JP2002506971A - Ｃ−ｍｙｃコーディング領域決定基結合タンパク質（ｃｒｄ−ｂｐ）およびその核酸配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト患者における癌の存在または非存在を診断する方法が開示されている。１つの実施態様において、該方法は、患者の組織をＣＲＤ−ＢＰ発現レベルについて調べ、その発現レベルを対照レベルと比較する段階を含む。本発明はまた、癌性組織における機能的ＣＲＤ−ＢＰのレベルを排除または低下させる段階を含む、癌細胞成長を抑制する方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願の相互参照） 本出願は、１９９８年３月９日に出願された米国仮出願番号第６０／０７７，
３７２号の優先権を主張する。第６０／０７７，３７２号は、本明細書に完全に
示したと同様に、参照して本明細書の記載の一部とする。

【０００２】 （連邦後援研究または開発に関する供述） 本発明は、以下の機関により与えられた米国政府支援のもとでなされた：ＮＩ
Ｈ許可番号：ＣＡ６３６７６；ＣＡ０７１７５；ＣＡ２３０７６。米国は本発明
に対して所定の権利を有するものである。

【０００３】 （発明の背景） ｃ−ｍｙｃタンパク質は、Ｍａｘとヘテロダイマーを形成する、転写因子のヘ
リックス−ループ−ヘリックス／ロイシンジッパー（ＨＬＨ／ＬＺ）^１ファミリ
ーの一員である（１−３）。一般に、トランス活性化Ｍｙｃ：Ｍａｘヘテロダイ
マーは増殖中の細胞中に見られ、一方、トランス抑制Ｍａｄ：Ｍａｘヘテロダイ
マーは分化した細胞中に見られる。ｃ−ｍｙｃタンパク質レベルは、細胞増殖、
分化および新生物形質転換に影響を及ぼし、これはおそらくＭｙｃ：Ｍａｘない
しＭａｄ：Ｍａｘヘテロダイマー間の平衡に影響を及ぼすことによる（４）。ｃ
−ｍｙｃタンパク質が過剰発現されるか、または不適切な時に誘導される場合、
この平衡は撹乱され、細胞増殖および分化は乱される。例えば、ｃ−ｍｙｃ過剰
発現は細胞分化を防止または遅延させる（５、６）。またそれは、血清不足細胞
が、細胞周期のＧ_０期に入るのを遮断し、その代わりにそれらをアポトーシスを
受けるように誘導する（７）。ｃ−ｍｙｃ過剰発現はまた、バーキットリンパ腫
を有する実験動物およびヒト患者における腫瘍形成にも関与する（８、９）。異
常ｃ−ｍｙｃ発現のこれらおよび他の有害な結果は、ｃ−ｍｙｃ遺伝子調節の全
態様を理解する重要性を強調する。

【０００４】 ^１本明細書で使用した略称は以下の通りである：ＨＬＨ／ＬＺ、ヘリックス−
ループ−ヘリックス／ロイシンジッパー；ＡＵＲＥ、ＡＵ−リッチ エレメント
；ＵＴＲ、非翻訳領域；ＣＲＤ、コーディング領域決定基；ＣＲＤ−ＢＰ、コー
ディング領域決定基結合タンパク質；ＤＴＴ、ジチオトレイトール；ＥＧＴＡ、
エチレングリコールビス（２アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ’（四酢酸）；Ｐ
ＭＳＦ、フェニルメチル−スルホニルフルオリド；Ｓ１３０、後ポリソーム上清
；ＳＤＳ、硫酸ドデシルナトリウム；ＲＳＷ、リボソーム塩洗浄物；ＰＣＲ、複
製連鎖反応；ｂｐ、塩基対；ＥＳＴ、発現配列標識；ＲＡＣＥ、ｃＤＮＡ末端の
迅速な増幅；ＢＡＣ、細菌人工染色体；ＧＣＧ、遺伝学コンピューターグループ
；ＩＰ、免疫沈降；ｍＲＮＰ、メッセンジャーリボ核タンパク質；ｈｎＲＮＰＫ
、異質核内リボ核タンパク質Ｋ；ＨＲＰ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ；Ｈ
ＳＰ−９０、熱ショックタンパク質−９０；ＭＯＰＳ、モルフォリンプロパンス
ルホン酸；ＫＨ、Ｋ相同性；ＯＲＦ、オープンリーディングフレーム；ＦＭＲ、
家族性精神遅滞；ＦＭＲＰ、ＦＭＲ ＲＮＡ結合タンパク質；ｈＫＯＣ、ヒト癌
で過剰発現されるヒトＫＨドメインタンパク質；ＰＡＧ、ポリアクリルアミドゲ
ル；ＰＡＧＥ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＥＣＬ、増強された化学発光
。

【０００５】 ｃ−ｍｙｃタンパク質は、リン酸化、タンパク質：タンパク質相互作用、およ
びその半減期の変化により調節される（１０−１２）。ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡレ
ベルは、転写および転写後調節され、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの安定性の変化は、
ｃ−ｍｙｃタンパク質レベルの大きな変動をもたらし得る。ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮ
Ａの半減期は、通常、僅か１０−２０分間であるが、必要時には３−６倍に延長
できる。例えば、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡは、複製中の胎児げっ歯類肝細胞では比
較的安定であり、豊富なｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡを産生する。それは成長していな
い成体肝細胞でははるかに安定性が低く、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡをほとんどまた
は全く含まない（１３、１４）。しかし、部分的肝切除後に成体肝細胞が複製す
る場合には、数倍アップレギュレートされ、安定化される（１５、１６）。

【０００６】 ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの２つのシス作用配列エレメントは、その内因性不安定
性およびおそらくその転写後調節：３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）のＡＵ−
リッチエレメント（ＡＵＲＥ）および１８０ヌクレオチドのコーディング領域決
定基（ＣＲＤ）、にも寄与する。ＣＲＤはＨＬＨ／ＬＺドメインの一部をコード
化し、ｍＲＮＡコーディング領域の３’末端に位置する。４回の観察により、ど
のようにｃ−ｍｙｃ ＣＲＤがＡＵＲＥとは独立して機能し、ｃ−ｍｙｃ ｍＲ
ＮＡ発現に影響を及ぼすのかが示される。（ｉ）そのＣＲＤが欠失したｃ−ｍｙ ｃ ｍＲＮＡは、野生型ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡよりも安定である（１７−２０）
。（ｉｉ）ＣＲＤは、培養した筋芽細胞が融合して筋管を形成する場合に起こる
転写後のｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションに必要である（２０、
２１）。（ｉｉｉ）β−グロビンｍＲＮＡのコーディング領域内のフレーム中へ
のｃ−ｍｙｃ ＣＲＤの挿入により、通常は非常に安定なβ−グロビンｍＲＮＡ
は不安定化する（２２）。（ｉｖ）ｃ−ｍｙｃ ＣＲＤは、部分的肝切除後に肝
再生を受けたトランスジェニックマウスにおけるｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡレベルの
アップおよびダウンレギュレートに必要である（１３、１５、１６、２３−２５
）。要約すると、ｃ−ｍｙｃ ＣＲＤは、動物および培養細胞のｃ−ｍｙｃ ｍ
ＲＮＡの安定性に影響を及ぼす。

【０００７】 我々は、培養細胞由来のポリソームを含む無細胞ｍＲＮＡ崩壊系を使用して、
ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの安定性およびＣＲＤの機能を詳細に調査した。ポリソー
ムは、崩壊のための基質（ｍＲＮＡ）並びにｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼす少
なくともいくつかの酵素および補因子の両方を含む。ポリソームは、適切な緩衝
系で様々な時間の間インキュベートし、ｃ−ｍｙｃなどのポリソームｍＲＮＡの
崩壊速度を、ハイブリダイゼーションアッセイにより監視する。この系は、無傷
細胞におけるｍＲＮＡ崩壊の多くの態様を反映する（２６−２９）。例えば、細
胞中で不安定なｍＲＮＡは、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で比較的不安定で
あり；細胞中で安定なｍＲＮＡはインビトロで安定である（２６）。標準的な反
応において、ポリソーム会合ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡは、おそらくエキソヌクレア
ーゼにより迅速に３’から５’方向に分解された（２９）。反応物に、ｃ−ｍｙ ｃ ＣＲＤに対応する１８０ヌクレオチドのセンスストランド競合体ＲＮＡを補
充した場合、別の崩壊経路が活性化された。このＣＲＤ ＲＮＡは、ｃ−ｍｙｃ ＣＲＤ内にヌクレオチド鎖切断開裂を誘導し、その結果、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮ
Ａは８倍不安定化された（３０）。これらの効果は、ｃ−ｍｙｃに特異的である
ようである。他の競合体ＲＮＡはｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡを不安定化せず、また、
ｃ−ｍｙｃ ＣＲＤ競合体ＲＮＡは、試験した他のｍＲＮＡを不安定化しなかっ
た。

【０００８】 これらの観察に基づき、我々は、タンパク質がｃ−ｍｙｃ ＣＲＤに結合する
と仮定した。我々はさらに、このタンパク質はＣＲＤをエンドヌクレアーゼ攻撃
から遮蔽し、ＣＲＤ競合体ＲＮＡがｍＲＮＡでタンパク質を滴定し、および、非
保護ｃ−ｍｙｃ ＣＲＤはその後エンドヌクレアーゼにより攻撃されることを示
唆した。このモデルと一致して、我々は、インビトロで強力にｃ−ｍｙｃ ＣＲ
Ｄ^３２Ｐ−ＲＮＡプローブに結合するタンパク質を検出した（３０）。このタン
パク質、すなわちｃ−ｍｙｃコーディング領域決定基結合タンパク質（ＣＲＤ−
ＢＰ）を続いて精製して均一にした（３１）。その後、我々は、ＣＲＤ−ＢＰは
発生的に調節され、胎児および新生児ラットでは発現されるが、成体動物では発
現されないことを見い出した（３２）。

【０００９】 （発明の要約） 下記の例に、我々は、ＲＮＡ結合タンパク質ファミリーの新規なメンバーであ
る、マウスＣＲＤ−ＢＰ ｃＤＮＡのクローニングを報告する。我々はまた、Ｃ
ＲＤ−ＢＰはインビトロでリボソームに結合でき、細胞抽出物中のほとんどのＣ
ＲＤ−ＢＰは、細胞質に位置し、ポリソームおよびリボソームに会合しているこ
とを示す。これらの観察は、ポリソームｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡをヌクレオチド鎖
切断攻撃から遮蔽するＣＲＤ−ＢＰの役割と一致し、これは、ＣＲＤ−ＢＰはｃ
−ｍｙｃ ｍＲＮＡを保存するのを助け、ｃ−ＭＹＣタンパク質の製造に使用で
きることを意味する。我々は、ＣＲＤ−ＢＰ発現の遮断により、非常に迅速なｃ
−ｍｙｃ ｍＲＮＡの破壊、および次いで、細胞からのｃ−ＭＹＣタンパク質の
枯渇が起こると信じる。

【００１０】 我々はまた、ＣＲＤ−ＢＰはげっ歯類由来の胎児組織だけでなく、実験室で成
長させた癌細胞系にも豊富に発現されることを示した（３２）。これに対し、Ｃ
ＲＤ−ＢＰは、成体げっ歯類由来の組織では検出できない（３２）。我々は、こ
れらの後者の観察は、ＣＲＤ−ＢＰは腫瘍胎児性タンパク質、すなわち、胎児お
よび出生後の生命の癌細胞に発現されるが、出生後の生命の正常（非癌性）組織
には発現されないタンパク質であるという考えと一致し得ると信じる。そうであ
れば、ＣＲＤ−ＢＰは、癌組織に存在するが、出生後の生命の正常組織には存在
しない。

【００１１】 癌性組織におけるＣＲＤ−ＢＰの特異的で限定された発現は、ＣＲＤ−ＢＰが
、ヒト癌の可能性ある診断／予後マーカーであることを意味し得る。さらに、Ｃ
ＲＤ−ＢＰは、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡが急速に破壊されるのを保護するようであ
り、またｃ−ＭＹＣタンパク質は細胞成長に必須であるので、ＣＲＤ−ＢＰの癌
細胞からの排除は、その成長の停止またはさらにはその死にもつながり得る。

【００１２】 本発明は、ヒト患者における癌の存在または非存在を診断する方法であって、
患者の組織をＣＲＤ−ＢＰ発現レベルについて調べ、その発現レベルを対照と比
較するか、または患者の血清をＣＲＤ−ＢＰに対する抗体について調べ、その抗
体レベルを正常対照（好ましくは年齢が適合し、性が適合したもの）のレベルと
比較する段階を含む。好ましくは、組織のＣＲＤ−ＢＰ発現レベルの対照は、試
験組織と同じ起源由来の非癌性組織である。例えば、乳房アッセイは、好ましく
は、乳房組織対照を有する。本発明の好ましい実施態様において、癌は、乳癌、
大腸癌および膵臓癌からなる群から選択される。

【００１３】 本発明の別の好ましい実施態様において、ＣＲＤ−ＢＰの検出は、生検組織を
ホモジナイズし、粗タンパク質抽出物を得る段階を含む。その後、その抽出物を
ＣＲＤ−ＢＰレベルについて調べる。

【００１４】 本発明はまた、ヒト患者における癌の段階を決定する定量法であって、患者の
組織をＣＲＤ−ＢＰ発現レベルについて調べ、その発現レベルを疾病予後と関連
づける段階を含む。

【００１５】 本発明はまた、癌細胞成長を抑制する方法であって、癌性細胞のＣＲＤ−ＢＰ
レベルを排除または低下させる段階を含む。

【００１６】 本発明の利点は、ヒト癌の診断法が開示されることである。

【００１７】 本発明の別の利点は、癌細胞成長の抑制法が開示されることである。

【００１８】 本発明の他の目的、利点および特徴は、当業者が明細書、特許請求の範囲およ
び図面を考察した後に明らかとなるであろう。

【００１９】 （発明の詳細な説明） Ａ．一般的 ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの半減期は、細胞がその成長速度を変化させるか、また
は分化する場合に調節される。ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡ分子内の２つの配列が、そ
の半減期を決定し、一方は３’−非翻訳領域にあり、他方はコーディング領域に
ある。細胞質タンパク質であるコーディング領域決定基結合タンパク質（ＣＲＤ
−ＢＰ）は、インビトロでｃ−ｍｙｃコーディング領域安定性決定基に結合する
。

【００２０】 無細胞ｍＲＮＡ崩壊系を使用した観察に基づき、我々は、ＣＲＤ−ＢＰは、ｍ
ＲＮＡに結合すると、ｍＲＮＡをヌクレオチド鎖切断攻撃から遮蔽し、よってｍ
ＲＮＡ半減期を延長することを提示する。ここで、我々は、４つのｈｎＲＮＰ
Ｋ−相同性ドメイン、ＲＧＧ ＲＮＡ結合ドメイン、および核内移行および核外
移行シグナルを含む、５７７アミノ酸タンパク質である、マウスＣＲＤ−ＢＰの
クローニングおよびさらなる特徴づけを記載する。ＣＲＤ−ＢＰは、あるヒト癌
に過剰発現されるヒトタンパク質に類似している。組換えマウスＣＲＤ−ＢＰは
、インビトロで特異的にｃ−ｍｙｃ ＣＲＤ ＲＮＡに結合し、ヒトＣＲＤ−Ｂ
Ｐに対する抗体と反応する。インビトロで翻訳されたＣＲＤ ＢＰはｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの非存在下でリボソームに結合し、細胞溶解液中のＣＲＤ−ＢＰの多
くがリボソームと会合している。

【００２１】 我々はまた、本発明のために提案した方法を以下に述べる。１つの実施態様に
おいて、我々は、ヒト患者における癌の存在または非存在を診断する方法を提案
するものであって、患者の組織をＣＲＤ−ＢＰ発現レベルについて調べ、その結
果を対照サンプルと比較する、および／または患者の血清を、ＣＲＤ−ＢＰに対
する抗体について調べ、その抗体レベルを正常対照（好ましくは年齢が適合し、
性が適合したもの）のレベルと比較する段階を含む。好ましくは、組織のＣＲＤ
−ＢＰ発現レベルの対照サンプルは、同起源由来の非癌性組織である。例えば、
試験乳房組織サンプルのＣＲＤ−ＢＰレベルを、非癌性であることが知られてい
る乳房組織のＣＲＤ−ＢＰレベルと比較する。

【００２２】 この検査は、粗タンパク質抽出物をＣＲＤ−ＢＰレベルについて、好ましくは
２抗体サンドイッチアッセイ、抗原競合アッセイ、抗体捕獲アッセイ、または、
粗タンパク質抽出物の、ＣＲＤ−ＢＰに対する抗体を用いた免疫ブロットにより
調べる形をとり得る。また、組織サンプル中の細胞を、直接、ＣＲＤ−ＢＰの存
在または非存在について、組織切片をＣＲＤ−ＢＰに対する抗体でプローブする
ことを含む免疫学的方法により、または組織切片をＣＲＤ−ＢＰに特異的な核酸
プローブでプローブすることを含むインサイツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイ
ゼーション法により調べ得る。

【００２３】 別の実施態様において、本発明は、癌疾患予後の決定法である。患者の組織サ
ンプルのＣＲＤ−ＢＰ発現レベルを調べ、これらのＣＲＤ−ＢＰレベルを疾患予
後に関連づける。

【００２４】 本発明はまた、患者の血清中の抗ＣＲＤ−ＢＰ抗体を同定および定量するため
の、免疫学的アッセイにおけるＣＲＤ−ＢＰの使用である。好ましくは、標準的
な免疫学的アッセイで組換えＣＲＤ−ＢＰを使用する。本発明はまた、癌患者由
来の血清中のＣＲＤ−ＢＰ自体を同定および定量するための、抗ＣＲＤ−ＢＰ抗
体の使用である。

【００２５】 我々は、ＣＲＤ−ＢＰのある発現レベルを、ある癌に直接関連づけることがで
き、それ故、その予見となることを見出すことを予期する。

【００２６】 我々はまた、癌性細胞からのＣＲＤ−ＢＰレベルを排除または低下させること
により、癌細胞成長を抑制する方法を提案する。好ましくは、この方法は、細胞
に競合体ＲＮＡを与えることにより、またはＣＲＤ−ＢＰの、ｃ−ｍｙｃ ｍＲ
ＮＡ ＣＲＤへの結合を遮断する阻害剤の使用による。

【００２７】 「ＣＲＤ−ＢＰ」により、我々は、好ましくは、配列番号２および下記の参考
文献３０、３１および３２で本明細書に記載したタンパク質を意味する。

【００２８】 ＣＲＤ−ＢＰ抗体を得る１つの典型的な方法は、大量の組換えＣＲＤ−ＢＰを
、細菌細胞、酵母細胞またはバキュロウイルス感染昆虫細胞のいずれかで製造す
ることであろう。その後、このタンパク質を、ウサギ、ヒツジまたはヤギに注射
して、ポリクローナル抗体を製造する。エピトープ特異的抗体もまた、免疫原と
して合成ペプチド（８−１５アミノ酸）を使用することにより製造できる。これ
らは当業者に公知の慣用的な技術である。

【００２９】 Ｂ．臨床サンプル中のＣＲＤ−ＢＰの検出 我々は、ＣＲＤ−ＢＰが癌胎児性タンパク質であり得ると仮定した。この仮定
は、ＣＲＤ−ＢＰは、胎児ラット組織では発現されるが、正常な成体ラット組織
では発現されないという我々の知見に基づく。それはまた、新生物の組織培養細
胞系にも発現される。

【００３０】 我々は、ＣＲＤ−ＢＰは正常な成体組織よりも腫瘍組織に有意により豊富であ
ることを例で下記に示す。それ故、我々は、生検標本におけるＣＲＤ−ＢＰの存
在は、標本が腫瘍細胞を含むことを示すとみている。我々は、ＣＲＤ−ＢＰの存
在は新形成の指標であり、予後および診断指標であるとみている。

【００３１】 多くの可能性あるＣＲＤ−ＢＰ検出スキームが存在する。最善のスキームは、
以下の変数に依存する：腫瘍組織に発現されるＣＲＤ−ＢＰの量、ＣＲＤ−ＢＰ
に対する抗体の特異性および結合力、および抗体のＣＲＤ−ＢＰ以外の他のタン
パク質との交差反応性の程度。下記は、いくつかの可能性ある検出スキームの概
要である。

【００３２】 おそらく、抗体がＣＲＤ−ＢＰに特異的であることを確約することが最善であ
ろう。我々は、ＣＲＤ−ＢＰペプチドに対する抗体の製造により、またはウエス
タンブロット時にＣＲＤ−ＢＰのみと反応し、どんな他の細胞性タンパク質と反
応しないモノクローナル抗体の使用によりそうすることができる。

【００３３】 １．タンパク質抽出物を使用したＣＲＤ−ＢＰの検出：生検組織をホモジナイズ し、粗タンパク質抽出物を調製する（提示） ａ．抗原または抗体を固体支持体に結合させる例示的検出スキーム ｉ．２抗体サンドイッチアッセイ：１つのＣＲＤ−ＢＰエピトープを認識するモ
ノクローナル抗体を、マイクロタイターウェルなどの固体支持体に結合させる。
サンドイッチアッセイは、各抗体がＣＲＤ−ＢＰの異なるエピトープに対するも
のである限り、２つのポリクローナル抗体を用いて実施される。組織の抽出物を
加え、抽出物中のＣＲＤ−ＢＰを抗体に結合させる。その後、異なるＣＲＤ−Ｂ
Ｐエピトープを認識する第二のモノクローナルを加える。第二抗体は、^１２５Ｉ
または^３Ｈで標識できる。その後、結合した標識抗体の量により、第一抗体に付
着したＣＲＤ−ＢＰの量の測定ができる。

【００３４】 別法として、標識第二抗体を定量化に使用できる。この第二抗体を、セイヨウ
ワサビペルオキシダーゼなどの酵素またはビオチンなどのプローブで標識できる
。その後、結合した第二抗体の量が、標準的なアッセイにより検出され、それに
より組織抽出物中のＣＲＤ−ＢＰ量の測定ができる。

【００３５】 ｉｉ．抗原競合アッセイ：抗ＣＲＤ−ＢＰ抗体をマイクロタイターウェルなどの
固体支持体に結合させる。その後、組織抽出物を、精製し放射標識されたＣＲＤ
−ＢＰと混合する。組織が十分なＣＲＤ−ＢＰを含む場合、このＣＲＤ−ＢＰは
限定されている抗体への結合について標識ＣＲＤ−ＢＰと競合する。従って、抽
出物中のＣＲＤ−ＢＰの量は、マイクロタイターウェルに結合した標識ＣＲＤ−
ＢＰの量に反比例する。我々はヒトＣＲＤ−ＢＰコーディング領域の核酸配列を
知っている。それ故、我々は、細菌、酵母または昆虫細胞を使用して、高度に精
製された放射標識ＣＲＤ−ＢＰを調製できる。

【００３６】 プロキプカプ（Ｐｒｏｋｉｐｃａｋ）ら（参考文献３１）は、１つのＣＲＤ−
ＢＰ精製法を開示する。我々はまた、添加したエピトープを活用するより容易な
精製スキームを想定する。細菌、酵母、またはバキュロウイルス感染細胞中で非
修飾ＣＲＤ−ＢＰを製造する代わりに、我々は、「エピトープ標識」ＣＲＤ−Ｂ
Ｐを生成するＣＲＤ−ＢＰ相補的ＤＮＡを設計する分子技術を使用できる。我々
は細胞中で標識ＣＲＤ−ＢＰを発現でき、その後、標識を活用して全ての他の細
胞タンパク質からＣＲＤ−ＢＰを分離する単一のアフィニティー段階でＣＲＤ−
ＢＰを精製できる。

【００３７】 ｉｉｉ．抗体捕獲アッセイ：組織抽出物をマイクロタイターウェルに結合させる
。抗体を加え、結合した抗体の量を決定する。抗体は標識しても標識しなくても
よい。標識しない場合、結合した量は、上記したように、抗−抗体抗体を使用し
、それらをペルオキシダーゼまたはビオチン標識により検出して間接的に決定す
る。

【００３８】 ｂ．免疫ブロット（ウエスタンブロット）によるＣＲＤ−ＢＰの例示的検出 組織抽出物を、変性ゲル中で電気泳動し、タンパク質をニトロセルロースまた
はＰＶＤＦ膜に写す。その後、膜を抗ＣＲＤ−ＢＰ抗体でプローブし、結合した
抗体の量を、標識抗−抗体抗体を使用して、任意の様々な検出技術により決定す
る。ウエスタンブロットの欠点は、抽出タンパク質または抗体を固体支持体に結
合させるアッセイよりもより時間がかかることである。利点は、特異的な相互作
用がより容易に識別され、人為的結果が排除されることである。ウエスタンブロ
ットにおけるＣＲＤ−ＢＰの存在は、ゲルの〜６８キロダルトン領域のバンドに
より示される。

【００３９】 我々は、アッセイは、計深棒または比色定量アッセイを使用できる程まで単純
化され得るとみている。

【００４０】 ２．免疫組織化学による細胞中のＣＲＤ−ＢＰの検出 典型的な方法において、生検組織を薄切片に切断し、固定し、その後、標準的
な免疫組織化学技術を使用して分析した。検出系は、組織中のＣＲＤ−ＢＰ量に
依存する。この技術は組織抽出物を使用した技術よりも時間がかかるが、免疫組
織化学は稀な異常細胞を同定できる。例えば、生検標本は、主に正常細胞をほん
の少しのパッチの新生物細胞と共に含み得る。新生物細胞がＣＲＤ−ＢＰを発現
する場合、それらは、ＣＲＤ−ＢＰ特異的抗体を使用して免疫組織化学により可
視化され得る。

【００４１】 ３．インサイツハイブリダイゼーションによる細胞中のＣＲＤ−ＢＰの検出 典型的な方法において、生検組織を薄切片に切断し、固定し、その後、ＣＲＤ
−ＢＰ ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いる標準的なインサイツハイブリダイ
ゼーション技術を使用して分析した。免疫組織化学の場合と同様に、インサイツ
ハイブリダイゼーション技術の利点は、大多数の正常細胞の真ん中で稀な癌性細
胞を検出できることである。

【００４２】 Ｃ．患者の血清におけるＣＲＤ−ＢＰまたはＣＲＤ−ＢＰ抗体の検出 ＣＲＤ−ＢＰは細胞質タンパク質である。それ故、それはほとんどの条件下で
免疫細胞に曝露されない。しかし、それがヒト腫瘍細胞で過剰発現される場合、
およびこれらの細胞が溶解を受けるか、または何らかの理由でタンパク質が細胞
から漏出する場合、ＣＲＤ−ＢＰ自体が患者の血清で検出され得て、および／ま
たはＣＲＤ−ＢＰに対する抗体が腫瘍を有する患者に生じ得る。少量の患者血清
中におけるＣＲＤ−ＢＰまたは該抗体の検出により、よって、癌の迅速かつ簡便
なスクリーンが提供される。前章はＣＲＤ−ＢＰ検出法の概要を述べた。抗ＣＲ
Ｄ−ＢＰ抗体を検出する戦略は、生検成分由来の抽出物中のＣＲＤ−ＢＰ自体を
検出する技術と類似した技術を活用し得る。多くの抗体検出法がある。患者血清
中の抗ＣＲＤ−ＢＰ抗体の検出に適切な技術のいくつかを下記に要約する。

【００４３】 ｉ．２抗体サンドイッチアッセイ ＣＲＤ−ＢＰ自体は、標準的な技術を使用して、細菌、酵母または昆虫細胞中
で製造される。その後、この組換えＣＲＤ−ＢＰを、マイクロタイターウェルな
どの固体支持体に結合させる。患者の血清を加え、血清中の抗ＣＲＤ−ＢＰ抗体
をＣＲＤ−ＢＰに結合させる。その後、プレートを十分に洗浄し、第二抗ヒト血
清を加える。第二抗体は１２５Ｉまたは３Ｈでまたは蛍光標識で標識できる。そ
の後、結合した標識抗体の量により、プレート上の組換えＣＲＤ−ＢＰに付着し
た抗ＣＲＤ−ＢＰ抗体の量の測定ができる。別法として、標識した第二抗体を定
量化に使用できる。この第二抗体は、セイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵
素、またはビオチンなどのプローブで標識できる。結合した第二抗体の量は、そ
の後、標準的なアッセイにより検出され、これにより、患者の血清中の抗ＣＲＤ
−ＢＰ抗体の量の測定ができる。

【００４４】 ｉｉ．抗原捕獲アッセイ 患者由来の血清を、マイクロタイターウェルなどの固体支持体に付着させる。
その後、放射標識組換えＣＲＤ−ＢＰを加える。非結合ＣＲＤ−ＢＰをプレート
から洗浄して除去し、結合した抗原の量を測定する。放射標識ＣＲＤ−ＢＰは、
インビボで、細菌または酵母中、３５Ｓを使用して標識できるか、またはインビ
トロで放射ヨウ素化できる。

【００４５】 Ｄ．癌細胞からＣＲＤ−ＢＰを排除することによる癌の処置 本発明の基本的な考えは、主に、ＣＲＤ−ＢＰは細胞のｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡ
を安定化させる、およびＣＲＤ−ＢＰは出生後に腫瘍細胞で発現されるが、正常
細胞では発現されないという、２つの概念に基づく。結果として、ｃ−ｍｙｃ
ｍＲＮＡは、腫瘍細胞で過剰発現されるかまたは不適切に発現される。ＣＲＤ−
ＢＰが排除できれば、その後ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡは不安定化される。ｃ−ｍｙ ｃ ｍＲＮＡが腫瘍細胞の成長または生存に必須である場合、腫瘍細胞は成長を
停止するかまたは死滅する。ＣＲＤ−ＢＰが腫瘍細胞でより豊富に発現される場
合に選択性が確約される。

【００４６】 ２つのアプローチが、ＣＲＤ−ＢＰのｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡとの相互作用を妨
げるのに好ましい。

【００４７】 １．ジェネティック・エンジニアリング 我々がｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡを我々の無細胞ｍＲＮＡ崩壊系で不安定化させた
方法は、過剰の競合体ＲＮＡを反応物に加えることであった。ＲＮＡはｃ−ｍｙ ｃ ｍＲＮＡコーディング領域決定基（ＣＲＤ）の１８０ヌクレオチドを含む。
競合体ＲＮＡは、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡからＣＲＤ−ＢＰを滴定すると考えられ
ている。結果として、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡのＣＲＤは、ＣＲＤ−ＢＰにより遮
蔽されず、ｍＲＮＡはリボヌクレアーゼにより迅速に分解される。

【００４８】 無傷細胞で類似の戦略を活用するために、患部組織または器官でｃ−ｍｙｃ
ｍＲＮＡ ＣＲＤ ＲＮＡを過剰発現させるジェネティック・エンジニアリング
技術を適用することが必要であろう。組織または器官でＣＲＤ競合体ＲＮＡを発
現できるＤＮＡを導入してもよい。別法として、リボヌクレアーゼ耐性で、長時
間持続形のＣＲＤ ＲＮＡ自体を導入することが可能であり得る。標的癌細胞は
ＣＲＤ−ＢＰを発現するが、非癌細胞はそれを発現しない場合に、特異性が達成
されることを注記することは重要である。これらの条件下で、競合体ＣＲＤ Ｒ
ＮＡは、癌細胞のみに有害な効果を及ぼす。

【００４９】 ２．ＣＲＤ−ＢＰの、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡ ＣＲＤへの結合を遮断する阻害剤 の使用 我々は、ＣＲＤ−ＢＰは、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの特定の区域、すなわち、Ｃ
ＲＤ ＲＮＡ区域を認識できるように折り畳むと推定する。細胞のｃ−ｍｙｃ
ｍＲＮＡとの相互作用能を阻害するために、ＣＲＤ−ＢＰに結合するペプチドま
たは核酸類似体または他の化合物を設計できる。これは、細胞に侵入でき、ウイ
ルス由来タンパク質および核酸と相互作用できる抗ウイルス化合物を設計するこ
とを願う製薬会社により考えられている戦略に類似している。ＨＩＶ感染患者に
使用されるプロテアーゼ阻害剤は、特異的なウイルスがコード化する産物に指向
した医薬の例である。

【００５０】 （例） Ａ．実験方法 細胞系および細胞成分分画の調製 全細胞系は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル、メリー
ランド）から得た。Ｍ５６２ヒト赤白血病細胞を、１０％仔ウシ血清とペニシリ
ン／ストレプトマイシン混合物を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。ＮＩ
Ｈ／３Ｔ３細胞を、１０％仔ウシ血清および抗生物質を含むＤＭＥＭ（４．５ｇ
／Ｌ グルコース）中で成長させた。全抗生物質および血清は、ギブコ／ＢＲＬ
ライフテクノロジー（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ）から得た。

【００５１】 細胞成分分画は、以下のように調製した。細胞収集後の全段階は４℃で行った
。細胞を、１リットルスピナフラスコ中で、３−５×１０^５細胞／ｍｌの密度ま
で成長させた。それらを収集し、低速遠心分離により集め、血清非含有の冷Ｆ１
２培地で３回洗浄した。細胞ペレットを、１００ｍＭ ＥＧＴＡ、１００ｍｇ／
ｍｌ ＰＭＳＦ、およびアプロチニン、ロイペプチン、およびペプスタチンＡの
それぞれ２ｍｇ／ｍｌ（全てシグマ（Ｓｉｇｍａ）から）を含む、緩衝液Ａ（１
ｍＭ酢酸カリウム、１．５ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭト
リス−Ｃｌ、ｐＨ７．４）中、１．５×１０^７細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。
細胞を、３０−４０ストロークのダウンスホモジナイザーで溶解し、溶解物を１
０分間、２０，０００×ｇで遠心分離して、核および他の細胞小器官をペレット
化した。上清（Ｓ２０）を、緩衝液Ａに溶かした３０％（ｗ／ｖ）スクロースの
クッション上に重層し、２．５時間、１３０，０００×ｇで遠心分離してポリソ
ームをペレット化した。スクロースクッション上の上清（Ｓ１３０）を収集し、
ポリソームペレットを、ＰＭＳＦ、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、およびアプ
ロチニンを含む緩衝液Ａ中に再懸濁した。Ｓ２０ペレット（粗核）を緩衝液Ａ中
で１回洗浄し、遠心分離し、上清中の核洗浄成分を収集し、保存した。その後、
ペレット化し洗浄した核を、３００μｌの緩衝液Ｂ（１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、
１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．
０）に再懸濁し、２．７ｍｌの緩衝液Ｃ（５．０％ＳＤＳ、１０％グリセロール
、５％β−メルカプトエタノール、６２．５ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ６．８）を
加えることにより溶解した。その後、抽出物を１０回、１８ゲージ針に通過させ
、１５分間煮沸した。組織培養細胞または網状赤血球翻訳反応物のいずれかから
リボソーム塩洗浄物（ＲＳＷ）を単離するために、ポリソームのアリコートを、
２０分間４℃で、緩衝液Ａ中１Ｍ ＮａＣｌと共にインキュベートし、次いで、
２．５時間、１３０，０００×ｇで遠心分離して、塩で洗浄されたポリソームを
再度ペレット化した（２６）。グリセロールを、スクロースクッション上の上清
（ＲＳＷ）に対して１０％まで加え、塩で洗浄したポリソームを、プロテアーゼ
阻害剤を含む緩衝液Ａ中に再懸濁した。全画分を−７０℃で貯蔵した。

【００５２】 タンパク質精製および小配列決定。ヒトｃ−ｍｙｃ ＣＲＤ−ＢＰを、記載し
た通り、Ｋ５６２細胞ＲＳＷから精製した（３１）。異なるＲＳＷ単離物からの
ＣＲＤ−ＢＰの２つの独立した調製物を、この研究のために小配列決定した。第
一の配列は、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンターのタンパク質配列
およびペプチド合成施設で決定した（マデイソン、ウィスコンシン）。第二配列
は、第一配列とは異なり、重複せず、エール大学のケック（Ｋｅｃｋ）研究室で
決定された（ニューヘーブン、コネチカット（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ））。
第二配列は、ＰＣＲプライマー調製のために使用した。

【００５３】マウスＣＲＤ−ＢＰ ｃＤＮＡのクローニング １．ＣＲＤ−ＢＰ ｃＤＮＡのクローニング。我々は、初めに、ヒトＣＲＤ−
ＢＰ ｃＤＮＡを調製し、その配列を使用してマウスＣＲＤ−ＢＰ ｃＤＮＡを
同定した。ＤＮＡオリゴマーを、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンタ
ーの核酸配列およびオリゴマー合成施設（マデイソン、ウィスコンシン）により
、またはギブコ−ＢＲＬライフテクノロジーズ（グランドアイランド、ニューヨ
ーク（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））により合成した。Ｋ５６２（ヒト）
細胞ｃＤＮＡλライブラリー（クロンテック、パロアルト、カリフォルニア（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））を、初めに、第二ＣＲＤ−ＢＰ
ペプチド配列の１５アミノ酸に基づく４５ｂｐのＤＮＡ配列を増幅するために、
変性ＰＣＲによりスクリーニングした。以下のプライマーを使用した：

【００５４】

【化１】

【００５５】 および

【００５６】

【化２】

【００５７】 。条件は、３０サイクル、９４℃で３０秒間、４５℃で３０秒間、７２℃で１分
間、ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））であった。この反応および続く反応からのＰＣＲ産物を、配列
決定のために、直接、ｐＴ７−Ｂｌｕｅ（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、マデイ
ソン、ウィスコンシン）にサブクローニングし、これは、製造業者の推奨に従っ
て、ＡＢＩ プリズム アンプリタック ＦＳ ダイ ターミネーター リアク
ション キット（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＦＳ Ｄｙｅ Ｔｅ
ｒｍｉｎａｔｏｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（アプライドバイオシステムズ
社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））を使用してＰＣＲに
より実施した。予期される１５アミノ酸配列をコード化する４５ｂｐ産物をこの
ように単離した。その後、同ｃＤＮＡライブラリーを、４５ｂｐ配列の中間部由
来のＣＲＤ−ＢＰ特異的コーディングプライマー

【００５８】

【化３】

【００５９】 とλ特異的プライマー

【００６０】

【化４】

【００６１】 と共に非変性ＰＣＲに、以下の条件下で使用した：３０サイクル、９４℃で３０
秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で３分間、ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＤＮＡポリメラ
ーゼ。この段階により２２７ｂｐのｃＤＮＡが製造された。その後、同ライブラ
リーをプレーティングし、二重にニトロセルロースフィルターに写し、プローブ
として２２７ｂｐの^３２Ｐ−ＤＮＡを用いたハイブリダイゼーションによりスク
リーニングした。この段階により、精製ＣＲＤ−ＢＰの配列決定により得られた
ペプチドの両方をコード化するオープンリーディングフレームをもつ１０６９ｂ
ｐの部分ヒトＣＲＤ−ＢＰ ｃＤＮＡが製造された。このｃＤＮＡは、コーディ
ング領域の５’部分、５’−ＵＴＲ、またはほとんどの３’−ＵＴＲを含まなか
った。

【００６２】 ３’末端領域のクローニングを完了させるために、ｃＤＮＡ末端の３’の迅速
な増幅（３’−ＲＡＣＥ）を実施した。オリゴマーＮｏｔ（ｄＴ）

【００６３】

【化５】

【００６４】 およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（ギブコ−ＢＲＬ）を、製造業者の推奨に
従って使用して、０．５μｇのＫ５６２細胞ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを逆転写した
。その後、ｃＤＮＡ鋳型を、５’および３’プライマーとして、それぞれ、オリ
ゴマーＣＲＤ−ＢＰ１

【００６５】

【化６】

【００６６】 およびＮｏｔアダプトマー

【００６７】

【化７】

【００６８】 と共にベント（ＶＥＮＴ） ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラ
ブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））を使用して増幅した。条件
は、９４℃で１分間の１サイクル、次いで、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒
間、７２度で１．５分間の３５サイクルであった。

【００６９】 ２．マウスＣＲＤ−ＢＰ ｃＤＮＡのクローニング。上記のように製造した部分
ヒトＣＲＤ−ＢＰ ｃＤＮＡを使用して、ＮＣＢＩ ブラスト（Ｂｌａｓｔ）プ
ログラムを使用するＥＳＴデータベースでマウスＣＲＤ−ＢＰ ｃＤＮＡを同定
した。２つのＥＳＴの大きい方、すなわちＡＡ０７３５１４が、ゲノムシステム
ズ社（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）（セントルイス、ミズーリ）
から得られ、配列決定した。それがコード化するアミノ酸配列は、我々のヒトＣ
ＲＤ−ＢＰの配列と９９％同一であり、これは、それがマウスＣＲＤ−ＢＰに対
応することを示す。それは、全３’−ＵＴＲおよびほとんどのコーディング領域
を含んだ。５’配列を伸長するために、５’−ＲＡＣＥを、製造業者の指示に従
って、アドヴァンテージ クレンタック ＤＮＡ ポリメラーゼ（ＡＤＶＡＮＴ
ＡＧＥ ＫｌｅｎＴａｇ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（クロンテック（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ））を使用して１７日目のマウス胚マラトン−レディ ｃＤＮＡ ライブラリー（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ）
（クロンテック）で実施した。一次反応において、「タッチダウンＰＣＲ」を、
５’および３’プライマーとして、それぞれ、オリゴマーＡＰ１（クロンテック
）およびＣＲＤ−ＢＰ２

【００７０】

【化８】

【００７１】 を用いて実施した。条件は、９４℃で１分間の１サイクル、９４℃で１０秒間、
７２℃で７．５分間の５サイクル、９４℃で１０秒間、７０℃で７．５分間の５
サイクル、９４℃で１０秒間、６８℃で７．５分間の２０サイクル、９４℃で１
０秒間、６０℃で２０秒間、６８℃で７．５分間の１０サイクルであった。ＤＮ
Ａバンドを、１％アガロースゲルから切出し、第二ＰＣＲを、それらと共に、入
れ子状態の５’および３’プライマーを使用して実施した［それぞれ、オリゴマ
ーＡＰ２（クロンテック）およびＣＲＤ−ＢＰ３

【００７２】

【化９】

【００７３】 ］。条件は、９４℃で１分間の１サイクル、次いで、９４℃で１５秒間、６０℃
で３０秒間、６８℃で５分間の２５サイクルであった。得られたクローンは翻訳
開始部位または任意の５’−ＵＴＲを含まなかったので、マウスＢＡＣライブラ
リーは、プライマーＣＲＤ−ＢＰ４

【００７４】

【化１０】

【００７５】 およびＣＲＤ−ＢＰ５

【００７６】

【化１１】

【００７７】 を用いてＰＣＲによりＣＲＤ ＢＰ遺伝子についてスクリーニングした。マウス
ＣＲＤ−ＢＰ遺伝子を含むＢＡＣクローンは、ゲノムシステムズ社から得た。残
りのコーディング領域および５’ＵＴＲの少なくとも一部は、プライマーとして
オリゴマーＣＲＤ ＢＰ６

【００７８】

【化１２】

【００７９】 を使用して、このＢＡＣクローンから配列決定した。配列比較は、ジェネティク
スコンピューターグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ
）（ＧＣＧ）ベストフィットおよびＧａｐアルゴリズムを使用して作成した。理
論的翻訳は、ＧＣＧ翻訳プログラムを用いて行った。

【００８０】マウスＣＲＤ−ＢＰのインビトロ翻訳 。マウスＣＲＤ−ＢＰ ｃＤＮＡの一部を
、ｐＳＰＵＴＫ（ストラタジーン、ラ・ホーヤ、カリフォルニア（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））にサブクローニングし、以下のように翻
訳クローンｐＳＰＵＴＫ−ＣＲＤ−ＢＰを創製した：１塩基変異（下線）を、５
’プライマー

【００８１】

【化１３】

【００８２】 に作成し、サブクローニングのためにＮｃｏＩ部位を製造した。変異により、ア
スパラギンからアスパラギン酸に変化する。３’プライマー

【００８３】

【化１４】

【００８４】 は、ＣＲＤ−ＢＰ ３’−ＵＴＲ由来であった。条件は、９４℃で１分間の１サ
イクル、次いで、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で３分間の２５
サイクルであった。ｐＳＰＵＴＫ−ＣＲＤ−ＢＰ、ｐＳＰＵＴＫ−ルシフェラー
ゼ、またはｐＳＰＵＴＫベクター鋳型を転写し、製造業者の指示に従って、Ｔｎ
Ｔ（登録商標）結合網状赤血球ライセートシステム（ＴｎＴ（登録商標） Ｃｏ
ｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ）（プロ
メガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用して翻訳した。

【００８５】 免疫沈降、免疫ブロット、およびゲル遅延アッセイ。６０Ｓリボソームサブユ
ニットの免疫沈降（ＩＰ）を、本質的に前記した通りに実施した（３３）。簡潔
には、ヒト抗Ｐタンパク質血清（イミュノビジョン（Ｉｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎ
））または正常なヒト血清を、タンパク質Ｇ−プラスセファロースビーズ（Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｇ−Ｐｌｕｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ）（オンコジーン
サイエンス（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ））にコンジュゲート（複合体
化）させた。抗Ｐタンパク質血清は、３つの大リボソームサブユニットタンパク
質（Ｐ_０−３８ｋＤａ、Ｐ_１−１９ｋＤａ、Ｐ_２−１７ｋＤａ；参考文献３４）
を認識する。Ｋ５６２ポリソームは、２０ｍＭ ＥＤＴＡと共に４℃で２０分間
インキュベートすることにより、ｍＲＮＰおよびリボソームサブユニットに解離
した。その後、タンパク質Ｇ−プラスセファロース複合抗体を、穏やかに混合し
ながら、４℃で１６時間、ＩＰ緩衝液（１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ
、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５％トリトンＸ−１００、１００μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ
、０．５％アプロチニン、および２μｇ／ｍｌの各ロイペプチンおよびペプスタ
チンＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）中で１０μｌの解離したポリソー
ムと共にインキュベートした。ビーズを３回２０分間、各４℃で、ＩＰ緩衝液中
で洗浄した。結合したタンパク質は、緩衝液Ｄ（２．３％ＳＤＳ、１０％グリセ
ロール、６２．５ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ６．８）中にビーズを再懸濁し、ビー
ズを９５℃で５分間インキュベートすることにより溶出した。

【００８６】 免疫ブロットは、前記した通りに実施した（３２）。ＣＲＤ−ＢＰ用には、一
次抗体は、精製ヒトタンパク質に対して生じたトリ抗ＣＲＤ−ＢＰ ＩｇＹであ
り（３１、３２）、第二検出抗体は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ
）複合ウサギ抗トリＩｇＹ（プロメガ）であった。リボソームＰタンパク質用に
は、ヒト抗Ｐタンパク質血清（上記参照）は一次抗体であり、第二検出抗体は、
ＨＲＰ複合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（プロメガ）であった。熱ショックタンパク質−９
０（ＨＳＰ９０）用には、一次抗体は、ウサギ抗マウスＨＳＰ−９０ポリクロー
ナルＩｇＧ（アラン・ポーランド（Ａｌａｎ Ｐｏｌａｎｄ）博士からの親切な
贈り物）であり、第二検出抗体はＨＲＰ複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（シグマ）であ
った。ブロットは、標準（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））またはスーパー
シグナルＵＬＴＲＡ（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））試薬のいずれかを使用して、増
強された化学発光（ＥＣＬ）により展開した。異なるバンドが、免疫前の抗体、
正常なヒト血清、または二次抗体のみを用いて検出されなかった（データは示し
ていない）。注記する場合、ブロットは、２％ＳＤＳ、１００ｍＭβ−メルカプ
トエタノール、５０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ６．８中、５０℃で３０分間で剥
がし、その後、５％乾燥脱脂乳を含む緩衝液中で十分に洗浄して、ＳＤＳおよび
β−メルカプトエタノールを除去した。ゲル遅延アッセイは、前記した通りに実
施した（３１、３２）。

【００８７】 スクロース勾配遠心分離およびリボソームＲＮＡ分析。全方法を４℃で実施し
た。ＣＲＤ−ＢＰのリボソームサブユニットとの会合を分析するために、Ｋ５６
２細胞ポリソーム（５０μｌ）または細胞質溶解物（Ｓ２０；１５０μｌ）のア
リコートを、２０ｍＭ ＥＤＴＡの最終濃度にした。成分を穏やかに混合し、氷
上に２０分間置き、緩衝液Ｅ（１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ酢酸カリウム、５
ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）中線形５
−３０％スクロース勾配１０ｍｌ上に重層し（３３）、ベックマンＳＷ４１．１
ローター中で４時間４℃で３８，０００ｒｐｍ（１７８，０００×ｇ）で遠心分
離した。遠心分離後、５００μｌの画分を、勾配の上部から連続的にピペッティ
ングした。チューブの底のペレットを、５％スクロースを含む緩衝液Ｅ５００μ
ｌに再懸濁した。タンパク質を、免疫ブロットの前にメタノールおよびクロロホ
ルムで沈降させた。各画分由来のＲＮＡを、製造業者の指示に従って、トリゾー
ル（ＴＲＩｚｏｌ）試薬（ギブコ／ＢＲＬ）を使用して単離し、１０ｍＭ酢酸ナ
トリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０を含む１％アガ
ロースゲル中で電気泳動した。リボソームＲＮＡバンドは、臭化エチジウム（０
．０５μｇ／ｍｌ）での染色により可視化した。

【００８８】 組換え３５Ｓ標識ＣＲＤ−ＢＰまたはルシフェラーゼは、網状赤血球抽出物中
で合成され、僅かな修飾を加えて本質的には前記した通りに（３５）、スクロー
ス勾配遠心分離により分析した。反応物（１００μｌ）を氷上で冷やし、２５ｍ
Ｍ酢酸カリウム、１．５ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、２０ｍＭトリ
ス−Ｃｌ、ｐＨ７．２を含む２０−４０％線形スクロース勾配４ｍｌ上に重層し
、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＳＷ６０ローター中で５時間、４℃で、１３３
，０００×ｇで遠心分離した。画分を勾配の上端から連続的にピペッティングし
、各５μｌを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧ中で電気泳動した。全長ＣＲＤ−ＢＰおよび
ルシフェラーゼタンパク質を、イメージクアントプログラム（ＩｍａｇｅＱｕａ
ｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）（モレキュラーダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄ
ｙｎａｍｉｃｓ））を使用してリンイメージャー分析（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａ
ｇｅｒａｎａｌｙｓｉｓ）により定量化した。各画分由来のリボソームＲＮＡを
抽出し、１％アガロースゲル中で電気泳動し、臭化エチジウムで染色して可視化
した。

【００８９】 Ｂ．結果 新規なＫＨ−ドメインＲＮＡ結合タンパク質である、ＣＲＤ−ＢＰをコード化 するｃＤＮＡのクローニング 。２つの高度に精製したＣＲＤ−ＢＰの調製物を、
別々の実験で、ヒトＫ５６２細胞のポリソームから単離した。各調製物の小配列
を決定すると、各々から、異なった重複していない配列が得られ、第一のものか
らは

【００９０】

【化１５】

【００９１】 で、第二のものからは

【００９２】

【化１６】

【００９３】 であった。小文字は、大文字よりも確信性の低い残基を示す。その後、Ｋ５６２ ｃＤＮＡライブラリーを、第二ペプチドのアミノおよびカルボキシ末端に基づ
く変性プライマーを使用してＰＣＲによりスクリーニングした（実験方法）。４
５ｂｐ産物が製造され、サブクローニングし、配列決定すると、第二アミノ酸配
列をコード化することが判明した。続くＰＣＲ増幅およびライブラリースクリー
ニングにより、小配列決定により得られた両方のペプチド配列を含むオープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む１０６９ｂｐの部分ヒトｃＤＮＡが同定さ
れた。

【００９４】 我々のマウスＣＲＤ−ＢＰの特性および発達調節の分析を続けるために、その
後、我々は、ヒトｃＤＮＡ配列を活用して、推定マウスＣＲＤ−ＢＰ ｃＤＮＡ
を単離した（実験方法）。少なくとも一部の５’−ＵＴＲ、完全なコーディング
領域、および完全な３’−ＵＴＲを含むクローンを得て、配列決定した（図１）
。２つのインフレームＡＵＧ開始コドンが、ｃＤＮＡの５’末端付近に存在する
。我々は、下流ＡＵＧを翻訳開始部位として試験的に示した。なぜなら、それは
翻訳開始シグナルとして好ましい配列内に包埋されているからである（３６）。
これに対し、上流ＡＵＧは、好ましい翻訳開始モチーフ内にはない。

【００９５】 ネズミｃＤＮＡの予測配列は、数個のＫＨドメインおよび１つのＲＧＧボック
スを含み、これらはいくつかのＲＮＡ結合タンパク質に見られる特徴的なモチー
フである。２対の反復として並べられた４つのＫＨドメインがある（図１、二重
下線）。各反復対は、約３０残基離れており、２対の反復は７８残基離れている
。予測ＲＧＧボックス（囲まれている）はＫＨドメインの上流に位置する。２つ
の予測核外移行シグナル（オーバーライン）がある。一方は、家族性精神遅滞に
関連している、ＦＭＲ ＲＮＡ結合タンパク質（ＦＭＲＰ）に見られるものと類
似している（３７−３９）。他方は、ＨＩＶ Ｒｅｖタンパク質のものと類似し
ている。予測核局在化シグナル（下線）もある。

【００９６】 ＣＲＤ−ＢＰのＲＧＧ、核外移行、およびＫＨドメイン領域は、数個の他のＲ
ＮＡ結合タンパク質に見られるものと類似している（図２）。さらに、ヒトおよ
びネズミＣＲＤ−ＢＰ配列は、ヒト癌に過剰発現されるヒトＫＨドメインタンパ
ク質の頭字語である、ｈＫＯＣと呼ばれるヒトｃＤＮＡに類似している（図２）
。ｈＫＯＣオープンリーディングフレームは、ヒト膵臓癌組織における過剰発現
に基づきクローン化された未知の機能のタンパク質をコード化する（４０）。マ
ウスＣＲＤ−ＢＰコーディング領域は、核酸およびタンパク質配列レベルで、そ
れぞれ、ヒトＣＲＤ−ＢＰのコーディング領域に８８．８％および９９．１％同
一である。比較するために、マウスＣＲＤ−ＢＰは、核酸およびタンパク質レベ
ルで、それぞれ、ｈＫＯＣコーディング領域に６６．６％および７４．０％同一
である。これらの比較および下記に提示したデータに基づき、我々は、我々のｃ
ＤＮＡは、ＣＲＤ−ＢＰをコード化し、ヒトＫＯＣのマウス相同体ではないと結
論づける。追加の証拠（下記に提示）により、ＣＲＤ−ＢＰおよびｈＫＯＣは、
ＲＮＡ結合タンパク質を含むＫＨドメインの新規なサブファミリーの一員である
ことが示唆される。

【００９７】インビトロで合成したＣＲＤ−ＢＰと細胞由来ＣＲＤ ＢＰとの比較 。我々のネ
ズミｃＤＮＡクローンが、期待する特性のｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡ結合タンパク質
をもつ全長ＣＲＤ−ＢＰをコード化するかを決定するために、我々は、タンパク
質をインビトロで合成し、免疫ブロットおよびゲル遅延アッセイにより分析した
。網状赤血球転写／翻訳反応は、ｐＳＰＵＴＫベクターにサブクローニングした
ＣＲＤ−ＢＰ ｃＤＮＡを用いプログラムされた。サブクローン中のＣＲＤ−Ｂ
Ｐ配列は、図１で翻訳開始部位として示したＡＵＧで始まった。このサブクロー
ンは、上流インフレームＡＵＧを含まなかった。翻訳抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより分画し、抗ＣＲＤ−ＢＰ抗体を用いて免疫ブロットすることにより分析
した。ｃＤＮＡ翻訳からの〜６８ｋＤａのタンパク質が、抗ＣＲＤ−ＢＰ抗体に
より認識され、ヒト（Ｋ５６２）およびマウス（ＮＩＨ／３Ｔ３）細胞由来の真
正ＣＲＤ−ＢＰの位置の近くまで移動した（図３、レーン１−３）。免疫反応性
バンドが、ｐＳＰＵＴＫベクターを用いて（図３、レーン４）またはルシフェラ
ーゼｃＤＮＡを用いて（データは示していない）プログラムされた抽出物を含む
対照レーンでは観察されず、このことは、抗体は、特異的にＣＲＤ−ＢＰを検出
したが、内因性網状赤血球タンパク質は検出しないことを示す。それ故、我々の
ｃＤＮＡはＣＲＤ−ＢＰをコード化する。Ｋ５６２およびＮＩＨ／３Ｔ３ ＲＳ
Ｗレーンに見られる交差反応性バンド（ｐ８５）は、以前に観察されたタンパク
質である（３２）。その実体および機能は不明である。ｐ８５はｃ−ｍｙｃ Ｃ
ＲＤ ＲＮＡには結合せず（３２）、それはＣＲＤ−ＢＰと比較した場合、異な
る亜細胞画分に局在化する（下記参照）。

【００９８】 ゲル遅延アッセイを実施して、組換えＣＲＤ−ＢＰがｃ−ｍｙｃ ＣＲＤ Ｒ
ＮＡに特異的に結合できるかを決定した。以前の実験で、我々は、ほとんどの組
換えＣＲＤ−ＢＰが、網状赤血球リボソームと共分画することを注記した（下記
参照）。それ故、ゲル遅延アッセイは、細胞由来または網状赤血球翻訳反応物由
来のＲＳＷを使用して実施した。ＲＳＷを、ｃ−ｍｙｃ ＣＲＤ^３２Ｐ−ＲＮＡ
と共にインキュベートし、ＲＮＡ／タンパク質複合体を、非変性ゲル電気泳動に
より遊離^３２Ｐ−ＲＮＡから分離した。ＲＮＡ／タンパク質複合体は、Ｋ５６２
細胞由来およびＣＲＤ−ＢＰ ｃＤＮＡを用いてプログラムされた翻訳抽出物由
来のタンパク質で観察された（図４Ａ、それぞれレーン１および２）。これらの
複合体は、ゲルの類似または同一の位置に移動した。ＲＮＡ／タンパク質複合体
は、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ベクター、またはｍＲＮＡ非含有（なし）対照
反応物由来のタンパク質では観察されなかった（図４Ａ、レーン３−５）。それ
故、インビトロで合成されたＣＲＤ−ＢＰは、その細胞由来対応物と同様、イン
ビトロでｃ−ｍｙｃ ＣＲＤ ＲＮＡと会合する。

【００９９】 以前の研究により、細胞由来ＣＲＤ−ＢＰは、我々が試験した他のＲＮＡには
結合しないことが示され、これは、それがｃ−ｍｙｃ ＣＲＤ ＲＮＡにかなり
の特異性を有することが示唆される（３０、３１）。競合アッセイを実施して、
組換えＣＲＤ−ＢＰが類似の特異性を示すかを決定した。ＲＮＡ−タンパク質結
合反応は、プローブとしてｃ−ｍｙｃ ＣＲＤ ^３２Ｐ−ＲＮＡと、タンパク質
源としてＲＳＷを含んだ。反応物に、競合体ＲＮＡを全く補充しないか、または
２００倍モル過剰の非標識ｃ−ｍｙｃ ＣＲＤ ＲＮＡまたはβ−グロビンＲＮ
Ａを補充した。ＣＲＤ ＢＰ／ＣＲＤ ^３２Ｐ−ＲＮＡ複合体は、過剰の非標識
ＣＲＤ ＲＮＡにより競合されたが、β−グロビンＲＮＡにより競合されなかっ
た（図４Ｂ）。この結果により、さらに、このｃＤＮＡは機能的ｃ−ｍｙｃ Ｃ
ＲＤ−ＢＰをコード化することが確認される。

【０１００】 組換えＣＲＤ−ＢＰと網状赤血球抽出物のリボソームとの共分画。上記したよ
うに、以前の実験により、高い比率の組換えＣＲＤ−ＢＰが、網状赤血球ポリソ
ームと共沈降することが示された。網状赤血球はノザンブロットにより測定した
ところ、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡを全く含まないので、この知見を確認することは
重要であった。それ故、ＣＲＤ−ＢＰは、ＦＭＲＰ（３３）と同様、我々がその
天然ｍＲＮＡリガンドであると信じる物質の非存在下でさえも、リボソームに親
和性を有することが可能であった。３５Ｓ標識ＣＲＤ−ＢＰおよびルシフェラー
ゼを、網状赤血球抽出物中で合成し、各抽出物を、スクロース勾配で沈降させた
。画分を集め、リボソーム含量についてゲル電気泳動により、およびタンパク質
についてゲル電気泳動およびリンイメージャー分析によりアッセイした。全ての
ルシフェラーゼが勾配の上端近くで沈降したが（図５、白丸）、９５％以上のＣ
ＲＤ−ＢＰが、モノソームおよびリボソームサブユニットと共沈降した（黒丸）
。それ故、ＣＲＤ ＢＰは、インビトロで、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの非存在下で
、リボソームおよびリボソームサブユニットに結合できる。

【０１０１】 ＣＲＤ−ＢＰの細胞質への局在化およびリボソームおよびリボソームサブユニ ットとの共分画 。ＣＲＤ−ＢＰは、主に、Ｋ５６２細胞抽出物の細胞質画分に位
置し、その多くはポリソームと会合している（参考文献３１およびデータは示し
ていない）。この観察は、ｍＲＮＡ結合タンパク質としてのその推定上の役割と
一致する。しかし、Ｋ５６２細胞あたりのＣＲＤ−ＢＰの量は、少なくとも１０
００倍はｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの量を超える（３１）。数個の要因が、これらの
細胞における「過剰」のＣＲＤ−ＢＰを説明できる：ｉ）ＣＲＤ−ＢＰは、ｃ− ｍｙｃ 以外の他のｍＲＮＡと会合し得る。ｉｉ）その一部は、ＦＭＲＰのケース
と同様、リボソームおよび／またはリボソームサブユニットと会合し得る（３３
）。ＣＲＤ−ＢＰないし細胞のリボソームとの間の会合は、網状赤血球リボソー
ムと新規に合成されたＣＲＤ−ＢＰとの会合と一致する（図５）。ＣＲＤ−ＢＰ
が細胞のｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡと結合するかを決定するための実験が進行中であ
る。どれぐらいが細胞リボソームおよびリボソームサブユニットと共分画し、お
よび、存在する場合どれぐらいが核と共分画するかを決定するために、対数的に
成長しているＫ５６２細胞を収集し、溶解し、６画分に分割した（実験方法）。
各画分の等しい細胞等価体を、抗ＣＲＤ−ＢＰ抗体を用いた免疫ブロットにより
分析した。全細胞ＣＲＤ−ＢＰの少なくとも９５％が、ポリソーム画分にあり、
このＣＲＤ−ＢＰの９０％以上が、１モル塩洗浄物に溶出された（図６Ａ、ＲＳ
Ｗ）。核または後ポリソーム上清を含む画分にはＣＲＤ−ＢＰはほとんどまたは
全く検出されなかった（図６Ａ、それぞれ核およびＳ１３０）。これらの画分に
おけるＣＲＤ−ＢＰの非存在は、サンプル調製中の識別不可能なタンパク質の加
水分解により説明され得る。なぜならＨＳＰ−９０は全画分で検出されたからで
ある（図６Ｂ）。いくつかのｐ８５が、核およびポリソーム画分の両方に検出さ
れた。この結果は、下記に提示した結果と併せて、ＣＲＤ−ＢＰおよび交差反応
性ｐ８５は、細胞に共局在化せず、機能的に異なるタンパク質であることをさら
に確認する。

【０１０２】 少なくともいくつかのＣＲＤ−ＢＰがリボソームサブユニットと会合している
ことを決定するために、Ｋ５６２細胞ポリソームを、遠心分離により精製し、そ
の後、リボソームサブユニットおよび遊離ｍＲＮＰに、ポリソームを解離する、
２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液中に再懸濁した。その後、ＥＤＴＡで処理した
ポリソームを、スクロース勾配で分画した。各勾配画分とチューブの底のペレッ
ト中の成分を、リボソームＲＮＡ含量についてゲル電気泳動により、およびＣＲ
Ｄ−ＢＰについて免疫ブロットにより分析した。小リボソームサブユニットは、
主に画分６−１１に沈降し、一方、大サブユニットは画分１０−１４にあった（
図７、パネルＡおよびＢ）。ＣＲＤ−ＢＰはサブユニットと共沈降し、また、ペ
レット化成分にも検出され、これは、非解離のポリソームおよびモノソームを含
むと予期される（図７Ｃ）。それ故、ＣＲＤ−ＢＰは、Ｋ５６２細胞のリボソー
ムサブユニットと共分画する。ＣＲＤ−ＢＰ／サブユニット会合の性質は不明で
ある。ＣＲＤ−ＢＰの広い分画範囲の観点から、我々は、次から次へと画分の相
対ＣＲＤ−ＢＰレベルを定量することを試みなかった。

【０１０３】 ゲル遅延およびＲＮＡ−タンパク質結合実験からのデータにより、ｐ８５は、
ｃ−ｍｙｃ ＣＲＤ ＲＮＡには結合しないことが示される（３１、３２）。図
７Ｃはまた、ポリソームと共ペレット化するｐ８５の小部分は、解離したリボソ
ームサブユニットには結合しないことを示す。むしろ、それは勾配の上端で沈降
する（図７Ｃ）。類似の結果が、ＥＤＴＡで処理した粗細胞質溶解物（Ｓ２０）
を使用して得られた（データは示していない）。要約すると、ｐ８５は、ポリク
ローナル抗ＣＲＤ−ＢＰ抗体とは反応するが、ｃ−ｍｙｃ ＣＲＤ ＲＮＡとは
結合せず（３０、３１）、細胞溶解物のＣＲＤ−ＢＰとは共分画しない。

【０１０４】 独立した方法を使用して、ＣＲＤ−ＢＰとリボソームサブユニットとの会合を
確かめるために、免疫沈降（ＩＰ）実験を、大（６０Ｓ）サブユニットと会合し
たタンパク質と特異的に反応する、Ｐタンパク質抗体を使用して実施した。Ｋ５
６２細胞ポリソームは、２０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下でサブユニットに解離し、
抗Ｐ抗体血清または正常ヒト血清で免疫沈降した。その後、免疫沈降タンパク質
を、Ｐタンパク質およびＣＲＤ−ＢＰに対する抗体を使用して免疫ブロットする
ことにより分析した。抗Ｐタンパク質抗体は、予期された通り、３つの６０Ｓタ
ンパク質（Ｐ_０、Ｐ_１、およびＰ_２）を免疫沈降させた（図８Ａ、レーンＩ）。
これらのタンパク質のいずれも、正常ヒト血清により免疫沈降されなかった（レ
ーンＮ）。抗Ｐタンパク質抗体はまたＣＲＤ−ＢＰを免疫沈降させた（図８Ｂ、
レーンＩ）。これらの知見により、ＣＲＤ−ＢＰはＫ５６２細胞抽出物のリボソ
ームサブユニットと会合することが確認される。

【０１０５】 Ｃ．議論 ＣＲＤ−ＢＰは、そのコーディング領域をヌクレオチド鎖切断攻撃から遮蔽す
ることにより、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡを安定化すると考えられている（２２、３
０、３１）。これに関して、それは、トランスフェリン受容体ｍＲＮＡの３’−
ＵＴＲに結合し保護する鉄応答タンパク質に類似し得る（４１に論評）。しかし
、ＣＲＤ−ＢＰは、鉄応答タンパク質および多くの他のｍＲＮＡ結合タンパク質
とは少なくとも２つの点で異なる。（ｉ）ほとんどの該タンパク質は、３’−Ｕ
ＴＲ内で結合するが、ＣＲＤ−ＢＰはｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡコーディング領域に
結合する。それは、インビトロでは、いずれのｃ−ｍｙｃ非翻訳領域由来のＲＮ
Ａ基質にも結合しない（３０）。ｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡのコーディング領域もま
た、タンパク質結合部位であるｍＲＮＡ半減期決定基を含む（４２）。おそらく
、ｍｙｃおよびｆｏｓ ｍＲＮＡコーディング領域決定基の機能およびそのそれ
ぞれの結合タンパク質は、ｍｙｃおよびｆｏｓタンパク質発現の調節に関連する
。（ｉｉ）ｃ−ｍｙｃ ＣＲＤ−ＢＰは、発達的に調節され、胎児および新生児
の生活では豊富に発現されるが、成体動物では発現されない（３２）。おそらく
、ＣＲＤ−ＢＰは、胚／胎児発達に特別な役割を有する。

【０１０６】 ＣＲＤ−ＢＰは、４つのＫＨドメインおよびＲＧＧボックスを含み、それは、
ポリソームおよびリボソームサブユニットと共分画する。これらの知見は、その
機能がある点で翻訳および／またはｍＲＮＡ代謝に関連しているＲＮＡ結合タン
パク質であることと一致する。ＣＲＤ−ＢＰはまた、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの非
存在下で、リボソームと共分画する（図５）。おそらく、それは無傷細胞でｃ− ｍｙｃ ｍＲＮＡおよびリボソームの両方に結合する。そうであれば、それは、
任意の非保護ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡ分子への結合に必要な場合に使用される貯蔵
庫として翻訳リボソームを有し得る。ＣＲＤ−ＢＰはまた、推定核局在配列およ
び２つの推定核外移行配列を含む（図１および２）。我々は、ＣＲＤ−ＢＰが、
核ないし細胞質間を往復するかを知らない。しかし、往復する場合、細胞質でそ
のほとんどの時間を細胞の成長に費やすようである。なぜなら、それは定常状態
で核にほとんど検出されないからである。（図６）

【０１０７】 上記したＣＲＤ−ＢＰの独特な特徴と一致して、ＣＲＤ−ＢＰおよびｈＫＯＣ
タンパク質は、ＫＨドメイン含有ＲＮＡ結合タンパク質の独特なサブファミリー
を示すようである。ＦＵＳＥ結合タンパク質を含む他の推定ＲＮＡ結合タンパク
質、Ｐ−エレメント体細胞阻害剤、およびＣ． ｅｌｅｇａｎｓＭ８８．５は、
４つのＫＨドメインを含む点でＣＲＤ−ＢＰに似ている（４３）。しかし、これ
らのタンパク質の数個の構造的特徴は、ＣＲＤ−ＢＰおよびｈＫＯＣとは異なる
。Ｐ−エレメント体細胞阻害剤およびＦＵＳＥ結合タンパク質のＫＨドメインは
、そのアミノ末端に向けて位置し、均一に空間配置された４つの単位反復として
組織化される。これらのタンパク質はまた、そのアミノおよびカルボキシ末端に
、グリシンリッチまたはグルタミンリッチ伸展を含む。Ｍ８８．５の４つのＫＨ
ドメインの全体の組織化は、ＣＲＤ−ＢＰおよびｈＫＯＣに最も類似している。
それは、８３アミノ酸離れた２対のＫＨドメインを含む。しかし、ＣＲＤ−ＢＰ
およびｈＫＯＣとは対照的に、Ｍ８８．５のアミノ末端は、グルタミンリッチで
あり、ＲＧＧボックスがない。ＦＵＳＥ結合タンパク質は、ＲＧＧボックスに似
た配列を含むが、この配列は、第３ないし第４ＫＨドメイン間に位置し、これは
、ＣＲＤ−ＢＰおよびｈＫＯＣタンパク質にはない。最終的に、これらの他のタ
ンパク質のＫＨドメインのコア配列は、ＣＲＤ−ＢＰまたはｈＫＯＣのものとは
非常に異なる。

【０１０８】 数個の構造的および機能的類似性がまた、ＣＲＤ−ＢＰ、ないしＦＭＲ１遺伝
子によりコード化されるタンパク質であるＦＭＲＰ間に認められ、その変異は、
ほとんどの共通形の遺伝性精神遅滞に関与している（４４、４５）。両方のタン
パク質が、ＫＨドメインおよびＲＧＧボックス（３７、３８）並びに核内移行お
よび核外移行シグナル（３９）を含む。両方のタンパク質が、リボソームおよび
おそらく同様にｍＲＮＡと会合する（３３、４９、４６）。どちらのタンパク質
も細胞生存には必要ではない。なぜなら、ＦＭＲＰを発現できない個体は、生存
するが、完全に正常な成体動物は、免疫ブロットおよび／またはゲル遅延アッセ
イにより検出可能なレベルでＣＲＤ−ＢＰを発現しないからである（３２）。Ｆ
ＭＲＰないしＣＲＤ−ＢＰ間には、特にその発現パターンにいくつかの有意な差
もある。両方共、胎児生活中では豊富に発現されるが、ＦＭＲＰのみが成体組織
に検出される（４７−４９）。

【０１０９】 ＣＲＤ−ＢＰの構造的特徴およびその発達調節パターンにより、それは以下の
理由から癌胎児性タンパク質であり得ることが示唆される：（ｉ）それは胎児お
よび出生後の生活でのみ豊富に発現される（３２）。（ｉｉ）現在データベース
中のマウスＣＲＤ−ＢＰ ＥＳＴは全て、胎児組織または胚幹細胞を含む細胞系
由来である。これらは、ＡＡ０７３１７３（１３日目の胚心臓組織由来）、ＡＡ
６１９６５０およびＡＡ３９９８３３（移植前の胚盤胞由来）、ＡＡ０７３５１
４（レチノイン酸で処理したＰ１９胚癌細胞系由来）、Ｄ７６６６２およびＤ７
６７８１（Ｆ９胚癌細胞系由来）を含む。（ｉｉｉ）ＣＲＤ−ＢＰは、多くの細
胞系で発現され、全て新生物性または新生物前である。それは、Ｋ５６２、Ｈｅ
Ｌａ、および３Ｔ３細胞で高レベルで（図３および４で、データは示していない
）、ＨＬ６０、ヒト前骨髄球性白血病細胞、およびＨ４ＩＩＥ、ラット肝細胞腫
細胞などの他の系で低レベルで発現される（データは示していない）。（ｉｖ）
膵臓癌およびいくつかの他の腫瘍で過剰発現されるｈＫＯＣタンパク質と類似し
ているが、同一ではない（図２および参考文献４０）。ＣＲＤ−ＢＰが癌胎児性
タンパク質である場合、生物の初期の発達に影響を及ぼす、および／または発癌
に影響を及ぼす、ＲＮＡ結合タンパク質の増加中のリストに加わるだろう。例え
ば、Ｅｌａｖタンパク質の変異は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ発育に影響を及ぼし（
５０−５３に論評）、一方、他のＲＮＡ結合タンパク質遺伝子の変異により、男
性不妊症または精神遅滞が生じる（４４）。

【０１１０】 Ｄ．臨床サンプル中のＣＲＤ−ＢＰの検出 ヒト腫瘍組織は、ＵＷ−マデイソン臨床癌センター（ＵＷ−Ｍａｄｉｓｏｎ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）の医者および外科医により提
供された。組織をホモジナイズし、粗細胞質抽出物を調製した。その後、抽出物
を、ケンドリック研究所（Ｋｅｎｄｒｉｃｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（マ
デイソン、ウィスコンシン）で２次元ゲル電気泳動により分画した。２次元で電
気泳動後、タンパク質をＰＶＤＦ膜に写し、我々の研究室に戻した。

【０１１１】 ＣＲＤ−ＢＰは、膜を、マウスＣＲＤ−ＢＰに対する抗体と共にインキュベー
トすることにより可視化した。これらの抗体は、ヒトＣＲＤ−ＢＰと交差反応す
る。

【０１１２】 知見は以下の通りである：

【０１１３】 １．我々は、ヒト乳癌、大腸癌および膵臓癌組織で豊富なＣＲＤ−ＢＰを検出
する。我々は、他の非造血癌と類似の結果を見出すことを予期する。

【０１１４】 ２．かなり少量のＣＲＤ−ＢＰが、１つの正常ヒト乳房組織サンプルで検出さ
れる。

【０１１５】 ３．ＣＲＤ−ＢＰが、数個のヒト白血病サンプルで検出される。

【０１１６】 これらの研究からの我々の結論は、ＣＲＤ−ＢＰは、非白血病ヒト癌で過剰発
現されるというものである。

【０１１７】 参考文献 １．アイヤー・デー・イー（Ａｙｅｒ，Ｄ．Ｅ．）およびアイゼンマン・アール
・エヌ（Ｅｉｓｅｎｍａｎ，Ｒ．Ｎ．）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ．７：２１１
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およびアイゼンマン・アール・エヌ、Ｃｅｌｌ ７２：２１１−２２２、１９９
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ｙｕｒｉｓ，Ｊ．）およびブレント・アール（Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．）、Ｃｅｌｌ
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【０１１８】 ６．フレイタッグ・エス・オー（Ｆｒｅｙｔａｇ，Ｓ．Ｏ．）、ダング・シー・
ヴィー（Ｄａｎｇ，Ｃ．Ｖ．）、およびリー・ダブリュー・エム・エフ（Ｌｅｅ
，Ｗ．Ｍ．Ｆ．）、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆ．１：３３９−３４３、
１９９０。 ７．エバン・ジー・アイ（Ｅｖａｎ，Ｇ．Ｉ．）、ウィリー・エー・エイチ（Ｗ
ｙｌｌｉｅ，Ａ．Ｈ．）、ギルバート・シー・エス（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｃ．Ｓ．
）、リトルウッド・ティー・デー（Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ，Ｔ．Ｄ．）、ランド
・エイチ（Ｌａｎｄ，Ｈ．）、ブルックス・エム（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｍ．）、ウォ
ーターズ・シー・エム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｃ．Ｍ．）、ペン・エル・ゼット（Ｐｅ
ｎｎ，Ｌ．Ｚ．）およびハンコック・デー・シー（Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｄ．Ｃ．）
、Ｃｅｌｌ ６９：１１９−１２８、１９９２。 ８．アダムズ・ジェイ・エム（Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ｍ．）、ハリス・エー・ダブリ
ュー（Ｈａｒｒｉｓ，Ａ．Ｗ．）、ピンカート・シー・エー（Ｐｉｎｋｅｒｔ，
Ｃ．Ａ．）、コルコラン・エル・エム（Ｃｏｒｃｏｒａｎ，Ｌ．Ｍ．）、アレキ
サンダー・ダブリュー・エス（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｗ．Ｓ．）、コリー・エス
（Ｃｏｒｙ，Ｓ．）、パルミター・アール・デー（Ｐａｌｍｉｔｅｒ，Ｒ．Ｄ．
）およびブリンスウター・アール・エル（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｎａ ｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８、１９８５。 ９．クライン・ジー（Ｋｌｅｉｎ，Ｇ．）、Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｓ，Ｃａｎｃｅｒ １：３−８、１９８９。 １０．リューシャー・ビー（Ｌｕｅｓｃｈｅｒ，Ｂ．）およびアイゼンマン・ア
ール・エヌ、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ．４：２０２５−２０３５、１９９０。

【０１１９】 １１．スポッツ・ジー・デー（Ｓｐｏｔｔｓ，Ｇ．Ｄ．）およびハン・エス・ア
ール（Ｈａｎｎ，Ｓ．Ｒ．）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３９５２−
３９６４、１９９０。 １２．ルッテルバッハ・ビー（Ｌｕｔｔｅｒｂａｃｈ，Ｂ．）およびハン・エス
・アール、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：５５１０−５５２２、１９
９４。 １３．モレロ・デー（Ｍｏｒｅｌｌｏ，Ｄ．）、アセリン・シー（Ａｓｓｅｌｉ
ｎ，Ｃ．）、ラベニュウ・エー（Ｌａｖｅｎｕ，Ａ．）、マーク・ケー・ビー（
Ｍａｒｃｕ，Ｋ．Ｂ．）およびバビネット・シー（Ｂａｂｉｎｅｔ，Ｃ．）、Ｏ ｎｃｏｇｅｎｅ ４：９５５−９６１、１９８９。 １４．グルップソ・ピー・エー（Ｇｒｕｐｐｕｓｏ，Ｐ．Ａ．）、フィッツジェ
ラルド・エム・ジェイ（ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ，Ｍ．Ｊ．）およびファウスト・
エヌ（Ｆａｕｓｔｏ，Ｎ．）、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．３３：４９Ａ、１９９
３。 １５．モレロ・デー（Ｍｏｒｅｌｌｏ，Ｄ．）、ラベニュウ・エー、およびバビ
ネット・シー、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：１５１１−１５１９、１９９０。

【０１２０】 １６．スティア・シー・ジェイ（Ｓｔｅｅｒ，Ｃ．Ｊ．）、ＦＡＳＥＢ Ｊ．１
０：５５９−５７３、１９９６。 １７．ジョーンズ・ティー・アール（Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ｒ．）およびコール・エ
ム・デー、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：４５１３−４５２１、１９８７。 １８．ウィズダム・アール（Ｗｉｓｄｏｍ，Ｒ．）およびリー・ダブリュー、Ｊ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６５：１９０１５−１９０２１、１９９０。 １９．ウィズダム・アールおよびリー・ダブリュー、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅ ｖｅｌ． ５：２３２−２４３、１９９１。 ２０．エイルディング・エヌ・エム（Ｙｅｉｌｄｉｎｇ，Ｎ．Ｍ．）、レーマン
・エム・ティー（Ｒｅｈｍａｎ，Ｍ．Ｔ．）およびリー・ダブリュー・エム・エ
フ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：３５１１−３５２２、１９９６。

【０１２１】 ２１．エイルディング・エヌ・エムおよびリー・ダブリュー・エム・エフ、Ｍｏ ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １７：２６９８−２７０７、１９９７。 ２２．ヘリック・デー・ジェイ（Ｈｅｒｒｉｃｋ，Ｄ．Ｊ．）およびロス・ジェ
イ（Ｒｏｓｓ，Ｊ．）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：２１１９−２１２
８、１９９４。 ２３．ラベニュー・エー、ピストイ・エス（Ｐｉｓｔｏｉ，Ｓ．）、プアニン・
エス（Ｐｏｕｒｎｉｎ，Ｓ．）、バビネット・シーおよびモレロ・デー、Ｍｏｌ ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １５：４４１０−４４１９、１９９５。 ２４．モレロ・デー、ラベニュー・エー、プアニン・エス、およびバビネット・
シー、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１９２１−１９２９、１９９３。 ２５．ピストイ・エス、ローランド・ジェイ（Ｒｏｌａｎｄ，Ｊ．）、バビネッ
ト・シー、およびモレロ・デー、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：５１
０７−５１１６、１９９６。

【０１２２】 ２６．ロス・ジェイおよびコブズ・ジー（Ｋｏｂｓ，Ｇ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ ｏｌ． １８８：５７９−５９３、１９８６。 ２７．ロス・ジェイ、ペルツ・エス・ダブリュー（Ｐｅｌｔｚ，Ｓ．Ｗ．）、コ
ブズ・ジー、およびブリューワー・ジー（Ｂｒｅｗｅｒ，Ｇ．）、Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ６：４３６２−４３７１、１９８６。 ２８．ペルツ・エス・ダブリューおよびロス・ジェイ、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：４３４５−４３５６、１９８７。 ２９．ブリューワー・ジーおよびロス・ジェイ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ８：１６９７−１７０８、１９８８。 ３０．ベルンスタイン・ピー・エル（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｐ．Ｌ．）、ヘリッ
ク・デー・ジェイ（Ｈｅｒｒｉｃｋ，Ｄ．Ｊ．）、プロキップカック・アール・
デー（Ｐｒｏｋｉｐｃａｋ，Ｒ．Ｄ．）、およびロス・ジェイ、Ｇｅｎｅｓ Ｄ ｅｖｅｌ． ６：６４２−６５４、１９９２。

【０１２３】 ３１．プロキップカック・アール・デー、ヘリック・デー・ジェイ、およびロス
・ジェイ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９２６１−９２６９、１９９４。 ３２．リーズ・ピー（Ｌｅｅｄｓ，Ｐ．）、クレン・ビー・ティー（Ｋｒｅｎ，
Ｂ．Ｔ．）、ボイラン・ジェイ・エム（Ｂｏｙｌａｎ，Ｊ．Ｍ．）、ベッツ・エ
ヌ・エー（Ｂｅｔｚ，Ｎ．Ａ．）、スティア・シー・ジェイ、グルプッソ・ピー
・エー（Ｇｒｕｐｐｕｓｏ，Ｐ．Ａ．）、およびロス・ジェイ、Ｏｎｃｏｇｅｎ ｅ １４：１２７９−１２８６、１９９７。 ３３．シオミ・エム・シー（Ｓｉｏｍｉ，Ｍ．Ｃ．）、ツァング・ワイ（Ｚｈａ
ｎｇ，Ｙ．）、シオミ・エイチ（Ｓｉｏｍｉ，Ｈ．）、およびドレイファス・ジ
ー（Ｄｒｅｙｆｕｓｓ，Ｇ．）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：３８２５
−３８３２、１９９６。 ３４．エルコン・ケー（Ｅｌｋｏｎ，Ｋ．）、スケリー・エス（Ｓｋｅｌｌｙ，
Ｓ．）、パルナッサ・エー（Ｐａｒｎａｓｓａ，Ａ．）、モラー・ダブリュー（
Ｍｏｌｌｅｒ，Ｗ．）、ダーノ・ダブリュー（Ｄａｈｎｏ，Ｗ．）、ワイスバッ
ハ・エイチ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｈ．）、およびブロット・エヌ（Ｂｒｏｔ，
Ｎ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７４１９−７
４２３、１９８６。 ３５．ヘンシャウ・イー・シー（Ｈｅｎｓｈａｗ，Ｅ．Ｃ．）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５９：４１０−４２１、１９７９。

【０１２４】 ３６．コザック・エム（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．）、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０８
：２２９−２４１、１９８９。 ３７．アシュレー・シー・ティー（Ａｓｈｌｅｙ，Ｃ．Ｔ．）、ウィルキンソン
・ケー・デー（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｋ．Ｄ．）、ライネス・デー（Ｒｅｉｎｅ
ｓ，Ｄ．）、およびワレン・エス・ティー（Ｗａｒｒｅｎ，Ｓ．Ｔ．）、Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２６２：５６３−５６５、１９９３。 ３８．シオミ・エイチ、シオミ・エム・シー、ナスバウム・アール・エル（Ｎｕ
ｓｓｂａｕｍ，Ｒ．Ｌ．）、およびドレイファス・ジー、Ｃｅｌｌ ７４：２９
１−２９８、１９９３。 ３９．エバーハート・デー・イー（Ｅｂｅｒｈａｒｔ，Ｄ．Ｅ．）、マルター・
エイチ・イー（Ｍａｌｔｅｒ，Ｈ．Ｅ．）、フェング・ワイ（Ｆｅｎｇ，Ｙ．）
、およびワレン・エス・ティー、Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．５：１０８３−
１０９１、１９９６。 ４０．ミュラー−ピラシュ・エフ（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｐｉｌｌａｓｃｈ，Ｆ．）
、ラチャー・ユー（Ｌａｃｈｅｒ，Ｕ．）、ウォールラップ・シー（Ｗａｌｌｒ
ａｐｐ，Ｃ．）、ミチャ・エー（Ｍｉｃｈａ，Ａ．）、チマーハックル・エフ（
Ｚｉｍｍｅｒｈａｃｋｌ，Ｆ．）、ハメイスター・エイチ（Ｈａｍｅｉｓｔｅｒ
，Ｈ．）、バーガ・ジー（Ｖａｒｇａ，Ｇ．）、フリエス・エイチ（Ｆｒｉｅｓ
ｓ，Ｈ．）、ビューフラー・エム（Ｂｕｅｃｈｌｅｒ，Ｍ．）、ベガー・エイチ
・ジー（Ｂｅｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．）、ビラ・エム・アール（Ｖｉｌａ，Ｍ．Ｒ．）
、アドラー・ジー（Ａｄｌｅｒ，Ｇ．）、およびグレス・ティー・エム（Ｇｒｅ
ｓｓ，Ｔ．Ｍ．）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４：２７２９−２７３３、１９９７。

【０１２５】 ４１．ハーフォード・ジェイ・ビー（Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．）、ロウアウル
ト・ティー・エー（Ｒｏｕａｕｌｔ，Ｔ．Ａ．）、およびクラウスナー・アール
・デー（Ｋｌａｕｓｎｅｒ，Ｒ．Ｄ．）、健康および疾病における鉄代謝。ジェ
イ・エイチ・ブロック（Ｊ．Ｈ．Ｂｒｏｃｋ）、ジェイ・ダブリュー・ハリデー
（Ｊ．Ｗ．Ｈａｌｌｉｄａｙ）、エム・ジェイ・ピパード（Ｍ．Ｊ．Ｐｉｐｐａ
ｒｄ）およびエル・ダブリュー・ポウェル（Ｌ．Ｗ．Ｐｏｗｅｌｌ）（編）、ダ
ブリュー・ビー・サウンダーズ（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ）、フィラデルフィ
ア、ｐ．１２３−１４９、１９９４。 ４２．チェン・シー−ワイ（Ｃｈｅｎ，Ｃ−Ｙ．）、ユー・ワイ（Ｙｏｕ，Ｙ．
）、およびシュウ・エー−ビー（Ｓｈｙｕ，Ａ−Ｂ．）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ ｉｏｌ． １２：５７４８−５７５７、１９９２。 ４３．ムスコ・ジー（Ｍｕｓｃｏ，Ｇ．）、スティア・ジー（Ｓｔｉｅｒ，Ｇ．
）、ジョセフ・エイチ（Ｊｏｓｅｐｈ，Ｈ．）、アントニエッタ・エム（Ａｎｔ
ｏｎｉｅｔｔａ，Ｍ．）、モレリ・シー（Ｍｏｒｅｌｌｉ，Ｃ．）、ニルゲス・
エム（Ｎｉｌｇｅｓ，Ｍ．）、ギブソン・ティー・ジェイ（Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．
Ｊ．）、パストア・エー（Ｐａｓｔｏｒｅ，Ａ．）、Ｃｅｌｌ ８５：２３７−
２４５、１９９６。 ４４．クッケ・エイチ・ジェイ（Ｃｏｏｋｅ，Ｈ．Ｊ．）、およびエリオット・
デー・ジェイ（Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｄ．Ｊ．）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１３
：８７−８９、１９９７。 ４５．ナスバウム・エヌ・エル（Ｎｕｓｓｂａｕｍ，Ｎ．Ｌ．）、およびレッド
ベター・デー・エイチ（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｄ．Ｈ．）、遺伝性疾患の代謝基
礎、シー・アール・スクライバー（Ｃ．Ｒ．Ｓｃｒｉｖｅｒ）、エー・ベアウデ
ット（Ａ．Ｂｅａｕｄｅｔ）、ダブリュー・エス・スライ（Ｗ．Ｓ．Ｓｌｙ）、
およびデー・バレ（Ｄ．Ｖａｌｌｅ）編（マクグロウ−ヒル、エヌ・ワイ）、ｐ
．７５９−８１０、１９９５。

【０１２６】 ４６．ハンジアン・イー・ダブリュー（Ｋｈａｎｄｊｉａｎ，Ｅ．Ｗ．）、コー
ビン・エフ（Ｃｏｒｂｉｎ，Ｆ．）、ウォーリー・エス（Ｗｏｅｒｌｙ，Ｓ．）
、およびロウセアウ・エフ（Ｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｆ．）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ ｅｔｉｃｓ １２：９１−９３、１９９６。 ４７．フェング・ワイ、グーテクンスト・シー・エー（Ｇｕｔｅｋｕｎｓｔ，Ｃ
．Ａ．）、エバーハート・デー・イー、ウィ・エイチ（Ｙｉ．，Ｈ．）、ワレン
・エス・ティー、およびハーシュ・エス・エム（Ｈｅｒｓｃｈ Ｓ．Ｍ．）、Ｊ ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １７：１５３９−１５４７、１９９７。 ４８．ハンジアン・イー・ダブリュー、フォーティン・エー（Ｆｏｒｔｉｎ，Ａ
．）、チボデアウ・エー（Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ，Ａ．）、トレンブレイ・エス（
Ｔｒｅｍｂｌａｙ，Ｓ．）、コーテ・エフ（Ｃｏｔｅ，Ｆ．）、デビィズ・デー
（Ｄｅｖｙｓ，Ｄ．）、マンデル・ジェイ・エル（Ｍａｎｄｅｌ，Ｊ．Ｌ．）、
およびロウセアウ・エフ、Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．４：７８３−７８９、
１９９５。 ４９．ヒンズ・エイチ・エル（Ｈｉｎｄｓ，Ｈ．Ｌ．）、アシュレー・シー・テ
ィー、サットクリフ・ジェイ・エス（Ｓｕｔｃｌｉｆｆ，Ｊ．Ｓ．）、ネルソン
・デー・エル（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．）、ワレン・エス・ティー、ハウズマン
・デー・イー（Ｈｏｕｓｍａｎ，Ｄ．Ｅ．）、およびシャーリング・エム（Ｓｃ
ｈａｌｌｉｎｇ，Ｍ．）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：３６−４３、
１９９３。 ５０．バード・シー・ジー（Ｂｕｒｄ，Ｃ．Ｇ．）およびドレイファス・ジー、 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：６１５−６２１、１９９４。

【０１２７】 ５１．ハーシュラーグ・デー（Ｈｅｒｓｃｈｌａｇ，Ｄ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ ｈｅｍ． ２７０：２０８７１−２０８７４、１９９５。 ５２．シャムー・ワイ（Ｓｈａｍｏｏ，Ｙ．）、アブダル−マナン・エヌ（Ａｂ
ｄｕｌ−Ｍａｎａｎ，Ｎ．）、およびウィリアムズ・ケー・アール（Ｗｉｌｌｉ
ａｍｓ，Ｋ．Ｒ．）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２３、７２５−７２８、
１９９５。 ５３．ガオ・エフ−ビー（Ｇａｏ，Ｆ−Ｂ．）およびキーネ・ジェイ・デー（Ｋ
ｅｅｎｅ，Ｊ．Ｄ．）、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １０９：５７９−５８
９、１９９６。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 マウスＣＲＤ−ＢＰ ｃＤＮＡおよび予測タンパク質配列（それぞれ配列番号
１および２）。核局在化および核外移行シグナルに似たペプチド配列が、それぞ
れ、一重下線およびオーバーラインにより示される。ＲＧＧボックスおよびＫＨ
ドメインに似たペプチド配列は、それぞれ、ボックスおよび二重下線により示さ
れる。アスタリスクは、翻訳終止部位を示し、ポリアデニル化シグナルは一重線
で示される。我々は、図に示した翻訳開始部位が正しいか、または唯一の開始部
位であるとは結論的に実証しなかった。５’−ＵＴＲは、転写開始部位が図で示
されていないので、不完全であり得る。

【図１Ｂ】 マウスＣＲＤ−ＢＰ ｃＤＮＡおよび予測タンパク質配列（それぞれ配列番号
１および２）。核局在化および核外移行シグナルに似たペプチド配列が、それぞ
れ、一重下線およびオーバーラインにより示される。ＲＧＧボックスおよびＫＨ
ドメインに似たペプチド配列は、それぞれ、ボックスおよび二重下線により示さ
れる。アスタリスクは、翻訳終止部位を示し、ポリアデニル化シグナルは一重線
で示される。我々は、図に示した翻訳開始部位が正しいか、または唯一の開始部
位であるとは結論的に実証しなかった。５’−ＵＴＲは、転写開始部位が図で示
されていないので、不完全であり得る。

【図１Ｃ】 マウスＣＲＤ−ＢＰ ｃＤＮＡおよび予測タンパク質配列（それぞれ配列番号
１および２）。核局在化および核外移行シグナルに似たペプチド配列が、それぞ
れ、一重下線およびオーバーラインにより示される。ＲＧＧボックスおよびＫＨ
ドメインに似たペプチド配列は、それぞれ、ボックスおよび二重下線により示さ
れる。アスタリスクは、翻訳終止部位を示し、ポリアデニル化シグナルは一重線
で示される。我々は、図に示した翻訳開始部位が正しいか、または唯一の開始部
位であるとは結論的に実証しなかった。５’−ＵＴＲは、転写開始部位が図で示
されていないので、不完全であり得る。

【図１Ｄ】 マウスＣＲＤ−ＢＰ ｃＤＮＡおよび予測タンパク質配列（それぞれ配列番号
１および２）。核局在化および核外移行シグナルに似たペプチド配列が、それぞ
れ、一重下線およびオーバーラインにより示される。ＲＧＧボックスおよびＫＨ
ドメインに似たペプチド配列は、それぞれ、ボックスおよび二重下線により示さ
れる。アスタリスクは、翻訳終止部位を示し、ポリアデニル化シグナルは一重線
で示される。我々は、図に示した翻訳開始部位が正しいか、または唯一の開始部
位であるとは結論的に実証しなかった。５’−ＵＴＲは、転写開始部位が図で示
されていないので、不完全であり得る。

【図２Ａ】 ＲＮＡ結合タンパク質の様々なコンセンサス配列を有するＣＲＤ−ＢＰ配列（
配列番号３−３０）。他のＲＮＡ結合タンパク質のＲＧＧドメイン（Ａ）（配列
番号３−９）核外移行シグナル（Ｂ）（配列番号１０−１６）、およびＫＨドメ
イン（Ｃ）（配列番号１７−３０）に対するマウスＣＲＤ−ＢＰ（ｍＣＲＤ−Ｂ
Ｐ）の配列が示される。図２に関して、ボックスで囲んだ残基は、コンセンサス
配列残基との同一性または保存を示す。タンパク質のＧｅｎｂａｎｋ受託番号は
、以下の通りである：ｈＫＯＣ、Ｕ９７１８８；ｈｎＲＮＰＫ、Ｓ７４６７８；
フィブリラリン（ｆｉｂｒｉｌｌａｒｉｎ）、Ｘ５６５９７；ヌクレオリン（ｎ
ｕｃｌｅｏｌｉｎ）、Ｍ６０８５８／Ｊ０５５８４；ＦＭＲＰ、Ｓ６５７９１；
Ｒｅｖ、Ｘ５８７８１。

【図２Ｂ】 ＲＮＡ結合タンパク質の様々なコンセンサス配列を有するＣＲＤ−ＢＰ配列（
配列番号３−３０）。他のＲＮＡ結合タンパク質のＲＧＧドメイン（Ａ）（配列
番号３−９）核外移行シグナル（Ｂ）（配列番号１０−１６）、およびＫＨドメ
イン（Ｃ）（配列番号１７−３０）に対するマウスＣＲＤ−ＢＰ（ｍＣＲＤ−Ｂ
Ｐ）の配列が示される。図２に関して、ボックスで囲んだ残基は、コンセンサス
配列残基との同一性または保存を示す。タンパク質のＧｅｎｂａｎｋ受託番号は
、以下の通りである：ｈＫＯＣ、Ｕ９７１８８；ｈｎＲＮＰＫ、Ｓ７４６７８；
フィブリラリン、Ｘ５６５９７；ヌクレオリン、Ｍ６０８５８／Ｊ０５５８４；
ＦＭＲＰ、Ｓ６５７９１；Ｒｅｖ、Ｘ５８７８１。

【図２Ｃ−１】 ＲＮＡ結合タンパク質の様々なコンセンサス配列を有するＣＲＤ−ＢＰ配列（
配列番号３−３０）。他のＲＮＡ結合タンパク質のＲＧＧドメイン（Ａ）（配列
番号３−９）核外移行シグナル（Ｂ）（配列番号１０−１６）、およびＫＨドメ
イン（Ｃ）（配列番号１７−３０）に対するマウスＣＲＤ−ＢＰ（ｍＣＲＤ−Ｂ
Ｐ）の配列が示される。図２に関して、ボックスで囲んだ残基は、コンセンサス
配列残基との同一性または保存を示す。タンパク質のＧｅｎｂａｎｋ受託番号は
、以下の通りである：ｈＫＯＣ、Ｕ９７１８８；ｈｎＲＮＰＫ、Ｓ７４６７８；
フィブリラリン、Ｘ５６５９７；ヌクレオリン、Ｍ６０８５８／Ｊ０５５８４；
ＦＭＲＰ、Ｓ６５７９１；Ｒｅｖ、Ｘ５８７８１。

【図２Ｃ−２】 ＲＮＡ結合タンパク質の様々なコンセンサス配列を有するＣＲＤ−ＢＰ配列（
配列番号３−３０）。他のＲＮＡ結合タンパク質のＲＧＧドメイン（Ａ）（配列
番号３−９）核外移行シグナル（Ｂ）（配列番号１０−１６）、およびＫＨドメ
イン（Ｃ）（配列番号１７−３０）に対するマウスＣＲＤ−ＢＰ（ｍＣＲＤ−Ｂ
Ｐ）の配列が示される。図２に関して、ボックスで囲んだ残基は、コンセンサス
配列残基との同一性または保存を示す。タンパク質のＧｅｎｂａｎｋ受託番号は
、以下の通りである：ｈＫＯＣ、Ｕ９７１８８；ｈｎＲＮＰＫ、Ｓ７４６７８；
フィブリラリン、Ｘ５６５９７；ヌクレオリン、Ｍ６０８５８／Ｊ０５５８４；
ＦＭＲＰ、Ｓ６５７９１；Ｒｅｖ、Ｘ５８７８１。

【図３】 組換えおよび細胞由来ＣＲＤ−ＢＰの同時移動を示す免疫ブロットアッセイ。
リボソーム塩洗浄物（ＲＳＷ）を、Ｋ５６２およびＮＩＨ／３Ｔ３細胞ポリソー
ムから、およびＣＲＤ−ＢＰ ＤＮＡまたはベクターＤＮＡによってプログラム
された網状赤血球転写／翻訳反応から単離したポリソームから調製した。Ｋ５６
２またはＮＩＨ／３Ｔ３ ＲＳＷの約７．５×１０^５細胞等価体または５０μｌ
の翻訳反応物から回収したＲＳＷの３％を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧで電気泳動し
、膜に写し、これを、抗ＣＲＤ−ＢＰ ＩｇＹ抗体と共にインキュベートし、そ
の後、ＨＲＰ−コンジュゲート抗ＩｇＹ抗体と共にインキュベートした。シグナ
ルは、スーパーシグナル化学発光試薬を用いて展開した。ＣＲＤ−ＢＰおよび交
差反応性タンパク質（ｐ８５）の位置が示される。前以て染色した分子量マーカ
ーの位置は、ｋＤａで右に示す。

【図４Ａ】 組換えＣＲＤ ＢＰのｃ−ｍｙｃ ＣＲＤ ＲＮＡへの特異的結合を示すゲル
遅延アッセイ。（Ａ）ＲＳＷは、Ｋ５６２細胞ポリソームから、およびＣＲＤ−
ＢＰ ｃＤＮＡ、ルシフェラーゼ ｃＤＮＡ（Ｌｕｃ）、またはベクターＤＮＡ
によってプログラムされた転写／翻訳反応から調製した。各ＲＳＷの等量（２μ
ｌ）を、５０，０００ｃｐｍの合成ｃ−ｍｙｃ ＣＲＤ ^３２Ｐ−ＲＮＡと共に
インキュベートした。ＲＮＡ／タンパク質複合体は、６％非変性ＰＡＧで電気泳
動することにより遊離（非結合）プローブから分離した。「なし」は、全くタン
パク質を加えていないゲル遅延反応を示す。ＣＲＤ−ＢＰ／ＣＲＤ複合体（結合
）および非結合（遊離）ＲＮＡの位置は、左に示す。（Ｂ）競合アッセイ。示さ
れるＲＳＷは、緩衝液（なし）または２００倍モル過剰の非標識合成ｃ−ｍｙｃ ＣＲＤ ＲＮＡまたはβ−グロビンＲＮＡの存在下または非存在下で、ｃ−ｍ ｙｃ ＣＲＤ^３２Ｐ−ＲＮＡと共にインキュベートした。その後、ＲＮＡ／タン
パク複合体を、６％非変性ＰＡＧで分離した。ＣＲＤ−ＢＰ／ＣＲＤ複合体（結
合）および非結合（遊離）ＲＮＡの位置は、左に示す。

【図４Ｂ】 組換えＣＲＤ ＢＰのｃ−ｍｙｃ ＣＲＤ ＲＮＡへの特異的結合を示すゲル
遅延アッセイ。（Ａ）ＲＳＷは、Ｋ５６２細胞ポリソームから、およびＣＲＤ−
ＢＰ ｃＤＮＡ、ルシフェラーゼ ｃＤＮＡ（Ｌｕｃ）、またはベクターＤＮＡ
によってプログラムされた転写／翻訳反応から調製した。各ＲＳＷの等量（２μ
ｌ）を、５０，０００ｃｐｍの合成ｃ−ｍｙｃ ＣＲＤ ^３２Ｐ−ＲＮＡと共に
インキュベートした。ＲＮＡ／タンパク質複合体は、６％非変性ＰＡＧで電気泳
動することにより遊離（非結合）プローブから分離した。「なし」は、全くタン
パク質を加えていないゲル遅延反応を示す。ＣＲＤ−ＢＰ／ＣＲＤ複合体（結合
）および非結合（遊離）ＲＮＡの位置は、左に示す。（Ｂ）競合アッセイ。示さ
れるＲＳＷは、緩衝液（なし）または２００倍モル過剰の非標識合成ｃ−ｍｙｃ ＣＲＤ ＲＮＡまたはβ−グロビンＲＮＡの存在下または非存在下で、ｃ−ｍ ｙｃ ＣＲＤ ^３２Ｐ−ＲＮＡと共にインキュベートした。その後、ＲＮＡ／タ
ンパク複合体を、６％非変性ＰＡＧで分離した。ＣＲＤ−ＢＰ／ＣＲＤ複合体（
結合）および非結合（遊離）ＲＮＡの位置は、左に示す。

【図５】 組換えＣＲＤ−ＢＰと網状赤血球リボソームおよびリボソームサブユニットと
の共分画。放射標識組換えＣＲＤ−ＢＰ（黒丸）およびルシフェラーゼ（ＬＵＣ
；白丸）は、別々の網状赤血球翻訳アッセイで合成した。その後、各抽出物を、
２０−４０％の線形スクロース勾配による沈降により分画した。各勾配画分の等
量を、放射標識タンパク質について、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧ中での電気泳動およ
びリンイメージャーでの定量化により分析した。ＣＲＤ−ＢＰおよびルシフェラ
ーゼの量は、任意の単位で与える。リボソームサブユニット、モノソーム、およ
びポリリボソームの位置は、Ａ２６０の測定により、および各画分の一部を、ア
ガロースゲルで電気泳動することにより決定して１８Ｓおよび２８Ｓ ｒＲＮＡ
を同定した。

【図６Ａ】 内因性ＣＲＤ−ＢＰとＫ５６２細胞ポリソームとの共分画および核におけるＣ
ＲＤ−ＢＰの欠失。亜細胞画分を、対数的に成長しているＫ５６２細胞から調製
した（実験方法）。各画分の等しい細胞の等価体（６×１０^５）を、１０％ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧで分離し、ニトロセルロース膜に写し、（Ａ）抗ＣＲＤ−ＢＰ Ｉｇ
Ｙまたは（Ｂ）抗ＨＳＰ−９０ ＩｇＧと共にインキュベートし、その後、セイ
ヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合二次抗体と共にインキュベートした
。免疫反応性タンパク質は、ＥＣＬ試薬を使用して可視化した。分子量マーカー
の位置は、ｋＤａで左に示す。

【図６Ｂ】 内因性ＣＲＤ−ＢＰとＫ５６２細胞ポリソームとの共分画および核におけるＣ
ＲＤ−ＢＰの欠失。亜細胞画分を、対数的に成長しているＫ５６２細胞から調製
した（実験方法）。各画分の等しい細胞の等価体（６×１０^５）を、１０％ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧで分離し、ニトロセルロース膜に写し、（Ａ）抗ＣＲＤ−ＢＰ Ｉｇ
Ｙまたは（Ｂ）抗ＨＳＰ−９０ ＩｇＧと共にインキュベートし、その後、セイ
ヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合二次抗体と共にインキュベートした
。免疫反応性タンパク質は、ＥＣＬ試薬を使用して可視化した。分子量マーカー
の位置は、ｋＤａで左に示す。

【図７Ａ】 ＣＲＤ−ＢＰとＫ５６２細胞由来のリボソームサブユニットとの共分画。対数
的に成長しているＫ５６２細胞由来のポリソームを、緩衝液中に再懸濁し、その
後、２０ｍＭ ＥＤＴＡ中でインキュベートし、リボソームサブユニット（６０
Ｓおよび４０Ｓ）を互いにおよびｍＲＮＰから解離した。サブユニットのアリコ
ートを、ＥＤＴＡを含む線形５−３０％スクロース勾配中で遠心分離した。画分
１は、勾配の上端であり、画分１８は、最後の勾配画分であり、画分１９は、遠
心チューブの底から再懸濁したペレットである。パネルＡ：２６０ｎｍにおける
各画分の吸光度。パネルＢ：各画分のアリコートから単離したＲＮＡを、１％ア
ガロースゲル中で電気泳動し、これは、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光下で写
真撮影した。大および小リボソームサブユニット由来の２８Ｓおよび１８Ｓ ｒ
ＲＮＡの位置はそれぞれ左に示す。パネルＣ：各画分のアリコートを、抗ＣＲＤ
−ＢＰ ＩｇＹを使用した免疫ブロットにより分析した。免疫反応性タンパク質
を、ＥＣＬ試薬を使用して可視化した。分子量マーカーの位置は、左にｋＤａで
示す。ＣＲＤ−ＢＰおよび交差反応性ｐ８５は、右に示す。

【図７Ｂ】 ＣＲＤ−ＢＰとＫ５６２細胞由来のリボソームサブユニットとの共分画。対数
的に成長しているＫ５６２細胞由来のポリソームを、緩衝液中に再懸濁し、その
後、２０ｍＭ ＥＤＴＡ中でインキュベートし、リボソームサブユニット（６０
Ｓおよび４０Ｓ）を互いにおよびｍＲＮＰから解離した。サブユニットのアリコ
ートを、ＥＤＴＡを含む線形５−３０％スクロース勾配中で遠心分離した。画分
１は、勾配の上端であり、画分１８は、最後の勾配画分であり、画分１９は、遠
心チューブの底から再懸濁したペレットである。パネルＡ：２６０ｎｍにおける
各画分の吸光度。パネルＢ：各画分のアリコートから単離したＲＮＡを、１％ア
ガロースゲル中で電気泳動し、これは、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光下で写
真撮影した。大および小リボソームサブユニット由来の２８Ｓおよび１８Ｓ ｒ
ＲＮＡの位置はそれぞれ左に示す。パネルＣ：各画分のアリコートを、抗ＣＲＤ
−ＢＰ ＩｇＹを使用した免疫ブロットにより分析した。免疫反応性タンパク質
を、ＥＣＬ試薬を使用して可視化した。分子量マーカーの位置は、左にｋＤａで
示す。ＣＲＤ−ＢＰおよび交差反応性ｐ８５は、右に示す。

【図７Ｃ】 ＣＲＤ−ＢＰとＫ５６２細胞由来のリボソームサブユニットとの共分画。対数
的に成長しているＫ５６２細胞由来のポリソームを、緩衝液中に再懸濁し、その
後、２０ｍＭ ＥＤＴＡ中でインキュベートし、リボソームサブユニット（６０
Ｓおよび４０Ｓ）を互いにおよびｍＲＮＰから解離した。サブユニットのアリコ
ートを、ＥＤＴＡを含む線形５−３０％スクロース勾配中で遠心分離した。画分
１は、勾配の上端であり、画分１８は、最後の勾配画分であり、画分１９は、遠
心チューブの底から再懸濁したペレットである。パネルＡ：２６０ｎｍにおける
各画分の吸光度。パネルＢ：各画分のアリコートから単離したＲＮＡを、１％ア
ガロースゲル中で電気泳動し、これは、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光下で写
真撮影した。大および小リボソームサブユニット由来の２８Ｓおよび１８Ｓ ｒ
ＲＮＡの位置はそれぞれ左に示す。パネルＣ：各画分のアリコートを、抗ＣＲＤ
−ＢＰ ＩｇＹを使用した免疫ブロットにより分析した。免疫反応性タンパク質
を、ＥＣＬ試薬を使用して可視化した。分子量マーカーの位置は、左にｋＤａで
示す。ＣＲＤ−ＢＰおよび交差反応性ｐ８５は、右に示す。

【図８Ａ】 抗Ｐタンパク質抗体を用いた免疫沈降により決定した、ＣＲＤ−ＢＰと６０Ｓ
リボソームサブユニットとの共分画。ＥＤＴＡ解離Ｋ５６２細胞ポリソームのア
リコートを、抗Ｐタンパク質抗体（Ｉ）または正常ヒト血清（Ｎ）と共にインキ
ュベートした。抗体−抗原複合体を免疫沈降（ＩＰ’ｄ）し、免疫沈降したタン
パク質を、抗Ｐタンパク質ＩｇＧ（パネルＡ）または抗ＣＲＤ−ＢＰ ＩｇＹ（
パネルＢ）を使用して免疫ブロットし、分析した。免疫反応性タンパク質は、Ｅ
ＣＬ試薬を使用して可視化した。Ｐタンパク質（Ｐ_０、Ｐ_１、およびＰ_２）およ
びＣＲＤ−ＢＰの位置は、右に示す。前以て染色した分子量マーカーの位置は、
左にｋＤａで示す。Ｈ鎖は、膜上のＩｇＧ Ｈ鎖との交差反応性を示す。

【図８Ｂ】 抗Ｐタンパク質抗体を用いた免疫沈降により決定した、ＣＲＤ−ＢＰと６０Ｓ
リボソームサブユニットとの共分画。ＥＤＴＡ解離Ｋ５６２細胞ポリソームのア
リコートを、抗Ｐタンパク質抗体（Ｉ）または正常ヒト血清（Ｎ）と共にインキ
ュベートした。抗体−抗原複合体を免疫沈降（ＩＰ’ｄ）し、免疫沈降したタン
パク質を、抗Ｐタンパク質ＩｇＧ（パネルＡ）または抗ＣＲＤ−ＢＰ ＩｇＹ（
パネルＢ）を使用して免疫ブロットし、分析した。免疫反応性タンパク質は、Ｅ
ＣＬ試薬を使用して可視化した。Ｐタンパク質（Ｐ_０、Ｐ_１、およびＰ_２）およ
びＣＲＤ−ＢＰの位置は、右に示す。前以て染色した分子量マーカーの位置は、
左にｋＤａで示す。Ｈ鎖は、膜上のＩｇＧ Ｈ鎖との交差反応性を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年６月１８日（２００１．６．１８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 16/28 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA29 AA35 BB10 BB14 BB20 BB24 BB29 BB46 BB51 CB01 CB17 DA13 FB02 FB03 FB05 GC12 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ02 QQ53 QR55 QS34 4C085 AA14 BB11 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74 【要約の続き】

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）患者の組織をＣＲＤ−ＢＰ発現レベルについて調べ；そ
   して ｂ）段階（ａ）の結果を、同起源由来の非癌性組織の発現レベルと比較する 各段階を含んでなる、非癌性組織と比較して増加した患者組織のＣＲＤ−ＢＲレ
   ベルが癌の診断となる、ヒト患者における癌の存在または非存在を診断する方法
   。
2. 【請求項２】 ＣＲＤ−ＢＰの検出が、生検組織をホモジナイズし、粗タン
   パク質抽出物を得て、その抽出物をＣＲＤ−ＢＰレベルについて調べる段階を含
   んでなる、請求項１の方法。
3. 【請求項３】 検出が２抗体サンドイッチアッセイを介してなされる、請求
   項２の方法。
4. 【請求項４】 検出が抗原競合アッセイを介してなされる、請求項２の方法
   。
5. 【請求項５】 検出が抗体捕獲アッセイを介してなされる、請求項３の方法
   。
6. 【請求項６】 ＣＲＤ−ＢＰの検出が免疫ブロットを介してなされる、請求
   項２の方法。
7. 【請求項７】 ＣＲＤ−ＢＰの検出が、細胞中で免疫学的方法またはインサ
   イツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション法を介して起こる、請求項１の
   方法。
8. 【請求項８】 癌が、乳癌、大腸癌および膵臓癌からなる群から選択される
   、請求項１の方法。
9. 【請求項９】 患者の組織が乳房組織である、請求項１の方法。
10. 【請求項１０】 非癌性組織が乳房組織である、請求項９の方法。
11. 【請求項１１】 患者の組織が大腸組織である、請求項１の方法。
12. 【請求項１２】 非癌性組織が大腸組織である、請求項１１の方法。
13. 【請求項１３】 組織が膵臓組織である、請求項１の方法。
14. 【請求項１４】 非癌性組織が膵臓組織である、請求項１３の方法。
15. 【請求項１５】 ａ）患者の組織をＣＲＤ−ＢＰ発現レベルについて調べ、
    そして ｂ）その発現レベルを疾病予後と関連づける 各段階を含んでなる、ヒト患者における癌の期を決定する方法。
16. 【請求項１６】 ａ）患者の血清をＣＲＤ−ＢＰにさらし、抗ＣＲＤ−ＢＰ
    抗体が存在するかを決定する 段階を含んでなる、患者の血清における抗ＣＲＤ−ＢＰ抗体の存在または非存在
    を決定する方法。
17. 【請求項１７】 ａ）患者の血清をＣＲＤ−ＢＰ抗体にさらし、ＣＲＤ−Ｂ
    Ｐが存在するかを決定する 段階を含んでなる、患者の血清におけるＣＲＤ−ＢＰ自体の存在または非存在を
    決定する方法。
18. 【請求項１８】 癌性細胞でのＣＲＤ−ＢＰのレベルを排除または低下させ
    る段階を含んでなる、癌細胞成長を抑制する方法。
19. 【請求項１９】 ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡを急速な破壊から保護するＣＲＤ−
    ＢＰの能力が、細胞に競合体ＲＮＡを与えることによる、請求項１８の方法。
20. 【請求項２０】 ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡを急速な破壊から保護するＣＲＤ−
    ＢＰの能力が、ＣＲＤ−ＢＰのｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡ ＣＲＤへの結合を遮断す
    る阻害剤の使用を介して減少または排除される、請求項１８の方法。