KR100592586B1

KR100592586B1 - 항암제 5-플루오로우라실 관련 유전자 마커 및 이를 이용한 5-플루오로우라실 항종양 효과 진단키트

Info

Publication number: KR100592586B1
Application number: KR1020030044689A
Authority: KR
Inventors: 김남순; 김용성; 박지선; 오정화; 김정민; 염영일
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2003-07-02
Filing date: 2003-07-02
Publication date: 2006-06-26
Also published as: KR20050004491A

Abstract

본 발명은 항암제 5-플루오로우라실 관련 유전자 마커 및 이를 이용한 5-플루오로우라실 항종양 효과 진단키트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 일반적으로 사용되는 항암제인 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU)에 대해 내성 위암 세포주 및 민감성 위암 세포주에서 특이적으로 발현이 증가되거나 감소되는 유전자를 밝혀 5-플루오로우라실 투여 시 위암의 치료 효율을 증대시키기 위한 5-플루오로우라실 관련 새로운 유전자 마커를 제공하고, 이를 이용하여 5-플루오로우라실 항종양 효과를 진단하는 진단키트에 관한 것이다.

5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 유전자 마커, 항종양 효과

Description

항암제 5-플루오로우라실 관련 유전자 마커 및 이를 이용한 5-플루오로우라실 항종양 효과 진단키트{ANTICANCER DRUG, 5-FLOUROURACIL-RELATED MARKER GENES AND DETECTION KIT FOR ANTICANCER EFFECTS THEREBY}

도 1은 6종의 5-플루오로우라실 민감성 유전자의 발현정도를 경쟁적 (competitive) RT-PCR로 나타낸 것이다[X축: 5-플루오로우라실 처리 시간, Y축: 표적 유전자 발현량을 베타-액틴 유전자의 발현량으로 나눈 값; SNU-601과 SNU-638은 5-플루오로우라실 민감성 세포주, SNU-484과 SNU-216은 5-플루오로우라실 내성 세포주를 나타냄].

본 발명은 항암제 5-플루오로우라실 관련 유전자 마커 및 이를 이용한 5-플루오로우라실 항종양 효과 진단키트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 일반적으로 사용되는 항암제인 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)에 대해 내성 위암 세포주 및 민감성 위암 세포주에서 특이적으로 발현이 증가되거나 감소되는 유전자를 밝혀 5-플루오로우라실 투여 시 위암의 치료 효율을 증대시키기 위한 5-플루오로우라실 관련 새로운 유전자 마커를 제공하고, 이를 이용하여 5-플루오로우라실 항종양 효과를 진단하는 진단키트에 관한 것이다.

위암은 국내에서 종양으로 인한 사망률 1위를 기록하고 있는 중요한 악성 종양으로, 서구에서는 그 빈도가 줄어들고 있으나, 일본과 한국을 위시한 아시아에서는 여전히 높은 빈도를 차지하고 있다. 위암은 조기에 발견하여 근치적 절제술을 시행하는 것이 최선의 치료 방법이나, 외과적 절제가 불가능하거나 전이되어 있는 진행 위암일 경우 화학요법이 가장 널리 이용되는 치료 방법이다.

현재까지 위암의 화학요법에 사용되는 약제 중 20% 이상의 관해율(response rate)을 보이는 약제로는 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 시스플라틴(cisplatin), MMC(mitomycin-C) 등이 있으며 이중 5-플루오로우라실은 가장 널리 사용되고 있는 대표적 약제이다. 이러한 약제들은 환자에 따라 관해율 및 관해 지속기간이 다르며, 단일제제요법보다 2개 혹은 3개 약제를 병용하는 복합화학요법이 더 효과적이라고 알려져 있다. 따라서, 이들 약제에 반응하는 환자의 관해율 등을 예측하여 환자에 맞는 적당한 약제를 선별할 필요가 있으므로 이를 위해서는 이들 약제, 특히 대표적 약제인 5-플루오로우라실과 관련된 유전자 마커 개발 및 연구가 필수적으로 요구되어진다.

5-플루오로우라실의 주요 작용기전으로는, 5-플루오로우라실의 대사 중간 산물인 FdUMP(5-fluorodeoxyuridine monophosphate)가 DNA의 de novo 합성효소인 TS(thymidylate synthetase)와 강한 공유결합 복합체를 형성하여 TS 효소의 활성을 저해시키고 이로 인해 DNA의 합성을 저해시킨다. 따라서, 위암과 같은 소화기 고형암에 있어서 종양내 TS 효소 수준은 5-플루오로우라실의 항종양 효과와 밀접한 관계가 있다고 보고되고 있다[C.J. Peters et al.,Induction of thymidylate synthetase as a 5-fluorouracil resistance mechanism. Biochim. Biophys. Acta 1587 (2002) 194-205., C. Aschele et al., Thymidylate synthetase expression as a predictor of clinical response to fluoropyrimidine-based chemotherapy in advanced colorectal cancer. Cancer Treat. Rew. 28 (2002) 27-47., M. Terashima et al., Roles of thymidylate synthetase and dipyrimidine dehydrogenase in tumor progression and sensitivity to 5-fluorouracil in human gastric cancer. Anticancer Res. 22 (2002) 761-768., H. Fujiwara et al., Quantitative measurement of thymidylate synthase and dipyrimidine dehydrogenase mRNA level in gastric cancer by real-time RT-PCR. Jpn. J. Cancer Res. 93 (2002) 1342-1350.]. 또한, 5-플루오로우라실은 DPD(dihydropyrimidine dehydrogenase)를 포함한 3개의 효소에 의해 F-β-알라닌(fluoro-β-alanine)으로 분해되는 것으로 알려져 있으며, 이들 효소 중 DPD 활성은 5-플루오로우라실의 항종양 효과와 관련있다고 보고되고 있다[M. Terashima et al., Roles of thymidylate synthase and dipyrimidine dehydrogenase in tumor progression and sensitivity to 5-fluorouracil in human gastric cancer. Anticancer Res. 22 (2002) 761-768., H. Fujiwara et al., Quantitative measurement of thymidylate synthase and dipyrimidine dehydrogenase mRNA level in gastric cancer by real-time RT-PCR. Jpn. J. Cancer Res. 93 (2002) 1342-1350., K. Isshi et al., Predicting 5-fluorouracil sensitivity using human colorectal cancer specimens: comparison of tumor dihydropyrimidine dehydrogenase and orotate phosphoribosyl transferase activities with in vitro chemosensitivity to 5-fluorouracil. Int. J. Clin. Oncol. 7 (2002) 335-342., Y. Hirano et al., Clinical significance of thymidine phosphorylase and dihydropyrimidine dehydrogenase expression in transitional cell cancer. Cancer Chemother. Pharmacol. 51 (2003) 29-35]. 이외에도 5-플루오로우라실의 분해에는 다약제 내성 관련 단백질, 아폽토시스(apoptosis) 관련 단백질이 관여한다고 보고되고 있으나, 그 기전이 확실히 밝혀지지 않은 실정이고 실제로는 일치하지 않는 경우도 있다. 또한, 5-플루오로우라실의 항종양 효과와 관련하여 최근의 마이크로어레이를 이용한 논문에서는 간암에서 퓨린 기전경로와 관계한 포스포디에스터라제(phosphodiesterase)와 아데노신 디아미나제(adenosine deaminase), 세포주기에 관련한 세포 분열 사이클 2(cell division cycle 2), 트랜스포밍 단백질 rhoB(transforming protein rhoB)와 같은 유전자가 동정되기도 했다[Y. Hoshida et al., Identification of genes associated with sensitivity to 5-fluorouracil and cisplatin in hepatoma cells. J. Gastroenterol. 37 (2002) 92-95]. 이와 같이, 현재로는 5-플루오로우라실 항종양 효과 기전이 제대로 규명되지 않았고, 항종양 효과에는 여러 기전들이 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 발명자들은 5-플루오로우라실 항종양 효과 기전을 확립하고자 연구한 결과, 5-플루오로우라실의 항종양 효 과와 관련있는 6종의 유전자로 발굴함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 위암 항암제인 5-플루오로우라실의 항종양 효과를 진단하는 것으로서 6종의 5-플루오로우라실 민감성 유전자 발현을 검색하여 5-플루오로우라실의 단독 투여 또는 복합화학제 투여시 5-플루오로우라실의 치료 효율을 증대시키기 위한 것이다.

본 발명은

1) 위암 세포주 또는 위암 조직에서 KIAA1141, FLJ21931, FLJ11021, CSTF3, CDKN1A 및 EST601820453F1 중에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 그의 단편의 양을 측정하는 단계;

2) 위암 이외의 암 세포주 또는 암 조직에서 상기 1)의 유전자 또는 그의 단편의 양을 측정하는 단계; 및

3) 상기 1) 및 2)에서 얻은 측정값을 5-플루오로우라실 내성 세포주 또는 내성 조직의 측정값과 비교하는 단계를 포함하는 5-플루오로우라실의 항종양 효과의 진단방법을 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 6종의 새로운 5-플루오로우라실 관련 유전자 마커를 제공한다. 6종의 5-플루오로우라실 민감성 유전자의 발현량을 5-플루오로우라실 민감성 위암 세포주와 내성 위암 세포주에서 비교한 결과, 5-플루오로우라실 민감성 후보 유전자는 5-플루오로우라실 민감성 위암 세포주에서 과발현됨이 관찰되었고, 5-플루오로우라실 내성 위암 세포주에서 저발현됨이 관찰되어 5-플루오로우라실과의 관련성이 확인되었다. 따라서, KIAA1141, FLJ21931, FLJ11021, CSTF3, CDKN1A 및 EST601820453F1의 유전자의 발현량을 측정함으로써 5-플루오로우라실 항종양 효과의 진단이 가능하다고 판단된다.

상기 5-플루오로우라실의 항종양 효과와 관련있는 유전자로 발굴된 6종의 유전자는 대부분 기능이 알려져 있지 않다. 이중, CSTF3은 분해촉진 인자(Cleavage stimulation factor, 77 kDa)로 초파리의 포크단백질 억제제(suppressor of forked protein, Suf)와 상동성을 지니며, mRNA의 3 말단 processing 과정의 첫 단계에 필요한 단백질로 보고되고 있고[A. Audibert, & M. Simonelig, The suppressor of forked gene of Drosophila, which encodes a homologue of human CstF-77K involved in mRNA 3'-end processing, is required for progression through mitosis. Mech Dev. 82 (1999) 41-50], CDKN1A는 사이크린 의존성 인산효소 억제제(Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A, p21WAF1)로, P53-의존적, 또는 비의존적으로 세포주기에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 최근 보고에서는 p53이 기능을 하지 않는 간암에서 CDKN1A의 강제적 과발현이 항암제 CDDP의 항종양 효과에 영향을 미친다는 결과를 보여주고 있다[LF. Qin., & IO. Ng, Exogenous expression of p21(WAF1/CIP1) exerts cell growth inhibition and enhances sensitivity to cisplatin in hepatoma cells. Cancer Lett. 22 (2001) 7-15]. 따라서, 본 발명은 상기 기능 외에 최초로 항암제 5-플루오로우라실의 항종양 효과와 관련있는 유전자 마커임을 확인함으로써 상기 6종 유전자의 새로운 용도에 그 특징이 있는 것이다.

또한, 본 발명은 6종의 새로운 5-플루오로우라실관련 마커를 사용한 5-플루오로우라실 항종양 효과 진단방법을 제공한다. 진단방법에는 다음 실시예에 기재된 DNA 칩 또는 경쟁적 RT-PCR 기술에 제한하지 않고, 6종의 새로운 5-플루오로우라실 관련 마커의 유전자 또는 그의 단편의 발현량을 측정하여 5-플루오로우라실 항종양 효과를 진단하는 방법이면 모든 방법이 여기에 포함된다.

본 발명은 또한 하기와 같은 단계들을 포함하는 5-플루오로우라실 특이적 민감성 유전자들의 발현 정도를 측정하는 방법을 제공한다:

a) 위암 세포주 또는 위암 조직에서 KIAA1141(AN: AB032967), FLJ21931(AN: AK025584), FLJ11021(AN: NM_023012), CSTF3(AN: NM_001326), CDKN1A(AN: NM_000389) 및 EST601820453F1(AN: BF131634) 중에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 그의 단편의 양을 측정하는 단계,

b) 위암 이외의 암 세포주 또는 암 조직에서 상기 1)의 유전자 또는 그의 단편의 양을 측정하는 단계, 및

c) 5-플루오로우라실 내성 세포주 또는 내성 조직에서 상기 1)의 유전자 또는 그의 단편의 양을 측정하는 단계.

상기 측정된 값을 비교함으로써 5-플루오로우라실의 항종양 효과를 진단할 수 있다. 구체적으로, (a)에 의해 얻어진 측정값을 (c)에서 얻어진 측정값과 비교하거나 (b)에 의해 얻어진 측정값을 (c)에서 얻어진 측정값과 비교함으로써 5-플루오로우라실 특이적 고발현 및 저발현 유전자의 상대적 발현양을 통하여 5-플루오로우라실의 항종양 효과 여부를 판정할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 5-플루오로우라실의 항종양 효과의 진단에 사용할 수 있는 6종의 표적유전자에 대하여 상보적인 염기 서열을 갖는 정방향(forward) 프라이머 및 역방향(reverse) 프라이머를 제공한다. 이러한 프라이머에는 다음 실시예에 기재된 프라이머의 염기배열에 제한하지 않고, 6종의 표적유전자 DNA의 일부 또는 전부의 배열이 함유되고 적어도 15 bp 길이의 DNA이면 바람직하다. '상보적'이란 적어도 15개의 연속 염기배열에서 완전히 상보적인 배열인 경우로 제한하지 않고 염기 배열상에서 적게는 70%, 바람직하게는 80% 이상의 상동성이 있으면 된다.

또한, 본 발명의 6종의 마커 유전자의 발현량은 마커 유전자 또는 그 단편을 프로브로 사용한 공지의 혼성화 반응(하이브리다이제이션 반응)을 통하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 노던 하이브리다이제이션["Molecular Cloning - A Laboratory Manual "Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al., 1982, section 7.37-7.52], 인시츄 하이브리다이제이션[Jacquemier 등, Bull Cancer 90: 31-8, 2003] 또는 마이크로어레이[Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3: 185-200, 2003] 등의 방법으로 측정할 수 있다. 프로브는 6종 유전자의 염기 서열을 함유한 통상 200 ∼ 1000 bp이며 바람직하게는 400 ∼ 800 bp의 길이를 가 진다. 염기서열은 6종 유전자의 염기 서열과 70% 이상의 유사성을 가지면 된다. 본 발명의 마커 유전자의 프로브는 상기에서 제조된 32종의 마커 유전자의 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 이용한 유전자 증폭법(PCR) 등의 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다.

또한, 상기 6종의 5-플루오로우라실 관련 마커에 대한 항체를 5-플루오로우라실의 항종양 효과의 진단에 사용함을 포함한다. 6종의 5-플루오로우라실 민감성 유전자에 대한 항체는 각 유전자를 발현벡터에 클로닝하여, 상기 표적유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 6종의 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩타이드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩타이드로는 최소 7개 아미노산, 더욱 바람직하기로는 9개 아미노산, 보다 더욱 바람직하기로는 12개 아미노산 이상이 될 수 있다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론항체, 단일클론항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함된다. 그리고 여기에는 전 부류(class)의 항체가 포함된다. 또한, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수항체도 포함된다. 제조된 항체는 위암조직을 비롯한 시험 시료에서 5-플루오로우라실 특이적으로 발현이 증가되는 단백질 및 억제되는 단백질을 검출함으로써, 5-플루오로우라실의 항종양 효과의 진단에 이용될 수 있다. 단백질 양의 검출은 통상의 ELISA 및 면역침강법 등에 의해 수행될 수 있다.

본 발명은 상기 6종의 5-플루오로우라실 관련 유전자마커에 대한 정방향(forward) 프라이머 및 역방향(reverse) 프라이머 또는 항체를 포함하는 5-플루오로우라실의 항종양 효과 진단제 및 5-플루오로우라실의 항종양 효과 진단키트도 제공한다.

본 발명의 5-플루오로우라실의 항종양 효과 진단제는 상기 5-플루오로우라실 특이적 마커 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머, 상기 6종 유전자의 프로브, 상기 6종 유전자의 고형지지체, 상기 6종 유전자의 항체 또는 상기 6종 항체의 고형지지체를 포함한다.

본 발명의 5-플루오로우라실의 항종양 효과 진단키트는 상기 5-플루오로우라실 특이적 마커 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머 또는 프로브 이외에 RNA 또는 폴리 (A)⁺ RNA 분리 시약을 더 포함할 수 있으며, 마이크로어레이를 통하여 발현양을 조사하는 경우에는 6종 유전자의 고형지지체를 포함한다. 또한, 면역학적 방법에 의한 진단키트는 상기 5-플루오로우라실 특이적 마커 유전자의 다클론항체, 단일클론항체 또는 이들 항체의 고형지지체 등을 포함한다.

본 발명에 따른 진단방법에 있어 상기의 진단학적 유의성을 갖는 6종의 유전자 또는 단백질은 단독적으로 이용가능하나, 조합하여 이용하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 상기한 본 발명의 5-플루오로우라실 관련 마커 및 진단키트는 위암에서의 5-플루오로우라실 항종양 효과의 진단에 이용될 수 있으나, 위암에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발 명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 5-플루오로우라실 세포독성에 의한 위암 세포주에서의 5-플루오로우라실에 대한 민감성 측정

10% 소혈청(FBS, Fetal Bovine Serum), 페니실린(10000 U/㎖)과 스트렙토마이신(10 mg/㎖)을 첨가한 RPMI 1640[Jeil Biotech, 한국] 배양액을 10 cm 디쉬에 20 ㎖씩 분주한 후 위암 세포주(SNU-1, SNU-5, SNU-216, SNU-484, SNU-601, SNU-638, SNU-668, SNU-719)을 디쉬당 세포가 1 ×10⁶이 되도록 접종하고 이를 37 ℃, 5% CO₂가 존재하는 배양기 내에서 배양하였다. 24시간 배양한 후 ㎖ 당 5-플루오로우라실의 농도가 0.01, 0.1, 1.0, 10, 100 ㎍가 되도록 각 세포 배양액에 5-플루오로우라실 [Sigma 사]를 첨가하였다. 이를 3일간 배양한 후 IC₅₀(50% Growth Inhibitory Concentration: 세포 배양이 50% 억제될 때의 농도) 값을 구하였다. IC₅₀값은 트립토판-블루 염색방법에 의해 생존 세포수를 측정했을 때, 5-플루오로우라실 처리 시료의 생존 세포수가 5-플루오로우라실을 처리하지 않은 대조군에 비하여 50%가 되는 약제 농도를 말한다.

상기와 같은 방법으로 산출된 IC₅₀값은 다음 표 1과 같으며 SNU-1, SNU-5, SNU-601, SNU-638와 SNU-668의 세포주는 5-플루오로우라실에 대해 민감성 세포주이며, SNU-216, SNU-484와 SNU-719는 5-플루오로우라실에 대해 내성 세포주로 나타났 다. 본 실험에서는 5-플루오로우라실에 대해 민감성 세포주로 SNU-601와 SNU-638을, 5-플루오로우라실에 대해 내성 세포주로 SNU-484, SNU-216을 사용하였다.

위암 세포주	IC₅₀(㎍/㎖)
SNU-601	0.20
SNU-668	0.21
SNU-638	0.23
SNU-1	0.27
SNU-5	0.37
SNU-719	2.63
SNU-484	4.70
SNU-216	34.0

실시예 2: cDNA 마이크로어레이법에 의한 위암 세포주에서의 5-플루오로우라실 항암제 관련 내성 후보 유전자 및 민감성 후보 유전자의 검출

(1) 위암 세포주에 5-플루오로우라실 항암제의 처리 및 이로부터 총 RNA의 분리

10% 소혈청(FBS, Fetal Bovine Serum), 페니실린(10000 U/㎖)과 스트렙토마이신(10 mg/㎖)을 첨가한 RPMI 1640[Jeil Biotech, 한국] 배양액을 15 cm 디쉬에 30 ㎖씩 분주한 후 위암 세포주(SNU-601,SNU-638, SNU-484, SNU-216)를 디쉬당 세포가 5 ×10⁶이 되도록 접종하고 이를 37 ℃, 5% CO₂가 존재하는 배양기 내에서 배양하였다. 이를 24시간 배양한 후 5-플루오로우라실을 10 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 실험군인 5-플루오로우라실 처리 전, 처리 후의 6, 12, 24시간의 각 세포 배양액을 회수하고, QIAGEN 키트(RNeasy Midi 키트: cat#75144)를 이용하여 각 배양액으로부터 총 RNA를 추출하였다.

(2) Cy3 또는 Cy5를 표식한 cDNA의 합성

상기 (1)에서 추출한 총 RNA를 사용하여 다음에 기재된 3DNA Array 50 키트 (Genisphere Inc, Hatfield, PA)의 방법에 따라 역전사(reverse transcription) 반응을 수행하여 cDNA를 합성하였다. 즉, 3 ㎕의 Cy3에 대한 RT 프라이머, 17 ㎕의 총 RNA(25 ㎍ 함유)와 물로된 RT 혼합물을 80 ℃에서 10분간 처리하고 바로 얼음에 방치한 후 RNase 저해제를 각각 1 ㎕ 넣어준 후 2 ㎕의 10 mM의 dNTP mix(A, T, G, C 각 10 mM)와 4 ㎕의 0.1M의 DTT(dithiotreitol)[Invitrogen life technologies, USA]와 250 mM 트리스-HCl(pH 8.3), 375 mM KCl 및 15 mM MgCl₂를 포함하는 8 ㎕의 5XRT 완충액[Invitrogen life technologies, USA]을 넣고 잘 혼합하였다. 여기에 2 ㎕ SuperScript II RNase H-역전사효소(200 유니트/㎕)[Invitrogen life technologies, USA]를 넣고 42 ℃에서 2시간동안 반응하였다. 7 ㎕의 0.5M NAOH/50mM EDTA를 넣어 반응을 중단시키고 65 ℃에서 10분간 반응하여 반응물을 가수분해한 후 10 ㎕의 1M 트리스-HCl(pH 7.5)를 넣어 중화시켰다. 합성된 cDNA는 스핀 칼럼(Microcon YM-30)[Millipore Corporation, Bedford, MA]으로 처리하여 순수하게 분리하였다. 한편, 5-플루오로우라실을 처리하지 않은 대조군은 3 ㎕의 Cy5에 대한 RT 프라이머를 첨가하고, 상기와 동일한 방법으로 cDNA를 합성하고 분리하였다.

(3) 혼성화 반응

실험군 및 대조군으로부터 취득한 cDNA를 총 부피 40 ㎕로 혼합하여 14K Unigene cDNA 칩(21C 인간유전체기능연구 사업단 제공, 한국)과 1차 혼성화 반응을 16시간 수행하였다. 그런 다음, 2% SDS를 포함하는 2XSSC, 2XSSC 및 0.2XSSC로 각각 5분간 세척하고, 95% 에탄올로 cDNA 프로브를 고정시킨 후, 다시 3DNA 포획 시약(Capture Reagent)#1과 3DNA 포획 시약#2를 혼합하여 총 부피 40 ㎕로 14K Unigene cDNA 칩와 2차 혼성화 반응을 6시간 수행하였다. 반응 후 상기와 같은 방법으로 세척하고 최종적으로 1000 rpm에서 3분간 원심분리하여 건조시켰다.

(4) 데이터 분석

칩상의 형광 이미지를 스캔어레이 5000 마이크로어레이 스캐너(Packard BioScience)로 532 nm에서 Cy3 및 635 nm에서 Cy5를 스캐닝하고 Gene PIX 프로그램(Axon Instruments, Inc.)을 사용하여 이미지 분석을 수행하고 R 패키지 프로그램을 이용하여 노말라이제이션(normalization)을 수행하였다. 각 세포주에서 5-플루오로우라실을 처리하지 않은 대조군에 비해 시간에 따라 증가 또는 감소하여 24시간 후 2배 이상 변화를 보인 유전자를 검출한 후, 이들 유전자중 5-플루오로우라실 민감성 세포주에서는 증가하나 내성 세포주에서는 감소 또는 무변화하는 유전자를 민감 후보유전자로, 5-플루오로우라실 내성 세포주에서는 증가하나 민감성 세포주에서는 감소 또는 무변화하는 유전자를 내성 후보유전자로 판단하였다[표 2].

그 결과, 5-플루오로우라실 처리 24시간 후 5-플루오로우라실 민감성 위암세 포주에서 발현이 2배 이상 증가하는 5-플루오로우라실 민감성 후보 유전자로 6종의 유전자, 즉 KIAA1141(AN: AB032967), FLJ21931(AN: AK025584), FLJ11021(AN: NM_023012), CSTF3(AN: NM_001326), CDKN1A(AN: NM_000389), EST601820453F1(AN: BF131634)이 발굴되었다.

유전자	Accession Number	Log2(Cy3/Cy5)^a
유전자	Accession Number	위암세포주	6시간	12시간	24시간
KIAA1141	AB032967	SNU-601	0.508	0.503	1.215
		SNU-638	0.384	0.598	1.190
		SNU-484	-0.095	0.198	-0.129
		SNU-216	-0.095	0.214	0.084
FLJ21931	AK025584	SNU-601	0.892	1.210	1.470
		SNU-638	0.306	0.845	1.300
		SNU-484	0.098	0.307	0.007
		SNU-216	0.000	-0.269	0.408
FLJ11021	NM_023012	SNU-601	0.578	1.460	1.340
		SNU-638	0.253	0.105	1.425
		SNU-484	-0.237	0.284	-0.027
		SNU-216	-0.437	-0.186	0.064
CSTF3	NM_001326	SNU-601	0.821	0.455	1.425
		SNU-638	0.675	0.774	1.431
		SNU-484	0.102	1.585	0.200
		SNU-216	-0.093	0.505	0.523
CDKN1A	NM_000389	SNU-601	1.163	0.782	1.345
		SNU-638	0.920	1.605	2.351
		SNU-484	0.077	0.140	-0.176
		SNU-216	-0.033	-0.332	0.222
EST601820453F1	BF131634	SNU-601	0.848	1.503	0.940
		SNU-638	0.143	0.289	1.245
		SNU-484	-0.305	-0.310	-1.120
		SNU-216	0.174	1.255	-0.186
a;5-플루오로우라실을 처리하지 않은 대조군에 대한 5-플루오로우라실을 처리한 실험군의 상대적인 로그값.

실시예 3: 경쟁적 RT-PCR을 이용한 5-플루오로우라실 관련 내성 후보유전자 및 민감성 후보유전자의 확인

(1) 역전사 효소 반응

상기 실시예 2의 (1)에서 획득한 총 RNA 중 5 ㎍의 총 RNA을 다음 조성으로 혼합한 후, 42 ℃에서 65분간 반응시켜 총 RNA에서 cDNA을 합성하였다. 이를 70 ℃, 15분간 열처리하여 cDNA의 반응을 종료시켰다.

역전사 반응액

폴리 dT_(12-18) 프라이머(0.4 ㎍/㎕) 1 ㎕

5 ×첫번째 스트랜드 버퍼 4 ㎕

10 mM dNTP mix 1 ㎕

0.1 M DTT 2 ㎕

RNase OUT(40 U/㎕) 1 ㎕

역전사효소(200 U/㎕) 1 ㎕

총 RNA(5 ㎍) X ㎕

증류수 (11-X) ㎕

총 함량 20 ㎕

(2) 경쟁적 PCR을 위한 주형의 농도 보정

마커 유전자를 정량하기 위한 표준 유전자로 본 실험에서는 베타-엑틴 유전자(beta-actin gene)를 사용하였다. 표준 유전자와 프라이머의 프라이밍 부분은 같으나, PCR 산물의 크기가 다른 경쟁 DNA(competitor)를 표준 유전자와 함께 PCR 반응을 수행하여, 시료간 표준 유전자의 발현량과 경쟁 DNA의 발현량이 같은 농도를 찾아, PCR에 사용되는 각 주형의 농도가 동일하게 되도록 시료의 농도를 보정하였다.

베타-엑틴 경쟁 DNA는 시판의 DNA[Takara, 일본]를 사용하였으며, 이를 이용한 PCR 산물의 길이는 340 bp이며, 베타-엑틴 유전자로부터 PCR 산물의 길이는 275 bp였다. 베타-엑틴 경쟁 DNA를 6 단계로 희석하고, 희석한 2 ㎕를 상기 (1)의 역전사 효소 반응액의 희석액 5 ㎕에 각각 혼합한 후, 3 ㎕의 5XPCR 반응액[바이오니아, 한국], 각각 0.6 ㎕의 2종류의 베타엑틴 프라이머(10 pmole/㎕: 서열번호 1과 서열번호 2), 3.8 ㎕의 증류수를 함유한 총 15 ㎕의 6개 PCR 반응액을 사용하여 경쟁적 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 반응 조건은 94 ℃(30초), 68 ℃(1분), 72 ℃(1분)로 25회씩 수행하였다.

정방향 프라이머(서열번호 1) : 5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3'

역방향 프라이머(서열번호 2) : 5'-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3'

PCR 산물을 2% 아가로스 젤에 3 ㎕씩 로딩하여 100 V에서 30분간 전기영동한 후, FrogTM 기계(젤 이미지 어낼리시스 시스템)[Core Bio, 한국]을 이용하여 젤 사진을 촬영하였다. 얻어진 젤 밴드 이미지 파일은 기계에 첨부된 ToltalLab v1.0 프로그램[NonLinear Dynamix Ltd.]을 사용하여, 베타-엑틴 유전자와 베타-엑틴 경쟁DNA에서 생성된 두 밴드의 감도가 비슷한 농도를 선별, 정량화한 후, 각 시료의 농도를 보정하였다.

(3) PCR을 이용한 cDNA의 증폭

상기 (2)에서 보정한 시료의 첫번째 cDNA로부터 각 유전자의 정방향(forward) 프라이머 및 역방향(reverse) 프라이머[표 3]을 사용하여 PCR 반응에 의해 각 유전자를 증폭시켰다. 이때, PCR 반응 조건은 94 ℃(30초), 55 ℃(1분), 72 ℃(1분)로 30회씩 수행하였다.

후보유전자인 KIAA1141, FLJ21931, FLJ11021, CSTF3, CDKN1A 및 EST 601820453F1의 프라이머는 다음 표 3과 같이 단백질 코딩 영역 내부에서 디자인하였고, 각 프라이머의 길이는 19 ∼ 20 bp, GC 함량은 50 ∼ 70% 정도이며 두 프라이머 사이에 상보적인 수소 결합이 최소가 되게 하여 프라이머 간의 이량체 형성이 억제되도록 디자인하였다[제노텍, 한국]. 다음은 경쟁적 PCR 반응액의 조성을 나타내었다.

RT-PCR 반응액

cDNA 5 ㎕

5 ×PCR 반응 mix [바이노니아, 한국] 3 ㎕

정방향 프라이머(10 pmole/㎕) 1 ㎕

역방향 프라이머(10 pmole/㎕) 1 ㎕

증류수 5 ㎕

총 함량 15 ㎕

유전자	프라이머
KIAA1141	정방향 (서열번호 3)	5'-AGTCCTGTGTCCACCGTTTC-3'
KIAA1141	역방향 (서열번호 4)	5'-GTCTCCTTGCATTCAGCACA-3'
FLJ21931	정방향 (서열번호 5)	5'-ATGGAGCTACAGCCTCCTGA-3'
FLJ21931	역방향 (서열번호 6)	5'-GAGCCTTGCCTGAGACAAAC-3'
FLJ11021	정방향 (서열번호 7)	5'-CCGCTCAAGATCAAGACACA -3'
FLJ11021	역방향 (서열번호 8)	5'-ATCCATTCCTCGCATTGAAG-3'
CSTF3	정방향 (서열번호 9)	5'-ACCCGAGTTTTGTTTGAACG-3'
CSTF3	역방향 (서열번호 10)	5'-AACGGCTCCCTTTTCTTCAT-3'
CDKN1A	정방향 (서열번호 11)	5'-ACTGTGATGCGCTAATGGC-3'
CDKN1A	역방향 (서열번호 12)	5'-ATGGTCTTCCTCTGCTGTCC-3'
EST601820453F1	정방향 (서열번호 13)	5'-CGGTCTAAAGTGGAAGAGC-3'
EST601820453F1	역방향 (서열번호 14)	5'-CAGAGTGAAGCCACTGGTGA-3'

(4) 경쟁적 PCR을 이용한 cDNA 증폭 산물의 확인

PCR 반응에 의해 증폭된 PCR 산물을 확인하기 위하여, PCR 반응액을 2%의 아가로스 젤에 100 V로 30분간 전기영동한 후, PCR 산물을 FrogTM 기계(젤 이미지 어낼리시스 시스템)[Core Bio]를 이용하여 젤 사진을 촬영하였다. 최종적으로 얻은 젤 밴드 이미지 파일(.tif)을 ToltalLab v1.0 프로그램(NonLinear Dynamix Ltd.)을 이용하여 밴드 세기를 정량화하였다.

경쟁적 RT-PCR 결과는 마이크로어레이 결과와 일치하였다[도 1]. 즉, 마이크로어레이 결과에서 5-플루오로우라실 민감 후보 유전자군인 KIAA1141, FLJ21931, FLJ11021, CSTF3 및 CDKN1A의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 5-플루오로우라실 민감성 세포주에서 높게 나타났으며, 5-플루오로우라실처리 시간에 따라 발현량은 증가하였다. 즉, KIAA1141, FLJ21931, FLJ11021, CSTF3, CDKN1A와 EST 601820453F1은 위암 항암제인 5-플루오로우라실 관련 유전자 마커로서 유용함이 밝혀져, 시료에서 이들 마커의 발현량을 측정함으로써 5-플루오로우라실 항종양 효과를 예측할 수 있음이 시사되었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 5-플루오로우라실 항종양 효과 진단에 유용한 마커로 5-플루오로우라실 민감성 위암세포주에서 검출된 6종의 5-플루오로우라실 민감성 후보 유전자가 제공되었다. 상기 5-플루오로우라실 관련 마커는 환자 조직에서 신속하고 민감하게 정량하여 5-플루오로우라실 세포독성을 예측할 수 있으므로, 위암을 비롯한 다양한 종류의 암의 화학요법 치료 시 5-플루오로우라실의 항종양 효과의 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있으며, 이에 따라 진단 후에 수행될 여러 가지 항암제 화학요법 치료에 많은 도움을 줄 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> ANTICANCER DRUG, 5-FLOUROURACIL-RELATED MARKER GENES AND DETECTION KIT FOR ANTICANCER EFFECTS THEREBY <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of beta-actin <400> 1 caagagatgg ccacggctgc t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of beta-actin <400> 2 tccttctgca tcctgtcggc a 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying KIAA1141 <400> 3 agtcctgtgt ccaccgtttc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying KIAA1141 <400> 4 gtctccttgc attcagcaca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying FLJ21931 <400> 5 atggagctac agcctcctga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying FLJ21931 <400> 6 gagccttgcc tgagacaaac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying FLJ11021 <400> 7 ccgctcaaga tcaagacaca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying FLJ11021 <400> 8 atccattcct cgcattgaag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying CSTF3 <400> 9 acccgagttt tgtttgaacg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying CSTF3 <400> 10 aacggctccc ttttcttcat 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying CDKN1A <400> 11 actgtgatgc gctaatggc 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying CDKN1A <400> 12 atggtcttcc tctgctgtcc 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying EST601820453F1 <400> 13 cggtctaaag tggaagagc 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying EST601820453F1 <400> 14 cagagtgaag ccactggtga 20

Claims

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KIAA1141(AN: AB032967), FLJ21931(AN: AK025584), FLJ11021(AN: NM_023012), CSTF3(AN: NM_001326), CDKN1A(AN: NM_000389) 및 EST601820453F1(AN: BF131634)의 6종 유전자 또는 이들의 조합에 대한 유전자에 대하여 상보적인 염기서열을 갖는 서열번호 3 내지 14로 표시되는 프라이머쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 5-플루오로우라실의 항종양 효과 진단키트.
KIAA1141(AN: AB032967), FLJ21931(AN: AK025584), FLJ11021(AN: NM_023012), CSTF3(AN: NM_001326), CDKN1A(AN: NM_000389) 및 EST601820453F1(AN: BF131634)의 6종 유전자 또는 이들의 조합에 대한 유전자에 대하여 상보적인 염기서열을 갖는 서열번호 3 내지 14로 표시되는 프라이머쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 5-플루오로우라실의 항종양 효과 진단제.
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