KR100644364B1

KR100644364B1 - 파킨슨병 유전자 마커 및 이를 이용한 파킨슨병 진단킷트

Info

Publication number: KR100644364B1
Application number: KR1020050018300A
Authority: KR
Inventors: 김남순; 오정화; 김정민; 전여진; 표재희; 변상순; 전국체; 송태훈; 이동석
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2005-03-04
Filing date: 2005-03-04
Publication date: 2006-11-10
Also published as: KR20060097224A

Abstract

본 발명은 파킨슨병 유전자 마커 및 이를 이용한 파킨슨병 진단킷트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 파킨슨병에 대한 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현 정도를 측정하여 파킨슨병을 진단하는데 매우 유용하게 사용될 수 있도록 개발된 파킨슨병 진단방법 및 진단킷트에 관한 것이다.

파킨슨병, 유전자 마커, 고발현, 저발현, 진단킷트

Description

파킨슨병 유전자 마커 및 이를 이용한 파킨슨병 진단킷트{DETECTION KIT FOR PARKINSON'S DISEASE BY MEASURING THE EXPRESSION OF PARKINSON'S DISEASE-RELATED GENES}

도 1은 유전자 발굴 빈도를 분석한 것이고,

도 2는 파킨슨병 환자와 정상인의 흑색질 시료에서 파킨슨병 고발현 유전자의 발현 정도를 정량적(quantitative) RT-PCR 방법을 사용하여 수행한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 파킨슨병 환자와 정상인의 흑색질 시료에서 파킨슨병 저발현 유전자의 발현 정도를 정량적 RT-PCR 방법을 사용하여 수행한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 파킨슨병 마우스 모델에서 적출한 흑색질 시료에서 파킨슨병 마커 유전자인 티로신 가수분해효소(thyrosine hydrolase)의 전사체 발현량 감소를 정량적 RT-PCR 방법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 파킨슨병 마우스 모델에서 적출한 흑색질 시료에서 파킨슨병 마커 유전자인 티로신 가수분해효소의 단백질 발현량 감소를 면역조직화학염색 (immunohistochemistry) 방법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다[(1): 대조군, (2); 실험군-3].

도 6은 파킨슨병 마우스 모델 시료에서 파킨슨병 고발현 유전자의 발현 정도를 정량적 RT-PCR 방법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 파킨슨병 마우스 모델 시료에서 파킨슨병 저발현 유전자의 발현 정도를 정량적 RT-PCR 방법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 파킨슨병(Parkinson's disease, 이하 PD 명명) 유전자 마커 및 이를 이용한 파킨슨병 진단킷트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 파킨슨병에 대한 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현 정도를 측정하여 파킨슨병 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있도록 개발된 파킨슨병 진단방법 및 진단킷트에 관한 것이다.

파킨슨병은 발병 원인이 완전히 밝혀지지 않은 "특발성"(特發性, idiopathic) 퇴행(退行)성 신경질환(neurodegenerative disease)에 속하는 것으로, 떨림(tremor), 강직(rigidity) 및 서행(bradykinesis) 등의 증상이 나타난다. 병리학적인 소견으로는 뇌 흑색질(Substantia nigra)에서 도파민 신경세포(dopaminergic neuron)가 소실되어 80% 이상의 도파민의 농도가 감소된 도파민 결핍 증상이 나타나고, 이로서 운동회로 조절의 이상으로 행동학적 이상이 나타난다[Levine 등, Trends Neurosci. 27: 691-697, 2004; Dauer 등, Neuron 39: 889-909, 2003; Moore 등, Brain Res. 30: 119-135, 1971]. 또한, PD에서는 루이체(Lewy body)라고 불리는 세포질 내 침전물(cytoplasmic inclusion) 형성이 관찰되고 이의 주 구성단백질은 알파시누클레인(alpha-synuclein)으로 보고되고 있다. 이러한 사실에 근거하여 PD에서 알파시누클레인이 중요한 역할을 할 것으로 추정하고 있다 [Spillantini 등, Nature 388: 839-840, 1997]. 또한, 산화적 스트레스(oxidative stress)와 미토콘드리아 기능부전(mitochondria dysfunction)도 PD 발병 기작에 관련이 있을 것으로 추정되고 있다[Grunblatt 등, J. Neural Transm. 111: 1543-1573, 2004].

알파시누클레인, 파킨(Parkin), UCH-L1(Ubiquitin C-Terminal Hydrolase-L1), DJ-1, NR4A2(Nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2), 신필린-1(Synphilin-1, Synuclein-alpha-interacting protein) 등의 유전자의 변이가 PD 유발 원인 유전자로 보고되고 있다[Dawson 등, Science 302:819-822, 2003]. 알파시누클레인 단백질은 신경계에 널리 분포하고, 구체적으로는 시냅스 전 소포(Presynaptic vesicles)와 밀접한 관계를 가지는 시냅스 전 신경 말단(Presynaptic nerve terminal)에서 발견된다. 현재까지 보고된 미스센스(missense) 변이(mutation)는 53번 위치의 알라닌 아미노산(Alanine)이 트레오닌(Threonine) 아미노산으로 바뀐 것과 30번 위치의 알라닌 아미노산이 프롤린(Proline) 아미노산으로 변이된 것으로 이는 우성 유전(dominantly inherited)되는 PD 가계에서 확인되었다 [Polymeropoulos 등, Science 276:2045-2047, 1997; Kruger 등, Nat. Genet. 18:107-108, 1998]. 파킨 단백질은 N-말단(N-terminus)에 유비퀴틴 호모로거스 도메인(ubiquitin homologous domain)이, C-말단에 두 개의 RING 핑거 도메인이 있 으며, RING 핑거 도메인의 존재로 보아서 파킨 단백질은 E3 유비퀴틴 리가아제 기능을 가지며, 유비퀴틴-프로테아솜 시스템(Ubiquitin-proteasome system)과 연관이 있을 것으로 보고되고 있다[Zhang 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13354-13359, 2000; Sherman 등, Neuron 29:15-32, 2001]. 이 유전자의 변이는 열성유전(recessively inherited) PD 가계에서 보고되고 있다[Kitada 등, Nature 392:605-608, 1998]. UCH-L1 단백질은 유비퀴틴의 C-말단의 유비퀴틸 에스테르(ubiquityl esters)를 가수분해(hydrolyze)하여 단량체(monomer)를 만드는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있고[Wilkinson, Semin. Cell Dev. Biol. 11:141-148, 2000], 이 유전자의 변이는 93번 위치의 이소루신(Isoleucine) 아미노산이 메치오닌(Methionine) 아미노산으로 변이된 것으로 한 가계에서 이러한 변이가 우성형질로 유전됨이 보고되었다[Leroy 등, Nature 395:451-452, 1998]. 그러나, 이와 같은 변이와 관련된 병리학적 데이터(Pathological data)는 아직 보고되지 않고 있다. DJ-1은 발암유전자로 처음 보고되었고[Nagakubo 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 231:509-513, 1997], 상염색체성의 열성(autosomal recessive)형질인 PARK7(Parkinson disease type 7)을 가지는 두 경우의 혈족 가계에서 DJ-1의 변이가 보고되었다[Bonifati 등, Science 299:256-259, 2003]. NR4A2 유전자는 도파민성 세포 발달(dopaminergic cell development)과 생존(survival)에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며[Zetterstrom 등, Science 276:248-250, 1997], 이 유전자의 변이가 가계성(familial) PD와 관련이 있음이 보고되었다[Le 등, Nat. Genet. 33:85-89, 2003]. 신필린-1 단백질에서의 변이는 621번 아미노산 위치 에서 아르기닌(Arginine) 아미노산이 시스테인(Cysteine) 아미노산으로 바뀐 것이 2명의 산발적인(sporadic) PD에서 관찰되었다[Marx 등, Hum. Molec. Genet. 12:1223-1231, 2003]. 지금까지의 PD 관련 유전자들에서의 변이들이 PD 환자들에서 전부 관찰되는 것이 아니고, 일부 가계 환자나 개개의 환자에서 관찰되는 것으로 보아서, PD의 발생과 진행은 세포내 다양한 신호전달과 조절기작에 관여하는 많은 유전자들의 복합적인 상호작용에 의한 것임을 추론할 수 있다. 즉, 몇몇 특정한 유전자들에 중점을 두고 PD의 형성 기작을 연구하는 것 보다 다량의 유전자 발현정도를 비교 분석하여 PD에 관련된 새로운 유전자들을 발굴하는 연구는 매우 중요한 의미가 있다.

최근, 다량의 유전자를 이용하는 연구 방법인 ESTs(Expressed Sequence Tags) 발굴, cDNA 마이크로어레이 및 SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 방법을 이용해서 PD 관련 유전자들을 발굴하는 연구가 시도되고 있으며 그 결과를 살펴보면 다음과 같다. 마우스 시료에서 PD가 발병하는 부위인 흑색질을 사용하여 마우스 뇌에서 발현되는 497개의 ESTs를 분석하여 이들 유전자들이 PD와 직접 또는 간접적으로 관련된다고 보고되었다. 그러나, 상기 실험에 사용된 시료는 PD를 유발시킨 마우스가 아니라 정상의 마우스였다[Stewart 등, Genomics 39:147-153, 1997]. 또한, cDNA 마이크로어레이를 이용해서 PD의 세포사멸 원인 중의 하나인 산화적 스트레스(oxidative stress)에 의해 조절되는 유전자들에 대해서도 보고되었다[Yoo 등. Mol. Brain Res. 110:76-84, 2003]. 한편, PD 유발물질로 알려진 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)를 마우스에 투여하여 PD 마우스 모델을 제작하고 이를 이용하여 PD 관련 유전자를 대량 발굴하는 cDNA 마이크로어레이 연구도 보고되었다[Mandel 등, Neurochem. Res. 27:1231-1243; Mandel 등, J. Neural. Transm. Suppl. 60:117-124, 2000; Grunblatt 등, J. Neurochem. 78:1-12, 2000]. 이외에도, PD로 진단은 되지 않았지만, PD 발병 나이인 72세와 81세의 두 명의 환자의 흑색질 조직을 이용하여 PD 후보유전자를 발굴하는 SAGE 분석 연구도 보고된 바 있다[Hauser 등, Hum. Mol. Genet. 12:671-677, 2003]. 하지만, 현재까지 PD 후보 유전자의 발굴이 미흡한 상태이다.

ESTs를 통한 유전자 수집은 시료에서 cDNA 라이브러리를 제조하고 여기에서 임의적으로 선별한 cDNA 클론들의 염기서열을 분석함으로써 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자를 수집하는 프로젝트이다. 이러한 EST 수집 방법을 통하여 새로운 유전자의 발굴[Adams 등, Science 252: 1651-1656, 1991;Adams 등, Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995; Hillier 등, Genome Res. 6: 807-828, 1996; Marra 등, Nat. Genet. 21:191-194,1999], 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석[Okubo 등, Nat. Genet. 2: 173-179, 1992; Adams 등, Science 252: 1651-1656, 1991; Adams 등, Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995; Liew 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10645-10649, 1994; Mao 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8175-8180, 1998; Ryo 등, Nucleic Acids Res. 26: 2586-2592, 1998; Sterky 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13330-13335, 1998]이 가능하다고 보고되고 있다.

본 발명에서는 6종의 파킨슨병 고발현 유전자와 4종의 파킨슨병 저발현 유전 자를 발굴하였으며, 이들은 파킨슨병과의 관련성이 보고되지 않은 것으로 현재 이들 유전자에 대해 알려진 내용은 다음과 같다. MBP(myelin basic protein)는 중추신경계에서 미엘린막(myelin membrane)의 구성성분으로 알려져 있고, 뇌종양 환자의 뇌척수액(cerebrospinal fluid)에서 고발현된다고 보고되고 있지만, PD에서의 발현은 아직 보고된 바 없다[Nakagawa 등, Neurosurgery 34: 825-833, 1994]. PBP(prostatic binding protein)는 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질(phosphatidylethanolamine-binding protein) 또는 RKIP(Raf kinase inhibitor protein)으로도 불리어지고, RAF1과 MAPKK와 결합하여 ERK 경로(pathway)를 방해하여 세포성장(cell proliferation)을 억제하여, 세포분화(differentiation)를 유도하는 것으로 보고되었다[Yeung 등, Nature 401: 173-177, 1999; Yamazaki 등, J. Biol. Chem. 279: 32191-32195, 2004]. 또한, PBP는 해마(hippocampus)의 발생(development)에 관련하는 생체활성(bioactive) 펩타이드(peptide)인 해마 신경자극(neurostimulatory) 펩타이드의 전구체(precursor)로 알려져 있지만[Tohdoh 등, Mol. Brain Res. 30: 381-384, 1995], PD에서의 발현은 아직 보고된 바 없다. GNAS(GNAS complex locus)는 아데닐레이트 사이클레이즈(adenylated cyclase)의 조절에 관여하는 단백질로써 외부로부터의 신호전달에 관여하고, 일반적으로 NESP55(neuroendocrine secretory protein 55)로 불려지고, 신경모세포종(neuroblastomas)에서의 발현이 보고되지만[Nilsson 등, Ann. N. Y. Acad. Sci. 1014: 280-283, 2004] PD에서는 아직 보고된 바 없다. RPS3A(Ribosomal protein S3a)는 유전자들의 해독(translation)에 관여하는 리보좀(ribosome)의 구 조단백질로서 정확한 기능이 많이 알려져 있지 않으나, 최근에는 세포 형질전환과 죽음에 관여하는 것으로 보고되고 있다[Naora, Immunol. Cell. Biol. 77: 197-205, 1999]. EIF3S5(Eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 5)는 EIF3의 하나의 서브유닛(subunit)이고, 단백질 합성에 관여하는 것으로 알려져있고, SERPINA3는 ACT(Alpha-1-antichymotrypsin)으로도 불려지며 치매(Alzheimer disease) 환자의 혈액이나 뇌척수액에서 ACT 수치가 올라간다고 보고되며[Matsubara 등, Ann. Neurol. 28: 561-567, 1990], PD에서의 ACT 유전자의 다형성(polymorphism)이 보고되었다[Yamamoto 등, Brain Res. 759: 153-155, 1997]. BCAS1(Breast Carcinoma Amplified Sequence 1)은 대부분의 유방암 세포주에서 과발현이 관찰되었고[Collins 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 95 : 8703-8708, 1998], 최근의 연구결과에 따르면 마우스 세포주에 과발현 시켰을때 세포 성장 속도에는 영향을 끼치지 못한는 것으로 보고되고 있다[Beardsley 등, Exp. Cell Res. 290: 402-413, 2003]. 이외에 결장직장암에서 이 유전자가 저발현된다고 보고되고 있다[Correa 등, Genomics 65: 299-302, 2000]. 하지만, 현재까지 PD에서는 보고된 바 없다. TUBA6(Tubulin alpha 6)는 미세소관(microtubules)의 주요 구성성분인 투불린(tubulin)의 알파 사슬(chain)의 아과(subfamily) 중의 하나이고, AQP4(Aquaporin 4)는 물-선택적인 막 채널(water-selective membrane channel)인 AQP의 아과로서, 포유류의 뇌에 많이 존재하는 단백질로서, 뇌부종(brain edema)의 형성에 관련되어 있음이 보고되고, AQP4의 세포내 위치(subcellular localization)를 저해함으로써 임박한급성(impending) 뇌부종의 발병(onset)을 지연시킬 수 있는 즉, 뇌부종의 치료제로 사용될 수 있음을 제시하고 있다[Vajda 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 270: 495-503, 2000; Manley 등, Nature Med. 6: 159-163, 2000; Vajda 등, Proc. Nat. Acad. Sci. 99: 13131-13136, 2002]. HNRPC(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C (C1/C2))는 리보뉴글레오좀(ribonucleosome)의 구성성분으로 알려져있고, PD와의 연관성은 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 새로운 파킨슨병 마커 유전자에 대해 연구한 결과, 정상 흑색질(substantia nigra) 조직과 파킨슨병 검체의 흑색질 조직에서 cDNA 라이브러리를 제작하고, 이들 라이브러리에서 임의적으로 클론을 선별하여 유전자 염기서열을 분석하고, 이들 유전자의 발굴 빈도를 바탕으로 파킨슨병 고발현 또는 저발현 유전자를 찾아내고 정량적(quantitative) RT-PCR 방법에 의해 정상 흑색질 조직과 파킨슨병 환자의 흑색질 조직 또는 파킨슨병 마우스 모델 시료에서 파킨슨병 고발현 유전자와 저발현 유전자를 확인하여 파킨슨병을 검출할 수 있는 새로운 파킨슨병 마커를 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 흑색질 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자들의 발현정도 측정을 이용한 파킨슨병 진단방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 시료의 흑색질 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자들의 발현정도 측정을 이용한 파킨슨병 진단킷트를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

본 발명은 MBP, PBP, EIF3S5, GNAS, RPS3A, BCAS1, SERPINA3, HNRPC, TUBA6 및 AQP4로 구성되는 군 중에서 선택된 파킨슨병 발현 유전자 및 이를 이용한 파킨슨병 진단킷트를 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 파킨슨병 특이적 고발현 유전자인 MBP, PBP, EIF3S5, GNAS, RPS3A 및 BCAS1로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자와, 파킨슨병 특이적 저발현 유전자인 SERPINA3, HNRPC, TUBA6 및 AQP4로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 발현 정도의 측정을 통하여 파킨슨병을 진단하는 파킨슨병 진단킷트에 관한 것이다.

본 발명의 파킨슨병 마커 유전자는 흑색질 조직에서 고발현되거나 저발현되는 유전자의 전장 및 그의 단편을 포함한다.

또한, 본 발명의 진단킷트는 파킨슨병 특이적 고발현 유전자인 MBP, PBP, EIF3S5, GNAS, RPS3A 및 BCAS1로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머와 파킨슨병 특이적 저발현 유전자인 SERPINA3, HNRPC, TUBA6 및 AQP4로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 포함한다.

또한, 본 발명의 진단킷트는 파킨슨병 특이적 고발현 유전자인 MBP, PBP, EIF3S5, GNAS, RPS3A 및 BCAS1로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 상보적인 프로브와 파킨슨병 특이적 저발현 유전자인 SERPINA3, HNRPC, TUBA6 및 AQP4로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 상보적인 프로브를 포함한다.

또한, 본 발명의 진단킷트는 파킨슨병 특이적 고발현 유전자인 MBP, PBP, EIF3S5, GNAS, RPS3A 및 BCAS1로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 인식하는 항체와 파킨슨병 특이적 저발현 유전자인 SERPINA3, HNRPC, TUBA6 및 AQP4로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 인식하는 항체를 포함한다.

또한, 상기 항체, 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있고, β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄가지변화를 측정하기 위하여 L4-PHA를 포함한다.

상기에서 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시데이즈(peroxidase), 알칼라인 포스파테이즈(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2, 2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 또는 OPD(o-Phenylenediamine), TMB(Tetramethyl Benzidine)가 사용될 수 있다.

본 발명에서 확인된 파킨슨병 마커 유전자의 서열정보는 다음 표 1에 나타낸 바와 같다.

유전자	길이	CDS(단백질 영역)	위치	GenBank Accession No.
MBP	1231	11, 571	18q23	BC008749
PBP	1507	146, 709	12q24.23	NM_002567
EIF3S5	1231	7, 1080	11p15.4	NM_003754
GNAS	1593	48, 1232	20q13.2-q13.3	NM_000516
RPS3A	925	64, 858	4q31.2-q31.3	NM_182777
BCAS1	2813	118,1872	20q13.2-q13.3	NM_003657
SERPINA3	1616	67, 1338	14q32.1	NM_001085
HNRPC	1774	192, 1103	14q11.2	NM_031314
TUBA6	1582	101, 1450	12q12-q14	NM_032704
AQP4	5216	64, 1035	18q11.2-q12.1	NM_001650

본 발명에서는 1종의 정상 흑색질(substantia nigra) 조직과 1종의 파킨슨병 검체의 흑색질 조직을 사용하여 총 2종의 cDNA 라이브러리를 제조하고, 이로부터 약 3,895개의 EST 염기 배열을 결정하고 정상 흑색질 조직과 파킨슨병 검체의 흑색질 조직 시료에서에서 각 유전자의 발굴 빈도를 분석하여, 파킨슨병 흑색질 시료에서 발굴 빈도가 높은 5종의 파킨슨병 고발현 유전자(MBP, PBP, EIF3S5, GNAS, RPS3A)와 발굴 빈도가 낮은 5종의 파킨슨병 저발현 유전자(SERPINA3, HNRPC, TUBA6, AQP4, BCAS1)를 각각 선별하여 파킨슨병 마커 유전자를 찾아내었다.

유전자 발굴빈도 분석에 사용된 파킨슨병 검체의 흑색질 시료 및 정상 흑색질 시료에서 본 발명의 5종의 파킨슨병 고발현 유전자와 5종의 파킨슨병 저발현 유전자의 발현량을 정량적(quantitative) RT-PCR 방법에 의해 비교한 결과, 5종의 파킨슨병 고발현 유전자는 파킨슨병 검체의 흑색질 조직 시료에서 고발현됨이 관찰되었고, 5종의 파킨슨병 저발현 유전자 중에서 한 종(BCAS1)을 제외한 나머지 4종은 파킨슨병 검체의 흑색질 조직 시료에서 저발현됨이 관찰되었고, BCAS1 유전자는 파킨슨병 검체의 흑색질 조직 시료에서 고발현이 관찰되어 최종적으로 파킨슨병 고발현 유전자로서 BCAS1을 포함한 6종 유전자와 저발현 유전자로서 4종의 유전자를 선별하였다.

또한, 선별한 파킨슨병 후보 유전자를 파킨슨병 마우스 모델에서도 확인하기 위해 파킨슨병 유발물질인 MPTP를 5㎎/㎏, 10㎎/㎏, 25㎎/㎏ 처리한 3종류의 파킨슨병 마우스 모델의 실험군과 PBS(Phosphate Buffer Saline)를 처리한 1종류의 대조군의 흑색질 조직 시료를 사용하여 6종의 파킨슨병 고발현 유전자와 4종의 파킨슨병 저발현 유전자의 발현량을 비교한 결과, 6종의 파킨슨병 고발현 유전자는 대조군 시료에 비해 대부분의 실험군 시료에서 고발현됨이 확인되었고, 4종의 파킨슨병 저발현 유전자는 대부분의 실험군 시료에서 저발현됨이 확인되어 선별된 파킨슨병 마커 유전자들의 유용성이 확인되었다.

따라서, 파킨슨병 특이적 유전자인 MBP, PBP, EIF3S5, GNAS, RPS3A, BCAS1, SERPINA3, HNRPC, TUBA6 및 AQP4로의 유전자의 발현 정도를 측정함으로써 파킨슨병을 진단할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 파킨슨병 특이적 유전자들의 발현 정도를 측정하는 방법을 상세하게 설명하면 다음과 같다: 즉,

(a) 파킨슨병 검체의 흑색질 조직에서 MBP, PBP, EIF3S5, GNAS, RPS3A 및 BCAS1로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 파킨슨병 고발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계,

(b) 정상 흑색질 조직에서 MBP, PBP, EIF3S5, GNAS, RPS3A 및 BCAS1로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 파킨슨병 고발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계,

(c) 파킨슨병 검체의 흑색질 조직에서 SERPINA3, HNRPC, TUBA6 및 AQP4로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 파킨슨병 저발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계,

(d) 정상 흑색질 조직에서 SERPINA3, HNRPC, TUBA6 및 AQP4로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 파킨슨병 저발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및

상기 (a)에 의해 얻어진 측정값을 상기 (b)에서 얻어진 측정값과 비교하고, 상기 (c)에 의해 얻어진 측정값을 상기 (d)에서 얻어진 측정값과 비교하여 파킨슨병 여부를 판단하는 단계를 포함한다.

본 발명의 10종의 마커 유전자의 발현양은 마커 유전자 또는 그 단편에 대하여 상보적인 염기 서열을 갖는 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 이용한 공지의 방법을 통하여 측정할 수 있다. 예를 들면, RT-PCR 방법으로 측정할 수 있다. 이러한 프라이머는 10종 마커 유전자의 DNA 영역 중에서 단백질을 코딩하는 DNA 영역의 일부 또는 전부의 배열이 함유되고 적어도 15 bp 길이의 DNA이어야 한다. 예를 들어, 표 5에 기재된 프라이머들이 사용될 수 있다. 본 발명에서 상보적이란 적어도 15개의 연속 염기배열에서 완전히 상보적인 배열인 경우로 제한하지 않고 염기 서열상에서 70%, 바람직하게는 80% 이상의 상동성이 있으면 된다.

또한, 본 발명의 10종의 마커 유전자의 발현량은 마커 유전자 또는 그 단편을 프로브로 사용한 공지의 혼성화(하이브리다이제이션) 반응을 통하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 노던 하이브리다이제이션("Molecular Cloning - A Laboratory Manual "Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al., 1982, section 7.37-7.52), 인시츄 하이브리다이제이션[Jacquemier 등, Bull Cancer 90: 31-8, 2003] 또는 마이크로어레이[Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3: 185-200, 2003] 등의 방법으로 측정할 수 있다. 프로브는 10종 유전자의 염기 서열을 함유한 통상 200 ∼ 1000 bp이며, 바람직하게는 400 ∼ 800 bp의 길이를 가진다. 염기 서열은 10종 유전자의 염기 서열과 70% 이상의 유사성을 가지면 된다. 본 발명의 마커 유전자의 프로브는 상기에서 제조된 10종의 마커 유전자의 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 이용한 유전자 증폭법(PCR) 등의 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다.

또한, 상기 10종의 파킨슨병 마커 유전자의 발현량은 각 유전자에 의하여 코드되는 단백질의 양을 측정함으로써 측정할 수 있다. 상기 방법에서 단백질은 파킨슨병마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 통상적인 ELISA 및 면역침강법 등에 의해 정량화될 수 있다.

본 발명의 6종의 파킨슨병 고발현 유전자와 4종의 파킨슨병 저발현 유전자에 대한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 10종의 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩타이드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩타이드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클론날 항체[Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.12-11.13], 모노클론날 항체[Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.4-11.11] 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체(Methods in Enzymology 203, 99-121, 1991)등의 특수항체도 포함된다.

본 발명의 10종의 파킨슨병 마커 유전자 또는 단백질은 단독으로 또는 조합하여 파킨슨병 진단킷트에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 파킨슨병 진단킷트는 상기 파킨슨병 특이적 마커 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머 또는 프로브 이외에 RNA 또는 폴리 (A)+ RNA 분리 시약을 더 포함할 수 있으며, 마이크로어레이를 통하여 발현양을 조사하는 경우에는 10종 유전자의 고형지지체를 포함한다.

또한, 10종의 파킨슨병 마커 유전자는 파킨슨병 관련 유전자일 가능성이 높으므로, 이러한 표적 유전자가 코딩하는 단백질에 결합하는 작은 분자의 화합물은 표적 단백질을 저해 또는 촉진하는 화합물의 후보가 될 수 있으며 이는 파킨슨병 치료제 등의 의약품으로 사용할 수 있다.

이런 화합물을 스크리닝하는 방법으로는, 상기 10종의 파킨슨병 마커 유전자가 코딩하는 단백질을 어피니티칼럼에 고정시키고 이를 피검시료와 접촉시켜 정제하는 방법[Pandya 등, Virus Res 87: 135-143, 2002], 투하이브리드법을 이용하는 방법[Fields, S and Song, O., Nature 340: 245 -246, 1989], 웨스턴 브로팅법["Molecular Cloning - A Laboratory Manual "Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al. (1982) section 18.30-18.74], 하이스루풋스크리닝법 [Aviezer 등, J Biomol Screen 6: 171-7, 2001] 등 다수의 공지의 방법을 사용할 수 있다. 스크리닝에 사용하는 피검시료로서는 세포 추출액, 유전자라이브러리의 발현산물, 합성저분자 화합물, 합성펩타이드, 천연 화합물 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: EST 발굴 빈도에 의해 파킨슨병 고발현 유전자와 저발현 유전자의 선별

본 발명자는 파킨슨병에서 발현되는 유전자를 분석하기 위하여, Ambion 사에서 제공하고 있는 파킨슨병 환자의 흑색질(Substantia nigra) 조직 총 RNA와 정상인의 흑색질 조직 총 RNA로부터 각각의 cDNA 라이브러리를 구축하고, 이로부터 무작위로 클론을 선별, 분석함으로써 EST 발굴 빈도를 기초로 한 파킨슨병 고발현 유전자와 저발현 유전자를 선별하고자 하였다.

1) cDNA 라이브러리의 제조

Ambion 사에서 구매한 파킨슨병 환자의 흑색질 조직에 대한 총 RNA(Cat# 6288, Ambion, 미국)와 정상인의 흑색질 조직에 대한 총 RNA(Cat#6866, Ambion, 미국) 각 15 ㎍을 BAP 효소 반응액[100Mm Tris-Hcl(pH 7.0), RNA 2mM DTT, 40U Rnasin(promega사, 미국)]에서 0.6 U의 BAP(Bacterial alkaline Phosphatase)[TakaRa사, 일본] 효소로 처리하고, 이어 TAP(Tabbaco acid pyrophosphatase)[Waco사, 일본] 효소 반응액[50 mM sodium acetate(pH 5.5), 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 20U Rnasin(promega사)]에서 30 U의 TAP 효소를 반응시켰다. 그 후, 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 5 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 0.5 mM ATP, 25% PEG, 40U Rnasin, 올리고리보뉴클레오티드 18 pmole(5'-agcaucgagucggccuuguu ggcccuacugg-3', 서열 1), 80U RNA 리가제[TakaRa사]의 반응을 수행하여 합성한 올리고머를 인산기를 가지는 미분해 mRNA에만 첨가되도록 반응시켰다.

이상의 반응을 처리한 총 RNA로부터 올리고텍스(oligotex) mRNA 정제킷트 [QIAGEN사, 독일]를 사용하여 mRNA를 분리하고, dT17을 함유한 올리고머 (5'-gcggctgaagacggcctatgtggccttttttttttttttttt-3', 서열 2)를 프라이머로 사용하여 1st cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 XL PCR 킷트[Perkin Elmer사, 미국]를 사용하여 합성된 DNA 삽입체의 5'-말단의 프라이머(5'-agcatcgagtcggccttgttg-3', 서열 3)과 3'-말단의 프라이머(5'-gcggctgaag acggcctatgt-3', 서열 4)를 함유한 PCR 반응을 수행하여 소량 증폭시켰다. PCR 산물을 SfiI의 효소로 처리한 후 아가로스 젤 전기영동을 하여 1.3 kb 이상의 cDNA 단편을 분리하였다. 분리된 cDNA 단편은 TaKaRa 연결 키트를 이용하여 DraIII 효소로 처리한 pCNS-D2 벡터에 연결시킨 후, 전기침공법(electroporation)에 의해 대장균 Top10F'[Invitrogen사, 미국] 균주에 형질전환시켜 cDNA 라이브러리를 제조하였다.

본 방법에 의해 파킨슨병 환자와 정상인의 흑색질 cDNA 라이브러리를 각각 1종씩 제조하였다[표 2].

2) cDNA 염기서열의 결정 및 데이터 분석

제작한 cDNA 라이브러리를 앰피실린(100 ㎍/㎖)이 함유된 LB 한천배지에 도말하여 다수의 cDNA 클론을 배양하였다. 얻어진 클론들의 염기서열을 분석하기 위하여 MWG 96웰 플라스미드 프렙 시스템(plasmid prep system)으로 플라스미드 DNA를 분리하고, 자동화염기서열 결정기인 ABI 3700(Applied Biosystems사, 미국)으로 염기서열분석을 수행하였다.

결정된 DNA 데이터의 유사성 검색은 BLASTN을 사용하여 유니진(UniGene) 데이터베이스(Hs.seq.all, build#164)에서 수행하였다.

2종의 cDNA 라이브러리에서 약 3,895개의 EST 염기 배열을 결정하고 이의 분석을 유니진 데이터베이스에서 수행한 결과, 총 2,188종의 유전자가 발굴되었다. 각 라이브러리별 결정된 EST 수와 발굴된 유전자의 종류는 상기 표 2에 나타낸 바와 같다.

3) 유전자 발굴 빈도 분석

정상인의 흑색질 cDNA 라이브러리를 대조군으로 파킨슨병 환자의 흑색질 cDNA 라이브러리에 발현되는 각 유전자의 발현 빈도를 조사하였다. 각 유전자의 발굴 빈도는 각 시료에서 발굴된 특정 유전자의 수를 발굴된 총 유전자 수의 비로 나타내었다. 또한, 각 라이브러리에서 각 유전자의 발굴 빈도는 각 라이브러리에서 발굴된 특정 유전자의 수를 발굴된 총 유전자의 수의 비로 계산하고 이를 색깔로서 나타내었다.

상기와 같은 분석에 의해 파킨슨병 시료에서 발굴 빈도가 증가하는 5종의 고발현 유전자와 발굴 빈도가 감소하는 저발현 유전자 5종이 각각 선별되었다[도 1].

실시예 2: RT-PCR 반응에 의한 선별된 표적 유전자의 발현량 분석

정상 흑색질 조직 시료와 파킨슨병 흑색질 시료에서 유전자 발굴 빈도에 의해 선별된 5종의 파킨슨병 고발현 유전자와 5종의 파킨슨병 저발현 유전자의 발현량을 RT-PCR 방법을 통해 정량적으로 분석하였다.

1) 역전사 효소 반응

상기 실시예 1에서 사용한 총 2종의 총 RNA 각각 5 ㎍을 사용하여 다음 표 3 같은 역전사 반응액에서 42 ℃, 60분간 반응시켜 총 2종의 1st cDNA를 합성하였다. 그 후, 70 ℃ 가열 블럭(heating block)에서 15분간 반응함으로써 cDNA 합성을 종료시켰다.

poly dT(12-18) 프라이머 (0.4 ㎍/㎕)	1 ㎕
5X first-strand buffer	4 ㎕
10mM dNTP 혼합물	1 ㎕
0.1M DTT	2 ㎕
RNaseOUT (40 U/㎕)	1 ㎕
역전사효소 (200 U/㎕)	1 ㎕
총 RNA (5 ㎍)	X ㎕
증류수	(10-X) ㎕
총부피	20 ㎕

2) PCR을 이용한 cDNA의 증폭 및 발현량 확인

① PCR을 이용한 cDNA의 증폭

상기 1)에서 얻은 cDNA를 1/50 희석한 후에 각 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 함유한 다음 표 4의 PCR 반응액에서 증폭시켰다. 이때, PCR 반응은 94 ℃ 1분, 57 ℃ 1분, 72 ℃ 1분으로 25~30회씩 수행하였다.

5종 파킨슨병 고발현 유전자인 MBP, PBP, EIF3S5, GNAS 및 RPS3A와 5종의 파킨슨병 저발현 유전자 SERPINA3, HNRPC, TUBA6, AQP4 및 BCAS1의 프라이머는 단백질 코딩 영역 내부에서 디자인하였고, 각 프라이머의 길이는 18 ∼ 20 bp, GC 함량은 50 ∼ 70% 정도이다. 그리고, 유전자 발현량을 상대적으로 정량하기 위해서 표준유전자로 알려진 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자도 같은 방법으로 PCR 반응을 수행하였다. GAPDH 프라이머는 실시예 3에 나오는 마우스 모델에서도 사용하기위해서 인간과 마우스 공통적인 프라이머를 사용하였다[정방향 프라이머: 5'-accatcttccaggagcgaga-3'(서열 5), 역방향 프라이머: 5'-agtgatggcatggactgtgg-3'(서열 6)]. 다음 표 4는 PCR 반응액의 조성을 나타낸다.

cDNA(1/50)희석액	2 ㎕
5×PCR 반응 mix[제노텍 사]	3 ㎕
정방향 프라이머 (10 pmole/㎕)	1 ㎕
역방향 프라이머 (10 pmole/㎕)	1 ㎕
증류수	8 ㎕
총부피	15 ㎕

PCR에 사용한 각 파킨슨병 마커 유전자들의 인간에서의 프라이머

유전자	정방향 프라이머(5'-> 3')	역방향 프라이머(5'-> 3')
MBP	ggctctggcaaggactca (서열 7)	agccatgggtgatccaga (서열 8)
PBP	cgctgcatgtcacctacg (서열 9)	ggcctgtcctgctcgtaa (서열 10)
EIF3S5	gctacgggccatgacatc (서열 11)	tgcccctcctacttgctg (서열 12)
GNAS	agaggcgattgaaaccattg (서열 13)	tccacctggaacttggtctc (서열 14)
RPS3A	ggtctcaagggtcgtgtgtt (서열 15)	tcatcttcttccggatttgg (서열 16)
SERPINA3	cgtggtggagctgaagtaca (서열 17)	cacagccttatggaccacct (서열 18)
HNRPC	ggctgtagtgccctcgaa (서열 19)	taggtccccctcctcagc (서열 20)
TUBA6	gcactctgattgtgccttca (서열 21)	ctcaaagcaagcattggtga (서열 22)
AQP4	ttgctttggactcagcattg (서열 23)	tgacatcagtccgtttggaa (서열 24)
BCAS1	gcttctcccacctgagacag (서열 25)	gcagtctccagtccttctgg (서열 26)

② PCR을 이용한 발현량 확인

PCR 반응에 의해 증폭된 PCR 산물을 확인하기 위하여, PCR 반응액을 2%의 아가로스 젤에 100 V로 30분간 전기영동한 후, PCR 산물을 Frog^TM 기계(젤 이미지 어낼리시스 시스템)[Core Bio 사, 한국]를 이용하여 젤 사진을 촬영하였다. 최종적으로 얻은 젤 밴드 이미지 파일(.tif)을 ToltalLab v1.0 프로그램[NonLinear Dynamix 사, 영국]을 이용하여 정량화하였다.

도 2는 고발현 유전자를, 도 3은 저발현 유전자를 확인한 결과이며 X축은 각종 유전자를 나타낸 것이고, Y축은 시료에서 표적 유전자의 발현량을 나타낸 것으로, 각 유전자의 발현량은 먼저 시료에서 발현되는 표준유전자인 GAPDH의 발현량으로 나눈 후, 파킨슨병 흑색질에서의 값을 정상 흑색질에서의 값으로 나눈 후에 Log2값을 취해서 얻었다. 5종의 파킨슨병 고발현 유전자는 파킨슨병 환자의 흑색질 조직 시료에서 고발현됨이 관찰되었고, 5종의 파킨슨병 저발현 유전자는 BCAS1을 제외한 나머지 4종의 유전자가 파킨슨병 환자의 흑색질 조직 시료에서 저발현됨이 관찰되었고, BCAS1 유전자는 파킨슨병 환자의 흑색질 조직시료에서 고발현이 관찰되었다. 결론적으로, 6종의 파킨슨병 고발현 유전자인 MBP, PBP, EIF3S5, GNAS, RPS3A 및 BCAS1은 파킨슨병 발병 마커로서 유용함이 확인되었고 4종의 파킨슨병 저발현 유전자인 SERPINA3, HNRPC, TUBA6 및 AQP4는 파킨슨병 억제 마커로서의 가능성이 확인되었다.

실시예 3: 파킨슨병 마우스 모델에서 파킨슨병 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현량 확인

본 실험에서는 파킨슨병을 유도시키는 물질로 알려진 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)를 마우스에 투여하여 제작한 3종류의 파킨슨병 마우스 모델의 흑색질 조직에서 6종의 파킨슨병 고발현 유전자와 4종의 저발현 유전자의 발현량을 RT-PCR법을 사용하여 수행하였다.

1) 파킨슨병 마우스 모델 제작

실험에 사용한 마우스는 10 주령된 B6 마우스 숫놈으로 대조군과 실험군별로 3마리씩 사용하였다. 대조군에는 200 ㎕의 PBS(Phosphate Buffer Saline)를 투여하고, 실험군-1에는 마우스 몸무게 1 ㎏당 5 ㎎의 MPTP(sigma, 미국)를 녹인 200㎕의 PBS를 투여하고, 실험군-2에는 마우스 몸무게 1 ㎏당 10 ㎎의 MPTP를 녹인 200 ㎕의 PBS를 투여하고, 실험군-3에는 마우스 몸무게 1 ㎏당 25 ㎎의 MPTP를 녹인 200 ㎕의 PBS를 투여하여 3종류의 파킨슨병 마우스 모델을 제작하였다. 투여는 하루에 한번씩 총 5일 동안 마우스 복강에 투여한 후 2일 후에 마우스를 희생하여 마우스 뇌를 슬라이스하고 냉각된 현미경하에서 3종류의 파킨슨병 마우스 모델 실험군과 1종류의 정상 마우스 모델 대조군으로부터 총 4종류의 흑색질 조직을 얻었다.

2) 총 RNA 분리 및 역전사 효소 반응

4종류의 흑색질 조직에서부터 QIAGEN 킷트(RNeasy midi 킷트: cat#75144)를 사용하여 총 RNA을 분리하였다. 우선, 마우스 조직을 액체질소를 이용하여 잘게 부순 후, 20 ㎕의 베타 머캅토에탄올(β-Mercaptoethanol)을 첨가한 2 ㎖의 키트 내 분해 완충액에 용해시켰다. 여기에 2 ㎖의 70% EtOH을 첨가하여 잘 섞은 후, 3000 g에서 5분간 원심분리하여 총 RNA를 막에 부착시켰다. 두 차례의 세척 과정을 수행한 후, 150 ㎕의 RNase가 제거된 물을 첨가하여 총 RNA를 용출, 분리하였다. 총 RNA 각각 5 ㎍을 사용하여 표 6 같은 역전사 반응액에서 42 ℃, 60분간 반응시켜 총 4종의 1st cDNA를 합성하였다. 그 후, 70 ℃ 가열 블럭(heating block)에서 15분간 반응함으로써 cDNA 합성을 종료시켰다.

poly dT(12-18) 프라이머 (0.4 ㎍/㎕)	2.5 ㎕
5X first-strand buffer	10 ㎕
10mM dNTP 혼합물	2.5 ㎕
0.1M DTT	5㎕
RNaseOUT (40 U/㎕)	2.5 ㎕
역전사효소 (200 U/㎕)	2.5 ㎕
총 RNA (5 ㎍)	X ㎕
증류수	(50-X) ㎕
총부피	50 ㎕

3) 파킨슨병 마우스 모델에서 파킨슨병 마커 유전자인 티로신 가수분해 효소 (Tyrosine hydrolase)의 전사체 발현량 감소 확인

제작한 마우스 모델이 파킨슨병 마우스 모델로서 적합한가를 검토하기 위해 현재 파킨슨병 마커 유전자로 알려진 티로신 가수분해 효소(TH) 유전자의 전사량의 확인을 정량적(quantitative) RT-PCR 방법에 의해 확인하였다. 상기 실시예 3-2)에서 합성한 cDNA를 1/20 희석하여 2 ㎕씩 주형으로 이용하여 5 X PCR 반응액[제노텍사, 한국] 3 ㎕와 각각 1 ㎕의 두 종류의 마우스 TH 유전자의 프라이머[10 pmole/㎕: 정방향 프라이머: 5'-gcttcagaagagccgtctca-3'(서열 27), 역방향 프라이머: 5'-agtggtggattttggcttca-3'(서열 28)], 8 ㎕의 증류수를 함유한 총 15 ㎕의 PCR 반응액을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 반응 조건은 94 ℃ 30초, 57 ℃ 1분, 72 ℃ 1분을 30회 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 확인하기 위하여, 실시예 2-2)-②와 같이 정량화하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다. X축은 각 시료(실험군-1, -2, -3)를 나타낸 것이고, Y축은 시료에서 TH 유전자의 발현량을 나타낸 것으로, TH 유전자의 발현량은 먼저 시료에서 발현되는 표준유전자인 GAPDH의 발현량으로 나눈 후, 각 실험군(실험군-1, 2, 3)에서의 값을 대조군의 값으로 나눈 후에 Log2값을 취해서 얻었다. 실험군-1, 2, 3에서 파킨슨병 마커 유전자인 TH 유전자의 발현량이 감소되는 것을 확인함으로써, 제작한 마우스가 파킨슨병 모델 마우스로서 사용 가능함이 확인되었다.

4) 제작한 파킨슨병 마우스 모델에서 파킨슨병 마커 유전자인 티로신 가수분해 효소 (Tyrosine hydrolase)의 단백질량 감소 확인

제작한 마우스 모델이 파킨슨병 마우스 모델로서 적합한가를 검토하기 위해 현재 파킨슨병 마커 유전자로 알려진 티로신 가수분해 효소(TH) 유전자의 단백질량의 감소를 조사하였다. 상기 실시예 3-1)에서 제작한 마우스 모델의 시료 중 대조군과 실험군-3으로부터 얻은 뇌조직을 정수리점(bregma)에서 뒤로 2.92 ~ 3.8 ㎜ 지점을 3㎛ 두께로 전두 절단(coronal section)방법으로 절단한 후, 항-TH 항체(Anti-TH antibody, DAKO사, 덴마크)로 아래와 같이 면역조직화학 염색(Immunohistochemistry)법을 실시하였다. 상기 절편을 0.1 M 트리스 완충용액(PH 7.4)에 들어있는 3% 과산화수소(H₂O₂)로 처리하여 내인성 퍼옥시데이즈(endogenous peroxidase)를 제거한 후 단백질 차단액(Protein Block Solution, DAKO사)으로 20분 동안 처리한 후 1차 항체인 항-TH-항체를 0.1 M 트리스 완충용액(0.1 M TBS, 0.01% Tween 20)으로 2,000배 희석하여 30분 동안 상온에서 처리하였다. 반응하지 않은 항체를 0.1 M 트리스 완충용액으로 완전히 세척하여 제거한 후 2차 항체인 EnVision 항-토끼 항체(anti-rabbit antibody, DAKO사)로 30분 반응 하였다. 0.1 M 트리스 완충용액으로 세척으로 반응하지 않은 항체를 제거한 후, 항체에 결합되어 있는 퍼옥시데이즈는 3,3'-디아미노벤자딘(3,3'-diaminobenzidine, DAB) 크로모겐(chromogen) 기질 용액(DAKO사)을 처리하여 가시화하였다. 최소의 백그라운드(background) 염색을 가진 면역표지(immunolabeling)의 정도를 위한 최적의 반응시간을 결정하기 위해서 현미경하에서 DAB 반응을 감시하였다. 0.1 M 트리스 완충용액으로 여러 차례 세척하여 반응을 종결시킨 후 에탄올로 탈수하고, 자일렌(xylene)으로 탈지한 후에 광학 현미경으로 확인하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5-(1)은 대조군으로서 200 ㎕의 PBS (Phosphate Buffer Saline)를 하루에 한번씩 총 5일 동안 마우스 복강에 투여한 것이고, 도 5-(2)는 실험군-3으로서 마우스 몸무게 1 ㎏당 25 ㎎의 MPTP를 녹인 200 ㎕의 PBS를 하루에 한번씩 총 5일 동안 마우스 복강에 투여한 것의 사진이다. 도면에서와 같이, 파킨슨 표적유전자인 티로신 가수분해 효소(TH)의 단백질 발현량이 대조군에 비해서 실험군-3에서 현저히 감소됨을 확인하였다.

5) 파킨슨병 마우스 모델에서 파킨슨병 후보 유전자의 발현량 확인

① 정량적 PCR을 이용한 cDNA의 증폭

상기 2)에서 얻은 cDNA를 1/10 희석한 후에 각 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 함유한 다음 표 7의 PCR 반응액에서 증폭시켰다. 이때, PCR 반응은 94 ℃ 1분, 57 ℃ 1분, 72 ℃ 1분으로 25 ~ 30회씩 수행하였다.

마우스에서 6종의 파킨슨병 고발현 유전자인 MBP, PBP, EIF3S5, GNAS, RPS3A 및 BCAS1과 4종의 파킨슨병 저발현 유전자 SERPINA3, HNRPC, TUBA6 및 AQP4의 프라이머는 단백질 코딩 영역 내부에서 디자인하였고, 각 프라이머의 길이는 20 bp, GC 함량은 50 ∼ 60% 정도이다. 그리고, 상기 실시예 2-2)-①에서와 같이 유전자 발현량을 상대적으로 정량하기 위해서 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 를 표준유전자로 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 다음 표 7은 PCR 반응액의 조성을 나타낸다.

cDNA(1/10)희석액	2 ㎕
5×PCR 반응 mix[제노텍 사]	3 ㎕
정방향 프라이머 (10pmole/㎕)	1 ㎕
역방향 프라이머 (10pmole/㎕)	1 ㎕
증류수	8 ㎕
총부피	15 ㎕

PCR에 사용한 각 파킨슨병 마커 유전자들의 마우스에서의 프라이머

유전자	정방향 프라이머(5'-> 3')	역방향 프라이머(5'-> 3')
MBP	acagcgatccaagtacctgg (서열 29)	ctgtctcttcctcccttccc (서열 30)
PBP	ggatcccaaattcagggagt (서열 31)	acatagtcatcccactcggc (서열 32)
EIF3S5	gaagacgtgttttagcccca (서열 33)	tttctcgttgagggcaatct (서열 34)
GNAS	aaggccactaaagtgcagga (서열 35)	tggtcacttggcacgtagtc (서열 36)
RPS3A	tcaagggtcgtgtgtttgaa (서열 37)	cacctctcgggtcatgattt (서열 38)
BCAS1	cacgacttcagccaatctca (서열 39)	tcaggctgggtctcttcact (서열 40)
SERPINA3	ggaagccagcttacaaccag (서열 41)	ttatcaggaaaggccgattg (서열 42)
HNRPC	ggtccatgaattcccgtgta (서열 43)	ggtgttctggtactgacccg (서열 44)
TUBA6	gaccaagcgtaccatccagt (서열 45)	actatctgccccaacctcct (서열 46)
AQP4	acggttcatggaaacctcac (서열 47)	tgagctccacatcaggacag (서열 48)

② PCR을 이용한 발현량 확인

PCR 반응에 의해 증폭된 PCR 산물을 확인하기 위하여, 상기 실시예 2-2)-②에서와 같이 PCR 반응액을 2%의 아가로스 젤에 100 V로 30분간 전기영동한 후 정량화하였다.

도 6은 고발현 유전자를, 도 7은 저발현 유전자를 확인한 결과이며 X축은 각 시료(실험군-1, -2, -3)를 나타낸 것이고, Y축은 시료에서 표적 유전자들의 발현량을 나타낸 것으로, 각 유전자의 발현량은 먼저 시료에서 발현되는 표준유전자인 GAPDH의 발현량으로 나눈 후, 각 실험군(실험군-1, -2, -3)에서의 값을 대조군의 값으로 나눈 후에 Log2값을 취해서 얻었다. 파킨슨병 흑색질에서 발굴 빈도가 높은 고발현 유전자의 RT-PCR 산물량은 인간에서와 같이 파킨슨병 마우스 모델인 실험군 시료에서 높았으며, 파킨슨병 흑색질에서 발굴 빈도가 낮은 저발현 유전자의 RT-PCR 산물량은 대조군에 비해 실험군 시료에서 전체적으로 낮게 나타났다. 즉, 인간 시료에서의 결과와 같이 파킨슨병 마우스 모델에서도 6종의 파킨슨병 후보 유전자인 MBP, PBP, EIF3S5, GNAS, RPS3A 및 BCAS1은 파킨슨병 발병 마커로서의 유용함이 확인되었고 4종의 파킨슨병 저발현 유전자 SERPINA3, HNRPC, TUBA6 및 AQP4는 파킨슨병 억제 마커로 사용 가능함이 확인되었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 파킨슨병 진단에 유용한 마커로 인간의 파킨슨병 흑색질 조직 및 파킨슨병 마우스 모델에서 6종의 파킨슨병 고발현 유전자와 4종의 파킨슨병 저발현 유전자가 제공되며, 상기 파킨슨병 마커 유전자들은 환자 조직 및 마우스 모델에서 신속하고 민감하게 정량하여 파킨슨병을 효과적으로 진단하는데 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

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파킨슨병 특이적 고발현 유전자인 MBP, PBP, EIF3S5, GNAS, RPS3A 및 BCAS1로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 상보적인 염기서열을 갖는 서열번호 7 내지 16 및 서열번호 25와 26으로 표시되는 센스 및 안티센스 프라이머 쌍과, 파킨슨병 특이적 저발현 유전자인 SERPINA3, HNRPC, TUBA6 및 AQP4로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 상보적인 염기서열을 갖는 서열번호 17 내지 24로 표시되는 센스 및 안티센스 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 파킨슨병 진단킷트.
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파킨슨병 특이적 고발현 유전자인 MBP(BC008749), PBP(NM_002567), EIF3S5(NM_003754), GNAS(NM_000516), RPS3A(NM_182777) 및 BCAS1(NM_003657)로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질과 파킨슨병 특이적 저발현 유전자인 SERPINA3(NM_001085), HNRPC(NM_031314), TUBA6(NM_032704) 및 AQP4(NM_001650)로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질에 시험 화합물을 결합시키고, 시험 화합물이 상기 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 파킨슨병 억제제의 스크리닝 방법.