JP2003289877A - 新規卵巣腫瘍マーカー物質、該マーカーの検査方法および該検査のためのキット並びに卵巣腫瘍治療用医薬 - Google Patents
新規卵巣腫瘍マーカー物質、該マーカーの検査方法および該検査のためのキット並びに卵巣腫瘍治療用医薬Info
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- JP2003289877A JP2003289877A JP2002104215A JP2002104215A JP2003289877A JP 2003289877 A JP2003289877 A JP 2003289877A JP 2002104215 A JP2002104215 A JP 2002104215A JP 2002104215 A JP2002104215 A JP 2002104215A JP 2003289877 A JP2003289877 A JP 2003289877A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規な卵巣腫瘍のマーカー、当該腫瘍マーカ
ーの検査方法および当該方法に用い得るキットを提供す
る。更に、上記腫瘍マーカーを標的とした腫瘍治療のた
めの医薬を提供する。 【解決手段】 ＲＥＴ遺伝子産物からなる卵巣腫瘍マー
カー物質、ＲＥＴ遺伝子の発現を検出することを特徴と
する、卵巣腫瘍マーカーの検査、および卵巣腫瘍マーカ
ー物質としてのＲＥＴを標的分子とした卵巣腫瘍治療の
ための医薬。
ーの検査方法および当該方法に用い得るキットを提供す
る。更に、上記腫瘍マーカーを標的とした腫瘍治療のた
めの医薬を提供する。 【解決手段】 ＲＥＴ遺伝子産物からなる卵巣腫瘍マー
カー物質、ＲＥＴ遺伝子の発現を検出することを特徴と
する、卵巣腫瘍マーカーの検査、および卵巣腫瘍マーカ
ー物質としてのＲＥＴを標的分子とした卵巣腫瘍治療の
ための医薬。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規卵巣腫瘍マー
カー物質に関する。また、本発明は、当該マーカーの検
査方法および該検査のためのキットに関し、特に該検査
においてはＲＥＴ遺伝子の発現が検出される。更に、本
発明は、本発明の新規卵巣腫瘍マーカーを発現する腫瘍
細胞に指向性の化合物或いは核酸を用いた当該腫瘍治療
のための医薬に関する。
カー物質に関する。また、本発明は、当該マーカーの検
査方法および該検査のためのキットに関し、特に該検査
においてはＲＥＴ遺伝子の発現が検出される。更に、本
発明は、本発明の新規卵巣腫瘍マーカーを発現する腫瘍
細胞に指向性の化合物或いは核酸を用いた当該腫瘍治療
のための医薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＲＥＴ遺伝子は、受容体型チロシンキナ
ーゼをコードするプロト癌遺伝子であり（Ｉｔｏｈ，
Ｆ．，Ｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｙ．，Ｔａｈｉｒａ，Ｔ．，
Ｉｋｅｄａ，Ｉ．，Ｉｍａｉ，Ｋ．，Ｙａｃｈｉ，
Ａ．，Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｔ． ａｎｄ Ｎａｇａｏ，
Ｍ．， Ｒｅｃｅｎｔ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ
ｒｅｔ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ．， Ｔｕｍ
ｏｒ Ｒｅｓ．， ２４：１−１３，１９８９）、当該
遺伝子によりコードされる受容体型チロシンキナーゼは
ＧＤＮＦ（Ｇｌｉａｌ−ｃｅｌｌ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎ
ｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃＦａｃｔｏｒ）の共受容体であ
ることが報告されている（Ｊｉｎｇ，Ｓ．，ｅｔ ａ
ｌ．， ＧＤＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒ
ｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｂｙ ＧＤＮＦＲ−ａｌｐｈａ， ａ ｎｏｖｅｌ ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ＧＤＮＦ．， Ｃｅｌｌ，
８５：１１１３−１１２４，１９９６およびＴｒｕｐ
ｐ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．， Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ＧＤＮＦ ｅｎｃｏｄｅｄ
ｂｙ ｔｈｅ ｃ−ｒｅｔ ｐｒｏｔｏ-ｏｎｃｏｇｅ
ｎｅ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３８１：７８５−７８９，
１９９６）。
ーゼをコードするプロト癌遺伝子であり（Ｉｔｏｈ，
Ｆ．，Ｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｙ．，Ｔａｈｉｒａ，Ｔ．，
Ｉｋｅｄａ，Ｉ．，Ｉｍａｉ，Ｋ．，Ｙａｃｈｉ，
Ａ．，Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｔ． ａｎｄ Ｎａｇａｏ，
Ｍ．， Ｒｅｃｅｎｔ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ
ｒｅｔ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ．， Ｔｕｍ
ｏｒ Ｒｅｓ．， ２４：１−１３，１９８９）、当該
遺伝子によりコードされる受容体型チロシンキナーゼは
ＧＤＮＦ（Ｇｌｉａｌ−ｃｅｌｌ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎ
ｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃＦａｃｔｏｒ）の共受容体であ
ることが報告されている（Ｊｉｎｇ，Ｓ．，ｅｔ ａ
ｌ．， ＧＤＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒ
ｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｂｙ ＧＤＮＦＲ−ａｌｐｈａ， ａ ｎｏｖｅｌ ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ＧＤＮＦ．， Ｃｅｌｌ，
８５：１１１３−１１２４，１９９６およびＴｒｕｐ
ｐ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．， Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ＧＤＮＦ ｅｎｃｏｄｅｄ
ｂｙ ｔｈｅ ｃ−ｒｅｔ ｐｒｏｔｏ-ｏｎｃｏｇｅ
ｎｅ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３８１：７８５−７８９，
１９９６）。
【０００３】本発明者等は、先に、ＲＥＴ遺伝子産物
（翻訳産物；以下「ＲＥＴ」と略す。）の発現は神経芽
細胞腫において特異的に認められるが、ほかに調べられ
た１９種の非神経芽細胞腫においては当該発現が認めら
れないことを明らかにした（Ｎａｇａｏ，Ｍ．，Ｉｓｈ
ｉｚｕｋａ，Ｙ．，Ｎａｋａｇａｗａｒａ，Ａ．，Ｋｏ
ｈｎｏ，Ｋ．，Ｋｕｗａｎｏ，Ｍ．，Ｔａｈｉｒａ，
Ｔ．，Ｉｔｏｈ，Ｆ．，Ｉｋｅｄａ，Ｉ． ａｎｄ Ｓ
ｕｇｉｍｕｒａ， Ｔ．， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
ｒｅｔ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｉｎ ｈｕ
ｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｍａｓ．， Ｊｐｎ．
Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．， ８１：３０９−３１２，
１９９０およびＩｋｅｄａ．Ｉ．，Ｉｓｈｉｚｕｋａ，
Ｙ．，Ｔａｈｉｒａ，Ｔ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｏｎ
ｄａ．Ｍ．，Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｔ．ａｎｄ Ｎａｇａ
ｏ．Ｍ．， Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｔ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎ
ｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ
ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ５：
１２９１−１２９６，１９９０）。更に、ＩＩａ型多発
性内分泌腫瘍や甲状腺髄様癌において、ＲＥＴ遺伝子の
突然変異が認められている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｌ．
Ｍ．，ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ ｍｕｔａ
ｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＲＥＴ ｐｒｏｔｏ−ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｅ ｎｅｏｐｌａｓｉｓ ｔｙｐｅ ２Ａ．， Ｎ
ａｔｕｒｅ， ３６３：４５８−４６０，１９９３およ
びＨｏｆｓｔｒａ，Ｒ．Ｍ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．， Ａ
ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｔ ｐｒｏｔ
ｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔ
ｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｎｅｏｐ
ｌａｓｉａ ｔｙｐｅ ２Ｂ ａｎｄ ｓｐｏｒａｄｉ
ｃ ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｒｃｉ
ｎｏｍａ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３６７：３７５−３７
６，１９９４）。
（翻訳産物；以下「ＲＥＴ」と略す。）の発現は神経芽
細胞腫において特異的に認められるが、ほかに調べられ
た１９種の非神経芽細胞腫においては当該発現が認めら
れないことを明らかにした（Ｎａｇａｏ，Ｍ．，Ｉｓｈ
ｉｚｕｋａ，Ｙ．，Ｎａｋａｇａｗａｒａ，Ａ．，Ｋｏ
ｈｎｏ，Ｋ．，Ｋｕｗａｎｏ，Ｍ．，Ｔａｈｉｒａ，
Ｔ．，Ｉｔｏｈ，Ｆ．，Ｉｋｅｄａ，Ｉ． ａｎｄ Ｓ
ｕｇｉｍｕｒａ， Ｔ．， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
ｒｅｔ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｉｎ ｈｕ
ｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｍａｓ．， Ｊｐｎ．
Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．， ８１：３０９−３１２，
１９９０およびＩｋｅｄａ．Ｉ．，Ｉｓｈｉｚｕｋａ，
Ｙ．，Ｔａｈｉｒａ，Ｔ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｏｎ
ｄａ．Ｍ．，Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｔ．ａｎｄ Ｎａｇａ
ｏ．Ｍ．， Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｔ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎ
ｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ
ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ５：
１２９１−１２９６，１９９０）。更に、ＩＩａ型多発
性内分泌腫瘍や甲状腺髄様癌において、ＲＥＴ遺伝子の
突然変異が認められている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｌ．
Ｍ．，ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ ｍｕｔａ
ｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＲＥＴ ｐｒｏｔｏ−ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｅ ｎｅｏｐｌａｓｉｓ ｔｙｐｅ ２Ａ．， Ｎ
ａｔｕｒｅ， ３６３：４５８−４６０，１９９３およ
びＨｏｆｓｔｒａ，Ｒ．Ｍ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．， Ａ
ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｔ ｐｒｏｔ
ｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔ
ｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｎｅｏｐ
ｌａｓｉａ ｔｙｐｅ ２Ｂ ａｎｄ ｓｐｏｒａｄｉ
ｃ ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｒｃｉ
ｎｏｍａ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３６７：３７５−３７
６，１９９４）。
【０００４】このように、ＲＥＴ遺伝子の発現は、神経
芽細胞腫や多発性内分泌腫瘍（ＭＥＮ２型）といった神
経堤細胞由来の腫瘍に特異的であることが報告されてき
たが、当該遺伝子が卵巣腫瘍細胞、特に卵巣癌細胞にお
いて発現していることは全く知られていない。
芽細胞腫や多発性内分泌腫瘍（ＭＥＮ２型）といった神
経堤細胞由来の腫瘍に特異的であることが報告されてき
たが、当該遺伝子が卵巣腫瘍細胞、特に卵巣癌細胞にお
いて発現していることは全く知られていない。
【０００５】ところで、上記のＲＥＴに関連して、本発
明者等は、ＲＥＴの細胞外ドメインに特異的なモノクロ
ーナル抗体を作製し、当該モノクローナル抗体が神経芽
細胞腫において遺伝子の特異的な転移を媒介することを
明らかにしている（Ｙａｎｏ，Ｌ．，Ｓｈｉｍｕｒａ，
Ｍ．，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｈａｙａｓｈｉ，
Ｙ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｈａｔａｋｅ，Ｋ．，Ｔａ
ｋａｋｕ，Ｆ． ａｎｄＩｓｈｉｚｕｋａ，Ｙ．， Ｉ
ｍｐｒｏｖｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｔｏ ｎ
ｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔ
ｉｎｇ ＲＥＴ， ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｕｒｏｓ
ｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ．， Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅ
ｒ．，１１：９９５−１００４，２０００）。このよう
なＲＥＴに特異的な抗体は、当該遺伝子産物を発現する
細胞を標的とする抗癌剤或いは遺伝子による治療に用い
ることができると考えられるが、そのような細胞に特異
的に結合する抗体以外の分子も使用可能であろう。いく
つかのペプチドが標的となり得るある種の細胞と特異的
に結合することが報告されている（Ｎｉｃｋｌｉｎ，
Ｓ．Ａ．，ｅｔａｌ．， Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔａｒ
ｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔ
ｏ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅ
ｌｌｓｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｓｏ
ｌａｔｅｄ ｂｙ ｐｈａｇｅｄｉｓｐｌｙ．， Ｃｉ
ｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １０２：２３１−２３７，２０
００； Ｊｏｓｔ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．， Ａ ｎ
ｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅ，ＴＨＡＬＷＨＴ，ｆｏｒ
ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｉ
ｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔ．， ４８９：２６３−２６９，２００１； および
Ｐａｒｋ，Ｂ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌ
ｌｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｔｉ−ＨＥＲ２／ｎｅｕ
ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ ｄｉｓａｂｌｅｓ
Ｐ１８５ ＨＥＲ/ｎｅｕｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎ
ａｓｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖ
ｏ．， Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １８：１
９４−１９８，２０００）。上記のうちで、Ｐａｒｋ等
は、合理的に設計された抗ＨＥＲ２／ｎｅｕペプチドに
よる、イン・ビトロおよびイン・ビボ双方での乳癌細胞
の成長抑制を報告しており、この事実は、ある種の標的
指向性ペプチド類もモノクローナル抗体類似の作用を奏
し得ることを示している。
明者等は、ＲＥＴの細胞外ドメインに特異的なモノクロ
ーナル抗体を作製し、当該モノクローナル抗体が神経芽
細胞腫において遺伝子の特異的な転移を媒介することを
明らかにしている（Ｙａｎｏ，Ｌ．，Ｓｈｉｍｕｒａ，
Ｍ．，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｈａｙａｓｈｉ，
Ｙ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｈａｔａｋｅ，Ｋ．，Ｔａ
ｋａｋｕ，Ｆ． ａｎｄＩｓｈｉｚｕｋａ，Ｙ．， Ｉ
ｍｐｒｏｖｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｔｏ ｎ
ｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔ
ｉｎｇ ＲＥＴ， ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｕｒｏｓ
ｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ．， Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅ
ｒ．，１１：９９５−１００４，２０００）。このよう
なＲＥＴに特異的な抗体は、当該遺伝子産物を発現する
細胞を標的とする抗癌剤或いは遺伝子による治療に用い
ることができると考えられるが、そのような細胞に特異
的に結合する抗体以外の分子も使用可能であろう。いく
つかのペプチドが標的となり得るある種の細胞と特異的
に結合することが報告されている（Ｎｉｃｋｌｉｎ，
Ｓ．Ａ．，ｅｔａｌ．， Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔａｒ
ｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔ
ｏ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅ
ｌｌｓｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｓｏ
ｌａｔｅｄ ｂｙ ｐｈａｇｅｄｉｓｐｌｙ．， Ｃｉ
ｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １０２：２３１−２３７，２０
００； Ｊｏｓｔ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．， Ａ ｎ
ｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅ，ＴＨＡＬＷＨＴ，ｆｏｒ
ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｉ
ｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔ．， ４８９：２６３−２６９，２００１； および
Ｐａｒｋ，Ｂ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌ
ｌｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｔｉ−ＨＥＲ２／ｎｅｕ
ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ ｄｉｓａｂｌｅｓ
Ｐ１８５ ＨＥＲ/ｎｅｕｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎ
ａｓｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖ
ｏ．， Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １８：１
９４−１９８，２０００）。上記のうちで、Ｐａｒｋ等
は、合理的に設計された抗ＨＥＲ２／ｎｅｕペプチドに
よる、イン・ビトロおよびイン・ビボ双方での乳癌細胞
の成長抑制を報告しており、この事実は、ある種の標的
指向性ペプチド類もモノクローナル抗体類似の作用を奏
し得ることを示している。
【０００６】しかしながら、ここでもまた、卵巣腫瘍細
胞のＲＥＴをその特異的な標的とするようなペプチド類
は知られていない。
胞のＲＥＴをその特異的な標的とするようなペプチド類
は知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規な卵巣
腫瘍のマーカーを提供することを目的とする。当該腫瘍
マーカーは卵巣腫瘍の診断に利用することが可能であ
る。また、当該腫瘍マーカーの検査は、ＲＴ−ＰＣＲや
イムノアッセイ、或いは当該腫瘍マーカーに特異的に結
合するペプチドを用いて該マーカーの発現を検出するこ
とにより行なうことができ、それらの方法および当該方
法に用い得るキットも本発明により提供される。更に、
本発明は、上記腫瘍マーカーを標的とした腫瘍治療のた
めの医薬を提供することをも目的とする。
腫瘍のマーカーを提供することを目的とする。当該腫瘍
マーカーは卵巣腫瘍の診断に利用することが可能であ
る。また、当該腫瘍マーカーの検査は、ＲＴ−ＰＣＲや
イムノアッセイ、或いは当該腫瘍マーカーに特異的に結
合するペプチドを用いて該マーカーの発現を検出するこ
とにより行なうことができ、それらの方法および当該方
法に用い得るキットも本発明により提供される。更に、
本発明は、上記腫瘍マーカーを標的とした腫瘍治療のた
めの医薬を提供することをも目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記のとおり、ＲＥＴ遺
伝子は神経芽細胞腫や多発性内分泌腫瘍（ＭＥＮ２型）
といった神経堤細胞由来の腫瘍で特異的に発現すること
が報告されてきたが、当該遺伝子は全ての腫瘍細胞にお
いて発現しているわけではなく、特に、当該遺伝子が卵
巣腫瘍細胞で発現していることは全く報告されていなか
った。本発明者等は、卵巣腫瘍細胞における有用なマー
カーについて鋭意研究を重ねたところ、驚くべきこと
に、ＲＥＴ遺伝子が卵巣腫瘍細胞においても高率に発現
することを見出し、当該遺伝子産物が卵巣腫瘍のマーカ
ーとなることを明らかにした。従って、本発明の第１
は、（１）ＲＥＴ遺伝子産物からなる卵巣腫瘍マーカー
物質である。
伝子は神経芽細胞腫や多発性内分泌腫瘍（ＭＥＮ２型）
といった神経堤細胞由来の腫瘍で特異的に発現すること
が報告されてきたが、当該遺伝子は全ての腫瘍細胞にお
いて発現しているわけではなく、特に、当該遺伝子が卵
巣腫瘍細胞で発現していることは全く報告されていなか
った。本発明者等は、卵巣腫瘍細胞における有用なマー
カーについて鋭意研究を重ねたところ、驚くべきこと
に、ＲＥＴ遺伝子が卵巣腫瘍細胞においても高率に発現
することを見出し、当該遺伝子産物が卵巣腫瘍のマーカ
ーとなることを明らかにした。従って、本発明の第１
は、（１）ＲＥＴ遺伝子産物からなる卵巣腫瘍マーカー
物質である。
【０００９】該卵巣腫瘍マーカーの検査は、ＲＥＴ遺伝
子の発現を検出することにより実施するのが有利であ
る。当該発現の検出には、ＲＥＴ遺伝子の転写状態を検
出するＲＴ−ＰＣＲや、ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）
法、或いはＲＥＴ遺伝子産物を直接の検出対象とするイ
ムノアッセイや、当該翻訳産物に特異的に結合するペプ
チド、例えば、配列番号１９乃至配列番号２６のアミノ
酸配列を有するペプチドから選択される１以上のペプチ
ドを使用する方法が利用され得る。従って、本発明の第
２乃至６は、（２）ＲＥＴ遺伝子の発現を検出すること
を特徴とする、卵巣腫瘍マーカーの検査方法、（３）上
記ＲＥＴ遺伝子発現の検出が、ＲＥＴ遺伝子の転写物ま
たはその断片を特異的に増幅するプローブを用いたＲＴ
−ＰＣＲ法により行われる上記（２）の検査方法、
（４）上記ＲＥＴ遺伝子発現の検出が、ＦＩＳＨ法によ
り行われる上記（２）の検査方法、（５）上記ＲＥＴ遺
伝子発現の検出が、ＲＥＴ遺伝子産物に特異的に結合す
る抗体を用いたイムノアッセイ法により行われる上記
（２）の検査方法、および（６）上記ＲＥＴ遺伝子発現
の検出が、ＲＥＴ遺伝子産物に特異的に結合する配列番
号１９乃至配列番号２６のアミノ酸配列を有するペプチ
ドから選択される１以上のペプチドを用いて行われる上
記（２）の検査方法である。
子の発現を検出することにより実施するのが有利であ
る。当該発現の検出には、ＲＥＴ遺伝子の転写状態を検
出するＲＴ−ＰＣＲや、ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）
法、或いはＲＥＴ遺伝子産物を直接の検出対象とするイ
ムノアッセイや、当該翻訳産物に特異的に結合するペプ
チド、例えば、配列番号１９乃至配列番号２６のアミノ
酸配列を有するペプチドから選択される１以上のペプチ
ドを使用する方法が利用され得る。従って、本発明の第
２乃至６は、（２）ＲＥＴ遺伝子の発現を検出すること
を特徴とする、卵巣腫瘍マーカーの検査方法、（３）上
記ＲＥＴ遺伝子発現の検出が、ＲＥＴ遺伝子の転写物ま
たはその断片を特異的に増幅するプローブを用いたＲＴ
−ＰＣＲ法により行われる上記（２）の検査方法、
（４）上記ＲＥＴ遺伝子発現の検出が、ＦＩＳＨ法によ
り行われる上記（２）の検査方法、（５）上記ＲＥＴ遺
伝子発現の検出が、ＲＥＴ遺伝子産物に特異的に結合す
る抗体を用いたイムノアッセイ法により行われる上記
（２）の検査方法、および（６）上記ＲＥＴ遺伝子発現
の検出が、ＲＥＴ遺伝子産物に特異的に結合する配列番
号１９乃至配列番号２６のアミノ酸配列を有するペプチ
ドから選択される１以上のペプチドを用いて行われる上
記（２）の検査方法である。
【００１０】更に、卵巣腫瘍細胞におけるＲＥＴ遺伝子
の発現は、当該腫瘍細胞の悪性度や組織型を分類する指
標となり得る。従って、本発明の第７および８は、
（７）ＲＥＴ遺伝子の発現が、卵巣腫瘍細胞の悪性度の
指標となる（２）乃至（６）のいずれか１つに記載の検
査方法、および（８）ＲＥＴ遺伝子の発現が、卵巣腫瘍
細胞の組織型の指標となる（２）乃至（６）のいずれか
１つに記載の検査方法である。
の発現は、当該腫瘍細胞の悪性度や組織型を分類する指
標となり得る。従って、本発明の第７および８は、
（７）ＲＥＴ遺伝子の発現が、卵巣腫瘍細胞の悪性度の
指標となる（２）乃至（６）のいずれか１つに記載の検
査方法、および（８）ＲＥＴ遺伝子の発現が、卵巣腫瘍
細胞の組織型の指標となる（２）乃至（６）のいずれか
１つに記載の検査方法である。
【００１１】検査の試料としては、検査対象者から採取
した組織切片や、細胞、体液等を用いることができる
が、ＲＥＴ遺伝子の転写状態を検出する検査方法におい
ては患者（検査対象者）由来のバッフィーコートが有利
に使用される。また、ＲＥＴ遺伝子産物（翻訳産物）に
対する検査方法においては患者（検査対象者）由来の血
清または病理組織切片が有利に使用される。従って、本
発明の第９および１０は、（９）患者由来のバッフィー
コートを試料に用いることを特徴とする、上記（３）ま
たは（４）に記載の検査方法であり、
した組織切片や、細胞、体液等を用いることができる
が、ＲＥＴ遺伝子の転写状態を検出する検査方法におい
ては患者（検査対象者）由来のバッフィーコートが有利
に使用される。また、ＲＥＴ遺伝子産物（翻訳産物）に
対する検査方法においては患者（検査対象者）由来の血
清または病理組織切片が有利に使用される。従って、本
発明の第９および１０は、（９）患者由来のバッフィー
コートを試料に用いることを特徴とする、上記（３）ま
たは（４）に記載の検査方法であり、
【００１２】（１０）患者由来の血清または病理組織切
片を試料に用いることを特徴とする、上記（５）または
（６）に記載の検査方法である。
片を試料に用いることを特徴とする、上記（５）または
（６）に記載の検査方法である。
【００１３】上記検査は、当該検査に用いる試薬をキッ
トとすることで容易に行なうことができ、ＲＴ−ＰＣＲ
による検査キットには、ＲＥＴ遺伝子の転写物またはそ
の断片を特異的に増幅し得る１以上のプライマーが含ま
れ得る。当該プライマーの例としては配列番号１乃至１
８の塩基配列を有する核酸があげられる。従って、本発
明の第１１は、（１１）上記（３）の卵巣腫瘍マーカー
の検査のためのキットであって、該キットは、プライマ
ーとして配列番号１乃至１８の塩基配列を有する核酸か
ら選択される１以上の核酸を含むことを特徴とする、前
記キットである。
トとすることで容易に行なうことができ、ＲＴ−ＰＣＲ
による検査キットには、ＲＥＴ遺伝子の転写物またはそ
の断片を特異的に増幅し得る１以上のプライマーが含ま
れ得る。当該プライマーの例としては配列番号１乃至１
８の塩基配列を有する核酸があげられる。従って、本発
明の第１１は、（１１）上記（３）の卵巣腫瘍マーカー
の検査のためのキットであって、該キットは、プライマ
ーとして配列番号１乃至１８の塩基配列を有する核酸か
ら選択される１以上の核酸を含むことを特徴とする、前
記キットである。
【００１４】更に、イムノアッセイによる検査キットで
は、ＲＥＴに対する特異的な抗体、例えば、ＲＥＴに特
異的なモノクローナル抗体および／またはポリクローナ
ル抗体が含まれ得る。従って、本発明の第１２は、（１
２）上記（５）の卵巣腫瘍マーカーの検査のためのキッ
トであって、該キットは、ＲＥＴ遺伝子産物に対するモ
ノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を
含むことを特徴とする、前記キットである。
は、ＲＥＴに対する特異的な抗体、例えば、ＲＥＴに特
異的なモノクローナル抗体および／またはポリクローナ
ル抗体が含まれ得る。従って、本発明の第１２は、（１
２）上記（５）の卵巣腫瘍マーカーの検査のためのキッ
トであって、該キットは、ＲＥＴ遺伝子産物に対するモ
ノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を
含むことを特徴とする、前記キットである。
【００１５】また、ＲＥＴに特異的に結合するペプチド
を使用する方法のためのキットにおいては、そのように
ＲＥＴに特異的に結合するペプチド或いはその改変体が
キットに含まれてよく、当該ペプチドの例としては、配
列番号１９乃至配列番号２６のアミノ酸配列を有するペ
プチドがあげられる。従って、本発明の第１３は、（１
３）上記（６）に記載の卵巣腫瘍マーカーの検査のため
のキットであって、該キットは、配列番号１９乃至配列
番号２６のアミノ酸配列を有するペプチドから選択され
る１以上のペプチドを含むことを特徴とする、前記キッ
トである。
を使用する方法のためのキットにおいては、そのように
ＲＥＴに特異的に結合するペプチド或いはその改変体が
キットに含まれてよく、当該ペプチドの例としては、配
列番号１９乃至配列番号２６のアミノ酸配列を有するペ
プチドがあげられる。従って、本発明の第１３は、（１
３）上記（６）に記載の卵巣腫瘍マーカーの検査のため
のキットであって、該キットは、配列番号１９乃至配列
番号２６のアミノ酸配列を有するペプチドから選択され
る１以上のペプチドを含むことを特徴とする、前記キッ
トである。
【００１６】前述の如く、ＲＥＴ遺伝子は卵巣腫瘍細胞
において高率で発現していることが今や明らかとなり、
従って、卵巣腫瘍マーカー物質であるＲＥＴが卵巣腫瘍
治療のための標的分子として利用できることが示され
た。すなわち、本発明の別の側面によれば、卵巣腫瘍マ
ーカー物質としてのＲＥＴを標的分子とした卵巣腫瘍治
療のための医薬が提供され、ＲＥＴに特異的に結合する
抗体或いはＲＥＴに特異的に結合するペプチドは当該医
薬の活性成分をＲＥＴ遺伝子発現細胞に指向させ得る。
従って、本発明の第１４は、（１４）卵巣腫瘍を治療す
るための医薬であって、該医薬は、ＲＥＴ遺伝子産物に
対する特異的抗体にコンジュゲートするか、或いは配列
番号１９乃至配列番号２６のアミノ酸配列を有するペプ
チドから選択されるペプチドにコンジュゲートした制癌
化合物を含むことを特徴とする、前記医薬である。
において高率で発現していることが今や明らかとなり、
従って、卵巣腫瘍マーカー物質であるＲＥＴが卵巣腫瘍
治療のための標的分子として利用できることが示され
た。すなわち、本発明の別の側面によれば、卵巣腫瘍マ
ーカー物質としてのＲＥＴを標的分子とした卵巣腫瘍治
療のための医薬が提供され、ＲＥＴに特異的に結合する
抗体或いはＲＥＴに特異的に結合するペプチドは当該医
薬の活性成分をＲＥＴ遺伝子発現細胞に指向させ得る。
従って、本発明の第１４は、（１４）卵巣腫瘍を治療す
るための医薬であって、該医薬は、ＲＥＴ遺伝子産物に
対する特異的抗体にコンジュゲートするか、或いは配列
番号１９乃至配列番号２６のアミノ酸配列を有するペプ
チドから選択されるペプチドにコンジュゲートした制癌
化合物を含むことを特徴とする、前記医薬である。
【００１７】前記医薬の活性成分或いは制癌化合物とし
ては、それ自体当業者に周知のいかなるものをも用いる
ことができるが、典型的に、当該制癌化合物は、タキソ
ール、シスプラチン、アドリアマイシン、エピルビシ
ン、サイクロフォスファマイドおよびカンプトテシンか
らなる群から選択される。従って、本発明の第１５は、
（１５）制癌化合物が、タキソール、シスプラチン、ア
ドリアマイシン、エピルビシン、サイクロフォスファマ
イドおよびカンプトテシンからなる群から選択される上
記（１４）の医薬である。
ては、それ自体当業者に周知のいかなるものをも用いる
ことができるが、典型的に、当該制癌化合物は、タキソ
ール、シスプラチン、アドリアマイシン、エピルビシ
ン、サイクロフォスファマイドおよびカンプトテシンか
らなる群から選択される。従って、本発明の第１５は、
（１５）制癌化合物が、タキソール、シスプラチン、ア
ドリアマイシン、エピルビシン、サイクロフォスファマ
イドおよびカンプトテシンからなる群から選択される上
記（１４）の医薬である。
【００１８】更に、ＲＥＴに特異的に結合する抗体或い
はＲＥＴに特異的に結合するペプチドは、いわゆる遺伝
子治療において、治療のための遺伝子を、ＲＥＴ遺伝子
を発現する腫瘍細胞に対して特異的に導入することを可
能にする。従って、本発明の第１６は、（１６）腫瘍を
治療するための医薬であって、該医薬は、ＲＥＴ遺伝子
産物に対する特異的抗体にコンジュゲートするか、或い
は配列番号１９乃至配列番号２６のアミノ酸配列を有す
るペプチドから選択されるペプチドにコンジュゲートし
たＲＥＴ遺伝子の発現を阻害しうる核酸を含むことを特
徴とする、前記医薬である。
はＲＥＴに特異的に結合するペプチドは、いわゆる遺伝
子治療において、治療のための遺伝子を、ＲＥＴ遺伝子
を発現する腫瘍細胞に対して特異的に導入することを可
能にする。従って、本発明の第１６は、（１６）腫瘍を
治療するための医薬であって、該医薬は、ＲＥＴ遺伝子
産物に対する特異的抗体にコンジュゲートするか、或い
は配列番号１９乃至配列番号２６のアミノ酸配列を有す
るペプチドから選択されるペプチドにコンジュゲートし
たＲＥＴ遺伝子の発現を阻害しうる核酸を含むことを特
徴とする、前記医薬である。
【００１９】上記から明らかなように、本発明のＲＥＴ
遺伝子産物からなる卵巣腫瘍マーカー物質は、卵巣腫瘍
の診断における指標となり得、またそれを標的分子とし
た腫瘍の治療方法をも提供する。
遺伝子産物からなる卵巣腫瘍マーカー物質は、卵巣腫瘍
の診断における指標となり得、またそれを標的分子とし
た腫瘍の治療方法をも提供する。
【００２０】
【発明の実施の形態】本発明のＲＥＴ遺伝子産物、すな
わちＲＥＴは、ＲＥＴ遺伝子によりコードされるポリペ
プチドであり、種々のグリコシル化度の相違する類縁体
が知られている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ ａ
ｌ．， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｒｅｔ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕ
ｃｔｓｉｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ａｎｄ ｌ
ｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，
６：２９７−３０１，１９９７）。後述の実施例に記
載するように、卵巣癌細胞株２００８およびＤ２４０か
ら得たＲＥＴは１３０ｋＤａの分子量を有していたが、
神経芽細胞種株（ＮＢ−３９−ｎｕ）由来のＲＥＴでは
その分子量が１５０および１７０ｋＤａと見積もられ、
これらは上記のとおり、そのグリコシル化の度合いの相
違を反映しているものと考えられる。そして、このよう
に、そのグリコシル化度が相違するＲＥＴやグリコシル
化されないＲＥＴも本発明のＲＥＴに含まれる。また、
卵巣癌細胞株２００８から得たＲＥＴのエキソン１０、
１１および１３〜１６での塩基配列分析の結果、当該細
胞種からのＲＥＴにおいては突然変異が認められず、当
該部分の塩基配列は正常なＲＥＴの配列と一致していた
が、上記のように、ある種の細胞ではＲＥＴの点突然変
異が観察されており、例えば、エキソン１０、１１およ
び１３〜１６以外の領域において突然変異を有するよう
なＲＥＴも本発明のＲＥＴに含まれる。なお、ＲＥＴプ
ロト癌遺伝子ｃＤＮＡは、国立国際医療センター難治性
疾患研究部（東京）より入手可能である。
わちＲＥＴは、ＲＥＴ遺伝子によりコードされるポリペ
プチドであり、種々のグリコシル化度の相違する類縁体
が知られている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ ａ
ｌ．， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｒｅｔ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕ
ｃｔｓｉｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ａｎｄ ｌ
ｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，
６：２９７−３０１，１９９７）。後述の実施例に記
載するように、卵巣癌細胞株２００８およびＤ２４０か
ら得たＲＥＴは１３０ｋＤａの分子量を有していたが、
神経芽細胞種株（ＮＢ−３９−ｎｕ）由来のＲＥＴでは
その分子量が１５０および１７０ｋＤａと見積もられ、
これらは上記のとおり、そのグリコシル化の度合いの相
違を反映しているものと考えられる。そして、このよう
に、そのグリコシル化度が相違するＲＥＴやグリコシル
化されないＲＥＴも本発明のＲＥＴに含まれる。また、
卵巣癌細胞株２００８から得たＲＥＴのエキソン１０、
１１および１３〜１６での塩基配列分析の結果、当該細
胞種からのＲＥＴにおいては突然変異が認められず、当
該部分の塩基配列は正常なＲＥＴの配列と一致していた
が、上記のように、ある種の細胞ではＲＥＴの点突然変
異が観察されており、例えば、エキソン１０、１１およ
び１３〜１６以外の領域において突然変異を有するよう
なＲＥＴも本発明のＲＥＴに含まれる。なお、ＲＥＴプ
ロト癌遺伝子ｃＤＮＡは、国立国際医療センター難治性
疾患研究部（東京）より入手可能である。
【００２１】前述の如く、腫瘍細胞におけるＲＥＴ遺伝
子の発現は、神経堤細胞由来の腫瘍細胞で特異的と考え
られてきたが、当該遺伝子は、卵巣腫瘍細胞、特に卵巣
癌細胞で高率に発現していることが明らかとなった。す
なわち、４種の卵巣癌細胞株の全てで、抗ＲＥＴモノク
ローナル抗体を用いた免疫染色の結果は陽性であり、ま
た、ＲＥＴのＣ末端ペプチドに対する家兎血清を用いた
免疫組織化学的解析により検査した手術検体における免
疫染色の陽性率は、卵巣癌で６１.１％、境界悪性卵巣
腫瘍で４０％、良性卵巣腫瘍で２０.７％であり、卵巣
癌の組織型別陽性率は、明細胞腺癌で７５.９％、漿液
性腺癌で３３.３％、粘液性腺癌で７３.７％、類内膜腺
癌で６６.６％、未分化癌で５０.０％および悪性混合性
上皮性腫瘍では１００％であった。従って、ＲＥＴは、
卵巣腫瘍、特に卵巣癌のマーカーとして利用することが
でき、ＲＥＴ遺伝子の発現について検査することで、卵
巣癌の迅速な診断が可能となる。また、卵巣腫瘍におけ
る当該遺伝子の発現の検査は、卵巣腫瘍の悪性度や卵巣
癌の組織型の判定の指標とすることができる。
子の発現は、神経堤細胞由来の腫瘍細胞で特異的と考え
られてきたが、当該遺伝子は、卵巣腫瘍細胞、特に卵巣
癌細胞で高率に発現していることが明らかとなった。す
なわち、４種の卵巣癌細胞株の全てで、抗ＲＥＴモノク
ローナル抗体を用いた免疫染色の結果は陽性であり、ま
た、ＲＥＴのＣ末端ペプチドに対する家兎血清を用いた
免疫組織化学的解析により検査した手術検体における免
疫染色の陽性率は、卵巣癌で６１.１％、境界悪性卵巣
腫瘍で４０％、良性卵巣腫瘍で２０.７％であり、卵巣
癌の組織型別陽性率は、明細胞腺癌で７５.９％、漿液
性腺癌で３３.３％、粘液性腺癌で７３.７％、類内膜腺
癌で６６.６％、未分化癌で５０.０％および悪性混合性
上皮性腫瘍では１００％であった。従って、ＲＥＴは、
卵巣腫瘍、特に卵巣癌のマーカーとして利用することが
でき、ＲＥＴ遺伝子の発現について検査することで、卵
巣癌の迅速な診断が可能となる。また、卵巣腫瘍におけ
る当該遺伝子の発現の検査は、卵巣腫瘍の悪性度や卵巣
癌の組織型の判定の指標とすることができる。
【００２２】このようなＲＥＴ遺伝子産物からなる卵巣
腫瘍マーカーの検査は、細胞におけるＲＥＴ遺伝子の発
現を検出することで行ない得るが、当該検出には、ＲＥ
Ｔ遺伝子の転写状態を対象とするＲＴ−ＰＣＲ、ＦＩＳ
Ｈ法、或いはＲＥＴ遺伝子産物自体の生成を測定するイ
ムノアッセイ若しくはＲＥＴ特異的結合ペプチドを使用
する方法を利用するのが有利である。
腫瘍マーカーの検査は、細胞におけるＲＥＴ遺伝子の発
現を検出することで行ない得るが、当該検出には、ＲＥ
Ｔ遺伝子の転写状態を対象とするＲＴ−ＰＣＲ、ＦＩＳ
Ｈ法、或いはＲＥＴ遺伝子産物自体の生成を測定するイ
ムノアッセイ若しくはＲＥＴ特異的結合ペプチドを使用
する方法を利用するのが有利である。
【００２３】ＲＴ−ＰＣＲは、典型的に、まず、被検試
料中のＲＥＴ遺伝子転写物であるＲＥＴ ｍＲＮＡまた
はその断片に関して、逆転写酵素により当該ＲＮＡに相
補的な一本鎖ＤＮＡ合成し、ついで、当該ＤＮＡまたは
その断片を特異的に増幅可能なプライマーを用いて該Ｄ
ＮＡまたはその断片をＲＣＲ増幅した後、得られるＤＮ
Ａを電気泳動等に供して検出することで実施される。Ｒ
Ｔ−ＰＣＲの具体的な手法としては当業者に周知の種々
のものが利用可能で、例えば、ｌｉｎｅｒａＲＴ−ＰＣ
Ｒ法なども用いることができ、また、「Ｉｓｈｉｋａｗ
ａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｒ
ｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｇ
ｅｎｅｓ ｉｎ ｓｅｖｅｒａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ａ
ｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｉｎ
ｎｏｒｍａｌ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｂｌｏｏｄｂ
ｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．，
Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２８：７２３
−７２８，１９９８」に報告されている方法に準じて実
施することができる。なお、本発明のＲＴ−ＰＣＲに使
用し得るプライマーの例としては、以下のものがあげら
れる。
料中のＲＥＴ遺伝子転写物であるＲＥＴ ｍＲＮＡまた
はその断片に関して、逆転写酵素により当該ＲＮＡに相
補的な一本鎖ＤＮＡ合成し、ついで、当該ＤＮＡまたは
その断片を特異的に増幅可能なプライマーを用いて該Ｄ
ＮＡまたはその断片をＲＣＲ増幅した後、得られるＤＮ
Ａを電気泳動等に供して検出することで実施される。Ｒ
Ｔ−ＰＣＲの具体的な手法としては当業者に周知の種々
のものが利用可能で、例えば、ｌｉｎｅｒａＲＴ−ＰＣ
Ｒ法なども用いることができ、また、「Ｉｓｈｉｋａｗ
ａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｒ
ｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｇ
ｅｎｅｓ ｉｎ ｓｅｖｅｒａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ａ
ｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｉｎ
ｎｏｒｍａｌ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｂｌｏｏｄｂ
ｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．，
Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２８：７２３
−７２８，１９９８」に報告されている方法に準じて実
施することができる。なお、本発明のＲＴ−ＰＣＲに使
用し得るプライマーの例としては、以下のものがあげら
れる。
【００２４】
ａｇａｔｃｃｔｇｇａｇｇａｔｃｃａａａｇ （配列番号１）
ｇｔａｔｔｔｇｇｃｇｔａｃｔｃｃａｃｇａ （配列番号２）
ａｔｔｔｇｃｃｔｇｇｃａｇａｔｃｔｃａｃ （配列番号３）
ｃａｃａｇｃａｇｇａｃａｃｃａａａａｇａ （配列番号４）
ｃａｃｃａｔｇｇｇｃｇａｃｃｔｃａｔ （配列番号５）
ｇａｃａａｇｃｃｇａａａｔｃｃｇａａａｔｃ （配列番号６）
ｇｃｃｔｇｇａｇａｇａｇｔｃｃｔｇｔａｃｃａ （配列番号７）
ｔｇａｇｇｇｔｇａａａｇｃａｔｃｃａｇｔｔａ （配列番号８）
ｔｔｔｇｃｃｔｇｇｃａｇａｔｃｔｃａｃａ （配列番号９）
ａｇｃｃｇａａａｔｃｃｇａａａｔｃｔｔｃａ （配列番号１０）
ｇａｃｃｇｔａｃａｔｇａｃｔａｔａｇｇｃｔｇｇｔｔ （配列番号１１）
ｇｃｃｃｔｇｇａａｇｔｃｔｇａｇｔｃａｔｔｇ （配列番号１２）
ｇｔｇａｇｇｃｃａａｇｇｃｔｔｇｇａｔ （配列番号１３）
ｔｇｔｃｃａａｔａａｇｃａｔｔｔｔｔｃａａａｃｔｃｔ（配列番号１４）
ｃｔｇｇａｇｔｔｃａａｇｃｇｇａａｇｇａ （配列番号１５）
ｃｔｃｃｃｃｔｇａｔｇｃａｇｇｔａｃｃａ （配列番号１６）
ｇｇａｔｇｇａｇａｇｇｃｃａｇａｃａａｃｔ （配列番号１７）
ｇｇｃｔｃｃｔｇｃｔｔｃｃａｇｃａｔｔ （配列番号１８）
上記の配列はＲＥＴ遺伝子のｃＤＮＡに含まれるもので
あり、具体的に、配列番号１は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮ
Ａの２３０６位、配列番号２は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮ
Ａの２５８５位、配列番号３は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮ
Ａの２７３６位、配列番号４は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮ
Ａの２９８２位、配列番号５は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮ
Ａの２７３３位、配列番号６は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮ
Ａの２８６１位、配列番号７は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮ
Ａの３４０２位、配列番号８は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮ
Ａの３４８５位、配列番号９は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮ
Ａの２７５５位、配列番号１０は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤ
ＮＡの２８５７位、配列番号１１は、ＲＥＴ遺伝子のｃ
ＤＮＡの１２４２位、配列番号１２は、ＲＥＴ遺伝子の
ｃＤＮＡの１３２２位、配列番号１３は、ＲＥＴ遺伝子
のｃＤＮＡの３７７６位、配列番号１４は、ＲＥＴ遺伝
子のｃＤＮＡの３８３９位、配列番号１５は、ＲＥＴ遺
伝子のｃＤＮＡの１０４２位、配列番号１６は、ＲＥＴ
遺伝子のｃＤＮＡの１１０２位、配列番号１７は、ＲＥ
Ｔ遺伝子のｃＤＮＡの３１０１位、および配列番号１８
は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮＡの３１５１位から始まる配
列、或いはそれに相補的な配列（偶数の配列番号を有す
る）に、夫々、対応する。なお、これらのプライマー
は、例えば、ホスホアミダイド法等の化学的合成手段に
より、上記の配列をもとにして容易に調製することがで
きる。
あり、具体的に、配列番号１は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮ
Ａの２３０６位、配列番号２は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮ
Ａの２５８５位、配列番号３は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮ
Ａの２７３６位、配列番号４は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮ
Ａの２９８２位、配列番号５は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮ
Ａの２７３３位、配列番号６は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮ
Ａの２８６１位、配列番号７は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮ
Ａの３４０２位、配列番号８は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮ
Ａの３４８５位、配列番号９は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮ
Ａの２７５５位、配列番号１０は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤ
ＮＡの２８５７位、配列番号１１は、ＲＥＴ遺伝子のｃ
ＤＮＡの１２４２位、配列番号１２は、ＲＥＴ遺伝子の
ｃＤＮＡの１３２２位、配列番号１３は、ＲＥＴ遺伝子
のｃＤＮＡの３７７６位、配列番号１４は、ＲＥＴ遺伝
子のｃＤＮＡの３８３９位、配列番号１５は、ＲＥＴ遺
伝子のｃＤＮＡの１０４２位、配列番号１６は、ＲＥＴ
遺伝子のｃＤＮＡの１１０２位、配列番号１７は、ＲＥ
Ｔ遺伝子のｃＤＮＡの３１０１位、および配列番号１８
は、ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮＡの３１５１位から始まる配
列、或いはそれに相補的な配列（偶数の配列番号を有す
る）に、夫々、対応する。なお、これらのプライマー
は、例えば、ホスホアミダイド法等の化学的合成手段に
より、上記の配列をもとにして容易に調製することがで
きる。
【００２５】ＲＴ−ＰＣＲによる検出のためのキットの
使用は、測定者が検査を実施する際に好都合である。当
該キットには、ＲＥＴのｍＲＮＡから一本鎖ＤＮＡを得
るためのプライマーおよび当該ＤＮＡまたはその断片を
特異的に増幅するＲＥＴ特異的プライマーが含まれ得、
当該プライマーの例としては、上記配列番号１乃至１８
の塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。キットには、
その他、ＲＮａｓｅＨ阻害剤や、逆転写酵素、ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ等が含まれてよく、そのようなキット
の構成や作製方法は当業者によく知られている。
使用は、測定者が検査を実施する際に好都合である。当
該キットには、ＲＥＴのｍＲＮＡから一本鎖ＤＮＡを得
るためのプライマーおよび当該ＤＮＡまたはその断片を
特異的に増幅するＲＥＴ特異的プライマーが含まれ得、
当該プライマーの例としては、上記配列番号１乃至１８
の塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。キットには、
その他、ＲＮａｓｅＨ阻害剤や、逆転写酵素、ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ等が含まれてよく、そのようなキット
の構成や作製方法は当業者によく知られている。
【００２６】更に、ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法
も、ＲＥＴ遺伝子の転写状態の検出に用いることができ
る。当該方法に用いることのできるプローブの例とし
て、ＦＩＴＣ若しくはＣｙ５で標識されたＲＥＴコスミ
ド・クローンをあげることができ、当該コスミド・クロ
ーンは、健常人の抹消血ＤＮＡより抽出したコスミド・
ライブラリーより調製することができ、詳細は、Ｏｎｃ
ｏｇｅｎｅ Ｒｅｓ．， ３：１９３−１９７，１９８
８を参照されたい。また、ＦＩＳＨ法による検出は、上
記のコスミド・クローンにより、文献記載の方法に準じ
て行なうことができる（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｎｕｃｌｅｉ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｗｉｔｈｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｂｒｅａｋ ａｎｄ
ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃａｕｓｅ
ｄ ｂｙ Ｖｐｒ， ａｎ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｇｅ
ｎｅｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎ
ｃｙ ｖｉｒｕｓ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５
９：２２５９−２２６４，１９９９）。
ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法
も、ＲＥＴ遺伝子の転写状態の検出に用いることができ
る。当該方法に用いることのできるプローブの例とし
て、ＦＩＴＣ若しくはＣｙ５で標識されたＲＥＴコスミ
ド・クローンをあげることができ、当該コスミド・クロ
ーンは、健常人の抹消血ＤＮＡより抽出したコスミド・
ライブラリーより調製することができ、詳細は、Ｏｎｃ
ｏｇｅｎｅ Ｒｅｓ．， ３：１９３−１９７，１９８
８を参照されたい。また、ＦＩＳＨ法による検出は、上
記のコスミド・クローンにより、文献記載の方法に準じ
て行なうことができる（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｎｕｃｌｅｉ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｗｉｔｈｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｂｒｅａｋ ａｎｄ
ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃａｕｓｅ
ｄ ｂｙ Ｖｐｒ， ａｎ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｇｅ
ｎｅｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎ
ｃｙ ｖｉｒｕｓ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５
９：２２５９−２２６４，１９９９）。
【００２７】上記のＲＴ−ＰＣＲやＦＩＳＨ法による、
ＲＥＴ遺伝子の転写状態を検出する方法においては、被
検試料として、患者由来のバッフィーコートを用いるの
が有利である。バッフィーコートは、患者由来の血液を
遠心分離した際、遠心管の最下層の赤血球層と最上層で
ある血清層の間に位置する、主に白血球などの細胞から
なる層であるが、当該層には血液中に存在する腫瘍細胞
も含まれ、従って、当該バッフィーコートは、上記ＲＴ
−ＰＣＲやＦＩＳＨ法による検査のための好適な被検試
料となる。従って、バッフィーコートによる検査では、
患者の血液を定法どおり遠心分離し、赤血球層と血清層
の間に位置するバッフィーコートを採取し、これをＲＴ
−ＰＣＲやＦＩＳＨ法の被検試料とすればよい。
ＲＥＴ遺伝子の転写状態を検出する方法においては、被
検試料として、患者由来のバッフィーコートを用いるの
が有利である。バッフィーコートは、患者由来の血液を
遠心分離した際、遠心管の最下層の赤血球層と最上層で
ある血清層の間に位置する、主に白血球などの細胞から
なる層であるが、当該層には血液中に存在する腫瘍細胞
も含まれ、従って、当該バッフィーコートは、上記ＲＴ
−ＰＣＲやＦＩＳＨ法による検査のための好適な被検試
料となる。従って、バッフィーコートによる検査では、
患者の血液を定法どおり遠心分離し、赤血球層と血清層
の間に位置するバッフィーコートを採取し、これをＲＴ
−ＰＣＲやＦＩＳＨ法の被検試料とすればよい。
【００２８】一方、ＲＥＴ遺伝子の発現は、ＲＥＴ遺伝
子産物、すなわちＲＥＴの生成として検出することもで
き、当該検出にはイムノアッセイが好適に応用される。
具体的に、例えば、患者由来の血清を試料としたサンド
ウイッチアッセイや競合アッセイ法、或いは病理組織切
片を試料とした免疫染色法等が利用可能である。イムノ
アッセイにはＲＥＴ遺伝子産物に対する抗血清や抗体類
が用いられる。これらの抗血清或いは抗体はＲＥＴ遺伝
子産物に特異的であればいかなるものを用いてもよく、
抗体類の例としては、ＲＥＴ遺伝子産物に特異的なポリ
クローナル抗体、モノクローナル抗体のほか、それら抗
体のフラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａ
ｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆ
（ｖ）フラグメント、Ｈ鎖モノマー又はダイマー、Ｌ鎖
モノマー又はダイマー、１個のＨ鎖及び１個のＬ鎖から
なるダイマー等もあげられる。これらの抗血清或いは抗
体の製造法も当業者に周知である。具体的に、抗血清
は、例えば、アジュバントと共に抗原（ＲＥＴ或いはＲ
ＥＴのフラグメント）を免疫動物に皮下注射し、当該皮
下投与を適当な間隔（例えば２週間）で所定の回数（例
えば４回）繰り返し、最終免疫後に全血を採集して、こ
れを分離することで得ることができる。そのような方法
は、「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ Ｉ
ＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第２.４章（発行元：Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ．,Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ）」等に記載されている。ポリクローナル抗体は、上
記抗血清からのＩｇＧ画分を精製することにより得ら
れ、例えば、「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ
ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第２.７章（発行元：Ｊ
ｏｈｎＷｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ．,Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ）」記載の方法を利用することができる。モノク
ローナル抗体は、抗原により免疫化した哺乳動物から得
たリンパ球（典型的には脾臓細胞）を特定の不死化細胞
（典型的には骨髄腫細胞）に融合し、生じたハイブリド
ーマ細胞の培養上清を、当該抗原に関してスクリーニン
グすることで得られる（Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９
５−４９７，１９７５参照）。また、抗体のフラグメン
トは、例えばペプシンやパパイン等のプロテアーゼによ
り完全な抗体を消化するか、消化後、必要に応じて還元
剤で処理することにより得ることができる。Ｈ鎖及びＬ
鎖モノマーは、完全な抗体をジチオスレイトール等の還
元剤で処理した後、精製した鎖状体を分離することによ
り得ることもできる。
子産物、すなわちＲＥＴの生成として検出することもで
き、当該検出にはイムノアッセイが好適に応用される。
具体的に、例えば、患者由来の血清を試料としたサンド
ウイッチアッセイや競合アッセイ法、或いは病理組織切
片を試料とした免疫染色法等が利用可能である。イムノ
アッセイにはＲＥＴ遺伝子産物に対する抗血清や抗体類
が用いられる。これらの抗血清或いは抗体はＲＥＴ遺伝
子産物に特異的であればいかなるものを用いてもよく、
抗体類の例としては、ＲＥＴ遺伝子産物に特異的なポリ
クローナル抗体、モノクローナル抗体のほか、それら抗
体のフラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａ
ｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆ
（ｖ）フラグメント、Ｈ鎖モノマー又はダイマー、Ｌ鎖
モノマー又はダイマー、１個のＨ鎖及び１個のＬ鎖から
なるダイマー等もあげられる。これらの抗血清或いは抗
体の製造法も当業者に周知である。具体的に、抗血清
は、例えば、アジュバントと共に抗原（ＲＥＴ或いはＲ
ＥＴのフラグメント）を免疫動物に皮下注射し、当該皮
下投与を適当な間隔（例えば２週間）で所定の回数（例
えば４回）繰り返し、最終免疫後に全血を採集して、こ
れを分離することで得ることができる。そのような方法
は、「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ Ｉ
ＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第２.４章（発行元：Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ．,Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ）」等に記載されている。ポリクローナル抗体は、上
記抗血清からのＩｇＧ画分を精製することにより得ら
れ、例えば、「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ
ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第２.７章（発行元：Ｊ
ｏｈｎＷｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ．,Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ）」記載の方法を利用することができる。モノク
ローナル抗体は、抗原により免疫化した哺乳動物から得
たリンパ球（典型的には脾臓細胞）を特定の不死化細胞
（典型的には骨髄腫細胞）に融合し、生じたハイブリド
ーマ細胞の培養上清を、当該抗原に関してスクリーニン
グすることで得られる（Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９
５−４９７，１９７５参照）。また、抗体のフラグメン
トは、例えばペプシンやパパイン等のプロテアーゼによ
り完全な抗体を消化するか、消化後、必要に応じて還元
剤で処理することにより得ることができる。Ｈ鎖及びＬ
鎖モノマーは、完全な抗体をジチオスレイトール等の還
元剤で処理した後、精製した鎖状体を分離することによ
り得ることもできる。
【００２９】抗原としては、ＲＥＴや組替え体ＲＥＴ、
或いはＲＥＴのＣ末端の２０アミノ酸残基からなるポリ
ペプチドが利用できる。好ましいポリクローナル抗体
は、ＲＥＴのＣ末端の２０アミノ酸残基からなるポリペ
プチドを用いて製造され、本発明者らが先に報告した論
文（Ｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｙ．，Ｓｈｉｍａ，Ｈ．，Ｓｕ
ｇｉｍｕｒａ，Ｔ． ａｎｄ Ｎａｇａｏ，Ｍ．， Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ
ｒｅｔＴＰＣ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ
ｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，
７：１４４１−１４４４，１９９２）に記載されてい
る。好ましいモノクローナル抗体は、ＲＥＴの組替えタ
ンパク質に関して得られ、本発明者らが、最近、報告し
た論文（Ｙａｎｏ，Ｌ．，Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｔａ
ｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｙ．，Ｓｕｚ
ｕｋｉ，Ｔ．，Ｈａｔａｋｅ，Ｋ．，Ｔａｋａｋｕ，
Ｆ．ａｎｄ Ｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｙ．， Ｉｍｐｒｏｖ
ｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｎｅｕｒｏ
ｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ
ＲＥＴ， ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｕｒｏｓｉｎｅ
ｋｉｎａｓｅ．， Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，
１１：９９５−１００４，２０００）の方法に基づいて
調製することができる。これらの論文は、参照すること
で本明細書に組み込まれる。
或いはＲＥＴのＣ末端の２０アミノ酸残基からなるポリ
ペプチドが利用できる。好ましいポリクローナル抗体
は、ＲＥＴのＣ末端の２０アミノ酸残基からなるポリペ
プチドを用いて製造され、本発明者らが先に報告した論
文（Ｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｙ．，Ｓｈｉｍａ，Ｈ．，Ｓｕ
ｇｉｍｕｒａ，Ｔ． ａｎｄ Ｎａｇａｏ，Ｍ．， Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ
ｒｅｔＴＰＣ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ
ｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，
７：１４４１−１４４４，１９９２）に記載されてい
る。好ましいモノクローナル抗体は、ＲＥＴの組替えタ
ンパク質に関して得られ、本発明者らが、最近、報告し
た論文（Ｙａｎｏ，Ｌ．，Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｔａ
ｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｙ．，Ｓｕｚ
ｕｋｉ，Ｔ．，Ｈａｔａｋｅ，Ｋ．，Ｔａｋａｋｕ，
Ｆ．ａｎｄ Ｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｙ．， Ｉｍｐｒｏｖ
ｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｎｅｕｒｏ
ｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ
ＲＥＴ， ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｕｒｏｓｉｎｅ
ｋｉｎａｓｅ．， Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，
１１：９９５−１００４，２０００）の方法に基づいて
調製することができる。これらの論文は、参照すること
で本明細書に組み込まれる。
【００３０】上記の抗体類は、免疫組織染色或いはサン
ドウイッチアッセイのために標識され得る。放射性物
質、金コロイドなどの着色粒子、蛍光または化学発光標
識、或いは酵素（ＥＬＩＳＡ用）で標識すれば検出抗体
として使用することができる。抗体の標識の方法として
は当業者にとって周知のいかなる方法も採用することが
でき、例えば、「Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．１１、
３９５〜３９９頁（１９７９年）」「Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．ｖｏｌ．１４、４１〜５７頁（１９８２年）」「Ｉ
ｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｒｅｌ
ａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
Ｐｒｅｓｓ、２１５〜２２５頁（１９７８年））」記
載の方法を利用することができる。なお、競合アッセイ
においては、ＲＥＴや組替え体ＲＥＴ、或いはＲＥＴの
Ｃ末端の２０アミノ酸残基からなるポリペプチド等、Ｒ
ＥＴ特異的抗体の抗原となり得るものが標識され得、当
該標識方法も当業者に周知である。また、サンドウイッ
チアッセイや競合アッセイにおいては、上記の抗体類が
固体支持体に固相化されることが好ましく、当該抗体類
は、例えば、炭酸緩衝液（ｐＨ９.６）にそれらを溶解
し、該溶液をマイクロプレートのウェルに添加して所定
時間インキュベートすることで固相化できる。イムノア
ッセイによる測定は、上記の抗血清或いは抗体類とＲＥ
Ｔの免疫複合体を検出することで行なわれる。病理組織
切片などの免疫染色では、ＲＥＴ特異的抗体をパラフィ
ン包埋切片と接触させ、生じた免疫複合体を、例えばＣ
ＳＡ ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｋｏ社製）により、当該シス
テムの製造者の指示に従って検出することができる。患
者血清を試料としたサンドウイッチアッセイでは、上記
の抗体類がウェル底面などの固相のコーティングに用い
られてキャプチャー側抗体を提供し、もう一方の抗体が
放射性物質や着色粒子又は酵素で標識されて検出側抗体
を提供する。キャプチャー側抗体を有するウェル内に試
料としての患者血清或いはその希釈液が添加され、所定
時間インキュベートされた後、該試料液をウェルから取
り除き、好適な緩衝液等によりウェル内を充分に洗浄
後、検出側の抗体がウェルに添加される。所定のインキ
ュベーションの後、ウェル内を洗浄し、キャプチャー側
抗体−測定対象物−検出側抗体複合体の生成を検出す
る。検出は、検出側抗体に標識された標識物質の性質に
依存し、放射性標識であれば放射線量が、着色粒子標識
であれば発色量や吸光度が、また酵素標識（ＥＬＩＳＡ
法）であれば、更に適当な基質をウェルに添加し、所定
のインキュベーション後の吸光度が検出される。なお、
上記ＥＬＩＳＡ法で酵素標識に用いる酵素に特に制限は
なく、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリ性
フォスファターゼ等の酵素が有利に使用される。西洋ワ
サビペルオキシダーゼで標識する場合は、当該酵素の基
質として３,３’,５,５’−テトラメチルベンチジン等
がその基質として利用可能である。アルカリ性フォスフ
ァターゼを使用する場合は、基質としてｐ−ニトロフェ
ニル燐酸が基質としてあげられる。なお、競合アッセイ
では、上記標識抗体の代わりに標識されたＲＥＴまたは
その免疫学的等価物が使用され、該物質と試料中の被検
物質との特異的抗体結合に関する競合が測定される。
ドウイッチアッセイのために標識され得る。放射性物
質、金コロイドなどの着色粒子、蛍光または化学発光標
識、或いは酵素（ＥＬＩＳＡ用）で標識すれば検出抗体
として使用することができる。抗体の標識の方法として
は当業者にとって周知のいかなる方法も採用することが
でき、例えば、「Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．１１、
３９５〜３９９頁（１９７９年）」「Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．ｖｏｌ．１４、４１〜５７頁（１９８２年）」「Ｉ
ｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｒｅｌ
ａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
Ｐｒｅｓｓ、２１５〜２２５頁（１９７８年））」記
載の方法を利用することができる。なお、競合アッセイ
においては、ＲＥＴや組替え体ＲＥＴ、或いはＲＥＴの
Ｃ末端の２０アミノ酸残基からなるポリペプチド等、Ｒ
ＥＴ特異的抗体の抗原となり得るものが標識され得、当
該標識方法も当業者に周知である。また、サンドウイッ
チアッセイや競合アッセイにおいては、上記の抗体類が
固体支持体に固相化されることが好ましく、当該抗体類
は、例えば、炭酸緩衝液（ｐＨ９.６）にそれらを溶解
し、該溶液をマイクロプレートのウェルに添加して所定
時間インキュベートすることで固相化できる。イムノア
ッセイによる測定は、上記の抗血清或いは抗体類とＲＥ
Ｔの免疫複合体を検出することで行なわれる。病理組織
切片などの免疫染色では、ＲＥＴ特異的抗体をパラフィ
ン包埋切片と接触させ、生じた免疫複合体を、例えばＣ
ＳＡ ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｋｏ社製）により、当該シス
テムの製造者の指示に従って検出することができる。患
者血清を試料としたサンドウイッチアッセイでは、上記
の抗体類がウェル底面などの固相のコーティングに用い
られてキャプチャー側抗体を提供し、もう一方の抗体が
放射性物質や着色粒子又は酵素で標識されて検出側抗体
を提供する。キャプチャー側抗体を有するウェル内に試
料としての患者血清或いはその希釈液が添加され、所定
時間インキュベートされた後、該試料液をウェルから取
り除き、好適な緩衝液等によりウェル内を充分に洗浄
後、検出側の抗体がウェルに添加される。所定のインキ
ュベーションの後、ウェル内を洗浄し、キャプチャー側
抗体−測定対象物−検出側抗体複合体の生成を検出す
る。検出は、検出側抗体に標識された標識物質の性質に
依存し、放射性標識であれば放射線量が、着色粒子標識
であれば発色量や吸光度が、また酵素標識（ＥＬＩＳＡ
法）であれば、更に適当な基質をウェルに添加し、所定
のインキュベーション後の吸光度が検出される。なお、
上記ＥＬＩＳＡ法で酵素標識に用いる酵素に特に制限は
なく、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリ性
フォスファターゼ等の酵素が有利に使用される。西洋ワ
サビペルオキシダーゼで標識する場合は、当該酵素の基
質として３,３’,５,５’−テトラメチルベンチジン等
がその基質として利用可能である。アルカリ性フォスフ
ァターゼを使用する場合は、基質としてｐ−ニトロフェ
ニル燐酸が基質としてあげられる。なお、競合アッセイ
では、上記標識抗体の代わりに標識されたＲＥＴまたは
その免疫学的等価物が使用され、該物質と試料中の被検
物質との特異的抗体結合に関する競合が測定される。
【００３１】本発明のイムノアッセイは、上記の抗体を
含むキットを用いて容易に実施することができる。サン
ドウィッチ法に基づくＥＬＩＳＡ用キットの例では、キ
ャプチャー用としての抗体からなる試薬と、検出用とし
ての酵素標識した抗体からなる試薬及び適切な酵素基質
がキットに含まれ得る。洗浄用の緩衝液や、ウェルへの
非特異的吸着を抑制するブロッキング用試薬等が更に含
まれてもよい。そのようなキットの構成及びその製造方
法は当業者にとって公知であろう。更に、該キットは、
いわゆるイムノクロマトの形態で使用することも可能で
ある。そのようなイムノクロマトの製造方法は、例え
ば、特開平２−１３２３７５号公報に記載されている。
含むキットを用いて容易に実施することができる。サン
ドウィッチ法に基づくＥＬＩＳＡ用キットの例では、キ
ャプチャー用としての抗体からなる試薬と、検出用とし
ての酵素標識した抗体からなる試薬及び適切な酵素基質
がキットに含まれ得る。洗浄用の緩衝液や、ウェルへの
非特異的吸着を抑制するブロッキング用試薬等が更に含
まれてもよい。そのようなキットの構成及びその製造方
法は当業者にとって公知であろう。更に、該キットは、
いわゆるイムノクロマトの形態で使用することも可能で
ある。そのようなイムノクロマトの製造方法は、例え
ば、特開平２−１３２３７５号公報に記載されている。
【００３２】更に、ＲＥＴ遺伝子の発現をＲＥＴ遺伝子
産物（ＲＥＴ）の生成として検出する場合、当該ＲＥＴ
に特異的に結合するペプチド（ＲＥＴ結合ペプチド；以
下、「ＲＢＰ」と略す。）も上記抗体と同様にして利用
できる。すなわち、上記イムノアッセイにおける特異抗
体を、そのような特異的ペプチドに置き換えることで、
ＲＥＴの生成を検出することが可能であり、イムノアッ
セイのプロトコールはそのままＲＢＰを用いた検出に応
用できる。
産物（ＲＥＴ）の生成として検出する場合、当該ＲＥＴ
に特異的に結合するペプチド（ＲＥＴ結合ペプチド；以
下、「ＲＢＰ」と略す。）も上記抗体と同様にして利用
できる。すなわち、上記イムノアッセイにおける特異抗
体を、そのような特異的ペプチドに置き換えることで、
ＲＥＴの生成を検出することが可能であり、イムノアッ
セイのプロトコールはそのままＲＢＰを用いた検出に応
用できる。
【００３３】好ましいＲＢＰの例は、以下の配列番号１
９乃至２６（配列表フリーテキスト：ＲＥＴ ｂｉｎｄ
ｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）のアミノ酸配列を有するペプ
チドである。
９乃至２６（配列表フリーテキスト：ＲＥＴ ｂｉｎｄ
ｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）のアミノ酸配列を有するペプ
チドである。
【００３４】
ＫＡＧＲＧＲＤＲ（１文字表記、配列番号１９）
ＧＲＧＲＤＲ（１文字表記、配列番号２０）
ＧＣＶＲＬＶＴＧＲＧＴＲ（１文字表記、配列番号２
１） ＧＳＫＡＧＲＧＲＤＲＲＲ（１文字表記、配列番号２
２） ＧＷＡＮＧＴＳＲＶＶＲＲ（１文字表記、配列番号２
３） ＩＳＣＳＧＡＬＲＬＰＹＷ（１文字表記、配列番号２
４） ＩＬＳＧＷＲＧＬＡＰＣＩ（１文字表記、配列番号２
５） ＧＴＬＫＧＬＲＱＧＲＨＶ（１文字表記、配列番号２
６） 上記のうち、配列番号１９および配列番号２０のアミノ
酸配列を有するペプチドは、各々、ＲＢＰ−１およびＲ
ＢＰ−３と命名され、本発明のＲＢＰのうち特に好まし
いものである。ＲＢＰ−１およびＲＢＰ−３は、ランダ
ム・ペプチド・ディスプレイ・ライブラリー（Ｆｌｉｔ
ｒｘ（商品名）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により得
られた１２アミノ酸残基からなるペプチドのチオレドキ
シン融合体を、ＲＥＴに対する結合能力に関してスクリ
ーニングした結果得られた６種類のＲＥＴ結合ペプチド
（配列番号２１乃至配列番号２６により表される）に存
在するグリシンとアルギニンの反復モチーフを参照して
化学的に合成されたペプチドである。当該ＲＢＰ−１お
よびＲＢＰ−３は、他のＲＥＴ結合ペプチド同様にＲＥ
Ｔに特異的に結合することが確認された。
１） ＧＳＫＡＧＲＧＲＤＲＲＲ（１文字表記、配列番号２
２） ＧＷＡＮＧＴＳＲＶＶＲＲ（１文字表記、配列番号２
３） ＩＳＣＳＧＡＬＲＬＰＹＷ（１文字表記、配列番号２
４） ＩＬＳＧＷＲＧＬＡＰＣＩ（１文字表記、配列番号２
５） ＧＴＬＫＧＬＲＱＧＲＨＶ（１文字表記、配列番号２
６） 上記のうち、配列番号１９および配列番号２０のアミノ
酸配列を有するペプチドは、各々、ＲＢＰ−１およびＲ
ＢＰ−３と命名され、本発明のＲＢＰのうち特に好まし
いものである。ＲＢＰ−１およびＲＢＰ−３は、ランダ
ム・ペプチド・ディスプレイ・ライブラリー（Ｆｌｉｔ
ｒｘ（商品名）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により得
られた１２アミノ酸残基からなるペプチドのチオレドキ
シン融合体を、ＲＥＴに対する結合能力に関してスクリ
ーニングした結果得られた６種類のＲＥＴ結合ペプチド
（配列番号２１乃至配列番号２６により表される）に存
在するグリシンとアルギニンの反復モチーフを参照して
化学的に合成されたペプチドである。当該ＲＢＰ−１お
よびＲＢＰ−３は、他のＲＥＴ結合ペプチド同様にＲＥ
Ｔに特異的に結合することが確認された。
【００３５】従って、本発明のＲＢＰを用いるＲＥＴ遺
伝子発現の検出方法では、該ＲＢＰがＲＥＴ特異的抗体
と同様、対応するイムノアッセイの方式に応じて標識化
され、或いは固相化され、そのような標識或いは固相化
ＲＢＰも本発明のＲＢＰに含まれる。病理組織切片を用
いた検出方法の例では、ＲＢＰをビオチン化し、これを
該切片と接触させ、形成されたビオチン化ＲＢＰとＲＥ
Ｔの複合体を、ストレプトアビジンにコンジュゲートし
たＦＩＴＣ（ＳＡ−ＦＩＴＣ）により蛍光的に可視化
し、これを検出すればよい。
伝子発現の検出方法では、該ＲＢＰがＲＥＴ特異的抗体
と同様、対応するイムノアッセイの方式に応じて標識化
され、或いは固相化され、そのような標識或いは固相化
ＲＢＰも本発明のＲＢＰに含まれる。病理組織切片を用
いた検出方法の例では、ＲＢＰをビオチン化し、これを
該切片と接触させ、形成されたビオチン化ＲＢＰとＲＥ
Ｔの複合体を、ストレプトアビジンにコンジュゲートし
たＦＩＴＣ（ＳＡ−ＦＩＴＣ）により蛍光的に可視化
し、これを検出すればよい。
【００３６】更に、ＲＢＰは、通常、Ｃ末端がカルボキ
シル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯ
Ｏ−）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）また
はエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエス
テルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ
−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ
1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキ
シルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニ
ル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベ
ンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基
もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ
1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基のほか、ピバ
ロイルオキシメチルエステルなどが用いられる。本発明
のＲＢＰがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボ
キシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミ
ド化またはエステル化されているものも本発明のＲＢＰ
に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記
したＣ末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発
明のＲＢＰには、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が
保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6
アシル基など）で保護されているもの、分子内のアミノ
酸の側鎖上にある、例えばＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ2、Ｓ
Ｈなどが適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル
基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているものも
含まれる。なお、本発明のＲＢＰの合成は、当業者に周
知のいかなる方法を用いても行なうことができ、簡便に
は、ペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー
４３０Ａ型、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＪａｐａｎ社製）
を使用した化学合成法によって実施できる。
シル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯ
Ｏ−）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）また
はエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエス
テルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ
−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ
1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキ
シルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニ
ル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベ
ンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基
もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ
1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基のほか、ピバ
ロイルオキシメチルエステルなどが用いられる。本発明
のＲＢＰがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボ
キシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミ
ド化またはエステル化されているものも本発明のＲＢＰ
に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記
したＣ末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発
明のＲＢＰには、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が
保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6
アシル基など）で保護されているもの、分子内のアミノ
酸の側鎖上にある、例えばＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ2、Ｓ
Ｈなどが適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル
基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているものも
含まれる。なお、本発明のＲＢＰの合成は、当業者に周
知のいかなる方法を用いても行なうことができ、簡便に
は、ペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー
４３０Ａ型、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＪａｐａｎ社製）
を使用した化学合成法によって実施できる。
【００３７】本発明のＲＢＰを用いるＲＥＴ遺伝子発現
の検出方法は、上記のとおり、対応するイムノアッセイ
においてＲＥＴ特異的抗体をＲＢＰに置き換えることに
より達成することができ、従って、当該検出のためのキ
ットもイムノアッセイのキットと対応付けることができ
る。例えば、サンドウィッチ法に基づくＥＬＩＳＡ類似
のキットの例では、キャプチャー用としての抗体の代わ
りとなるＲＢＰからなる試薬と、検出用としての酵素標
識抗体の代わりの標識ＲＢＰからなる試薬及び適切な酵
素基質がキットに含まれ得る。洗浄用の緩衝液や、ウェ
ルへの非特異的吸着を抑制するブロッキング用試薬等が
更に含まれてもよい。病理組織切片における検出のため
のキットの例では、ビオチン化したＲＢＰとＳＡ−ＦＩ
ＴＣがキットに含まれ得る。そのようなキットの構成及
びその製造方法は当業者にとって公知であろう。更に、
該キットは、いわゆるイムノクロマト類似の形態で使用
することも可能である。そのような装置の製造方法も、
上記の特開平２−１３２３７５号公報に記載されてい
る。
の検出方法は、上記のとおり、対応するイムノアッセイ
においてＲＥＴ特異的抗体をＲＢＰに置き換えることに
より達成することができ、従って、当該検出のためのキ
ットもイムノアッセイのキットと対応付けることができ
る。例えば、サンドウィッチ法に基づくＥＬＩＳＡ類似
のキットの例では、キャプチャー用としての抗体の代わ
りとなるＲＢＰからなる試薬と、検出用としての酵素標
識抗体の代わりの標識ＲＢＰからなる試薬及び適切な酵
素基質がキットに含まれ得る。洗浄用の緩衝液や、ウェ
ルへの非特異的吸着を抑制するブロッキング用試薬等が
更に含まれてもよい。病理組織切片における検出のため
のキットの例では、ビオチン化したＲＢＰとＳＡ−ＦＩ
ＴＣがキットに含まれ得る。そのようなキットの構成及
びその製造方法は当業者にとって公知であろう。更に、
該キットは、いわゆるイムノクロマト類似の形態で使用
することも可能である。そのような装置の製造方法も、
上記の特開平２−１３２３７５号公報に記載されてい
る。
【００３８】前述の如く、ＲＥＴ遺伝子は卵巣腫瘍細胞
において高率で発現していることが今や明らかとなり、
従って、卵巣腫瘍マーカー物質であるＲＥＴが卵巣腫瘍
治療のための標的分子として利用できることが示され
た。すなわち、本発明の別の側面によれば、卵巣腫瘍マ
ーカー物質としてのＲＥＴを標的分子とした卵巣腫瘍治
療のための医薬が提供され、ＲＥＴに特異的に結合する
抗体或いはＲＥＴに特異的に結合するペプチド（ＲＢ
Ｐ）は当該医薬の活性成分をＲＥＴ遺伝子発現細胞に指
向させ得る。また、ＲＢＰは、卵巣腫瘍細胞のほか、Ｒ
ＥＴの発現が報告されている他の腫瘍の治療にも用いる
ことができる。
において高率で発現していることが今や明らかとなり、
従って、卵巣腫瘍マーカー物質であるＲＥＴが卵巣腫瘍
治療のための標的分子として利用できることが示され
た。すなわち、本発明の別の側面によれば、卵巣腫瘍マ
ーカー物質としてのＲＥＴを標的分子とした卵巣腫瘍治
療のための医薬が提供され、ＲＥＴに特異的に結合する
抗体或いはＲＥＴに特異的に結合するペプチド（ＲＢ
Ｐ）は当該医薬の活性成分をＲＥＴ遺伝子発現細胞に指
向させ得る。また、ＲＢＰは、卵巣腫瘍細胞のほか、Ｒ
ＥＴの発現が報告されている他の腫瘍の治療にも用いる
ことができる。
【００３９】そのような医薬は、ＲＥＴ特異的抗体また
はＲＥＴ結合ペプチド（ＲＢＰ）と制癌作用を有する化
合物または細胞毒素とをコンジュゲートした物質、或い
は、いわゆる遺伝子治療においては、ＲＥＴ特異的抗体
またはＲＥＴ結合ペプチド（ＲＢＰ）とアンチセンス核
酸などのＲＥＴ遺伝子の発現を抑制する核酸とをコンジ
ュゲートした物質を用いることにより製造され得る。
はＲＥＴ結合ペプチド（ＲＢＰ）と制癌作用を有する化
合物または細胞毒素とをコンジュゲートした物質、或い
は、いわゆる遺伝子治療においては、ＲＥＴ特異的抗体
またはＲＥＴ結合ペプチド（ＲＢＰ）とアンチセンス核
酸などのＲＥＴ遺伝子の発現を抑制する核酸とをコンジ
ュゲートした物質を用いることにより製造され得る。
【００４０】制癌化合物としては、当業者に周知のいか
なる化合物をも用いることができ、その好ましい例とし
ては、タキソール、シスプラチン、アドリアマイシン、
エピルビシン、サイクロフォスファマイドおよびカンプ
トテシンがあげられるがこれに限定されない。抗体或い
はＲＢＰのようなペプチドと制癌化合物をコンジュゲー
トする方法はよく知られており、例えば、国際公開ＷＯ
９９／２５７２９号公報、特公平６−１１７１３号公報
および日本国特許第３１６９２２３号公報を参照された
い。
なる化合物をも用いることができ、その好ましい例とし
ては、タキソール、シスプラチン、アドリアマイシン、
エピルビシン、サイクロフォスファマイドおよびカンプ
トテシンがあげられるがこれに限定されない。抗体或い
はＲＢＰのようなペプチドと制癌化合物をコンジュゲー
トする方法はよく知られており、例えば、国際公開ＷＯ
９９／２５７２９号公報、特公平６−１１７１３号公報
および日本国特許第３１６９２２３号公報を参照された
い。
【００４１】いわゆる遺伝子治療においては、上記制癌
化合物に換えて、アンチセンス核酸などのＲＥＴ遺伝子
の発現を抑制する核酸が抗体或いはＲＢＰとコンジュゲ
ートされる。好ましいアンチセンス核酸は、ＲＥＴをコ
ードするｍＲＮＡを作り出すのに必要なゲノム領域から
ｐｒｅ−ｍＲＮＡへの転写段階、ｐｒｅ−ｍＲＮＡから
成熟ｍＲＮＡへのプロセッシング段階、核膜通過段階、
蛋白への翻訳段階のいずれかで、遺伝子情報を担うＤＮ
ＡもしくはＲＮＡに結合し、遺伝情報の伝達の正常な流
れに影響を与えて蛋白質の発現を調節するものを意味
し、ＲＥＴ遺伝子の核酸配列の全体あるいはいずれかの
部分に相補する配列からなるものであってもよい。ま
た、ゲノム領域から転写されるｍＲＮＡがイントロン構
造あるいは５’末端や３’末端に被翻訳領域を含む形で
あるときは、かかる非翻訳部分の配列に相当あるいは相
補するアンチセンス核酸も利用できる。アンチセンス核
酸は、ＤＮＡやＲＮＡの他、その立体構造や機能がＤＮ
ＡあるいはＲＮＡと類似する各種誘導体のすべてを含む
ものである。例えば、３’末端もしくは５’末端に他の
物質が結合した核酸、オリゴヌクレオチドの塩基、糖、
リン酸の少なくともいずれか１つにおいて置換や修飾が
生じた核酸、天然には存在しないような塩基、糖あるい
はリン酸を有する核酸、糖−リン酸骨格以外の骨格（バ
ックボーン）を有する核酸等が挙げられる。これらの核
酸は、ヌクレアーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結
合力の少なくとも１つが高められた誘導体として好適で
ある。また、一般的には、ステム・ループを形成してい
るｍＲＮＡのループ部分にハイブリダイズするような塩
基配列、すなわちステム・ループを形成している領域の
塩基配列に相補的な塩基配列をもつアンチセンス核酸、
あるいは、翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、
キャッピング部位、スプライス部位に結合するようなア
ンチセンス核酸、すなわちこれらの部位の配列に相補的
な配列を有するアンチセンス核酸も、一般に高い発現抑
制効果が期待できる点で好ましい。
化合物に換えて、アンチセンス核酸などのＲＥＴ遺伝子
の発現を抑制する核酸が抗体或いはＲＢＰとコンジュゲ
ートされる。好ましいアンチセンス核酸は、ＲＥＴをコ
ードするｍＲＮＡを作り出すのに必要なゲノム領域から
ｐｒｅ−ｍＲＮＡへの転写段階、ｐｒｅ−ｍＲＮＡから
成熟ｍＲＮＡへのプロセッシング段階、核膜通過段階、
蛋白への翻訳段階のいずれかで、遺伝子情報を担うＤＮ
ＡもしくはＲＮＡに結合し、遺伝情報の伝達の正常な流
れに影響を与えて蛋白質の発現を調節するものを意味
し、ＲＥＴ遺伝子の核酸配列の全体あるいはいずれかの
部分に相補する配列からなるものであってもよい。ま
た、ゲノム領域から転写されるｍＲＮＡがイントロン構
造あるいは５’末端や３’末端に被翻訳領域を含む形で
あるときは、かかる非翻訳部分の配列に相当あるいは相
補するアンチセンス核酸も利用できる。アンチセンス核
酸は、ＤＮＡやＲＮＡの他、その立体構造や機能がＤＮ
ＡあるいはＲＮＡと類似する各種誘導体のすべてを含む
ものである。例えば、３’末端もしくは５’末端に他の
物質が結合した核酸、オリゴヌクレオチドの塩基、糖、
リン酸の少なくともいずれか１つにおいて置換や修飾が
生じた核酸、天然には存在しないような塩基、糖あるい
はリン酸を有する核酸、糖−リン酸骨格以外の骨格（バ
ックボーン）を有する核酸等が挙げられる。これらの核
酸は、ヌクレアーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結
合力の少なくとも１つが高められた誘導体として好適で
ある。また、一般的には、ステム・ループを形成してい
るｍＲＮＡのループ部分にハイブリダイズするような塩
基配列、すなわちステム・ループを形成している領域の
塩基配列に相補的な塩基配列をもつアンチセンス核酸、
あるいは、翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、
キャッピング部位、スプライス部位に結合するようなア
ンチセンス核酸、すなわちこれらの部位の配列に相補的
な配列を有するアンチセンス核酸も、一般に高い発現抑
制効果が期待できる点で好ましい。
【００４２】上記の医薬は、例えば、丸剤、錠剤、フィ
ルムコーティング錠、糖衣錠、顆粒剤、硬および軟ゼラ
チンカプセル剤、水性、アルコール性または油性溶液、
シロップ、エマルションまたは懸濁液の形で経口的に、
または、例えば坐剤の形で直腸的に投与できる。しか
し、投与は、例えば皮下、筋肉内または静脈内に、注射
溶液または点滴溶液の形で行なうこともできる。好まし
い投与形態は、例えば、処置する疾病およびその重度に
依存する。
ルムコーティング錠、糖衣錠、顆粒剤、硬および軟ゼラ
チンカプセル剤、水性、アルコール性または油性溶液、
シロップ、エマルションまたは懸濁液の形で経口的に、
または、例えば坐剤の形で直腸的に投与できる。しか
し、投与は、例えば皮下、筋肉内または静脈内に、注射
溶液または点滴溶液の形で行なうこともできる。好まし
い投与形態は、例えば、処置する疾病およびその重度に
依存する。
【００４３】本発明に記載の医薬は、医薬製品の製造に
既知の標準的なプロセスにより製造できる。
既知の標準的なプロセスにより製造できる。
【００４４】この目的のために、ＲＥＴ特異的抗体また
はＲＥＴ結合ペプチド（ＲＢＰ）と制癌作用を有する化
合物または細胞毒素とをコンジュゲートし、或いは、Ｒ
ＥＴ特異的抗体またはＲＥＴ結合ペプチド（ＲＢＰ）と
アンチセンス核酸などのＲＥＴ遺伝子の発現を抑制する
核酸とをコンジュゲートした物質を、１つ以上の固体ま
たは液体医薬担体および／または添加剤または賦形剤
と、所望であれば、他の活性医薬成分と組合せて配合
し、適切な投与形または投与量形にし、医薬とすること
ができる。医薬製品は、ＲＥＴ特異的抗体またはＲＥＴ
結合ペプチド（ＲＢＰ）と制癌作用を有する化合物また
は細胞毒素とをコンジュゲートし、或いは、いわゆる遺
伝子治療においては、ＲＥＴ特異的抗体またはＲＥＴ結
合ペプチド（ＲＢＰ）とアンチセンス核酸などのＲＥＴ
遺伝子の発現を抑制する核酸とをコンジュゲートさせた
物質を含み、これは通常、医薬製品の０．５から９０重
量％の量である。
はＲＥＴ結合ペプチド（ＲＢＰ）と制癌作用を有する化
合物または細胞毒素とをコンジュゲートし、或いは、Ｒ
ＥＴ特異的抗体またはＲＥＴ結合ペプチド（ＲＢＰ）と
アンチセンス核酸などのＲＥＴ遺伝子の発現を抑制する
核酸とをコンジュゲートした物質を、１つ以上の固体ま
たは液体医薬担体および／または添加剤または賦形剤
と、所望であれば、他の活性医薬成分と組合せて配合
し、適切な投与形または投与量形にし、医薬とすること
ができる。医薬製品は、ＲＥＴ特異的抗体またはＲＥＴ
結合ペプチド（ＲＢＰ）と制癌作用を有する化合物また
は細胞毒素とをコンジュゲートし、或いは、いわゆる遺
伝子治療においては、ＲＥＴ特異的抗体またはＲＥＴ結
合ペプチド（ＲＢＰ）とアンチセンス核酸などのＲＥＴ
遺伝子の発現を抑制する核酸とをコンジュゲートさせた
物質を含み、これは通常、医薬製品の０．５から９０重
量％の量である。
【００４５】例えば、丸剤、錠剤、糖衣錠、および硬ゼ
ラチンカプセル剤を製造するために、ラクトース、デン
プン、例えばコーンスターチまたはデンプン誘導体、タ
ルク、ステアリン酸、またはその塩等を使用できる。軟
ゼラチンカプセル剤および坐剤の担体は、例えば、脂
肪、ワセリン、半固体および液体ポリオール、天然また
は硬化油等である。溶液、例えば注射溶液、またはエマ
ルションまたはシロップの製造に適切な担体の例は、
水、生理的食塩水、アルコール、例えばエタノール、グ
リセロール、ポリオール、スクロース、転化糖、グルコ
ース、マンニトール、植物油等である。
ラチンカプセル剤を製造するために、ラクトース、デン
プン、例えばコーンスターチまたはデンプン誘導体、タ
ルク、ステアリン酸、またはその塩等を使用できる。軟
ゼラチンカプセル剤および坐剤の担体は、例えば、脂
肪、ワセリン、半固体および液体ポリオール、天然また
は硬化油等である。溶液、例えば注射溶液、またはエマ
ルションまたはシロップの製造に適切な担体の例は、
水、生理的食塩水、アルコール、例えばエタノール、グ
リセロール、ポリオール、スクロース、転化糖、グルコ
ース、マンニトール、植物油等である。
【００４６】医薬製品はまた、活性成分および担体の他
に、慣用的な添加剤、例えば充填剤、崩壊剤、結合剤、
潤滑剤、湿潤剤、安定化剤、乳化剤、分散剤、保存剤、
甘味剤、着色剤、香味剤、または芳香剤、増粘剤、希釈
剤、緩衝物質、また溶媒または可溶化剤、または、徐放
作用を達成するための手段、浸透圧を変化させる塩、コ
ーティング物質または抗酸化剤を含み得る。
に、慣用的な添加剤、例えば充填剤、崩壊剤、結合剤、
潤滑剤、湿潤剤、安定化剤、乳化剤、分散剤、保存剤、
甘味剤、着色剤、香味剤、または芳香剤、増粘剤、希釈
剤、緩衝物質、また溶媒または可溶化剤、または、徐放
作用を達成するための手段、浸透圧を変化させる塩、コ
ーティング物質または抗酸化剤を含み得る。
【００４７】投与するＲＥＴ特異的抗体またはＲＥＴ結
合ペプチド（ＲＢＰ）と制癌作用を有する化合物または
細胞毒素とをコンジュゲートし、或いは、いわゆる遺伝
子治療においては、ＲＥＴ特異的抗体またはＲＥＴ結合
ペプチド（ＲＢＰ）とアンチセンス核酸などのＲＥＴ遺
伝子の発現を抑制する核酸とをコンジュゲートした物質
の投与量は、個々の症例に依存し、慣用的な方法で最適
な効果について個々の環境に適合すべきである。従っ
て、処置する疾病の性質および重度、および、処置する
患者の性、年齢、体重および個々の応答、使用する化合
物の強度および作用時間、または上記のコンジュゲート
に加えて他の活性成分を投与するかどうかに依存する。
合ペプチド（ＲＢＰ）と制癌作用を有する化合物または
細胞毒素とをコンジュゲートし、或いは、いわゆる遺伝
子治療においては、ＲＥＴ特異的抗体またはＲＥＴ結合
ペプチド（ＲＢＰ）とアンチセンス核酸などのＲＥＴ遺
伝子の発現を抑制する核酸とをコンジュゲートした物質
の投与量は、個々の症例に依存し、慣用的な方法で最適
な効果について個々の環境に適合すべきである。従っ
て、処置する疾病の性質および重度、および、処置する
患者の性、年齢、体重および個々の応答、使用する化合
物の強度および作用時間、または上記のコンジュゲート
に加えて他の活性成分を投与するかどうかに依存する。
【００４８】タキソールを特異的抗体にコンジュゲート
した物質の例では、一般に、タキソールとして、患者の
体表面積１ｍ2あたり１０５乃至１３５ｍｇの１日量が
投与に適切である。１日量は、１回投与量で、または特
に大量投与の場合、例えば２、３または４回の複数の単
回投与量に分割し得る。個々の特徴に応じて、適宜、記
載の１日量より上下に変動させることが必要であり得
る。
した物質の例では、一般に、タキソールとして、患者の
体表面積１ｍ2あたり１０５乃至１３５ｍｇの１日量が
投与に適切である。１日量は、１回投与量で、または特
に大量投与の場合、例えば２、３または４回の複数の単
回投与量に分割し得る。個々の特徴に応じて、適宜、記
載の１日量より上下に変動させることが必要であり得
る。
【００４９】以下、実施例により本発明を詳細に説明す
るが、実施例は本発明を何ら限定するものではない。
るが、実施例は本発明を何ら限定するものではない。
【００５０】
【実施例】実施例１ 卵巣癌細胞株におけるＲＥＴ遺伝
子の発現ＲＥＴ 遺伝子の発現を４種類の卵巣癌細胞株で調べた。
本実施例に用いた卵巣癌細胞株は２００８、Ｄ２４０、
２７８０ＡＤおよび２７８０ＣＰであり、２００８株
は、Ｈｏｗｅｌｌ．Ｓ．Ｂ氏（カリフォルニア大学サン
・ディエゴ校・Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｌａ Ｊ
ｏｌｌａ，ＣＡ．９２０９３）から、Ｄ２４０株は、理
化学研究所セルバンクから、２７８０ＡＤ株および２７
８０ＣＰ株は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ．Ｐ．Ｃ．氏（Ｆｏｘ
Ｃｈａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｐｈｉｌ
ａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ−１９１１１）から、各々、入
手した。これらの細胞株は、１０％牛胎児血清（Ｓｉｇ
ｍａ社製）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ’
ｓ ｍｅｄｉｕｍ（日本水産社製）内で培養した。陽性
対照としてＮＢ−３９−ｎｕ（ヌードマウス移植ｎｅｕ
ｒｏｂｌａｓｔｏｍａ由来、理化学研究所セルバンクか
ら入手）を用い、これは１０％牛胎児血清を含むのＩｓ
ｃｏｖｅｓの修飾Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ
内で培養した。ＨｅＬａ（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｅｐｉｔ
ｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）およびＡＮＣＡ３
（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏ
ｍａ）を陰性対照として用いた。
子の発現ＲＥＴ 遺伝子の発現を４種類の卵巣癌細胞株で調べた。
本実施例に用いた卵巣癌細胞株は２００８、Ｄ２４０、
２７８０ＡＤおよび２７８０ＣＰであり、２００８株
は、Ｈｏｗｅｌｌ．Ｓ．Ｂ氏（カリフォルニア大学サン
・ディエゴ校・Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｌａ Ｊ
ｏｌｌａ，ＣＡ．９２０９３）から、Ｄ２４０株は、理
化学研究所セルバンクから、２７８０ＡＤ株および２７
８０ＣＰ株は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ．Ｐ．Ｃ．氏（Ｆｏｘ
Ｃｈａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｐｈｉｌ
ａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ−１９１１１）から、各々、入
手した。これらの細胞株は、１０％牛胎児血清（Ｓｉｇ
ｍａ社製）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ’
ｓ ｍｅｄｉｕｍ（日本水産社製）内で培養した。陽性
対照としてＮＢ−３９−ｎｕ（ヌードマウス移植ｎｅｕ
ｒｏｂｌａｓｔｏｍａ由来、理化学研究所セルバンクか
ら入手）を用い、これは１０％牛胎児血清を含むのＩｓ
ｃｏｖｅｓの修飾Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ
内で培養した。ＨｅＬａ（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｅｐｉｔ
ｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）およびＡＮＣＡ３
（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏ
ｍａ）を陰性対照として用いた。
【００５１】ＲＥＴ遺伝子発現の確認は免疫染色法を用
いて行い、特異抗体としては論文（Ｙａｎｏ，Ｌ．，Ｓ
ｈｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｈａ
ｙａｓｈｉ，Ｙ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｈａｔａｋ
ｅ，Ｋ．，Ｔａｋａｋｕ，Ｆ．ａｎｄ Ｉｓｈｉｚｕｋ
ａ，Ｙ．， Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓ
ｆｅｒ ｔｏ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ
ｓ ｂｙ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＲＥＴ， ａ ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ ｔｕｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ．， Ｈｕｍ．
Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．， １１：９９５−１００４，２
０００）の方法に基づいて調製したものを用いた。免疫
複合体の検出は、ＣＳＡ ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｋｏ社
製）により、製造者の指示に従って行なった。
いて行い、特異抗体としては論文（Ｙａｎｏ，Ｌ．，Ｓ
ｈｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｈａ
ｙａｓｈｉ，Ｙ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｈａｔａｋ
ｅ，Ｋ．，Ｔａｋａｋｕ，Ｆ．ａｎｄ Ｉｓｈｉｚｕｋ
ａ，Ｙ．， Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓ
ｆｅｒ ｔｏ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ
ｓ ｂｙ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＲＥＴ， ａ ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ ｔｕｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ．， Ｈｕｍ．
Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．， １１：９９５−１００４，２
０００）の方法に基づいて調製したものを用いた。免疫
複合体の検出は、ＣＳＡ ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｋｏ社
製）により、製造者の指示に従って行なった。
【００５２】その結果、上記４種の卵巣癌細胞ではＲＥ
Ｔ遺伝子の発現が認められ、ＨｅＬａおよびＡＮＣＡ３
細胞では発現が観察されなかった（図１）。
Ｔ遺伝子の発現が認められ、ＨｅＬａおよびＡＮＣＡ３
細胞では発現が観察されなかった（図１）。
【００５３】なお、ＲＥＴのＣ末端２０アミノ酸残基か
らなるポリペプチドを用いて製造されたポリクローナル
抗体による、細胞の全抽出物或いは膜画分に対するウエ
スタン・ブロッテイングの結果、２００８およびＤ２４
０細胞株において観測されたＲＥＴは１３０ｋＤａの分
子量を有していたのに対し、ＮＢ−３９−ｎｕにおいて
は１５０および１７０ｋＤａであった。ウエスタン・ブ
ロットに用いた第１抗体をその抗原（ＲＥＴのＣ末端ペ
プチド）とプレ・インキュベーションした後に再度検査
を行なうとウエスタン・ブロッテイングの像が完全に消
失することから、上記１３０ｋＤａに検出されたバンド
もＲＥＴであったと結論される（図２）。このような分
子量の違いは、ＲＥＴ分子のグリコシル化の程度の相違
を反映しているものと考えられる（Ｔａｋａｈａｓｈ
ｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｔ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇ
ｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓ
ｔｏｍａ ａｎｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ．，
Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ６：２９７−３０１，１９９
７）。
らなるポリペプチドを用いて製造されたポリクローナル
抗体による、細胞の全抽出物或いは膜画分に対するウエ
スタン・ブロッテイングの結果、２００８およびＤ２４
０細胞株において観測されたＲＥＴは１３０ｋＤａの分
子量を有していたのに対し、ＮＢ−３９−ｎｕにおいて
は１５０および１７０ｋＤａであった。ウエスタン・ブ
ロットに用いた第１抗体をその抗原（ＲＥＴのＣ末端ペ
プチド）とプレ・インキュベーションした後に再度検査
を行なうとウエスタン・ブロッテイングの像が完全に消
失することから、上記１３０ｋＤａに検出されたバンド
もＲＥＴであったと結論される（図２）。このような分
子量の違いは、ＲＥＴ分子のグリコシル化の程度の相違
を反映しているものと考えられる（Ｔａｋａｈａｓｈ
ｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｔ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇ
ｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓ
ｔｏｍａ ａｎｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ．，
Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ６：２９７−３０１，１９９
７）。
【００５４】また、２００８細胞株において、ＦＩＴＣ
で標識したＲＥＴのコスミド・クローン（１０ｑ１１．
２）およびＣｙ５で標識した中心体マーカーであるＣＥ
Ｎ（１０ｑ１１．１−ｑ１１．１）（図３）を用いてＦ
ＩＳＨ分析（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍ
ｉｃｒｏｎｕｃｌｅｉ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｂｒｅａｋ ａｎｄ ｇｅｎ
ｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ
Ｖｐｒ， ａｎ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｇｅｎｅ ｏ
ｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ
ｖｉｒｕｓ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５９：２２
５９−２２６４，１９９９に準ずる）を行なったとこ
ろ、ＲＥＴ遺伝子の増幅や転座は認められなかった（図
４）。さらに、２００８細胞株においてＲＥＴ遺伝子を
ＰＣＲ増幅し（Ｏｒｉｏｌａ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｎｏｖｅｌ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｅ
ｘｏｎ １０ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｔ ｐｒｏｔｏ−ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ ｉｎ ａｆａｍｉｌｙ ｗｉｔｈ ｍ
ｅｄｕｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍ
ａ．， Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．， ７８：２
７１−２７３、１９９８参照）、そのエキソン１０、１
１および１３−１６について塩基配列の解析を行なった
ところ、それらの部位に変異は認められなかった。
で標識したＲＥＴのコスミド・クローン（１０ｑ１１．
２）およびＣｙ５で標識した中心体マーカーであるＣＥ
Ｎ（１０ｑ１１．１−ｑ１１．１）（図３）を用いてＦ
ＩＳＨ分析（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍ
ｉｃｒｏｎｕｃｌｅｉ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｂｒｅａｋ ａｎｄ ｇｅｎ
ｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ
Ｖｐｒ， ａｎ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｇｅｎｅ ｏ
ｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ
ｖｉｒｕｓ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５９：２２
５９−２２６４，１９９９に準ずる）を行なったとこ
ろ、ＲＥＴ遺伝子の増幅や転座は認められなかった（図
４）。さらに、２００８細胞株においてＲＥＴ遺伝子を
ＰＣＲ増幅し（Ｏｒｉｏｌａ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｎｏｖｅｌ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｅ
ｘｏｎ １０ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｔ ｐｒｏｔｏ−ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ ｉｎ ａｆａｍｉｌｙ ｗｉｔｈ ｍ
ｅｄｕｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍ
ａ．， Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．， ７８：２
７１−２７３、１９９８参照）、そのエキソン１０、１
１および１３−１６について塩基配列の解析を行なった
ところ、それらの部位に変異は認められなかった。
【００５５】実施例２ 卵巣腫瘍手術例におけるＲＥＴ
遺伝子の発現 慈恵医大の倫理委員会および患者の承認を得て、１９８
９〜１９９５年の卵巣腫瘍手術症例１９２例（卵巣癌９
０例、境界悪性１５例および良性８７例）について、そ
のパラフィン包埋切片での免疫組織化学的解析を実施し
た。免疫染色には、ＲＥＴのＣ末端２０アミノ酸残基か
らなるポリペプチドを抗原に用いて製造した家兎ポリク
ローナル抗体を第１抗体として用い（Ｉｓｈｉｚｕｋ
ａ，Ｙ．，Ｓｈｉｍａ，Ｈ．，Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｔ．
ａｎｄ Ｎａｇａｏ，Ｍ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｒｅｔＴＰＣ
ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎ ｃｙｔｏｐ
ｌａｓｍ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ７：１４４１−１
４４４，１９９２）、免疫複合体の検出にはｐｅｒｏｘ
ｉｄａｓｅにコンジュゲートしたヤギ抗家兎ＩｇＧ抗体
を第２抗体として用いて、Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ試薬
（商品名、Ｗａｋｏ社製）により検出した（図５）。
遺伝子の発現 慈恵医大の倫理委員会および患者の承認を得て、１９８
９〜１９９５年の卵巣腫瘍手術症例１９２例（卵巣癌９
０例、境界悪性１５例および良性８７例）について、そ
のパラフィン包埋切片での免疫組織化学的解析を実施し
た。免疫染色には、ＲＥＴのＣ末端２０アミノ酸残基か
らなるポリペプチドを抗原に用いて製造した家兎ポリク
ローナル抗体を第１抗体として用い（Ｉｓｈｉｚｕｋ
ａ，Ｙ．，Ｓｈｉｍａ，Ｈ．，Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｔ．
ａｎｄ Ｎａｇａｏ，Ｍ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｒｅｔＴＰＣ
ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎ ｃｙｔｏｐ
ｌａｓｍ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ７：１４４１−１
４４４，１９９２）、免疫複合体の検出にはｐｅｒｏｘ
ｉｄａｓｅにコンジュゲートしたヤギ抗家兎ＩｇＧ抗体
を第２抗体として用いて、Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ試薬
（商品名、Ｗａｋｏ社製）により検出した（図５）。
【００５６】その結果、免疫染色の陽性率は、卵巣癌で
６１.１％、境界悪性卵巣腫瘍で４０％、良性卵巣腫瘍
で２０.７％であり、卵巣癌の組織型別陽性率は、明細
胞腺癌で７５.９％、漿液性腺癌で３３.３％、粘液性腺
癌で７３.７％、類内膜腺癌で６６.６％、未分化癌で５
０.０％および悪性混合性上皮性腫瘍では１００％であ
った。この結果から、ＲＥＴ遺伝子産物が卵巣腫瘍マー
カーとなり得ることが示された。
６１.１％、境界悪性卵巣腫瘍で４０％、良性卵巣腫瘍
で２０.７％であり、卵巣癌の組織型別陽性率は、明細
胞腺癌で７５.９％、漿液性腺癌で３３.３％、粘液性腺
癌で７３.７％、類内膜腺癌で６６.６％、未分化癌で５
０.０％および悪性混合性上皮性腫瘍では１００％であ
った。この結果から、ＲＥＴ遺伝子産物が卵巣腫瘍マー
カーとなり得ることが示された。
【００５７】実施例３ ＲＢＰの同定
ＲＥＴ細胞外ドメインに相当する組換えタンパク質を文
献（Ｙａｎｏ，Ｌ．，Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｔａｎｉ
ｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｙ．，Ｓｕｚｕｋ
ｉ，Ｔ．，Ｈａｔａｋｅ，Ｋ．，Ｔａｋａｋｕ，Ｆ．
ａｎｄ Ｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｙ．， Ｉｍｐｒｏｖｅｄ
ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏｎｅｕｒｏｂｌａ
ｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＲＥＴ，
ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｕｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａ
ｓｅ．， Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．， １１：９
９５−１００４，２０００）の方法により発現させ、精
製した。当該タンパク質（２０μｇ）を６ｃｍ径のプレ
ート（Ｎｕｎｃ社製）にコーティングした。ＲＥＴ結合
タンパク質（ＲＢＰ）は、ランダム・ペプチド・ディス
プレイ・ライブラリー（Ｆｌｉｔｒｘ（商品名）、Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内から、製造業者が推奨するプ
ロトコールに準じてスクリーニングした（Ｌｕ，Ｚ．，
ｅｔ ａｉ．， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｉ
ｏｒｅｄｏｘｉｎ ｒａｎｄｏｍｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉ
ｂｒａｒｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｓ ｆｕ
ｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｕｓｉｏｎｓ ｔｏ ｆｌａｇｅ
ｌｌｉｎ： ａ ｓｙｓｔｅｍ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆ
ｏｒ ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔ
ｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．， Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｏｌ．， １３：３６６−３７２，１９９５）。この
ライブラリーにおいては、１２アミノ酸残基からなるペ
プチドがチオレドキシンに融合した融合タンパク質とし
て発現された。該融合タンパクを発現するバクテリアの
プールを上記プレートに添加して、室温で１時間インキ
ュベートした後、ＰＢＳで５回、プレート内を緩やかに
洗浄した。プレートに結合したバクテリアはアンピシリ
ン含有培地に回収し、この操作を５回繰り返した。最終
的に回収されたバクテリアをクローニングし、そのプラ
スミドを精製した。精製したプラスミドに関して塩基配
列決定した。
献（Ｙａｎｏ，Ｌ．，Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｔａｎｉ
ｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｙ．，Ｓｕｚｕｋ
ｉ，Ｔ．，Ｈａｔａｋｅ，Ｋ．，Ｔａｋａｋｕ，Ｆ．
ａｎｄ Ｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｙ．， Ｉｍｐｒｏｖｅｄ
ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏｎｅｕｒｏｂｌａ
ｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＲＥＴ，
ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｕｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａ
ｓｅ．， Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．， １１：９
９５−１００４，２０００）の方法により発現させ、精
製した。当該タンパク質（２０μｇ）を６ｃｍ径のプレ
ート（Ｎｕｎｃ社製）にコーティングした。ＲＥＴ結合
タンパク質（ＲＢＰ）は、ランダム・ペプチド・ディス
プレイ・ライブラリー（Ｆｌｉｔｒｘ（商品名）、Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内から、製造業者が推奨するプ
ロトコールに準じてスクリーニングした（Ｌｕ，Ｚ．，
ｅｔ ａｉ．， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｉ
ｏｒｅｄｏｘｉｎ ｒａｎｄｏｍｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉ
ｂｒａｒｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｓ ｆｕ
ｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｕｓｉｏｎｓ ｔｏ ｆｌａｇｅ
ｌｌｉｎ： ａ ｓｙｓｔｅｍ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆ
ｏｒ ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔ
ｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．， Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｏｌ．， １３：３６６−３７２，１９９５）。この
ライブラリーにおいては、１２アミノ酸残基からなるペ
プチドがチオレドキシンに融合した融合タンパク質とし
て発現された。該融合タンパクを発現するバクテリアの
プールを上記プレートに添加して、室温で１時間インキ
ュベートした後、ＰＢＳで５回、プレート内を緩やかに
洗浄した。プレートに結合したバクテリアはアンピシリ
ン含有培地に回収し、この操作を５回繰り返した。最終
的に回収されたバクテリアをクローニングし、そのプラ
スミドを精製した。精製したプラスミドに関して塩基配
列決定した。
【００５８】その結果、図６に示す６種類のペプチド
（各々、配列番号２１乃至２６）をＲＥＴ結合ペプチド
として同定した。
（各々、配列番号２１乃至２６）をＲＥＴ結合ペプチド
として同定した。
【００５９】実施例４ ＲＢＰ−１およびＲＢＰ−３
上記６種のＲＥＴ結合ペプチドのアミノ酸配列中のグリ
シンとアルギニンの反復モチーフに着目して、クローン
２７のペプチドから誘導されるＲＢＰ−１（配列番号１
９）およびＲＢＰ−３（配列番号２０）をＳａｗａｄｙ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｔｏｋｙｏ）に依頼して化学
的に合成した。
シンとアルギニンの反復モチーフに着目して、クローン
２７のペプチドから誘導されるＲＢＰ−１（配列番号１
９）およびＲＢＰ−３（配列番号２０）をＳａｗａｄｙ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｔｏｋｙｏ）に依頼して化学
的に合成した。
【００６０】ＲＢＰ−１のＲＥＴ遺伝子発現細胞への結
合を確かめるため、当該細胞を氷冷メタノールにより固
定化し、その後１０μｇ／ｍｌのビオチン化したＲＢＰ
−１とともにインキュベートした。０．０２重量％のＴ
ｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳで洗浄後、細胞を更にス
トレプトアビジンにコンジュゲートしたＦＩＴＣ（ＳＡ
-ＦＩＴＣ、Ｚｙｍｅｄ社製）を含む溶液とともにイン
キュベートした。なお、細胞の核を可視化するために、
上記細胞を更に４’６−ジアミヂノ−２−フェニルイン
ドール（ＤＡＰＩ、Ｓｉｇｍａ社製）で染色し、染色し
た細胞を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ＲＢＰ−１
は、ＮＢ−３９−ｎｕや２００８細胞株を含むＲＥＴ陽
性細胞と結合するが対照としてのＨｅＬａ細胞には結合
しないことが示された（図７）。なお、図７において、
ＲＢＰ−１の４位と６位のアルギニンをアラニンに置換
したペプチドでは、ＲＥＴ陽性細胞に対する結合が観察
されなかった。さらに、ＲＥＴを発現しない野生型のＲ
ＣＮ−９細胞では、やはりＲＢＰ−１の結合が観察され
ず、一方、ＲＥＴで形質転換したＲＣＮ−９においては
ＲＢＰ−１の結合が観察された（図８）。この結果か
ら、ＲＢＰ−１はＲＥＴに特異的に結合することが示さ
れた。
合を確かめるため、当該細胞を氷冷メタノールにより固
定化し、その後１０μｇ／ｍｌのビオチン化したＲＢＰ
−１とともにインキュベートした。０．０２重量％のＴ
ｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳで洗浄後、細胞を更にス
トレプトアビジンにコンジュゲートしたＦＩＴＣ（ＳＡ
-ＦＩＴＣ、Ｚｙｍｅｄ社製）を含む溶液とともにイン
キュベートした。なお、細胞の核を可視化するために、
上記細胞を更に４’６−ジアミヂノ−２−フェニルイン
ドール（ＤＡＰＩ、Ｓｉｇｍａ社製）で染色し、染色し
た細胞を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ＲＢＰ−１
は、ＮＢ−３９−ｎｕや２００８細胞株を含むＲＥＴ陽
性細胞と結合するが対照としてのＨｅＬａ細胞には結合
しないことが示された（図７）。なお、図７において、
ＲＢＰ−１の４位と６位のアルギニンをアラニンに置換
したペプチドでは、ＲＥＴ陽性細胞に対する結合が観察
されなかった。さらに、ＲＥＴを発現しない野生型のＲ
ＣＮ−９細胞では、やはりＲＢＰ−１の結合が観察され
ず、一方、ＲＥＴで形質転換したＲＣＮ−９においては
ＲＢＰ−１の結合が観察された（図８）。この結果か
ら、ＲＢＰ−１はＲＥＴに特異的に結合することが示さ
れた。
【００６１】実施例５ ＲＢＰ−１およびＲＢＰ−３の
ＲＥＴ発現細胞内への取り込み ＲＢＰ−１およびＲＢＰ−３がＲＥＴ遺伝子を発現する
細胞を標的とした医薬に使用できるかどうかを確かめる
ため、ＲＢＰ−１およびＲＢＰ−３のＲＥＴ陽性細胞へ
の取り込みを調べた。
ＲＥＴ発現細胞内への取り込み ＲＢＰ−１およびＲＢＰ−３がＲＥＴ遺伝子を発現する
細胞を標的とした医薬に使用できるかどうかを確かめる
ため、ＲＢＰ−１およびＲＢＰ−３のＲＥＴ陽性細胞へ
の取り込みを調べた。
【００６２】実験は、ＮＢ−３９−ｎｕ（ＲＥＴ陽性）
およびＨｅＬａ（ＲＥＴ陰性）細胞の培養物にビオチン
化したＲＢＰを添加することにより行い、当該添加の翌
日に細胞を氷冷メタノールで１５分間処理して固定し、
０．２重量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で更に処理する
ことにより行なわれた。このようにして細胞膜に結合し
たＲＢＰを除去し、細胞内に取り込まれたＲＢＰのみを
測定することとした。上記の細胞は、更にＳＡ−ＦＩＴ
Ｃ溶液内で、室温、４５分間インキュベートし、その
後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄
した。更に１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微
鏡下で観察した。
およびＨｅＬａ（ＲＥＴ陰性）細胞の培養物にビオチン
化したＲＢＰを添加することにより行い、当該添加の翌
日に細胞を氷冷メタノールで１５分間処理して固定し、
０．２重量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で更に処理する
ことにより行なわれた。このようにして細胞膜に結合し
たＲＢＰを除去し、細胞内に取り込まれたＲＢＰのみを
測定することとした。上記の細胞は、更にＳＡ−ＦＩＴ
Ｃ溶液内で、室温、４５分間インキュベートし、その
後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄
した。更に１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微
鏡下で観察した。
【００６３】その結果、ＲＢＰ−１およびＲＢＰ−３の
双方がＮＢ−３９−ｎｕに取り込まれることを確認した
（図９）。
双方がＮＢ−３９−ｎｕに取り込まれることを確認した
（図９）。
【００６４】次に、ＲＢＰ−３がイン・ビボでの診断試
薬としても使用可能かどうかを確認するために、ヌード
マウスの皮下に５ｘ１０5の２００８細胞を接種し、そ
の後、当該担癌マウスの腹腔にＲＢＰ−３を注入した。
注入１時間後に腫瘍を採取して検査した。結果を図１０
に示す。血管周囲の部位に位置する腫瘍細胞は陽性に染
色され、対照として生理食塩水を投与したものでは陽性
のシグナルが観測されなかった。
薬としても使用可能かどうかを確認するために、ヌード
マウスの皮下に５ｘ１０5の２００８細胞を接種し、そ
の後、当該担癌マウスの腹腔にＲＢＰ−３を注入した。
注入１時間後に腫瘍を採取して検査した。結果を図１０
に示す。血管周囲の部位に位置する腫瘍細胞は陽性に染
色され、対照として生理食塩水を投与したものでは陽性
のシグナルが観測されなかった。
【００６５】以上の結果は、ＲＢＰが、ＲＥＴ遺伝子の
発現検出の試薬として並びにＲＥＴを標的とする医薬と
して応用可能なことを示す。
発現検出の試薬として並びにＲＥＴを標的とする医薬と
して応用可能なことを示す。
【００６６】
【発明の効果】本発明のＲＥＴ遺伝子産物からなる卵巣
腫瘍マーカー物質は、卵巣腫瘍の診断における指標とな
り得、また当該マーカーを標的分子とした腫瘍の治療方
法をも提供する。
腫瘍マーカー物質は、卵巣腫瘍の診断における指標とな
り得、また当該マーカーを標的分子とした腫瘍の治療方
法をも提供する。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Sasaki, Hiroshi
<120> Novel ovarian carcinoma marker, method of analysing
the marker, kit for analysing the marker
and medicament for treating ovarian carcinoma.
<130> I-SSH-1
<160> 26
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 1
agatcctgga ggatccaaag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 2
gtatttggcg tactccacga 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 3
atttgcctgg cagatctcac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 4
cacagcagga caccaaaaga 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 5
caccatgggc gacctcat 18
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 6
gacaagccga aatccgaaat c 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 7
gcctggagag agtcctgtac ca 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 8
tgagggtgaa agcatccagt ta 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 9
tttgcctggc agatctcaca 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 10
agccgaaatc cgaaatcttc a 21
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 11
gaccgtacat gactataggc tggtt 25
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 12
gccctggaag tctgagtcat tg 22
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 13
gtgaggccaa ggcttggat 19
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 14
tgtccaataa gcatttttca aactct 26
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 15
ctggagttca agcggaagga 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 16
ctcccctgat gcaggtacca 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 17
ggatggagag gccagacaac t 21
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 18
ggctcctgct tccagcatt 19
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:RET binding peptide
<400> 19
Lys Ala Gly Arg Gly Arg Asp Arg
1 5
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:RET binding peptide
<400> 20
Gly Arg Gly Arg Asp Arg
1 5
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:RET binding peptide
<400> 21
Gly Cys Val Arg Leu Val Thr Gly Arg Gly Thr Arg
1 5 10
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:RET binding peptide
<400> 22
Gly Ser Lys Ala Gly Arg Gly Arg Asp Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:RET binding peptide
<400> 23
Gly Trp Ala Asn Gly Thr Ser Arg Val Val Arg Arg
1 5 10
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:RET binding peptide
<400> 24
Ile Ser Cys Ser Gly Ala Leu Arg Leu Pro Tyr Trp
1 5 10
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:RET binding peptide
<400> 25
Ile Leu Ser Gly Trp Arg Gly Leu Ala Pro Cys Ile
1 5 10
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:RET binding peptide
<400> 26
Gly Thr Leu Lys Gly Leu Arg Gln Gly Arg His Val
1 5 10
【図１】 卵巣癌細胞でのＲＥＴの発現に関する免疫組
織化学的解析結果を示す図面代用写真である。ＨｅＬ
ａ、２００８、Ａ２７８０ＡＤ、ＮＢ−３９−ｎｕ、Ｄ
*２４０およびＡＮ３ＣＡについて免疫染色を行なっ
た。赤色は抗ＲＥＴ抗体、緑色は抗核抗体を表す。
織化学的解析結果を示す図面代用写真である。ＨｅＬ
ａ、２００８、Ａ２７８０ＡＤ、ＮＢ−３９−ｎｕ、Ｄ
*２４０およびＡＮ３ＣＡについて免疫染色を行なっ
た。赤色は抗ＲＥＴ抗体、緑色は抗核抗体を表す。
【図２】 卵巣癌細胞株におけるＲＥＴタンパク質の検
出を示す図面代用写真である。卵巣癌細胞株で発現され
たＲＥＴの分子量は１３０ｋＤａである（上段パネ
ル）。
出を示す図面代用写真である。卵巣癌細胞株で発現され
たＲＥＴの分子量は１３０ｋＤａである（上段パネ
ル）。
【図３】 ＲＥＴのコスミド・クローン（１０ｑ１１．
２）および中心体マーカーＣＥＮ（１０ｑ１１．１−ｑ
１１．１）を示す図である。
２）および中心体マーカーＣＥＮ（１０ｑ１１．１−ｑ
１１．１）を示す図である。
【図４】 ２００８細胞株におけるＲＥＴのキャラクタ
リゼーションを示す図面代用写真である。ＦＩＳＨ分析
の結果、ＲＥＴ遺伝子の増幅、転座は認められない。
リゼーションを示す図面代用写真である。ＦＩＳＨ分析
の結果、ＲＥＴ遺伝子の増幅、転座は認められない。
【図５】 卵巣腫瘍の免疫組織化学的解析結果を示す図
面代用写真である。漿液性腺癌、粘液性腺癌および明細
胞腺癌について示した。左欄は第１抗体を用いない場合
（対照）、右欄は家兎抗ＲＥＴ抗体による。
面代用写真である。漿液性腺癌、粘液性腺癌および明細
胞腺癌について示した。左欄は第１抗体を用いない場合
（対照）、右欄は家兎抗ＲＥＴ抗体による。
【図６】 ランダム・ペプチド・ディスプレイ・ライブ
ラリーから得られたＲＢＰを示す図である。各々、配列
番号２１乃至２６に対応。ボックスはグリシンとアルギ
ニンの反復モチーフを示す。
ラリーから得られたＲＢＰを示す図である。各々、配列
番号２１乃至２６に対応。ボックスはグリシンとアルギ
ニンの反復モチーフを示す。
【図７】 ＲＥＴ陽性細胞に対するＲＢＰ−１の結合を
示す図面代用写真である。パネル１はＮＢ−３９−ｎｕ
（陽性対照）、パネル２はＨｅＬａ細胞（陰性対照）、
パネル３はＲＥＴ陽性細胞である２００８細胞へのＲＢ
Ｐ−１の結合を示す。パネル４はＲＢＰ−１の４位と６
位のアルギニンをアラニンに置換したペプチドによる２
００８細胞での結果を示し、特異的結合は認められな
い。
示す図面代用写真である。パネル１はＮＢ−３９−ｎｕ
（陽性対照）、パネル２はＨｅＬａ細胞（陰性対照）、
パネル３はＲＥＴ陽性細胞である２００８細胞へのＲＢ
Ｐ−１の結合を示す。パネル４はＲＢＰ−１の４位と６
位のアルギニンをアラニンに置換したペプチドによる２
００８細胞での結果を示し、特異的結合は認められな
い。
【図８】 ＲＥＴ発現に依存したＲＢＰ−１の結合を示
す図面代用写真である。ラット大腸癌細胞株ＲＣＮ−９
をＲＥＴ ｃＤＮＡの発現プラスミドで形質転換した。
パネル１はベクタープラスミドのみで形質転換したＲＣ
Ｎ−９、パネル２はＲＥＴ ｃＤＮＡによる形質転換
体。
す図面代用写真である。ラット大腸癌細胞株ＲＣＮ−９
をＲＥＴ ｃＤＮＡの発現プラスミドで形質転換した。
パネル１はベクタープラスミドのみで形質転換したＲＣ
Ｎ−９、パネル２はＲＥＴ ｃＤＮＡによる形質転換
体。
【図９】 ＲＥＴ陽性細胞へのＲＢＰの取り込みを示す
図面代用写真である。ビオチン化したＲＢＰ−１および
ＲＢＰ−３を培養物に加えた。赤色はＲＢＰ、緑色は核
からのシグナルを示す。
図面代用写真である。ビオチン化したＲＢＰ−１および
ＲＢＰ−３を培養物に加えた。赤色はＲＢＰ、緑色は核
からのシグナルを示す。
【図１０】 ＲＥＴ陽性卵巣癌細胞でのＲＢＰ−３の蓄
積を示す図面代用写真である。２００８細胞株を接種し
たヌードマウスの腹腔にビオチン化ＲＢＰ−３（パネル
３および４）或いは生理食塩水（パネル１および２）を
注射して投与した。１時間後腫瘍を摘出し分析した。検
出はＳＡ-ＦＩＴＣにより行なった。パネル１および３
は低倍率（ｘ１００）、パネル２および４は高倍率（ｘ
４００）での観察結果で、パネル２および４は、各々、
パネル１および３の囲み部分に相当する。矢印は血管内
の赤血球による蛍光を示し、赤血球自体が本来有する自
家蛍光であると考えられる。
積を示す図面代用写真である。２００８細胞株を接種し
たヌードマウスの腹腔にビオチン化ＲＢＰ−３（パネル
３および４）或いは生理食塩水（パネル１および２）を
注射して投与した。１時間後腫瘍を摘出し分析した。検
出はＳＡ-ＦＩＴＣにより行なった。パネル１および３
は低倍率（ｘ１００）、パネル２および４は高倍率（ｘ
４００）での観察結果で、パネル２および４は、各々、
パネル１および３の囲み部分に相当する。矢印は血管内
の赤血球による蛍光を示し、赤血球自体が本来有する自
家蛍光であると考えられる。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 15/00 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｃ０８５
35/00 Ｃ１２Ｎ 9/12
Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｑ 1/02
Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ
1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566
33/566 33/574 Ａ
33/574 33/577 Ｂ
33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 CA04 CA09 HA14
4B050 CC03 DD11 LL01 LL03
4B063 QA19 QQ03 QQ08 QQ44 QR55
QR62 QS25 QS33 QS34
4C076 CC26 CC27 EE41 FF68
4C084 AA13 MA05 NA13 ZA81 ZB26
4C085 AA13 AA14 BB01 BB07 CC21
EE01 EE05
Claims (16)
- 【請求項１】 ＲＥＴ遺伝子産物からなる卵巣腫瘍マ
ーカー物質。 - 【請求項２】 ＲＥＴ遺伝子の発現を検出することを
特徴とする、卵巣腫瘍マーカーの検査方法。 - 【請求項３】 上記ＲＥＴ遺伝子発現の検出が、ＲＥ
Ｔ遺伝子の転写物またはその断片を特異的に増幅するプ
ローブを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により行われる請求項２
に記載の検査方法。 - 【請求項４】 上記ＲＥＴ遺伝子発現の検出が、ＦＩ
ＳＨ法により行われる請求項２に記載の検査方法。 - 【請求項５】 上記ＲＥＴ遺伝子発現の検出が、ＲＥ
Ｔ遺伝子産物に特異的に結合する抗体を用いたイムノア
ッセイ法により行われる請求項２に記載の検査方法。 - 【請求項６】 上記ＲＥＴ遺伝子発現の検出が、ＲＥ
Ｔ遺伝子産物に特異的に結合する配列番号１９乃至配列
番号２６のアミノ酸配列を有するペプチドから選択され
る１以上のペプチドを用いて行われる請求項２に記載の
検査方法。 - 【請求項７】 ＲＥＴ遺伝子の発現が、卵巣腫瘍細胞
の悪性度の指標となる請求項２乃至６のいずれか１項に
記載の検査方法。 - 【請求項８】 ＲＥＴ遺伝子の発現が、卵巣腫瘍細胞
の組織型の指標となる請求項２乃至６のいずれか１項に
記載の検査方法。 - 【請求項９】 患者由来のバッフィーコートを試料に
用いることを特徴とする、請求項３または４に記載の検
査方法。 - 【請求項１０】 患者由来の血清または病理組織切片を
試料に用いることを特徴とする、請求項５または６に記
載の検査方法。 - 【請求項１１】 請求項３に記載の卵巣腫瘍マーカーの
検査のためのキットであって、該キットは、プライマー
として配列番号１乃至１８の塩基配列を有する核酸から
選択される１以上の核酸を含むことを特徴とする、前記
キット。 - 【請求項１２】 請求項５に記載の卵巣腫瘍マーカーの
検査のためのキットであって、該キットは、ＲＥＴ遺伝
子産物に対するモノクローナル抗体および／またはポリ
クローナル抗体を含むことを特徴とする、前記キット。 - 【請求項１３】 請求項６に記載の卵巣腫瘍マーカーの
検査のためのキットであって、該キットは、配列番号１
９乃至配列番号２６のアミノ酸配列を有するペプチドか
ら選択される１以上のペプチドを含むことを特徴とす
る、前記キット。 - 【請求項１４】 卵巣腫瘍を治療するための医薬であっ
て、該医薬は、ＲＥＴ遺伝子産物に対する特異的抗体に
コンジュゲートするか、或いは配列番号１９乃至配列番
号２６のアミノ酸配列を有するペプチドから選択される
ペプチドにコンジュゲートした制癌化合物を含むことを
特徴とする、前記医薬。 - 【請求項１５】 制癌化合物が、タキソール、シスプラ
チン、アドリアマイシン、エピルビシン、サイクロフォ
スファマイドおよびカンプトテシンからなる群から選択
される請求項１４に記載の医薬。 - 【請求項１６】 腫瘍を治療するための医薬であって、
該医薬は、ＲＥＴ遺伝子産物に対する特異的抗体にコン
ジュゲートするか、或いは配列番号１９乃至配列番号２
６のアミノ酸配列を有するペプチドから選択されるペプ
チドにコンジュゲートしたＲＥＴ遺伝子の発現を阻害し
うる核酸を含むことを特徴とする、前記医薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002104215A JP2003289877A (ja) | 2002-04-05 | 2002-04-05 | 新規卵巣腫瘍マーカー物質、該マーカーの検査方法および該検査のためのキット並びに卵巣腫瘍治療用医薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002104215A JP2003289877A (ja) | 2002-04-05 | 2002-04-05 | 新規卵巣腫瘍マーカー物質、該マーカーの検査方法および該検査のためのキット並びに卵巣腫瘍治療用医薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003289877A true JP2003289877A (ja) | 2003-10-14 |
Family
ID=29242875
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002104215A Pending JP2003289877A (ja) | 2002-04-05 | 2002-04-05 | 新規卵巣腫瘍マーカー物質、該マーカーの検査方法および該検査のためのキット並びに卵巣腫瘍治療用医薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003289877A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2223113A1 (en) * | 2007-12-21 | 2010-09-01 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Circulating ret receptor |
-
2002
- 2002-04-05 JP JP2002104215A patent/JP2003289877A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2223113A1 (en) * | 2007-12-21 | 2010-09-01 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Circulating ret receptor |
| EP2223113A4 (en) * | 2007-12-21 | 2011-04-06 | Siemens Healthcare Diagnostics | RECEIVER RET CIRCULANT |
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