KR20090102318A - Ｕｂｃ9 유전자 또는 ＵＢＣ9 단백질을 이용한 유방암진단용 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유방암 진단용 키트에 관한 것으로, 본 발명에서는 UBC9 유전자 또는 단백질이 암 관련 마커로 활용될 수 있음을 밝히고, Ubc9 유전자 또는 UBC9 단백질과 결합하는 항체를 포함하는 유방암 진단용 키트 및 이를 이용한 유방암 진단 방법을 제공한다.

Description

Ｕｂｃ9 유전자 또는 ＵＢＣ9 단백질을 이용한 유방암 진단용 키트{Breast cancer diagnostic Kit using Ubc9 gene and UBC9 protein}

본 발명은 Ubc9 유전자 또는 UBC9 단백질과 결합하는 항체를 포함하는 유방암 진단용 키트 및 이를 이용한 유방암 진단 방법에 관한 것이다.

UBC9 단백질은 'SUMO modification E2 enzyme'으로 158 a.a로 구성되며, 여러 단백질에 결합하여 SUMO 단백질 변형을 통해 세포 내에서 특정 단백질의 기능을 조절하는 등의 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(서열목록의 서열번호1 및 서열번호2 참조)

UBC9에 의한 SUMO 경로는 크로마틴 리모델링에 의한 전사 억제(shiio and Eisenman, 2003; Yang and Sharrocks, 2004), HDAC1 (David et al, 2002), p300/CBP(Girwood et al, 2003), CtBP (Lin et al, 2003), STAT-1(Rogers et al, 2003), BKLF (Perdomo et al, 2005)와 같은 다양한 전사 조절 인자를 통한 전사 활성 조절과 단백질들의 핵 내로의 이동 또는 핵 내의 특정 부위로의 이동이 일어난다는 보고들(Matunis et al, 1996; Epps and Tanda et al, 1998; Mullar et al, 1998)과 DNA 손상 복구(Hardeland et al, 2002; Hoege et al, 2002; Stelter and Ulrich, 2003), 염색체 응축과 분열(Hari et al, 2001; Strunnikov et al, 2001; Bachant et al, 2002; Azuma et al, 2003; Karim et al, 2005), 세포 분열과 세포사(Matthias and Matthias, 2006; Mo et al, 2005) 등 세포 내 주요 기능들과의 연관이 보고되어 있다.

본 발명에서는 UBC9이 정상 유방 세포에 비해 암 유방 세포에서 과발현되어 있으며, UBC9 단백질을 과발현시켰을 때 세포의 유사 분열에 문제가 생기는 것을 확인하였으며, 특히 유사 분열 말기, 즉, 유사 분열 'exit'가 저해되는 것을 확인할 수 있었다.

이에 본 발명은 정상 유방 세포에 비해 암 유방 세포에서 과발현되어 있는 Ubc9 유전자 또는 그것이 암호화하는 UBC9 단백질을 암 관련 지표 물질(마커)로 발굴한 후, 이에 대한 감지 키트를 개발하여 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 Ubc9 유전자 또는 그 일부분과 결합할 수 있는 정방향 및 역방향의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 유방암 진단용 키트를 제공하고, 이 유방암 진단용 키트를 이용하여 Ubc9 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하여 정상 대조군과 비교함으로써 유방암을 진단하는 것을 특징으로 하는 유방암 진단 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 UBC9 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 유방암 진단용 키트를 제공하고, 이 유방암 진단용 키트를 이용하여 UBC9 단백질의 발현량을 측정하여 정상 대조군과 비교함으로써 유방암을 진단하는 것을 특징으로 하는 유방암 진단 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명하고자 한다.

본 발명은 UBC9이 정상 유방 세포에 비해 유방암 세포에서 과발현되어 있으며, UBC9 단백질을 과발현시켰을 때 세포의 유사 분열에 문제가 생기는 것을 확인하고, Ubc9 유전자를 마커로 사용하여 이의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하여 정상군과 비교함으로써 유방암을 진단할 수 있는 유방암 진단 키트를 제공한다.

이에 본 발명은 본 발명의 제1형태로 Ubc9 유전자 또는 그 일부분과 결합할 수 있는 정방향 및 역방향의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 유방암 진단용 키트 및 이 유방암 진단용 키트를 이용하여 Ubc9 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하여 정상 대조군과 비교함으로써 유방암을 진단하는 것을 특징으로 하는 유방암 진단 방법을 제공한다.

한편, 본 발명에서 사용한 “마커”라는 용어는 유방암 세포를 정상 세포와 구분시켜 주는 지표 물질을 의미하는 것으로, Ubc9 유전자에 대한 핵산 마커 및 UBC9 단백질에 대한 폴리펩타이드 마커일 수 있으며, 이들 마커들은 정상 세포에 비해 유방암 세포에서 발현이 증가하는 특징을 가진다.

본 발명의 Ubc9 유전자는 'UBIQUITIN CONJUGATING ENZYME9'으로서, 종래에 유방암과 관련되어서는 보고된 바가 없다. 처음 이 유전자는 효모에서 동정이 되었으며 이 후, 1996년 이 유전자의 사람 상동 유전자가 동정이 되었다. Ubc9 유전자는 세포 내의 UBIQUITIN과 유사한 SUMO(Small Ubiquitin-like Modifier)라는 단백질을 특정 단백질에 붙여 주는 단백질 변형 효소이며, 이러한 단백질 변형 과정에는 E1이라는 활성화 효소와 UBIQUITIN 또는 SUMO와 기질을 연결해 주는 E2 효소와 ligase 효소인 E3 효소가 순차적으로 관여하게 되는데, UBIQUITIN 변형이 다양한 E2(Ubiquitin-conjugating) 효소를 가지고 있는데 비해, SUMO 변형은 Ubc9이 유일한 E2 효소로 알려져 있다. 그 기능으로는 표적 단백질의 전사 활성 조절, 단백질의 세포 내 이동, 세포 주기 조절, 세포사멸 등 다양한 세포 내 과정에 관여하는 것으로 보고가 되고 있다.

한편, 본 발명자들이 수행한 실험에 의하면, 정상 유방 세포주인 HMEC 세포에 비해, 유방암 세포주인 MCF7과 MDA-MB-231 세포에서 UBC9 단백질이 과발현된 것을 확인할 수 있었다(도 1).

또한, UBC9 단백질의 위치를 확인하기 위해 분열 중인 세포 내에서 UBC9 단백질의 위치를 확인하였는데, UBC9 단백질은 유사 분열 중인 세포의 중심체에 감마 튜블린(γ-tubulin)과 함께 위치하고 있는 것을 확인할 수 있었고, 또한, 유사 분열 전반에 걸쳐서 알파 튜블린(α-tubulin)과 함께 위치하는 것도 확인할 수 있었다(도 2a, 도 2b).

한편, UBC9 단백질이 유사 분열에 미치는 영향을 확인하고자 하였는데, UBC9이 과발현된 세포 중에서 간기의 세포에서는 특이점을 관찰할 수 없었으나, 유사 분열 중인 세포들 중에서 세포 분열 말기에 분열을 하지 못하고 있는 세포들을 관찰할 수 있었다. 그리고 세포의 크기가 커져 있는 것을 확인할 수 있었고, 이렇게 분열하지 못하는 세포는 2개나 4개를 유지해야 하는 중심체의 구성 단백질인 센트린(centrin)의 수가 비정상적인 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 UBC9 W(정상 단백질)와 UBC9 C93S(효소 불활성 단백질)에서 모두 유사하게 나타났다(도 3a, 도 3b, 도 3c). 이와 같은 결과는 UBC9 단백질이 과발현되었을 때, 세포의 유사 분열에 문제가 생긴다는 사실을 확인시켜 주는 것이었다.

이와 같은 결과에 의해 UBC9의 과발현에 의한 유사 분열 조절은 특히 세포질 분열(cytokinesis)에 영향을 미친다고 추론되어, 세포에 UBC9 W와 UBC9 C93S를 과발현시킨 후, 세포주기 중 S시기를 정지시킬 수 있는 티미딘(thymidine)을 이용하여 세포주기를 관찰하였다. 세포주기를 관찰한 결과, 과발현된 세포는 유사 분열이 시작되는 10시간 시점부터 유사분열에 머무른 세포의 수가 증가하기 시작해서 유사 분열이 마무리되는 시점인 12시간에는 G2/M시기에서 머문 세포 중, 벡터(vector; V)만 트랜스펙션(transfection)한 세포에 비해 UBC9 W를 과발현시킨 세포가 23%, UBC9 C93S를 과발현시킨 세포가 37% 더 머물러 있는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 유사 분열 시기에는 단백질의 양이 증가하다가 유사 분열 말기에는 감소하는 세포주기 단백질인 사이클린(cyclin) B의 양을 확인한 결과, 유사 분열 초기인 10시간째까지는 큰 차이가 없었지만 유사 분열 마무리 시점인 12시간째에는 벡터만 트랜스펙션시킨 세포에 비해 UBC9 W와 UBC9 C93S가 과발현된 세포는 양이 감소하지 못한 것을 확인할 수 있었다(도 4a, 도 4b). 이와 같이 UBC9 단백질이 과발현된 세포에서 유사 분열이 지체되는 현상이 정확히 유사 분열의 어느 시점인지 확인하기 위해 유사 분열 초기에 세포를 정지시킬 수 있는 약물인 노코다졸(nocodazol; NZ)을 처리한 후, 풀어주는 실험을 진행하였는데, 벡터만 트랜스펙션시킨 세포에 비해 UBC9 W이 과발현된 세포는 30%, UBC9 C93S가 과발현된 세포는 28%의 세포가 G2/M시기에 더 머물러 있는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터 UBC9 단백질이 과발현된 세포에서 유사 분열이 지체되는 현상이 G2 시기나 G2/M전환시기 또는 유사 분열 초기시점이 아닌 유사 분열이 진행된 후에 발생하는 현상임을 확인할 수 있었다. 또한, 사이클린 B 단백질 양과 유사 분열 표지 단백질로 알려진 인산화 된 히스톤 3 단백질 양도 벡터에 비해 감소하는 양이 적었으며, 이러한 결과들로부터 유사 분열 시기가 지났음에도 불구하고 유사 분열 시기에 머물러 있는 세포들이 존재하는 것을 알 수 있었다(도 5a, 도 5b).

한편, 생물학적 시료 중의 Mac-2BP 위암 마커 유전자의 발현 수준은 mRNA 또는 이의 단백질의 양을 확인함으로써 알 수 있으며, 생물학적 시료에서 mRNA와 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, mRNA와 단백질의 양은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명에서 사용한 '생물학적 시료'라는 용어는 Ubc9 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준의 차이를 검출할 수 있는 조직, 세포 등으로, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청 등을 포함하나, 반드시 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 “mRNA 수준 측정”이란 Ubc9 유전자의 발현 수준을 확인하는 것으로 생물학적 시료로부터 Ubc9 유전자의 mRNA 존재 여부와 mRNA의 발현량을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 반드시 이 예들로 한정되는 것은 아니다. 이와 같은 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 유방암 의심 환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 발현량의 증가로부터 유방암을 진단할 수 있다.

mRNA 수준을 RT-PCR로 측정하기 위한 키트는 Ubc9 유전자 또는 그 일부를 증폭을 할 수 있는 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하며, 증폭 대상 영역 및 길이는 프라이머를 다양하게 디자인함으로써 조절할 수 있다. 프라이머는 증폭 대상 유전자의 핵산서열에 대한 상보적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 통상 7~50bp로 디자인된다. 키트는 상기의 프라이머 외에 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPCwater), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

한편, 본 발명은 본 발명의 제2형태로서 UBC9 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 유방암 진단용 키트 및 이 유방암 진단용 키트를 이용하여 UBC9 단백질의 발현량을 측정하여 정상 대조군과 비교함으로써 유방암을 진단하는 것을 특징으로 하는 유방암 진단 방법을 제공한다.

“단백질 발현량의 측정”이란 생물학적 시료에서 Ubc9 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다.

본 발명에서 사용한 '항체'라는 용어는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미하는 것으로, 본 발명에서 UBC9 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하는데, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 이용하여 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 반드시 이것만으로 한정하는 것은 아니고 단백질의 정량을 분석할 수 있는 방법은 모두 사용될 수 있다. 본 발명에서는 상기와 같은 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 유방암 의심 환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, Ubc9 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여, 유방암을 진단할 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용된 '항원-항체 복합체'라는 용어는 UBC9 단백질 및 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미립자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이것만으로 한정되는 것은 아니고, 검출 라벨로 사용할 수 있는 것은 모두 사용될 수 있다. 검출 라벨로 이용 가능한 '효소'의 예로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제 또는 β-라타마제 등이 있다. 검출 라벨로 이용 가능한 '형광물'에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있다. 검출 라벨로 이용 가능한 '리간드'의 예로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, '발광물'의 예로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있고, '미립자'의 예로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며, '레독스 분자'의 예로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN) 8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ , [RU(bpy) 3 ] 2+ 또는 [MO(CN) 8 ] 4- 등이 있고, '방사선동위원소'의 예로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 또는 186Re 등이 있다.

단백질 발현 수준의 측정은 일 예로서 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)법을 이용할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등의 다양한 ELISA 방법을 포함한다.

한편, 단백질 발현 수준의 측정은 일 예로서, ELISA 외에 UBC9 단백질에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 방법도 사용될 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현정도를 확인하는 것이다.

한편, 단백질 발현 수준의 측정은 일 예로서, UBC9에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅을 이용하는 것도 사용될 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 그 후, 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는데, 이를 통해 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양이 측정된다.

한편, 상기한 바와 같이 본 발명에서의 UBC9 단백질의 검출을 위한 항체는 항체공학에서 널리 알려진 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 UBC9 단백질을 항원으로 하여 이를 동물에 주사하고, 주사된 동물로부터 채혈함으로써, 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 것인데, 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개

등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 통상적으로, 하이브리도마 방법은 UBC9 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터 세포를 수득하고, 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이들 두 세포를 폴리에틸렌글리콜과 같은 널리 공지된 방법에 의해 융합시키고, 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득한 후, UBC9 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 공지 기술에 따라 시험관 내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다. 이와 같이 생산된 하이브리도마가 생산하는 단클론 항체를 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.

파지 항체 라이브러리 방법은 UBC9 단백질에 대한 항체 유전자(Single chain fragmentvariable, scFv형태)를 획득하여 이를 파아지의 표면에 융합 단백질 형태로 발현함으로써 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 이 라이브러리로부터 UBC9 단백질과 결합하는 모노크로날 항체를 분리, 제작하는 방법이다. 상기 방법으로부터 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리할 수 있다.

본 발명의 키트에 포함되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

한편, UBC9 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 키트는 대조군 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함할 수 있으며, 그 외에도 항원-항체 결합체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

이상 상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명에서는 UBC9 단백질이 정상 유방 세포에 비해 암 유방 세포에서 과발현되어 있음을 확인하여, UBC9 유전자 또는 단백질이 암 관련 마커로 활용될 수 있음을 밝혔고, Ubc9 유전자 또는 UBC9 단백질과 결합하는 항체를 포함하는 유방암 진단용 키트 및 이를 이용한 유방암 진단 방법을 제공하는 바, 의약산업에 있어 매우 유용하다.

도 1은 정상 유방 세포주에 비해 암 유방 세포주에서 UBC9의 발현 양이 증가해 있는 것을 나타낸 도이다. 정상 유방 세포주인 HMEC 세포에 비해, 유방암 세포주인 MCF7과 MDA-MB-231 세포에서 UBC9 단백질이 과발현되어 있고, 레인별 동량 단백질의 확인을 위해 액틴(Actin) 단백질의 양을 측정하였다.

도 2a와 도 2b는 UBC9 단백질이 유사 분열 중인 세포의 중심체에 감마-튜블린과 함께 위치하는 것과 또한 유사 분열 전반에 걸쳐 알파-튜블린과 함께 위치하는 것을 나타낸 도이다. 도 2a에서 UBC9 단백질은 그린 형광 염색을, 감마-튜블린은 레드 형광 염색을 하여 관찰을 하였고, 도 2b에서 UBC9 단백질은 레드 형광 염색을, 알파-튜블린은 그린 형광 염색을 하여 관찰하였다.

도 3a와 도 3b 및 도 3c는 UBC9 W (정상 단백질)와 UBC9 C93S (효소 불활성 단백질)를 과발현시켜 세포를 관찰하였을 때, UBC9이 과발현된 세포 중에서 간기의 세포에서는 특이점이 관찰되지 않고, 유사 분열 중인 세포들 중 세포 분열 말기에 분열하지 못하고 있는 세포들과 이러한 결과로 크기가 커진 세포들을 나타낸 도이다. 또한, 분열하지 못하는 세포는 2개나 4개를 유지해야 하는 중심체의 구성 단백질인 센트린(centrin)의 수가 비정상적인 것을 나타낸 도이다. 도 3a와 도 3b에서 FLAG-UBC9 단백질은 FLAG 단백질에 레드 형광 염색을, 그린 형광 단백질인 GFP 단백질이 표지된 센트린(centrin)은 그린 형광의 발광을 통해 관찰하였다.

도 4a와 도 4b는 세포에 UBC9 W(정상 단백질)와 UBC9 C93S(효소 불활성 단백질)를 과발현시킨 후, 세포 주기 중 S 시기에 세포를 정지시킬 수 있는 티미딘을 이용하여 세포 주기를 관찰한 것을 나타낸 도이다. 과발현된 세포는 티미딘을 풀어 준 후, 유사 분열이 시작되는 10시간 시점부터 유사 분열에 머무른 세포의 수가 증가하기 시작해서 유사 분열이 마무리되는 시점인 12시간에는 G2/M시기에서 머문 세포 중, 벡터(vector; V)만 트랜스펙션(transfection)한 세포에 비해 UBC9 W를 과발현시킨 세포가 23%, UBC9 C93S를 과발현시킨 세포가 37% 더 머물러 있는 것을 나타낸 도이다. 세포주기 단백질인 사이클린 B의 양을 확인한 결과, 유사 분열 초기인 10시간째까지는 큰 차이가 없었지만 유사 분열 마무리 시점인 12시간째에는 벡터만 트랜스펙션시킨 세포에 비해 UBC9 W와 UBC9 C93S이 과발현된 세포는 단백질 양이 감소하지 못한 것을 나타낸 도이다. 레인별 동량 단백질의 확인을 위해 알파-튜블린 단백질의 양을 측정하였다.

도 5a, b는 유사 분열 초기에 세포를 정지시킬 수 있는 약물인 노코다졸(NZ)을 처리 한 후 풀어주고, 사이클린 B와 인산화된 히스톤 3의 단백질 양을 관찰한 것을 나타낸 도이다. 세포에 약물처리를 하고, 240분 동안 세포를 관찰한 결과, 벡터만 트랜스펙션 시킨 세포에 비해 UBC9 W이 과발현된 세포는 30%, UBC9 C93S가 과발현된 세포는 28%의 세포가 G2/M시기에 더 머물러 있는 것을 확인할 수 있었으며, 사이클린 B의 단백질 양과 유사 분열 표지 단백질로 알려진 인산화 된 히스톤 3 단백질 양도 벡터에 비해 감소하는 양이 적은 것을 관찰한 것을 나타낸 도이다. 레인별 동량 단백질의 확인을 위해 알파-튜블린 단백질의 양을 측정하였다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

실험예 1: 암세포에서 UBC9 단백질의 발현 양 측정

암세포에서 UBC9 단백질의 발현 양을 측정하기 위해 먼저, 정상 유방 세포주인 HMEC(human mammary epithelial cell) 세포를 MEGM(mammary epithelial growth medium, Cambrex)에서 배양하였고, 유방암 세포주인 MCF7과 MDA-MB-231 세포는 RPMI배양액에서 배양하였다.

세포주에서 UBC9 단백질의 발현 양을 측정한 결과, 정상 유방 세포주인 HMEC 세포에 비해, 유방암 세포주인 MCF7과 MDA-MB-231 세포에서 UBC9 단백질이 과발현 된 것을 확인할 수 있었다(도 1).

실험예 2: UBC9 단백질의 위치 확인

UBC9 단백질의 위치를 확인하기 위해 분열 중인 세포 내에서 UBC9 단백질의 위치를 확인하였다.

UBC9의 위치를 확인한 결과, UBC9 단백질은 유사 분열 중인 세포의 중심체에 감마 튜블린(γ-tubulin)과 함께 위치하고 있는 것을 확인할 수 있었고, 또한, 유사 분열 전반에 걸쳐서 알파 튜블린(α-tubulin)과 함께 위치하는 것도 확인할 수 있었다(도 2a, 도 2b).

실험예 3: UBC9 단백질의 유사 분열에 미치는 영향 확인

UBC9 단백질이 유사 분열에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 먼저 벡터를 제조하였다.

pCDNA-FLAG 벡터에 UBC9 유전자를 클로닝하였고, UBC9 효소 활성저해 단백질(UBC9 C93S)을 제조하기 위하여 93번 시스테인(cysteine)을 세린(serine)으로 치환하였다.

그리고 DMEM 배양액에서 배양된 U2OS와 HeLa-Centrin 세포에 FLAG-UBC9 W, FLAG-UBC9 C93S 벡터를 Effectene transfection kit(Qiagen)를 이용하여 각각 트랜스펙션(transfection)하였다. 벡터들을 세포에 각각 트랜스펙션한 후, U2OS와 HeLa-Centrin 세포를 3.7% 포름알데히드 용액(Sigma)에서 고정시킨 후, UBC9(BD Biosciences), 감마 튜블린(γ-tubulin; Santa Cruz), 알파 튜블린(α-tubulin; Cell Signaling Technology), FLAG(Sigma) 항체를 이용하여 일차 항원 항체 반응을 하였고, Alexa488과 Alexa546(Molecular Probes) 항체를 이용하여 이차 항원 항체 반응을 통해 형광염색을 하였다. 형광염색을 한 후, DNA 염색을 위해 DAPI(4', 6-Diamidino-2-Phenylindole) 염색을 하였고, 형광현미경(Carl Zeiss)을 통해 관찰하였다.

UBC9 단백질이 유사 분열에 미치는 영향을 확인한 결과, UBC9이 과발현된 세포 중에서 간기의 세포에서는 특이점을 관찰할 수 없었으나, 유사 분열 중인 세포들 중에서 세포 분열 말기에 분열을 하지 못하고 있는 세포들을 관찰할 수 있었다. 그리고 세포의 크기가 커져 있는 것을 확인할 수 있었고, 이렇게 분열하지 못하는 세포는 2개나 4개를 유지해야 하는 중심체의 구성 단백질인 센트린(centrin)의 수가 비정상적인 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 UBC9 W(정상 단백질)와 UBC9 C93S(효소 불확성 단백질)에서 모두 유사하게 나타났다(도 3a, 도 3b, 도 3c).

상기의 결과로부터 UBC9 단백질이 과발현되었을 때, 세포의 유사 분열에 문제가 생긴다는 사실을 확인할 수 있었다.

실험예 4: UBC9 단백질이 세포분열에 미치는 영향 확인

상기 실험예 3에 의해 UBC9의 과발현에 의한 유사 분열 조절은 특히 세포질 분열(cytokinesis)에 영향을 미친다고 추론되어지는 바, 본 실험예 4에서는 세포에UBC9 W와 UBC9 C93S를 과발현시킨 후, 세포주기 중 S시기를 정지시킬 수 있는 티미딘(thymidine)을 이용하여 세포주기를 관찰하였다.

세포주기 분석은 PI(propidium iodide)염색을 통한 유세포 분석기(FACSCalibur; BD Biosciences)로 분석을 수행하였다. 세포를 70% 에탄올 상태로 고정시킨 후, CycleTest Kit(BD Biosciences)로 DNA를 염색하였고, 유세포 분석기를 통해 세포의 DNA 양을 측정하면서 CellQuest 3.3 software와 Modifit program(BD Biosciences, USA)으로 분석하였다.

세포주기를 관찰한 결과, 과발현된 세포는 유사 분열이 시작되는 10시간 시점부터 유사 분열에 머무른 세포의 수가 벡터에 비해 증가하기 시작해서 유사 분열이 마무리되는 시점인 12시간에는 G2/M시기에서 머문 세포 중, 벡터(vector; V)만 트랜스펙션(transfection)한 세포에 비해 UBC9 W를 과발현시킨 세포가 23%, UBC9 C93S를 과발현시킨 세포가 37% 더 머물러 있는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 유사 분열 시기에는 단백질의 양이 증가하다가 유사 분열 말기에는 감소하는 세포주기 단백질인 사이클린 B의 양을 확인한 결과, 유사 분열 초기인 10시간째까지는 큰 차이가 없었지만 유사 분열 마무리 시점인 12시간째에는 벡터만 트랜스펙션시킨 세포에 비해 UBC9 W와 UBC9 C93S이 과발현된 세포는 양이 감소하지 못한 것을 확인할 수 있었다(도 4a, 도 4b).

상기에서 살펴본 바와 같이, UBC9 단백질이 과발현된 세포된 세포에서 유사 분열이 지체되는 현상이 정확히 유사 분열의 어느 시점인지 확인하기 위해 유사 분열 초기에 세포를 정지시킬 수 있는 약물인 노코다졸(nocodazol; NZ)을 처리한 후, 풀어주는 실험을 진행하였다.

세포에 약물처리를 하고, 240분 동안 세포를 관찰한 결과, 상기의 결과들과 마찬가지로 벡터만 트랜스펙션 시킨 세포에 비해 UBC9 W이 과발현된 세포는 30%, UBC9 C93S가 과발현된 세포는 28%의 세포가 G2/M시기에 더 머물러 있는 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과로부터 UBC9 단백질이 과발현된 세포에서 유사 분열이 지체되는 현상이 G2 시기나 G2/M 전환시기 또는 유사 분열 초기시점이 아닌 유사 분열이 진행된 이후에 발생하는 현상임을 확인할 수 있었다.

또한, 사이클린 B의 단백질 양과 유사 분열 표지 단백질로 알려진 인산화 된 히스톤 3 단백질 양도 벡터에 비해 감소하는 양이 적었으며, 이러한 결과들로부터 유사 분열 시기가 지났음에도 불구하고 유사 분열 시기에 머물러 있는 세포들이 존재하는 것을 알 수 있었다(도 5a, 도 5b).

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Breast cancer diagnostic Kit using Ubc9 gene and UBC9 protein <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 477 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(474) <220> <221> gene <222> (1)..(477) <223> Ubc9 gene sequence <400> 1 atg tcg ggg atc gcc ctc agc aga ctc gcc cag gag agg aaa gca tgg 48 Met Ser Gly Ile Ala Leu Ser Arg Leu Ala Gln Glu Arg Lys Ala Trp 1 5 10 15 agg aaa gac cac cca ttt ggt ttc gtg gct gtc cca aca aaa aat ccc 96 Arg Lys Asp His Pro Phe Gly Phe Val Ala Val Pro Thr Lys Asn Pro 20 25 30 gat ggc acg atg aac ctc atg aac tgg gag tgc gcc att cca gga aag 144 Asp Gly Thr Met Asn Leu Met Asn Trp Glu Cys Ala Ile Pro Gly Lys 35 40 45 aaa ggg act ccg tgg gaa gga ggc ttg ttt aaa cta cgg atg ctt ttc 192 Lys Gly Thr Pro Trp Glu Gly Gly Leu Phe Lys Leu Arg Met Leu Phe 50 55 60 aaa gat gat tat cca tct tcg cca cca aaa tgt aaa ttc gaa cca cca 240 Lys Asp Asp Tyr Pro Ser Ser Pro Pro Lys Cys Lys Phe Glu Pro Pro 65 70 75 80 tta ttt cac ccg aat gtg tac cct tcg ggg aca gtg tgc ctg tcc atc 288 Leu Phe His Pro Asn Val Tyr Pro Ser Gly Thr Val Cys Leu Ser Ile 85 90 95 tta gag gag gac aag gac tgg agg cca gcc atc aca atc aaa cag atc 336 Leu Glu Glu Asp Lys Asp Trp Arg Pro Ala Ile Thr Ile Lys Gln Ile 100 105 110 cta tta gga ata cag gaa ctt cta aat gaa cca aat atc caa gac cca 384 Leu Leu Gly Ile Gln Glu Leu Leu Asn Glu Pro Asn Ile Gln Asp Pro 115 120 125 gct caa gca gag gcc tac acg att tac tgc caa aac aga gtg gag tac 432 Ala Gln Ala Glu Ala Tyr Thr Ile Tyr Cys Gln Asn Arg Val Glu Tyr 130 135 140 gag aaa agg gtc cga gca caa gcc aag aag ttt gcg ccc tca taa 477 Glu Lys Arg Val Arg Ala Gln Ala Lys Lys Phe Ala Pro Ser 145 150 155 <210> 2 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Gly Ile Ala Leu Ser Arg Leu Ala Gln Glu Arg Lys Ala Trp 1 5 10 15 Arg Lys Asp His Pro Phe Gly Phe Val Ala Val Pro Thr Lys Asn Pro 20 25 30 Asp Gly Thr Met Asn Leu Met Asn Trp Glu Cys Ala Ile Pro Gly Lys 35 40 45 Lys Gly Thr Pro Trp Glu Gly Gly Leu Phe Lys Leu Arg Met Leu Phe 50 55 60 Lys Asp Asp Tyr Pro Ser Ser Pro Pro Lys Cys Lys Phe Glu Pro Pro 65 70 75 80 Leu Phe His Pro Asn Val Tyr Pro Ser Gly Thr Val Cys Leu Ser Ile 85 90 95 Leu Glu Glu Asp Lys Asp Trp Arg Pro Ala Ile Thr Ile Lys Gln Ile 100 105 110 Leu Leu Gly Ile Gln Glu Leu Leu Asn Glu Pro Asn Ile Gln Asp Pro 115 120 125 Ala Gln Ala Glu Ala Tyr Thr Ile Tyr Cys Gln Asn Arg Val Glu Tyr 130 135 140 Glu Lys Arg Val Arg Ala Gln Ala Lys Lys Phe Ala Pro Ser 145 150 155

Claims (4)

1. Ubc9 유전자 또는 그 일부분과 결합할 수 있는 정방향 및 역방향의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 유방암 진단용 키트
2. 제1항의 유방암 진단용 키트를 이용하여 Ubc9 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하여 정상 대조군과 비교함으로써 유방암을 진단하는 것을 특징으로 하는 유방암 진단 방법
3. UBC9 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 유방암 진단용 키트
4. 제3항의 유방암 진단용 키트를 이용하여 UBC9 단백질의 발현량을 측정하여 정상 대조군과 비교함으로써 유방암을 진단하는 것을 특징으로 하는 유방암 진단 방법