KR102069435B1 - 콧물액을 이용한 파킨슨 질환의 진단 방법, 이를 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents
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Abstract
본원은 대상의 콧물액 시료로부터 파킨슨 질환 관련 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 파킨슨 질환 진단을 위한 정보제공방법, 파킨슨 질환 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.
Description
본원은 대상의 콧물액 시료로부터 파킨슨 질환 관련 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 파킨슨 질환 진단을 위한 정보제공방법, 파킨슨 질환 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.
평균 수명이 증가하여 고령화 사회로 진입함에 따라, 노화에 따라 발병하는 퇴행성 질환이 커다란 의료 및 사회적 문제로 대두되고 있다. 이러한 퇴행성 질환 중에서도 특히 퇴행성 운동장애 뇌질환인 파킨슨 질환 환자의 수가 급격하게 증가하는 추세에 있다.
파킨슨 질환 (Parkinson's disease)은 팔, 다리 또는 전신의 근육이 경련 또는 경직되며 중심을 잡지 못하는 퇴행성 신경질환이다. 이와 같은 증상은 뇌신경세포의 문제로 신경전달물질인 도파민 분비에 이상이 생기면서, 뇌의 특정 신경세포가 점차 파괴되어 발생한다. 파킨슨 질환의 전형적인 증상은 경련, 근육 경직 및 동작이 느려지는 증상 등을 포함하는 운동장애이다.
파킨슨 질환은 진행속도가 느리고 수십 년에 걸쳐서 진행되기 때문에 발병 시점을 정확히 알기 어려우며, 증상이 발견되었을 때는 이미 뇌의 흑질 부위의 신경세포가 상당히 변성된 경우가 많다. 따라서, 파킨슨 질환의 진행의 적절한 조절을 위해서는 상당한 수준의 신경세포 사멸이 나타나기 이전에 조기 진단할 수 있는 질환 특이적인 신규 마커의 발굴이 중요하다.
현재는 파킨슨 질환의 조기 진단을 위한 생체 분비 시료로서 뇌척수액, 혈액 및 소변 등이 사용되고 있다. 그러나, 뇌척수액은 채취 가능한 시료의 양의 제한적이고 연구목적으로 샘플을 얻기가 어려워 다양한 종류의 마커들을 동시에 분석하는데 한계가 있었다. 혈액과 소변의 경우 비록 뇌척수액에 비해서는 비침습적 시료 채취가 가능한 장점이 있으나, 퇴행성 질환의 병변 발현 부위를 직접 대변하지 못하는 샘플에서의 간접적인 진단 마커 측정이기 때문에 감도나 일관성에 문제가 있을 수 있다.
본원은, 파킨슨 환자의 80% 이상에서 조기에 후각 이상의 소견이 보고되었음에 주목하고, 파킨슨 질환의 조기진단 전략으로서 시료 채취의 용이성이 우수한 콧물액을 이용한 전사체 분석방법을 개발하고자 하였다. 파킨슨 환자에서 후각 이상은 운동 병변이 발현되기 수년 이전에 나타나는데, 이러한 후각 이상을 대변할 수 있는 콧물액을 이용한 파킨슨 질환의 조기 진단 시도는 시도된 바 없었다.
이에 본원에서는, 콧물액으로부터 전사체 RNA를 추출 및 분리하고, 이로부터 실시간 정량 PCR (realtime quantitative PCR) 기법을 통해 주요 파킨슨 질환 마커들 (α-시뉴클레인(SNCA), 파킨, ZNF746 (PARIS), RNF146, c-Abl 및 AIMP2)의 발현을 정량하고자 하였다. 또한, 정상군과 파킨슨 환자의 콧물액 전사체 분석으로부터 파킨슨 병변과 연계성을 보이는 마커들을 파킨슨 질환 병변의 조기 진단 마커로서 활용하고자 하였다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 분리된 콧물액에서 파킨슨 질환 관련 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 파킨슨 질환 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 파킨슨 질환 진단용 조성물을 포함하는 파킨슨 질환 진단용 키트를 제공할 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 파킨슨 질환 의심 환자로부터 콧물액을 분리하고; 상기 콧물액 내의 세포로부터 파킨슨 질환 관련 유전자 전사체, 또는 이로부터 발현되는 펩타이드 또는 단백질의 발현 수준을 측정하고, 이를 표준 유전자의 발현에 대해 정규화시키고; 정규화된 발현 수준을, 정상인에 대해 측정되고 정규화된 발현 수준과 비교하는 것을 포함하는, 파킨슨 질환 진단을 위한 정보제공방법을 제공할 수 있다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 구현예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 추가적인 구현예 및 실시예가 존재할 수 있다.
본원은, 후각 이상을 보이는 잠재적 파킨슨 질환 환자의 콧물액 전사체 중의 콧물액 특이적 파킨슨 질환 마커를 정량함으로써 파킨슨 질환의 조기 진단 내지 확진 방법을 제공하고자 하였다. 특히, 정상군과 파킨슨 환자의 콧물액 전사체 분석으로부터 파킨 전사체의 감소 및 AIMP2 전사체의 증가가 파킨슨 병변과 유의적으로 연계성을 보임을 확인하여, 콧물액 내의 파킨과 AIMP2를 파킨슨 질환 병변의 조기 진단 마커로서 활용하고자 하였다. 또한, 콧물액으로부터의 전사체 분리 정제, 그리고 파킨 및 AIMP2 전사체 정량을 통한 효율적이고 선택적인 감도 높은 파킨슨 질환의 진단키트 개발에 응용하고자 하였다.
본원은 최초로 파킨슨 질환 환자의 콧물액 내의 전사체를 정량하고, 콧물액 전사체 특이적인 파킨슨 질환 마커의 발현 양상으로부터 파킨슨 질환의 조기 진단 방법을 제공하고자 한 것이다.
도 1a는 본원의 일 실시예에 따라 콧물액으로부터 목적 유전자의 전사체를 정량하기 위한 공정의 순서도이고, 도 1b는 콧물액으로부터 목적 유전자의 전사체가 정상적으로 정제되었음을 확인한 전기영동 결과이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따라 수행된 목적 유전자의 cDNA의 PCR 및 용융 곡선 측정 조건을 나타낸 것이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따라 정상군 및 파킨슨 환자의 콧물액에서 발현되는 목적 유전자들의 PCR 산물의 용융 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 4a 내지 도 4c는 정상군 및 파킨슨 환자의 콧물액에서 발현되는 목적 유전자들의 정량 결과를 나타내는 그래프이고, 도 4d는 실험에 사용된 샘플수를 보여주는 표이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따라 수행된 목적 유전자의 cDNA의 PCR 및 용융 곡선 측정 조건을 나타낸 것이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따라 정상군 및 파킨슨 환자의 콧물액에서 발현되는 목적 유전자들의 PCR 산물의 용융 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 4a 내지 도 4c는 정상군 및 파킨슨 환자의 콧물액에서 발현되는 목적 유전자들의 정량 결과를 나타내는 그래프이고, 도 4d는 실험에 사용된 샘플수를 보여주는 표이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 그 중에서도 본 발명은 파킨슨 질환의 진단에 유용하다. 본원은 파킨슨 질환의 발병 및 진행을 예측하는 것을 포함한다. 특히 파킨슨 질환의 발병을 조기에 예측할 수 있는 지표가 매우 중요한데, 본원의 방법에 따르면 후각 이상의 소견을 보이는 파킨슨 질환 의심 환자에서 용이하게 채취할 수 있는 콧물을 내의 파킨슨 질환 연관 유전자 내지 단백질의 수준을 파킨슨 질환 진단 마커로 이용할 수 있다. 여기서 "진단용 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)란 파킨슨 질환 환자의 세포를 파킨슨 질환이 없는 정산인의 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로서, 정상인의 세포에 비하여 파킨슨 질환 환자의 세포에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 폴리펩타이드, 핵산, 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 다당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등으로부터 선택될 수 있다.
본원 명세서 전체에서, "핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.
본원 명세서 전체에서, "유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
본원 명세서 전체에서, "유전자 발현"이란 용어는 일반적으로 전사체, 그리고 나아가 생물학적 활성이 있는 폴리펩티드가 DNA 서열로부터 생성되고 세포에서 생물학적 활성을 나타내는 세포 과정을 의미한다. 그런 의미로, 유전자 발현은 전사 및 해독 과정을 포함할 뿐만 아니라, 유전자 또는 유전자 산물의 생물학적 활성에 영향을 끼칠 수 있는 전사후 및 해독후 과정을 포함한다. 상기 과정들은 RNA 합성, 가공 및 수송뿐만 아니라, 폴립펩티드 합성, 수송 및 폴리펩티드의 해독후 변형을 포함하지만, 이들에 국한되는 것은 아니다. 본원에서는 유전자 발현의 일 양태로 mRNA 발현 및 단백질 발현의 경우를 모두 포함한다.
본원 명세서 전체에서, "프라이머"는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 PCR에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.
이하, 본원의 파킨슨 질환 진단용 조성물, 파킨슨 질환 진단용 키트, 및 파킨슨 질환 진단을 위한 정보제공방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 1 측면은, 분리된 콧물액에서 파킨슨 질환 관련 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 파킨슨 질환 진단용 조성물에 관한 것이다.
본원의 조성물은, 일반적으로 파킨슨 질환 진단에 사용되는 뇌척수액에 비해 수집이 용이한 콧물액을 이용하여 파킨슨 질환을 진단하기 위한 것으로서, 파킨슨 질환에서 조기에 관찰되는 병변의 일종인 후각이상이 나타나는 코로부터 콧물액을 채취하여 이로부터 파킨슨 질환 관련 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 높은 정확도로 조기에 파킨슨 질환을 진단할 수 있다.
예를 들어, 상기 콧물액은 비강 세척액으로부터 수득한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 비강 세척은 식염수 또는 물 (증류수)를 이용해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
상기 분리된 콧물액에서 파킨슨 질환 관련 유전자의 발현 수준을 측정하는 것은, 콧물액 내의 세포를 분리하고, 상기 세포들에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 파킨슨 질환 관련 유전자는 α-시뉴클레인(또는 SNCA), 파킨 (parkin), ZNF746 (또는 PARIS), RNF146, OMP, c-Abl 및 AIMP2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있으며, 정상인의 그것에 비해 파킨슨 환자의 콧물액에서 달리 발현되는 유전자라면 제한 없이 사용할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 발현 수준을 측정하기 위한 제제는 파킨슨 질환 관련 유전자의 핵산 서열 또는 이에 대응하는 서열에 결합하는 핵산 프라이머, 또는 파킨슨 질환 유전자에 의해 발현되는 펩타이드 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있으며, 본원이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 수행되는 유전자 발현의 정량 방법이라면 제한 없이 사용할 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 다른 조성물을 포함하는 파킨슨 질환 진단용 키트에 관한 것이다.
본원의 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 상기 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예를 들어 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.
본원의 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 상기 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본원에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 파킨슨 질환 의심 환자로부터 콧물액을 분리하고; 상기 콧물액 내의 세포로부터 파킨슨 질환 관련 유전자 또는 이의 전사체, 또는 이로부터 발현되는 펩타이드 또는 단백질의 발현 수준을 측정하고, 이를 표준 유전자의 발현에 대해 정규화시키고; 정규화된 발현 수준을, 정상인에 대해 측정되고 정규화된 발현 수준과 비교하는 것을 포함하는, 파킨슨 질환 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 파킨슨 질환 관련 유전자는 α-시뉴클레인 (SNCA), 파킨 (parkin), ZNF746 (PARIS), RNF146, c-Abl 및 AIMP2로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 표준 유전자는 GAPDH일 수 있으나, 파킨슨 질환의 유무에 관계없이 개체들 사이에서 일정한 발현을 보이는 유전자라면 제한 없이 사용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 유전자의 발현 수준은 역전사효소 중합반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응 (competitive RT-PCR), 실시간 역전사 효소 중합효소반응 (real time quantitative RT-PCR), 정량적 중합효소반응 (quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology)을 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 단백질 또는 펩타이드의 발현 수준은 웨스턴블롯 (Western blot), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 면역침전분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 유세포분석 (Fluorecence Activated Cell Sorter, FACS), 또는 단백질 칩 (protein chip)을 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 정규화된 발현 수준의 비교는, 미리 결정된 컷오프 값과 비교하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 이 경우, 상기 컷오프 값은 검사한 수치의 민감도와 1-특이도로 그려지는 곡선인 ROC 곡선 (Receiver Operation Characterstic Curve)에 따라 결정되는 것일 수 있다. 즉, 미리 준비된 파킨슨 환자의 콧물액 내의 유전자 발현 수준과 정상인의 콧물액 내의 유전자 발현 수준을 정규화한 후 이를 이용한 ROC 곡선 결과로부터 컷오프값을 미리 결정한 후, 진단하고자 하는 대상의 콧물액 내의 유전자 발현 수준의 정규화 값과 상기 미리 결정된 컷오프 값을 비교하여 파킨슨 질환의 진단을 위한 정보를 제공할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원에 따른 파킨슨 질환 진단을 위한 정보제공방법에서, 상기 파킨슨 질환 관련 유전자 발현 수준 (정규화된 발현 수준) 측정 결과를 정상군에 대한 측정 결과와 대비하여 파킨슨 질환을 진단할 수도 있고, 또는 미리 결정된 컷오프값과 대비하여 진단할 수도 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 파킨의 정규화된 발현 수준이 컷오프값에 비해 낮은 경우 파킨슨 질환이 있는 것으로 판단할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 파킨의 정규화된 발현에 있어서 컷오프값이 0.65일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, AIMP2의 정규화된 발현 수준이 컷오프값에 비해 높은 경우 파킨슨 질환이 있는 것으로 판단할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 파킨의 AIMP2의 정규화된 발현에 있어서 컷오프값이 1.9일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원은 파킨슨 질환의 신규 조기진단법에 관한 것으로서 콧물액으로부터 전사체를 분석함으로써 파킨슨 질환의 진단이 가능함을 최초로 제시하였다. 또한 여러 파킨슨 질환 관련 유전자 중 파킨 및 AIMP2가 파킨슨 질환 특이적인 바이오 마커로 유용하게 활용될 수 있음을 제시한 것이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[
실시예
]
1.
콧물액
세포에서의 전체
전사체
정제 및 cDNA 합성
콧물액 세포로부터 검출가능한 수준의 전사체를 정제할 수 있는지에 대한 확인 실험이 먼저 수행되었다 (도 1a). 사람의 비강 세척액의 세포 펠렛에 대해서 QIAzol을 이용하여 총 RNA를 정제하였다. 미량의 콧물 RNA를 온전히 분리하기 위해서 이스트 tRNA를 캐리어로 첨가하여 정제를 진행하였다. 분리된 RNA로부터 cDNA 라이브러리를 합성 후, GAPDH에 대한 프라이머쌍을 이용해 PCR을 수행한 결과, cDNA 라이브러리 특이적인 PCR 산물이 합성되는 것을 아가로즈 젤에서 확인할 수 있었다 (도 1b). 신경아세포종(neuroblastoma) 세포주인 SH-SY5Y에서의 정제 RNA에서 합성한 cDNA 라이브러리와 비교 결과, 소량이지만 PCR에서 검출 가능한 GAPDH 전사체가 존재함을 증명할 수 있었다.
2.
RTQ
PCR을
통한
타겟
유전자의 정량
정상군과 파킨슨 환자의 콧물액에 대해서 cDNA 라이브러리를 합성한 후, 파킨슨 질환 연계 유전자들 (α-시뉴클레인, c-Abl, RNF146, OMP, AIMP2, 파킨(Parkin) 및 ZNF746 (PARIS))에 대해서 특이적인 프라이머쌍을 디자인하여 RTQ PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머의 정보는 표 1 및 서열목록에 나타나 있으며, RTQ PCR 수행 조건이 도 2에 나타나 있다. 구체적으로, 도 2 하단의 표와 같은 조성을 가지는 샘플에 대해서, 도 2 상단에 나타난 프로토콜로 RTQ PCR을 42 사이클 수행하였다. SYBR 그린의 형광은 매 증폭 단계에서 측정하였으며, PCR 산물의 선택성을 확인하기 위해 용융 곡선 단계 (melt curve stage)에서 목적 유전자의 앰플리콘에 대해 피크를 확인하였다.
| 유전자 | 프라이머 방향 | 서열 | |
| 1 | c-Abl | Forward | CATCACGCCAGTCAACAGTCT (서열번호 1) |
| Reverse | GTACACCCTCCCTTCGTATCT (서열번호 2) | ||
| 2 | α-시뉴클레인 | Forward | AAGAGGGTGTTCTCTATGTAGGC (서열번호 3) |
| Reverse | GCTCCTCCAACATTTGTCACTT (서열번호 4) | ||
| 3 | AIMP2 | Forward | AGGTAAAGCCCTATCACGGG (서열번호 5) |
| Reverse | ACAGGTTAGACTCTTCCTGCA (서열번호 6) | ||
| 4 | 파킨 | Forward | CAGCAGTATGGTGCAGCGGA (서열번호 7) |
| Reverse | TCAAATACGGCACTGCACTC (서열번호 8) | ||
| 5 | PARIS | Forward | GCTGGAATTTCCGGTGTAAACC (서열번호 9) |
| Reverse | GGGGTCCAAGATGGCCTCT (서열번호 10) | ||
| 6 | RNF146 | Forward | ATTCCCGAGGATTTCCTTGACA (서열번호 11) |
| Reverse | GCTCATCGTACTGCCACCA (서열번호 12) | ||
| 7 | OMP | Forward | TACCGCCTCAACTTCACCCA (서열번호 13) |
| Reverse | CCTCCTTGCGCCAGAAGATG (서열번호 14) | ||
| 8 | GAPDH | Forward | AAACCCATCACCATCTTCCAG (서열번호 15) |
| Reverse | AGGGGCCATCCACAGTCTTCT (서열번호 16) |
정상군 및 파킨슨 환자 콧물액 cDNA 라이브러리에 대한 PCR 산물의 앰플리콘이 타겟 유전자들에 대해서 메인 피크가 하나로 잡혔으므로, 콧물액 라이브러리에 대한 PCR이 성공적으로 수행되었음을 확인할 수 있었다.
정상군 (CTRL)과 파킨슨 환자 (IPD)의 콧물에서의 각 유전체의 정량값을 내부 로딩 대조군(internal loading control)으로 사용된 GAPDH의 정량값으로 정규화하여 각 군에서의 타겟 유전자들의 상대적인 양을 확인하였다. 도 4a는 α-시뉴클레인 (SNCA), c-Abl (cAbl) 및 RNF146, 도 4b는 OMP와 AIMP2, 그리고 도 4c는 파킨 (PK)와 PARIS의 상대적인 전사체 양을 보여준다. 유의성 검사를 위해 독립표본 양측 스튜던트 t 검정 (unpaired two-tailed student t test)을 수행하였다 (*P < 0.05, **P < 0.01, *** P < 0.001, n.s = 유의성 없음). 각 유전자에 대한 정량값은 GAPDH의 발현량으로 정규화한 후 각 군에서의 상대적인 값으로 계산하였다. 각각의 실험에 대해서 실험에 사용된 샘플수는 도 4d에 나타나 있다. α-시뉴클레인, c-Abl, RNF146 및 파킨의 경우 파킨슨 환자의 콧물에서 유의적인 양적 감소를 보였으며, OMP와 AIMP2는 증가하는 양상을 보였다 (도 4a 내지 4c). 신기하게도, RNF146, AIMP2 및 파킨의 경우 정상군에서 샘플간의 변동이 적었으며 (도 4b 및 4c), 특히 AIMP2와 파킨은 높은 신뢰 수준에서 유의성을 가지고 파킨슨 질환 환자의 콧물액에서 양이 변화하는 것으로 나타났다.
파킨과 AIMP2는 파킨슨 질환 병리와 연계성을 가진 유전자로 알려져 있다. 파킨은 기질 단백질의 유비퀴틴화 표지 및 프로테아좀을 통한 분해를 매개하는 E3 리가아제 효소로서 이 유전자의 돌연변이는 파킨의 효소 활성을 저해함으로써 파킨슨 질환의 열성 유전을 유발한다고 알려져 있다. 파킨의 돌연변이뿐만 아니라 니트로실화(nitrosylation), 인산화, 및 용해성의 감소 또한 산발성 파킨슨 질환 병리에 관여되는 것으로 보고되었다. 파킨슨 질환과 비강 세척액에서의 파킨 전사체의 감소 연계성에 대해서는 이전에 보고된 바 없다. AIMP2은 파킨에 의해서 조절되는 독성 단백질로서, 정상 상태에서는 낮은 수준으로 존재하지만 파킨의 돌연변이나 효소 활성 저하 상황에서 양적인 축적이 나타나는 것으로 파킨슨 환자의 중뇌 조직 부검을 통해 보고된 바 있다. 특히 동물실험을 통해서 밝혀진 바에 따르면, AIMP2의 축적이 도파민 신경세포의 사멸을 포함한 파킨슨 질환의 주요 병변을 유발하는데 중요한 병리적 역할을 한다. 그러나 마찬가지로 파킨슨 질환 환자의 비강 세척액에서의 AIMP2 전사체의 변화 및 질병 연계성 역시 이전에 보고된 바 없다. 따라서, 본원은 콧물액 내의 파킨 전사체의 감소 및 AIMP2 전사체의 증가는 파킨슨 질환으로의 발전에 대한 위험인자로서 조기 진단 마커로서 활용될 수 있음을 최초로 확인하였다.
특히, ROC 곡선으로부터 계산된 정규화된 유전자 발현 수준의 컷오프값은 파킨 (역수화 수치)의 경우 약 0.654918이었고, 이 경우 민감도가 약 91%, 특이도가 약 87%로 계산되었다. AIMP2의 경우 컷오프값이 약 1.9472, 민감도가 약 82%, 특이도가 약 71%로 계산되었다. 따라서, 상기 컷오프값들을 이용한 콧물액 내의 파킨 및 AIMP2 전사체의 정량이 파킨슨 질환의 조기 진단을 위한 정확하고 유용한 수단이 될 것으로 기대된다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY
<120> METHOD FOR DIAGNOSING PARKINSONS DISEASE USING NASAL MUCUS,
COMPOSITION THEREFORE AND KIT COMPRISING THE SAME
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<160> 16
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Abl F
<400> 1
catcacgcca gtcaacagtc t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Abl R
<400> 2
gtacaccctc ccttcgtatc t 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a-synuclein F
<400> 3
aagagggtgt tctctatgta ggc 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a-synuclein R
<400> 4
gctcctccaa catttgtcac tt 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AIMP2 F
<400> 5
aggtaaagcc ctatcacggg 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AIMP2 R
<400> 6
acaggttaga ctcttcctgc a 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Parkin F
<400> 7
cagcagtatg gtgcagcgga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Parkin R
<400> 8
tcaaatacgg cactgcactc 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PARIS F
<400> 9
gctggaattt ccggtgtaaa cc 22
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PARIS R
<400> 10
ggggtccaag atggcctct 19
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<211> 22
<212> DNA
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<220>
<223> RNF146 F
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attcccgagg atttccttga ca 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNF146 R
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gctcatcgta ctgccacca 19
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OMP F
<400> 13
taccgcctca acttcaccca 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OMP R
<400> 14
cctccttgcg ccagaagatg 20
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<211> 21
<212> DNA
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aaacccatca ccatcttcca g 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH R
<400> 16
aggggccatc cacagtcttc t 21
Claims (14)
- 분리된 콧물액에서 파킨슨 질환 관련 α-시뉴클레인 (SNCA), 파킨 (parkin), RNF146, OMP, c-Abl 및 AIMP2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 유전자의 전사체 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 파킨슨 질환 진단용 조성물.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 유전자의 전사체 발현 수준을 측정하기 위한 제제는 파킨슨 질환 관련 유전자의 핵산 서열 또는 이에 대응하는 서열에 결합하는 핵산 프라이머를 포함하는 것인, 조성물.
- 제 1 항의 조성물을 포함하는, 파킨슨 질환 진단용 키트.
- 파킨슨 질환 의심 환자로부터 콧물액을 분리하고;
상기 콧물액 내의 세포로부터 파킨슨 질환 관련 α-시뉴클레인 (SNCA), 파킨 (parkin), RNF146, OMP, c-Abl 및 AIMP2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 유전자 전사체의 발현 수준을 측정하고, 이를 표준 유전자의 발현에 대해 정규화시키고;
정규화된 발현 수준을, 정상인에 대해 측정되고 정규화된 발현 수준과 비교하는 것을 포함하는, 파킨슨 질환 진단을 위한 정보제공방법.
- 삭제
- 제 5 항에 있어서,
상기 표준 유전자는 GAPDH인, 정보제공방법.
- 제 5 항에 있어서,
상기 유전자의 발현 수준은 역전사효소 중합반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응 (competitive RT-PCR), 실시간 역전사 효소 중합효소반응 (real time quantitative RT-PCR), 정량적 중합효소반응 (quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology)을 이용하여 측정되는 것인, 정보제공방법.
- 삭제
- 제 5 항에 있어서,
상기 정보제공방법은 정규화된 발현 수준과 비교는, 미리 결정된 컷오프 값과 비교하는 것인, 정보제공방법.
- 제 10 항에 있어서,
상기 정보제공방법은 파킨의 정규화된 발현 수준이 컷오프값에 비해 낮은 경우 파킨슨 질환이 있는 것으로 판단하는 것인, 정보제공방법.
- 제 10 항에 있어서,
상기 정보제공방법은 파킨의 정규화된 발현에 있어서 컷오프값이 0.65인, 정보제공방법.
- 제 10 항에 있어서,
상기 정보제공방법은 AIMP2의 정규화된 발현 수준이 컷오프값에 비해 높은 경우 파킨슨 질환이 있는 것으로 판단하는 것인, 정보제공방법.
- 제 10 항에 있어서,
상기 정보제공방법은 파킨의 AIMP2의 정규화된 발현에 있어서 컷오프값이 1.9인, 정보제공방법.
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