DE60219925T2

DE60219925T2 - Methode zur induzierung neurofibrillärer tangles in transgenen tieren

Info

Publication number: DE60219925T2
Application number: DE60219925T
Authority: DE
Inventors: Jürgen Brain and Mind Research Inst Camperdown GÖTZ; Roger Nitsch; Feng Chen
Original assignee: Universitaet Zuerich
Current assignee: Universitaet Zuerich
Priority date: 2001-08-24
Filing date: 2002-08-24
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2022-08-25
Also published as: WO2003017918A3; ATE360988T1; US7550648B2; WO2003017918A2; EP1418807B1; DE60219925D1; JP2005500076A; US20080261878A1; EP1418807B8; EP1418807A2; AU2002333704A1; US20050015819A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Induzieren der Bildung von neurofibrillären Tangles in transgenen Nagern und auf die Nager als solche. Ein in-vivo-Assay wird bereitgestellt, mit dem Verbindungen und Modifizierungsmittel auf ihre potentielle Wirksamkeit als Therapeutika für die Behandlung von Störungen, die mit neurofibrillären Tangles verbunden sind, insbesondere Alzheimer-Krankheit und andere Tauopathien, getestet und bewertet werden können.
Neurodegenerative Krankheiten, insbesondere Alzheimer-Krankheit, haben eine schwere debilisierende Auswirkung auf das Leben eines Patienten. Weiterhin bilden diese Krankheiten eine enorme gesundheitliche, soziale und ökonomische Belastung. Alzheimer-Krankheit ist der häufigste altersbedingte neurodegenerative Zustand, der etwa 10% der Bevölkerung mit einem Alter von über 65 Jahren und bis zu 45% mit einem Alter von über 85 betrifft (wegen einer neueren Übersicht, siehe Vickers et al., Progress in Neurobiology 2000, 60:139). Zur Zeit beläuft sich dies auf schätzungsweise 12 Millionen Fälle in den USA, Europa und Japan. Diese Lage wird sich mit der demographischen Zunahme der Zahl alter Menschen ("Altwerden der geburtenstarken Jahrgänge") in Industrieländern unvermeidlich noch verschlechtern. Die neuropathologischen Kennzeichen, die in den Gehirnen von Individuen, die unter Alzheimer-Krankheit leiden, auftreten, sind senile Plaques, die aus Amyloid-β-Protein bestehen, und tiefgreifende Änderungen des Cytoskeletts, die mit dem Auftreten von abnormen filamentösen Strukturen und der Bildung von neurofibrillären Bündeln (Tangles) zusammenfallen. AD ist eine fortschreitende Krankheit, die mit frühen Defiziten in der Gedächtnisbildung verbunden ist und letztlich zur vollständigen Erosion der höheren kognitiven Funktion führt. Zur Zeit gibt es keine Heilung für AD und auch keine effektive Behandlung, die den Fortschritt von AD aufhalten oder AD auch nur mit hoher Wahrscheinlichkeit vor dem Tod diagnostizieren kann. Das späte Einsetzen und die komplexe Pathogenese von neurodegenerativen Störungen bedeuten eine gewaltige Herausforderung für die Entwicklung von Therapeutika und Diagnostika. Daher ist es sehr wichtig, geeignete Tiermodelle und in-vivo-Assaysysteme für neurodegenerative Krankheiten zu entwickeln, die bei der Entwicklung und anschließenden Bewertung solcher Therapeutika und Diagnostika nützlich sein können.
Die Pathologie der Alzheimer-Krankheit ist durch zwei Kennzeichen charakterisiert: senile Plaques, die aus proteinartigen Ablagerungen von β-Amyloid-Peptid bestehen, und neurofibrilläre Tangles, die aus Tau-Protein bestehen. Zur Zeit ist man sich noch nicht darüber einig, welche dieser histopathologischen Merkmale enger mit der primären Ursache der Neurodegeneration bei Alzheimer-Krankheit zusammenhängen. Tauopathien sind allgemein durch neuronale und/oder gliale Tau-Einschlüsse, unlösliche Ablagerungen, die Tau oder Tau-ähnliche Strukturen umfassen, das Auftreten von abnormen filamentösen neuronalen Strukturen, Strukturen von geraden Tau-Filamenten und die Bildung von neurofibrillären Tangles, die aus gepaarten helikalen Filamenten bestehen, gekennzeichnet. Tau ist ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein mit niedrigem Molekulargewicht und wird vorwiegend in den Axons des ZNS und in geringerem Maße in Axons des peripheren Nervensystems exprimiert, während es in Astrocyten und Oligodendrocyten kaum überhaupt exprimiert wird. Alternatives Spleißen des für Tau codierenden Gens führt zu mehreren Isoformen, die im adulten menschlichen Gehirn vorhanden sind. Das Spleißereignis ist entwicklungsmäßig reguliert. In fetalem Gehirn werden nur die kürzesten Isoformen exprimiert, während im postnatalen menschlichen Gehirn alle sechs Tau-Isoformen mit einer Länge von 352 bis zu 441 Aminosäuren vorliegen. Sie unterscheiden sich im Ausmaß der Tandem-Wiederholungssequenzen im C-terminalen Bereich. Zum Beispiel bestehen die 3R-Tau- und 4R-Tau-Isoformen aus entweder drei oder vier Wiederholungssequenzen von jeweils 31 und 32 Aminosäuren. Tau-Proteine binden an Mikrotubuli und stabilisieren diese und fördern ihre Polymerisation. Die Bindung von Mikrotubuli durch Tau ist auf hochkonservierte Aminosäuremotive zurückzuführen, die im carboxyterminalen Teil des Proteins lokalisiert sind.
Die 4R-Tau-Isoformen haben eine höhere Bindungsaffinität zu Mikrotubuli und sind aktiver in Bezug auf die Förderung ihres Zusammenbaus als die 3R-Tau-Isoformen. Eines der verblüffendsten Merkmale von Tau-Proteinen ist die Phosphorylierung, die bei etwa 30 von 79 potentiellen Serin-(Ser) und Threonin(Thr)-Phosphorylierungsstellen auftritt. Der Grad der Phosphorylierung nimmt mit dem Alter ab. Folglich ist das Tau-Protein im fetalen ZNS höher phosphoryliert als im adulten ZNS. Einige der Phosphorylierungsstellen befinden sich innerhalb der mikrotubulibindenden Domänen von Tau, und es hat sich gezeigt, dass eine Zunahme der Tau-Phosphorylierung die Bindung von Mikrotubuli negativ reguliert. In diesem Zusammenhang ist bemerkenswert, dass zum Beispiel Ser262 und Ser396, die innerhalb oder neben mikrotubulibindenden Motiven liegen, in fetalem Tau phosphoryliert sind und in den Tau-Proteinen der abnormen gepaarten helikalen Filamente (PHFs), die die in den Gehirnen von AD-Patienten vorhandenen neurofibrillären Tangles (NFTs) bilden, hyperphosphoryliert sind. Gepaarte helikale Filamente sind ultrastrukturelle Komponenten von neurofibrillären Tangles (NFTs). PHFs sind filamentöse Aggregate von Tau-Proteinen, die abnorm hyperphosphoryliert sind und mit spezifischen Anti-Tau-Antikörpern angefärbt und lichtmikroskopisch nachgewiesen werden können. Dasselbe gilt für sogenannte gerade Tau-Filamente. PHFs bilden gezwirnte Bänder, die aus zwei Filamenten bestehen, welche mit einer Periodizität von etwa 80 nm umeinander geschlungen sind. Diese pathologischen Merkmale werden gewöhnlich als "Tau-Pathologie" oder "mit Tau zusammenhängende Pathologie" bezeichnet. Eine ausführlichere Beschreibung von neuropathologischen Merkmalen von Tauopathien findet man bei Lee et al., Annu Rev Neurosci 2001, 24:1121, und Götz 3, Brain Res Brain Res Rev 2001, 35:266. Außer bei Alzheimer-Krankheit (AD) sind NFT auch bei mehreren anderen neurodegenerativen Krankheiten reichlich vorhanden; dazu gehören frontotemporale Demenz mit Parkinson-Krankheit, die mit dem Chromosom 17 verknüpft ist (FTDP-17) und durch Mutationen im Tau-Gen verursacht wird (Hutton et al., Nature 1998, 393:702; Poorkaj et al., Ann. Neurol 1998, 43:815; Spillantini et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95:7737).
Neben NFTs ist β-Amyloid das hauptsächliche histopathologische Kennzeichen von AD. β-Amyloid besteht aus hydrophoben Aβ-Peptiden, die eine starke Tendenz haben, zu verschiedenen oligomeren und filamentösen Zuständen zu aggregieren. SDS-stabile Oligomere und Protofibrillen scheinen besonders neurotoxisch zu sein (Hartley et al., J Neurosci 1999, 19:8876-8884). Frautschy und Mitarbeiter untersuchten die Bedeutung von extrazellulären β-Amyloid-Ablagerungen und ihre Auswirkung auf die AD-Pathologie, indem sie Amyloidkerne in Rattengehirn injizierten (Frautschy et al., Proc Natl Acad Sci USA 1991, 88:8362). Die Autoren berichteten von neurotoxischen Wirkungen von Amyloid und beobachteten eine mikrogliale Entzündungsreaktion und neuronalen Verlust, aber es wurde keine mit Tau zusammenhängende Pathologie, wie abnorme Tau-Aggregation, beobachtet. Eine Induktion von mikrotubuliassoziierter Tau-Phosphorylierung an den Epitopen AT8 und 12E8/Ab31 wurde nach der Injektion von Aβ₄₂ in Gehirne von gealterten Rhesusaffen, aber nicht nach Injektion in Rattengehirne beobachtet (Geula et al., Nat Med 1998, 4:827).
β-Amyloid-Plaques und neurofibrilläre Tangles (NFTs) sind die definierenden neuropathologischen Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit, aber ihre pathophysiologische Beziehung war bisher unklar. Frühere Versuche, Tiermodellsysteme für die Bildung von fibrillären Aggregaten von Tau und neurofibrillären Tangles zu erzeugen, waren in Bezug auf die Bildung von Aggregaten und Tangles mit charakteristischen Merkmalen, die man bei menschlicher Krankheit beobachtet, ohne Erfolg. Ebenso weisen transgene Mausmodelle auf der Basis von Mutationen im Amyloid-Vorläuferprotein nur eine partielle AD-artige Pathologie auf. Solche Tiere entwickeln Amyloid-Plaques, die immunreaktiv in bezug auf hyperphosphoryliertes Tau sind und solchen in Gehirnen mit Alzheimer-Krankheit ähneln, doch fehlen ihnen alle neurofibrillären oder Tangle-artigen Merkmale (Sturchler-Pierrat et al., Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94:13287). Diese APP-Tiermodelle sind Gegenstand von Patentanmeldungen, die deren Verwendung zum Testen von Therapeutika für die Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten beanspruchen (Sommer und Staufenbiel, Patentanmeldung WO 98/03644 ). Eine andere Patentanmeldung (Hutton et al., WO 99/57129 ) beschreibt ein transgenes Tiermodell, das ein Tau-Polypeptid exprimiert. Die zur Erzeugung solcher transgenen Tiere verwendeten Tau-Gensequenzen tragen Mutationen, die mit Tau-Pathologien in Menschen verknüpft sind. Eine erhebliche Zahl von neurofibrillären Tangles oder überhaupt irgendwelche neurofibrillären Tangles wurden jedoch nicht beobachtet. Somit scheint dieses Tiermodell nur von begrenztem Nutzen als Modell für eine Krankheit mit pathologischen Merkmalen, die mit der NFT-Bildung zusammenhängen, wie AD, zu sein. Zwar wurde vor kurzem berichtet, dass transgene Mäuse, die pathogene humane Tau-Mutationen exprimieren, abnorme Tau-haltige Filamente in Gehirnen bilden (Lewis et al., Nat Genet 2000, 25:402; Götz et al., J Biol Chem 2001, 276:529) und dass diese Filamente Ähnlichkeiten mit neurofibrillären Tangles (NFTs) bei mehreren humanen neurodegenerativen Krankheiten einschließlich Alzheimer-Krankheit (AD) und frontotemporaler Demenz mit Parkinson-Krankheit, die mit dem Chromosom 17 verknüpft ist (FTDP-17), aufweisen, doch ist ihre Anzahl erheblich geringer als bei solchen, die man gewöhnlich bei menschlichen Krankheiten findet (Götz, Brain Res Brain Res Rev 2001, 35:266). Diese quantitative Einschränkung verbietet die Verwendung dieser transgenen Mäuse als Modellsystem für diese Krankheiten. Es gibt also ein dringendes Bedürfnis nach einem geeigneten Tiermodellsystem für die Bildung von echten NFTs.
In bezug auf die vorliegende Erfindung ist es jetzt möglich, ein Tiermodellsystem zu erzeugen, das durch eine beschleunigte Produktion und eine erhöhte Anzahl von NFTs sowie durch spezielle Merkmale von NFTs, die denjenigen, die man bei menschlichen AD-Patienten findet, ähnlich sind, gekennzeichnet. Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein nichthumanes Tiermodell und ein in-vivo-Assaysystem bereitzustellen, die zum Testen von Therapien, Verbindungen und Modulationsmitteln von neurodegenerativen Krankheiten, die mit der Bildung von neurofibrillären Tangles verbunden sind, insbesondere Alzheimer-Krankheit, geeignet sind. Die vorliegende Erfindung zeigt, dass die Injektion von β-Amyloid-Aβ₄₂-Fibrillen in Gehirne von bezüglich P301L-mutantem Tau transgenen Mäusen eine Erhöhung der Anzahl von NFTs in Zellkörpern innerhalb der Amygdalen, von denen aus Neuronen zu den Injektionsstellen ragen, auf das Vielfache verursacht. Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die beschleunigte Produktion von NFTs.
Die Singularformen "ein", "eine" und "der/die/das", wie sie hier und in den Ansprüchen verwendet werden, umfassen auch eine Bezugnahme auf den Plural, wenn der Zusammenhang nichts anderes erfordert. Zum Beispiel bedeutet "ein Tier" auch eine Menge von Tieren usw. Der hier verwendete Ausdruck "Fragment" soll z.B. ein alternativ gespleißtes oder verkürztes oder in anderer Weise gespaltenes Transcriptionsprodukt oder Translationsprodukt umfassen. Der hier verwendete Ausdruck "Derivat" bezieht sich auf ein mutantes oder RNA-editiertes oder chemisch modifiziertes oder in sonstiger Weise verändertes Transcriptionsprodukt oder ein mutantes oder chemisch modifiziertes oder in sonstiger Weise verändertes Translationsprodukt. Zum Beispiel kann ein "Derivat" durch Verfahren wie veränderte Phosphorylierung oder Glycosylierung oder Acetylierung oder Lipidierung oder durch veränderte Signalpeptidabspaltung oder andere Typen der Reifungsspaltung erzeugt werden. Diese Vorgänge können auch posttranslational erfolgen. Der Ausdruck "Variante", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid oder Protein in Bezug auf in der vorliegenden Erfindung offenbarte Polypeptide und Proteine, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren am N-Terminus und/oder am C-Terminus und/oder innerhalb der nativen Aminosäuresequenzen der nativen Polypeptide oder Proteine der vorliegenden Erfindung hinzugefügt und/oder substituiert und/oder deletiert und/oder inseriert sind. Weiterhin soll der Ausdruck "Variante" jede kürzere oder längere Version eines Polypeptids oder Proteins umfassen. Varianten umfassen Proteine und Polypeptide, die aus der Natur isoliert oder durch rekombinante und/oder synthetische Mittel produziert werden können. "Native Proteine oder Polypeptide" bezieht sich auf natürlich vorkommende verkürzte oder sezernierte Formen, natürlich vorkommende Variante Formen (z.B. Spleißvarianten) und natürlich vorkommende allelische Varianten. Die Ausdrücke "Mittel", "Modulationsmittel" oder "Verbindung" beziehen sich auf irgendeine Substanz, Chemikalie, Zusammensetzung oder Extrakt, die bzw. der eine positive oder negative biologische Wirkung auf ein Tier, eine Zelle, ein Gewebe, eine Körperflüssigkeit oder im Kontext irgendeines biologischen Systems oder irgendeines untersuchten Assaysystems hat. Es kann sich um Agonisten, Antagonisten, partielle Agonisten oder inverse Agonisten eines Angriffspunkts handeln. Solche Mittel, Modulationsmittel oder Verbindungen können Nucleinsäuren, natürliche oder synthetische Peptide oder Proteinkomplexe oder Fusionsproteine sein. Es kann sich auch um Antikörper, organische oder anorganische Moleküle oder Zusammensetzungen, kleine Moleküle, Wirkstoffe und beliebige Kombinationen irgendwelcher der obigen Mittel handeln. Sie können zum Testen, für diagnostische oder therapeutische Zwecke verendet werden.
Neurodegenerative Krankheiten oder Störungen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen Alzheimer-Krankheit, Niemann-Pick-Krankheit, frontotemporale Demenz mit Parkinson-Krankheit (FTDP-17), progressive supranukleäre Paralyse, kortikobasale Degeneration, Parkinson-Demenz-Komplex von Guam und andere Tauopathien. Weitere Zustände, die neurodegenerative Vorgänge beinhalten, sind zum Beispiel Parkinson-Krankheit, Chores Huntington, amyotrophe laterale Sklerose und andere Motorneuronerkrankungen, zerebrovaskuläre Demenz, Multi-System-Atrophie sowie milde kognitive Beeinträchtigungen. Eine Liste von mit Tau zusammenhängenden Krankheiten und Störungen ist in einer Veröffentlichung von Lee et al. (Annu Rev Neurosci, 2001, 24:1122) zu finden.
Die vorliegende Erfindung gibt ein Verfahren zur Erhöhung der Zahl der neurofibrillären Tangles in einem transgenen Nager an, der ein rekombinantes Gen exprimiert, das für Tau-Protein codiert, wobei die Zunahme der neurofibrillären Tangles durch Injektion von APP oder eines β-Amyloid-Fragments davon induziert wird. In einem anderen Aspekt gibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Beschleunigung der Produktion von neurofibrillären Tangles in einem transgenen Nager an, der ein rekombinantes Gen exprimiert, das für Tau-Protein codiert, wobei die beschleunigte Produktion von neurofibrillären Tangles durch Injektion von APP oder eines β-Amyloid-Fragments davon induziert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der angegebenen Verfahren handelt es sich bei dem injizierten β-Amyloid um Aβ₄₂. Weiterhin ist bevorzugt, dass das verabreichte Aβ₄₂ fibrillär, voraggregiert oder aggregiert ist.
Der nichthumane transgene Nager ist vorzugsweise eine Maus, ein Meerschweinchen oder eine Ratte. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der transgene Nager, in dem neurofibrilläre Tangles produziert werden sollen, vorzugsweise eine Maus. In einer bevorzugten Ausführungsform exprimiert die transgene Maus ein rekombinantes Gen, das für humanes Tau codiert, vorzugsweise die Tau-Protein-Isoform, die vier mikrotubulibindende Motive enthält und die auch als Isoform mit vier Wiederholungssequenzen bezeichnet wird. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform exprimiert die transgene Maus ein rekombinantes Gen, das für P301-L-mutantes Tau codiert. Andere Tau-Gensequenzen mit einer Mutation, die mit Tau-Pathologie verknüpft ist, können jedoch ebenfalls als Transgen in dem Tier exprimiert werden.
In den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird β-Amyloid durch Injektion in das Gehirn des Tiers, insbesondere durch Injektion in den Hippocampus oder Kortex, appliziert oder verabreicht. Ein bevorzugtes Verfahren ist die stereotaktische Injektion (Paxinos, The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Academic Press, San Diego, 1997).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Verfahren der vorliegenden Erfindung erfolgt die Zunahme und/oder die beschleunigte Produktion von neurofibrillären Tangles vorwiegend in der Amygdala des Gehirns des Tiers, insbesondere in der basolateralen Amygdala. Eine solche Zunahme und/oder beschleunigte Produktion von neurofibrillären Tangles soll jedoch nicht auf die Amygdala beschränkt sein. Andere Bereiche des Gehirns, zum Beispiel der parietale Kortex, können die gewünschte Wirkung ebenfalls zeigen. Vorzugsweise erfolgt die Zunahme der neurofibrillären Tangles auf ein Mehrfaches, vorzugsweise wenigstens auf das Zweifache, der Menge bei einem Kontrolltier, dem kein APP oder Fragment, Derivat oder Variante davon, insbesondere β-Amyloid, verabreicht wurde. Ein geeignetes Kontrolltier kann zum Beispiel ein Tier sein, das eine falsche Injektion oder Scheininjektion oder Kontrollinjektion erhalten hat, zum Beispiel mit einem Aβ_42-1-Umkehrpeptid. In einem anderen bevorzugten Beispiel erfolgt die Zunahme der neurofibrillären Tangles wenigstens auf das Fünffache der Menge bei einem Kontrolltier, dem kein APP oder Fragment davon, insbesondere β-Amyloid, verabreicht wurde.
Die hier beschriebenen Verfahren können weiterhin nützlich sein für die Induktion anderer neuropathologischer Merkmale, die den bei Alzheimer-Krankheit beobachteten Merkmalen ähnlich sind, wie die Bildung von Neuropilfäden und/oder die Degeneration von Neuriten.
Die Erfindung betrifft einen transgenen Nager, der ein rekombinantes Gen exprimiert, das für Tau-Protein codiert, wobei der Nager neurofibrilläre Tangles erzeugen kann. Weiterhin ist ein Merkmal der vorliegenden Erfindung ein transgener Nager, der ein rekombinantes Gen exprimiert, das für Tau-Protein codiert, wobei der Nager eine erhöhte Zahl von neurofibrillären Tangles erzeugen kann. Außerdem ist ein weiteres Merkmal der Erfindung ein transgener Nager, der ein rekombinantes Gen exprimiert, das für Tau-Protein codiert, wobei der Nager zu einer beschleunigten Produktion von neurofibrillären Tangles befähigt ist.
Es ist eine besondere Ausführungsform der Erfindung, dass alle die oben genannten transgenen Nager neurofibrilläre Tangles erzeugen, die mit denen vergleichbar sind, die man gewöhnlich bei humanen neurodegenerativen Krankheiten findet.
Die hier beschriebenen Nager umfassen APP oder ein β-Amyloid-Fragment davon in einer ausreichenden Menge, um die Produktion von neurofibrillären Tangles zu induzieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform beansprucht die vorliegende Erfindung einen transgenen Nager, der ein rekombinantes Gen exprimiert, das für Tau-Protein codiert, wobei die Zunahme der Zahl der neurofibrillären Tangles und/oder die beschleunigte Produktion von neurofibrillären Tangles durch Injektion von APP oder eines β-Amyloid-Fragments davon induziert wird. Das β-Amyloid wird vorzugsweise in das Gehirn des Nagers injiziert, insbesondere durch Injektion in den Hippocampus oder den Kortex. Alternativ dazu kann ein für APP oder ein β-Amyloid-Fragment davon codierendes rekombinantes Gen coexprimiert werden, wobei das APP zur Erzeugung eines Spaltprodukts enzymatisch verarbeitet wird, wobei es sich bei dem Spaltprodukt um β-Amyloid handelt. Vorzugsweise ist das coexprimierte APP ein mutantes APP, insbesondere eine mit der Pathologie der Alzheimer-Krankheit verbundene Mutante. Die Coexpression kann zum Beispiel durch rekombinante Expressionsverfahren durchgeführt werden, wie sie im Stand der Technik beschrieben sind.
Die transgenen Nager gemäß der vorliegenden Erfindung liefern einen in-vivo-Assay zum Bestimmen oder Bewerten der Wirksamkeit von Therapien oder Modulationsmitteln oder Verbindungen zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, insbesondere Alzheimer-Krankheit, frontotemporale Demenz (FTD) und andere neurodegenerative Krankheiten, die mit der Bildung von neurofibrillären Tangles verbunden sind. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der in-vivo-Assay zum Bestimmen oder Bewerten der Wirksamkeit von amyloidsenkenden Therapien, wie β-Amyloid-Impfung, oder NFT-reduzierenden Therapien geeignet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ein in-vivo-Assay zum Beispiel die folgenden Schritte: (i) Bereitstellen eines transgenen Nagers, der neurofibrilläre Tangles produziert, wobei der Nager nach den Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt wird, (ii) In-Kontakt-Bringen des Nagers mit einer Verbindung oder einem Modulationsmittel oder alternativ dazu Anwenden einer Therapie bei dem Nager und (iii) Bewerten der Fähigkeit der Verbindung oder des Modulationsmittels oder der Therapie zur Modulation der Bildung von neurofibrillären Tangles und/oder der Bildung von Neuropilfäden und/oder der Degeneration von Neuriten oder anderer mit AD zusammenhängenden Pathologien bei dem Nager. Die Bestimmung der Bildung von neurofibrillären Tangles in dem in-vivo-Assay kann nach einer Vielzahl von Verfahren erfolgen, zum Beispiel Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie, und sie kann die Verwendung von konformationsabhängigen Antikörpern umfassen, die ein Tau-Molekül im Kontext von neurofibrillären Tangles erkennen und von einem Tau-Molekül, das in anderen Zuständen der Aggregation vorkommt, unterscheiden können. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die konformationsabhängigen Antikörper optisch markiert, vorzugsweise fluoreszenzmarkiert, und können zum Beispiel durch mehrere optische Methoden nachgewiesen werden, wie Fluoreszenz-Polarisationsspektroskopie, Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie, Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie, Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse, Fluoreszenzlebensdauermessungen, Fluoreszenzanisotropiemessungen, Fluoreszenzresonanzenergietransfer oder Kombinationen davon. Alternativ dazu können in einer anderen Ausführungsform Antikörper verwendet werden, die phosphorylierte Epitope von Tau, insbesondere Epitope, deren Phosphorylierungsgrad mit dem Zustand der Tau-Aggregation und Bildung von neurofibrillären Tangles, wie man sie bei Alzheimer-Krankheit beobachtet, korreliert, insbesondere das Tau-Epitop S422, erkennen können.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden ausführlichen Beschreibung der Figuren und Beispiele hervor, die nur der Veranschaulichung dienen und den Rest der Offenbarung oder den Umfang der Erfindung in den Ansprüchen nicht einschränken sollen.
1 Stereotaktische Injektionen von Suspensionen von Aβ₄₂-Fibrillen oder Aβ_42-1 in den somatosensorischen Kortex einer Hemisphäre sowie den CA1-Bereich des Hippocampus der kontralateralen Hemisphäre von Mäusegehirnen. Stellen von Injektionen sind durch symbolische Spritzen angezeigt.
2 Stereotaktische Injektionen von Aβ₄₂- oder Aβ_42-1-Fibrillen in den somatosensorischen Kortex und den CA1-Bereich des Hippocampus von Mäusegehirnen. Durch Elektronenmikroskopie wurde bestätigt, dass aggregiertes synthetisches Aβ₄₂ Fibrillen (A) bildete, während ein umgekehrtes Kontrollpeptid, Aβ_42-1 (B), keine bildete. Die Mäusegehirne wurden 18-60 Tage nach der Injektion analysiert. Maßstabsbalken: A, B: 0,4 µm.
3 Suspensionen von Aβ₄₂-Fibrillen oder Aβ_42-1 wurden stereotaktisch in den somatosensorischen Kortex einer Hemisphäre sowie den CA1-Bereich des Hippocampus der kontralateralen Hemisphäre von Mäusegehirnen injiziert. Der Antikörper 6E10 zeigte, dass Aβ₄₂-Fibrillen wenigstens 45 tage lang nach der Injektion an den Injektionsstellen vorhanden waren (A). Als Färbekontrollen wurden Amyloidplaques enthaltende APP^SW-Transgene (Hsiao et al., Neuron 1995, 15:1203) und humane AD-Gehirnschnitte mit aufgenommen. Aβ₄₂ und Aβ_42-1 erhöhten das Vorkommen von reaktiven Astrocyten sowohl um die Injektionsstelle (B) herum als auch in der Amygdala (C). Die reaktive Astrocytose persistierte wenigstens 45 Tage lang. Durch die stereotaktische Anwendung von Texasrot-gekoppeltem Dextran in identische Koordinaten wurde eine Teilmenge von Neuronen in der Amygdala angefärbt, was bestätigte, dass diese bis in die Injektionsstellen ragten (D). A-D: Sieben Monate altes P301-L-Weibchen, 45 Tage nach der Injektion analysiert. Maßstabsbalken: A-D: 50 µm.
4 Anwesenheit von neurofibrillären Tangles (NFTs) in P301L-Tau-transgenen Mäusen, die von Aβ₄₂-Fibrillen induziert wurden. Aβ₄₂-Fibrillen induzierten bereits 18 Tage nach der Injektion die Gallyas-positive Bildung von zahlreichen NFTs und Neuropilfäden in der Amygdala und gelegentlich im Kortex. Amygdala einer sechs Monate alten weiblichen P301L-transgenen Maus, 18 Tage nach der Injektion analysiert. Maßstabsbalken: 25 µm.
5 Aβ₄₂-Fibrillen lösen bereits 18 Tage nach der Injektion die Bildung von zahlreichen Gallyas-positiven NFTs und Neuropilfäden in der Amygdala und gelegentlich im Kortex von P301L-transgenen Mäusen aus. Gallyas-Silber-Imprägnierungen von NFTs in der Amygdala und dem parietalen Kortex von P301L-Tau-transgenen Mäusen, denen Aβ₄₂ (A, C) und Aβ_42-1 injiziert wurde. Eine Teilmenge von NFTs wurde auch mit Thioflavin-S angefärbt (D). A: Acht Monate altes P301L-Männchen, 40 Tage nach der Injektion analysiert; B: 6,5 Monate altes P301L-Weibchen, 40 Tage nach der Injektion analysiert; C: sechs Monate alte weibliche P301L-transgene Maus, 18 Tage nach der Injektion analysiert; D: sieben Monate altes P301L-Weibchen, 45 Tage nach der Injektion analysiert. Maßstabsbalken: A, B: 25 µm; C, D: 12,5 µm.
6 Neurofibrilläre Tangles (NFTs) in P301L-Tau-transgenen Mäusen, die von Aβ₄₂-Fibrillen induziert wurden. Aβ₄₂-Fibrillen lösen die Bildung von zahlreichen Gallyas-positiven NFTs und Neuropilfäden in der Amygdala und gelegentlich im Kortex von P301L-transgenen Mäusen aus (A). Die induzierten NFTs waren denjenigen, die man in Gehirnen findet, die von AD-Patienten erhalten wurden, sehr ähnlich (B). Beide Objektträger wurden parallel nach derselben Vorschrift angefärbt. A: 5,25 Monate altes P301L-Männchen, 21 tage nach der Injektion analysiert. B: Humane, 86 Jahre alte AD-Patientin.
7 Aβ₄₂-Fibrillen lösen bei P301L-Tau-transgenen Mäusen die Bildung von neurofibrillären Tangles NFTs aus. Die Immunelektronenmikroskopie von dünnen Schnitten der Amygdala zeigt AD-artige Tau-Filamente (unter Verwendung von Antikörper AT8). Maßstabsbalken: geringe Vergrößerung: 800 µm (A); starke Vergrößerung: 100 µm (B).
8 Gallyas-positive NFTs in der Amygdala. NFTs wurden am Tag 22 nach der Injektion in transgenen Mäusen, denen Aβ₄₂, Aβ_42-1 oder nichts injiziert wurde, in nichttransgenen Wurfgeschwistern als Kontrollen sowie in transgenen Mäusen, die humanes Wildtyp-Tau exprimieren (Probst et al., Acta Neuropathol (BerI) 2000, 99:469), gezählt. Das mittlere Alter in Monaten ± SD zum Zeitpunkt der Analysen ist angegeben. Gallyas-positive NFTs wurden gemäß den hier beschriebenen Verfahren gezählt und stellen die Summe in 20 standardisierten Frontalschnitten dar, die sowohl die ipsilaterale als auch die kontralaterale Amygdala umfassen. Mann-Whitney-U-Test: P = 0,007 (zweiseitige exakte Signifikanz) beim Vergleich von P301L-Mäusen, denen Aβ₄₂ bzw. Aβ_42-1 injiziert wurde.
9 Abnorme Phosphoepitope von Tau, induziert durch Aβ₄₂-Fibrillen. Das R145d-Epitop S422 war im Hippocampus und Kortex nicht phosphoryliert (A), aber in der Amygdala spezifisch durch Aβ₄₂-Fibrillen induziert (B, starke Vergrößerung). Im Gegensatz zu R145d und AT100 war das AT8-Epitop in vielen Neuronen des Hippocampus. Kortex (C) und der Amygdala (D, starke Vergrößerung) phosphoryliert. A-D: Sechs Monate altes P301L-Männchen, 18 Tage nach der Injektion analysiert. Maßstabsbalken: A, C: 100 µm; B, D: 25 µm. Schematische Karte einer Mäusegehirn-Hemisphäre, die relevante Hirnbereiche anzeigt (E).
10 Abnorme Phosphoepitope von Tau, induziert durch Aβ₄₂-Fibrillen. Doppelte Immunofluoreszenz-Anfärbung mit R145d (Tau-Phospho-Epitop S422) und AT100 (Phospho-Epitop S212/T214) zeigte, dass R145d-positive Neuronen in der Amygdala AT100-positiv waren (A, B, Mischung: C). Maßstabsbalken: 40 µm.
11 Abnorme Phosphoepitope von Tau, induziert durch Aβ₄₂-Fibrillen. Ungefähr die Hälfte der R145d-positiven Neuronen (A, B) trugen Gallyas-positive neurofibrilläre Tangles (C, D), und dazu gehörten im Allgemeinen die Neuronen, die durch R145d (Phospho-S422) am intensivsten gefärbt wurden (durch Pfeile angezeigt).
A-D: Sieben Monate altes P301L-Weibchen, 45 Tage nach der Injektion analysiert. Maßstabsbalken: 40 µm.
Beispiele
Um zu bestimmen, ob β-Amyloid die NFT-Bildung beschleunigen kann, wurden synthetische Aβ₄₂-Fibrillen in den somatosensorischen Kortex und den Hippocampus von fünf bis sechs Monate alten P301L-Tau-transgenen Mäusen und nichttransgenen Wurfgeschwistern injiziert (siehe verfahren Abschnitt (i)-(iii)). Als Kontrollpeptid wurde die umgekehrte Sequenz, Aβ_42-1 die von der identischen Quelle abgeleitet war, verwendet (Verfahren Abschnitt (ii)). Aβ₄₂-Fibrillen wurden durch Schüttelinkubation bei 37 °C erzeugt und durch Elektronenmikroskopie bestätigt (2A, B) (Verfahren Abschnitt (ii) und (iii)). Aβ₄₂-Fibrillen waren in vivo sowohl bei P301L-transgenen als auch bei Wildtyp-Kontrollmäusen stabil und wenigstens bis 45 Tage nach den Injektionen leicht nachweisbar (3A). Amyloidablagerungen im Gehirn gingen mit einer erheblichen reaktiven Astrogliose sowohl an den Injektionsstellen (3B) als auch an der Amygdala (3C) einher (Verfahren siehe Abschnitt (iv)); diese Ablagerungen wurden sowohl bei transgenen Mäusen, denen Aβ₄₂, als auch bei solchen, denen eine Kontrolle injiziert wurde, beobachtet und persistierten wenigstens 45 tage lang nach der Injektion. Diese Reaktion kann mit der Tatsache zusammenhängen, dass Neuronen in der Amygdala bis zu den Injektionsstellen ragen, wie durch den retrograden Transport von Texasrot-konjugiertem Dextran von der Injektionsstelle im somatosensorischen Kortex zu Zellkörpern in der Amygdala gezeigt wird (3D) (Verfahren Abschnitt (iv)).
Achtzehn Tage nach den Injektionen von Aβ₄₂ offenbarte eine Gallyas-Silber-Imprägnierung (Abschnitt (iv)) zahlreiche NFTs (5A-C, 6A) zusammen mit Neuropilfäden und degenerierenden Neuriten (4) in der Amygdala von P301L-, aber nicht von Wildtypmäusen. Gelegentliche NFTs waren auch im parietalen Kortex vorhanden (5C). Die NFTs in Mäusen (6A) waren denjenigen in AD-Gehirnen, die parallel nach derselben Vorschrift angefärbt wurden, sehr ähnlich (6B). Außerdem waren die Neuropilfäden denjenigen, die man bei AD kennt, ähnlich (Braak et al., Neurosci Lett 1986, 65:351; McKee et al., Ann Neurol 1989, 26:652; Velasco et al., Brain Res 1998, 813:329). Eine Teilmenge von Gallyas-positiven neurofibrillären Tangles in den Mäusen wurde ebenfalls mit Thioflavin-S angefärbt, was mit der Histopathologie von AD im Einklang steht (5D). Die Filamente hatten eine Breite von 20-25 nm und eine Periodizität von 90 nm und werden am besten als verzwirnte Bänder beschrieben (7). In menschlichen Trägern verursacht die P301L-Mutation eine vorwiegende Expression von Isoformen mit 4 Wiederholungssequenzen (4R) mit einer kleinen Menge an Wildtyp-3R-Isoformen, was zu 15 nm breiten verzwirnten Filamenten mit einer Periodizität von mehr als 130 nm führt (Spillantini et al., Am 3 Pathol 1998, 153:1359). Da Mäuse endogen nur 4R-Tau-Isoformen exprimieren und das Transgen so entworfen wurde, dass es 4R-Human-P301L-Tau exprimiert, enthielten die hier beobachteten Filamente kein 3R-Tau. Was wichtig ist, die humanen intronischen FTDP-17-Mutationen, die die Bildung von 3R-Tau reduzieren, verursachen auch verzwirnte Bänder, die hauptsächlich aus 4R-Tau bestehen. Es ist daher möglich, dass die relativen Mengen an 3R- und 4R-Isoformen zur ultrastrukturellen Morphologie der Filamente beitragen.
Quantitative Analysen zeigten bei den P301L-Mäusen, denen Aβ₄₂ injiziert wurde, fünfmal mehr Gallyas-positive NFTs als bei den Mäusen, denen Aβ_42-1 oder nichts injiziert wurde (5A, B; 8). Querschnitts-Zeitverlauf-Analysen der NFT-Bildung zeigten anfängliche NFTs 18 Tage nach der Aβ₄₂-Injektion, mit weiteren Erhöhungen der Anzahl (n = 58) wenigstens bis 60 Tage nach der Injektion. Die NFT-Bildung in beiden Hemisphären bei den P301L-Mäusen, denen Aβ₄₂ injiziert wurde, variierte nicht mit dem Geschlecht (Weibchen: 23 ± 21; Männchen: 23 ± 4; n = 7, P = 0,86, Mann-Whitney-U-Test). Dagegen entwickelten in einem Alter von 6 bis 8,5 Monaten P301L-Männchen, denen Aβ_42-1 injiziert wurde, einige NFTs, und P301L-Weibchen entwickelten keine NFTs. Dieser Unterschied war statistisch signifikant (Weibchen: 0; Männchen: 5,8 ± 1,9; n = 7, P < 0,01, Mann-Whitney-U-Test). Die Anwesenheit der Tau-Mutation ist bevorzugt, um die NFT-Bildung zu induzieren.
Ein überraschendes und bemerkenswertes Ergebnis war die räumliche Trennung der Stelle der Aβ₄₂-Injektion von der entfernten NFT-Bildung in der Amygdala ohne signifikante Unterschiede zwischen der ipsilateralen und der kontralateralen Amygdala (11,4 ± 10,13 und 9,4 ± 8,0; n = 7, P = 0,058, Wilcoxon-Signed-Ranks-Test). Dies legt die Möglichkeit nahe, dass eine Beschädigung von präsynaptischen Endigungen oder Axons von Neuronen, die bis zur Injektionsstelle ragen, eine NFT-Bildung in den jeweiligen Zellkörpern verursachte. Die anatomische Trennung der Amyloid-Ablagerung und NFT-Bildung steht daher im Einklang mit der Aβ₄₂-induzierten axonalen Schädigung und möglicherweise dem beeinträchtigten axonalen Transport von Tau (Varadarajan et al., J Struct Biol 2000, 130:184). Wir bestätigten, dass die betroffene neuronale Population in der Amygdala bis zu den kortikalen Injektionsstellen ragte, indem wir den retrograden Transport von Texasrot-konjugiertem Dextran von den Injektionsstellen zur Amygdala zeigten (3D). Andere Mechanismen der somatodendritischen Akkumulierung von Tau sind weniger wahrscheinlich: Zuerst schlossen wir eine direkte Einwirkung von Aβ₄₂-Fibrillen der Zellkörper in der Amygdala durch Immunhistochemie aus. Zweitens sind Zunahmen der Synthese von Tau-Proteinmengen unwahrscheinlich, was durch die Abwesenheit von axonalen Verdünnungen oder Sphäroiden in Neuronen der Amygdala angezeigt wird. Drittens würde ein diffusionsfähiger toxischer Faktor kaum erklären, warum Neuronen in der Nähe der Injektionsstellen keine NFTs entwickeln. Bei humanen Patienten mit AD wird häufig eine anatomische Trennung von Amyloidplaques und NFTs gefunden, wobei sich die Amyloidablagerungen um Synapsen herum und NFTs in den jeweiligen Zellkörpern von Projektionsneuronen (Price und Sisodia, Ann Rev Med 1994, 45:435). Außerdem gehört die Amygdala zu den am stärksten anfälligen Bereichen, die bei humanen Patienten früh von der NFT-Bildung betroffen sind (Arnold et al., Cereb Cortex 1991, 1:103). Die starke Anfälligkeit der Amygdala bei unseren P301L-Mäusen wird dadurch gestützt, dass Neuronen in der Amygdala ähnliche Mengen des Transgens exprimierten wie kortikale oder hippocampale pyramidale Neuronen, doch diese entwickelten kaum irgendwelche NFTs (Götz et al., 3 Biol Chem 2001, 276:529). Obwohl unsere Experimente nicht formal auf die Beteiligung von Astrocyten und Mikroglia an der NFT-Bildung abzielten, war die Aktivierung dieser Zellen allein eindeutig nicht ausreichend für die NFT-Bildung, da Aβ₄₂ und Aβ_42-1 Astrocyten und Mikrogliazellen sowohl um die Injektionsstellen herum als auch in der Amygdala in ähnlicher Weise aktivierten (3B, C).
Die Bildung von NFTs bei AD ist mit einer Hyperphosphorylierung und Konformationsänderungen von Tau assoziiert (Grundke-Iqbal et al., Proc Natl Acad Sci USA 1986, 83:4913; Braak und Braak, Neurobiol Aging 1995, 16:271; Jicha et al., J Neurosci Res 1997, 48:128). Um zu bestimmen, ob die Aβ₄₂-induzierte NFT-Bildung bei P301L-Mäusen mit einer veränderten Phosphorylierung und Konformation von Tau assoziiert ist, verwendeten wir Antikörper, die gegen abnorme Phosphoepitope gerichtet waren (R145d, pS⁴²², AT100, TG3) (Goedert et al., Biochem J 1994, 301:871; Dickson et al., Neurobiol Aging 1995, 16:285; Tanaka et al., FEBS Lett 1998, 426:248), hyperphosphorylated epitopes (AT8, S199P, AT180, 12E8, AD2, PHF1) (Goedert et al., Biochem J 1994, 301:871; Greenberg et al., J Biol Chem 1992, 267:564; Goedert et al., Neurosci Lett 1995, 189:167; Seubert et al., J Biol Chem 1995, 270:18917; Buee-Scherrer et al., Brain Res Mol Brain Res 1996, 39:79; Delacourte et al., Ann Neurol 1998, 43, 193; Sergeant et al., J Neurochem 1999, 72:1243), sowie konformationsabhängige Antikörper (TG3, MC1) (Jicha et al., J Neurosci Res 1997, 48:128; Dickson et al., Neurobiol Aging 1995, 16:285), wobei wir veröffentlichte Standardverfahren verwendeten (siehe Verfahren Abschnitt (iv) und Götz et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95:12370).
Während mehrere Antikörper einschließlich AT8 phosphoryliertes Tau in den gesamten Gehirnen von P301L-Mäusen unabhängig von den Injektionen nachwiesen, wiesen R145d/pS⁴²² und AT100, die gegen die Phosphoepitope S422 bzw. S212/T214 gerichtet sind, spezifisch NFTs und Neuronen nur als Reaktion auf Aβ₄₂ nach (9A, B; 10A-C). Bemerkenswerterweise war das räumliche Verteilungsmuster dieser abnorm phosphorylierten Formen von Tau identisch mit demjenigen, das man bei Gallyas-Färbungen beobachtet, und trat wiederum vorwiegend in der Amygdala auf (9A, B). Die kombinierte Anfärbung zeigte, dass Neuronen, die mit R145d/pS⁴²² angefärbt wurden, auch mit AT100 angefärbt wurden (10A-c). Weder R145d noch AT100 färbten irgendwelche Zellen in nichttransgenen Mäusen durch Immunfärbung an. Die Spezifität der R145d-, pS⁴²²- und AT100-Immunreaktivität für Aβ₄₂-assoziierte abnorme Phosphorylierung war bemerkenswert, da diese Antiseren bei P301L-Tau-transgenen Mäusen, denen nichts oder Aβ_42-1 injiziert wurde, kaum irgendwelche Signale zeigten und bei transgenen Mäusen, die humanes Wildtyp-Tau exprimierten, gar keine Signale zeigten. Außerdem wurden alle Gallyas-positiven NFTs auch mit R145d angefärbt, wie es durch die Vorschriften für die sequentielle Immunfluoreszenz und die Gallyas-Silber-Färbung angezeigt wird, was stark vermuten lässt, dass die NFTs bei P301L-Mäusen S422-phosphoryliertes Tau enthielten. Halb quantitative Analysen zeigten, dass ungefähr die Hälfte der R145d-positiven Neuronen (11A, B) Gallyas-positiv waren (11C, D), und R145d färbte diese Neuronen im Allgemeinen intensiver als Zellen ohne NFTs.
Zusammen steht das Ergebnis unserer Immunfärbung mit der Möglichkeit im Einklang, dass die Phosphorylierung der Epitope S212/T214 und S422 eng mit der NFT-Bildung verbunden ist. Die hier offenbarten Daten übertreffen die früheren Ergebnisse, dass Aβ₄₂ in vitro und in vivo eine Tau-Phosphorylierung an den AT8- und 12E8/Ab31-Epitopen induzierten (Busciglio et al., Neuron 1995, 14:879; Geula et al., Nat Med 1998, 4:827). Bei unseren P301L-Mäusen war Tau an diesen Epitopen phosphoryliert, auch in Abwesenheit von injiziertem Aβ₄₂. Daher mögen diese Epitope notwendig sein, sie waren jedoch eindeutig nicht ausreichend für die NFT-Bildung bei P301L-Mäusen. Bei der Verwendung von R145d/pS⁴²² und AT100 fanden wir heraus, dass auf Aβ₄₂-Injektionen eine Phosphorylierung von Tau an S212/T214 und S422 folgte, was eine Rolle dieser Epitope bei der NFT-Bildung vermuten ließ.
Zusammengefasst belegen die hier offenbarten Daten, dass Aβ₄₂-Fibrillen die NFT-Bildung bei P301L-Mäusen erheblich beschleunigen können. Die nach dem Verfahren der Erfindung erzeugten neurofibrillären Tangles ähneln stark denjenigen, die aus Gehirnen von AD-Patienten extrahiert werden und deren Bildung bereits innerhalb von 18 Tagen nach der Injektion erreicht wurde. Die hier offenbarten Daten beweisen, dass bei transgenen Mäusen die Wechselwirkung von β-Amyloid mit der P301L-Mutation für die NFT-Bildung erforderlich ist; weder β-Amyloid noch die Mutation allein waren ausreichend, um große Zahlen von NFTs zu erzeugen. Die gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugten Mäuse liefern einen in-vivo-Assay, um zu bestimmen, ob solche amyloidsenkenden Therapien wie Aβ-Impfung bei der Verhinderung der NFT-Bildung in vivo wirksam sind.
Verfahren

(i) Erzeugung von transgenen Mäusen: Zur Erzeugung von transgenen Mäusen wurde die humane pathogene Tau-Mutation P301L durch einen PCR-vermittelten Ansatz in die cDNA eingeführt, die die längste humane Gehirn-Tau-Isoform codiert. Diese Isoform enthielt die Exons 2 und 3 sowie vier mikrotubulibindende Repeats (2⁺3⁺4R, htau40). Um P301L-Tau-transgene von Wildtyp-Tau-transgenen Mäusen unterscheiden zu können, wurde eine stumme Mutation in das P301L-Konstrukt eingeführt, die eine diagnostische SmaI-Restriktionsstelle zerstört. Die cDNA wurde mit einer Kozak-Consensus-Sequenz versehen und in einen murinen genomischen Thy.1.2-Expressionsvektor subkloniert. Die Vektorsequenzen dieses Konstrukts (pR5 genannt) wurden vor der Mikroinjektion entfernt. Transgene Mäuse wurden durch pronukleäre Injektion von B6D2F1xB6D2F1-Embryonen produziert. Founder wurden durch PCR-Analyse von Lysaten aus Schwanzbiopsien identifiziert, wobei man zwei verschiedene Primerpaare verwendet. Foundertiere wurden mit C57BL/6-Mäusen gekreuzt, um Linien zu etablieren. Transgene Mäuse wurden einem Screening mit den folgenden Oligonucleotiden unterzogen: Tau-I: 5'-GGAGTTCGAAGTGATGGAAG-3' und Tau-K: 5'-GGTTTTTGCTGGAATCCTGG-3'. Die Amplifikation ergab ein Produkt von 500 bp. Ein Restriktionsverdau des Amplifikationsprodukts durch SmaI bestätigte die Anwesenheit des P301L-Transgen. Von zehn unabhängigen transgenen Linien hatten vier vergleichbare Expressionsniveaus, wie durch Immunoblot-Analyse bestimmt wurde. Linie pR5-183 wurde in der vorliegenden Studie verwendet.
(ii) Produktion von Aβ42- und reversen Aβ42-1-Fibrillen: Aβ₄₂ (Bachem, Nr. H-1368, Charge Nr. 524548) und Aβ_42-1 (Bachem, Nr. H-3976, Charge Nr. 536763) wurden in PBS mit Endkonzentrationen von 250 µM rekonstituiert, 84 Stunden lang in einem Eppendorf-Thermomischer bei 37 °C mit 1000 U/min geschüttelt und durch Elektronenmikroskopie analysiert. Präparate wurden auf kohlenstoffbeschichtete 300-mesh-Gitter gelegt und mit 2% Phosphowolframsäure angefärbt. Das Präparat des umgekehrten Peptids Aβ_42-1 bestand aus unlöslichen Aggregaten, die durch Negativkonstrastierung in der Elektronenmikroskopie nicht leicht nachweisbar waren (2B). Mikroskopische Aufnahmen wurden bei einer Betriebsspannung von 80 bis 100 kV und einer Nennvergrößerung von 40 000 mit einem Philips-Modell-CM12-Elektronenmikroskop aufgezeichnet.
(iii) Stereotaktische Injektion: Stereotaktische Injektionen in Mäusegehirn wurden gemäß den Vorschriften von Paxinos (Paxinos K B, The mouse brain in stereotaxic coordinates, Academic Press, San Diego, 1997) durchgeführt. Mäuse wurden mit einem Gemisch von 2% Xylatin und 10% Ketamin anästhetisiert, und 1,5 µl Peptidsuspension wurde ihnen stereotaktisch in den CA1-Bereich der hippocampalen Formation der rechten Hemisphäre (Koordinaten: AP –1,9 mm vom Bregma, LAT –1,0 mm, DV +1,9 mm) und in den Kortex der linken Hemisphäre (Koordinaten: AP –1,9 mm vom Bregma, LAT +2,0 mm, DV +1,2 mm; beinhaltet den Stumpfbereich des somatosensorischen Kortex 1, S1Tr) injiziert, wobei eine von einer Minipumpe (Motorized Stereotaxic Injector, Stoelting Co.) angetriebene 10-µl-Hamilton-Spritze mit einer Injektionsgeschwindigkeit von 0,15 µl/min verwendet wurde. Die Nadel wurde weitere zehn Minuten in der Injektionsstelle gehalten und dann langsam herausgezogen. Operierte Tiere wurden unter täglicher Kontrolle gehalten. Keine Maus entwickelte Infektionen oder starb während des Experiments. Mäuse, die eine Injektionen erhalten hatten, wurden an den tagen 18, 26, 45 bzw. 60 transkardial mit 4% Paraformaldehyd in Natriumphosphat-Puffer, pH 7,4, perfundiert und für die Immunhistochemie bearbeitet. Um die axonale Aufnahme zu bestimmen, injizierten wir 1,5 µl Texasrot-gekoppeltes Dextran von 12,5 mg/ml (70 000 MW, Molecular Probes) in PBS und perfundierten die Mäuse fünf bis acht Tage später.
(iv) Immunhistologische Färbungen, Immunfluoreszenzanalyse und Antikörper: Immunhistologische Färbungen wurden an 4 µm dicken koronalen Paraffinschnitten aus dem Gehirn unter Verwendung der veröffentlichten Standardverfahren durchgeführt. Serielle Frontalschnitte wurden angefertigt, und Gehirnschnitte von AD-Patienten und gesunden Menschen wurden als Kontrollen mitverwendet. Einige der Schnitte wurden zur Signalverstärkung 2,5 Minuten lang mit 5 µg/ml Proteinase K in Tris-gepufferter Kochsalzlösung oder PBS bei 37 °C vorbehandelt. Die Schnitte wurden mit Thioflavin-S angefärbt und nach der Vorschrift von Gallyas (Gallyas F, Acta Morphol Acad Sci Hung 1971, 19:1) mit Silber imprägniert. Für Gallyas-Färbungen wurde jeder 20. Schnitt von den Positionen AP –1,5 mm bis AP –2,4 mm (vom Bregma aus) analysiert, während jeder fünfte Schnitt um die Injektionsstelle herum (Position AP –1,9 mm) von den Positionen AP –1,8 mm bis AP –2,0 mm analysiert wurde. Gallyas-positive NFTs wurden in 20 standardisierten frontalen Schnitten des Gesamthirns von jeder Maus gezählt und addiert. Durchschnittswerte und Standardabweichungen wurden für die in 8 angegebene Zahl der Mäuse bestimmt. Tau14 (Zymed Inc, South San Francisco, Kalif., Aminosäuren 83-120, verwendet in 1:2-Verdünnungen) und HT7 (Innogenetics Inc, Belgien, Aminosäuren 159-163, 1:200) wurden verwendet, um humanes Tau spezifisch nachzuweisen. Die folgenden Antikörper wurden verwendet, um unterschiedliche Tau-Phosphoepitope (in Klammern) nachzuweisen: AT270 (Innogenetics Inc., 1:500, Threonin 181), AT8 (Innogenetics Inc., 1:50, Serin 202/Threonin 205), AT100 (Innogenetics Inc., 1:100, Serin 212/Threonin 214), 12E8 (Dr. Peter Seubert, 1:100, Serin 262/Serin 356), AT180 und TG3 (Dr. Peter Davies, 1:100 bzw. 1:20, Threonin 231/Serin 235), PHF1 (Dr. Peter Davies, 1:50); S199P (Dr. Andre Delacourte, 1:100, Serin 199), R145d (Dr. Khalid Iqbal, 1:30, Serin 422) und pS⁴²² (Biosource Inc., 1:50, Serin 422) sowie AD2 (Dr. Chantal Mourton-Gilles, 1:10.000, Serin 396/Serin 404). MC1 wies das Konformationsepitop Alz-50 nach (Dr. Peter Davies, 1:20). Der monoklonale Antikörper 6E10 (Serotec, 1:500) wurde verwendet, um Aβ-Peptid nachzuweisen. Polyklonaler Anti-GFAP-Antikörper (Sigma, 1:400) wurde verwendet, um aktivierte Astrocyten nachzuweisen, und Isolectin B4 (Vector Laborstories, 2 µg/ml) wurde verwendet, um Mikroglia nachzuweisen. Sekundäre Antikörper wurden von Vector Laborstories (Vectastain-ABC-Kits PK-6101 und PK-6102) für Peroxidase/DAB-Färbungen und von Molecular Probes (ALEXA-FLUOR-Reihe) für die Immunofluoreszenz erhalten.
(v) Transmissionselektronenmikroskopie: Bereiche, die die Amygdala enthielten, wurden aus 40 µm dicken Vibratom-Schnitten herausgeschnitten und in 4% Paraformaldehyd und 0,1% Glutaraldehyd in PBS fixiert. Nach der Fixierung mit OsO4 wurden Gewebeproben für die Routineelektronenmikroskopie in Epoxyharz (Egon, Sigma, Bornem, Belgien) eingebettet. Für die Immunogold-Markierung wurden ultradünne Schnitte aus in Epoxyharz eingebetteten Geweben auf Formvar-beschichteten Nickelgittern 10 Minuten lang mit 6% Natriummetaperiodat und 30 Minuten lang mit 5% normalem Ziegenserum in PBS behandelt. Dann erfolgte eine Inkubation der Schnitte mit dem monoklonalen Antikörper AT8 in 1%igem normalem Ziegenserum in PBS in einer Verdünnung von 1:50 während 2 Stunden. Nach dem Waschen wurde 10-nm-kolloidaler goldmarkierter sekundärer Antikörper in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (Ziegen-Anti-Maus; British Biocell, Cardiff, UK) 1 Stunde lang aufgetragen. Dann wurden nach dem Waschen Schnitte mit Bleicitrat und Uranylacetat angefärbt. Kontrollschnitte wurden nach demselben verfahren angefärbt, aber unter Weglassen des primären Antikörpers. AT8 schien häufig "Enden" von Filamenten zu markieren, und zwar aufgrund der Tatsache, dass Filamente, die an den Oberflächen der in Epoxyharz eingebetteten Präparate angeschnitten wurden, für die Antikörper leichter zugänglich waren als tiefer Schichten.

Claims

Verfahren zur Erhöhung der Zahl der neurofibrillären Tangles in einem transgenen Nager, der ein rekombinantes Gen exprimiert, das für humanes P301L-mutantes Tau-Protein codiert, wobei die Zunahme der neurofibrillären Tangles durch Injektion von APP oder eines β-Amyloid-Fragments davon induziert wird.
Verfahren zur Beschleunigung der Produktion von neurofibrillären Tangles in einem transgenen Nager, der ein rekombinantes Gen exprimiert, das für humanes P301L-mutantes Tau-Protein codiert, wobei die beschleunigte Produktion von neurofibrillären Tangles durch Injektion von APP oder eines β-Amyloid-Fragments davon induziert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei es sich bei dem β-Amyloid-Fragment um Aβ₄₂ handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Aβ₄₂ fibrillär, voraggregiert oder aggregiert ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der transgene Nager eine Maus ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das β-Amyloid-Fragment in das Gehirn des Nagers, insbesondere in den Hippocampus oder den Cortex, injiziert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Zunahme der neurofibrillären Tangles vorwiegend in der Amygdala des Nagerhirns, insbesondere der basolateralen Amygdala, erfolgt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Zunahme der neurofibrillären Tangles auf ein Mehrfaches, vorzugsweise wenigstens auf das Zweifache, der Menge bei einem Kontrolltier, in das kein APP oder ein β-Amyloid-Fragment davon induziert wurde, erfolgt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Zunahme der neurofibrillären Tangles wenigstens auf das Fünffache der Menge bei einem Kontrolltier, in das kein APP oder ein β-Amyloid-Fragment davon induziert wurde, erfolgt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Induzieren von Neuropilfäden und/oder zur Degeneration von Neuriten.
Transgener Nager, der ein rekombinantes Gen exprimiert, das für humanes P301L-mutantes Tau-Protein codiert, und der eine erhöhte Zahl von neurofibrillären Tangles oder eine beschleunigte Produktion von neurofibrillären Tangles aufweist, wobei die erhöhte Zahl der neurofibrillären Tangles und/oder die beschleunigte Produktion der neurofibrillären Tangles des Nagers durch Injektion des APP oder des β-Amyloid-Fragments gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 erhalten wird.
Nager gemäß Anspruch 11, wobei neurofibrilläre Tangles erzeugt werden, die mit denjenigen vergleichbar sind, die man üblicherweise bei neurodegenerativen Krankheiten des Menschen findet.
Nager gemäß einem der Ansprüche 11 und/oder 12, der das APP oder das β-Amyloid-Fragment in einer ausreichenden Menge umfasst, um die Produktion von neurofibrillären Tangles zu induzieren.
Nager gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei das β-Amyloid-Fragment in das Gehirn des Nagers, insbesondere in den Hippocampus oder den Cortex, injiziert wird.
Nager gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14, der ein für APP codierendes rekombinantes Gen coexprimiert, wobei das APP zur Erzeugung des β-Amyloid-Fragments enzymatisch verarbeitet wird.
Nager gemäß Anspruch 15, wobei das APP ein mutantes APP ist.
Nager gemäß einem der Ansprüche 11 bis 16, bei dem es sich um eine Maus handelt.
Verwendung des Nagers gemäß einem der Ansprüche 11 bis 17 als Tiermodell in einem in-vivo-Assay zur Bestimmung oder Bewertung der Wirksamkeit von Modulationsmitteln oder Therapien, insbesondere amyloidsenkenden Therapien oder NFT-reduzierenden Therapien.
Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei die Modulationsmittel oder Therapien auf neurodegenerative Krankheiten gerichtet sind, insbesondere Alzheimer-Krankheit, frontotemporale Demenz (FTD) und andere neurodegenerative Krankheiten, die mit einer Bildung von neurofibrillären Tangles einhergehen.