Lizardi et al. en 1988, puis par Burg et al. ainsi que par Stone et al. en 1996.

Dans le cas où le polynucléotide cible à détecter est un ARNm, on utilisera avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en oeuvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase reverse afin d'obtenir un ADNc à partir de l'ARNm contenu dans l'échantillon biologique. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé d'amplification ou de détection selon l'invention.

Comme indiqué supra, le procédé de diagnostic de l'invention peut être mise en #uvre de préférence en utilisant la technique dite PCR-SSP telle que décrite dans Cavanagh G. et al, Transfusion Medecine, 1997,7, 41-45 et dans Skogen B. et al, Transfusion, 1994, Vol 34, N 11955 : 960. Cette technique consiste à amplifier spécifiquement l'ADNc d'ILK-2 par une amorce sélective d'ILK-2. En ce sens, on effectue une amplification sélective d'ILK-2 en utilisant au moins une amorce sélective d'ILK-2 (sens ou anti-sens) ayant à son extrémité 3' un nucléotide spécifique de la séquence d'ILK-2 (ledit nucléotide ne se retrouve pas dans la séquence d'ILK-1). La Taq polymérase ne pouvant réparer un mésappariement nucléotidique à l'extrémité 3' de l'amorce, elle sera incapable d'amplifier ILK-1. Par amorce sélective d'ILK-2 on

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entend donc toute séquence complémentaire d'ILK-2 se distinguant de la séquence d'ELK-1 par au moins un nucléotide en position 3'. On peut citer par exemple les amorces sélectives suivantes : - 5'-TGCCGGGAGGGCAACGCG-3' (SEQ ID N 5) - 5'- GAGAGGAGCACGTATCAATGTG-3' (SEQ ID N 6) - 5'- TTCTGGGGTCAAGACCAG-3' (SEQ ID N 7) - 5'-CAGCTCAACTTTCTGGCA-3' (SEQ ID N 8) Il est bien entendu à la portée de l'homme du métier d'utiliser toute amorce qui serait équivalente aux amorces de séquence SEQ ID N 5 à 8.

Ce diagnostic peut également être mené grâce à un procédé de détection et/ou de quantification d'un polypeptide décrit ci-dessus, ledit procédé mettant en #uvre un anticorps selon l'invention, de préférence au sein d'un test ELISA ou directement par immuno-cytochimie.

Un aspect complémentaire concerne un kit de diagnostic permettant de mettre en #uvre le procédé décrit précédemment. Ce kit de diagnostic comprend un oligonucléotide ou un anticorps selon l'invention.

L'invention a également pour objet un procédé de criblage de composés susceptibles d'inhiber ILK-2 comprenant les étapes suivantes : a) addition d'au moins un composé susceptible d'inhiber ILK-2 dans le milieu de culture de cellules exprimant ILK-2, en particulier de cellules cancéreuses à fort potentiel invasif, b) Analyse du taux de prolifération, d'adhésion, de migration et/ou d'invasion comparé avec celui de cellules non-traitées (contrôle), c) Sélection des composés permettant une baisse du taux supérieure à 50%, en particulier supérieure à 90%, de préférence supérieure à 99%.

Un procédé de criblage alternatif de composés susceptibles d'inhiber ILK-2 peut comprendre les étapes suivantes :

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a) purification d'ILK-2, b) incubation d'ILK-2 obtenue à l'étape a) avec un substrat, notamment avec le substrat exogène de la protéine basique de la myéline (MBP) ou la protéine de fusion de la queue cytoplasmique de l'intégrine ss1, ss2, ou ss3, de préférence avec (GST-ss3cyto) dans un tampon comprenant du [y32P]ATP avec au moins un composé susceptible d'inhiber ILK-2, c) Analyse de la quantité de substrat phosphorylé par autoradiographie, phosphorimageur ou précipitation au PEG et quantification dans un compteur ss, d) Sélection des composés permettant une diminution de la quantité de substrat phosphorylé supérieure à 50%, en particulier supérieure à 90%, de préférence supérieure à 99%.

Une illustration de mise en #uvre de ce procédé est détaillé dans l'exemple 2 qui suit.

L'homme du métier est en mesure de mettre en #uvre les procédés selon l'invention et d'identifier les composés inhibant ILK-2 moyennant des expériences de routine et peut tester les inhibiteurs des sérine thréonine kinases, tels que par exemple les composés décrits dans les documents suivants : WO 99/15500 SUBSTITUTED OXINDOLE DERIVATIVES AS PROTEIN TYROSINE KINASE AND AS PROTEIN SERINE/THREONINE KINASE INHIBITORS, WO 98/50370 METHODS OF MODULATING SERINE/THREONINE PROTEIN KINASE FUNCTION WITH QUINAZOLINE-BASED COMPOUNDS, WO 99/07854 SERINE/THREONINE KINASE, AND USES RELATED THERETO, WO 99/16438 AZABENZIMIDAZOLE-BASED COMPOUNDS FOR MODULATING SERINE/THREONINE PROTEIN KINASE FUNCTION, et WO 99/17759 METHODS OF MODULATING SERINE/THREONINE PROTEIN KINASE FUNCTION WITH 5-AZAQUINOXALINE-BASED COMPOUNDS Lee J.C et Adams j.L ; Inhibitors of serine/threonine kinases, Curr. Opin. Biotechnol 1995 ;(6) 657 :661 et

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Dès lors, les composés susceptibles d'être obtenus à partir du procédé décrit ci-dessus sont visés par la présente invention.

Un aspect supplémentaire porte sur une composition comprenant un composé ou un vecteur selon l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et sur l'utilisation dudit composé ou vecteur selon pour la fabrication d'un médicament.

De préférence, l'invention a pour objet leur utilisation pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une maladie pour laquelle l'expression d'ILK-2 est impliquée, notamment pour le traitement du cancer, en particulier pour prévenir et/ou empêcher les métastases.

La nouvelle protéine kinase ILK humaine, désignée ILK-2, partage 99 % d'homologie de séquence au niveau des acides aminés avec ILK humaine publiée (Hannigan, 1996), appelée ici ILK-1, mais seulement environ 90 % d'homologie au niveau de l'ADNc, ce qui démontre que cette nouvelle protéine ILK-2 est une isoforme plutôt qu'un variant allélique de la kinase ILK-1 publiée. Chose intéressante, la séquence de l'ADNc d'ILK- 2 humaine est plus proche d'ILK de souris (Li et al., 1997) que d'ILK-1 humaine, ce qui suggère qu'ILK de souris est en fait l'homologue d'ILK-2 humaine. L'analyse de la métaphase par hybridation in situ sous fluorescence de lymphocytes humains normaux, ainsi que des lignées cellulaires présentant, du point de vue caryotypique, des translocations bien caractérisées et a permis d'identifier un locus unique pour le gène d'ILK-1 humaine sur le chromosome 11, entre les locus HBBC et CALC dans l'intervalle de bande llpl5.5-pl5.4. Cette partie du chromosome 11 est fortement associée à la tumorigénèse (Hannigan, 1997). En revanche, deux régions chromosomiques de la souris, la région E du chromosome 7, qui partage des séquences contiguës avec le chromosome 11 humain, et la région E1-E3 du chromosome 9, ont été identifiées à l'homologue murin d'ILK humaine, corroborant l'hypothèse de l'existence dans le génome de la souris d'un deuxième gène homologue d'ILK ou d'un pseudogène d'ILK (Li, 1997). Avec l'identification de l'isoforme ILK-2 humaine, il doit également exister un deuxième gène dans le génome humain et, sur la base des données publiées par Hannigan et al., 1997 (qui ont identifié un locus unique sur le chromosome 11), on s'attend à ce que ce gène ILK-2 soit situé à proximité immédiate du gène ILK-1.

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A l'inverse de nombreux récepteurs de signal, les intégrines sont dépourvues d'activité enzymatique kinase endogène et s'appuient sur des kinases intracellulaires telles qu'ILK pour activer les voies de signalisation impliquant les processus de phosphorylation. Une mutation de l'acide aminé invariant unique E359K dans le sousdomaine de la kinase d'ILK donne une forme inactive d'ILK qui présente une fonction négative dominante (Delcommenne, 1998). Etant donné que les quatre substitutions d'acides aminés qui différencient ILK-2 et ILK-1 sont toutes situées dans les sousdomaines de la kinase, on a étudié l'activité kinase de la GST/ILK-2. Ces substitutions n'ont pas d'effet inhibiteur sur l'activité de la kinase. De plus, nos résultats montrent qu'ILK-1 et ILK-2 sont capables de phosphoryler la queue cytoplasmique de l'intégrine ss3, comme le démontre la phosphorylation de la protéine de fusion GST-(33cyto. ILK- 2 ne peut pas être distinguée d'ILK-1 en ce qui concerne leur poids moléculaire, leur immunoréactivité, leur aptitude à l'autophosphorylation et leur capacité de phosphorylation du substrat exogène, la MBP ou de la partie cytoplasmique de l'intégrine ss3. Une stabilité accrue de la protéine ou une activité enzymatique renforcée d'ILK-2 paraît fournir une explication de la corrélation étroite entre l'expression d'ILK-2 et le phénotype malin des cellules cancéreuses.

Il a été démontré qu'ILK est exprimée dans un spectre étendu de tissus humains (Hannigan, 1996) et murins (Li, 1997) lorsqu'on l'étudie au niveau de l'ARNm. En revanche, l'immunoréactivité d'ILK a été étudiée dans des cellules et des tissus humains normaux ainsi que dans différents types de cellules tumorales. Chung et al. (1998) ont découvert qu'ILK est principalement exprimée dans les cellules du myocarde et les fibres des muscles squelettiques. Parmi les tumeurs testées, le sarcome d'Ewing (SE), les tumeurs neuroectodermiques primitives (TNEP) et les médulloblastomes ont révélé une forte réactivité d'ILK tandis que d'autres sarcomes à petites cellules rondes étaient négatifs. Ceci suggère qu'ILK présente un intérêt en tant que marqueur diagnostic spécifique de tumeurs avec différentiation neuronale primitive.

Des données récentes démontrent que l'activité kinase d'ILK-1 est étroitement régulée par des stimuli provenant d'une adhésion cellulaire dépendante de l'intégrine ou d'une stimulation par un facteur de croissance (Delcommenne, 1998). Plus récemment, il a également été montré que l'expression d'ILK est régulée positivement par la tyrosine

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kinase du récepteur erbB-2 dans un épiderme hyperplasique (Xie, 1998). Nos données mettent en évidence une régulation distincte de l'expression d'ILK-1 et d'ILK-2 par le facteur de croissance TGF-ss1. En effet, la stimulation par le TGF-J31 de la lignée cellulaire de mélanome humain HT-144 régule positivement l'expression d'ILK-2, sans modifier l'expression d'ILK-l. Ces données suggèrent que le promoteur du gène codant pour ILK-2 doit avoir une activité fonctionnelle distincte de celle du promoteur ILK-1.

Pour la suite de la description, on se référera aux légendes des figures présentées ciaprès.

Légendes Figure 1 : des séquences d'ADNc des ILK humaine et murine La séquence d'ADNc d'ILK-2 est alignée avec la séquence d'ILK-1 (Hannigan et al., 1996) et celle d'ILK de souris (Li et al., 1997). Seuls les nucléotides non identiques sont montrés pour les séquences publiées d'ILK humaine et murine. Les sites de restriction uniques BamHI dans ILK-1 et Hindi dans ILK-2 sont représentés. La case ombrée indique le codon qui est absent dans la séquence publiée d'ILK-1.

Figure 2 : Séquence d'acides aminés déduite d'ILK-2 comparée à ILK humaine et murine Les acides aminés d'ILK humaine et murine sont omis, sauf dans les positions où ils diffèrent d'ILK-2. Par rapport à ILK-1, les quatre substitutions dans ILK-2 humaine se situent dans les sous-domaines kinases (résidus 199 à 451) et sont indiqués en gras.

Figure 3 : par Northern Blot de l'expression de l'ARNm d'ILK-2 dans différentes lignées de cellules tumorales 3A. On a soumis de l'ARN poly(A)+ (3 ug) isolé de cellules HT-144 stimulées par le TGF-P à une électrophorèse dans un gel dénaturant formaldéhyde-agarose à 2 %, on l'a transféré sur une membrane en nylon et on l'hybride avec un ADNc complet codant pour ILK-2 et marqué au 32P. La position des marqueurs de taille de l'ARN en kilobases est indiquée.

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3B. On a traité de la manière décrite de l'ARN poly (A)+ provenant de cellules HT-144 stimulées par le TGF-ss1 ainsi que des cellules HT1080 et SK-Mel-2 et on les a hybridés en premier lieu avec l'ADNc d'ILK-2 complet marqué au 32P puis on les a réhybridés avec une sonde ADNc d'ILK-1 marquée au 32P.

Figure 4 : Analyse par RT-PCR-RFLP de l'expression de l'ARNm d'ILK-1 et ILK-2 dans des cellules cancéreuses On a transcrit 2 g de l'ARN total préparé à partir de cellules de mélanomes HT-144 stimulées par le TGF-P, de cellules de mélanomes SK-Mel-1 et SK-Mel-2, de cellules de cancer de la prostate PC3, de fibrosarcome HT1080 et de fibroblastes primaires normaux en utilisant des amorces qui co-amplifient ILK-1 et ILK-2. Les fragments d'ADNc amplifiés sont digérés soit avec BamHI (B), soit avec Hindi (H). Les fragments non digérés (N) et digérés (B, H) sont soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %, puis colorés au bromure d'éthidium. Les marqueurs de poids moléculaire (échelle ADN 1 kb plus) sont représentés à gauche du gel.

Figure 5 : Expression de l'ARNm d'ILK-1 et ILK-2 dans des tissus normaux On a effectué une RT-PCR-RFLP en utilisant 2 g de l'ARN total provenant d'une collection de tissus normaux (Clonetech) de la manière décrite dans la légende de la figure 4. Les fragments PCR amplifiés sont digérés soit avec BamHI, soit avec Hindi et soumis directement à une électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %.

Figure 6 : Analyse par Western Blot de l'expression d'ILK-1 et ILK-2 On a soumis des extraits cellulaires (100 ug de protéine/puits) provenant de différentes lignées cellulaires cancéreuses humaines ou de fibroblastes primaires humains à une électrophorèse SDS-PAGE 8 % et à une analyse par Western Blot. Une bande unique de 59 kDa est identifiée dans tous les échantillons avec un anticorps polyclonal antiILK.

Figure 7: Analyse par Western Blot de l'expression des protéines de fusion GST/ILK-1 et GST/ILK-2 On a soumis des extraits (100 g de protéine/puits) de bactéries transformées exprimant les protéines de fusion GST/ILK-1 et GST/ILK-2 ou exprimant la GST seule. Une bande spécifique de 88 kDa est identifiée avec un anticorps polyclonal anti-

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GST dans les extraits des bactéries produisant GST/ILK-1 ou GST/ILK-2 et une bande de 29 kDa dans les bactéries produisant la GST seule Figure 8: Activité kinase des protéines de fusion GST/ILK-1 et GST/ILK-2 recombinantes 8A. On a incubé de la GST/ILK-2 purifiée par chromatographie d'affinité sur glutathion-Sépharose avec du [[gamma]32P]ATP en présence ou en absence du substrat MBP, on l'a soumise à une électrophorèse SDS-PAGE 10 % et transférée sur une membrane en nitrocellulose. La membrane a été exposée à une autoradiographie en présence d'écrans amplificateurs.

8B. On a incubé de la GST/ILK-1 ou GST/ILK-2 purifiée par chromatographie d'affinité sur glutathion-Sépharose en présence de la protéine de fusion GST-ss3cyto, on l'a soumise à une électrophorèse SDS-PAGE 8 %, et transférée sur une membrane de nitrocellulose soumise à autoradiographie. A titre de contrôle négatif, on a incubé de la GST/ILK-2 avec de la MBP en présence de [[alpha]32P]ATP (FM = Front de Migration).

Figure 9 : Croissance indépendante de l'ancrage des cellules de mélanome SKMel-2 transfectées avec ILK-2 9A. On a transfecté de manière stable les cellules de mélanome SK-Mel-2 non métastatiques avec le vecteur pcDNA-neo contenant l'ADNc entier d'ILK-2 et on a sélectionné des clones résistants à la néomycine. L'expression d'ILK-2 par le clone cellulaire sélectionné SK-Mel-2/9 est démontrée par RT-PCR-RFLP semi-quantitative.

On a co-amplifié dans un même tube l'ADNc d'ILK et l'ADNc de P-actine, servant de contrôle interne, en utilisant de l'ARN provenant des cellules SK-Mel-2 parentales et/ou du clone cellulaire SK-Mel-2/9. L'ADN amplifié non digéré (N) ou digéré avec BamHI (B) ou Hindi (H) a été soumis directement à une électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %. Les marqueurs de poids moléculaire (échelle ADN 1 kb plus) sont montrés à gauche du gel.

9B. Culture en gélose molle des cellules SK-Mel-2 parentales et des cellules SK-Mel- 2/9 transfectées avec le vecteur contenant l'ADNc d'ILK-2.

Figure 10: Induction sélective de l'expression d'ILK-2 dans des cellules de mélanome HT-144 par le TGF-01.

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Les cellules de mélanome HT-144 ont été cultivées en présence ou en absence de 10 g de TGF-pl et l'expression de l'ARNm d'ILK-1 et ILK-2 a été déterminée par RTPCR-RFLP comme décrit dans la légende de la figure 4.

EXEMPLE 1 : Séquencenucléotidique et séquence d'acides aminés d'ILK-2.

Matériels et méthodes Lignées cellulaires et culture Les lignées cellulaires de mélanome HT-144, SK-Mel-1 et SK-Mel-2, de fibrosarcome HT-1080 et de cancer de la prostate PC3 ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) et cultivées en milieu de Dulbecco modifié par Iscove (IMDM, BioWhittaker, Verviers, Belgique) supplémenté avec 10 % (V/V) de sérum de veau f#tal inactivé à la chaleur, de la glutamine (2 mM) et de la pénicilline/streptomycine (100 U/ml). Pour les cultures de fibroblastes humains, des échantillons chirurgicaux de prépuces humains ont été broyés finement puis cultivés dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm. Les cultures de fibroblastes primaires ont été amplifiées par deux ou trois passages et soit utilisées directement, soit congelées pour une utilisation ultérieure. Pour chaque passage, les cellules adhérentes ont été détachées avec du tampon EDTA pH 7,4 (NaCl 126 mM, KC1 5 mM, EDTA 1 mM et HEPES 50 mM) Expériences RT-PCR L'ARN total de cellules HT-144 stimulées par le TGF-p ou de différentes lignées de cellules cancéreuses, ou de cultures primaires de fibroblastes normaux, a été préparé par la méthode d'extraction au thiocyanate acide de guanidinium/phénol/chloroforme (Chomczynski et Sacchi, 1987). Pour la RT-PCR, on a transcrit 2 ug de l'ARN total en ADNc à l'aide du kit RNA PCR Ver. 2.1 (TaKaRa Biomedicals, Verviers, Belgique) en se servant d'une amorce anti-sens (30mère) correspondant à la séquence nucléotidique 1359-1341 d'ILK-1 avec un site de restriction Xho additionnel (CTCGAG) : 5'CTCGAGCTACTTGTCCTGATCTTCTCAAG-3' (SEQ ID N 3).

L'amorce sens est un 32mère correspondant à la séquence nucléotidique 1-21 d'ILK avec un site de restriction EcoRI (GAATTC) : 5'-GAATTCGTATGGACGACATTTTCACTCAGTGC-3' (SEQ ID N 4).

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Ensuite, on a amplifié l'ADNc pendant 40 cycles sur un appareil GeneAmp PCR System 2040 de Perkin Elmer. Le programme des cycles comprend une étape de dénaturation à 95 C pendant 1 minute et une étape d'hybridation à 50 C pendant 2 minutes, suivies d'une étape d'élongation à 72 C pendant 3 minutes. Pour l'analyse RT-PCR semi-quantitative, on a amplifié de l'ADNc d'ILK ensemble avec l'ADNc de P-actine, servant de contrôle interne, dans un seul tube pendant 25 cycles, comme décrit précédemment (Janji, 1999).

Analyse RFLP de l'ADNc d'ILK amplifié Pour l'analyse RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), on a purifié de l'ADNc d'ILK amplifié par RT-PCR en utilisant le système de purification d'ADN PCR Preps (Promega, Madison, WI) ; l'ADNc amplifié a été digéré avec BamHI ou HincII et soumis à une électrophorèse en gel d'agarose à 1 %. Les bandes sont visualisées après coloration du gel au bromure d'éthidium.

Clonage et séquençage de l'ADNc d'ILK-2 amplifié par PCR On a sous-cloné l'ADNc d'ILK-2 dans le site de restriction EcoRI-XhoI du vecteur pcDNA3.1(+)neo (Invitrogen, Groningue, Pays-Bas) et on a vérifié le produit d'assemblage par séquençage didésoxy à l'aide du kit de séquençage T7 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suède).

Analyse Northern Blot L'ARN Poly(A) a été obtenu après isolement de l'ARN total à l'aide d'une colonne oligo-dT cellulose (Life Technologies Inc., Merelbeke, Belgique) suivant les instructions du fabricant. L'ARN Poly (A) (2 g) a été séparé par électrophorèse dans un gel d'agarose 1 %/ formaldéhyde et on l'a transféré sur une membrane en nylon Hybond N (Amersham Pharmacia Biotech). On a effectué une préhybridation à 42 C pendant 4 heures dans du formamide à 50 %, du KH2P04 25 mM, de la solution de Denhardt 5x, du SSC 5x, 0,1 mg/ml d'ADN de sperme de saumon fragmenté préalablement dénaturé à 100 C pendant 3 minutes. On a hybridé la membrane pendant une nuit à 42 C avec une sonde correspondant à l'ADNc ILK-2 entier et marqué au 32P à l'aide d'un kit d'amorçage aléatoire (Life Technologies). Après hybridation, on a lavé la membrane pendant 20 minutes dans du SSC 2x, SDS 0,1% à la température ambiante et deux fois à 50 C pendant 20 minutes dans du SSC lx, SDS

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0,1%. Ensuite, on a exposé la membrane à -80 C pour autoradiographie. Enfin, on a déhybridé la membrane par ébullition dans du SDS 0,1 % et on l'a retestée avec de l'ADNc ILK-1 entier marqué au 32P.

Analyse Western Blot L'orthovanadate de sodium (NaV04), la leupeptine, la pepstatine, l'aprotinine, le 4- guanidinobutylamide de N- (trans-époxysuccinyl)-L-leucine (E64),le fluorure de 4-(2- aminoéthyl)-benzènesulfonyle (AESBF) sel chlorhydrate et la benzamidine sont fournis par Sigma (Bornem, Belgique) ; les IgG de chèvre anti-lapin conjuguées à la peroxydase de raifort, l'anticorps de lapin anti-ILK UB 06-550 est fourni par Upstate Biotechnology (Veenendaal, Pays-Bas) ; l'anticorps de chèvre anti-GST' fourni par Amsterdam Pharmacia Biotech.

On a lysé les cellules à 4 C dans du tampon RIPA (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, NP-40 1 %, SDS 0,1 %, désoxycholate 1 %) contenant 1 mM d'orthovanadate de sodium, 10 g/ml de leupeptine, 10 ug/ml de pepstatine, 50 uM d'AEBSF, 10 g/ml d'E64,25 ug/ml d'aprotinine et 0,5 mM de benzamidine. On a effectué une préclarification des lysats et on a déterminé la concentration en protéines.

On a analysé des échantillons de lysat cellulaire (70 g de protéine) ou des échantillons de lysat bactérien (100 ug de protéine) dans des gels de polyacrylamideSDS à 8 %, on les a transférés sur une membrane de nitrocellulose Hybond C (Amersham Pharmacia Biotech), on les a traités avec l'anticorps polyclonal de lapin anti-ILK ou anti-GST et des anticorps secondaires de chèvre anti-IgG de lapin conjugués à la peroxydase de raifort, et pour finir on les a révélés à l'aide d'un kit de chémiluminescence (Pierce, Anvers, Belgique).

Résultats Des amorces spécifiques d'ILK correspondant aux extrémités 5' et 3' et la RT-PCR ont été utilisées pour amplifier l'ADNc d'ILK entier à partir de l'ARNm de cellules HT- 144 stimulées par le TGF-p. L'identité du produit de PCR cloné de 1359 bases avec le cDNA d'ILK humaine a été vérifiée par une analyse des fragments de restriction.

Chose intéressante, l'analyse de plusieurs ADNc entiers d'ILK sous-clonés a révélé pour certains d'entre eux l'absence d'un site de restriction BamHI, présent à la position 814 dans la séquence d'ADNc d'ILK. Le séquençage de l'ADNc complet dépourvu du site BamHI révèle une homologie de seulement 93 % environ avec la séquence d'ILK-

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1, ce qui indique que l'ADNc d'ILK-2 code pour une isoforme plutôt que pour un variant allélique d'ILK-1. La comparaison de la séquence d'ILK-2 avec celle d'ILK-1 et d'ILK de souris révèle en outre une homologie plus étroite d'ILK-2 avec ILK de souris qu'avec ILK-1, suggèrent qu'ILK de souris est l'homologue d'ILK-2 humaine (figure 1). Toutefois, au niveau des acides aminés, la séquence déduite d'ILK-2, comparée à celle d'ILK-1, diffère par 4 acides aminés seulement au niveau des positions 197 (T-A), 214 (G-S), 259 (S-A) et 437 (P-S). Les quatre mutations sont toutes situées dans les sous-domaines de la kinase (figure 2).

Afin de déterminer la taille de l'ARNm codant pour ILK-2, on a effectué une analyse Northern Blot en utilisant de l'ARNm poly(A)+ provenant de cellules de mélanome HT-144 stimulées par le TGF-ss, ainsi que de l'ARNm poly (A)+ de cellules SK-Mel-2 et HT-1080. Compte tenu de la forte homologie de séquence entre ILK-1et ILK-2, on a d'abord fait réagir le Northern Blot avec la sonde ILK-2, puis on l'a déshybridé et on l'a retesté avec la sonde ILK-1. Comme le montre la figure 3A, on a identifié un transcrit unique de 1,8 kb dans l'ARNm des cellules HT-144 stimulées par le TGF-P. Une bande similaire est également fortement marquée dans l'ARNm des cellules HT-1080 mais seulement faiblement dans l'ARNm des cellules SK-Mel-2 (figure 3B). On a identifié la même bande à 1,8 kb avec la sonde ILK-1 mais cette bande n'est que faiblement marquée dans l'ARNm des cellules HT-144 et plus fortement dans l'ARNm des cellules SK-Mel-2. Ces résultats démontrent qu'ILK-1 et ILK-2 sont codées par un ARNm de taille identique. Néanmoins, une réactivité croisée de la sonde ILK-2 avec l'ARNm d'ILK-1 ne peut pas être exclue.

Distribution tissulaire d'ILK-2 comparée à ILK-1 Etant donné que l'expression tissulaire spécifique d'ILK-2 et d'ILK-1 ne pouvait pas être étudiée par une analyse Northern Blot, nous avons utilisé la méthode RT-PCR, suivie d'une analyse de polymorphisme de restriction (RFLP) afin d'identifier les transcrits géniques d'ELK-1 et d'ILK-2. Une analyse comparative de l'ADNc d'ILK-1 et ILK-2 révèle la présence d'un site de restriction HincII unique à la position 409 de l'ADNc ILK-2, donnant lieu à deux fragments de 411 et 948 bases, ainsi qu'un site de restriction BamHI unique dans ILK-1, générant deux fragments des 536 et 823 bases (figure 1). On a effectué la RT-PCR puis l'analyse RFLP sur de l'ARNm isolé de diverses lignées de cellules cancéreuses humaines ainsi que de fibroblastes humains

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primaires. Comme le montre la figure 4, les cellules HT-144 expriment à la fois l'ARNm d'ILK-1 et d'ILK-2 tandis que les cellules HT1080 expriment seulement ILK- 2, à la différence de SK-Mel-1, SK-Mel-2 et PC3 ainsi que des fibroblastes primaires normaux, qui n'expriment qu'ILK-1, confirmant les données fournies par l'analyse Northern Blot. L'analyse par Western Blot de l'expression d'ILK à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-ILK-1 a révélé une seule bande de poids moléculaire 59.000 dans les cellules tumorales exprimant soit ELK-1, soit ILK-2, démontrant une antigénicité croisée entre ILK-1et ILK-2 (figure 6). Pour étudier l'expression d'ILK-1 et ILK-2 dans les différents tissus, nous avons ainsi utilisé la technique RT-PCRRFLP. Tous les tissus normaux testés se sont révélés positifs pour l'ARNm d'ILK-1, mais négatifs pour l'ARNm d'ILK-2 (figure 5). Ces résultats montrent qu'ILK-2 n'est pas exprimée dans les tissus normaux mais qu'elle est surexprimée dans des lignées cellulaires cancéreuses fortement invasives.

EXEMPLE 2 : Activité kinase d'ILK-2 Matériels et méthodes Purification des protéines de fusion produites dans E. coli On a purifié l'ADNc complet codant pour ILK-1 et ILK-2 et on l'a inséré dans le site EcoRI/XhoI du vecteur pGEX-4T-2 (Amersham Pharmacia Biotech) en phase avec la séquence codant pour la GST et contenant un site de clivage de la thrombine. On a vérifié la séquence à l'aide du kit de séquençage T7. La GST native et les protéines de fusion GST/ILK-1 et GST/ILK-2 sont exprimées dans E. coli BL21 après induction par l'IPTG et purifiées par chromatographie d'affinité sur glutathion-Sépharose décrite précédemment (Vallar, 1999). En résumé, les culots bactériens ont été mis en suspension dans du PBS (NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM, Na2HP04 10 mM, KH2P04 1,8 mM pH 7,4) contenant de l'EDTA 10 mM et du fluorure d'aminoéthylbenzènesulfonyle (AEBSF) 50 M et incubés pendant 30 minutes à température ambiante en présence de 200 g/ml de lysozyme. La suspension bactérienne a été soniquée et traitée avec du Triton X-100 à 1 % pendant 30 minutes à 4 C. Le matériel insoluble a été sédimenté par centrifugation à 10. 400 x g à 4 C pendant 20 minutes. Le surnageant a été prélevé et filtré sur une membrane de 0,8 m puis soumis à une chromatographie d'affinité sur colonne (100 x 20 mm) en utilisant le glutathion/Sépharose 4B (Amersham Pharmacia

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Biotech) préalablement équilibrée avec du PBS. Les protéines de fusion liées ont été éluées avec du glutathion réduit 10 mM dans du Tris-HCl 50 mM pH 8,0.

Etude in vitro de l'activité kinase de la protéine de fusion GST-ILK recombinante On a déterminé l'activité kinase in vitro en utilisant un protocole expérimental standard. En résumé, la GST-ILK-1 ou GST-ILK-2 (6 g) purifiée sur glutathionSépharose a été incubée pendant 20 minutes à 30 C en présence ou en l'absence de 10 g de la protéine de base de la myéline (MBP) utilisée comme substrat exogène ou de la protéine de fusion contenant la partie cytoplasmique de l'intégrine ss3 (GST- ss3cyto) (Vallar et al., 1999) dans un volume total de 50 l de tampon de réaction (HEPES 50 mM pH 7,0, MnCl2 10 mM, MgCl2 10 mM, NaF 2 mM, Na3V04 1 mM) contenant 10 Ci de [y32P]ATP. On a stoppé la réaction par ajout d'un volume égal de tampon de charge 2x pour échantillons SDS-PAGE. Les produits de la réaction ont été analysés sur un gel SDS-PAGE à 11% et transférés sur de la nitrocellulose. On a exposé la membrane pour autoradiographie à-80 C pendant 48 heures en présence d'écrans amplificateurs. On a effectué également la même expérience en présence de [a32P]ATP comme contrôle négatif.

Transfection d'ADNc ILK-2 dans des cellules SK-Mel-2 On a mélangé le vecteur pcDNA-neo (Invitrogen) contenant l'ADNc ILK-1entier ou le vecteur vide avec 40 ug de lipofectamine (Life Technologies) dans un volume final de 200 ul d'IMDM et on l'a ajouté à des cellules de mélanome SK-Mel-2, cultivées à 60 % de confluence dans des boîtes de culture tissulaire de 100 mm. Au bout de 24 heures, on a ajouté du sérum de veau f#tal au milieu de culture et, 48 heures après la transfection, on a cultivé les cellules en présence de néomycine 1 mM. On a analysé un clone cellulaire résistant à la néomycine (SK-Mel-2/9) pour déterminer l'expression d'ILK-2 par Western Blot et RT-PCR-RLFP.

Culture des cellules en gélose molle Afin de comparer la croissance cellulaire adhésion-indépendante des cellules SK-Mel- 2 parentales et du clone SK-Mel-2/9 transfecté par ILK-2, on a effectué la culture des cellules en gélose molle telle que décrite par Chen et al. (1997). En résumé, on a préparé une suspension de 6 x 103cellules dans 1 ml d'agarose à 0,4 % à bas point de fusion (Life Technologies) dissous dans du milieu IMDM contenant 10 % de sérum de

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veau f#tal et des antibiotiques et on l'a étalée sur une couche précoulée d'agarose à 0,8 % dans le même milieu de culture dans des boîtes de culture à 6 puits. Après 3 semaines d'incubation à 37 C dans un incubateur humidifié avec 5 % de C02, on a visualisé les colonies cellulaires à l'aide de la technique de coloration des cellules par du MTT.

Résultats Activité kinase d'ILK-2 Bien qu'ILK-2 diffère d'ILK-1 par quatre acides aminés seulement, le fait que les 4 substitutions se situent dans les sous-domaines kinases de la molécule nous a conduit à étudier l'activité kinase d'ILK-2. Pour cela, ILK-1 et ILK-2 ont été exprimées dans des bactéries sous forme de protéines de fusion liées à la glutathion-S-transférase (GST).

L'analyse Western Blot réalisée avec un anticorps polyclonal anti-GST a mis en évidence dans chaque lysat bactérien une bande spécifique à 88 kDa correspondant à GST-ILK-1et GST-ILK-2 (figure 7).

Pour l'étude in vitro de l'activité de la kinase d'ILK-2, on a purifié les protéines de fusion GST/ILK-1 et GST/ILK-2 par chromatographie d'affinité sur glutathionSépharose et on les a incubées avec du [[gamma]-32P]ATP ou du [[alpha]-32P]ATP en présence ou en absence du substrat exogène de protéine basique de la myéline (MBP) ou de la protéine de fusion comprenant la partie cytoplasmique de l'intégrine ss3 (GST-ss3cyto).

Comme le montre les figures 8A et 8B, la GST/ILK-2 est autophosphorylée de manière similaire à la GST/TLK-1 en présence de [y-32P]ATP mais pas en présence de [a-32P]ATP, utilisée ici comme contrôle négatif. ILK-2 est également capable de phosphoryler la MBP ainsi que la partie cytoplasmique de la sous-unité ss3 de l'intégrine.

La surexpression d'ILK-2 dans les cellules de mélanome SK-Mel-2 induit une croissance cellulaire indépendante de l'ancrage Afin de tester l'activité fonctionnelle d'ILK-2 in vivo, on a transfecté de l'ADNc d'ILK- 2 dans des cellules SK-Mel-2 dont on a montré qu'elles expriment seulement ILK-1.

Les cellules SK-Mel-2 sont tumorigènes mais non métastatiques lorsqu'elles sont

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étudiées in vivo après injection dans des souris nude . In vitro, ces cellules présentent une croissance cellulaire dépendante de l'ancrage (Gouon, 1996). Bien que l'analyse Western Blot d'un clone cellulaire SK-Mel-2/9, transfecté avec ILK-2 et résistant à la néomycine, ne révèle aucune surexpression de l'antigène ILK, comparé aux cellules SK-Mel-2 parentales (figure 8A), l'analyse RT-PCR semi-quantitative de l'ARNm isolé de ce clone cellulaire montre la présence de l'ARNm codant pour la protéine ILK-2 transfectée, non exprimées dans les cellules SK-Mel-2 parentales (figure 8B). Afin d'étudier l'effet de l'expression d'ILK-2 sur la croissance indépendante de l'ancrage des cellules SK-Mel-2, on a étudié la croissance des cellules SK-Mel-2 parentales et des cellules SK-Mel-2/9 en gélose molle. Comme le montre la figure 8C, deux semaines après l'ensemencement des cellules, les cellules SK-Mel-2/9 exprimant ILK-2 forment de grandes colonies, à l'inverse des cellules SK-Mel-2 parentales, qui subissent seulement 1 ou 2 divisions cellulaires avant la mort cellulaire.

L'expression de l'ARNm d'ILK-2 mais pas d'ILK-1 est régulée positivement dans des cellules de mélanome HT-144 après stimulation par le TGF-ss1.

Etant donné qu'ILK-2 semble structurellement et fonctionnellement similaire à ILK-1 mais présente une expression tissulaire particulière, limitée aux cellules cancéreuses fortement invasives, la question est de savoir si l'expression d'ILK-2 peut être régulée d'une manière différente de celle d'ILK-1. En ce sens, on a étudié l'effet du TGF-ss sur l'expression d'ILK-2 dans les cellules de mélanome HT-144. Une RT-PCR semiquantitative, suivie d'une analyse RFLP, est illustrée sur la figure 9. Lorsque la RTPCR est effectuée sur 25 cycles seulement en utilisant de l'ARNm provenant de cellules HT-144 non stimulées, on ne détecte aucun produit de PCR correspondant à ILK-1 ou à ILK-2. En revanche, dans les cellules HT-144 stimulées avec 10 ng de TGF-ss1 pendant 48 heures, on observe une bande amplifiée à 1359 bases qui correspond exclusivement à ILK-2. Par contre, on n'observe aucun changement du niveau d'expression de l'ARNm de P-actine (300 bp) après stimulation par le TGF-ss1, la P-actine servant de contrôle interne. Les résultats démontrent que le TGF-P 1 stimule uniquement l'expression d'ILK-2, suggérant que les promoteurs géniques d'ILK-1 et d'ILK-2 sont fonctionnellement distincts.

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LISTE DE SEQUENCES <110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - CNRS
CENTRE DE RECHERCHE PUBLIQUE - CRP <120> NOUVELLE KINASE LIÉE AUX INTÉGRINES ILK-2 <130> D18409 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.2 <210> 1 <211> 1359 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> Séquence nucléotidique ILK-2 <400> 1 atggacgaca ttttcactca gtgccgggag ggcaacgcgg tggcggtgcg cttgtggctg 60 gacaacacag agaacgacct caatcagggg gatgatcatg gcttctcccc cttgcactgg 120 gcctgccgag aaggccgctc tgctgtggtt gaaatgctga tcatgagagg agcacgtatc 180 aatgtgatga atcgtgggga tgataccccc ctgcacctgg cagccagtca tggacaccgt 240 gacatcgtac agaagctgtt gcaatacaag gctgacatca atgcagtgaa tgagcatggg 300 aatgtgcccc ttcactatgc ctgtttctgg ggtcaagacc aggtggcaga ggacctggtg 360 gctaacgggg ctcttgtcag catctgtaac aagtatggag agatgcctgt tgacaaagcc 420 aaggcacccc ttagagagct tctccgagaa cgggcagaga agatgggcca gaatctcaac 480 cgtattccat acaaggacac attctggaag gggaccactc gtactcggcc ccgaaatggg 540 accctgaaca aacactccgg tattgacttc aaacagctca actttctggc aaagctcaac 600 gagaatcatt ctggagagct atggaaaggc cgctggcaga gcaatgacat tgttgtgaag 660 gtgctgaagg ttcgagactg gagtacaagg aaaagcaggg acttcaatga agagtgtccc 720 cggctcagga ttttctcaca tccaaacgtg cttccagtgc taggagcttg ccaggctcca 780 ccagctcccc acccaaccct tatcacacac tggatgccat atggatctct ctacaatgta 840 ctacatgaag gcaccaattt cgttgtggac cagagccaag ctgtaaagtt tgctttggac 900 atggcaagag gcatggcttt tctacacaca ctagagcctc tcatacctcg acatgcacta 960 aatagccgta gtgtaatgat cgatgaagac atgactgctc gaatcagcat ggctgatgtc 1020 aagttttctt tccagtgccc agggcgcatg tatgcacctg cctgggtagc ccctgaagcc 1080 ctgcagaaga agcctgaaga cactaacaga cgctcagcag acatgtggag ctttgcagtg 1140 cttctgtggg aactggtgac acgagaggtg ccctttgctg acctctctaa tatggagatc 1200 ggaatgaagg tggcactgga aggccttcgg cctacaattc caccaggtat ttccccacac 1260 gtgtgtaagc tcatgaagat ttgtatgaat gaagatcctg caaagcgatc caagtttgac 1320 atgattgtgc ctatccttga gaagatgcag gacaagtag 1359 <210> 2 <211> 452 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Séquence peptidique ILK-2 <400> 2 Met Asp Asp Ile Phe Thr Gln Cys Arg Glu Gly Asn Ala Val Ala Val
1 5 10 15

<Desc/Clms Page number 31>

Arg Leu Trp Leu Asp Asn Thr Glu Asn Asp Leu Asn Gln Gly Asp Asp
20 25 30 His Gly Phe Ser Pro Leu His Trp Ala Cys Arg Glu Gly Arg Ser Ala
35 40 45 Val Val Glu Met Leu Ile Met Arg Gly Ala Arg Ile Asn Val Met Asn
50 55 60 Arg Gly Asp Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly His Arg
65 70 75 80 Asp Ile Val Gln Lys Leu Leu Gln Tyr Lys Ala Asp Ile Asn Ala Val
85 90 95 Asn Glu His Gly Asn Val Pro Leu His Tyr Ala Cys Phe Trp Gly Gln
100 105 110 Asp Gin Val Ala Glu Asp Leu Val Ala Asn Gly Ala Leu Val Ser Ile
115 120 125 Cys Asn Lys Tyr Gly Glu Met Pro Val Asp Lys Ala Lys Ala Pro Leu
130 135 140 Arg Glu Leu Leu Arg Glu Arg Ala Glu Lys Met Gly Gln Asn Leu Asn 145 150 155 160 Arg Ile Pro Tyr Lys Asp Thr Phe Trp Lys Gly Thr Thr Arg Thr Arg
165 170 175 Pro Arg Asn Gly Thr Leu Asn Lys His Ser Gly Ile Asp Phe Lys Gln
180 185 190 Leu Asn Phe Leu Ala Lys Leu Asn Glu Asn His Ser Gly Glu Leu Trp
195 200 205 Lys Gly Arg Trp Gin Ser Asn Asp Ile Val Val Lys Val Leu Lys Val
210 215 220 Arg Asp Trp Ser Thr Arg Lys Ser Arg Asp Phe Asn Glu Glu Cys Pro 225 230 235 240 Arg Leu Arg Ile Phe Ser His Pro Asn Val Leu Pro Val Leu Gly Ala
245 250 255 Cys Gln Ala Pro Pro Ala Pro His Pro Thr Leu Ile Thr His Trp Met
260 265 270 Pro Tyr Gly Ser Leu Tyr Asn Val Leu His Glu Gly Thr Asn Phe Val
275 280 285 Val Asp Gln Ser Gin Ala Val Lys Phe Ala Leu Asp Met Ala Arg Gly
290 295 300 Met Ala Phe Leu His Thr Leu Glu Pro Leu Ile Pro Arg His Ala Leu 305 310 315 320

<Desc/Clms Page number 32>

Asn Ser Arg Ser Val Met Ile Asp Glu Asp Met Thr Ala Arg Ile Ser
325 330 335 Met Ala Asp Val Lys Phe Ser Phe Gln Cys Pro Gly Arg Met Tyr Ala
340 345 350 Pro Ala Trp Val Ala Pro Glu Ala Leu Gln Lys Lys Pro Glu Asp Thr
355 360 365 Asn Arg Arg Ser Ala Asp Met Trp Ser Phe Ala Val Leu Leu Trp Glu
370 375 380 Leu Val Thr Arg Glu Val Pro Phe Ala Asp Leu Ser Asn Met Glu Ile 385 390 395 400 Gly Met Lys Val Ala Leu Glu Gly Leu Arg Pro Thr Ile Pro Pro Gly
405 410 415 Ile Ser Pro His Val Cys Lys Leu Met Lys Ile Cys Met Asn Glu Asp
420 425 430 Pro Ala Lys Arg Ser Lys Phe Asp Met Ile Val Pro Ile Leu Glu Lys
435 440 445 Met Gin Asp Lys
450 <210> 3 <211> 29 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Amorce <400> 3 ctcgagctac ttgtcctgat cttctcaag 29 <210> 4 <211> 32 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Amorce <400> 4 gaattcgtat ggacgacatt ttcactcagt gc 32 <210> 5 <211> 18 <212> ADN <213> Séquence artificielle

<Desc/Clms Page number 33>

<220> <223> Amorce <400> 5 tgccgggagg gcaacgcg 18 <210> 6 <211> 22 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Amorce <400> 6 gagaggagca cgtatcaatg tg 22 <210> 7 <211> 18 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Amorce <400> 7 ttctggggtc aagaccag 18 <210> 8 <211> 18 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Amorce <400> 8 cagctcaact ttctggca 18

Claims (30)

1. REVENDICATIONS 1. Acide nucléique purifié ou isolé, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléique choisie parmi le groupe de séquences suivantes : a) la séquence SEQ ID No. 1 ; b) un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID No. 1; c) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 93 % après alignement optimal avec une séquence telle que définie en a) ou b) ; d) la séquence complémentaire ou la séquence de l'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b) ou c).
2. 2. Acide nucléique selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'il comporte un seul site de restriction Hindi en position 409 de l'ADNc d'ILK-2.
3. 3. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 2 caractérisée en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID N 1.
4. 4. Acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 3 ou d'une séquence capable de s'hybrider avec une séquence dérivée du gène ILK-2, de préférence sélectionné parmi les acides nucléiques sélectifs de ILK-2, notamment de SEQ ID N 5 à 8.
5. 5. Séquence nucléotidique selon la revendication 4 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une sonde, d'une amorce, ou d'un oligonucléotide antisens.
6. 6. Polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence peptidique ayant au moins 80% d'identité avec ILK-2 après alignement optimal et en ce qu'il possède

   <Desc/Clms Page number 35>

   259, et une sérine en position 437.

   une alanine en position 197, une sérine en position 214, une alanine en position
7. 7. Polypeptide selon la revendication 6 ayant la séquence SEQ ID N 2.
8. 8. Polypeptide selon l'une des revendications 6 et 7 caractérisé en ce qu'il possède une activité sérine/thréonine kinase.
9. 9. Polypeptide selon l'une des revendications 6 à 8 caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le contrôle de la croissance, de l'adhésion, de la migration cellulaire, en particulier dans le processus d'invasion des cellules tumorales.
10. 10. Vecteur comprenant une séquence selon l'une des revendications 1 à 5 ou une séquence codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 6 à 9.
11. 11. Vecteur selon la revendication 10 caractérisé en ce que ladite séquence est fusionnée à un promoteur efficace dans les cellules eucaryotes et/ou procaryotes.
12. 12. Vecteur selon la revendication 11caractérisé en ce qu'il comporte en outre un gène de sélection.
13. 13. Vecteur selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il comprend une séquence antisens capable d'inhiber l'expression de ELK-2.
14. 14. Anticorps capable de se lier spécifiquement à un polypeptide selon l'une des revendications 6 à 9.
15. 15. Procédé de détection et/ou de quantification d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il met en #uvre un oligonucléotide selon

    <Desc/Clms Page number 36>

    8.

    l'une des revendications 4 et 5, de préférence un oligonucléotide de SEQ ID N 5 à
16. 16. Procédé de détection et/ou de quantification d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Obtention d'ADNc de ILK à partir des ARNm totaux contenu dans un échantillon par RT-PCR, b) Analyse RFLP de l'ADNc obtenu à l'étape a) en utilisant Hindi pour produire deux fragments d'environ 411 et 948 bases dans le cas d'ILK-2 d'une longueur d'environ 1359 nucléotides.
17. 17. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que l'échantillon provient de la biopsie d'un tissu d'un individu.
18. 18. Procédé selon l'une des revendications 15 à 17 caractérisé en ce qu'on effectue une amplification spécifique à l'aide d'au moins une amorce selon la revendication 5, de préférence par la technique PCR-SSP.
19. 19. Procédé selon l'une des revendications 15 à 18 permettant le calcul du ratio ILK-2 / ILK-1 caractérisé en que l'on utilise Hindi et BahmHI pour produire deux fragments d'environ 411 et 948 bases caractéristiques de ILK-2 (1359 bases) et deux fragments d'environ 536 et 823 bases caractéristiques de ILK-1 (1359 bases).
20. 20. Procédé selon l'une des revendications 15 à 19 permettant le diagnostic du potentiel invasif de cellules cancéreuses.
21. 21. Procédé de détection et/ou de quantification d'un polypeptide selon l'une des revendications 6 à 9 caractérisé en ce qu'il met en #uvre un anticorps selon la revendication 14.

    <Desc/Clms Page number 37>
22. 22. Procédé selon la revendication 21 comprenant un test ELISA.
23. 23. Kit de diagnostic caractérisé en ce qu'il permet de mettre en #uvre le procédé selon l'une des revendications 16 à 22.
24. 24. Kit de diagnostic selon la revendication 23 comprenant un oligonucléotide selon l'une des revendications 4 et 5 ou un anticorps selon la revendication 14.
25. 25. Procédé de criblage de composés susceptibles d'inhiber ILK-2 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) addition d'au moins un composé susceptible d'inhiber ILK-2 dans le milieu de culture de cellules exprimant ILK-2, en particulier de cellules cancéreuses à fort potentiel invasif, b) Analyse du taux de prolifération, d'adhésion, de migration et/ou d'invasion comparé avec celui de cellules non-traitées (contrôle), c) Sélection des composés permettant une baisse du taux supérieure à 50%, en particulier supérieure à 90%, de préférence supérieure à 99%.
26. 26. Procédé de criblage de composés susceptibles d'inhiber ILK-2 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) purification d'ILK-2, b) incubation d'ILK-2 obtenue à l'étape a) avec un substrat, notamment avec le substrat exogène de la protéine basique de la myéline (MBP) ou la protéine de fusion de la queue cytoplasmique de l'intégrine ss1, ss2, ou ss3, de préférence avec (GST-ss3cyto), dans un tampon comprenant du [y32P]ATP avec au moins un composé susceptible d'inhiber ILK-2, c) Analyse de la quantité de substrat phosphorylé par autoradiographie, phosphorimageur ou précipitation au PEG et quantification dans un compteur ,

    <Desc/Clms Page number 38>

    d) Sélection des composés permettant une diminution de la quantité de substrat phosphorylé supérieure à 50%, en particulier supérieure à 90%, de préférence supérieure à 99%.
27. 27. Composé susceptible d'être obtenu à partir du procédé selon l'une des revendications 25 et 26.
28. 28. Composition comprenant un composé selon la revendication 27 ou un vecteur selon l'une des revendications 10 à 13 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
29. 29. Utilisation d'un composé selon la revendication 27 ou d'un vecteur selon l'une des revendications 10 à 13 pour la fabrication d'un médicament.
30. 30. Utilisation selon la revendication 29 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une maladie pour laquelle une expression d'ILK-2 est impliquée, notamment pour le traitement du cancer, en particulier pour prévenir et/ou empêcher les métastases.