CN101970657A - 癫痫模型非人哺乳动物 - Google Patents
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Abstract
【课题】由于以往的模型动物主要是强制性诱导痉挛发作的所谓的痉挛模型动物,旨在提供癫痫的真模型动物,及可容易识别重组体的方法。【解决方案】本发明的癫痫模型非人哺乳动物是与人癫痫的基因异常具有相同的基因异常的大鼠等的人癫痫模型非人哺乳动物,是向与人常染色体显性夜间性额叶癫痫相关联的神经元烟碱乙酰胆碱受体α4亚基(CHRNA4)基因或β2亚基(CHRNB2)基因的非人哺乳动物的DNA中导入作为基因异常的基因突变,且具有导入特定探针得到的突变基因。此外,本发明的癫痫模型非人哺乳动物可容易识别其重组体。
Description
技术领域
本发明涉及癫痫模型非人哺乳动物。更具体而言、本发明涉及具有同源于与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的基因的基因异常、自然发症癫痫发作的癫痫模型非人哺乳动物。另外,本发明涉及使基因重组个体识别容易地可能的突变基因、其构建方法及其识别方法。
背景技术
癫痫是约2%日本国民患病的比较多的神经疾病,其分子生物学成因长期不明。其原因是因为癫痫是多种多样的疾病的总称。但是,最近以家族性癫痫为中心,略得知了其遗传异常。
其中的常染色体显性夜发性额叶癫痫是家族性癫痫之一,以夜间的癫痫发作为特征,作为其原因基因异常,报告了神经元乙酰胆碱受体的α4且β2亚基的基因的CHRNA4且CHRNB2的基因的突变(非专利文献1)。作为CHRNA4的基因异常,有S284L、S280F及291-292insL的3种被报告(非专利文献2、3、4、5)。另外,作为CHRNB2的基因异常,有V287L、V287M及I312M的3种的基因异常被报告(非专利文献6、7、8)。
作为用于癫痫的诊断法或处理方法的开发及发展的手段,使用了所谓“癫痫模型动物”。以往的癫痫模型动物是电刺激或使用戊四唑等的痉挛诱发物的“痉挛模型动物”。另外,也公开了通过导入糖链抗体基因引起癫痫样痉挛的转基因非人哺乳动物(专利文献1)。另外,也制备了响应于体位转换呈现出强直间代痉挛或癫痫症状的,从染色体上缺损了μ3B基因功能的非人动物(专利文献2)。但是,这些以往的模型动物虽然可作为痉挛发作的模型动物,但不可作为分子生物学水平的人癫痫的真模型动物。
发明人发现,人染色体显性夜发性额叶癫痫为神经元烟碱乙酰胆碱受体α4亚基(CHRNA4)基因的第284位的Ser被置换为Leu(非专利文献9)。
由此,本发明人制备了通过基因重组导入了大鼠神经元乙酰胆碱受体基因CHRNA4的基因突变的基因重组癫痫模型动物(专利文献3)。
但是,由于以往技术在制备所述基因重组模型动物中,发生同源重组的概率不高,有必要筛选大量重组体。另外,重组体的筛选中有必要对其基因的一部分进行测序,为此要耗费相当的时间和费用。因此,要是能开发出不进行基因测序而判别重组体的方法,就能节约大幅的时间和费用,也期待所述重组体的判别方法的开发。
非专利文献1:Hirose,S.,et al.,Neurology 53:1749-1753,1999
非专利文献2:Steinlein,O.K.,et al.A missense mutation in theneuronal nicotinic acetylcholine receptor alpha 4 subunit is associatedwith autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy.Nat Genet11,201-203(1995).
非专利文献3:Hirose,S.,et al.A novel mutation of CHRNA4responsible for autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy.Neurology 53,1749-1753(1999).
非专利文献4:Steinlein,O.K.,et al.Independent occurrence ofthe CHRNA4 Ser248Phe mutation in a Norwegian family withnocturnal frontal lobe epilepsy.Epilepsia 41,529-535(2000).
非专利文献5:Steinlein,O.K.,et al.An insertion mutation of theCHRNA4 gene in a family with autosomal dominant noctu rnal frontallobe epilepsy.Hum Mol Genet 6,943-947(1997).
非专利文献6:De Fusco,M.,et al.The nicotinic receptor b2subunit is mutant in nocturnal frontal lobe epilepsy.Nat Genet 26,275-276(2000).
非专利文献7:Phillips,H.A.,et al.CHRNB2 is the secondacetylcholine receptor subunit associated with autosomal dominantnocturnal frontal lobe epilepsy.Am J Hum Genet 68,225-231(2001).
非专利文献8:Bertrand,D.,et al.The CHRNB2 mutation I312Mis associated with epilepsy and distinct memory deficits.Neurobiol Dis20,799-804(2005).
非专利文献9:Hirose,S.,et al.A novel mutation of CHRNA4responsible for autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy.Neurology 53,1749-1753(1999).
专利文献1:特开2006-141217号公报
专利文献2:专利第3853136号公报
专利文献3:特开2005-245361号公报
发明内容
发明拟解决的技术课题
为响应上述愿望,本发明人经锐意研究的结果发现,将与人CHRNA4或CHRNB2的基因异常相关联的基因突变分别导入非人动物的同源基因Chrna4或Chrnb2的cDNA中、且向所述突变cDNA的部分碱基序列导入改造成具有与其碱基序列不同,但编码相同氨基酸序列的碱基序列的探针而制备出的非人哺乳动物可作为癫痫的模型动物,同时,如此制备出的非人哺乳动物不仅可容易识别所述重组个体,还由于由重组基因表达的mRNA与其自身的同源基因的mRNA有区别而可容易检测。而且,本发明人在将与人CHRNA4或CHRNB2的基因异常相关联的基因突变分别导入非人动物的同源基因Chrna4或Chrnb2的cDNA中时,通过加工突变位点和所述突变而使出现限制性内切酶切割位点来导入突变,发现可容易识别重组个体,从而完成本发明。
因此,本发明是与人癫痫的基因异常具有相同基因异常的大鼠等的癫痫模型非人哺乳动物,旨在提供向与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元烟碱乙酰胆碱受体α4亚基(CHRNA4)基因或β2亚基(CHRNB2)基因的非人哺乳动物的DNA中导入了作为基因异常的基因突变,且具有可通过导入特定探针而得到的突变基因的癫痫模型非人哺乳动物及其制备方法。
另外,本发明旨在提供将上述基因突变导入cDNA,同时将所述cDNA的部分碱基序列用具有虽与所述部分碱基序列不同,但编码相同氨基酸序列的碱基序列的探针置换而得到的突变基因及其制备方法。
本发明的优选实施方式旨在提供将上述基因突变导入cDNA的新出现限制性内切酶切割位点的突变基因及其突变方法。
而且,本发明旨在提供通过施用针对上述限制性内切酶切割位点的限制性内切酶或制备上述探针时使用的限制性内切酶而可容易识别重组体个体的重组体识别方法。
解决课题的技术方案
为达成这些目的,本发明提供制备成具有向与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元烟碱乙酰胆碱受体α4亚基(CHRNA4)基因或β2亚基(CHRNB2)基因的非人动物的同源基因Chrna4或Chrnb2中分别导入与基因异常相关联的基因突变,同时,向所述基因的部分碱基序列导入改造成具有与所述部分碱基序列不同,但编码相同的氨基酸序列的碱基序列的探针而得到的突变基因的癫痫模型非人哺乳动物。
另外,本发明的优选实施方式提供由于所述突变而使出现限制性内切酶切割位点的癫痫模型非人哺乳动物。
本发明还旨在提供上述癫痫模型非人哺乳动物的制备方法,包括:向与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元乙酰胆碱受体基因的α4亚基CHRNA4或β2亚基CHRNB2的非人动物的同源基因Chrna4或Chrnb2的cDNA中导入与基因异常相关联的基因突变,同时,将所述cDNA的部分碱基序列用具有虽与所述部分碱基序列不同,但编码相同的氨基酸序列的碱基序列的探针置换而制备突变基因,将所述突变基因移入表达载体,将用限制性内切酶切断而分离的分离DNA注入受精卵而得到受精卵,通过将所述受精卵移植给受胚雌性动物来制备重组体。
另外,本发明提供、向基因的碱基序列中导入了一个或多个突变,同时所述基因的cDNA的部分碱基序列被具有虽与所述部分碱基序列不同,但编码相同的氨基酸序列的碱基序列的探针置换的突变基因及其制备方法。本发明的优选实施方式提供伴随所述突变而出现限制性内切酶切割位点的突变基因及其制备方法。
而且,本发明提供利用上述探针或上述限制性内切酶位点的限制性内切酶识别上述癫痫模型非人哺乳动物中是否存在作为上述突变基因的外来基因与宿主动物自身基因之间的同源重组的重组体识别方法。
发明效果
本发明的癫痫模型非人哺乳动物不是利用外部刺激或痉挛诱发物强制性地诱导痉挛发作的所谓“痉挛模型动物”,而是具有可作为自然诱发癫痫发作的癫痫的真模型动物的巨大效果。
即,本发明的癫痫模型非人哺乳动物由于与人癫痫基因异常具有相同基因异常,具有可作为自然诱发与人的痉挛发作同样的癫痫发作的癫痫的真模型动物的巨大效果。
另外,本发明的癫痫模型非人哺乳动物具有如下效果:通过使用导入由于所述突变而出现的限制性内切酶切割位点的限制性内切酶或突变基因的探针的限制性内切酶,可无需对重组体测序而容易地识别重组个体,同时,还由于由重组基因表达的mRNA与大鼠等的其自身的Chrna4或Chrnb2的mRNA有区别而可通过PCR法或原位杂交法等容易地检测。
附图说明
【图1】图1是示CHRNA4的Sma I/Bpu1102I位点中的酶切位点的图。(A)示野生型CHRNA4的酶切位点,(B)是示探针的酶切位点的图。
【图2】图2是示实施例1中构建的表达载体的示意图。
【图3】图3是示SnaB I/NaeI位点中PDGF启动子和大鼠Chrna4的构成的示意图。
【图4】图4是示CHRNB2的Hinc II/Sma I位点中酶切位点的图。(A)示野生型CHRNB2的酶切位点,(B)是示探针的酶切位点的图。
【图5】图5是示实施例4中构建的表达载体的示意图。
【图6】图6是示SnaB I/Dra III位点中PDGF启动子和大鼠Chrnb2的构成的示意图。
【图7】图7是示测定转基因大鼠(Chrnb2V287L)的脑波(EEG)的结果的图。
【图8】图8是图6的记号A部分的放大图。
【图9】图9是图6的记号B部分的放大图。
实施方式
本发明的癫痫模型非人哺乳动物是具有将与作为家族性癫痫之一的以夜间的癫痫发作为特征的人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元烟碱乙酰胆碱受体α4亚基(CHRNA4)基因或β2亚基(CHRNB2)基因的基因突变进行基因重组,所述基因的部分碱基序列被导入具有虽碱基序列不同,但编码相同氨基酸序列的碱基序列的探针的突变基因,缺失或缺损了神经元烟碱乙酰胆碱受体的α4亚基CHRNA4基因或β2亚基CHRNB2基因的功能的基因重组癫痫模型非人哺乳动物。
其中,用语“非人哺乳动物”是指小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪、马、牛等的人以外的哺乳动物,以常年用于抗癫痫药的开发的观点来看优选大鼠。另外,在本说明书中,为使说明简洁,以大鼠为例进行说明,但不特别限定于大鼠。
目前,具有基因异常的疾病模型动物一般可通过所述技术领域惯用的重组动物制备法来制备。在本发明中,可通过所述技术领域以往使用的重组动物制备法来制备对于作为家族性癫痫之一的以夜间的癫痫发作为特征的人常染色体显性夜发性额叶癫痫的癫痫模型动物。
为此,首先,将与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元烟碱乙酰胆碱受体α4亚基(CHRNA4)基因或β2亚基(CHRNB2)基因的同源基因通过PCR克隆等的常规方法从大鼠等分离。其中,大鼠Chrna4的cDNA的碱基序列信息以L31620人CHRNA4cDNA的碱基序列信息的NM_000744(NCBI)登录,而大鼠Chrnb2的cDNA的碱基序列信息以NM_019297(NCBI)登录。
大鼠的神经元烟碱乙酰胆碱受体α4亚基(Chrna4)基因的cDNA(野生型)的碱基序列如下所示。其中,下划线部分显示本发明中被探针置换的部分。另外,对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示。(SEQ ID NO:1)
ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACCGGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCCCATGCGGAGGAGC GGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGGTTACAACAAGTGGTCTC GGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTG GCTTGTCCATTGCTCAGCTCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTGCGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGTCCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGCAGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGTACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACTGGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTGCCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATCCCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTGCATCTCGGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCCCGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCTCCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACGCCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCCCCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGACTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTGGGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGCATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCACCAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACATGCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCCCTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTTCTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCCTTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
大鼠的神经元烟碱乙酰胆碱受体β2亚基(Chrnb2)基因的cDNA(野生型)的碱基序列如下所示。其中,下划线部分显示本发明中被探针置换的部分。另外,对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示。
(SEQ ID NO:2)
ATGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTGGGAACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTACTAACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCAGATCATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGACAATATGAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGGCATGTACGAAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCATCTACAAGAGTGCATGCAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCATGGACCTACGACCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGGGGAGTGGGACATCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATGACTTCATCATTCGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCCATCCTGGTCTTCTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGTGTTCCTGCTGCTCATCTCCAAGATTGTGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGCTAGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCCCCCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACGTCAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGGCTGACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCTGCATCAGTGCAGGGCTTGGCTGGGGCTTTCCGA GCTGAGCCCACTGCA GCCGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGACCACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGTTCCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACTGCCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
可通过已知的突变法向如此得到的cDNA克隆中导入突变。可在本发明中使用的突变法优选使用所述技术领域以往广泛使用的位点特异性突变法等的以往方法。此位点特异性突变法可位点特异性地向cDNA中的任意位点导入任意突变。对于可向所述cDNA的位点位点特异性地导入的突变物特别限制,也可为所述突变缺失、缺损、置换或添加等的改变。
因此,在本发明中,可利用位点特异性突变法向分离大鼠Chrna4或Chrnb2中导入所定的突变,其结果,导入了突变的大鼠的同源基因Chrna4或Chrnb2带有编码具有与人常染色体显性夜发性额叶癫痫的发作相关联的功能的蛋白质的碱基序列。
其中,本说明书中使用的“同源基因”或与此相关的用语是遗传学用语,是指基因的碱基序列中具有与被认为祖先相同的异种动物的基因类似的碱基序列,所编码的蛋白也具有类似功能的基因。
在本发明中,可如下修饰大鼠的神经元烟碱乙酰胆碱受体亚基基因的cDNA。
具体而言,以大鼠的cDNA克隆为模板,基于既有的大鼠Chrna4或Chrnb2的cDNA序列设计、制备2种引物(例如,具有下示碱基序列的正向引物和反向引物)。
基于大鼠Chrna4的cDNA序列制备的正向引物(40聚体)(SEQID NO:3)和反向引物(38聚体)(SEQ ID NO:4)具有如下碱基序列。
SEQ ID NO:3:
AGATCTCGCGAAGCTTCACCATGGCCAATTCGGGCACCGG
SEQ ID NO:4:
AGATCTAGATCAGCAAGCAGCCAGCCAGGGAGGCAGGA
基于大鼠Chrnb2的cDNA序列制备的正向引物(41聚体)(SEQID NO:5)和反向引物(40聚体)(SEQ ID NO:6)具有如下碱基序列。
SEQ ID NO:5:
AGATCTCGCGACATGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCT
SEQ ID NO:6:
ATCGATGGATCCTCACTTGGAGCTGGGAGCTGAGTGGTCA
用这些引物进行PCR,将得到的PCR产物亚克隆于合适的载体中。对得到的克隆测序,确定Chrna4及Chrnb2的cDNA的碱基序列。
接着,向如上所述得到的cDNA克隆的任意位点导入突变。突变法已知各种方法,它们均可适用于本发明。特别是,可通过使用位点特异性突变法等的突变法向任意位点导入任意突变。
如上所述,作为CHRNA4基因的基因异常,报告有S280F、S284L且291-292insL。另外,作为CHRNB2基因的基因突变,报告有V287L、V287M及I312M。
由此,在本发明中,可通过上述突变法,对如上所述通过PCR克隆分离的大鼠Chrna4(野生型)(SEQ ID NO:1)及大鼠Chrnb2(野生型)(SEQ ID NO:2),导入相当于例如,CHRNA4基因的基因异常(S280F、S284L、或291-292insL)或者CHRNB2的基因突变(V287L或V287M)的物种特异性同源基因的突变。
即,突变可使用合适的正义引物和反义引物、通过市售的试剂盒将所定的突变导入所定的突变位点。可用于此突变的正义引物和反义引物一般为20聚体~40聚体、优选为25聚体~35聚体。此时,为使限制性内切酶切割位点新出现于突变位点,可加工引物、突变位点等来导入突变。
具体而言,当向例如,野生型大鼠Chrna4导入S282F(在人中为S280F)的突变时,可使用下示的正义引物(29聚体)和反义引物(29聚体),将cDNA的碱基序列第845位的C突变为T(c.845C>T),再将第846位的G突变为C(c.846G>C)。由于此突变,与CHRNA4的第p.282位同源的氨基酸残基Ser被置换为Phe。
可使用的正义引物(SEQ ID NO:7)及反义引物(SEQ ID NO:8)的碱基序列如下。
SEQ ID NO:7:CACACTGTGCATCTTCGTGCTGCTTTCTC
SEQ ID NO:8:GAGAAAGCAGCACGAAGATGCACAGTGTG
通过上述突变生成的突变大鼠cDNA的碱基序列如下所示。
(SEQ ID NO:9)
ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACCGGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGCCCATGCGGAGGAGCG GCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGGTTACAACAAGTGGTCTCG GCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTGG CTTGTCCATTGCTCAGCTCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTGCGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGTCCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGCAGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGTACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACTGGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTGCCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATCCCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTGCATCTTCGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCCCGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCTCCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACGCCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCCCCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGACTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTGGGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGCATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCACCAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACATGCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCCCTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTTCTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCCTTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
同样,当向野生型大鼠Chrna4导入S286L(在人中为S284L)的突变时,可使用下示的正义引物(29聚体)和反义引物(29聚体),将cDNA的碱基序列第856位的T突变为C(c.856T>C),再将第857位的C突变为T(c.857C>T)。由于此突变,与CHRNA4的第p.286位同源的氨基酸残基Ser被置换为Leu。
可使用的正义引物(SEQ ID NO:10)及反义引物(SEQ ID NO:11)的碱基序列如下。
SEQ ID NO:10:CGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTG
SEQ ID NO:11:
CAGGAAGACGGTGAGAAGAAGCAGCACCG
通过上述突变生成的突变cDNA的碱基序列如下所示。
(SEQ ID NO:12)
ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACCGGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCCCATGCGGAGGAGC GGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGGTTACAACAAGTGGTCTC GGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTG GCTTGTCCATTGCTCAGCTCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTGCGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGTCCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGCAGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGTACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACTGGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTGCCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATCCCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTGCATCTCGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCCCGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCTCCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACGCCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCCCCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGACTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTGGGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGCATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCACCAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACATGCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCCCTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTTCTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCCTTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
同样,通过在野生型大鼠Chrna4的cDNA的碱基序列第878位和第879位之间插入GCT(c.878-879insGCT),使用下示正义引物(30聚体)和反义引物(30聚体),与CHRNA4的第p.293位(在人中为第291位)同源的氨基酸残基Leu和与CHRNA4的第p.294位(在人中为第292位)同源的氨基酸残基Ile之间被插入Leu。
可使用的正义引物(SEQ ID NO:13)及反义引物(SEQ ID NO:14)的碱基序列如下。
SEQ ID NO:13:
GTCTTCCTGCTGCTGCTCATCACCGAGATC
SEQ ID NO:14:
GATCTCGGTGATGAGCAGCAGCAGGAAGAC
通过上述突变生成的突变cDNA的碱基序列如下所示。
(SEQ ID NO:15)
ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACCGGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCCCATGCGGAGGAGC GGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGGTTACAACAAGTGGTCTC GGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTG GCTTGTCCATTGCTCAGCTCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTGCGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGTCCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGCAGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGTACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACTGGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTGCCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATCCCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTGCATCTCGGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTGCTAATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCCCGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCTCCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACGCCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCCCCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGACTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTGGGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGCATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCACCAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACATGCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCCCTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTTCTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCCTTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
与上述c.878-879insGCT的情况同样,通过在野生型大鼠Chrna4的cDNA的碱基序列第879位和第880位之间插入TTA(c.879-880insTTA),与CHRNA4的第p.293位(在人中为第291位)同源的氨基酸残基Leu和与CHRNA4的第p.294位(在人中为第292位)同源的氨基酸残基Ile之间被插入Leu。
(SEQ ID NO:16)
ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACCGGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCCCATGCGGAGGAGC GGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGGTTACAACAAGTGGTCTC GGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTG GCTTGTCCATTGCTCAGCTCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTGCGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGTCCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGCAGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGTACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACTGGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTGCCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATCCCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTGCATCTCGGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCTTAATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCCCGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCTCCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACGCCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCCCCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGACTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTGGGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGCATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCACCAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACATGCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCCCTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTTCTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCCTTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
同样,通过向例如,野生型大鼠Chrnb2导入V287L的突变,在大鼠同源基因Chrnb2的cDNA中,使用含SEQ ID NO:16所示的碱基序列的正向引物及含SEQ ID NO:17所示的碱基序列的反向引物,第c.856位的G被置换为C(c.856G>C),与人的神经元乙酰胆碱受体β2亚基CHRNB2同源的第p.286位的氨基酸残基Val被置换为氨基酸残基Leu。
可使用的正义引物(30聚体)(SEQ ID NO:17)及反义引物(30聚体)(SEQ ID NO:18)的碱基序列如下。
SEQ ID NO:17:
CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCC
SEQ ID NO:18:
GGAGGTGGGAGGCATAATCTTGGAGATGAG
通过上述突变生成的突变cDNA的碱基序列如下所示。
(SEQ ID NO:19)
GGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTGGGAACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTACTAACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCAGATCATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGACAATATGAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGGCATGTACGAAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCATCTACAAGAGTGCATG CAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCATGGACCTACGACCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGGGGAGTGGGACATCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATGACTTCATCATTCGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCCATCCTGGTCTTCTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGTGTTCCTGCTGCTCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGCTAGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCCCCCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACGTCAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGGCTGACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCTGCATCAGTGCAGGGCTTGGCTGGGGCTTTCCGAGC TGAGCCCACTGCAGCCGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGACCACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGTTCCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACTGCCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
同样,通过向野生型大鼠Chrnb2导入V287M的突变,在大鼠同源基因Chrnb2的cDNA中,使用含SEQ ID NO:20所示的碱基序列的正向引物及含SEQ ID NO:21所示的碱基序列的反向引物,第c.856位的G被置换为A(c.856G>A),与人的神经元乙酰胆碱受体β2亚基CHRNB2同源的第p.286位的氨基酸残基Val被置换为氨基酸残基Met。
可使用的正义引物(30聚体)(SEQ ID NO:20)及反义引物(30聚体)(SEQ ID NO:21)的碱基序列如下。
SEQ ID NO:20:
CTCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCC
SEQ ID NO:21:
GGAGGTGGGAGGCAGAATCTTGGAGATGAG
通过上述突变生成的突变cDNA的碱基序列如下所示。
(SEQ ID NO:22)
TGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTGGGAACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTACTAACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCAGATCATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGACAATATGAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGGCATGTACGAAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCATCTACAAGAGTGCATGCAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCATGGACCTACGACCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGGGGAGTGGGACATCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATGACTTCATCATTCGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCCATCCTGGTCTTCTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGTGTTCCTGCTGCTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGCTAGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCCCCCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACGTCAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGGCTGACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCTGCATCAGTGCAGGGCTTGGCTGGGGCTTTCCGAG CTGAGCCCACTGCAGCCGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGACCACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGTTCCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACTGCCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
在本发明中,通过将如上所述导入突变的突变种类加工成对应于位于所述突变位点的密码子的碱基序列,从而可使所述突变位点出现新酶位点。
例如,就Chrna4而言,通过导入879-880insTTA的突变,出现由限制性内切酶Tru9I(MseI)的切割位点(T↓TAA)。另外,就Chrnb2而言,通过导入V287L或V287M,出现由限制性内切酶HinfIf的切割位点(G↓ANTG)。其中,箭标(↓)示切割处。但是,限制性内切酶的种类或切割位点等不限于此、可通过改变突变来适宜选择。
在本发明中,向上述cDNA导入含所定碱基序列的核苷酸作为探针。导入的探针是加工成与原碱基序列相比碱基序列完全或几乎完全不同,但原氨基酸序列相同的核苷酸,其碱基数一般为约30bp~200bp、优选为约50bp~150bp、更优选为约60bp~120bp。这样的核苷酸可通过DNA合成法等的所述技术领域惯用的常规方法来制备。
具体而言,例如,对于Chrna4基因的突变cDNA而言,可以具有下示碱基序列(118bp)的核苷酸作为探针制备成碱基序列虽与所述cDNA的第c.104位~第c.221位的碱基序列不同,但氨基酸序列相同。
(SEQ ID NO:23)
GGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGGCTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCA
同样,例如,对于Chrnb2的突变cDNA而言,可以具有下示碱基序列(62bp)的核苷酸作为探针制备成碱基序列虽与cDNA的第c.1171位~第c.1232位的碱基序列不同,但氨基酸序列相同。
(SEQ ID NO:24)
AACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCGCTGGCCC
接着,将如上所述制备出的核苷酸探针杂交后,通过常规方法使用限制性内切酶位点导入探针。例如,可通过所述技术领域惯用的探针导入法将SEQ ID NO:22所示的探针插入具有上述碱基序列的Chrna4的突变cDNA的所定位点、pCRII-TOPO载体等的适当的载体的Sma I和Bpu1102I(别名Esp I或Cel II)位点。另外,例如,可通过所述技术领域惯用的探针导入法,将SEQ ID NO:22所示的探针插入具有上述碱基序列的Chrnb2的突变cDNA的所定位点、pCRII-TOPO载体等的适当的载体的限制性内切酶位点的Hinc I和Sma I。各步骤进行测序,确定碱基序列。
大鼠Chrana4的突变cDNA(S282F)(其中,在人中为S280F。)中导入了SEQ ID NO:23所示的探针的探针导入突变基因cDNA(S282FPB)的碱基序列(SEQ ID NO:25)如下所示。其中,由于c.845C>T和c.846G>C的突变,如矩形所框住(□),第844位~第846位的TCG被突变为TTC,且探针部分如下划线所示,其碱基数为118bp,位于第104位~第221位。
(SEQ ID NO:25)
ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACCGGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCTCACGCCGAAGAAC GCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGGCTATAATAAATGGTCCC GCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCG GATTATCTATCGCTCAGCTCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTGCGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGTCCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGCAGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGTACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACTGGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTGCCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATCCCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTGCATCTTCGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCCCGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCTCCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACGCCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCCCCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGACTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTGGGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGCATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCACCAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACATGCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCCCTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTTCTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCCTTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
大鼠Chrna4的突变cDNA(S286L)(其中,在人中为S284L。)中导入了SEQ ID NO:23所示的探针的探针导入突变基因cDNA(S284LPB)的碱基序列(SEQ ID NO:26)如下所示。其中,由于c.856T>C和c.857C>T的突变,如矩形所框住(□),第856位~第858位的TCT被突变为CTT,且探针部分如下划线所示,碱基数为118bp,位于第104位~第221位。
(SEQ ID NO:26)
ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACCGGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCTCACGCCGAAGAAC GCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGG CTATAATAAATGGTCCC GCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCG GATTATCTATCGCTCAGCTCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTGCGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGTCCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGCAGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGTACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACTGGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTGCCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATCCCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTGCATCTCGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCCCGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCTCCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACGCCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCCCCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGACTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTGGGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGCATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCACCAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACATGCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCCCTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTTCTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCCTTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
大鼠Chrana4的突变cDNA(879-880insL)中导入了SEQ ID NO:23所示的探针的探针导入突变基因cDNA(S282FPB)的碱基序列(SEQ ID NO:27)如下所示。其中,由于c.845C>T和c.846G>C的突变,如矩形所框住(□),第844位~第846位的TCG被突变为TTC,且探针部分如下划线所示,为118bp,位于第104位~第221位。但是,在人中为S280F。
(SEQ ID NO:27)
ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACCGGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCTCACGCCGAAGAAC GCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGGCTATAATAAATGGTCCC GCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCG GATTATCTATCGCTCAGCTCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTGCGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGTCCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGCAGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGTACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACTGGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTGCCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATCCCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTGCATCTCGGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTGCTAATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCCCGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCTCCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACGCCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCCCCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGACTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTGGGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGCATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCACCAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACATGCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCCCTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTTCTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCCTTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
大鼠Chrnb2的突变cDNA中导入了SEQ ID NO:24所示的探针的探针导入突变基因cDNA(V286L)的碱基序列(SEQ ID NO:28)如下所示。
(SEQ ID NO:28)
GGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTGGGAACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTACTAACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCAGATCATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGACAATATGAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGGCATGTACGAAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCATCTACAAGAGTGCATGCAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCATGGACCTACGACCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGGGGAGTGGGACATCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATGACTTCATCATTCGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCCATCCTGGTCTTCTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGTGTTCCTGCTGCTCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGCTAGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCCCCCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACGTCAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGGCTGACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGC CGAACCTACCGCCGCTGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGACCACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGTTCCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACTGCCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
大鼠Chrnb2的突变cDNA中导入了SEQ ID NO:24所示的探针的探针导入突变基因cDNA(V286M)的碱基序列(SEQ ID NO:29)如下所示。
(SEQ ID NO:29)
TGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTGGGAACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTACTAACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCAGATCATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGACAATATGAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGGCATGTACGAAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCATCTACAAGAGTGCATGCAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCATGGACCTACGACCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGGGGAGTGGGACATCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATGACTTCATCATTCGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCCATCCTGGTCTTCTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGTGTTCCTGCTGCTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGCTAGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCCCCCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACGTCAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGGCTGACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGG CCGAACCTACCGCCGCTGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGACCACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGTTCCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACTGCCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
使用如上所述制备的导入大鼠上述突变和探针的大鼠Chrna4或Chrb2的cDNA,本发明的癫痫非人哺乳动物其本身可根据公知的非人哺乳动物制备方法,通过常规方法来制备。所述非人哺乳动物的制备方法可例举:将目的基因导入动物个体的转基因动物的制备方法、重组了靶基因和目的导入基因的基因置换动物的制备方法、使用改变了目的基因的细胞的核的克隆个体的制备方法等。
本发明中,以将作为目的基因的上述突变基因的cDNA导入例如大鼠等的动物个体的受精卵的转基因动物的制备方法为例进行说明。
首先,制备具有编码与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元烟碱乙酰胆碱受体的α4亚基(CHRNA4)基因或β2亚基(CHRNB2)基因的同源基因中具有所述突变的突变基因的DNA的表达载体。
即,分离含非人哺乳动物的神经元烟碱乙酰胆碱受体α4亚基(Chrna4)基因或β2亚基(Chrnb2)基因的DNA,可通过向此DNA片段中插入外源基因等来构建表达载体。作为所述外源基因,优选为标记基因,特别优选为新霉素抗性基因等的抗生素抗性基因。插入抗生素抗性基因时,可通过只在含抗生素的培养基中培养来筛选发生同源重组的细胞株。另外,为进行更有效的筛选,也可在表达载体结合胸苷激酶基因等。由此,可排除发生非同源重组的细胞株。另外,在表达载体结合白喉毒素A片段(DT-A)基因等,则可排除发生非同源重组的细胞株。作为表达载体,使用例如,pCI-neo、pMCIneo、pXT1、pSG5、peDNA3.neo、pLITMUS28、pcDNAIamp、pcDNA3等。
上述DNA优选为,将所述DNA被连接到适当的启动子下游的表达载体作为导入基因导入到非人哺乳动物的DNA。此外,作为启动子,只要是可在导入编码上述受体亚基的DNA的非人哺乳动物的细胞内开始转录的启动子,则可使用任何启动子,可例举源于例如,猴肾病毒40、多瘤病毒、腺病毒2、人巨细胞病毒、反转录病毒等的病毒的基因等的启动子。
另外,在本发明中使用的表达载体优选为,在编码非人动物的神经元烟碱乙酰胆碱受体的α4亚基(Chrna2)基因或β2亚基(Chrnb2)的突变基因的DNA的下游具有mRNA的3’末端的多聚腺苷酸化中必要的多聚腺苷酸化信号的表达载体。作为多聚腺苷酸化信号,可例举例如,源于上述病毒等的各基因所含的SV40的后期基因或初期基因等的多聚腺苷酸化信号等。此外,在表达载体中,为了更高表达目的基因,也可将各基因的剪接信号、增强子区域、内含子的一部分连接到启动子区域的5’上游、启动子区域和翻译区域间、或者翻译区域的3’下游。
在本发明中,例如,使用限制性内切酶位点XhoI和NotI将导入上述突变和探针的大鼠突变Chrna4或Chrnb2的cDNA移入表达载体中后,用限制性内切酶SnaBI和NaeI切割。例如,将大鼠突变Chrna4的cDNA移入具有源于pCI-neo载体的PDGF启动子的表达载体中时,可使用限制性内切酶位点XhoI和NotI移入,用限制性内切酶SnaBI和NaeI切割,另外,移入大鼠Chrb2的cDNA时,可使用限制性内切酶位点XhoI和SalI移入,用限制性内切酶SnaBI和DraIII切割。由此,可将含PDGF启动子、大鼠突变Chrna4或Chrnb2的cDNA及polyA部分的片段作为DNA构建物从凝胶切出分离、纯化。
在本发明中,例如,可通过将如上所述分离、纯化的DNA构建物等导入非人哺乳动物的分化全能性细胞来制备非人哺乳动物。作为可使用的分化全能性细胞,可使用例如,受精卵、初期胚、胚胎干细胞等。待导入DNA构建物的受精卵可通过将例如,性腺刺激激素(PMS)等的排卵诱发剂施用于腹腔内,诱发雌性动物的超数排卵而回收可导入DNA构建物的受精卵,摘出与通过输精管结扎等而去势的雄性小鼠交配的假孕雌性动物的输卵管,在显微镜下采集来得到。
接着,向得到的受精卵中导入DNA构建物。已知作为将构建物导入受精卵的手段的各种方法,但在考虑转基因动物个体的制备效率或往下一代的导入基因的传递效率时,优选微注射法。将如此注入了突变基因的受精卵移植到代孕母亲的输卵管中,使发育成个体,从身体的一部分(例如,尾部尖端等)的体细胞提取DNA,通过DNA印迹或PCR法确定导入的基因的存在。可通过筛选如此体细胞的基因组中整合了导入基因的个体来制备目的转基因动物。
将如上所述确定存在导入基因的个体(杂合子)作为原代(Founder:F0),则导入基因传递到50%其子代(F1)。接着,通过交配此F1个体的雌雄,可制备2倍体染色体的两方具有导入基因的个体(F2)。
对此,本发明中用于癫痫模型非人哺乳动物的制备的转基因方法是,向正常状态的内源性基因(Chrna4基因或Chrnb2基因)染色体DNA的任意位置新导入编码突变型Chrna4或Chrnb2的突变基因。为此,本发明的癫痫模型动物中,分别同时产生正常的Chrna4或Chrnb2,和突变型Chrna4或Chrnb2。神经元烟碱乙酰胆碱受体是发挥离子通道(α亚基2个、β亚基3个)功能的蛋白质,这样的离子通道只要任意亚基突变,则通道功能改变。因此,如本发明所述,认为同时表达正常亚基和突变亚基对于表现人型癫痫发作的模型动物合适。
本发明的癫痫模型非人哺乳动物,如后述实施例所示,具有如同人染色体显性夜发性额叶癫痫,在睡眠中自然发症癫痫发作的优异的特性。
其中,目的基因整合到全部细胞的染色体上的个体的选择通常如下进行:从构成个体的血液组织、上皮组织等的组织的一部分制备DNA,对DNA进行测序,以DNA水平确定存在导入基因。但是,如此测序DNA来选择所述重组个体需要费时费力且费成本的复杂操作。
即,制备具有基因异常的疾病模型动物时,有必要正确判别同源重组体。以往的疾病模型动物的制备法中,为了判别重组体,有必要对所述个体的基因的一部分进行测序,且需要表达所述导入基因的mRNA。但是,通过RT-PCR或原位杂交等表达所述导入基因的mRNA并不容易。
由此,在本发明中,通过如上所述对突变基因进行突变,同时将所述突变基因的一部分用探针置换来进行操作,以使可容易地进行重组体的识别。另外,由于上述突变而出现新限制性内切酶切割位点时,也可容易地进行重组体的识别。其中,此方法应理解为,不仅限于下示说明的具体实施方式,与基因突变或限制性内切酶等的种类无关,适用于全部突变。另外,在本发明中,对位点特异性地导入所述cDNA克隆的位点的突变的种类无特别限定。
即,本发明中,为了可容易地进行所述重组个体的选择,如上所述,向编码非人动物的神经元烟碱乙酰胆碱受体的α4亚基(Chrna4)基因或β2亚基(Chrnb2)基因DNA导入例如,S280L、S284L、S291-292L、V287L、V287M等的突变,而使出现新的限制性内切酶切割位点。通过如此使出现新的限制性内切酶切割位点,可在制备重组体时,容易识别重组体。
在本发明中,将制备出的突变cDNA的一部分的碱基序列用含碱基序列与所述碱基序列基本上完全不同,但氨基酸序列相同的碱基序列的探针置换,再导入与原碱基序列相同的位点,通过使用所述导入的探针的限制性内切酶,不仅可容易识别重组个体,还由于由重组基因表达的mRNA与大鼠自身的Chrna4mRNA或Chrnb2mRNA有区别,可通过RT-PCR或原位杂交等容易地检测。
另外,例如,通过向神经元乙酰胆碱受体基因的α4亚基CHRNB2的同源基因Chrnb2导入突变(c.856G>C)或(c.856G>A),出现限制性内切酶切割位点Hinf If,可通过使用限制性内切酶Hinf If的PCR-RFLP(限制性内切酶片段长度多态性)法等判别含此切割位点的区域。即,不发生目的同源重组的个体由于不具有Hinf If位点,不发生由限制性内切酶Hinf If的切割,与此相比,发生目的同源重组的个体则由于具有Hinf If位点,可由限制性内切酶Hinf If切割。因此,在本发明中,通过使神经元乙酰胆碱受体基因的α4亚基CHRNA4的同源基因Chrna4或β4亚基CHRNB2的同源基因Chrnb2突变而出现限制性内切酶切割位点,可容易地识别重组体。
其中,其中使用的PCR-RFLP法,由于其本身是公知手法,通过此方法,将对象位点用PCR扩增,将扩增产物用所定限制性内切酶、例如,True9I或Hinf If等的限制性内切酶消化,用电泳等检查消化后的DNA片段的大小,研究所述限制性内切酶的切割位点的存在与否。
以下,通过实施例更详细说明本发明,本发明不限于下述实施例,且下述实施例仅为旨在具体说明本发明的例示记载,应理解为不旨在以任何方式限定本发明的记载。
实施例
实施例1:
首先,以大鼠脑QUICK-Clone cDNA(CLONTECH;MountainView,CA)作为模板,用基于既有的大鼠Chrna4的cDNA序列设计的2个引物,即,正向引物(BN-大鼠CHRNA4cDNA-F):
AGATCTCGCGAAGCTTCACCATGGCCAATTCGGGCACCGG(40聚体)(SEQ ID NO:3)和
反向引物(大鼠CHRNA4cDNA-BX-R):
AGATCTAGATCAGCAAGCAGCCAGCCAGGGAGGCAGGA(38聚体)(SEQ ID NO:4)
进行了PCR。将得到的PCR产物纯化,亚克隆到pCRII-TOPO载体(Invitorogen;Carlsbad,CA)中。将得到的克隆测序,确定Chrna4的cDNA的碱基序列。其中,大鼠碱基序列信息以登录号L31620(NCBI)被登录。
向得到的克隆使用QuikChange位点特异性诱变试剂盒(STRATAGENE;La Jolla,CA)进行突变。首先,使用r845T846C-sen:CACACTGTGCATCTTCGTGCTGCTTTCTC(29聚体)(SEQ ID NO:7)和r845T846C-ant:GAGAAAGCAGCACGAAGATGCACAGTGTG(29聚体)(SEQ IDNO:8)将cDNA碱基序列第845位的C突变为T,又将第846位的G突变为C。得到的突变cDNA的碱基序列如SEQ ID NO:9所示。由此,与人神经元乙酰胆碱受体α4亚基同源的第p.282位的氨基酸残基Ser被突变为氨基酸残基Phe。
向如此制备出的突变的cDNA的c.104~c.221,制备具有含编码与此位点相同的氨基酸序列,但碱基序列与原碱基序列完全不同的下示碱基序列的118bp的核苷酸的探针(SEQ ID NO:23)而导入所述位点。
(SEQ ID NO:23)
GGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGGCTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCA
对如上所述导入探针的突变cDNA杂交后,将待插入pCRII-TOPO载体的Chrna4的cDNA,使用限制性内切酶位点的SmaI和Bpu1102I进行插入。各步骤中进行测序,确定碱基序列。
而且,将具有所述突变(S286L)的大鼠Chrna4的cDNA使用限制性内切酶位点XhoI和NotI移入具有源于pCI-neo载体的PDGF启动子的表达载体中后,用限制性内切酶SnaBI和NaeI进行切割。将具有PDGF启动子和大鼠Chrna4的cDNA及polyA部分的片段由凝胶切出分离、纯化。此经分离、纯化的DNA显微注入到受精卵,将状态良好的200个以上的卵移植到受胚雌性动物的输卵管中,通过自然分娩的方法制备出重组体。
实施例2:
如同实施例1,使用r856C857T-sen:CGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTG(29聚体)(SEQ IDNO:10)和r856C857T-ant:CAGGAAGACGGTGAGAAGAAGCAGCACCG(29聚体)(SEQ IDNO:11)将cDNA碱基序列第856位的T突变为C,将第857位的C突变为T。得到的突变cDNA的碱基序列如SEQ ID NO:12所示。由此,与人神经元乙酰胆碱受体α4亚基同源的第p.286位的氨基酸残基Ser被突变为氨基酸残基Leu。
向如此制备出的突变的cDNA的c.104~c.221,如同实施例1,制备含SEQ ID NO:23所示的118bp的核苷酸的探针而导入。
使用如上所述导入探针的突变cDNA,如同实施例1制备出重组体。
实施例3:
如同实施例1,使用正义引物rCHRNA-878insGCT-sen:GTCTTCCTGCTGCTGCTCATCACCGAGATC(30聚体)(SEQ IDNO:13)和反义引物rCHRNA-878insGCT-ant:GATCTCGGTGATGAGCAGCAGCAGGAAGAC(30聚体)(SEQ IDNO:14)在cDNA碱基序列第878位和第879位之间插入GCT。得到的突变cDNA的碱基序列如SEQ ID NO:15所示。由此,与人神经元乙酰胆碱受体α4亚基同源的第p.293位的氨基酸残基Leu和第p.294位的氨基酸残基Ile之间被插入氨基酸残基Leu。
使用如此制备出的突变的cDNA,如同实施例1制备出重组体。
实施例4:
向通过PCR克隆分离的大鼠Chrnb2,通过突变法,导入c.856G>C和c.856G>A的突变。即,以大鼠脑QUICK-ClonecDNA(CLONTECH Mountain View,CA)作为模板,由基于既有的大鼠Chrnb2的cDNA序列设计的2个引物(BN-大鼠CHRNB2cDNA-F:AGATCTCGCGACATGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCT(41聚体)(SEQ ID NO:5)和大鼠CHRNB2cDNA-CB-R:ATCGATGGATCCTCACTTGGAGCTGGGAGCTGAGTGGTCA(40聚体)(SEQ ID NO:6)进行PCR。生成得到的PCR产物,并亚克隆到pCRII-TOPO载体(Invitorogen Carlsbad,CA)中。对得到的克隆进行测序,确定Chrnb2的cDNA的碱基序列。此大鼠碱基序列信息以登录号NM_019297(NCBI)被登录。
使用QuikChange位点特异性诱变试剂盒(STRATAGENE、LaJolla,CA)向得到的克隆中导入突变。首先,使用大鼠CHRNB2m286V/M-F:CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCC(30聚体)(SEQ ID NO:17)和大鼠CHRNB2m286V/M-R:GGAGGTGGGAGGCATAATCTTGGAGATGAG(30聚体)(SEQ IDNO:18),将cDNA碱基序列第856位的G突变为C。由此,与人的神经元乙酰胆碱受体β2亚基同源的第p.286位的氨基酸残基Val被突变为氨基酸残基Leu(作为β是遵从了特许厅的在线申请规则)。
此突变中,由c.856G>C的导入,限制性内切酶切割位点出现HinfIf,认为制备重组体时,可容易地识别重组体。
向制备出的突变的cDNA的c.1171~c.1232导入了编码与此位点相同的氨基酸序列,但碱基序列与所述碱基序列完全不同的探针(SEQID NO:24)。
(SEQ ID NO:24)
AACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCGCTGGCCC
其中,制备此62bp的核苷酸,杂交后,将待插入pCRII-TOPO载体中的Chrnb2的cDNA使用限制性内切酶位点的Hinc II和Sma I进行插入。各步骤中进行测序,确定碱基序列。
而且,将具有所述突变和探针的大鼠Chrnb2的2种cDNA,使用限制性内切酶位点Xho I和Sal I移入具有源于pCI-neo载体的PDGF启动子的表达载体中后,用限制性内切酶SnaBI和DraIII切割。将具有PDGF启动子和大鼠Chrnb2的cDNA及polyA部分的片段由凝胶切出分离、纯化。将此分离出的DNA显微注入受精卵,将状态良好的200个以上的卵移植到受胚雌性动物的输卵管中,通过自然分娩方法制备出重组体。
实施例5:
如同实施例4,使用大鼠CHRNB2m286V/L-F:CTCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCC(30聚体)(SEQ IDNO:20)和大鼠CHRNB2m286V/L-R:GGAGGTGGGAGGCAGAATCTTGGAGATGAG(30聚体)(SEQID NO:21)将cDNA碱基序列第856位的G突变为A。由此,与人的神经元乙酰胆碱受体β2亚基同源的第p.286位的氨基酸残基Val被突变为氨基酸残基Met。使用如此得到的突变cDNA,如同实施例4制备出重组体。
实施例6:
癫痫模型大鼠的脑波(electroencephalogram:EEG)测定
对8~10周龄的转基因大鼠(Chrnb2V287L)进行脑波(EEG)测定。将大鼠用戊巴比妥钠(大日本住友制药株式会社)麻醉,固定于脑定位固定装置(SR-5、成重),电极安装于大鼠的头盖骨的前卤点至动脉:2.5mm,侧部:1.5mm和动脉:-2.5mm,侧部:2.5mm,将无关电极安装于大鼠鼻骨附近的骨的厚部分,用牙科用粘固剂固定。将脑波测定用的涂覆特氟隆(注册商标)的不锈钢电极安装于左右大脑半球的额叶(距前卤点A=3.mm、L=0.8mm),用牙科用粘固剂固定。将无关电极埋入小脑位点的上部。脑波(EEG)则使用VideoOption(KISSEI COMTEC),将大鼠放入箱子内数天,在自由运动条件下进行测定,脑波解析使用SleepSign(KISSEI COMTEC)进行。
脑波测定结果示于图5。图中、将异常脑波部分以记号A及记号B显示,以记号A显示的异常脑波部分的放大图示于图6,而将以记号B显示的异常脑波部分示于图7。此结果证实,本发明的大鼠可作为癫痫模型大鼠而被利用。
工业实用性
本发明的癫痫模型非人哺乳动物是与人癫痫基因异常具有相同基因异常的癫痫模型非人哺乳动物,通过使用此模型动物,可诱发与人癫痫发作同等的痉挛发作而进行研究,可利用于癫痫的治疗药的研究、开发。
Claims (33)
1.具有与人癫痫基因异常相同的基因异常的人癫痫模型非人哺乳动物,其特征在于,所述人癫痫模型非人哺乳动物具有如下突变基因:
●所述突变基因通过将基因突变分别导入神经元烟碱乙酰胆碱受体基因的α4亚基CHRNA4或β2亚基CHRNB2的非人哺乳动物的Chrna4或Chrnb2中而产生,所述神经元烟碱乙酰胆碱受体基因的α4亚基CHRNA4或β2亚基CHRNB2与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联,且
●所述突变基因包括探针,所述探针具有虽与原碱基序列不同,但编码相同氨基酸序列的碱基序列。
2.权利要求1的人癫痫模型非人哺乳动物,其中所述突变基因由于所述突变而出现新限制性内切酶切割位点。
3.权利要求1或2的人癫痫模型非人哺乳动物,其中所述Chrna4由于突变而具有SEQ ID NO:9所示的碱基序列,所述突变是所述Chrna4的cDNA的:
●第845位的碱基C(胞嘧啶)被突变为碱基T(胸腺嘧啶)(c.845C>T),及
●第846位的碱基G(鸟嘌呤)被突变为碱基C(胞嘧啶)(c.846G>C)。
4.权利要求1、2或3的人癫痫模型非人哺乳动物,其中通过所述突变而将c.845T>C及/或c.846G>A的突变导入所述Chrna4的cDNA中,从而与所述α4亚基CHRNA4的第p.282位同源的氨基酸残基Ser被置换为氨基酸残基Phe。
5.权利要求1或2的人癫痫模型非人哺乳动物,其中所述Chrna4由于突变而具有SEQ ID NO:12所示的碱基序列,所述突变是所述Chrna4的cDNA的:
●第856位的碱基T(胸腺嘧啶)被突变为碱基C(胞嘧啶)(c.856T>C),及/或
●第857位的碱基C(胞嘧啶)被突变为碱基T(胸腺嘧啶)(c.857C>T)。
6.权利要求1、2或5的人癫痫模型非人哺乳动物,其中通过所述突变而将c.856T>C及c.857C>T的突变导入非人哺乳动物的Chrna4中,从而与所述α4亚基CHRNA4的第p.286位同源的氨基酸残基Ser被置换为氨基酸残基Leu。
7.权利要求1或2的人癫痫模型非人哺乳动物,其中所述基因由于突变而分别如SEQ ID NO:15或16所示,所述突变是所述基因的Chrna4中分别导入了c.878-879insGCT或c.879-880insTTA的突变。
8.权利要求1、2或7的人癫痫模型非人哺乳动物,其中通过所述突变而将c.878-879insGCT或c.879-880insTTA的突变导入所述Chrna4中,从而与所述α4亚基CHRNA4的第p.293位同源的氨基酸残基Leu和与所述α4亚基CHRNA4的第p.294位同源的氨基酸残基Ile之间被插入Leu。
9.权利要求1或2的人癫痫模型非人哺乳动物,其中所述Chrnb2由于突变而具有分别如SEQ ID NO:19或22所示的碱基序列,所述突变是所述Chrnb2的cDNA的第856位的碱基G(鸟嘌呤)被分别突变为碱基C(胞嘧啶)(c.856G>C)或碱基A(腺嘌呤)(c.856G>A)。
10.权利要求1、2或9的人癫痫模型非人哺乳动物,其中通过所述突变而将c.856G>C或c.856G>A的突变分别导入所述Chrnb2中,从而与所述β2亚基CHRNB2的第p.286位同源的氨基酸残基Val被置换为氨基酸残基Leu或氨基酸残基Met。
11.权利要求1~10中任一项的人癫痫模型非人哺乳动物,其中所述探针具有SEQ ID NO:23或24所示的碱基序列。
12.制备权利要求1~11中任一项的人癫痫模型非人哺乳动物的方法,所述方法包括:
●如下制备突变基因:
■将基因突变导入非人哺乳动物的Chrna4或Chrnb2的cDNA,所述基因突变涉及与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元烟碱乙酰胆碱受体基因的α4亚基CHRNA4或β2亚基CHRNB2的基因异常;及
■将所述cDNA的部分碱基序列用探针置换,所述探针具有虽与所述cDNA部分碱基序列不同,但编码相同氨基酸序列的碱基序列;
●将所述突变基因转移入表达载体;及
●将包含于所述表达载体内的所述突变基因经受精卵移植到受胚雌性动物而制备重组非人哺乳动物。
13.权利要求12的方法,其中所述突变基因中由于所述突变而出现新限制性内切酶切割位点。
14.权利要求12或13的方法,其中所述Chrna4的cDNA的:
●第845位的碱基C(胞嘧啶)被突变为碱基T(胸腺嘧啶)(c.845C>T),且/或第846位的碱基G(鸟嘌呤)被突变为碱基C(胞嘧啶)(c.846G>C);或
●第856位的碱基T(胸腺嘧啶)被突变为碱基C(胞嘧啶)(c.856T>C),且第857位的碱基C(胞嘧啶)被突变为碱基T(胸腺嘧啶)(c.857C>T);或
●第878位和第879位之间被插入密码子GCT(c.879-880insGCT),或者第879位和第880位之间被插入密码子TTA(c.879-880insTTA)。
15.权利要求12、13或14的方法,其中,
向所述Chrna4的cDNA中分别导入如下突变:
●c.845C>T且c.846G>C,或
●c.856T>C且c.857C>T,或
●c.878-879insGCT或c.879-880insTTA,
从而与所述α4亚基CHRNA4同源的
●第p.282位的氨基酸残基Ser被置换为氨基酸残基Phe,或
●第p.284位的氨基酸残基Ser被置换为氨基酸残基Leu,或
●第p.293位的氨基酸残基Leu和第p.294位的氨基酸残基Ile之间被插入氨基酸残基Leu。
16.权利要求12或13的方法,其中由于所述突变而Chrnb2的cDNA的第856位的碱基G(鸟嘌呤)被突变为碱基C(胞嘧啶)(c.856G>C)或碱基A(腺嘌呤)(c.856G>A)。
17.权利要求12、13或16的方法,其中向所述Chrnb2中导入c.856G>C或c.856G>A的突变,从而将与所述β2亚基CHRNB2同源的第p.286位的氨基酸残基Val分别置换为氨基酸残基Leu或氨基酸残基Met。
18.突变基因,其特征在于,
●基因的碱基序列中导入了一个或多个突变,且
●所述基因的部分碱基序列被置换为探针,所述探针具有虽与所述部分碱基序列不同,但编码相同的氨基酸序列的碱基序列。
19.权利要求18的突变基因,其还含由于所述一个或多个突变的导入而出现的新限制性内切酶切割位点。
20.权利要求18或19的突变基因,其中所述基因是与神经元烟碱乙酰胆碱受体基因的α4亚基CHRNA4或β2亚基CHRNB2分别同源的非人哺乳动物的同源基因Chrna4或Chrnb2,所述神经元烟碱乙酰胆碱受体基因的α4亚基CHRNA4或β2亚基CHRNB2与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联。
21.权利要求18、19或20的突变基因,其中所述Chrna4的cDNA的
●第845位的碱基C(胞嘧啶)被突变为碱基T(胸腺嘧啶)(c.845C>T),且第846位的碱基G(鸟嘌呤)被突变为碱基C(胞嘧啶)(c.846G>C),或
●第856位的碱基T(胸腺嘧啶)被突变为碱基C(胞嘧啶)(c.856T>C),且第857位的碱基C(胞嘧啶)被突变为碱基T(胸腺嘧啶)(c.857C>T),或
●第878位和第879位之间被插入密码子GCT(c.878-879insGCT),或者第879位和第880位之间被插入密码子TTA(879-880insTTA)。
22.权利要求18~21中任一项的突变基因,其中
●向所述Chrna4的cDNA中分别导入如下突变:
■c.845C>T且c.846G>C,或
■c.856T>C且c.857C>T,或
■c.879-880insGCT或c.879-880insTTA,
从而与所述α4亚基CHRNA4同源的
■第p.280位的氨基酸残基Ser被置换为氨基酸残基Phe,或
■第p.284位的氨基酸残基Ser被置换为氨基酸残基Leu;或者
■第p.293位的氨基酸残基Leu和第p.294位的氨基酸残基Ile之间被插入氨基酸残基Leu。
23.权利要求18或19的突变基因,其中所述Chrnb2的cDNA的第856位的碱基G(鸟嘌呤)被分别突变为碱基C(胞嘧啶)(c.856G>C)或碱基A(腺嘌呤)(c.856G>A)。
24.权利要求18、19或23的突变基因,其中向所述Chrnb2中导入c.856G>C或c.856G>A的突变,从而与所述β2亚基CHRNB2同源的第p.286位的氨基酸残基Val被分别突变为氨基酸残基Leu或氨基酸残基Met。
25.制备权利要求18~25中任一项的突变基因的方法,包括:
●向所述基因的碱基序列中导入一个或多个突变,且
●通过插入探针来置换所述基因的部分碱基序列,所述探针具有虽与所述部分碱基序列不同,但编码相同的氨基酸序列的碱基序列。
26.权利要求25的方法,其中由于所述一个或多个突变而出现新限制性内切酶切割位点。
27.权利要求25或26的方法,其中所述基因是与神经元烟碱乙酰胆碱受体基因的α4亚基CHRNA4或β2亚基CHRNB2分别同源的非人哺乳动物的同源基因Chrna4或Chrnb2,所述神经元烟碱乙酰胆碱受体基因的α4亚基CHRNA4或β2亚基CHRNB2与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联。
28.权利要求25、26或27的方法,其中向所述Chrna4的cDNA中分别导入如下突变:
●c.845C>T且c.846G>C,或
●c.856T>C且c.857C>T,或
●c.878-879insGCT或c.879-880insTTA。
29.权利要求25~28中任一项的方法,其中,
向所述Chrna4的cDNA中分别导入如下突变:
●c.845C>T且c.846G>C,或
●c.856T>C且c.857C>T,或
●c.879-880insGCT,
从而与所述α4亚基CHRNA4同源的
●第p.282位的氨基酸残基Ser被置换为氨基酸残基Phe,或
●第p.284位的氨基酸残基Ser被置换为氨基酸残基Leu;或者
●第p.293位的氨基酸残基Leu和第p.294位的氨基酸残基Ile之间被插入氨基酸残基Leu。
30.权利要求25或26的方法,其中向所述Chrnb2的cDNA中导入c.856G>C或c.856G>A的突变。
31.权利要求25、26或30的方法,其中向所述Chrnb2中导入c.856G>C或c.856G>A的突变,从而与所述β2亚基CHRNB2同源的第p.286位的氨基酸残基Val被分别置换为氨基酸残基Leu或氨基酸残基Met。
32.识别权利要求1~11的人癫痫模型非人哺乳动物的同源重组体的方法,包括:利用限制性内切酶检测探针是否被导入权利要求18~24中任一项的突变基因的同源重组体中,其中,
所述非人哺乳动物的基因Chrna4或Chrnb2是与人神经元烟碱乙酰胆碱受体的α4亚基CHRNA4或β2亚基CHRNB2分别同源的非人哺乳动物的同源基因Chrna4或Chrnb2,
所述探针具有虽与所述非人哺乳动物的同源基因Chrna4或Chrnb2的部分碱基序列不同,但编码相同氨基酸序列的碱基序列。
33.权利要求32的方法,其中所述人癫痫模型非人哺乳动物的同源重组体通过使用限制性内切酶检测出现在所述突变基因中的限制性内切酶切割位点来识别。
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Cited By (1)
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