CN106995936A

CN106995936A - 一种癫痫脑病基因芯片及其应用

Info

Publication number: CN106995936A
Application number: CN201710349685.4A
Authority: CN
Inventors: 尹飞; 彭镜; 邓小鹿; 何芳; 陈晨; 盖楠; 王颖; 马玉平; 张文; 彭盼
Original assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2017-05-17
Filing date: 2017-05-17
Publication date: 2017-08-01
Anticipated expiration: 2037-05-17
Also published as: CN106995936B

Abstract

本发明公开了一种癫痫脑病基因芯片，所述基因芯片包括针对如下基因的探针：ABCC8、NOTCH3、SCN1A、GCK、TSC2、GALNS、NPC1、MECP2、NF1。在一个实施方案中，所述探针的序列为SEQ ID NO.1‑79。本发明是基因芯片可以实现对癫痫脑病的基因检测。

Description

一种癫痫脑病基因芯片及其应用

技术领域

本发明属于遗传病检测领域，特别涉及癫痫脑病的检测，特别是一种癫痫脑病基因芯片及其应用。

背景技术

早期癫痫性脑病是指在新生儿期或婴儿期出现持续的癫痫性活动(包括临床频繁的癫痫发作以及发作间期脑电持续的痫性放电)，从而导致认知、运动全面发育落后，智力低下，自闭症等灾难性的神经系统后遗症。由于病因复杂、发病机制不明，导致医师盲目换药，患者四处求医。如何明确这些患儿的病因、识别早期疾病预警标志、提供精准治疗也成为了困扰临床医师的棘手问题，是目前临床亟待解决的重要问题。

癫痫虽可继发于各种脑损伤，但超过50％的癫痫是存在遗传基础的，甚至获得性癫痫也被认为与遗传因素相关。对癫痫和癫痫脑病的遗传学研究层出不穷，积累了大量遗传学数据。同时遗传学知识的运用，也改变了癫痫的传统诊断模式。

随着高通量测序技术的发展与成熟，人类全基因组测序已经成为遗传相关致病基因突变研究和诊断的重要工具。通过全基因组测序对被测样本进行全基因组扫描，可实现对基因突变零遗漏，从而成为遗传代谢病相关致病基因突变研究和诊断的有效工具。

由于人类基因组的大小约为3Gb，对其进行全基因组测序总计约需90Gb测序数据。巨大的数据量要求所致高昂的测序成本，导致全基因组测序应用遗传代谢病的基因诊断收到限制。全基因组测序需要产生大量的测序数据量，测序成本高，因此测序深度不大可能太深。对于检查基因突变而言，想要实现突变检查的零遗漏，全基因组测序确实难以担当此任。特别是对于，一次检测数百个基因上发生的所有突变，高深度测序才能实现对突变检测的准确性。

全基因组测序需要产生大量的测序数据量，测序成本高，因此测序深度不可能太深。对于检查基因突变而言，想要实现突变检查的零遗漏，全基因组测序确实难以担当此任。特别是对于，一次检测数百个基因上发生的所有突变，高深度测序才能实现对突变检测的准确性。

因此，开发一款价格低廉的，准确性高的基因突变检查产品，特别是对于癫痫脑病基因突变的诊断产品，具有重要的意义。

发明内容

本发明人经过对大量临床病人的基因组数据进行分析，提供了一组基因探针，通过包括这些基因探针的基因芯片，实现对癫痫脑病的基因检测。

因此，在第一方面，本发明提供了一种癫痫脑病基因芯片，所述基因芯片包括针对如下基因的探针：ABCC8、NOTCH3、SCN1A、GCK、TSC2、GALNS、NPC1、MECP2、NF1。

ABCC8突变位点为：c.892C>T、c.4532T>C、c.3593C>T和c.382G>A；NOTCH3突变位点为：c.5764G>T、c.2129A>G、c.1759C>T、c.1630C>T、c.734G>A、c.434C>G和c.199T>G；SCN1A突变位点为：c.4246G>A、c.4764T>G、c.4450G>A、c.3138T>G、c.2791C>T、c.1834C>T和c.1072C>T；GCK突变位点为：c.716A>G；TSC2突变位点为：c.5051G>A、c.1093A>G、c.1096G>A和c.5027G>A；GALNS突变位点为：c.1485C>G；NPC1突变位点为：c.1301C>T；MECP2突变位点为：c.844C>T、c.799C>T和c.383C>G；NF1突变位点为：c.2554C>T和c.6611G>A。

在一个实施方案中，检测这些突变位点的探针包括SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.37、SEQ IDNO.34、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.53、SEQ IDNO.60、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.72、SEQ IDNO.68、SEQ ID NO.75和SEQ ID NO.78。

在一个实施方案中，检测这些突变位点的探针分别包括选自如下各组的1-3个探针：SEQ ID NO.7-9、SEQ ID NO.1-3、SEQ ID NO.4-6、SEQ ID NO.10-12、SEQ ID NO.13-15、SEQ ID NO.22-24、SEQ ID NO.16-18、SEQ ID NO.19-21、SEQ ID NO.25-27、SEQ ID NO.28-30、SEQ ID NO.31-33、SEQ ID NO.39-40、SEQ ID NO.36-38、SEQ ID NO.34-35、SEQ IDNO.46-48、SEQ ID NO.41-42、SEQ ID NO.43-45、SEQ ID NO.49-51、SEQ ID NO.52-53、SEQID NO.59-61、SEQ ID NO.54-56、SEQ ID NO.55-57、SEQ ID NO.58-60、SEQ ID NO.62-64、SEQ ID NO.65-67、SEQ ID NO.70-72、SEQ ID NO.68-69、SEQ ID NO.74-76和SEQ IDNO.77-79。在优选的实施方案中，检测这些突变位点的探针分别还包括这样的探针，即上述探针的位点被突变碱基替换的探针。

在一个实施方案中，所述基因芯片包括针对如下基因的探针：NF1、SCN1A、TSC2、MECP2、GCK、SCN5A、CHD7、IDS、ABCC8、PTEN、HNF1A、NSD1、HPRT1、SLC12A3、PAX6、NPC1、ATP7A、NIPBL、PTCH1、OPA1、TSC1、L1CAM、CASR、NOTCH3、PLP1、CREBBP、WFS1、RS1、GALNS和POLG。

在一个实施方案中，所述基因芯片包括针对表1中列出的基因的探针。

在第二方面，本发明提供了一种利用基因芯片筛查受试者基因突变的方法，所述方法包括：

1)提取所述受试者的基因组DNA，或者提取所述受试者的RNA，反转录成cDNA；

2)将所述DNA或cDNA打断至200-300bp的范围；

3)对上述打碎的基因组DNA进行DNA小片段文库的制备；

4)将DNA小片段文库和本发明第一方面的基因芯片进行杂交，检测基因突变。

在一个实施方案中，在步骤2)中采用illumina TruSeq DNA librarypreparation试剂盒，进行DNA小片段文库的制备。

在第三方面中，本发明还提供了本发明第一方面的基因芯片用于检测癫痫脑病的用途。

本发明的方法和基因芯片至少有如下优点：

相对于全基因组测序，大大节约了所需要的测序数据量；

一次性检测疾病相关致病基因的大多数突变，平衡了性价比，为疾病的治疗和干预提供保障。

具体实施方式

通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。

基因芯片是近几年在高科技领域出现的重大科技进展之一，其主要原理是将能反应样本中大量基因信息的基因探针以一定顺序和密度固定在载体上形成阵列，与实际样本进行杂交反应，通过杂交信号分析可高通量获得所有待检基因的信息。该技术以其高通量、快速、准确性高等优点为癫痫遗传学诊断提供一条新的解决途径，对患儿的临床治疗、预后评估具有重要作用。

在本发明中，人类参考基因组是HG19。

在本发明中，采用本领域通用表示法表示突变。例如，突变(c.1072C>T；p.P358S)中，c表示cDNA，p表示蛋白质，DNA水平的突变对应蛋白质水平的突变。

对于本发明说明书和权利要求书中，提及基因序列，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如提及一条探针序列，实际上包括该序列以及其互补序列。例如，提及SEQ IDNO:1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及一条探针序列，实际也包括相应的RNA序列。

发明人近几年在临床研究中积累了近2000例癫痫脑病例的外显子组序列得测序数据，原始测序片段(reads)由Illumina basecalling Software 1.7进行处理，经过过滤去污染、使用SOAPaligner 2.20(Li R,Li Y,Kristiansen K,et al,SOAP:shortoligonucleotide alignment program.Bioinformatics 2008,24(5):713-714；Li R,YuC,LiY,et al,SOAP2:an improved ultrafast tool for short readalignment.Bioinformatics 2009,25(15):1966-1967)比对参考基因组，获得比对到基因组上的唯一匹配测序片段。靶区域的基因型由SOAPsnp(Li R,Li Y,FangX,Yang H,et al,SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing.Genome Res2009,19(6):1124-1132)确定。随后，对结果通过四个公共数据库(dbSNP(v131):http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp131.txt.gz.；1000人：ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp或ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp；hapmap:ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap；以及YH数据库:http://yh.genomics.org.cn)进行过滤，去掉所有已知与癫痫脑病无关的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异。

结果发现，癫痫脑病例与如下表1中列出的基因的有关：

根据表1中列出的基因设计针对这些基因的检测探针，通过包括所述探针的基因芯片可以检测95％的癫痫脑病例。

为了简化本发明的基因芯片，综合考虑探针成本和检出率的性价比对所述基因芯片包括的探针进行优化，所述基因芯片包括针对如下基因的探针可以检测83％的癫痫脑病例：NF1、SCN1A、TSC2、MECP2、GCK、SCN5A、CHD7、IDS、ABCC8、PTEN、HNF1A、NSD1、HPRT1、SLC12A3、PAX6、NPC1、ATP7A、NIPBL、PTCH1、OPA1、TSC1、L1CAM、CASR、NOTCH3、PLP1、CREBBP、WFS1、RS1、GALNS和POLG。

为了简化本发明的基因芯片，进一步考虑探针成本和检出率的性价比对所述基因芯片包括的探针进行优化，所述基因芯片包括针对如下基因的探针可以检测69％的癫痫脑病例：ABCC8、NOTCH3、SCN1A、GCK、TSC2、GALNS、NPC1、MECP2、NF1。

所述基因的突变位点1-30及其在染色体上的位置如下表2中所示。

突变1-30对应的探针列对应染色体上的位置表如下表3中所示：

在本实施例中，针对所述基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为120bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3。对于所述探针序列的长度，大于120bp会带来合成上的困难，小于110bp一是其捕获能力降低，二是会增加探针数量，从而增加成本，二者平衡非常重要，发明人经过不断试验，得到了120bp的较优值。对于所述探针在每两个相邻的探针序列之间的重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3，这是因为会对每一个区域都形成2层或者3层的探针覆盖，因此探针覆盖均匀，进而不影响捕获的均一性，而探针覆盖不均匀会影响到捕获的均一性。因此，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3。在所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2的情况下，优选探针长度是偶数；在所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的2/3的情况下，优选探针长度是3的整倍数。但是，在探针长度不是偶数或3的整倍数的情况下，所述重叠取所述探针长度1/2或2/3的近似整数也是可以的，虽然其效果不如探针长度是偶数或3的整倍数的情况。

将针对所述基因的探针和探针SEQ ID NO.1-79通过商业基因芯片公司制备基因芯片，每个探针序列进行三次重复。检测表2中所示突变位点的探针分别还包括这样的探针，即上述探针的位点被突变碱基替换的探针。

实施例

以Affymetrix HG U133A芯片平台各检测了684名患者和700正常对照样本的基因表达对本发明的基因芯片进行测试。基因芯片设计和测试由艾吉泰康(北京)生物技术有限公司进行。

第1步：RNA的抽提。

按照制造商提供的说明书，使用QIAGEN’s RNeasy Total RNA Isolation kit抽提800名患者和800正常人外周静脉血的总RNA；使用QIAGEN’s Oligotex Direct mRNA kit从总RNA中抽提mRNA。

第2步：RNA沉淀。

用QIAGEN’s RNeasy Total RNA Isolation kit分离或洗涤后没有必要沉淀总RNA。调整洗脱体积以制备cDNA合成接近希望的RNA浓度。大多数Poly(A)⁺mRNA分离过程都会导致得到较稀的RNA，所以需要在cDNA合成前浓缩mRNA。TRIzol分离和热酚提取后需要乙醇沉淀：1)加1/10体积3M NaOAc,pH5.2,和2.5倍体积乙醇；2)混匀，-20℃放置最少1小时；3)4℃，≥12000×g离心20分钟；4)80％乙醇洗涤沉淀2次；5)空气干燥沉淀；6)DEPC(焦磷酸二异质)处理水重新溶解沉淀。最合适的溶解体积由cDNA合成中需要的RNA的浓度和量来决定。RNA测定，用分光光度计分析RNA浓度，在260nm下以1单位吸光度等于40μg/ml RNA，需要在260nm和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度，A₂₆₀/A₂₈₀应接近2.0为较纯的RNA(即比值在1.9-2.1)。

第3步：由纯化的总RNA合成双链cDNA。

HPLC纯化T7-(d7)₂₄引物；

1)第一链cDNA合成，cDNA合成前，DEPC处理水和逆转录的正确体积必须确定。它由加到反应中的RNA浓度和总体积决定。

RNA和SuperScriptⅡRT体积不要超过12μl。

合成反应可在1.5ml离心管中进行(RNase-free)，按下列组分合成cDNA。

2)第二链cDNA合成。第一链反应放置冰上，稍微离心甩下管壁试剂，在第一链合成的管中加入下列第二链反应试剂，混匀。

≥12000g离心10分钟，16℃放置2小时加2μl 10U T4 DNA聚合物16℃放置5分钟，加10μl 0.5M EDTA继续纯化cDNA步骤或-20℃储存。

3)纯化双链cDNA。Phase Lock Gels(PLG)-酚/氯仿提取，≥12000g离心PLG管20-30秒，离下管壁PLG；加162μl(等体积)的(25：24：1)酚：氯仿：异戊醇(10mM Tris-HCLpH8.0,1mM EDTA饱和)到cDNA最后合成产物中(162μl)，最后体积到324μl，混匀，≥12000g离心10分钟；转移上清液至PLG管，不要混合，PLG会混入溶液中；≥12000g离心2分钟；转移上层水相到一个新的1.5ml离心管中；加0.5倍体积7.5M NH₄OA_C和2.5倍体积乙醇(-20℃储存)到样品中，混匀；立即在室温下≥12000g离心20分钟；去上清，0.5ml 80％乙醇(-20℃储存)洗涤沉淀，在室温下≥12000g离心5分钟；小心去掉80％乙醇，80％乙醇再洗涤一次；空气干燥沉淀，检查是否干燥，Rnase-free水重新溶解沉淀。

第4步：生物素标记cDNA合成。

利用BioArray High Yield RNA Transcript Labeling kit进行cDNA标记，cDNA体外转录产物(总RNA)如下表。

cDNA体外转录成分如下，37℃，4.5小时，600rpm振荡10秒/35分种。

第5步：纯化和质控体外转录(IVT)产物。

QIAGEN RNeasy Columns纯化体外转录产物，洗涤和洗脱之前将样品过柱两次；洗脱RNA时加水到柱子后，静置一分钟，再离心。cDNA质控，用分光光度计分析RNA浓度，A₂₆₀/A₂₈₀应接近2.0为较纯的RNA(即比值在1.9-2.1)。根据下面的计算公式确定调整cRNA的含量：

cRNA含量＝RNA_m-(总RNA_i)(y)

RNA_m＝体外转录后测得cRNA量(μg)

总RNA_i＝开始总RNA的量(μg)

y＝在IVT过程中使用的cDNA的倍数

凝胶电泳检测样品，同时进行纯化和没有纯化的体外转录产物的凝胶电泳有助于检测纯化过程丢失的范围，0.1％琼酯糖凝胶电泳分析0.1％的样品，RNA和溴化乙锭混合，加热到65℃，5分钟。

第6步：片段化cDNA。

在新的1.5ml RNase-free离心管中按下表加入样品，

94℃，35分钟。然后放置冰上。变性凝胶电泳，至少需要1μg cRNA。-20℃储存样品。

第7步：杂交。在新的1.5mL RNase-free离心管中按下表加入样品，

20×真核生物杂交控制试剂冻存，在使用前在65℃下5分钟。使用前室温平衡探针；在99℃下5分钟；通过加样孔加入适量体积1×杂交缓冲液湿润芯片；在45℃下60rpm预杂交芯片10分钟；处理过的样品45℃，5分钟；最大速离心5分钟；从芯片中取出缓冲液，加等体积处理好的杂交液45℃，60rpm杂交芯片16小时。

第8步：洗脱和染色。

杂交16小时后，从芯片中取出杂交液装入一个新的离心管，放置冰上或-80℃长时间保存；洗脱缓冲液A充满芯片；配制下列溶液：SAPE液(使用前配制，4℃储存)

抗体溶液

洗脱工作站按下表工作。

第9步：扫描。

采用GeneChip Scanner 3000 7G扫描芯片，并进行芯片的图像分析处理。

结果表明，根据表1中列出的基因设计针对这些基因的检测探针，通过包括所述探针的基因芯片可以检测95％的癫痫脑病例。

为了简化本发明的基因芯片，进一步考虑探针成本和检出率的性价比对所述基因芯片包括的探针进行优化，所述基因芯片包括针对如下基因的探针可以检测69％的癫痫脑病例：ABCC8、NOTCH3、SCN1A、GCK、TSC2、GALNS、NPC1、MECP2、NF1，即探针SEQ ID NO.1-79。

对于表3中列出的30个突变，为了达到最少28个探针有效检测突变的目的，发明人对针对这些突变位点可以设计出的探针SEQ ID NO.1-79进行了测试，发现SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.40、SEQ IDNO.37、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.50、SEQ IDNO.53、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.66、SEQ IDNO.72、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.75和SEQ ID NO.78可以最大实现癫痫脑病患者和正常对照的区分达到65％。所有探针SEQ ID NO.1-79可以检测69％的癫痫脑病例。

虽然已经结合优选实施例对本发明进行了描述，但应当理解本发明的保护范围并不局限于这里所描述的实施例。结合这里披露的本发明的说明和实践，本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真正范围和主旨均由权利要求所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大学湘雅医院

<120> 一种癫痫脑病基因芯片及其应用

<130> CP20170522

<160> 79

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttctcccta gcatcccact aaaccctttc caagaccatg gtcccatgga ggggcccagg 60

accaaccgtg gccatgtcaa tggaagccgt ggcctcgtcc 100

<210> 2

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaccatggtc ccatggaggg gcccaggacc aaccgtggcc atgtcaatgg aagccgtggc 60

ctcgtccatg atgaagatgc tggtcttcct cacgaaggcc 100

<210> 3

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgtggccatg tcaatggaag ccgtggcctc gtccatgatg aagatgctgg tcttcctcac 60

gaaggcccgg gccaggcaga acagctgcct ctgtccctgg 100

<210> 4

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgggggaatg tggactcgta cctgaaggcc cggatggtgg tgagtccttc tacggtttcg 60

gcaaagtgtg agagaagtgg aagctgggtg gtgtcatcca 100

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggtggtga gtccttctac ggtttcggca aagtgtgaga gaagtggaag ctgggtggtg 60

tcatccagct gctgcaggtc cctgtggcgg ggaacagagt 100

<210> 6

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

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tgtgagagaa gtggaagctg ggtggtgtca tccagctgct gcaggtccct gtggcgggga 60

acagagtgga acagttaaga gggcaggctc agggctcggc 100

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<212> DNA

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cccaaggtgg tccacgatcc caaagatgca cagtggcccg gcgaagccca gcaggtcggc 60

caagatgcgg aaagtgctgc tgaggaccag gcgcctcccg 100

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<213> 人工序列

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tggcccggcg aagcccagca ggtcggccaa gatgcggaaa gtgctgctga ggaccaggcg 60

cctcccgaag gcatggctga gtgcctgcca gatggcccgg 100

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<213> 人工序列

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gcggaaagtg ctgctgagga ccaggcgcct cccgaaggca tggctgagtg cctgccagat 60

ggcccgggca ccttgagtgc cctgaatgtc cttccgctgc 100

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<213> 人工序列

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gaatgaaggt actgcccctc cctcctacac ctcacctacc aattagcagc ttggggaagt 60

tggaagtctc gatgttgtga tagtagacca cggaggtgac 100

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<213> 人工序列

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acctaccaat tagcagcttg gggaagttgg aagtctcgat gttgtgatag tagaccacgg 60

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<213> 人工序列

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tctcgatgtt gtgatagtag accacggagg tgacagcagc catgaacgcc atcccggctg 60

gcatgtacag gtgcagatgg tgggattcgg tcaccctgag 100

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<213> 人工序列

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gtgacaccaa cccagcttag acttgattcc tctgccaacc taccaagctc atccacagca 60

ttgacatcag catggctggc gatgagctct tccaccatgc 100

<210> 14

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<213> 人工序列

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gccaacctac caagctcatc cacagcattg acatcagcat ggctggcgat gagctcttcc 60

accatgccct ctactgccag gcgggccgcc aggatcagtg 100

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tcagcatggc tggcgatgag ctcttccacc atgccctcta ctgccaggcg ggccgccagg 60

atcagtgccg ttgagccatc tgccatgcgg gcatccaagt 100

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ctgtggtccc agaagggcag cggcagaggt acttgtccac caggtctagg catttgccgc 60

catggcggca gggctggctg cggcattcgt ccacctggct 100

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<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgtccaccag gtctaggcat ttgccgccat ggcggcaggg ctggctgcgg cattcgtcca 60

cctggctctc gcagcgtgtg cccgtgtagc caggagcaca 100

<210> 18

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggcagggctg gctgcggcat tcgtccacct ggctctcgca gcgtgtgccc gtgtagccag 60

gagcacaggc acatgagaag ctggcgatgc catccacgca 100

<210> 19

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

aggcacatga gaagctggcg atgccatcca cgcagcgacc atggtggcat gggtcagggg 60

agcagtcgtc cacgttgcga tcacacagcg tgccctcaaa 100

<210> 20

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

agcgaccatg gtggcatggg tcaggggagc agtcgtccac gttgcgatca cacagcgtgc 60

cctcaaagcc tgtggggcca agagggtcag gctccgccca 100

<210> 21

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cgtccacgtt gcgatcacac agcgtgccct caaagcctgt ggggccaaga gggtcaggct 60

ccgcccactt gccaggggcc tgcccacaag tgaggcctcg 100

<210> 22

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

caggggaagg tagtcaggcc agggaggtgg gccagggaga gggggcagtg tctgaggctg 60

agaagggccc tcacccgcca ggtgcatcat agcagatgcc 100

<210> 23

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

agggagaggg ggcagtgtct gaggctgaga agggccctca cccgccaggt gcatcatagc 60

agatgccgtg actgcagggc tcatgggcac agggatggct 100

<210> 24

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gccctcaccc gccaggtgca tcatagcaga tgccgtgact gcagggctca tgggcacagg 60

gatggctcgg ggggaggcag agtgggggca aggagccagg 100

<210> 25

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cccacctgtc cactcaggag ggcactggca gttataggtg ttgacgccat ccacgcatgt 60

ccccccattg agacatcggt gtcctggaca gtcgtccacg 100

<210> 26

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tataggtgtt gacgccatcc acgcatgtcc ccccattgag acatcggtgt cctggacagt 60

cgtccacgtt cacttcacaa ttctgaccct caaaccctag 100

<210> 27

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cattgagaca tcggtgtcct ggacagtcgt ccacgttcac ttcacaattc tgaccctcaa 60

accctagcag ggaagggggc aaggatggtc accgccgggc 100

<210> 28

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ggcagggctc acccacccgg cactcatcca cgtcgcttcg gcagctgcgg ccctggtagc 60

caggtgggca ggagcagagg aagcgtccat cgggccccac 100

<210> 29

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

cgcttcggca gctgcggccc tggtagccag gtgggcagga gcagaggaag cgtccatcgg 60

gccccactga gcagcgggca ccgtgggcac aagggctgct 100

<210> 30

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ggcaggagca gaggaagcgt ccatcgggcc ccactgagca gcgggcaccg tgggcacaag 60

ggctgctgag gcagggatct ggcagggagc agtcagggcc 100

<210> 31

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

aactctggca gacaccacgg ccagcacagg ggcctgagtg acaggggtcc tccagctgac 60

accgctcacc cacccagcca ggcgggcacc tgtgggcaga 100

<210> 32

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ctgagtgaca ggggtcctcc agctgacacc gctcacccac ccagccaggc gggcacctgt 60

gggcagagat ggcttggttg ggcagcacag ggcaggatgg 100

<210> 33

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

cacccaccca gccaggcggg cacctgtggg cagagatggc ttggttgggc agcacagggc 60

aggatggccc cagacacaaa gatacacaca agacaggcaa 100

<210> 34

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tacttatctt ctttttctgc tggttgaaat tatctatgat gacaccaata aacaggttca 60

aggtgaagaa ggacccaaag atgatgaaaa taacaaagta 100

<210> 35

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

tctttttctg ctggttgaaa ttatctatga tgacaccaat aaacaggttc aaggtgaaga 60

aggacccaaa gatgatgaaa ataacaaagt aaagatacat 100

<210> 36

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

aatcaaaaat attccatcca atggtaaaat aataatggcg tagagagatg agtttcagta 60

cacactctcc agtaaatagc acaatgaaca ccagattgat 100

<210> 37

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

atattccatc caatggtaaa ataataatgg cgtagagaga tgagtttcag tacacactct 60

ccagtaaata gcacaatgaa caccagattg atgcgtgaca 100

<210> 38

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

agagagatga gtttcagtac acactctcca gtaaatagca caatgaacac cagattgatg 60

cgtgacaaaa tggtagtcac atattcactc tggtcatctg 100

<210> 39

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ttcagagaaa atagtgttca cttacaactt gaagcaaaga gagataccca aatcctacat 60

tatcaaagtt tactttcaca tttttccatc gagcagtctc 100

<210> 40

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gcaaagagag atacccaaat cctacattat caaagtttac tttcacattt ttccatcgag 60

cagtctcatt tctttctatt agttttaggc aatcagtatg 100

<210> 41

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

ggaaggagtg gaagaagtca ttcatgtgcc agcgtgggag ttgacaatca ctggcgatct 60

tgcagacaca atctttgtag cttttaccaa agagctgcat 100

<210> 42

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

gagtggaaga agtcattcat gtgccagcgt gggagttgac aatcactggc gatcttgcag 60

acacaatctt tgtagctttt accaaagagc tgcatgccga 100

<210> 43

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

tcttcccatt cgctggaaac actgccagca tccgggatga cctactggtc tgactcaggt 60

tgctgttgcg tctctctccg tgtcgtcggg gcacaaacaa 100

<210> 44

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

gggatgacct actggtctga ctcaggttgc tgttgcgtct ctctccgtgt cgtcggggca 60

caaacaagga atctctacgg ctctcgttat cctcaaaggt 100

<210> 45

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

tgcgtctctc tccgtgtcgt cggggcacaa acaaggaatc tctacggctc tcgttatcct 60

caaaggtgct gtgctcatca tctgcgaagt cgttctcaga 100

<210> 46

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

agtcaagatc tttcccaatt tctgctgtat gattggacat acaactgtct ttcttgttgt 60

ttagatcatc aagtggttta atttcatcta aaatcttttg 100

<210> 47

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

tggacataca actgtctttc ttgttgttta gatcatcaag tggtttaatt tcatctaaaa 60

tcttttgttt cctaatgaag gactgttgaa taaattcata 100

<210> 48

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

catcaagtgg tttaatttca tctaaaatct tttgtttcct aatgaaggac tgttgaataa 60

attcatatat ttttcttttc acataagcta ctcctttgtg 100

<210> 49

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

agaagtcctg agtcattagt cgaaacaagg acaaaaaagc ccaactgaag gtatcaaagc 60

ttgtgtagcc ataattggga tttctaccag ctttcacaca 100

<210> 50

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

aaaaagccca actgaaggta tcaaagcttg tgtagccata attgggattt ctaccagctt 60

tcacacacat atatccctct ggacattggc tgcaagtggg 100

<210> 51

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

agccataatt gggatttcta ccagctttca cacacatata tccctctgga cattggctgc 60

aagtggggta aaagaaagta ttacaagtcg ttctgctgcc 100

<210> 52

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

actcgtccag ctcgccggag tccccgaagg cgccccactc ggtattgacg cacatgcggc 60

cctcgtcccc ctccaccagc tccacattct gcatctcctc 100

<210> 53

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

tcgccggagt ccccgaaggc gccccactcg gtattgacgc acatgcggcc ctcgtccccc 60

tccaccagct ccacattctg catctcctcc atgtagcagg 100

<210> 54

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

gtggtgtcct atgagatcgt cctgtccatc accaggctca tcaagaagta taggaaggag 60

ctccaggtgg tggcgtggga cattctgctg aacatcatcg 100

<210> 55

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

aggctcatca agaagtatag gaaggagctc caggtggtgg cgtgggacat tctgctgaac 60

atcatcgaac ggctccttca gcagctccag gtggggtggg 100

<210> 56

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

gtggtggcgt gggacattct gctgaacatc atcgaacggc tccttcagca gctccaggtg 60

gggtgggggc aggagctccg gggagcaccg ggaacccaga 100

<210> 57

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

gaacggctcc ttcagcagct ccaggtgggg tgggggcagg agctccgggg agcaccggga 60

acccagacag gcaggctcgg cccactcaga agatggtacc 100

<210> 58

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

cgtccccaga tggcctcaca ggtgcatcat agccgctcca accccaccga tatctacccc 60

tccaagtgga ttgcccggct ccgccacatc aagcggctcc 100

<210> 59

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

cgctccaacc ccaccgatat ctacccctcc aagtggattg cccggctccg ccacatcaag 60

cggctccgcc agcgggtagg gaatatgggg ctccctcagc 100

<210> 60

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

tggattgccc ggctccgcca catcaagcgg ctccgccagc gggtagggaa tatggggctc 60

cctcagcggg gtgtgctggc tgcccaagct gtggggcggg 100

<210> 61

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

cgccagcggg tagggaatat ggggctccct cagcggggtg tgctggctgc ccaagctgtg 60

gggcgggtgt gtgggcagag cggttgccac gcctcccaga 100

<210> 62

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

ccagaggcac ttcttgggaa tggattctgg aggtgtcaga cacttcccta acttttcaca 60

gcccggaggt gcccagttct gggaaatgaa aattgagaaa 100

<210> 63

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

tgtcagacac ttccctaact tttcacagcc cggaggtgcc cagttctggg aaatgaaaat 60

tgagaaaaag aacatgcagt tattcaagct cttctggacc 100

<210> 64

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

aggtgcccag ttctgggaaa tgaaaattga gaaaaagaac atgcagttat tcaagctctt 60

ctggacccag cagcagcggg cattttgttg ttgctgttct 100

<210> 65

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

aggtccaaag ggtacatcag ctcccgaagg gtatggctgg taaatgtgtt tgtcagtgag 60

aggggcccgg atgatgagct gctccgtccg gaagaaaggc 100

<210> 66

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

tggctggtaa atgtgtttgt cagtgagagg ggcccggatg atgagctgct ccgtccggaa 60

gaaaggccca aagtgctggt caaagtactc tttttccagg 100

<210> 67

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

ccggatgatg agctgctccg tccggaagaa aggcccaaag tgctggtcaa agtactcttt 60

ttccaggcga gcctggctgc tgggggctga ccagaggtca 100

<210> 68

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

agagatagga gttgctctta cttacttgat caaatacaca tcatacttcc cagcagagcg 60

gccagatttc ctttgcttaa gcttccgtgt ccagccttca 100

<210> 69

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

atacacatca tacttcccag cagagcggcc agatttcctt tgcttaagct tccgtgtcca 60

gccttcaggc agggtggggt catcatacat gggtccccgg 100

<210> 70

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

tcctgcacag atcggataga agactccttc acggctttct ttttggcctc ggcggcagcg 60

gctgccacca cactccccgg ctttcggccc cgtttcttgg 100

<210> 71

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

gctttctttt tggcctcggc ggcagcggct gccaccacac tccccggctt tcggccccgt 60

ttcttgggaa tggcctgagg gtcggcctca gcttttcgct 100

<210> 72

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

accacactcc ccggctttcg gccccgtttc ttgggaatgg cctgagggtc ggcctcagct 60

tttcgcttcc tgccggggcg tttgatcacc atgacctggg 100

<210> 73

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

ggaatggcct gagggtcggc ctcagctttt cgcttcctgc cggggcgttt gatcaccatg 60

acctgggtgg atgtggtggc cccacccccc tcagccttgc 100

<210> 74

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

gatttgtctg acacagactc cctacaggaa tggatcaaca tgactggctt cctttgtgcc 60

cttgggggag tgtgcctcca gcagagaagc aattctggcc 100

<210> 75

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

atcaacatga ctggcttcct ttgtgccctt gggggagtgt gcctccagca gagaagcaat 60

tctggcctgg caacctatag cccacccatg ggtccagtca 100

<210> 76

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

ggagtgtgcc tccagcagag aagcaattct ggcctggcaa cctatagccc acccatgggt 60

ccagtcagtg aacgtaaggg ttctatgatt tcagtgatgt 100

<210> 77

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

atgtacaata tgtattcaga gtatcccctt ttttaggcat gcatgagaga tattccaacg 60

tgcaagtggc tggaccagtg gacagaacta gctcaaaggt 100

<210> 78

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

taggcatgca tgagagatat tccaacgtgc aagtggctgg accagtggac agaactagct 60

caaaggtatg tcctaaatta aatataagtt gtaaaaatat 100

<210> 79

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

tggctggacc agtggacaga actagctcaa aggtatgtcc taaattaaat ataagttgta 60

aaaatatgca tattgttgaa aatacagcta ttactgtatg 100

Claims

1.一种癫痫脑病基因芯片，所述基因芯片包括针对如下基因的探针：ABCC8、NOTCH3、SCN1A、GCK、TSC2、GALNS、NPC1、MECP2、NF1。

2.根据权利要求1的基因芯片，ABCC8突变位点为：c.892C>T、c.4532T>C、c.3593C>T和c.382G>A；NOTCH3突变位点为：c.5764G>T、c.2129A>G、c.1759C>T、c.1630C>T、c.734G>A、c.434C>G和c.199T>G；SCN1A突变位点为：c.4246G>A、c.4764T>G、c.4450G>A、c.3138T>G、c.2791C>T、c.1834C>T和c.1072C>T；GCK突变位点为：c.716A>G；TSC2突变位点为：c.5051G>A、c.1093A>G、c.1096G>A和c.5027G>A；GALNS突变位点为：c.1485C>G；NPC1突变位点为：c.1301C>T；MECP2突变位点为：c.844C>T、c.799C>T和c.383C>G；NF1突变位点为：c.2554C>T和c.6611G>A。

3.根据权利要求1的基因芯片，所述探针分别包括选自如下各组的1-3个探针：SEQ IDNO.7-9、SEQ ID NO.1-3、SEQ ID NO.4-6、SEQ ID NO.10-12、SEQ ID NO.13-15、SEQ IDNO.22-24、SEQ ID NO.16-18、SEQ ID NO.19-21、SEQ ID NO.25-27、SEQ ID NO.28-30、SEQID NO.31-33、SEQ ID NO.39-40、SEQ ID NO.36-38、SEQ ID NO.34-35、SEQ ID NO.46-48、SEQ ID NO.41-42、SEQ ID NO.43-45、SEQ ID NO.49-51、SEQ ID NO.52-53、SEQ ID NO.59-61、SEQ ID NO.54-56、SEQ ID NO.55-57、SEQ ID NO.58-60、SEQ ID NO.62-64、SEQ IDNO.65-67、SEQ ID NO.70-72、SEQ ID NO.68-69、SEQ ID NO.74-76和SEQ ID NO.77-79。

4.根据权利要求3的基因芯片，所述探针包括SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.26、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.34、SEQ IDNO.47、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.60、SEQ IDNO.56、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.68、SEQ IDNO.75和SEQ ID NO.78。

5.根据权利要求3或4的基因芯片，所述探针分别还包括这样的探针，即上述探针的位点被突变碱基替换的探针。

6.根据权利要求1的基因芯片，所述基因芯片包括针对如下基因的探针：NF1、SCN1A、TSC2、MECP2、GCK、SCN5A、CHD7、IDS、ABCC8、PTEN、HNF1A、NSD1、HPRT1、SLC12A3、PAX6、NPC1、ATP7A、NIPBL、PTCH1、OPA1、TSC1、L1CAM、CASR、NOTCH3、PLP1、CREBBP、WFS1、RS1、GALNS和POLG。

7.根据权利要求6的基因芯片，所述基因芯片包括针对表1中列出的基因的探针。

8.一种利用基因芯片筛查受试者基因突变的方法，所述方法包括：

2)将所述DNA或cDNA打断至200-300bp的范围；

3)对上述打碎的基因组DNA进行DNA小片段文库的制备；

4)将DNA小片段文库和权利要求1-7任一项的基因芯片进行杂交，检测基因突变。

9.根据权利要求8的方法，在步骤2)中采用illumina TruSeq DNAlibrarypreparation试剂盒，进行DNA小片段文库的制备。