KR100552494B1

KR100552494B1 - 간암 유전자 마커 및 이를 이용한 간암 진단킷트

Info

Publication number: KR100552494B1
Application number: KR1020040004638A
Authority: KR
Inventors: 김남순; 김용성; 오정화; 박홍석; 윤선영; 변상순; 김미랑; 김상수; 강성수; 안병민; 최종영
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2004-01-26
Filing date: 2004-01-26
Publication date: 2006-02-14
Also published as: KR20050076876A

Abstract

본 발명은 간암 유전자 마커 및 이를 이용한 간암 진단킷트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 간암에 대한 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현 정도를 측정하여 간암을 진단하는데 매우 유용하게 사용될 수 있도록 개발된 간암 진단방법 및 진단킷트에 관한 것이다.

간암, 유전자 마커, 고발현, 저발현, 진단 킷트

Description

간암 유전자 마커 및 이를 이용한 간암 진단킷트{DETECTION KIT FOR LIVER CANCER BY MEASURING THE EXPRESSION OF HEPATIC CANCER-RELATED GENES}

도 1은 유전자 발굴 빈도를 분석한 것이고,

도 2는 각종 시료에서 간암 고발현 유전자의 발현 정도를 경쟁적(competitive) RT-PCR 방법을 사용하여 수행한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 각종 시료에서 간암 저발현 유전자의 발현 정도를 경쟁적 RT-PCR 방법을 사용하여 수행한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 간암 임상시료에서 간암 고발현 유전자의 발현 정도를 경쟁적 RT-PCR 방법으로 확인한 것이다.

도 5는 간암 임상시료에서 간암 저발현 유전자의 발현 정도를 경쟁적 RT-PCR 방법을 사용하여 수행한 것이다.

본 발명은 간암 유전자 마커 및 이를 이용한 간암 진단킷트에 관한 것으로 서, 더욱 상세하게는 간암에 대한 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현 정도를 측정하여 간암 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있도록 개발된 간암 진단방법 및 진단킷트에 관한 것이다.

간암은 전 세계적으로 발생 빈도가 높은 암 중 하나로 매년 백만명의 환자들이 간암으로 사망하고 있으며, 특히 한국 및 일본 등의 아시아에서 발생되는 가장 흔한 암이다[Parkin 등, Int. J. Cancer 80: 827-841, 1999; Luo 등, Basic Biology and Clinical Sciences 1st Ed., pp. 435-445, 1997; Chen 등, J. Gastroenterol. Hepatol. 12:S294-308, 1997]. 간조직 기원에서 발생하는 암의 85%은 간암(hepatocellular carcinoma)이며 간암의 발생은 간 조직에 B형 간염과 C형 간염 바이러스의 감염과 아플라톡신 β1의 노출이 그 원인으로 보고되고 있다[Bosch 등, Semin. Cancer Dis. 19:271-285, 1999; Luo 등, Basic Biology and Clinical Sciences 1st Ed., pp. 435- 445, 1997]. 그러나, 정확한 기작은 아직까지 알려져 있지 않다. 기존의 연구에 따르면 TGF-α(transforming growth factor α)와 TGF-β와 같은 몇 가지 생장인자(growth factor)들이 간암의 진행기작에 연관됨이 보고되고 있으며, 암 억제인자로 잘 알려진 RB, p53 단백질도 간암 형성 과정에 중요한 역할을 수행하는 후보 유전자들이 있다[Collier 등, Liver 13:151-155, 1993; Abou-Shady 등, Am. J. Surg. 177:209-215, 1999; Naka 등, Anticancer Res. 18:555-564, 1998]. 또한, 세포주기 기작에서 G₁ 단계로 진행하는 세포주기 조절물질들의 변화가 간암 형성에 관련되어 있다는 보고도 있다[Hui 등, Hepatogasteroenterology 45:1635-1642, 1998]. 이외에도 DNA 돌연변이와 유전자 발현의 유전적 변화(genetic alteration)등이 간암 환자조직에서 확인된다고 보고되고 있다[Park 등, Cancer Res. 59:307-310, 1999; Bjersing 등, J. Intern. Med. 234:339-340, 1993; Tsopanomichalou 등, Liver 19:305-311, 1999; Kusano 등, Hepatology 29:1858-1862, 1999; Keck 등, Cancer Genet. Cytogenet. 111:37-44, 1999]. 이와 같이, 간암의 발생과 진행은 몇몇 특정 유전자들에 의해 이루어지는 것이 아니라 암의 악성화가 진행되면서 발생하는 세포내 다양한 신호전달과 조절기작에 관여하는 많은 유전자들의 복합적인 상호작용에 의한 것임을 알 수 있다. 따라서, 몇몇 특정한 유전자들에 중점을 두고 간암의 형성 기작을 연구하는 것 보다 정상 간세포와 간암 세포주들 사이의 다량의 유전자 발현정도를 비교 분석하여 간암에 관련된 새로운 유전자들을 발굴하는 연구는 매우 중요한 의미가 있는 것이다.

이와 같이, 암의 형성은 다양한 유전자들과 이들 유전자들의 발현 및 조절 기작이 복합적으로 연관되어 진행되므로 최근 들어 다량의 유전자를 사용한 cDNA 마이크로어레이나 유전자 칩으로 간암 관련 유전자들의 발현율을 비교하여 간암의 새로운 진단이나 치료의 마커를 발굴하기 위한 연구가 이루어지고 있다[Shirota 등, Hepatology 33:832-840, 2001; Xu 등, Cancer Res. 61:3176-3181, 2001; Tackels-Horne 등, Cancer 92:395-405, 2001; Chen 등, Mol. Biol. Cell 13:1929-1939, 2002; Li 등, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 128:369-379, 2002; Lee 와 Thorgeirsson, Hepatology 35:1134-1143, 2002; Goldenberg 등, Mol. Carcinog. 33:113-124, 2002; Midorikawa 등, Jpn. J. Cancer Res. 93:636-643, 2002]. 이들의 연구에서는 적게는 1K 칩에서 많게는 12K DNA 칩을 이용하여 간암 환자들의 조직들을 비교한 결과를 보고하고 있다. 간암 세포에서 발현이 증가하거나 감소하는 유전자들은 세포 분열(cell division), 세포신호전달(cell signaling), 세포 골격(Cell structure), 세포운동(cell mobility), 세포방어(cell defense), 유전자 및 단백질의 발현(gene/protein expression) 그리고 세포 내 물질대사(cell metabolism) 등 여러 부분에 관여하는 것으로서 환자 조직들에 따라 동일한 발현 변화를 보이는 유전자가 있는 반면 다른 발현 변화를 보이는 유전자들이 많았다. 이것은 각각 환자들의 특이성 때문일 가능성이 크므로 연구하는 대상의 환자 조직들의 정확한 병리학적 소견과 분류가 따라야 하며 정확한 유전자를 이용한 진단에는 보다 많은 새로운 유전자들의 검색과 확인이 이루어져야 한다.

한편, 인간 게놈 프로젝트의 한 연구 분야로 수행되어 온 "EST(expressed sequence tag) 수집"은 특정 조직이나 세포주에서 cDNA 라이브러리를 제조하고 여기에서 임의적으로 선별한 cDNA 클론들의 염기서열을 분석함으로써 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자를 수집하는 프로젝트이다. 이러한 EST 수집 방법을 통하여 새로운 유전자의 발굴[Adams 등, Science 252: 1651-1656, 1991;Adams 등, Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995; Hillier 등, Genome Res. 6: 807-828, 1996; Marra 등, Nat. Genet. 21:191-194,1999], 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석[Okubo 등, Nat. Genet. 2: 173-179, 1992; Adams 등, Science 252: 1651-1656, 1991; Adams 등, Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995; Liew 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10645-10649, 1994; Mao 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8175-8180, 1998; Ryo 등, Nucleic Acids Res. 26: 2586-2592, 1998; Sterky 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13330-13335, 1998]이 가능하다고 보고되고 있다. 또한, Xu 등이 보고한 29개의 간암환자들의 간암조직과 주변 정상조직을 사용하여 각각 cDNA 라이브러리를 구축한 후 그 발현빈도를 분석한 보고에 따르면, 간암세포에서 발현빈도가 높은 유전자들로 주로 혈청 알부민(serum albumin), α1-항트립신, 인터-α-트립신 저해제, 아포지질단백질 AII, 피브리노겐, 셀레노프로테인 P, 알돌라아제 등이 보고되고 있다. 이와 같이, 특정 세포내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 간암 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 간암의 진행에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이고 나아가 간암의 진단이 가능하게 될 것이다.

본 발명에서는 Park 등이 간암으로부터 만든 SNU-354, SNU-368, SNU-387, SNU-475와 HLK1, HLK3, J-SHC 등의 간암 세포주를 이용하여 정상 간조직과 유전자의 발현빈도를 분석하고 이로부터 간암 고발현 유전자 및 저발현 유전자를 선별하고자 하였다[Park 등, Int. J. Cancer 62:276-282, 1995]. 현재까지 SNU 간암 세포주를 이용한 연구가 많이 수행되어, SNU 세포주들간의 특이적인 발현을 보이는 유전자에 대해 보고되고 있다. 즉, SNU-368 세포주에서는 트랜스페린(transferrin), IGF-II(insulin-like growth factor II) 그리고 IGF-1R(insulin growth factor-1 receptor)이 과발현이 되고 있음이 보고 되어있고, 또한 세포사멸에 관련된 파스(fas) 리간드의 발현도 증가되어 있음이 보고되었다[Park 등, Int. J. Cancer 62:276-282, 1995; Shin 등, Int. J. Cancer 82:587-591, 1999; Kim 등, Cancer Res. 56:3831-3836, 1996]. SNU-354 세포주는 알부민의 발현이 매우 높고 세포막에 파스의 발현 또한 높다고 보고되고 있다[Park 등, Int. J. Cancer 62:276-282, 1995; Shin 등, Int. J. Cancer 82:587-591]. 그러나, 여러 세포주에서 동일하게 유전자 발현의 변화를 보이는 유전자들은 아직까지 규명되지 않고 있다. 따라서, 몇 종류들의 간암 세포주들과 정상 간암조직에서 유사한 유전자 발현 패턴을 보이는 유전자들은 간암 마커로서 사용 가능할 것이다.

본 발명에서는 10종의 간암 고발현 유전자와 4종의 간암 저발현 유전자를 발굴하였으며, 이들은 간암과의 관련성이 보고되지 않은 것으로 현재 이들 유전자에 대해 알려진 내용은 다음과 같다. K-ALPHA-1은 투불린 아이소타입 중 하나로 세포 구조 형성에 관여하며 LDHA(lactate dehydrogenase A)은 당 분해 경로의 효소로서 대장암 세포주[Rutzky 와 Sicikiano, J. Natl. Cancer Inst. 68:81-90, 1982]나 뇌실 상의 세포종(ependymoma)[Korshunov 등, Am. J. Pathol. 163:1721-1727]에서 과발현 되고 있음이 알려져 있으나 간암과의 관련성은 보고된 바 없다. FTL(ferritin, light polypeptide)은 철분을 저장하는 세포내 분자물질이며 RPL4(ribosomal protein L4), RPL9(ribosomal protein L9), RPL10(ribosomal protein L10) 그리도 RPL13A(ribosomal protein L13A)들은 유전자들의 해독 (translation)에 관여하는 라이보좀(ribosome)의 구조단백질로서 정확한 기능이 많이 알려져 있지 않으나 최근 들어 특정 암세포에서 그 발현에 변화를 보인다는 보 고가 되고 있다. RPL4는 쥐(rat)의 신경세포의 분열(proliferation)과 분화 (differentiation)에 어떤 역할을 할 가능성이 제시되었고[Ueno 등, Histol. Histopathol. 17:789-798, 2002] PRL9는 NGF(nerve growth factor)를 처리한 신경세포에서 그 발현이 증가한다고 보고되었으며[James 등, BMC Neuroscience. in press, 2002] RPL9는 인간 전립선암 (prostate cancer)에서 안드로젠(androgen) 호르몬에 영향을 받지 않는 유전자로서 그 발현이 증가하는 것으로 보고되었다[Karan 등, Carcinogenesis. 23:967-975, 2002]. RPL13A는 췌장 (pancreas)과 전립선암 조직에서 그 발현에 변화가 없는 유전자로서 다른 유전자들의 발현의 변화를 측정할 때 표준화시키는 대조유전자로서 사용 가능하다는 보고가 되어 있다[Jesnowski 등, Pancreatology. 2:421-424, 2002]. ENO1(enolase 1)은 간암세포주에서 v-src 발암 유전자에 의해 그 발현이 증가하는 유전자로 보고되어 있으나 v-src 신호전달에 국한되어 있는 보고이다[Jiang 등, Cancer Res. 57:5328-5335, 1997]. GNB2L1(guanine nucleotide binding protein, beta polypeptide 2-like 1)은 2003년에 최초로 보고된 유전자로서 기능에 관한 연구는 이루어진 바 없다[Wang 등, Mol. Biol. Rep. 30:53-60, 2003]. AMBP (alpha-1-microglobulin/bikunin precursor)는 혈장 당단백질 중 하나로 급성 간염의 경우 나타나는 저삼투압성 스트레스(hypotonic stress)나 간세포로의 글루타민 섭취에 따라 이 유전자 발현이 감소한다는 보고는 되어 있으나 간암 진단 마커 유전자로서의 보고가 아직 되어 있지 않다[Claeyssens 등, FEBS Lett. 14:15-18, 1998]. GC(group-specific component)는 혈장에 과량 포함된 단백질로서 면역체계에 관여 하는 대식세포(macrophage)를 활성화시키며 여러 암에서 면역억제물질로 작용한다는 보고가 되어 있다[Yamamoto 등, Cancer Res. 56:2827-2831, 1996]. 반면에 만성 간질환 환자들의 혈장 내에서의 GC 단백질의 량의 감소가 골형성이상증에 관여한다는 보고도 있다[Mihas 와 Hirschowitz, J. Med. 9:109-115, 1978]. SERPINC1(serine proteinase inhibitor, clade C, member 1)은 안티트롬빈 III로서 혈소판 생성에 관여하나 간암세포에 그 발현의 감소에 대한 보고는 되어있지 않다. A1BG(alpha 1-B glycoprotein)는 최근 들어 cDNA가 클로닝되었으며 면역글로불린 상과(上科, superfamily)의 한 물질로 세포인식(cell recognition)과 세포운동조절(cell behavior regulation)에 관여할 것으로 추정하고 있다[Gardmo 등, endocrinology 142:2695-2701, 2001].

이에, 본 발명자들은 간암 세포주와 정상 간조직의 cDNA 라이브러리의 유전자 염기서열을 분석하고, 이들 유전자의 발굴 빈도를 바탕으로 하여 간암 고발현 또는 저발현 유전자를 찾아내고 경쟁적 RT-PCR 방법에 의해 간암 세포주와 정상 간 조직 또는 간암 환자 시료에서 간암 고발현 유전자와 저발현 유전자를 확인하여 간암을 검출할 수 있는 새로운 간암 종양마커를 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 간암 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자들의 발현정도 측정을 이용한 간암 진단방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 간암 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자들의 발현정도 측정을 이용한 간암 진단킷트를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

본 발명은 간암 특이적 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A, AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 발현 정도의 측정을 통하여 간암을 진단하는 간암 진단방법 및 진단킷트를 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 간암 특이적 고발현 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 및 RPL13A로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자와, 간암 특이적 저발현 유전자인 AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 발현 정도의 측정을 통하여 간암을 진단하는 간암 진단킷트에 관한 것이다.

본 발명의 간암 마커 유전자는 간암 조직에서 고발현되거나 저발현되는 유전자의 전장 및 그의 단편을 포함한다.

또한, 본 발명의 진단킷트는 간암 특이적 고발현 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 및 RPL13A로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머와 간암 특이적 저발현 유전자인 AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 포함한다.

또한, 본 발명의 진단킷트는 간암 특이적 고발현 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 및 RPL13A로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 상보적인 프로브와 간암 특이적 저발현 유전자인 AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 상보적인 프로브를 포함한다.

또한, 본 발명의 진단킷트는 간암 특이적 고발현 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 및 RPL13A로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 인식하는 항체와 간암 특이적 저발현 유전자인 AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 인식하는 항체를 포함한다.

또한, 상기 항체, 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있고, β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄가지변화를 측정하기 위하여 L4-PHA를 포함한다.

상기에서 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시데이즈(peroxidase), 알칼라인 포스파테이즈(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2, 2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 또는 OPD(o-Phenylenediamine), TMB(Tetramethyl Benzidine)가 사용될 수 있다.

본 발명에서 확인된 간암 마커 유전자의 서열정보는 다음 표 1에 나타낸 바와 같다.

유전자	길이	CDS(단백질 영역)	위치	GenBank Accession No.
K-ALPHA-1	1596	68, 1423	12q13.12	NM_006082
LDHA	1661	98, 1096	11p15.4	NM_005566
FTL	878	189, 716	19q13.3-q13.4	NM_000146
ANXA2	1362	50, 1069	15q21-q22	NM_004039
RPL4	1449	57, 1340	1q21.2-q21.3	NM_000968
ENO1	1812	152, 1456	1p36.3-p36.2	NM_001428
RPL9	716	29, 607	4p13	NM_000661
GNB2L1	1093	96, 1049	5q35.3	NM_006098
RPL10	2188	42, 686	Xq28	NM_006013
RPL13A	1142	23, 634	19q13.3	NM_012423
AMBP	1413	227, 1285	9q32-q33	NM_001633
SERPINC1	1395	1, 1395	1q23-q25.1	NM_000488
GC	1801	154, 1578	4q12-q13	NM_000583
A1BG	3386	55, 1542	19q13.4	NM_130786

본 발명에서는 8종의 간암 세포주(SNU475, SNU368, HLK1, SNU354 2 종류,JSHC, SNU387, HLK3)와 3종의 정상 간 조직 표본(N800102, N670205, N803806)을 사용하여 총 11종의 cDNA 라이브러리를 제조하고, 이로부터 약 18,211개의 EST 염기 배열을 결정하고 간암 세포주 시료와 정상 간 조직 시료에서 각 유전자의 발굴 빈도를 분석하여, 간암 세포주 시료에서 발굴 빈도가 높은 10종의 간암 고발현 유전자(K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A)와 발굴 빈도가 낮은 4종의 간암 저발현 유전자(AMBP, SERPINC1, GC, A1BG)를 각각 선별하여 간암 마커 유전자를 찾아내었다.

유전자 발굴빈도 분석에 사용된 간암 세포주 시료 및 정상 간 시료에서 본 발명의 10종의 간암 고발현 유전자와 4종의 간암 저발현 유전자의 발현량을 정량적 RT-PCR 방법에 의해 비교한 결과, 간암 고발현 유전자는 간암 세포주 시료에서 고발현됨이 관찰되었고, 간암 저발현 유전자는 정상 간 조직 시료에서는 고발현되나 간암 세포주 시료에서는 저발현됨이 관찰됨으로써 본 발명의 간암 마커 유전자들과 간암과의 관련성이 확인되었다.

또한, 7명의 환자에서 채취한 7쌍(간암조직 및 정상 간조직)의 임상시료를 사용하여 10종의 간암 고발현 유전자와 4종의 간암 저발현 유전자들의 발현량을 비교한 결과, 10종의 간암 고발현 유전자는 정상 간 임상 시료에 비해 대부분의 간암 임상시료에서 고발현됨을 확인하였고, 4종의 간암 저발현 유전자는 대부분의 간암 임상시료에서 저발현됨이 확인되어 임상적으로 간암으로 진단된 조직에서 본 발명의 간암 마커 유전자들의 유용성이 확인되었다.

따라서, 간암 특이적 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A, AMBP, SERPINC1, GC, A1BG의 유전자의 발현 정도를 측정함으로써 간암을 진단할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 간암 특이적 유전자들의 발현 정도를 측정하여 간암을 진단하는 방법을 상세하게 설명하면 다음과 같다: 즉,

(a) 시험 간암 조직에서 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 간암 고발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계,

(b) 정상 간 조직에서 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 간암 고발현 유 전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계,

(c) 시험 간암 조직에서 AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 간암 저발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계,

(d) 정상 간 조직에서 AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 간암 저발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및

(e) 상기 (a)에 의해 얻어진 측정값을 상기 (b)에서 얻어진 측정값과 비교하고, 상기 (c)에 의해 얻어진 측정값을 상기 (d)에서 얻어진 측정값과 비교하여 간암 여부를 판정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 14종의 마커 유전자의 발현양은 마커 유전자 또는 그 단편에 대하여 상보적인 염기 서열을 갖는 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 이용한 공지의 방법을 통하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 경쟁적 RT-PCR 방법으로 측정할 수 있다. 이러한 프라이머는 14종 마커 유전자의 DNA 영역 중에서 단백질을 코딩하는 DNA 영역의 일부 또는 전부의 배열이 함유되고 적어도 15 bp 길이의 DNA이어야 한다. 예를 들어, 서열번호 7 내지 34에 기재된 프라이머들이 사용될 수 있다. 본 발명에서 상보적이란 적어도 15개의 연속 염기배열에서 완전히 상보적인 배열인 경우로 제한하지 않고 염기 서열상에서 70%, 바람직하게는 80% 이상의 상동성이 있으면 된다.

또한, 본 발명의 14종의 마커 유전자의 발현량은 마커 유전자 또는 그 단편 을 프로브로 사용한 공지의 혼성화(하이브리다이제이션) 반응을 통하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 노던 하이브리다이제이션("Molecular Cloning - A Laboratory Manual "Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al., 1982, section 7.37-7.52), 인시츄 하이브리다이제이션[Jacquemier 등, Bull Cancer 90: 31-8, 2003] 또는 마이크로어레이[Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3: 185-200, 2003] 등의 방법으로 측정할 수 있다. 프로브는 14종 유전자의 염기 서열을 함유한 통상 200 ∼ 1000 bp이며, 바람직하게는 400 ∼ 800 bp의 길이를 가진다. 염기 서열은 14종 유전자의 염기 서열과 70% 이상의 유사성을 가지면 된다. 본 발명의 마커 유전자의 프로브는 상기에서 제조된 14종의 마커 유전자의 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 이용한 유전자 증폭법(PCR) 등의 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다.

또한, 상기 14종의 간암 마커 유전자의 발현량은 각 유전자에 의하여 코드되는 단백질의 양을 측정함으로써 측정할 수 있다. 상기 방법에서 단백질은 간암마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 통상적인 ELISA 및 면역침강법 등에 의해 정량화될 수 있다.

본 발명의 10종의 간암 고발현 유전자와 4종의 간암 저발현 유전자에 대한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 14종의 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩타이드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩타이드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클론날 항체[Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.12-11.13], 모노클론날 항체[Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.4-11.11] 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체(Methods in Enzymology 203, 99-121, 1991)등의 특수항체도 포함된다.

본 발명의 14종의 간암 마커 유전자 또는 단백질은 단독으로 또는 조합하여 간암 진단에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 간암 진단킷트는 상기 간암 특이적 마커 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머 또는 프로브 이외에 RNA 또는 폴리 (A)+ RNA 분리 시약을 더 포함할 수 있으며, 마이크로어레이를 통하여 발현양을 조사하는 경우에는 14종 유전자의 고형지지체를 포함한다.

또한, 14종의 간암 마커 유전자는 발암 관련 유전자 또는 발암 억제 유전자일 가능성이 높으므로, 이러한 표적 유전자가 코딩하는 단백질에 결합하는 작은 분자의 화합물은 표적 단백질을 저해 또는 촉진하는 화합물의 후보가 될 수 있으며 이는 항암제, 치료제 등의 의약품으로 사용할 수 있다.

이런 화합물을 스크리닝하는 방법으로는, 상기 14종의 간암 마커 유전자가 코딩하는 단백질을 어피니티칼럼에 고정시키고 이를 피검시료와 접촉시켜 정제하는 방법[Pandya 등, Virus Res 87: 135-143, 2002], 투하이브리드법을 이용하는 방법[Fields, S and Song, O., Nature 340: 245 -246, 1989], 웨스턴 브로팅법["Molecular Cloning - A Laboratory Manual "Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al. (1982) section 18.30-18.74], 하이스루풋스크리닝법 [Aviezer 등, J Biomol Screen 6: 171-7, 2001] 등 다수의 공지의 방법을 사용할 수 있다. 스크리닝에 사용하는 피검시료로서는 세포 추출액, 유전자라이브러리의 발현산물, 합성저분자화합물, 합성펩타이드, 천연 화합물 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 간암 세포주와 정상 간 조직으로부터 총 RNA 분리

10% 소혈청(Fetal Bovine Serum)[Gibco BRL 사], 페니실린(10000 U/㎖)과 스트렙토마이신(10 mg/㎖)을 첨가한 RPMI1640[Jeil Biotech 사] 배양액을 15 cm 디쉬에 30 ㎖씩 분주한 후 간암 세포주인 SNU475, SNU368, SNU354, SNU387[한국세포주은행]과 HLK1, HLK3, JSHC[전북대]를 디쉬당 세포가 5 ×10⁶이 되도록 접종하고 이를 37 ℃, 5% CO₂가 존재하는 배양기에서 배양을 하였다. 3쌍의 정상 간 조직 표본인 N800102, N670205, N803806[을지대학교 의과대학]은 외과적으로 제거된 조 직으로부터 얻고, 분석할 때까지 이를 액체 질소에 보관하였다.

세포의 총 RNA는 QIAGEN 키트(RNeasy Maxi 키트: cat#75162)를 사용하여 분리하였다. 우선, 부착 세포는 EDTA와 트립신을 이용해 회수한 후, 150 ㎕의 베타 머캅토에탄올(β-Mercaptoethanol)을 첨가한 15 ㎖의 키트 내 분해 완충액에 용해시켰다. 여기에 15 ㎖의 70% EtOH을 첨가하여 잘 섞은 후, 3000 g에서 5분간 원심분리하여 총 RNA를 막에 부착시켰다. 두 차례의 세척 과정을 수행 후, 1.2 ml의 RNase가 제거된 물을 첨가하여 총 RNA를 용출, 분리하였다.

실시예 2: EST 발굴 빈도에 의해 간암 고발현 유전자와 저발현 유전자의 선별

본 발명자는 간암에서 발현되는 유전자를 분석하기 위하여, 간암 세포주와 정상 간 조직에서 각종 cDNA 라이브러리를 구축하고, 이로부터 무작위로 클론을 선별, 분석함으로써 EST 발굴 빈도를 기초로 한 간암 고발현 유전자와 저발현 유전자를 선별하고자 하였다.

1) cDNA 라이브러리의 제조

상기 실시예 1에서 얻은 각 시료의 총 RNA 각 100 ㎍을 BAP 효소 반응액[100Mm Tris-Hcl(pH 7.0), RNA 2mM DTT, 80U Rnasin(promega사)]에서 3 U의 BAP (Bacterial alkaline Phosphatase)[TakaRa사] 효소로 처리하고, 이어 TAP[Waco사] 효소 반응액[50 mM sodium acetate(pH 5.5), 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 80U Rnasin (promega사)]에서 100 U의 TAP(Tabbaco acid pyrophosphatase) 효소를 반응 시켰다. 그 후, 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 5 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 0.5 mM ATP, 26% PEG, 100U Rnasin, 서열번호 1의 올리고리보뉴클레오티드 40 pmole, 250U RNA 리가제[TakaRa사]의 반응을 수행하여 합성한 올리고머를 인산기를 가지는 미분해 mRNA에만 첨가되도록 반응시켰다.

이상의 반응을 처리한 총 RNA로부터 올리고텍스(oligotex) mRNA 정제키트 [QIAGEN사]를 사용하여 mRNA를 분리하고, dT17을 함유한 서열번호 2의 올리고머를 프라이머로 사용하여 1^st cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 XL PCR 키트 [Perkin Elmer사]를 사용하여 합성된 DNA 삽입체의 5'-말단(서열번호: 3)과 3'-말단의 올리고머(서열번호: 4)를 함유한 PCR 반응을 수행하여 소량 증폭시켰다. PCR 산물을 SfiI의 효소로 처리한 후 아가로스 젤 전기영동을 하여 1.3 kb 이상의 cDNA 단편을 분리하였다. 분리된 cDNA 단편은 TaKaRa 연결 키트를 이용하여 DraIII 효소로 처리한 pCNS-D2 벡터에 연결시킨 후, 전기침공법(electroporation)에 의해 대장균 Top10F'[Invitrogen사] 균주에 형질전환시켜, cDNA 라이브러리를 제조하였다.

본 방법에 의해 8종의 간암 세포주 cDNA 라이브러리와 3종의 정상 간 조직 cDNA 라이브러리를 제조하고 EST 분석하였다[표 2].

2) cDNA 염기서열의 결정 및 데이터 분석

제작한 cDNA 라이브러리를 앰피실린(100 ㎍/㎖)이 함유된 LB 한천배지에 도말하여 다수의 cDNA 클론을 배양하였다. 얻어진 클론들의 염기서열을 분석하기 위하여 MWG 96웰 플라스미드 프렙 시스템(plasmid prep system)으로 플라스미드 DNA를 분리하고, 자동화염기서열 결정기인 ABI 3700으로 염기서열분석을 수행하였다.

결정된 DNA 데이터의 유사성 검색은 BLASTN을 사용하여 유니진(UniGene) 데이터베이스(Hs.seq.all, build#163)에서 수행하였다.

총 11 종의 cDNA 라이브러리에서 약 18,211개의 EST 염기 배열을 결정하고 이의 분석을 유니진 데이터베이스에서 수행한 결과, 총 9,028종의 유전자가 발굴되었다. 각 라이브러리별 결정된 EST 수와 발굴된 유전자의 종류는 상기 표 2에 나타낸 바와 같다.

3) 유전자 발굴 빈도 분석

3종의 정상 간 조직 cDNA 라이브러리를 대조군으로 하고 8종의 간암 세포주 cDNA 라이브러리는 간암 시료로 하여 크게 2가지로 분류하였다. 각 유전자의 발굴 빈도는 각각의 시료에서 발굴된 특정 유전자의 수를 발굴된 총 유전자 수의 비로 나타내었다. 또한, 각 라이브러리에서 각 유전자의 발굴 빈도는 각 라이브러리에서 발굴된 특정 유전자의 수를 발굴된 총 유전자의 수의 비로 계산하고 이를 색깔로서 나타내었다.

상기와 같은 분석에 의해 간암 세포주 시료에서 발굴 빈도가 증가하는 10종의 고발현 유전자와 발굴 빈도가 감소하는 저발현 유전자 4종이 각각 선별되었다[도 1].

실시예 3: RT-PCR 반응에 의한 선별된 표적 유전자의 발현량 분석

정상 간 조직 시료와 간암 세포주 시료에서 유전자 발굴 빈도에 의해 선별된 10종의 간암 고발현 유전자와 4종의 간암 저발현 유전자의 발현량을 경쟁적 RT-PCR 방법을 통해 정량적으로 분석하였다.

1) 역전사 효소 반응

상기 실시예 1에서 분리한 총 9종의 총 RNA에서 각각 5 ㎍을 사용하여 다음 역전사 반응액에서 42 ℃, 60분간 반응시켜 총 9종의 1^st cDNA를 합성하였다. 그 후, 70 ℃ 가열 블럭(heating block)에서 15분간 반응함으로써 cDNA 합성을 종료시켰다.

poly dT(12-18) 프라이머 (0.4 ㎍/㎕)	1 ㎕
5X first-strand buffer	4 ㎕
10 mM dNTP 혼합물	1 ㎕
0.1M DTT	2 ㎕
RNaseOUT (40 U/㎕)	1 ㎕
역전사효소 (200 U/㎕)	1 ㎕
총 RNA (5 ㎍)	X ㎕
증류수	(10-X) ㎕
총부피	20 ㎕

2) 경쟁적(competitive) PCR을 이용한 cDNA의 증폭 및 발현량 확인

① 경쟁적 PCR을 위한 주형의 농도 보정

마커 유전자를 정량하기 위한 표준 유전자로 본 실험에서는 B2M 유전자를 사용하였다. 표준 유전자와 프라이머의 프라이밍 부분은 같으나, PCR 산물의 크기가 다른 경쟁 DNA(competitor)를 표준 유전자와 함께 PCR 반응을 수행하여, 시료간 표준 유전자의 발현양과 경쟁 DNA의 발현양이 같은 농도를 찾아, PCR에 사용되는 각 주형의 농도가 동일하게 되도록 시료의 농도를 보정하였다.

B2M 경쟁 DNA는 3 ㎕의 pCNS 벡터 DNA(2 ng), 10 ㎕의 5 ×PCR premix[바이오니아 사], 1 ㎕의 5' 프라이머(20 pmole: 서열번호 5), 1 ㎕의 3'프라이머 (20 pmole: 서열번호 6), 35 ㎕의 증류수를 함유한 50 ㎕의 반응액에서 PCR 반응을 수행하여 제조하였다. 이때 PCR 반응의 조건은 94 ℃ 30초, 50 ℃ 1분으로 25회 수행하였으며, B2M 경쟁 DNA인 PCR 산물의 길이는 322 bp였다.

조제한 B2M 경쟁 DNA를 3/10⁸, 7/10⁸, 1/10⁷, 3/10⁷, 7/10⁷, 1/10⁶, 3/10⁶, 7/10⁶의 8단계로 희석한 후, 2 ㎕를 상기 1)의 역전사 효소 반응액(역전사 반응에 사용된 RNA의 10 ng에 해당되는 양)과 각각 혼합한 후, 4 ㎕의 5 ×Taq DNA 중합효소 혼합액, 2 ㎕의 B2M 프라이머(5 pmole/㎕)(서열번호 5 및 6), 8 ㎕의 증류수를 함유한 총 20 ㎕의 6개 PCR 반응액을 사용하여 경쟁적 PCR을 수행하였다. 이때 PCR 반응 조건은 94 ℃ 40초, 55 ℃ 1분, 72 ℃ 1분으로 25회씩 수행하였다.

PCR 산물을 2% 아가로스 젤에 3 ㎕씩 로딩하여 100 V에서 30분 전기영동한 후, Frog^TM 기계(젤 이미지 어낼리시스 시스템)[Core Bio 사]를 이용하여 젤 사진을 촬영하였다. 최종적으로 얻은 젤 밴드 이미지 파일(.tif)을 ToltalLab v1.0 프로그램[NonLinear Dynamix 사]을 이용하여, 두 밴드(B2M 경쟁 DNA에서는 322 bp, 원래 B2M유전자에서는 390 bp)의 감도가 비슷한 농도를 선별, 정량화한 후, 각 시료의 농도를 보정하였다.

② PCR을 이용한 cDNA의 증폭

상기 ①에서 보정한 시료의 cDNA를 각 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 함유한 다음 표 4의 PCR 반응액에서 증폭시켰다. 이때, PCR 반응은 94 ℃ 1분, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 1분으로 25회씩 수행하였다.

10종 간암 고발현 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A와 4종의 간암 저발현 유전자 AMBP, SERPINC1, GC, A1BG의 프라이머는 단백질 코딩 영역 내부에서 디자인하였고, 각 프라이머의 길이는 17 ∼ 22 bp, GC 함량은 50 ∼ 70% 정도이다. 다음은 PCR 반응액의 조성을 나타낸다.

cDNA	5 ㎕
5 ×PCR 반응 mix[바이오니아 사]	2 ㎕
정방향 프라이머 (10 pmole/㎕)	1 ㎕
역방향 프라이머 (10 pmole/㎕)	1 ㎕
증류수	1 ㎕
총부피	10 ㎕

경쟁적 PCR에 사용한 각 간암 마커 유전자들의 프라이머

유전자	정방향 프라이머	역방향 프라이머
K-ALPHA-1	서열번호 7	서열번호 8
LDHA	서열번호 9	서열번호 10
FTL	서열번호 11	서열번호 12
ANXA2	서열번호 13	서열번호 14
RPL4	서열번호 15	서열번호 16
ENO1	서열번호 17	서열번호 18
RPL9	서열번호 19	서열번호 20
GNB2L1	서열번호 21	서열번호 22
RPL10	서열번호 23	서열번호 24
RPL13A	서열번호 25	서열번호 26
AMBP	서열번호 27	서열번호 28
SERPINC1	서열번호 29	서열번호 30
GC	서열번호 31	서열번호 32
A1BG	서열번호 33	서열번호 34

③ 경쟁적 PCR을 이용한 발현량 확인

PCR 반응에 의해 증폭된 PCR 산물을 확인하기 위하여, PCR 반응액을 2%의 아가로스 젤에 100 V로 30분간 전기영동한 후, PCR 산물을 상기 ①에서와 같이 ToltalLab v1.0 프로그램(NonLinear Dynamix Ltd.)을 이용하여 정량화하였다.

도 2와 3에 나타낸 결과와 같이, 도 2는 고발현 유전자를, 도 3은 저발현 유전자를 확인한 결과이며, X축은 각종 시료를 나타낸 것으로, L3, L4, L5, L9, L12, L13, L16은 간암 세포주들이며 L17, L20은 정상 간 조직을 나타내며, Y축은 각종 시료에서 표적 유전자의 발현량을 나타낸 것으로, 각 유전자의 발현량은 먼저 각종 시료에서 발현되는 B2M의 발현량으로 나눈 후, 고발현 유전자의 발현량은 간암 세포주에서 발현되는 발현량의 평균량에 대한 비율로서 나타냈으며, 저발현 유전자의 발현량은 정상 간 조직에서 발현되는 발현량의 평균량에 대한 비율로서 나타낸 것이다. 간암 세포주에서 발굴 빈도가 높은 고발현 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 간암 세포주 시료에서 높았으며, 간암 세포주에서 발굴 빈도가 낮은 저발현 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 정상 간 조직에 비해 간암 세포주 시료에서 낮게 나타났다. 즉, 10종의 간암 후보 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A는 간암 마커로서 유용함을 확인하였고 4종의 간암 저발현 유전자 AMBP, SERPINC1, GC, A1BG는 간암 억제 마커로 사용 가능한 것이 확인되었다.

실시예 4: 임상 시료에서 간암 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현량 확인

본 실험에서는 카톨릭 의과대학교에서 제공한 7명의 간암 환자로부터 직접 채취한 시험 조직/정상 조직(각각 T1 내지 T7 및 N1 내지 N7)의 쌍으로 된 7종의 임상 시료에서, 10종의 간암 고발현 유전자와 4종의 저발현 유전자의 발현량을 경 쟁적 RT-PCR법을 사용하여 수행하였다.

1) 총 RNA 분리 및 역전사 효소 반응

실시예 1에서와 같은 방법으로 총 RNA를 분리하고, 실시예 3-1)에서와 같이 각 시료의 총 RNA 5㎍을 사용하여 42 ℃, 60분간 역전사 반응을 수행함으로써 총 14종의 1^st cDNA를 합성하였다. 그 후, 70 ℃ 가열 블럭에서 15분간 반응함으로써 cDNA 합성을 종료시켰다.

2)경쟁적 PCR을 이용한 각 유전자의 발현량 확인

PCR에 사용되는 각 주형의 농도는 B2M 프라이머[서열번호: 7 및 8]를 사용하여 얻은 B2M PCR 산물을 2% 아가로스 젤에 10 ㎕씩 로딩하여 상기 실시예 3-3)-①에서와 같이 TotalLab v1.0 프로그램으로 농도를 정량한 후, 가장 낮은 농도의 시료를 기준으로 나머지 13개의 시료의 농도를 희석하였다. 유전자들의 종류에 따라 주형으로 사용된 시료의 농도가 다르나 적게는 1^stcDNA의 1/10 희석한 농도의 시료부터 1/200으로 희석한 시료를 사용하였다. 보정한 시료의 역전사 반응액을 2 ㎕씩 주형으로 이용하여 각 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 함유한 총 15 ㎕의 PCR 반응액에서 증폭시켰다. 이때 PCR 반응은 94 ℃ 30초, 55 ℃ 1분, 72 ℃ 1분, 25회씩 수행하였다. 사용된 프라이머는 상기 표 5에서 표시된 것과 같다. 증폭된 PCR 산물을 확인하기 위하여, PCR 반응액 전부를 2%의 아가 로스 젤에 100 V로 30분으로 전기영동한 후, PCR 산물을 3-3)-①에서와 같이 ToltalLab v1.0 프로그램(NonLinear Dynamix Ltd.)을 이용하여 정량화 하였다. 도 4와 도 5에 나타낸 결과와 같이, 도 4는 고발현 유전자를, 도 5은 저발현 유전자를 확인한 결과이며, X축은 임상 시료를 나타낸 것으로, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7은 임상 환자들의 정상 간조직이고 T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7은 임상 환자들의 간암조직을 나타내며, Y축은 각종 시료에서 표적 유전자의 발현량을 나타낸 것으로, 각 유전자의 발현량은 먼저 각종 시료에서 발현되는 B2M의 발현량으로 나눈 후, 가장 낮은 발현량을 보이는 시료를 기준으로 한 비율로서 나타낸 것이다. 그 결과, 간암 고발현 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 동일 환자에서 채취한 정상 간 조직에서보다 대부분의 시험 조직에서 더 높았으며, 간암 저발현 유전자인 AMBP, SERPINC1, GC, A1BG 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 시험 조직에서보다 대부분의 정상 간 조직에서 더 높게 나타났다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 간암 진단에 유용한 마커로 간암 세포주에서 10종의 간암 고발현 유전자와 4종의 간암 저발현 유전자가 제공되며, 상기 종양 마커 유전자들은 환자 조직에서 신속하고 민감하게 정량하여 간암을 비롯한 다양한 암환자들의 종양의 악성화를 효과적으로 진단하는데 사용될 수 있다.

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간암 특이적 고발현 유전자인 K-ALPHA-1(NM_006082), LDHA(NM_005566), FTL(NM_000146), ANXA2(NM_004039), RPL4(NM_000968), ENO1(NM_001428), RPL9(NM_000661), GNB2L1(NM_006098), RPL10(NM_006013) 및 RPL13A(NM_012423)로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자와, 간암 특이적 저발현 유전자인 AMBP(NM_001633), SERPINC1(NM_000488), GC(NM_000583) 및 A1BG(NM_130786)로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 발현 정도의 측정을 통하여 간암을 진단하는 것을 특징으로 하는 간암 진단킷트.
제 3 항에 있어서, 간암 특이적 고발현 유전자인 K-ALPHA-1(NM_006082), LDHA(NM_005566), FTL(NM_000146), ANXA2(NM_004039), RPL4(NM_000968), ENO1(NM_001428), RPL9(NM_000661), GNB2L1(NM_006098), RPL10(NM_006013) 및 RPL13A(NM_012423)로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머와, 간암 특이적 저발현 유전자인 AMBP(NM_001633), SERPINC1(NM_000488), GC(NM_000583) 및 A1BG(NM_130786)로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단킷트.
제 4 항에 있어서, 상기 프라이머가 15 bp 이상의 DNA인 것을 특징으로 하는 간암 진단킷트.
제 3 항에 있어서, 간암 특이적 고발현 유전자인 K-ALPHA-1(NM_006082), LDHA(NM_005566), FTL(NM_000146), ANXA2(NM_004039), RPL4(NM_000968), ENO1(NM_001428), RPL9(NM_000661), GNB2L1(NM_006098), RPL10(NM_006013) 및 RPL13A(NM_012423)로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 상보적인 프로브와 간암 특이적 저발현 유전자인 AMBP(NM_001633), SERPINC1(NM_000488), GC(NM_000583) 및 A1BG(NM_130786)로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 상보적인 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단킷트.
제 6 항에 있어서, 상기 프로브가 200 ∼ 1000 bp인 것을 특징으로 하는 간암 진단킷트.
제 3 항에 있어서, 간암 특이적 고발현 유전자인 K-ALPHA-1(NM_006082), LDHA(NM_005566), FTL(NM_000146), ANXA2(NM_004039), RPL4(NM_000968), ENO1(NM_001428), RPL9(NM_000661), GNB2L1(NM_006098), RPL10(NM_006013) 및 RPL13A(NM_012423)로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 인식하는 항체와 간암 특이적 저발현 유전자인 AMBP(NM_001633), SERPINC1(NM_000488), GC(NM_000583) 및 A1BG(NM_130786)로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 인식하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단킷트.
간암 특이적 고발현 유전자인 K-ALPHA-1(NM_006082), LDHA(NM_005566), FTL(NM_000146), ANXA2(NM_004039), RPL4(NM_000968), ENO1(NM_001428), RPL9(NM_000661), GNB2L1(NM_006098), RPL10(NM_006013) 및 RPL13A(NM_012423)로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질과 간암 특이적 저발현 유전자인 AMBP(NM_001633), SERPINC1(NM_000488), GC(NM_000583) 및 A1BG(NM_130786)로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질에 시험 화합물을 결합시키고, 시험 화합물이 상기 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 간암 억제제의 스크리닝 방법.