KR20070116555A - 간질 특이적 유전자들의 발현 정도 측정을 통한 간질 진단키트 - Google Patents

간질 특이적 유전자들의 발현 정도 측정을 통한 간질 진단키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간질 특이적 유전자인 GAPDH, TSC22, TTR, DEPP, SPP1, ACTG2, ID2, HNLF, CPE, MBP, LDHA, HSPA9B, A2BP1, PPP2CA, ATP6VE1, MAP2, MGC8685, HLA-C, ARF1, VSNL1의 발현 정도 측정을 통하여 간질을 진단하는 간질 진단키트에 관한 것으로, 간질의 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
간질, 해마, 마커 유전자, GAPDH, TSC22, TTR, DEPP, SPP1, ACTG2, ID2, HNLF, CPE, MBP, LDHA, HSPA9B, A2BP1, PPP2CA, ATP6VE1, MAP2, MGC8685, HLA-C, ARF1, VSNL1

Description

간질 특이적 유전자들의 발현 정도 측정을 통한 간질 진단 키트 {DETECTION KIT FOR EPILEPSY BY MEASURING THE EXPRESSION OF EPILEPSY MARKER GENES}
도 1은 유전자 발굴 빈도를 분석한 것이고,
도 2는 각종 시료에서 간질 특이 저발현 유전자의 발현 정도를 경쟁적 (competitive) RT-PCR 방법을 수행하여 나타낸 것이다. (a)부터 (n)은 저발현 유전자를 나타낸다. X축은 각종 시료를 나타낸 것으로, N2, N3, N4, N5, N6는 정상 해마조직, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8은 간질 환자의 해마 조직이다. Y축은 각종 시료에서 표적 유전자의 발현량을 나타낸 것으로, 저발현 유전자의 발현량은 각종 시료에서 발현되는 베타-엑틴의 발현량으로 나눈값에 Log2를 취한 값이다.
도 3은 각종 시료에서 간질 특이 저발현 유전자의 발현 정도를 경쟁적 (competitive) RT-PCR 방법을 수행하여 나타낸 것이다. (o)부터 (t)는 저발현 유전자를 나타낸다. X축은 각종 시료를 나타낸 것으로, N2, N3, N4, N5, N6는 정상 해마조직, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8은 간질 환자의 해마 조직이다. Y축은 각종 시료에서 표적 유전자의 발현량을 나타낸 것으로, 저발현 유전자의 발현량은 각종 시료에서 발현되는 베타-엑틴의 발현량으로 나눈값에 Log2를 취한 값이다.
본 발명은 간질 마커 유전자의 발현 정도 측정을 통하여 간질을 진단하는 진단키트에 관한 것이다.
통계에 의하면 간질은 세계적으로 전 인구의 약 0.5%~2%가 간질을 앓고 있는 것으로 보고되고 있다. 또한 매년 10만명당 45명 정도의 새로운 환자가 발생한다고 한다. 또한 우리나라에는 약 30~40만명의 간질환자가 있는 것으로 추정되며 매년 2만명 정도의 새로운 간질환자가 발생한다고 보고되고 있다. 간질과 관련된 유전자는 많이 보고되지 않으며, 최근 분자적 생물학적 분석법에 의해 간질에서 GABA (Avoli 등, prog . Neurobiol . 77: 166-200, 2005) 유전자의 많은 유전적 변이가 보고되고 있다. 그리고 ITM2, GABARAP, NELF, CD9 (Arai 등, Brain Res . 118: 147-151, 2003) 같은 유전자들이 간질 모델동물에서 저발현된다고 보고되고 있다. 그러나 이러한 유전자만으로 간질을 진단하기에는 불충분하다.
인간 게놈 프로젝트의 한 연구 분야로 수행되어 온 “EST (expressed sequence tag) 수집”은 특정 조직이나 세포주에서 cDNA 라이브러리를 제조하고 여기에서 임의적으로 선별한 cDNA 클론들의 염기서열을 분석함으로써 특정 조직에서 발현되는 유전자를 수집하는 프로젝트이다. 이러한 EST 수집 방법을 통하여 새로운 유전자의 발굴 (Adams 등, Science 252: 1651-1656, 1991;Adams 등, Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995; Hillier 등, Genome Res . 6: 807-828, 1996; Marra 등, Nat . Genet. 21:191-194,1999), 특정 조직에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석 (Okubo 등, Nat . Genet . 2: 173-179, 1992; Adams 등, Science 252: 1651-1656, 1991; Adams 등, Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995; Liew 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91: 10645-10649, 1994; Mao 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95: 8175-8180, 1998; Ryo 등, Nucleic Acids Res . 26: 2586-2592, 1998; Sterky 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 95: 13330-13335, 1998)이 가능하다고 보고되고 있다. 따라서, 특정 세포내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 간질과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 간질 진행에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 간질의 진단이 가능하게 될 것이다.
본 발명에서는 20종의 간질 특이 저발현 유전자가 발굴되었으며, 이들은 간질과의 관련성이 전혀 보고되지 않은 것으로 현재 이들 유전자에 대해 알려진 내용은 다음과 같다. TSC22 (transforming growth factor beta-stimulated protein TSC-22)는 전사인자 이며, TTR (transthyretin)는 세포 구조 형성에 관여하며, ACTG2 (actin, gamma 2, smooth muscle, enteric)는 세포 운동성과 세포골격을 유지하는 단백질이다. ID2 (inhibitor of DNA binding 2)는 전사조절인자로 알려져 있으며, HNLF (putative NFkB activating protein HNLF), DEPP (decidual protein induced by progesterone), SPP1 (secreted phosphoprotein 1), MGC8685 (beta polypeptide paralog)는 아직 정확한 기능이 보고되지 않았다. CPE (carboxypeptidase E)는 신경펩티드 작용을 하며, MBP (myelin basic protein)는 신경조직의 희돌기 세포와 슈반셀의 수초를 구성하는 중요한 역할을 한다. GAPD (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)와 LDHA (lactate dehydrogenase A)는 당분해 경로, HSPA9B (heat shock 70kDa protein 9B)는 열충격 관련 단백질이며, A2BP1 (ataxin 2-binding protein 1)는 RNA표지 단백질로 알려져 있다. PPP2CA (protein phosphatase 2)는 세포의 배양과 분열을 억제하는 역할을 하며, ATP6V1E1 (ATPase, H+ transporting, lysosomal 31kDa, V1 subunit E isoform 1)는 ATPase의 활성을 지닌다. MAP2 (microtubule-associated protein)는 미세소관 연관된 단백질이며, HLA-C (major histocompatibility complex, class I, C)는 소포체의 면역체계에 중요한 역할을 한다. ARF1 (ADP-ribosylation factor 1)은 GTP 결합 단백질로서 클로레라 톡신 카탈라이틱 서브유닛의 다른 자리입체성 (allosteric) 활성효소로 작용하며, VSNL1 (visinin-like 1)는 뉴런의 칼슘분비 단백질로 알려져 있다.
본 발명자들은 측두엽 간질의 원인인 위축성 해마 (해마) 조직 및 정상 해마조직의 cDNA 라이브러리의 유전자 염기서열을 분석하고, 이들 유전자의 발굴 빈도를 바탕으로 하여 간질에서 특이적으로 저발현 되는 유전자를 찾아내고 경쟁적 RT-PCR 방법에 의해 저발현 유전자를 확인함으로써 간질을 검출할 수 있는 새로운 간질 마커를 확립하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 간질 조직에서 특이적으로 저발현되는 유전자들의 발현정도 측정을 이용한 간질 진단 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명은 간질 특이적 저발현 유전자인 GAPDH, TSC22, TTR, DEPP, SPP1, ACTG2, ID2, HNLF, CPE, MBP, LDHA, HSPA9B, A2BP1, PPP2CA, ATP6VE1, MAP2, MGC8685, HLA-C, ARF1, VSNL1의 발현 정도의 측정을 통하여 간질을 진단하는 간질 진단키트를 제공한다.
본 발명의 간질 진단키트는 간질 특이적 저발현 유전자인 GAPDH, TSC22, TTR, DEPP, SPP1, ACTG2, ID2, HNLF, CPE, MBP, LDHA, HSPA9B, A2BP1, PPP2CA, ATP6VE1, MAP2, MGC8685, HLA-C, ARF1, VSNL1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 포함한다.
또는, 본 발명의 간질 진단키트는 간질 특이적 저발현 유전자인 GAPDH, TSC22, TTR, DEPP, SPP1, ACTG2, ID2, HNLF, CPE, MBP, LDHA, HSPA9B, A2BP1, PPP2CA, ATP6VE1, MAP2, MGC8685, HLA-C, ARF1, VSNL1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 상보적인 프로브를 포함한다.
또 다르게는, 본 발명의 간질 진단키트는 간질 특이적 저발현 유전자인 GAPDH, TSC22, TTR, DEPP, SPP1, ACTG2, ID2, HNLF, CPE, MBP, LDHA, HSPA9B, A2BP1, PPP2CA, ATP6VE1, MAP2, MGC8685, HLA-C, ARF1, VSNL1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 인식하는 항체를 포함한다.
이하에서 본 발명을 좀더 상세히 설명한다.
본 발명에서는 20종의 간질 특이적 저발현 유전자의 간질 진단용 용도를 제공한다.
본 발명의 간질 마커 유전자는 간질 조직에서 저발현되는 유전자의 전장 및 그의 단편을 포함한다.
본 발명에서 확인된 간질 마커 유전자의 서열정보는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
본 발명에서는 4종의 간질환자의 해마조직 표본 (H1, H2, H3, H4) 및 1종의 정상 해마조직 표본(N1)을 사용하여 총 5종의 cDNA 라이브러리를 제조하고, 이로부터 약 6271개의 EST 염기 배열을 결정한 후 간질환자의 해마 시료 (간질 해마조직)와 정상 해마 시료 (정상 해마 조직)에서 각 유전자의 발굴 빈도를 분석하여, 간질 시료에서 발굴 빈도가 낮은 20종의 간질 저발현 유전자 즉, 간질 억제 후보 유전자(GAPDH, TSC22, TTR, DEPP, SPP1, ACTG2, ID2, HNLF, CPE, MBP, LDHA, HSPA9B, A2BP1, PPP2CA, ATP6VE1, MAP2, MGC8685, HLA-C, ARF1, VSNL1)를 각각 선별하여 간질 마커 유전자를 찾아내었다.
유전자 발굴빈도 분석에 사용된 간질환자의 해마 시료 및 정상 해마 시료에서 본 발명의 20종의 간질 억제 후보 유전자의 발현량을 정량적 RT-PCR 방법에 의해 비교한 결과, 간질 억제 후보 유전자는 간질 시료에서 저발현됨이 관찰됨으로써 본 발명의 간질 마커 유전자들과 간질과의 관련성이 확인되었다.
따라서, 간질 특이적 유전자인 GAPDH, TSC22, TTR, DEPP, SPP1, ACTG2, ID2, HNLF, CPE, MBP, LDHA, HSPA9B, A2BP1, PPP2CA, ATP6VE1, MAP2, MGC8685, HLA-C, ARF1, VSNL1의 유전자의 발현 정도를 측정함으로써 간질을 진단할 수 있다.
유전자 길이 CDS(단백질 영역) 위치 GenBank Accession No.
GAPD 1283 76, 1083 12p13 NM_002046
TSC22 1791 216, 650 13q14 NM_006022
TTR 615 27, 86 18q12.1 NM_000371
DEPP 2012 218, 856 10q11.21 NM_007021
SPP1 1616 166, 1068 4q21-q25 NM_000582
ACTG2 1345 123, 1253 2p13.1 NM_001615
ID2 1402 184, 588 2p25 NM_002166
HNLF 1048 23, 706 7p13 NM_182547
CPE 2443 291, 1721 4q32.3 NM_001873
MBP 2794 265, 1179 18q23 NM_001025101
LDHA 1661 98, 1096 11p15.4 NM_005566
HSPA9B 2883 109, 2148 5q31.1 NM_004134
A2BP1 2279 987, 2180 16p13.3 NM_018723
PPP2CA 2643 399, 1328 5q23-q31 NM_002715
ATP6V1E1 1330 135, 815 22pter-q11.2 NM_001696
MAP2 6627 249, 5825 2q34-q35 NM_031846
MGC8685 1914 95, 1432 6p25 NM_178012
HLA-C 1543 8, 1108 6p21.3 NM_002117
ARF1 1986 229, 774 1q42 NM_001024226
VSNL1 2014 385, 960 2p24.3 NM_003385
따라서, 본 발명은 또한 하기와 같은 단계들을 포함하는 간질 특이적 유전자들의 발현 정도를 측정하는 방법을 제공한다:
(a) 시험 해마 조직에서 GAPDH, TSC22, TTR, DEPP, SPP1, ACTG2, ID2, HNLF, CPE, MBP, LDHA, HSPA9B, A2BP1, PPP2CA, ATP6VE1, MAP2, MGC8685, HLA-C, ARF1, VSNL1 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 간질 저발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계,
(b) 정상 해마 조직에서 GAPDH, TSC22, TTR, DEPP, SPP1, ACTG2, ID2, HNLF, CPE, MBP, LDHA, HSPA9B, A2BP1, PPP2CA, ATP6VE1, MAP2, MGC8685, HLA-C, ARF1, VSNL1및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 간질 저발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계.
상기 측정된 값들을 비교함으로써 간질을 진단할 수 있다. 구체적으로 (a)에 의해 얻어진 측정값을 (b)에서 얻어진 측정값과 비교함으로써 간질 특이적 저발현 유전자의 상대적 발현량을 통하여 간질 여부를 판정할 수 있다.
본 발명의 20종의 마커 유전자의 발현량은 마커 유전자 또는 그 단편에 대하여 상보적인 염기 서열을 갖는 센스 프라이머 및/또는 안티센스 프라이머를 이용한 공지의 방법을 통하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 경쟁적 RT-PCR (Competitive Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction), 실시간 RT-PCR 등의 방법으로 측정할 수 있다. 이러한 프라이머는 20종 마커 유전자의 DNA 영역 중에서 단백질을 코딩하는 DNA 영역의 일부 또는 전부의 배열이 함유되고 적어도 15bp 길이, 바람직하게는 15bp~25bp의 DNA이어야 한다. 예를 들어, 표 4에 기재된 프라이머들이 사용될 수 있다. 본 발명에서 상보적이란 적어도 15개의 연속 염기배열에서 완전히 상보적인 배열인 경우로 제한하지 않고 염기 서열상에서 70%, 바람직하게는 80% 이상의 상동성이 있으면 된다. 본 발명에서 상보적이란 적어도 15개의 연속 염기배열에서 완전히 상보적인 배열인 경우로 제한하지 않고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려진 바와 같이 염기 서열상에서 70%, 바람직하게는 80% 이상의 상동성이 있으면 된다. 이러한 정도의 상동성을 가진 서열은 상기 20종 마커 유전자와 이중쇄 구조를 이루어 중합효소 연쇄반응을 진행할 수 있기 때문이다.
또한, 본 발명의 20종의 마커 유전자의 발현량은 마커 유전자 또는 그 단편을 프로브(probe)로 사용한 공지의 혼성화 반응(하이브리다이제이션 반응)을 통하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 노던 하이브리다이제이션("Molecular Cloning - A Laboratory Manual "Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al., 1982, section 7.37-7.52), 인시츄 하이브리다이제이션(Jacquemier 등, Bull Cancer 90: 31-8, 2003) 또는 마이크로어레이(Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3: 185-200, 2003) 등의 방법으로 측정할 수 있다. 프로브는 20종 유전자의 염기 서열을 함유한 통상 200bp~1000bp이며 바람직하게는 400bp~800bp의 길이를 가진다. 염기 서열은 20종 유전자의 염기 서열과 각각 70% 이상의 상동성을 가지면 된다. 이러한 정도의 상동성을 가진 서열은 상기 20종 마커 유전자와 이중쇄 구조를 이루어 중합효소 연쇄반응을 진행할 수 있기 때문이다. 본 발명의 마커 유전자의 프로브는 상기에서 제조된 20종의 마커 유전자의 센스 프라이머 및/또는 안티센스 프라이머를 이용한 유전자 증폭법(PCR) 등의 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다.
또한, 상기 20종의 간질 마커 유전자의 발현 양은 각 유전자에 의하여 코드되는 단백질의 양을 측정함으로써 측정할 수 있다. 상기 방법에서 단백질은 간질 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 통상적인 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 및 면역침강법 등에 의해 정량화될 수 있다.
본 발명의 20종의 간질 특이 저발현 유전자에 대한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 20종의 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩타이드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩타이드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.12-11.13), 모노클로날 항체(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.4-11.11) 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 폴리클로날 항체의 일부, 모노클로날 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체(Methods in Enzymology 203, 99-121 (1991)등의 특수항체도 포함된다.
본 발명의 20종의 간질 마커 유전자 또는 단백질은 단독으로 또는 조합하여 간질 진단에 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 간질 진단키트는 상기 간질 특이적 마커 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머 또는 프로브 이외에 RNA 또는 폴리 (A)+ RNA 분리 시약을 더 포함할 수 있으며, 마이크로어레이를 통하여 발현량을 조사하는 경우에는 20종 유전자의 고형지지체를 포함한다.
또한, 20종의 간질 마커 유전자는 간질 억제 유전자일 가능성이 높으므로, 이러한 표적 유전자가 코딩하는 단백질에 결합하는 작은 분자의 화합물은 표적 단백질을 저해 또는 촉진하는 화합물의 후보가 될 수 있으며 이는 치료제 등의 의약품으로 사용할 수 있다.
이런 시험 화합물을 스크리닝하는 방법으로는, 20종의 간질 마커 유전자가 코딩하는 단백질을 친화 크로마토그래피 칼럼(affinity chromatography column)에 고정시키고 이를 피검시료와 접촉시켜 정제하는 방법(Pandya 등, Virus Res 87: 135-143, 2002), 투하이브리드법을 이용하는 방법(Fields, S and Song, O., Nature 340: 245 -246, 1989), 웨스턴 블로팅법("Molecular Cloning - A Laboratory Manual "Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al. (1982) section 18.30-18.74), 하이스루풋스크리닝법(Aviezer 등, J Biomol Screen 6: 171-7, 2001) 등 다수의 공지의 방법을 사용할 수 있다. 스크리닝에 사용하는 피검시료로서는 세포 추출액, 유전자 라이브러리의 발현 산물, 합성 저분자화합물, 합성 펩타이드, 천연 화합물 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이들만으로 제한되는 것은 아니다.
( 실시예 1) 간질환자 해마 조직 및 정상 해마 조직으로부터 총 RNA 분리
8종의 간질환자의 해마 조직 표본인 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8(서울대학교 의과대학)은 외과적으로 제거된 조직으로부터 얻고, 분석할 때까지 이를 액체 질소에 보관하였다. 6종의 정상 해마 조직 표본인 N1, N2, N3, N4, N5, N6는 System bio (U.S.A)와 Ambion (U.S.A)사로부터 구입하였다.
조직의 총 RNA는 QIAGEN 키트(RNeasy Maxi 키트: cat#75162)를 사용하여 분리했다. 조직은 약 1g을 취하여, 베타 머캅토에탄올을 첨가한 15㎖의 키트 내의 RLT 완충액에 용해시키고, 호모지나이저로 분쇄하였다. 시료 용액을 3000g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 분리하고, 여기에 15㎖의 70% EtOH을 첨가하여 잘 섞은 후, 3000g에서 5분간 원심분리하여 총 RNA를 막에 부착시켰다. 두 차례의 세척 과정을 수행 후, 1.2ml의 RNase가 제거된 물을 첨가하여 총 RNA를 용출, 분리하였다.
( 실시예 2) EST 발굴 빈도에 의한 간질 특이 저발현 유전자의 선별
본 발명자는 간질에서 발현되는 유전자를 분석하기 위하여, 간질 해마조직과 정상 해마 조직에서 각종 cDNA 라이브러리를 구축하고, 이로부터 무작위로 클론을 선별, 분석함으로써 EST 발굴 빈도를 기초로 한 간질 저발현 유전자를 선별하고자 하였다.
2-1: cDNA 라이브러리의 제조
실시예 1에서 얻은 각 시료의 총 RNA 각 100㎍을 BAP 효소 반응액(100Mm Tris-Hcl(pH 7.0), RNA 2mM DTT, 80U Rnasin(promega))에서 3U의 BAP (Bacterial alkaline Phosphatase, TakaRa) 효소로 처리하고, 이어 TAP(Waco) 효소 반응액(50mM sodium acetate (pH 5.5), 1mM EDTA, 2mM DTT, 80U Rnasin (promega))에서 100U의 TAP(Tabbaco acid pyrophosphatase)효소를 반응시켰다. 그후, 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 5mM MgCl2, 2mM DTT, 0.5mM ATP, 26% PEG, 100U Rnasin, 서열번호 1(agcaucgagu cggccuuguu ggccuacugg)의 올리고리보뉴클레오티드 40pmole, 250U RNA 리가아제(TakaRa)의 반응을 수행하여 합성한 올리고머를 인산기를 가지는 미분해 mRNA에만 첨가되도록 반응시켰다.
이상의 반응을 처리한 총 RNA로부터 올리고텍스(oligotex) mRNA 정제키트 (QIAGEN)를 사용하여 mRNA를 분리하고, dT17을 함유한 서열번호 2(gcggctgaag acggcctatg tggccttttt tttttttttt tt)의 올리고머를 프라이머로 사용하여 1st cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 XL PCR 키트 (PerkinElmer)를 사용하여 합성된 DNA 삽입체의 5’-말단(서열번호 3; agcatcgagt cggccttgtt g)과 3’-말단의 올리고머(서열번호 4; gcggctgaag acggcctatg t)를 함유한 PCR 반응을 수행하여 소량 증폭시켰다. PCR 산물을 SfiI의 효소로 처리한 후 아가로스 젤 전기영동을 하여 1.3kb 이상의 cDNA 단편을 분리하였다. 분리된 cDNA 단편은 TaKaRa 연결 키트를 이용하여 DraIII 효소로 처리한 pCNS-D2 벡터에 연결한 후, 전기침공법(electroporation)에 의해 대장균 Top10F' (Invitrogen) 균주에 형질전환시켜, cDNA 라이브러리를 제조하였다.
본 방법에 의해 4종의 간질환자 해마 조직 cDNA 라이브러리와 1종의 정상 해마 조직 cDNA 라이브러리를 제조하였다(표 2).
Figure 112007040681404-PAT00001
2-2: cDNA 염기서열의 결정 및 데이터 분석
제작한 cDNA 라이브러리를 엠피실린(100ug/ml)이 함유된 LB 한천배지에 도말하여 다수의 cDNA 클론을 배양하였다. 얻어진 클론들의 염기서열을 분석하기 위하여 MWG 96well plasmid prep system으로 플라스미드 DNA를 분리하고, 자동화 염기서열 결정기인 ABI 3700으로 염기서열분석을 수행하였다.
결정된 DNA 데이터의 유사성 검색은 BLASTN을 사용하여 UniGene 데이터베이스 (Hs.seq.all, build#164)에서 수행하였다.
5종의 cDNA 라이브러리에서 약 6271개의 EST 염기 배열을 결정하고 이의 분석을 UniGene 데이터베이스에서 수행한 결과, 총 2564종의 유전자가 발굴되었다. 각 라이브러리별 결정된 EST 수와 발굴된 유전자의 종류는 표 2에 나타낸 바와 같다.
2-3: 유전자 발굴 빈도 분석
4종의 간질환자 해마조직 cDNA 라이브러리는 간질 시료로, 1종의 정상 해마 조직 cDNA 라이브러리는 정상 해마 시료로 크게 2개로 분류하였다. 각 유전자의 발굴 빈도는 각각의 시료에서 발굴된 특정 유전자의 수를 발굴된 총 유전자 수의 비로 나타내었다. 또한 각 라이브러리에서 각 유전자의 발굴 빈도는 각 라이브러리에서 발굴된 특정 유전자의 수를 발굴된 총 유전자의 수의 비로 계산하고 이를 색깔로서 나타내었다.
상기와 같은 분석에 의해 간질 시료에서 발굴 빈도가 감소하는 저발현 유전자 20종이 각각 선별되었다(도 1).
( 실시예 3) RT - PCR 반응에 의한 선별된 표적 유전자의 발현량 분석
간질환자 해마 시료와 정상 해마 조직 시료에서 유전자 발굴 빈도에 의해 선별된 20종의 간질 특이 저발현 유전자의 발현량을 경쟁적 RT-PCR 방법을 통해 정량적으로 분석하였다.
3-1: 역전사 효소 반응
실시예 1에서 분리한 총 14종의 총 RNA에서 각각 2.5㎍을 사용하여 하기의 역전사 반응액에서 42℃, 65분간 반응시켜 총 14종의 1st cDNA를 합성하였다. 그 후, 70℃ 가열 블록(heating block)에서 15분간 반응함으로써 cDNA 합성을 종료시켰다.
3-2: 경쟁적 ( Competitive ) PCR 을 이용한 cDNA 의 증폭 및 발현량 확인
3-2-1: 경쟁적 PCR 을 위한 주형의 농도 보정
마커 유전자를 정량하기 위한 표준 유전자로 본 실험에서는 베타-엑틴 유전자를 사용하였다. 표준 유전자와 프라이머의 프라이밍 부분은 같으나, PCR 산물의 크기가 다른 경쟁 DNA(competitor)를 표준 유전자와 함께 PCR 반응을 수행하여, 시료간 표준 유전자의 발현량과 경쟁 DNA의 발현량이 같은 농도를 찾아, PCR에 사용되는 각 주형의 농도가 동일하게 되도록 시료의 농도를 보정하였다.
베타-엑틴 경쟁 DNA는 시판의 DNA (Takara, 일본)를 사용하였으며, 이를 이용한 PCR 산물의 길이는 340bp이며, 베타-엑틴 유전자로부터 PCR 산물의 길이는 275bp였다. 베타-엑틴 경쟁 DNA를 6 단계로 희석하고, 희석한 2㎕를 역전사 효소 반응액의 희석액 5㎕에 각각 혼합한 후, 3㎕의 5XPCR 반응액 (바이오니아, 한국), 각각 0.6㎕의 2종류의 베타-엑틴 프라이머[10 pmole/㎕: 정방향 프라이머(서열번호 5) : 5'-caagagatggccacggctgct-3', 역방향 프라이머(서열번호 6) : 5'-tccttctgcatcctgtcggca-3'], 3.8㎕의 증류수를 함유한 총 15㎕의 6개 PCR 반응액을 사용하여 경쟁적 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 반응 조건은 94℃(30초), 58℃(50초), 72℃(1분)로 25회씩 수행하였다.
PCR 산물을 1.5% 아가로스 젤에 15㎕씩 로딩하여 100V에서 20분 전기영동한 후, FrogTM 기계(젤 이미지 어낼리시스 시스템)[Core Bio 사]를 이용하여 젤 사진을 촬영하였다. 최종적으로 얻은 젤 밴드 이미지 파일(.tif)을 ToltalLab v1.0 프로그램(NonLinear Dynamix 사)을 이용하여, 두 밴드(베타-엑틴 경쟁 DNA에서는 340bp, 원래 베타-엑틴유전자에서는 275bp)의 감도가 비슷한 농도를 선별, 정량화한 후, 각 시료의 농도를 보정하였다.
3-2-2: PCR 을 이용한 cDNA 의 증폭
실시예 3-2-1에서 보정한 시료의 cDNA를 각 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 함유한 하기 표 3의 PCR 반응액에서 증폭시켰다. 이때 PCR 반응은 94℃ (30초), 58℃ (50초), 72℃ (1분), 25회씩 수행하였다.
20종의 간질 특이 저발현 유전자 GAPDH, TSC22, TTR, DEPP, SPP1, ACTG2, ID2, HNLF, CPE, MBP, LDHA, HSPA9B, A2BP1, PPP2CA, ATP6VE1, MAP2, MGC8685, HLA-C, ARF1, VSNL1의 프라이머는 단백질 코딩 영역 내부에서 디자인하였고, 각 프라이머의 길이는 17∼20bp, GC 함량은 50∼70% 정도였다(코아바이오시스템, 한국). 표 3은 PCR 반응액의 조성을 나타내고, 표 4는 경쟁적 PCR에 사용한 각 간질 마커 유전자들의 프라이머를 나타낸다.
3-3-3: 경쟁적 PCR 을 이용한 발현량 확인
PCR 반응에 의해 증폭된 PCR 산물을 확인하기 위하여, PCR 반응액을 1.5%의 아가로스 젤에 100V로 30분간 전기영동 한 후, PCR 산물을 3-2-1에서와 같이 ToltalLab v1.0 프로그램 (NonLinear Dynamix Ltd.)을 이용하여 정량화하였다.
cDNA 5㎕
5X PCR 반응 mix (바이오니아, 한국) 3㎕
정방향 프라이머 (10pmole/㎕) 1㎕
역방향 프라이머 (10pmole/㎕) 1㎕
증류수 5㎕
Total 15㎕
유전자 정방향 프라이머(5‘->3’) 역방향 프라이머(5‘->3’)
GAPD ACCATCTTCCAGGAGCGAG (서열번호 7) AAGTGATGGCATGGACTGTGG (서열번호 8)
TSC22 TGCCTTTGGCACAACAGA (서열번호 9) CGTCAGCGGTAGCACCTT (서열번호 10)
TTR CTGCCTTGCTGGACTGGT (서열번호 11) CAGCCGTGGTGGAATAGG (서열번호 12)
DEPP CCCCTGGACTGGCTTTT (서열번호 13) CTGGGGAGGGGTCAGAGT (서열번호 14)
SPP1 CCACGAGGGTGTTTTGG (서열번호 15) TGGCCAGTGTCTTCAGCA (서열번호 16)
ACTG2 TGGCCCTGGATTTTGAGA (서열번호 17) ATAGAGCCCCCGATCCAG (서열번호18)
ID2 TCGGGCTTCATTCTGAGC (서열번호 19) TCTGGTGATGCAGGCTGA (서열번호 20)
HNLF GCAAACTGCGTGTGCATC (서열번호 21) CCAGCTTCTTGGCCTCAA (서열번호 22)
CPE CAGCTCCTCCCCAGATGA (서열번호 23) CCTTCCACGGAGATGGTG (서열번호 24)
MBP ACAGCGATCCAAGTACCTGG (서열번호 25) CTGTCTCTTCCTCCCTTCCC (서열번호 26)
LDHA ACGTCAGCAAGAGGGAGAAA (서열번호 27) TTCCACTCCATACAGGCACA (서열번호 28)
HSPA9B TACTGCCGCTGATGGTCA (서열번호 29) TTCGCCGGTCTTCTTCAG (서열번호 30)
A2BP1 GCCAACCAGGAGGGATCT (서열번호 31) TAGGGGTCGGCAGCATAA (서열번호 32)
PPP2CA GTGCCATGACCGGAATGT (서열번호 33) TGGTCACGGCTGTTGATG (서열번호 34)
ATP6VE1 GCTGCTGGATGGACTGGT (서열번호 35) CGAGCTCCACCTCCTGAA (서열번호: 36)
MAP2 AAATGCCAACGGAAGCAA (서열번호 37) CCTCATGGGGCTCTTCAA (서열번호 38)
MGC8685 AGGGGAGGACGGACAGAC (서열번호 39) GCCCTTGGCCCAGTTATT (서열번호 40)
HLA-C TCATCTCTGTCGGCTACGTG (서열번호 41) CCATCCAGTTTTCAGGTCT (서열번호 42)
ARF1 AATGCGCATCCTCATGGT (서열번호 43) CAGCCCCAGCTTGTCTGT (서열번호 44)
VSNL1 CTGGCCCCTGAAGTGATG (서열번호 45) CCACTCGGGTGATCTTGC (서열번호 46)
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 간질에서 발굴 빈도가 낮은 간질 특이 저발현 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 간질 시료에서 낮게 나타났다. 즉, 20종의 간질 발암 후보 유전자인 GAPDH, TSC22, TTR, DEPP, SPP1, ACTG2, ID2, HNLF, CPE, MBP, LDHA, HSPA9B, A2BP1, PPP2CA, ATP6VE1, MAP2, MGC8685, HLA-C, ARF1, VSNL1는 간질 억제 마커로 사용 가능한 것이 확인되었다.
본 발명에 의해, 간질의 진단에 유용한 간질 마커로 정상 해마조직에서 측정된 20종의 간질 저발현 유전자가 확인되었다. 상기 간질 마커는 환자 조직에서 신속하고 민감하게 정량할 수 있어 간질의 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 간질 특이적 저발현 유전자인 GAPDH, TSC22, TTR, DEPP, SPP1, ACTG2, ID2, HNLF, CPE, MBP, LDHA, HSPA9B, A2BP1, PPP2CA, ATP6VE1, MAP2, MGC8685, HLA-C, ARF1, VSNL1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질에 특정 시험 화합물을 결합시켜 그 시험 화합물이 상기 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인함으로써 간질 억제제를 스크리닝할 수 있다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> DETECTION KIT FOR EPILEPSY BY MEASURING THE EXPRESSION OF EPILEPSY MARKER GENES <130> KRIBB-NSKIM1 <150> KR20060050227 <151> 2006-06-05 <160> 46 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 1 agcaucgagu cggccuuguu ggccuacugg 30 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 2 gcggctgaag acggcctatg tggccttttt tttttttttt tt 42 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 3 agcatcgagt cggccttgtt g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 4 gcggctgaag acggcctatg t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of beta-actin <400> 5 caagagatgg ccacggctgc t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of beta-actin <400> 6 tccttctgca tcctgtcggc a 21 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foeward primer of GAPD <400> 7 accatcttcc aggagcgag 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GAPD <400> 8 aagtgatggc atggactgtg g 21 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of TSC22 <400> 9 tgcctttggc acaacaga 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of TSC22 <400> 10 cgtcagcggt agcacctt 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of TTR <400> 11 ctgccttgct ggactggt 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of TTR <400> 12 cagccgtggt ggaatagg 18 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of DEPP <400> 13 cccctggact ggctttt 17 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of DEPP <400> 14 ctggggaggg gtcagagt 18 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of SPP1 <400> 15 ccacgagggt gttttgg 17 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of SPP1 <400> 16 tggccagtgt cttcagca 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of ACTG2 <400> 17 tggccctgga ttttgaga 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of ACTG2 <400> 18 atagagcccc cgatccag 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of ID2 <400> 19 tcgggcttca ttctgagc 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of ID2 <400> 20 tctggtgatg caggctga 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of HNLF <400> 21 gcaaactgcg tgtgcatc 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of HNLF <400> 22 ccagcttctt ggcctcaa 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of CPE <400> 23 cagctcctcc ccagatga 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of CPE <400> 24 ccttccacgg agatggtg 18 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of MBP <400> 25 acagcgatcc aagtacctgg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of MBP <400> 26 ctgtctcttc ctcccttccc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of LDHA <400> 27 acgtcagcaa gagggagaaa 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of LDHA <400> 28 ttccactcca tacaggcaca 20 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of HSPA9B <400> 29 tactgccgct gatggtca 18 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of HSPA9B <400> 30 ttcgccggtc ttcttcag 18 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of A2BP1 <400> 31 gccaaccagg agggatct 18 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of A2BP1 <400> 32 taggggtcgg cagcataa 18 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of PPP2CA <400> 33 gtgccatgac cggaatgt 18 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of PPP2CA <400> 34 tggtcacggc tgttgatg 18 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of ATP6VE1 <400> 35 gctgctggat ggactggt 18 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of ATP6VE1 <400> 36 cgagctccac ctcctgaa 18 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of MAP2 <400> 37 aaatgccaac ggaagcaa 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of MAP2 <400> 38 cctcatgggg ctcttcaa 18 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of MGC8685 <400> 39 aggggaggac ggacagac 18 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of MGC8685 <400> 40 gcccttggcc cagttatt 18 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of HLA-C <400> 41 tcatctctgt cggctacgtg 20 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of HLA-C <400> 42 ccatccagtt ttcaggtct 19 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of ARF1 <400> 43 aatgcgcatc ctcatggt 18 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of ARF1 <400> 44 cagccccagc ttgtctgt 18 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of VSNL1 <400> 45 ctggcccctg aagtgatg 18 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of VSNL1 <400> 46 ccactcgggt gatcttgc 18

Claims (5)

  1. 간질 특이적 저발현 유전자인 GAPDH, TSC22, TTR, DEPP, SPP1, ACTG2, ID2, HNLF, CPE, MBP, LDHA, HSPA9B, A2BP1, PPP2CA, ATP6VE1, MAP2, MGC8685, HLA-C, ARF1 및 VSNL1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 정도 측정을 통하여 간질을 진단하기 위하여 상기 유전자, 길이 200bp 이상인 상기 유전자에 상보적인 프로브, 서열번호 제5번 내지 제46번의 상기 간질 특이적 저발현 유전자의 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머로 이루어진 그룹 중 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 간질 진단 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자의 발현량을 실시간 RT-PCR 또는 경쟁적 RT-PCR 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 간질 진단 키트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 15bp~25bp의 DNA인 것을 특징으로 하는 간질 진단 키트.
  4. 간질 특이적 저발현 유전자인 GAPDH, TSC22, TTR, DEPP, SPP1, ACTG2, ID2, HNLF, CPE, MBP, LDHA, HSPA9B, A2BP1, PPP2CA, ATP6VE1, MAP2, MGC8685, HLA-C, ARF1 및 VSNL1에 의하여 코딩되는 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 인식하는 항체를 포함하며, GAPDH, TSC22, TTR, DEPP, SPP1, ACTG2, ID2, HNLF, CPE, MBP, LDHA, HSPA9B, A2BP1, PPP2CA, ATP6VE1, MAP2, MGC8685, HLA-C, ARF1 및 VSNL1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 발현 정도의 측정을 통하여 간질을 진단하는 것을 특징으로 하는 간질 진단 키트.
  5. 간질 특이적 저발현 유전자인 GAPDH, TSC22, TTR, DEPP, SPP1, ACTG2, ID2, HNLF, CPE, MBP, LDHA, HSPA9B, A2BP1, PPP2CA, ATP6VE1, MAP2, MGC8685, HLA-C, ARF1 및 VSNL1에 의하여 코딩되는 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질에 시험 화합물을 결합시키는 단계; 및
    상기 간질 특이적 저발현 유전자가 코딩하는 단백질 1종 이상을 친화 크로마토그래피 칼럼에 고정시키고 이를 피검시료와 접촉시켜 정제하는 방법, 투하이브리드법, 웨스턴 블로팅법 또는 하이스루풋스크리닝법으로 상기 시험 화합물이 상기 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 단계;를 포함하는 간질 억제제를 스크리닝하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20160113516A (ko) 2015-03-20 2016-09-29 한국과학기술원 난치성 뇌전증 진단 및 치료용 조성물
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