JP2006506645A - 癌の存在またはステージの診断方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、癌の検出のための診断および予後方法において有用な、切頭されたCCAAT-置換タンパク質/Cutホメオボックスのアイソフォーム(CDP/Cux)に対する抗体を供する。さらに、癌の検出のために、p75をコードするRNA転写物の検出方法を供する。
Description
CCAAT-置換タンパク質/cutホメオボックス(CDP/Cux)は全ての後生動物中に存在する転写因子のファミリーに属し、そして、増殖および分化の制御に関係する(Nepveu (2001) Gene 270 : 1-15)。キイロショウジョウバエにおいて、多くの表現型は、Cut、CDP/Cuxホモログの組織特異的なエンハンサーと干渉する転移性の絶縁体配列の挿入に起因する(Jack,et al.(1991) Development 113:735-747;Jack and DeLotto(1995) Genetics 139:1689-1700;Modolell,et al.(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:1678-1682;Cai and Levine(1997) EMBO J.16:1732-1741;Dorsett(1993) Genetics 134:1135-1144)。その影響された組織は、翼(「cut翼」)、脚、外感覚器、マルピーギ尿細管、気管系、および中枢神経系中のいくつかの構造を含む(Jack,et al.(1991) supra;Jack(1985) Cell 42:869-876;Jack and DeLotto(1992) supra;Liu,et al.(1991) Genetics 127:151-159;Liu and Jack(1992) Dev.Biol.150:133-143;Bodmer,et al.(1987) Cell 51:293-307;Blanc(1942) Univ.Calif.Publ.Zool.49;Braun(1942) J.Exp.Zool.84:325-350;Hertweck(1931) J.Exp.Zool.139:559-663)。マウスおよびニワトリがCux-1およびCux-2を有するように、ヒトは、2つのCDP/Cux遺伝子であるCDP-1およびCDP-2を有する(Neufeld,et al.(1992) supra;Valarche,et al.(1993) Development 119:881-896;Quaggin,et al.(1996) J.Biol.Chem.271:22624-22634)。Cux-2は最初に神経組織中で発現されるが、Cux-1は主に組織に存在する(Neufeld et al.(1992) supra;Andres,et al.(1992) Development 116:321−334;Ellis,et al.(2001) Genes Dev.15:2307-2319)。Cux-1ノックアウトマウスは、ねじれた頬髯、成長遅延、肺上皮の遅延した分化、改変した毛の濾胞形態形成、オスの生殖不能、並びにTおよびB細胞中の欠損を含む様々な器官における表現型を示す(Ellis,et al.(2001) supra;Sinclair,et al.(2001) Blood 98:3658-3667;Luong,et al.(2002) Mol.Cell.Biol.22:1424-1437;Tufarelli,et al.(1998) Dev.Biol.200:69-81)。小型のcux-1ノックアウトマウスと比べ、Cux-1を発現する遺伝子組み換えマウスは、CMVエンハンサー/プロモーターの制御下において、多臓器過形成および臓器肥大を示す(Ledford,et al.(2002) Dev.Biol.245:157-171)。このように、ショウジョウバエおよびマウスにおける遺伝子実験は、CDP/Cux/Cut遺伝子が様々な組織の発達および恒常性において重要な役割を果たすことを示す。
組織培養液中で、CDP/Cuxの発現および活性化は細胞の増殖に関係し(Holthuis,et al.(1990) Science 247:1454-1457;van Wijnen,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2573-2577;Coqueret,et al.(1998) EMBO J.17:4680-4694)、その遺伝子の抑圧は末期の分化細胞中で起こり(Pattison,et al.(1997)J.Virol.71:2013-2022;Lawson,et al.(1998)Blood 91:2517-2524;van Gurp,et al.(1999) Cancer Res.59:5980-5988;O'Connor,et al.(2000) J.Virol.74:401-410;Skalnik,et al.(1991) J.Biol.Chem.266:16736-16744;Teerawatanasuk,et al.(1999) J.Neurochem.72:29-39)、そして、マトリックス付着領域の調節が起こった(Liu,et al.(1997) Mol.Cell.Biol.17:5275-5287;Banan,et al.(1997) J.Biol.Chem.272:18440-18452;Chattopadhyay,et al.(1998) J.Biol.Chem.273:29838-29846;Wang,et al.(1999) Mol.Cell.Biol.19:284-295;Stunkel,et al.(2000) J.Virol.74:2489-2501)。CDP/Cux/Cutタンパク質はDNA結合性ドメインを含む。全てのタンパク質は、少なくともCutホメオドメイン(HD)および3つのCut反復(CR1、CR2およびCR3)を含む。ホメオボックス遺伝子のcutスーパークラスは、3つのクラスに分割された:CUX、ONECUTおよびSATB(Burglin and Cassata(2002) Int.J.Dev.Biol.46:115-123)。ショウジョウバエCut、ヒトCDPおよびマウスCux遺伝子は3つのCut反復を含み、各種においてもまた、1つのCut反復を含むONECUT遺伝子が存在する(Neufeld,et al.(1992) supra;Valarche,et al.(1993) Decelopment 119:881-896;Blochlinger,et al.(1988) Nature 333:629-635;Lemaigre,et al(1996) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9460-9464;Lannoy,et al.(1998) J.Biol.Chem.273:13552-13562)。SATB1は2つのCut反復様ドメインおよび多岐にわたるCut様ホメオドメインを含む(Dickinson,et al.(1997) J.Biol.Chem.272:11463-11470)。
個々のCut反復はそれら自身上のDNAと結合することできないが、2番目のCut反復またはCutホメオドメインと協力する必要がある(Moon,et al.(2000) J.Biol.Chem.275:31325-31334)。2つのCDP/CuxDNA結合活性は、細胞中において報告された。CDP/Cux p200は、CR1CR2と同様に、一過性にDNAと結合し、そして、CCAAT-置換活性を輸送する(Neufeld,et al.(1992) supra;Skalnik,et al.(1991) supra;Moon,et al.(2000) supra;Barberis,et al.(1987) Cell 50:347-359)。細胞周期のG1/Sの移行において、p200のタンパク質分解性の切断はCDP/Cux p110を産出し、それは、CR2CR3HDを含み、そして、異なるDNA結合特異性およびキネティクスを示す(Moon,et al.(2001) Mol.Cell.Biol.21:6332-6345)。特に、p110はDNAと安定な相互作用を形成することができる。さらには、p110アイソフォームは、子宮平滑筋腫において、高レベルで発現される(Moon,et al.(2001) supra)。
現在の乳癌のための予後マーカーは不十分である。良好な予後乳癌をともなう患者の70%のみが、手術のみで実際に治癒するが、30%は癌が再発する。さらに、乳癌において最も有効な予後因子であるリンパ管状態の確立は、合併症無しでは存在しない。例えば、リンパ浮腫、腋窩管切開の可能性のある交配的な合併症は、患者の24%未満において発生しうる。それゆえ、乳房腫瘍の診断上における予後的および予測的な指標の改良が必要である。
このたび、新規のCDP/Cuxアイソフォーム、p75は、CDP/Cux座のイントロン20中で開始されるmRNAによりコードされることが発見された。この新規なアイソフォームは、p200、p110およびp100CDP/Cuxアイソフォームのものとは別々のDNA結合性を示す。イントロン20中で開始されるmRNAの発現は、ある組織または細胞に制限されるが、その発現は、乳房腫瘍細胞株中および初期のヒトの乳房腫瘍中、並びに、他の癌組織中で活性化される。
本発明は、癌を有する、あるいは、有する疑いのある患者から単離した資料中のCDP/Cuxアイソフォームのレベルを検出することによる、癌の診断方法を供する。切頭されたCDP/Cuxアイソフォームの増加レベルは、癌の存在またはステージを示す。
ある態様は、試料中の切頭されたCDP/Cuxアイソフォームのレベルを検出するための抗体結合アッセイを使用すること、および、上記レベルを既知のスタンダードと比較することを供する。
他の態様は、試料中のp75転写レベル評価すること、および、上記レベルを既知のスタンダードと比較することを供する。
また、資料中の切頭されたCDP/Cuxアイソフォームの検出キットを供する。
本発明のこれらおよび他の観点は、以下の発明の説明中でより詳細にする。
発明の詳細な説明
本発明は、切頭されたCDP/Cuxアイソフォームのレベルを検出することにより、癌の存在およびステージを診断する方法を供する。CDP/Cuxの切頭されたアイソフォームは、一般的に、p200のタンパク質分解的にプロセッシングされたアイソフォームである。すなわち、p200は完全長アイソフォーム以下に産出するためにプロテアーゼにより切断される。特に、p100およびp110の切頭化アイソフォームは、CDP/Cux座のイントロン20中で開始されたmRNAによりコードされる新たに発見されたp75アイソフォームとして是認される。
本発明は、切頭されたCDP/Cuxアイソフォームのレベルを検出することにより、癌の存在およびステージを診断する方法を供する。CDP/Cuxの切頭されたアイソフォームは、一般的に、p200のタンパク質分解的にプロセッシングされたアイソフォームである。すなわち、p200は完全長アイソフォーム以下に産出するためにプロテアーゼにより切断される。特に、p100およびp110の切頭化アイソフォームは、CDP/Cux座のイントロン20中で開始されたmRNAによりコードされる新たに発見されたp75アイソフォームとして是認される。
p75アイソフォームは、CDP-Cux座のエクソン19、20および21を含むリボプローブを使用してRNase マッピング分析において同定した。予測より小さな保護されたフラグメントは、ある出所、特に、ヘラ細胞および胎盤由来のRNAサンプルで産出した。この結果は、エクソン21を含んだもう1つのCDP/Cux転写物が存在したがエクソン20は含まなかったことを示した。また、p75をコードするこのRNA転写物は、本明細書において、I20-mRNAを意味する。その新規な転写物の5’末端は、リバースプライマーとして2つの連続的なエクソン21由来のオリゴヌクレオチドを使用して、cDNA末端の急速な増幅(RACE)方法により、胎盤からクローン化した。DNA配列決定分析は、エクソン21のRACE-増幅化配列の上流がイントロン20から始まり、そして、イントロン20/エクソン21ジャンクションの上流、少なくとも500ntに及んだことを示した。RACE反応において、夾雑しているゲノムDNAが鋳型として貢献した可能性を除外するため、フォワードプライマーとして、エクソン19またはイントロン20由来のオリゴヌクレオチドを、および、リバースプライマーとして、エクソン22由来のヌクレオチドを使用して、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)分析を行った。異なる大人のヒト組織(Clonetech,Palo Alto,CA)由来の第1鎖cDNAの調製物を、材料の出所として使用した。エクソン19および22のプライマーを使用して609bpのフラグメント、並びに、イントロン20およびエクソン22のプライマーを使用して474bpのフラグメントを得た。後者は、イントロン20、エクソン21およびエクソン22に由来する配列を含むmRNAの予想した大きさと一致する。この結果は、エクソン21の上流を開始し、そして、エクソン20を含まないCDP/Cuxの存在を確認した。マウスの組織から単離したRNAのRT-PCR分析は、類似する転写物が、そのマウスの胎盤および胸腺において高レベルで発現されることを確認した。マウスのI20-mRNAは成熟および未成熟T細胞中で発現したが、成熟CD8+T細胞中よりも成熟CD+4細胞中において高レベルで発現した。このため、これらの発見は、I20-mRNAが組織および細胞型に特異的な様式において発現することを示す。
予想した大きさのRT-PCR生成物は、エクソン21の上流、約500、1500、2500に位置したフォワードプライマーで得た。エクソン21の上流3000および35000ntに位置したオリゴヌクレオチドで得た生成物はなかった。それから、エクソン21の上流、−2270から−2978に位置するヌクレオチドを含むリボプローブで、RNaseマッピング分析を行った。独特な、約200ヌクレオチドの保護されたフラグメントが観察され、I20-mRNAの転写が、イントロン20/エクソン21ジャンクションの上流、約2.5kbpで開始することを示している。イントロン20のこの領域に対応する核酸配列は、SEQ ID NO:1として供する。これらの結果は、組織特異的な様式において発現し、そしてエクソン21の上流で開始される新規なCDP/Cux mRNAを限定する。
そのI20-mRNAは、長い5’-非翻訳配列、続いて、エクソン21の始まりを開始する開いた読み枠(open reading frame)を含む。AUGコドンは、HSCDP cDNA配列のnt3224に対応する位置に存在する(目録No.M74099)。この位置における配列、CCGAUGG(SEQ ID NO:2)は、Kozakコンセンサスに一致しない。さらに、タンパク質は in vitro 転写/翻訳系において発現し、そしてUUCのAUGでの置換は完全に翻訳を除去した。NIH3T3細胞の、マウスI20-mRNAをコードする核酸配列を宿す発現ベクターでのトランスフェクションは、マウスの胸腺中に存在するタンパク質と共遊走する75kDaの新規なタンパク質を増加させた。このタンパク質は、C末端α1300抗体で検出されたが、α23N末端CDP/Cux抗体では検出されなかった。
電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)において、トランスフェクションしたNIH3T3細胞由来の核抽出物は、α1300 CDP/Cux抗体でスーパーシフトされることができるが、無関係の抗体ではされない遅延した複合体を産出した。NIH3T3細胞を、そのカルボキシ終端にインフルエンザウイルスのヘマトグルチニン(hematoglutinin)(HA)タグを伴うp75を発現するベクターでトランスフェクションすると、トランスフェクションしたNIH3T3細胞の核中に、間接的な免疫蛍光による特異的なシグナルが検出された。これらの結果は、I20-mRNAが、DNAに局在化し、そして結合する75kDaのCDP/Cuxタンパク質をコードすることを実証する。
CDP/Cux p110アイソフォームはCR2、CR3およびHDを含み、一方、p75アイソフォームはCR3およびHDを含む。2つのアイソフォームのDNA結合性を、細菌性発現化、ヒスチジン(his)タグ化融合タンパク質およびトランスフェクションした哺乳動物細胞由来の核抽出物を使用して比較した。その精製したp110およびp75のヒスチジン(his)タグ化タンパク質は、それぞれ、0.7×10-9Mおよび1.1×10-9Mの見かけ上の解離定数を伴う類似したDNA結合アフィニティを示した。反対に、p110およびp75のDNA結合キネティクスは異なった。;p75のDNAに対する結合はp110よりも安定的であった。これらの発見に一致して、p110およびp75の解離速度は、それぞれ、0.8および6.15分であった。これらの結果は、p75 CDP/Cuxアイソフォームは、S期において発現するp110アイソフォームよりもDNAに対して安定的に相互作用することを示す。p75およびp110CDP/Cuxの転写調節特性は、レポーターアッセイを使用して並行して分析した。様々な実験結果は、p110およびp75タンパクともに、p21WAF1/CIP1レポーターを抑制し、類似した様式において、DNApolαレポーターからの発現を刺激したことを示した。このように、p75 CDP/Cuxは核に局在し、DNAと結合し、そして、標的遺伝子の転写を調節することができる。
CDP/Cuxの完全長およびI20-mRNAの発現は、乳房腫瘍細胞株のパネル中、およびヒトの乳房上皮細胞(HMEC)中で分析した。RNase保護分析による調査では、I20-mRNAに対応するフラグメントは、MCF7、SkBr3、BT20、MDA436、MDA231、MDA468、およびMCF10A中で検出されたが、BT549、MDA435s、またはMCF12A乳房腫瘍細胞株では検出されなかった。RT-PCRアッセイにおいて、I20-mRNAに対応するフラグメントは、分析した全ての乳房腫瘍細胞株で検出された(MCF12A、MCF10A、MCF7、BT20、MDA231、MDA436、SkBr3、T47DおよびZR-75-1)。同様に、ウェスタンブロット分析での調査によると、p75タンパク質は、MDA231、MCF10A、T47DおよびMCF7乳房腫瘍細胞株中で検出されたが、HMEC細胞中では検出されなかった。細胞株の2対中のI20-mRNAの発現をさらに分析した。I20-mRNAの発現は、腫瘍化Hs578T細胞株中の方が、その対応細胞である非腫瘍化Hs578Bst中よりも3-4倍高かった(Hackett,et al.(1977) J.Natl.Cancer Inst.58:1795-1806)。不死化および形質転換化したマウス器官の乳房内皮細胞株の対、HC11およびノッチ-HC11(Diecart,et al.(1999) Oncogene 18:5973-5981)は、また、マウスCDP/Cux I20-mRNAが形質転換した株中において、高レベル(約2倍)で発現したことを示した。このように、これらの発見は、CDP/Cux I20-mRNAおよびp75タンパク質の発現が多くの乳癌細胞中で活性化されることを示す。
p75が、乳房上皮細胞に細胞の形質転換に関係する特性を与えるか否かを決定するため、p75を安定的に発現するT47D細胞株を評価した。T47D細胞は、乳房腫瘍に由来するが、それらはコラーゲン中で尿細管を分化し、そして形成する能力を保持する(Keely(2001) Methods Enzymol.333:256-266;Keely,et al.(1995) J.Cell.Sci.108:595-607)。このため、これらの細胞は、推定上の発癌遺伝子の効果の研究のための細胞モデルを供する。興味深いことに、p75を発現するT47Dクローンは、もはや、コラーゲン中で尿細管を形成することができなかった。さらに、p75を発現するT47Dクローンにより産出されたコロニーは、凹窩シストではなく、しかし、代わりに中央の管腔を欠く細胞の緻密な凝集であった。これらの結果は、CDP/Cux p75、T47Dの強制的な発現において、細胞が、組織化された上皮シートを形成する能力を失うことを示す。
I20-mRNAは、多くの乳癌において発現するが、正常な乳房組織では発現しない。RT-PCR分析を使用して、I20-mRNAは、既知の乳房の症状を除く女性由来の縮小乳房形成組織の試料から単離したRNA中では検出されなかった。この結果は、I20-mRNAが、正常なマウス乳腺中で発現しなかったという発見と一致する。しかしながら、3つの乳癌のケース、C8921D、A168AおよびC8961B腫瘍において、強力なI20-mRNAシグナルが観察された。これらの腫瘍の2つ、C8921DおよびC8961Bは、浸潤性小葉癌腫であり、一方、A168Aは、極めて散在性の成長パターンを伴う浸潤性の管、小葉混合癌腫に分類された。低い(C9978B、C9991B、A35C、A67A、B11305D、C10544B、C10544B、C800A、C86644AおよびC8996D腫瘍)または無(C9096AおよびC7903A腫瘍)のI20-mRNA発現を示す全ての他の腫瘍は、管癌腫として分類された。
I20-mRNAの発現は、より散在的な成長パターンに関係しているように見える。このため、管、小葉または小葉/管混合癌腫のいずれかの分類に基づき選択された浸潤性癌腫の拡大パネルにおいて、I20-mRNA発現を試験した。I20-mRNA発現レベルは、浸潤性管癌腫と比較して、浸潤性小葉および浸潤性小葉/管混合癌腫と有意に関係した(表1)。
これらの結果は、I20-mRNAが、粘着性のクラスターおよび細管を形成する能力を示す乳房腫瘍と比較して、より散在的な成長パターンを示す乳房腫瘍のサブセットにおいて高レベルで発現することを示す。これらの結果は、乳房上皮細胞が、I20-mRNAの強制的な発現におけるコラーゲン中での細管を形成するそれらの能力を喪失したことを示す組織培養液アッセイと一致する。
I20-mRNAおよびp75は、急性骨髄白血病(AML)細胞株中で発現する。CDP/Cux α1300抗体によるウェスタンブロッド分析において、4つのAML細胞株、KG-1a、MV4−11、RS4-11およびTF1中にp75の存在を検出した。このように、RT-PCR分析により測定されたように、I20-mRNAに対応するフラグメントは、AML細胞株、KG-1a、RS4-11およびTF1中で検出されたが、KG-1、MV4-11、HL-60、またはHELでは検出されなかった。これらの結果は、切頭されたCDP/Cuxアイソフォームが、癌腫、並びに、他のクラスの癌の検出に有用であることを示す。
腫瘍および腫瘍細胞株は、p100、p110、p75およびp75をコードするRNA転写物(I20-mRNA)のレベルが上昇した。特に、より散在的な成長パターンを示す腫瘍は、切頭されたCDP/Cuxアイソフォームのレベルが上昇した。したがって、これらの切頭されたCDP/Cuxタンパク質および核酸配列は、診断上の、予後的な、もしくは予測的な方法またはアッセイの一部として使用できる。それによって、患者のp100、p110、p75またはp75をコードするRNA転写物のレベルの増加または上昇を試験することができる。本発明の診断方法を使用して、熟練した臨床家は癌の存在を決定すること、癌の感染度またはステージの程度を決定すること、発達する転移の可能性を評価すること、および、様々な治療法に対する応答を予想することが可能となるだろう。
一般的に、切頭されたCDP/Cuxアイソフォームを検出するためのアッセイは、試料、例えば、癌を有する、または、有するおそれのある患者由来の組織診試料、組織、細胞または液体(例えば、全血または血清)の単離を含んで成る。それから、p100、p110、p75またはp75RNA転写物(I20-mRNA)のレベルを、本明細書において供した方法に従い評価する。検出できる癌は、制限することなく、脳(グリア芽細胞腫、髄芽腫、星細胞腫、乏突起細胞腫、上衣細胞腫)、肺、肝臓、脾臓、腎臓、膵臓、小腸、血球、リンパ管、結腸、直腸、乳房、子宮内膜、胃、前立腺、精巣、卵巣、子宮、皮膚、頭部および頸部、食道、骨髄、血液または他の組織の癌を含む。特に、本発明の方法は、癌腫、例えば、基底および扁平細胞癌腫、消化管癌腫(例えば、結腸直腸癌、食道の癌腫、並びに、膵臓、肝臓および胆道癌腫)および乳房、子宮、卵巣、精巣、前立腺、および膀胱癌腫の検出に有用である。好ましい態様において、本発明の方法は、乳癌の分析において使用される。
本発明のある観点は、試料、CDP/Cuxのp75アイソフォームをコードするRNA転写物において、検出するための方法を供する。一般的に、核酸は、標準的な方法に従い(例えば、Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York) 試料中に含まれる細胞から単離する。理想的には、試料中に存在する正常な細胞から腫瘍細胞を単離するために、その腫瘍の顕微解剖に従い調製する。核酸は、全細胞RNAまたはポリ-A+への分画であってよい。そのRNAを相補的DNA(cDNA)に転換することを所望してもよい。通常は、その核酸を増幅する。
試料から単離した核酸中に存在するp75RNA転写物(I20-mRNA)のレベルを評価または定量するために、様々な方法が使用できる。例えば、p75RNA転写物(I20-mRNA)のレベルは、周知の方法、例えば、ノーザンブロット分析;オリゴヌクレオチドまたはcDNAがチップまたはウェハー上のアレイ中に設定される、オリゴヌクレオチドまたはcDNAフラグメントハイブリダイゼーション;本明細書中に例示したような、RNase保護分析またはRT-PCRを使用して評価できる(例えば、Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning ,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New Yorkを参照のこと)。
そのような検出方法に有用な、適当なプライマー、ブローブ、またはオリゴヌクレオチドは、本明細書において例示され、あるいは、p75RNA転写物(I20-mRNA)中に含まれるが、それより大きなCDP/Cuxアイソフォームすなわち、p100、p110、およびp200の転写物には不存在の核酸配列を含んで成る、SEQ ID NO:1として供される配列から、当業者により産出されてもよい。本明細書において定義される、プライマーの語は、鋳型依存の工程において新生の核酸の合成をプライミングすることが可能ないかなる核酸をも包含することを意味する。一般的に、プライマーは、その長さにおいて、10から20塩基対のオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列を利用してもよい。プライマーは、1本鎖形態であることが好ましいが、2本鎖または1本鎖形態においても供することができる。プローブは、プライマーとしても作用できるが、別に定義される。プローブは、おそらくプライミングが可能であるが、標的DNAまたはRNAと結合するために設計され、そして、増幅工程において使用する必要はない。好ましい態様において、プローブまたはプライマーは、例えば、放射性化学種(32P、14C、35S、3H、または他の標識)またはフルオロフォア(ローダミン、フルオレッセイン)で標識する。本出願によれば、そのプローブまたはプライマーは非放射性のものを使用、即ち非標識にしてもよく、そしてRNAまたはcDNA分子を標識する。
試料中のp75RNA転写物の存在レベルを評価するために、様々なRT-PCTの方法を利用することができる。臨床的な試料が可変的な量および質である場合、相対的な定量RT-PCR反応は、内部標準を用いて行うことができる。その内部標準は、標的cDNAフラグメントよりも大きな増幅可能なcDNAフラグメントであってよく、そして、内部標準をコードするmRNAの存在量が、その標的をコードするmRNAよりもおよそ5-100倍高くてもよい。このアッセイは、相対的な存在量を測定するが、それぞれのmRNA種の存在量は測定しない。
外部の標準プロトコルを用いて、よりありふれた相対的な定量RT-PCRアッセイを使用して、他のアッセイを行うことができる。これらのアッセイは、それらの増幅カーブの直線部分におけるPCR生成物をサンプリングする。サンプリングに最適なPCRサイクルの数は、各標的cDNAフラグメントに対して経験的に決めなければならない。付け加えると、様々な試料から単離した各RNA群の逆転写酵素生成物は、等濃度の増幅可能なcDNAのために慎重に規準化しなければならない。アッセイが絶対的なmRNAの存在量を測定するために、この考慮は極めて重要である。絶対的なmRNAの存在量は、規準化した試料中でのみ、異なる遺伝子発現の測定として使用できる。増幅カーブの直線範囲の経験的な決定およびcDNA調製の規準化は退屈で時間を費やす工程であるが、RT-PCRアッセイの結果を、内部標準を用いた相対的な定量RT-PCRアッセイ由来のものよりも優れたものにできる。
本発明により特に意図するものは、チップに基づくDNA技術である。端的には、これらの技術は、迅速且つ正確な大量の遺伝子分析のための定量方法を含む。オリゴヌクレオチドでのタギング、または固定したプローブアレイを使用することにより、あるものは、ハイブリダイゼーションに基づくこれらの分子の高密度アレイおよびスクリーンとして、標的分子を分離するためのチップ技術を利用できる(例えば、Pease,et al.(1994) Science 251(4995):767-73 を参照のこと)。
そのフォーマットに基づき、視覚的な手段(例えば、ゲルの臭化エチジウム染色)により、検出を行うことができる。あるいは、その検出は、化学発光、蛍光標識の放射標識を介する、あるいは、電気的なまたは温度的な衝撃シグナルを介する生成物の間接的な同定を含んでもよい(Bellus (1994) J.Macromal.Sci.Pure Appl.Chem.A311:1355-1376)。
本発明の他の観点は、試料中の、CDP/Cuxの切頭されたアイソフォーム、例えば、p75、p100、およびp110の検出方法を供する。従って、p75、p100およびp110を特異的に認識する抗体を供する。様々なCDP/Cuxアイソフォーム(すなわち、p75、p100、p110、およびp200)を識別することができ、そして、抗原-抗体の複合体を形成するために唯一のアイソフォームと結合できる場合、抗体は、切頭されたCDP/Cuxアイソフォームを特異的に認識すると言える。例えば、p75を特異的に認識する抗体は、p75のみと結合し、p100、p110またはp200とは結合しないであろう。同様に、p110を特異的に認識する抗体は、p110にだけ結合し、p75、p100、またはp200とは結合しない。
CDP/Cuxの切頭されたアイソフォームを特異的に認識する抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであってよい。さらに、それらの抗体は、天然物または、部分的もしくは全体的な合成産出物であってよい。また、CDP/Cuxの切頭されたアイソフォームと特異的に結合および認識する能力を維持する、全てのフラグメントまたはその誘導体も含まれる。その抗体は、いかなるヒトクラス:IgG、IgM、IgA、IgD,およびIgEを含む、いかなる免疫グロブリンクラスのメンバーであってよいが、しかしながら、本発明においては、IgGクラスの誘導体が好ましい。
抗体フラグメントは、完全長以下の抗体のいかなる誘導体であってよい。好ましくは、その抗体フラグメントは、少なくとも完全長抗体の特異的な結合能の有意な一部を維持する。抗体フラグメントの例は、制限することなく、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、Fv、dsFv完全体、またはFdフラグメントを含む。その抗体フラグメントは、いかなる方法により産出されてもよい。例えば、その抗体フラグメントは、無処置の抗体の断片化により酵素的にまたは化学的に産出してもよく、部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組み替え的に産出してもよい。その抗体フラグメントは任意的に、1本鎖抗体フラグメントであってもよい。あるいは、そのフラグメントは、例えば、ジスルフィド結合によって共に結合する多重鎖を含んで成ってよい。また、そのフラグメントは、任意的に、多分子複合体であってよい。機能的な抗体フラグメントは、一般的に、約50以上のアミノ酸を含んで成り、そして、さらに一般的には、約200以上のアミノ酸を含んで成るであろう。
本発明の抗体は、古典的なクローニングおよび細胞融合技術を使用して産出できる。例えば、注目の抗原は、一般的に、野生型もしくは近郊系マウス(例えば、BALB/c)または所望した抗体を生産する遺伝子組み換えマウス、または、ラット、ウサギ、または、原生もしくはヒト抗体を産出することができる他の動物に対して投与する(例えば、腹腔内注射)。その抗原は、p75、p100、p110またはそのフラグメントであってよい。好ましい態様において、その抗原は、p75、p100またはp110の新規なN-終端である。その抗原は、単独で、またはアジュバントと混合して、またはベクター(VEEレプリコンベクター)から発現させて、または、DNAとして、または、免疫応答を誘導するための融合タンパク質として投与できる。融合タンパク質は、キャリアータンパク質、2、3例を挙げると例えば、ヒスチジンタグ(his)、マウスIgG2a Fcドメイン、β-ガラクトシダーゼ、グルタチオン、S-トランスフェラーゼ、スカシ貝ヘモシアニン(KLH)、または、ウシ血清アルブミンとカップリングすることが所望される免疫応答に対するペプチドを含んで成る。これらのケースにおいて、ペプチドは、我々にとって、キャリアータンパク質を伴うハプテンとして役立つ。例えば、2回以上、動物に追加免疫した後、脾臓を摘出し、そして、スプレノサイトを抽出し、そして、周知の方法を使用してミエローマ細胞と融合させる(Kohler and Milstein(1975) Nature 256:495-497;Harlow and Lane(1988) Antbodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。それから、その結果生成した、所望するモノクローナル抗体を産出するハイブリッド細胞を、慣習的な方法、例えば、限界希釈、および生成したクローンを使用してクローン化し、培養する。
あるいは、CDP/Cuxの切頭されたアイソフォームを特異的に認識する抗体は、ファージディスプレイ法により由来する。ファージディスプレイ抗体の産出方法は当業界において周知である(例えば、Huse,et al.(1989) Science 246(4935):1275-81)。
CDP/Cuxアイソフォーム特異性抗体の選択は、CDP/Cuxの切頭されたアイソフォームに対する結合アフィニティに基づき、そして、in vitro、in vivo、または in situ で行うことができる、酵素結合免疫吸着法、免疫分散化学発光法、免疫蛍光法、免疫組織化学法、放射免疫アッセイ、凝集、補体固定法、免疫電気泳動、および免疫沈降アッセイ等を含む様々な周知の免疫アッセイにより決定してもよい。これらの標準技術は当業者にとって周知である(例えば、"Method in Immunodiagnosis",2nd Edition,Rose and Bigazzi,eds.John Wiley&sons,1980;Campbell et al.,"Methods and Immnology",W.A.Benjamin,Inc.,1964;and Oellerich,M.(1984) J.Clen.Chem.Clin.Biochem.22:895-904 を参照のこと)。それから、抗体は、抗原の免疫吸着、続いて、無処置のCDP/Cuxに対応する架橋ペプチドでの2サイクルの免疫枯渇により、精製できる。
一度、完全に特異性を特徴付けたら、健康組織および疾患組織中のp75、p100またはp110アイソフォームのレベルを評価するために、例えば、ELISA法、ウェスタンブロット法、または免疫組織化学法といった技術を介して、診断上の、予後的および予測的な方法を使用することができる。これらの抗体の使用は、将来的な癌の前兆としての悪性度の存在もしくは不存在のための、または、組織学的クラスもしくは癌のタイプを同定するためのスクリーンを供する。さらにこの方法は、単独でも、または、他の周知な腫瘍診断方法との組み合わせにおいても使用できる。例えば、抗-p75、抗-p100または抗-p110抗体を使用する乳房腫瘍切片の免疫組織化学的分析は、erbB2発現の腫瘍切片の免疫組織化学的分析を含む、乳房腫瘍の診断的な特徴付けのために、現在の手順に加えてもよい。
切頭されたCDP/Cuxアイソフォームを検出するための一般的な方法は、試料と、CDP/Cuxの切頭されたアイソフォームを特異的に認識する抗体との接触を供する。その抗体は、抗体-抗原複合体を形成するために、切頭されたCDP/Cuxアイソフォームと結合することを許容する。その抗体-抗原複合体を形成するために必要とする条件および時間は変えることができ、そして、試験試料および使用される検出方法に依存する。例えば、試料の洗浄により、一度、非特異的な総合作用を除去し、その抗体-抗原複合体を、上述した抗原を検出および/または定量するための適切ないくつかの周知な免疫アッセイのいかなる免疫アッセイを使用して検出する(例えば、Harlow and Lane(1988) supra を参照のこと)。そのような周知の免疫アッセイは抗体捕獲アッセイ、抗原捕獲アッセイ、および2抗体サンドウィッチアッセイを含む。
免疫アッセイは、一般的に、標識化抗原、抗体、または検出のための2次試薬に依存する。これらのタンパク質は、放射性化合物、酵素、ビオチン、または、蛍光色素で標識してもよい。このうち、放射性標識は、ほぼ全てのタイプのアッセイに使用できる。酵素接合標識は、特に、放射性を回避しなければならない場合、または、すぐに結果が必要である場合に有用である。ビオチンカップリング試薬は、通常、標識化ストレプトアビジンとともに標識する。ストレプトアビジンは、密接に、かつ素早くビオチンと結合し、そして、ラジオアイソトープまたは酵素で標識化してもよい。蛍光色素は、それらの使用に高価な設備が必要であるが、極めて高感度な検出方法である。これらの普通の当業者は、本発明において利用できる他の適当な標識法を知っているであろう。これらの標識の抗体またはそのフラグメントとの結合は、標準技術を使用して達成でき(例えば、Kennedy,et al(1976) Clin.Chim.Acta 70:1-31;Schurs,et al.(1977) Clin.Chim Acta 81:1-40)、そして、これらの標識を検出する方法もまた、当業者に周知である。
試料中に存在するp75、p100、p110またはp75RNA転写物のレベルの検出後、与えられた患者において示された結果を、既知のスタンダードと比較する。既知のスタンダードは、試料が得られたその患者に関連する診断上の、予後的、または予測的な情報を供するために、正常な患者および癌を有する患者の統計的に有意な基準群でよい。そのスタンダードは、腫瘍の複数のクラスに由来する複数の腫瘍試料の診断的な分析を行うことにより産出できる。例えば、乳房腫瘍の既知のスタンダードは、組織学的タイプ(乳輪(aveolar)または管)、腫瘍の段階、リンパ管浸潤、標識指数(または腫瘍細胞の増殖)、erbB2発現レベル、エストロゲンまたはプロゲステロン受容体、およびp53状態、疾患を除いた生存率、および全体的な生存率を含む、様々な臨床的および生物学的パラメータを含んで成ってよい。
また、本発明は、本発明を実施するために有用なキットを供する。本キットは、切頭されたCDP/Cuxアイソフォームを特異的に認識する抗体を含む容器を含んで成る。また、そのキットは、本発明を実施するために必要または便利な他の溶液を含んで成る。その容器は、ガラス、プラスチックまたは箔で作られていてもよく、そして、バイアル、ビン、ポーチ、チューブ、バッグ等として作られてもよい。また、そのキットは、記載情報、例えば、本発明を実施するための手順または分析的情報、例えば、最初の容器中に含まれる試薬量を含んでよい。その容器は、他の容器、例えば、箱、またはバッグ中に、記載情報とともに存在してもよい。
本発明は、以下の制限の無い実施例により、さらに詳細に説明される。
RNAの調製、RNaseマッピング、逆転写酵素-PCR
RNAは、商業者の指示に従い、TRIZOLTM(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)を使用して調製し、そして、RNaseを含まないDNaseにより37℃で30分間処理した。
RNaseマッピングのためのリボプローブを周知の方法を使用して調製した(Zeng,et al.(2000) Gene 241:75-85)。80%ホルムアミド、0.4MのNaCl、0.4Mのピペラジン-N,N-ビス(2-エタンスルホン酸)(PIPES)(pH6.4)、1mMのEDTA中で、40μgの全RNAを8×105cpmの標識化リボプローブへと54℃16時間アニールした。RNA-RNAハイブリッドを、1ml当たり30ユニットのRNase T2(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)で、37℃で1時間消化した。それから、ハイブリッドを20μgのtRNA、295μlの4Mのグアニジンチオシアネートおよび590μlのイソプロパノールで沈殿させた。ペレットを、80%ホルムアルデヒド、1×TBEおよび0.1%キシレンシアノール+ブロモフェノールブルー中で最懸濁し、変性させ、そして、4%アクリルアミド-8M 尿素ゲル上で電気泳動した。
逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を、基準化したHuman Multiple Tissue cDNA(MTCTM)を行い、第一鎖cDNA調製物を異なる大人のヒト組織(Clonthech,Palo Alto,CA)から得た。マウス組織、胸腺細胞、乳房腫瘍細胞株、および乳房腫瘍試料(Mnitoba Breast Tumor Bank,Canada)由来のcDNAを、SuperscriptTM IIRNaseH-逆転写酵素(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)を使用して、商業者の指示に従い調製した。使用したプライマーは、:
Fi20 5’-GCTATTTTCAGGCACGGTTTCTC(SEQ ID NO:3)(ヒト、イントロン20中nt−40から−18、SEQ ID NO:1のnt1962−1984);
B22 5’-TCCACATTGTTGGGGTCGTTC(SEQ ID NO:4)(ヒト、目録no:M74099のnt3630−3609、マウス、目録no:NM_009986のnt3345-3324);
F19 5’-AGAAAGGCCGAGAACCCTTCA(SEQ ID NO:5)(ヒト、目録no:M74099のnt3021-3041);
Fi20m 5’-CGACGGTCCCCTTCTGGAATGG(SEQ ID NO:6)(マウス、イントロン20中nt−111から−88);
およびF18 5’-CAAGCGCTGAGTCCC(SEQ ID NO:7)(マウス目録no:NM_009986のnt2406-2420)を含む。
Fi20 5’-GCTATTTTCAGGCACGGTTTCTC(SEQ ID NO:3)(ヒト、イントロン20中nt−40から−18、SEQ ID NO:1のnt1962−1984);
B22 5’-TCCACATTGTTGGGGTCGTTC(SEQ ID NO:4)(ヒト、目録no:M74099のnt3630−3609、マウス、目録no:NM_009986のnt3345-3324);
F19 5’-AGAAAGGCCGAGAACCCTTCA(SEQ ID NO:5)(ヒト、目録no:M74099のnt3021-3041);
Fi20m 5’-CGACGGTCCCCTTCTGGAATGG(SEQ ID NO:6)(マウス、イントロン20中nt−111から−88);
およびF18 5’-CAAGCGCTGAGTCCC(SEQ ID NO:7)(マウス目録no:NM_009986のnt2406-2420)を含む。
プライマーは、5μlの10×キナーゼバッファー(70mMのTrisHCl、pH7.6、10mMのMgCl2および5mMのDTT)、T4ポリヌクレオチドキナーゼの15ユニットおよび0.8mCiのγ32P-ATPを含む、最終容量50μl中で標識し、そして37℃で1時間インキュベートした。取り込まれなかったヌクレオチドを、Sephadex G25スピンカラムを使用して除去した。PCRを1ngのcDNA、1.5mMのMgCl2、3μlの標準10×PCRバッファー(200mMのトリス-HCl、pH8.4、500mMのKCl)、0.45μMの各プライマー、0.12mMのdNTP、および1ユニットのTaqポリメラーゼ(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)を含む最終容量30μl中で行った。95℃で4分間の最初の変性工程、続いて、95℃で45秒間の変性、61℃で50秒間のアニーリング、そして、72℃で60秒間の伸長の25サイクル、続いて、72℃で7分間の最後の伸長により行った。反応条件がプラトーに達しなかったことを保証するため、パイロット反応を行った。
細胞培養
Hela、HEL、293およびNIH3T3細胞は、10%胎児ウシ血清(FBS)を追加した、イーグルのダルベッコ改変培地(DMEM)中で培養した。乳房腫瘍細胞株MCF7、MDA231、MDA468、T47D、Hs578T、MDA435s、およびBT549は、5%FBSを追加したDMEM中で培養した。MDA436細胞は、15%FBSおよび10mg/mlのインスリン(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)を追加したレイボビッツ(Leibovitz)培地中で培養した。MCF10AおよびMCF12A細胞は、5%ヘパリンスルフェート、10mg/mlのインスリン、0.5mg/mlのヒドロコルチゾール(SIGMATM-Aldrich,St.Louis,MO)、0.1mg/mlのコレラエンテロトキシン(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)、および20ng/mlのEGF(Boehringer Mnngeim,Germany)を追加した50%DMEM-F12培地中で培養した。HMEC細胞は、商業者の培地および指示(Clonetics,San Diego,CA)を使用して培養した。トランスフェクションは、ExGene500(MBI Fermentas,Germany)を使用して、商業者の指示に従い行った。
Hela、HEL、293およびNIH3T3細胞は、10%胎児ウシ血清(FBS)を追加した、イーグルのダルベッコ改変培地(DMEM)中で培養した。乳房腫瘍細胞株MCF7、MDA231、MDA468、T47D、Hs578T、MDA435s、およびBT549は、5%FBSを追加したDMEM中で培養した。MDA436細胞は、15%FBSおよび10mg/mlのインスリン(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)を追加したレイボビッツ(Leibovitz)培地中で培養した。MCF10AおよびMCF12A細胞は、5%ヘパリンスルフェート、10mg/mlのインスリン、0.5mg/mlのヒドロコルチゾール(SIGMATM-Aldrich,St.Louis,MO)、0.1mg/mlのコレラエンテロトキシン(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)、および20ng/mlのEGF(Boehringer Mnngeim,Germany)を追加した50%DMEM-F12培地中で培養した。HMEC細胞は、商業者の培地および指示(Clonetics,San Diego,CA)を使用して培養した。トランスフェクションは、ExGene500(MBI Fermentas,Germany)を使用して、商業者の指示に従い行った。
プラスミド作成
ヒトのイントロン20-mRNAの発現のために、イントロン20由来の配列と結合するXhoIおよびNotI部位を含む5’末端プライマー(5’-ACTGCTCGAGCGGCCGCTTTTAGCAGAATGCCCTCATG、SEQ ID NO:8)およびHSCDPのnt3862-3841に対応する3’末端プライマー(目録番号M74099)(5’-GTTTTTGGTGACGGGTATGGC、SEQ ID NO:9)を使用して、PCR増幅を行った。その生産物をXhoIおよびBstXI(HSCDPのnt3625)で消化し、そして、HSCDPのnt3625から4511を含むBstXI-NotIフラグメントで連結した。それから、NotIフラグメントをpcDNA3.1ベクター(INVITROGENTM,Carlsbad,CA)の対応部位に導入し、そして、XhoI-NotIフラグメントをpMX139ベクターへ挿入した。
ヒトのイントロン20-mRNAの発現のために、イントロン20由来の配列と結合するXhoIおよびNotI部位を含む5’末端プライマー(5’-ACTGCTCGAGCGGCCGCTTTTAGCAGAATGCCCTCATG、SEQ ID NO:8)およびHSCDPのnt3862-3841に対応する3’末端プライマー(目録番号M74099)(5’-GTTTTTGGTGACGGGTATGGC、SEQ ID NO:9)を使用して、PCR増幅を行った。その生産物をXhoIおよびBstXI(HSCDPのnt3625)で消化し、そして、HSCDPのnt3625から4511を含むBstXI-NotIフラグメントで連結した。それから、NotIフラグメントをpcDNA3.1ベクター(INVITROGENTM,Carlsbad,CA)の対応部位に導入し、そして、XhoI-NotIフラグメントをpMX139ベクターへ挿入した。
T47Dコラーゲンアッセイ
T47D細胞を1μgのpSV-NEOとともに10μgのpMXまたはpMX-p75でトランスフェクションした。安定的にタンパク質を発現している細胞株を400μg/mlのG418(Bibco BRL,Gaithersburg,MD)で3週間選別した。細管形成の検出のためのアッセイを、2×105細胞/mlを5%FBSで追加したDMEM中の1.3mg/mlのコラーゲンに加えることにより行った(Keely(2001) supra;Keely,et al.(1995) supra)。細胞を10日間培養した。Retiga 1300デジタルカメラ(QIMGINGTM,Burnaby,BC,Canada)および10×対物レンズを伴うZeiss AxioVert 135顕微鏡(Carl Zeiss Canada Ltd.,Toronto,Canada)を使用して、細管を可視化させた。それから、コラーゲン中の細胞を、4%パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋し、そして切片化した(8μM)。切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。40×対物レンズを使用してPixCell IITM LCMシステム(Arcturus Engineering Inc.,Mountain View,CA)を使用してイメージを得た。
T47D細胞を1μgのpSV-NEOとともに10μgのpMXまたはpMX-p75でトランスフェクションした。安定的にタンパク質を発現している細胞株を400μg/mlのG418(Bibco BRL,Gaithersburg,MD)で3週間選別した。細管形成の検出のためのアッセイを、2×105細胞/mlを5%FBSで追加したDMEM中の1.3mg/mlのコラーゲンに加えることにより行った(Keely(2001) supra;Keely,et al.(1995) supra)。細胞を10日間培養した。Retiga 1300デジタルカメラ(QIMGINGTM,Burnaby,BC,Canada)および10×対物レンズを伴うZeiss AxioVert 135顕微鏡(Carl Zeiss Canada Ltd.,Toronto,Canada)を使用して、細管を可視化させた。それから、コラーゲン中の細胞を、4%パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋し、そして切片化した(8μM)。切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。40×対物レンズを使用してPixCell IITM LCMシステム(Arcturus Engineering Inc.,Mountain View,CA)を使用してイメージを得た。
p75の局在性および結合性アッセイ
周知方法(Moon,et al.(2000) supra)を使用して核抽出物を調製した。
周知方法(Moon,et al.(2000) supra)を使用して核抽出物を調製した。
マウス胸腺タンパク質の抽出物を、バッファーX(50mMのHepes、pH7.9、0.4MのNaCl、4mMのNaF、4mMのNaVO3、0.2mMのEDTA、0.1%NP-40、10%グリセロール、およびプロテアーゼ阻害因子(Roche,Indianapolis,IN))中での均質化により調製した。
CR2CR3HDおよびCR3HDを発現するpET-15bベース(NOVAGEN(登録商標),Madison,WI)細菌性発現ベクターを、BL21(DM3)大腸菌(E.coli)中に導入し、IPTGで誘導した。その融合タンパク質を、アフィニティクロマトグラフィーを使用して商業者の指示に従い精製した。
電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)を行い、そして周知方法(Moon,et al.(2000) supra;Moon,et al.(2001) supra)を使用して、DNA結合性のキネティックスおよびアフィニティを測定した。
標準技術(Moon,et al.(2000) supra)を使用してルシフェラーゼアッセイを行った。
NIH3T3細胞をカバーガラス上に置き、そして5μgのpMX-p75-HAでトランスフェクションした。2日後、細胞を2分間、100%メタノールで固定した。1×リン酸バッファー食塩水(PBS)で2回洗浄後、細胞を50mMのNH4Cl中で10分間消光化し、10分間可溶化し(95%PBS+5%FBS+0.5%TRITON(登録商標)X-100)、そして抗-HA抗体(1:10000)で、室温において1時間インキュベートした。広範な洗浄後、2番目の抗体(抗マウス alexa 488-接合化、1:1000)を遮光中、室温で30分間インキュベートした。Retiga 1300デジタルカメラ(QIMGINGTM,Burnaby,BC,Canada)および63×対物レンズを伴うZeiss AxioVert 135顕微鏡(Carl Zeiss Canada Ltd.,Toronto,Canada)を使用して、細胞を可視化させた。Northern Eclipse Version6.0(Empix Imaging,Missisauga,Canada)を使用してイメージを分析した。
ヒト乳癌検体分析
2つのサブグループ(Monitoba Breast Tumor Bank,Canada)での分析のため、41の浸潤性管癌腫を選別した。整合させた鏡像パラフィンおよび凍結組織ブロックを産出するため、全てのケースを一律に行った。RNA抽出およびRT-PCR分析(Hiller,et al.(1996) Biotechniquis 21:38-44)のために使用した凍結組織切片と直接近接した組織由来の高品質パラフィン切片中で、腫瘍の症状および特徴を直接的にアッセイした。その最初のグループは散在性または浸潤性成長パターンを伴わない、ネストまたは腺性配列を形成する腫瘍細胞の大きな粘着性クラスターを示す浸潤性管癌腫(n=21)を含んで成った。2番目のサブグループ(n=21)は、散在型浸潤性成長パターンを選択した浸潤性腫瘍を含んで成った。これらは、有意な小葉成分または「小葉」成長パタンーンを伴うが、局所的な腺性形成および/または管タイプの細胞学的特色のいずれかを伴う、「管&小葉癌腫」(n=9)および浸潤性小葉癌腫(n=11)を含んだ(Pereira,et al.(1995) Histopathology 27:219-226;Ellis et al.(1992) Histopathology 20:479-489)。
2つのサブグループ(Monitoba Breast Tumor Bank,Canada)での分析のため、41の浸潤性管癌腫を選別した。整合させた鏡像パラフィンおよび凍結組織ブロックを産出するため、全てのケースを一律に行った。RNA抽出およびRT-PCR分析(Hiller,et al.(1996) Biotechniquis 21:38-44)のために使用した凍結組織切片と直接近接した組織由来の高品質パラフィン切片中で、腫瘍の症状および特徴を直接的にアッセイした。その最初のグループは散在性または浸潤性成長パターンを伴わない、ネストまたは腺性配列を形成する腫瘍細胞の大きな粘着性クラスターを示す浸潤性管癌腫(n=21)を含んで成った。2番目のサブグループ(n=21)は、散在型浸潤性成長パターンを選択した浸潤性腫瘍を含んで成った。これらは、有意な小葉成分または「小葉」成長パタンーンを伴うが、局所的な腺性形成および/または管タイプの細胞学的特色のいずれかを伴う、「管&小葉癌腫」(n=9)および浸潤性小葉癌腫(n=11)を含んだ(Pereira,et al.(1995) Histopathology 27:219-226;Ellis et al.(1992) Histopathology 20:479-489)。
Claims (10)
- 切頭されたCCAAT-置換タンパク質/Cutホメオボックスのアイソフォームの増加レベルが癌の存在またはステージを示す、試料中の切頭されたCCAAT-置換タンパク質/Cutホメオボックスのアイソフォームの検出を含んで成る癌の存在またはステージを診断する方法。
- 上記切頭されたCCAAT-置換タンパク質/Cutホメオボックスのアイソフォームが、タンパク質分解的にプロッセッシングされたp200のアイソフォームを含んで成る、請求項1に記載の方法。
- 上記タンパク質分解的にプロッセッシングされたp200のアイソフォームが、p100またはp110を含んで成る、請求項2に記載の方法。
- 上記切頭されたCCAAT-置換タンパク質/Cutホメオボックスのアイソフォームがp75またはp75ポリペプチドをコードするRNA転写物を含んで成る、請求項1に記載の方法。
- 切頭されたCCAAT-置換タンパク質/Cutホメオボックスのアイソフォームのレベルの検出が、試料と切頭されたCCAAT-置換タンパク質/Cutホメオボックスアイソフォームを特異的に認識する抗体とを接触させ、これにより抗体を切頭されたCCAAT-置換タンパク質/Cutホメオボックスのアイソフォームと結合させ;結合抗体を検出し;そして、切頭されたCCAAT-置換タンパク質/Cutホメオボックスのアイソフォームのレベルを既知のスタンダードと比較することを含んで成る、請求項1に記載の方法。
- タンパク質分解的にプロセッシングされたCCAAT-置換タンパク質/Cutホメオボックスp200のアイソフォームを特異的に認識する抗体。
- 上記タンパク質分解的にプロセッシングされたCCAAT-置換タンパク質/Cutホメオボックスp200のアイソフォームがp100またはp110を含んで成る、請求項6に記載の抗体。
- CCAAT-置換タンパク質/Cutホメオボックスのp75アイソフォームを特異的に認識する抗体。
- CCAAT-置換タンパク質/Cutホメオボックスのアイソフォームのレベルの検出が、p75ポリペプチドをコードするRNA転写物のレベルの評価、および、試料中のp75RNA転写物レベルと既知のスタンダードとの比較を含んで成る、請求項1に記載の方法。
- CCAAT-置換タンパク質/Cutホメオボックスのアイソフォームを特異的に認識する抗体を含んで成る、CCAAT-置換タンパク質/Cutホメオボックスのアイソフォームの存在の検出キット。
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