DE60114157T2 - Verfahren zur herabregulierung von amyloid - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verbesserungen bei der Therapie und Prävention der Alzheimer-Krankheit (AD) ("Alzheimer's disease") und anderer Krankheiten, gekennzeichnet durch Ablagerung von Amyloid, z.B. gekennzeichnet durch Amyloidablagerungen im zentralen Nervensystem (ZNS) ("central nervous system = CNS"). Spezifischer ermöglicht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herabregulierung (unerwünschter) Amyloidablagerungen durch das Ermöglichen der Produktion von Antikörpern gegen das relevante Protein oder Bestandteile davon in Subjekten, die unter Krankheiten leiden oder in der Gefahr sind, unter Krankheiten zu leiden, die eine Pathologie aufweisen, die Amyloidablagerung einschließt. Die Erfindung sorgt außerdem für Verfahren zur Produktion von Polypeptiden, verwendbar bei diesem Verfahren, sowie für die modifizierten Polypeptide als solche. Von der vorliegenden Erfindung auch umfasst sind Nucleinsäurefragmente, die die modifizierten Polypeptide codieren, sowie Vektoren, die diese Nucleinsäurefragmente inkorporieren, und Wirtszellen und Zelllinien, die damit transformiert sind. Die Erfindung sorgt außerdem für Zusammensetzungen, die modifizierte Polypeptide umfassen oder Nucleinsäuren umfassen, die modifizierte Polypeptide codieren.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Amyloidose ist die extrazelluläre Ablagerung unlöslicher Proteinfibrillen, die zu Gewebeschädigung und Krankheit führt (Pepys, 1996; Tan et al., 1995; Kelly, 1996). Die Fibrillen bilden sich, wenn normalerweise lösliche Proteine und Peptide auf anormale Weise selbstassoziieren (Kelly, 1997).
  • Amyloid ist mit ernsthaften Krankheiten assoziiert, einschließlich systemischer Amyloidose, AD, Altersdiabetes, Parkinson'scher Krankheit, Huntington-Krankheit, frontotemporaler Demenz und der Prion-verwandten übertragbaren spongiformen Enzephalopathien (Kuru und Creutzfeldt-Jacob-Krankheit bei Menschen und Scrapie und BSE bei Schafen bzw. Vieh), und die Bildung von Amyloidplaques bei beispielsweise Alzheimer scheint eng mit dem Fortschreiten der menschlichen Krankheit assoziiert zu sein. In Tiermodellen wurden gezeigt, dass die Überexpression oder die Expression modifizierter Formen von Proteinen, die in Ablagerungen gefunden werden, wie beispielsweise das β-Amyloid-Protein, verschiedene Krankheitssymptome, z.B. Alzheimer-ähnliche Symptome, induziert. Es gibt keine spezifische Behandlung für Amyloidablagerung, und diese Krankheiten sind für gewöhnlich tödlich.
  • Die Untereinheiten von Amyloidfibrillen können Wildtyp-Proteine, Variantenproteine oder verkürzte Proteine sein, und in vitro können ähnliche Fibrillen aus Oligopeptiden und denaturierten Proteinen gebildet werden (Bradbury et al., 1960; Filshie et al., 1964; Burke & Rougvie, 1972). Die Art der Polypeptidkomponente der Fibrillen definiert den Charakter der Amyloidose. Trotz großer Unterschiede bei der Größe, Nativstruktur und Funktion von Amyloidproteinen sind alle Amyloidfibrillen von unbestimmter Länge, unverzeigt, von 70 bis 120 A Durchmesser und zeigen charakteristische Färbung mit Kongo-Rot (Pepys, 1996). Sie sind charakteristisch für eine cross-β-Struktur (Pauling & Corey, 1951), bei welcher die Polypeptidkette in β-Faltblättern organisiert ist. Obwohl die Amyloidproteine stark unterschiedliche Vorläuferstrukturen aufweisen, können sie alle eine strukturelle Umwandlung, vielleicht entlang eines ähnlichen Wegs, zu einer fehlgefalteten Form durchlaufen, die der Baustein des β-Faltblatt-Helix-Protofilaments ist.
  • Dieses charakteristische Fasermuster führte zu Amyloidosen, die β-Fibrillosen genannt werden (Glenner, 1980a, b), und das Fibrillenprotein von AD wurde als β-Protein bezeichnet, bevor seine Sekundärstruktur bekannt war (Glenner & Wong, 1984). Die charakteristischen cross-β-Beugungsmuster, zusammen mit der Fibrillenerscheinung und Färbungseigenschaften sind nun die akzeptierten diagnostischen Kennzeichen von Amyloid und sie deuten darauf hin, dass die Fibrillen, obwohl sie von sehr unterschiedlichen Proteinvorläufern gebildet werden, einen Grad struktureller Ähnlichkeit teilen und unabhängig von der Art ihrer Vorläuferproteine eine strukturelle Superfamilie umfassen (Sunde M., Serpell L.C., Bartlam M., Fraser P.E., Pepys M.B., Blake C.C.F., J. Mol. Biol., 31. Oktober 1997; 273(3):729-739).
  • Eine der am weitesten verbreiteten und best bekannten Krankheiten, bei der vorgeschlagen wird, dass Amyloidablagerungen im zentralen Nervensystem eine zentrale Rolle beim Fortschreiten der Krankheit spielen, ist AD.
  • AD
  • Die Alzheimer-Krankheit (AD = Alzheimer's disease) ist eine irreversible progressive Gehirnstörung, die graduell auftritt und in Gedächtnisverlust, Verhaltens- und Persönlichkeitsänderungen und in einem Nachlassen der geistigen Fähigkeiten resultiert. Man bringt diese Verluste in Bezug zum Tod von Gehirnzellen und dem Abbrechen der Verbindungen zwischen ihnen. Der Verlauf dieser Krankheit variiert von Person zu Person, wie es auch die Rate des geistigen Verfalls tut. Im Durchschnitt leben AD-Patienten, nachdem bei ihnen AD diagnostiziert wurde, 8 bis 10 Jahre lang, obwohl die Krankheit bis zu 20 Jahre anhalten kann.
  • AD schreitet in Stufen fort, von früher, moderater Vergesslichkeit bis zu einem starken Verlust der Gehirnfunktion. Dieser Verlust ist als Demenz bekannt. Bei den meisten Personen mit AD treten Symptome erstmals nach dem Alter von 60 auf, aber frühere Ausbrüche sind nicht unhäufig. Die frühesten Symptome beinhalten oft Kurzzeitgedächtnisverlust, fehlerhaftes Urteilsvermögen und Änderungen der Persönlichkeit. Menschen in den anfänglichen Stufen von AD denken oft weniger klar und vergessen die Namen bekannter Menschen und üblicher Objekte. Später im Krankheitsverlauf können sie vergessen wie selbst einfache Aufgaben zu tun sind. Schließlich verlieren Menschen mit AD das gesamte Urteilsvermögen und werden für ihre alltägliche Pflege von anderen Menschen abhängig. Letztlich verläuft die Krankheit so schwächend, dass die Patienten bettlägerig sind, und es wahrscheinlich ist, dass sie andere Krankheiten und Infektionen entwickeln. Am häufigsten sterben Menschen mit AD an Lungenentzündung.
  • Obwohl das Risiko, AD zu entwickeln, mit dem Alter zunimmt, sind AD- und Demenzsymptome nicht Teil des normalen Alterns. AD und andere Demenz-erzeugende Störungen werden durch Krankheiten verursacht, die das Gehirn beeinträchtigen. Beim normalen Altern gehen Nervenzellen im Gehirn nicht in großen Anzahlen verloren. Im Gegensatz dazu unterbricht AD drei Schlüsselprozesse: Nervenzellenkommunikation, Metabolismus und Reparatur. Diese Unterbrechung verursacht letztlich, dass viele Nervenzellen aufhören zu funktionieren, Verbindungen mit anderen Nervenzellen verlieren und absterben.
  • Zunächst zerstört AD Neuronen in Teilen des Gehirns, die das Gedächtnis kontrollieren, insbesondere im Hippocampus und zugehörigen Strukturen. Sowie Nervenzellen im Hippocampus aufhören, korrekt zu funktionieren, versagt das Kurzzeitgedächtnis und oft beginnt die Fähigkeit einer Person, einfache und bekannte Aufgaben durchzuführen, abzunehmen. AD attackiert außerdem den zerebralen Cortex, insbesondere die Gebiete, die verantwortlich für Sprache und Urteilskraft sind. Schließlich sind viele andere Gebiete des Gehirns involviert. All diese Gehirnregionen atrophieren (schrumpfen), und der AD-Patient wird bettlägerig, inkontinent, vollständig hilflos und spricht auf die äußere Welt nicht an (Quelle: National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
  • Die Bedeutung von AD
  • AD ist die häufigste Ursache von Demenz unter Menschen im Alter von 65 und älter. Wegen ihrem enormen Einfluss auf Individuen, Familien, das Gesundheitssystem und die Gesellschaft als ein Ganzes stellt sie ein bedeutendes Gesundheitsproblem dar. Wissenschaftler schätzen, dass bis zu 4 Millionen Menschen gegenwärtig unter der Krankheit leiden und die Prävalenz verdoppelt sich alle 5 Jahre jenseits des Alters von 65. Man schätzt außerdem, dass ungefähr 360.000 neue Fälle (Inzidenz) jedes Jahr auftreten werden, obwohl diese Anzahl zunehmen wird, sowie die Bevölkerung altert (Brookmeyer et al., 1998).
  • AD legt der Gesellschaft eine schwere ökonomische Last auf. Eine kürzlich durchgeführte Studie in den Vereinigten Staaten schätzte, dass die jährlichen Kosten des Sorgens für einen AD-Patienten 18.408 US Dollar für einen Patienten mit milder AD, 30.096 Dollar für einen Patienten mit moderater AD und 36.132 Dollar für einen Patienten mit schwerer AD sind. Die jährlichen nationalen Kosten zum Sorgen für AD-Patienten in den Vereinigten Staaten wird auf leicht über 50 Milliarden Dollar geschätzt (Leon et al., 1998).
  • Ungefähr 4 Millionen Amerikaner sind 85 oder älter, und in den meisten industrialisierten Ländern ist diese Altersgruppe eines der am schnellsten wachsenden Segmente der Bevölkerung. Man schätzt, dass sich diese Gruppe mit dem Jahr 2030 in den USA auf eine Anzahl von nahezu 8,5 Millionen belaufen wird; manche Experten, die Bevölkerungstrends studieren, schlagen vor, dass die Anzahl noch größer sein könnte. So wie mehr und mehr Menschen länger leben, wird die Anzahl an Menschen, die von Krankheiten des Alterns, einschließlich AD beeinträchtigt sind, weiter wachsen. Beispielsweise zeigen manche Studien, dass nahezu die Hälfte aller Menschen im Alter von 85 und älter eine Form von Demenz aufweisen (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
  • Die Hauptcharakteristika von AD
  • Zwei anormale Strukturen im Gehirn sind die Kennzeichen von AD: Amyloidplaques und neurofibrilläre Knäuel bzw. Plaques (NFT) ("neurofibrillary tangles"). Plaques sind dichte, weitgehend unlösliche Ablagerungen von Protein und zellulärem Material außerhalb der Neuronen des Gehirns und um sie herum. Knäuel bzw. Plaques sind unlösliche verdrehte Fasern, die sich innerhalb von Neuronen aufbauen.
  • Es existieren zwei Typen von AD: familiäre AD (FAD), welche einem gewissen Vererbungsmuster folgt, und sporadische AD, wo kein offensichtliches Vererbungsmuster gesehen wird. Wegen der Unterschiede im Alter beim Ausbruch wird AD ferner als frühzeitig auftretend (was bei Menschen jünger als 65 vorkommt) und spät auftretend (was bei jenen im Alter von 65 und älter auftritt) beschrieben. Frühzeitig auftretende AD ist selten (etwa 10 % der Fälle) und betrifft im Allgemeinen Menschen im Alter von 30 bis 60. Manche Formen von frühzeitig auftretender AD werden vererbt und verlaufen in Familien. Frühzeitig auftretende AD schreitet außerdem oft schneller fort als die üblichere, spät auftretende Form.
  • Alle bis jetzt bekannten FADs weisen einen früheren Beginn auf, und es ist bekannt, dass 50 % der FAD-Fälle durch Defekte in drei Genen, die auf drei unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert sind, verursacht werden. Dieses sind Mutationen in dem APP-Gen auf Chromosom 21; Mutationen in einem Gen auf Chromosom 14, genannt Presenilin 1; und Mutationen in einem Gen auf Chromosom 1, genannt Presenilin 2. Bis jetzt gibt es jedoch keinen Beweis, dass irgendeine dieser Mutationen eine Hauptrolle in der stärker verbreiteten, sporadischen oder nicht-familiären Form von AD mit spätem Beginn spielen. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999)
  • Amyloidplaques
  • Bei AD entwickeln sich Amyloidplaques bzw. amyloide Plaques zuerst in Gebieten des Gehirns, die für Erinnerung und andere kognitive Funktionen verwendet werden. Sie bestehen aus größtenteils unlöslichen Ablagerungen von β-Amyloid (nachfolgend als Aβ bezeichnet) – ein Proteinfragment eines größeren Proteins, genannt Amyloidprecursorprotein bzw. Amyloidvorläuferprotein (APP, dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2 dargelegt ist) – vermischt mit Teilen von Neuronen und mit Nicht-Nervenzellen, wie beispielsweise Mikroglia und Astrozyten. Es ist nicht bekannt, ob amyloide Plaques selbst die Hauptursache von AD darstellen oder ob sie ein Nebenprodukt des AD-Prozesses sind. Gewiss können Änderungen in dem APP-Protein AD verursachen, wie in der vererbten Form von AD, verursacht durch Mutationen im APP-Gen, gezeigt, und Aβ-Plaquebildung scheint eng mit dem Fortschreiten der menschlichen Krankheit assoziiert zu sein (Lippa C.F. et al., 1998).
  • APP
  • APP ist eines von vielen Proteinen, die mit Zellmembranen assoziiert sind. Nachdem es hergestellt ist, wird APP in die Nervenzellmembran eingebettet, teilweise innerhalb und teilweise außerhalb der Zelle. Vor kurzem durchgeführte Studien unter Verwendung transgener Mäuse zeigen, dass APP eine wichtige Rolle beim Wachstum und Überleben von Neuronen zu spielen scheint. Beispielsweise schützen gewisse Formen und Mengen von APP möglicherweise Neuronen gegen sowohl kurz- als auch langfristige Beschädigung und verleihen beschädigten Neuronen möglicherweise eine bessere Fähigkeit, sich selbst zu reparieren, und helfen Teilen von Neuronen nach Gehirnverletzung zu wachsen.
  • Während APP in die Zellmembran eingebettet ist, wirken Proteanen auf bestimmte Stellen in APP, wobei sie es in Proteinfragmente spalten. Eine Protease hilft dabei, APP zu spalten, um Aβ zu bilden, und eine andere Protease spaltet APP in der Mitte des Amyloidfragments, so dass Aβ nicht gebildet werden kann. Das gebildete Aβ ist von zwei unterschiedlichen Längen, ein kürzeres 40 (oder 41)-Aminosäuren-Aβ, das relativ löslich ist und langsam aggregiert, und ein geringfügig längeres, "klebriges" 42-Aminosäuren-Aβ, das rasch unlösliche Klumpen ausbildet. Es ist bis jetzt nicht genau bekannt, wie Aβ, während es gebildet wird, sich durch Nervenzellen oder um Nervenzellen herum bewegt. In den Endstufen dieses Prozesses aggregiert das "klebrige" Aβ in lange Filamente außerhalb der Zelle und bildet, zusammen mit Fragmenten toter und sterbender Neuronen und den Mikroglia und Astrozyten, die Plaques, die im Gehirngewebe charakteristisch für AD sind.
  • Es bestehen gewisse Hinweise darauf, dass die Mutationen in APP es wahrscheinlicher machen, dass Aβ aus dem APP-Vorläufer herausgeschnitten wird, wodurch folglich verursacht wird, dass entweder mehr Gesamt-Aβ oder relativ mehr von der "klebrigen" Form hergestellt wird. Es scheint außerdem, dass Mutationen in den Presenilin-Genen möglicherweise zur Degenerierung von Neuronen auf wenigstens zwei Wegen beitragen: durch Modifizieren von Aβ-Produktion oder durch direkteres Auslösen des Todes von Zellen. Andere Forscher schlagen vor, dass mutierte Preseniline 1 und 2 möglicherweise beim Beschleunigen der Geschwindigkeit von Apoptose beteiligt sind.
  • Es ist zu erwarten, dass, sowie die Krankheit fortschreitet, mehr und mehr Plaques gebildet werden, was mehr und mehr des Gehirns füllt. Studien schlagen vor, dass es sein kann, dass das Aβ in einer Art dynamisches Gleichgewicht zur selben Zeit aggregiert und disaggregiert. Dies erweckt die Hoffnung, dass es möglich sein kann, die Plaques, sogar nachdem sie sich gebildet haben, abzubauen. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
  • Man glaubt, dass Aβ für Neuronen toxisch ist. In Gewebekulturstudien beobachteten Forscher eine Zunahme beim Tod von Hippocampus-Neuronenzellen, manipuliert, um mutierte Formen von Human-APP zu überexprimieren, im Vergleich zu Neuronen, die das normale Human-APP überexprimierten (Luo et al., 1999).
  • Ferner ist in Tiermodellen gezeigt worden, dass Überexpression oder die Expression modifizierter Formen des Aβ-Proteins Alzheimer-ähnliche Symptome induzierten (Hsiao K. et al., 1998).
  • Angesichts dieser erhöhten Aβ-Erzeugung, dessen Aggregation in Plaques und der resultierenden Neurotoxizität und der Tatsache, dass die resultierende Neurotoxizität zu AD führen kann, ist es von therapeutischem Interesse, Bedingungen zu untersuchen, unter welchen Aβ-Aggregation in Plaques verlangsamt oder sogar blockiert werden kann.
  • Preseniline
  • Mutationen in Presenilin-1 (5-180) sind für nahezu 50 % aller Fälle von frühzeitig auftretender familiärer AD (FAD) verantwortlich. Um die 30 Mutationen, die AD verursachen, sind identifiziert worden. Der Ausbruch von AD variiert mit den Mutationen. Mutationen in Presenilin-2 sind für einen viel kleineren Anteil der FAD-Fälle verantwortlich, sind jedoch immer noch ein signifikanter Faktor. Es ist nicht bekannt, ob Preseniline bei sporadischer nicht-familiärer AD beteiligt sind. Die Funktion der Preseniline ist nicht bekannt, jedoch scheinen sie beim Prozessieren von APP, um Aβ-42 (die längere klebrigere Form des Peptids, SEQ ID NO: 2, Reste 673-714) zu ergeben, involviert zu sein, weil AD-Patienten mit Presenilin-Mutationen erhöhte Level dieses Peptids aufweisen. Es ist unklar, ob die Preseniline außerdem eine Rolle beim Verursachen der Erzeugung von NFTs haben. Manche schlagen vor, dass Preseniline außerdem eine direktere Rolle bei der Degenerierung von Neuronen und Neuronentod spielen könnten. Presenilin-1 ist auf Chromosom 14 lokalisiert, während Presenilin-2 mit Chromosom 1 in Verbindung steht. Wenn eine Person eine mutierte Version nur eines dieser Gene trägt, ist nahezu sicher, dass er oder sie frühzeitig auftretende AD entwickelt.
  • Es besteht etwas Ungewissheit darüber, ob Presenilin-1 mit der hypothetischen γ-Secretase, beteiligt beim Prozessieren von APP, identisch ist (Naruse et al., 1998).
  • Apolipoprotein E
  • Apolipoprotein E ist für gewöhnlich mit Cholesterin assoziiert, es wird jedoch außerdem in Plaques und Knäueln von AD-Gehirnen gefunden. Während Allele 1-3 nicht bei AD beteiligt zu sein scheinen, besteht eine signifikante Korrelation zwischen dem Vorhandensein des APOE-e4-Allels und der Entwicklung später AD (Strittmatter et al., 1993). Es ist jedoch ein Risikofaktor und nicht eine direkte Ursache, wie es für die Presenilin- und APP-Mutationen der Fall ist, und es ist nicht auf familiäre AD beschränkt.
  • Die Art und Weisen, auf welche das ApoE e4-Protein die Wahrscheinlichkeit der Entwicklung von AD erhöht, sind nicht mit Gewissheit bekannt, jedoch ist eine mögliche Theorie, dass es Aβ-Aufbau erleichtert und dies dazu beiträgt, das Alter, in dem AD ausbricht, herabzusetzen, oder dass die Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter APOE-Allele die Art und Weise, auf welche Neuronen auf Verletzung reagieren, beeinträchtigen kann (Buttini et al., 1999).
  • Es ist gezeigt worden, dass auch Apo A1 amyloidogen ist. Intaktes apo A1 kann selbst Amyloid-ähnliche Fibrillen in vitro ausbilden, die Kongo-Rot-positiv sind (Am. J. Pathol. 147 (2): 238-244 (Aug. 1995), Wisniewski T., Golabek A.A., Kida E., Wisniewski K.E., Frangione B.).
  • Es scheint einige widersprüchliche Ergebnisse zu geben, die anzeigen, dass es, verglichen mit anderen Allelen, einen positiven Effekt des APOE-e4-Allels beim Verringern von Symptomen von Gedächtnisverlust gibt (Stern, Brandt, 1997, Annals of Neurology 41).
  • Neurofibrilläre Plaques
  • Dieses zweite Kennzeichen von AD besteht aus anormalen Sammlungen verdrehter Fäden, die innerhalb von Nervenzellen gefunden werden. Die Hauptkomponente der Plaques bzw. Knäuel ist eine Form eine Proteins, das tau (t) genannt wird. Im zentralen Nervensystem sind tau-Proteine am Besten für ihr Vermögen bekannt, Mikrotubuli zu binden und bei ihrer Stabilisation zu helfen. Mikrotubuli sind ein Bestandteil der internen Trägerstruktur oder des Skeletts der Zelle. Jedoch ist bei AD tau chemisch verändert, und dieses veränderte tau kann die Mikrotubuli nicht länger stabilisieren, was verursacht, dass diese zerfallen. Dieser Kollaps des Transportsystems kann zuerst in Fehlfunktionen bei der Kommunikation zwischen Nervenzellen resultieren und kann später zu Neuronentod führen.
  • In AD verdrillt sich chemisch verändertes tau in gepaarte helikale Filamente – zwei Fäden von tau, die um einander gewunden sind. Diese Filamente sind die Hauptsubstanz, die man in neurofibrillären Plaques findet. In einer kürzlich durchgeführten Studie fanden Forscher bei weniger als 6 % der Neuronen in einem bestimmten Teil des Hippocampus in gesunden Gehirnen, bei mehr als 43 % dieser Neuronen bei Menschen, die mit milder AD starben, und bei 71 % dieser Neuronen bei Menschen, die mit schwerer AD starben, neurofibrilläre Veränderungen. Wenn der Neuronenverlust untersucht wurde, wurde eine ähnliche Steigerung gefunden. Hinweise dieser Art unterstützen die Idee, dass die Bildung von Plaques und der Verlust an Neuronen zusammen während des Verlaufs von AD fortschreiten. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
  • Tauopathien und Plaques bzw. Knäuel
  • Mehrere andere neurodegenerative Krankheiten ausser AD sind durch die Aggregation von tau in unlösliche Filamente in Neuronen und Glia, was zu Dysfunktion und Tod führt, gekennzeichnet. Vor sehr kurzer Zeit haben mehrere Gruppen von Forschern, die Familien mit einer Vielfalt vererbbarer Arten von Demenz ungleich AD untersuchten, die ersten Mutationen in dem tau-Gen auf Chromosom 17 gefunden (Clark et al., 1998; Hutton et al., 1998; Poorkaj et al., 1998; Spillantini et al., 1998). In diesen Familien verursachen Mutationen im tau-Gen Neuronen-Zelltod und Demenz. Diese Störungen, welche einige Charakteristika mit AD gemeinsam haben, sich jedoch in mehrerlei wichtiger Hinsicht unterscheiden, werden kollektiv "fronto-temporale Demenz und Parkinsonismus, verknüpft mit Chromosom 17" (FTDP-17) genannt. Sie sind Krankheiten, wie beispielsweise die Parkinson-Krankheit, einige Formen amyotropher lateraler Sklerose (ALS), korticobasale Degeneration, progressive supranukleäre Lähmung und Pick'sche Krankheit, und sind alle durch anormale Aggregation von tau-Protein gekennzeichnet.
  • Andere AD-ähnliche neurologische Krankheiten
  • Es gibt wichtige Parallelen zwischen AD und anderen neurologischen Krankheiten, einschließlich Prionkrankheiten (wie beispielsweise Kuru, Creutzfeld-Jacob-Krankheit und BSE ("bovine spongiform encephalitis")), Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit und fronto-temporaler Demenz. Alle involvieren Ablagerungen anormaler Proteine im Gehirn. AD und Prionkrankheiten verursachen Demenz und Tod, und beide sind mit der Bildung unlöslicher Amyloidfibrillen, jedoch aus Membranproteinen, die sich voneinander unterscheiden, assoziiert.
  • Wissenschaftler, die die Parkinson-Krankheit, die am zweit-meisten verbreitete neurodegenerative Störung nach AD, untersuchen, entdeckten das erste Gen, das mit dieser Krank heit verknüpft ist. Dieses Gen codiert für ein Protein, genannt Synuclein, welches verblüffenderweise auch in den Amyloidplaques der Gehirne von AD-Patienten gefunden wird (Lavedan C., 1998, Genome Res. 8(9): 871-80). Forscher haben außerdem entdeckt, dass genetische Defekte in der Huntington-Krankheit, einer anderen progressiven neurodegenerativen Störung, die Demenz verursacht, verursachen, dass sich das Huntington-Protein in unlösliche Fibrillen formt, die den Aβ-Fibrillen von AD und den Proteinfibrillen der Prionkrankheit sehr ähnlich sind (Scherzinger E. et al., 1999, PNAS USA 96(8): 4604-9).
  • Wissenschaftler haben außerdem ein neues Gen entdeckt, welches, wenn mutiert, für Familiäre Britische Demenz (FBD), eine selten vererbte Krankheit, die starke Bewegungsstörungen und progressive Demenz, ähnlich der, die in AD beobachtet wird, verursacht, verantwortlich ist. In einer biochemischen Analyse der in den FBD-Plaques gefundenen Amyloidfibrillen wurde ein einzigartiges Peptid, genannt ABri, gefunden (Vidal et al., 1999). Eine Mutation an einem bestimmten Punkt entlang dieses Gens resultiert in der Produktion eines längeren Bri-Proteins als dem normalen. Das ABri-Peptid, welches aus dem mutierten Ende des Bri-Proteins geschnitten ist, wird als Amyloidfibrillen abgelagert. Man denkt, dass diese Plaques zu der neuronalen Dysfunktion und Demenz führen, die FBD kennzeichnen.
  • Immunisierung mit Aβ
  • Das Immunsystem wird normalerweise eine Rolle beim Beseitigen von Fremdprotein und proteinösen Partikeln im Organismus spielen, jedoch bestehen die Ablagerungen, die mit den oben genannten Krankheiten assoziiert sind, hauptsächlich aus Selbst-Proteinen, wodurch die Rolle des Immunsystems bei der Kontrolle dieser Krankheiten weniger offensichtlich wird. Ferner sind die Ablagerungen in einem Kompartiment (dem ZNS) lokalisiert, das normalerweise vom Immunsystem getrennt ist. Dabei legen beide Tatsachen nahe, dass eine beliebige Impfung oder immunotherapeutische Vorgehensweise nicht erfolgreich wäre.
  • Nichtsdestotrotz haben Wissenschaftler kürzlich versucht, Mäuse mit einer Impfung zu immunisieren, die aus heterologem Human-Aβ und einer Substanz, von der bekannt war, dass sie das Immunsystem anregt, zusammengesetzt war (Schenk et al., 1999 und WO 99/27944). Der Impfstoff wurde in einem partiellen transgenen Mausmodell von AD mit einem in die DNA der Maus eingefügten mutierten menschlichen Gen für APP getestet. Die Mäuse produzierten das modifizierte APP-Protein und entwickelten mit zunehmendem Alter amyloide Plaques. Dieses Mausmodell wurde verwendet, um zu testen, ob eine Impfung gegen das modifizierte transgene Human-APP einen Effekt auf den Plaque-Aufbau aufwies. In einem ersten Experiment wurden einer Gruppe transgener Mäuse monatliche Injektionen des Impfstoffs verabreicht, die bei einem Alter von 6 Wochen begannen und bei 11 Monaten endeten. Eine zweite Gruppe transgener Mäuse empfing keine Injektionen und diente als eine Kontrollgruppe. Im Alter von 13 Monaten wiesen die Mäuse in der Kontrollgruppe Plaques auf, die 2 bis 6 % ihrer Gehirne bedeckten. Im Gegensatz dazu wiesen die immunisierten Mäuse praktisch keine Plaques auf.
  • In einem zweiten Experiment begannen die Forscher die Injektionen bei 11 Monaten, als sich einige Plaques bereits entwickelt hatten. Über einen 7-monatigen Zeitraum wiesen die transgenen Kontrollmäuse eine 17-fache Zunahme der Menge an Plaques in ihren Gehirnen auf, während jene, die den Impfstoff empfingen, eine 99%ige Abnahme im Vergleich zu den 18 Monate alten transgenen Kontrollmäusen aufwiesen. In einigen Mäusen schienen einige der zuvor existierenden Plaqueablagerungen durch die Behandlung entfernt worden zu sein. Man fand außerdem, dass weiterer Plaque-assoziierter Schaden wie beispielsweise Entzündung und anormale Nervenzellprozesse als Ergebnis der Immunisierung abnahmen.
  • Das obige ist folglich eine vorläufige Studie an Mäusen und Wissenschaftler müssen beispielsweise herausfinden, ob geimpfte Mäuse in anderer Hinsicht gesund bleiben und ob das Gedächtnis jener geimpften Mäuse normal bleibt. Außerdem werden, weil das Mausmodell AD nicht vollständig repräsentiert (die Tiere entwickeln keine neurofibrillären Plaques, und es sterben auch nicht viele ihrer Neuronen), zusätzliche Studien notwendig sein, um zu bestimmen, ob Menschen eine ähnliche Reaktion wie Mäuse oder eine von den Mäusen unterschiedliche Reaktion aufweisen. Eine andere in Erwägung zu ziehende Fragestellung ist, dass das Verfahren möglicherweise Amyloidablagerung "heilt", jedoch dabei versagt, die Entwicklung von Demenz zu stoppen.
  • Technische Probleme stellen außerdem grundsätzliche Herausforderungen dar. Beispielsweise ist es unwahrscheinlich, dass es unter Verwendung dieser Technologie überhaupt möglich ist, einen Impfstoff zu erzeugen, welcher Menschen ermöglicht, Antikörper gegen ihre eigenen Proteine zu erzeugen. Folglich werden zahlreiche Probleme in Sachen Sicherheit und Effektivität gelöst werden müssen, bevor irgendwelche Tests an Menschen in Erwägung gezogen werden können.
  • Die Arbeit von Schenk et al. zeigt folglich, dass, wenn es möglich wäre, eine starke Immunreaktion gegen Selbst-Proteine in proteinösen Ablagerungen im zentralen Nervensystem, wie beispielsweise den in AD gebildeten Plaques, zu erzeugen, es möglich ist, sowohl die Bildung der Ablagerungen zu verhindern und möglicherweise außerdem bereits gebildete Plaques zu beseitigen.
  • AUFGABE DER ERFINDUNG
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, neue Therapien gegen Konditionen bereitzustellen, die durch Ablagerung von Amyloid gekennzeichnet sind, wie beispielsweise AD. Eine weitere Aufgabe ist, eine Autovakzine bzw. einen Eigenimpfstoff gegen Amyloid zu entwickeln, um eine neue Behandlung für AD und für andere pathologische Störungen, die Amyloidablagerung involvieren, zu erhalten.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Hierin beschrieben ist die Verwendung einer Eigenvakzinationstechnologie zum Erzeugen starker Immunreaktionen gegen ansonsten nicht-immunogene Selbst-Proteine, die in Pathologie betreffenden Amyloidablagerungen eingeschlossen sind. Dadurch wird eine starke Immunreaktion, entweder gegen das Amyloid, gegen eine oder mehrere der Komponenten, die in den Ablagerungen eingeschlossen sind, oder gegen ein Protein oder mehrere der Proteine, das für Amyloidbildung verantwortlich ist/sind, erzeugt. Außerdem ist die Herstellung solcher Impfstoffe für die Prävention, mögliche Heilung oder Linderung der Symptome solcher Krankheiten, die mit Amyloidablagerungen assoziiert sind, beschrieben.
  • Folglich betrifft die Erfindung in ihrem breitesten und allgemeinsten Umfang die Verwendung eines Agens, ausgewählt aus
    • a) wenigstens einem Analogon eines autologen Aβ- oder APP-Polypeptids eines Tiers, in das wenigstens ein isoliertes fremdes T-Helfer-Epitop (TH-Epitop) mittels Aminosäureinsertion, -addition, -deletion oder -substitution eingeführt ist, wobei das fremde TH-Epitop frei von D-Aminosäuren ist und in das autologe Aβ oder APP, wie es für die P2- und P30-Epitope in 1 schematisch gezeigt wird, eingeführt ist,
    • b) einer Nucleinsäuresequenz, die für wenigstens ein in a) definiertes Analogon codiert, und
    • c) einem nicht-pathogenen Mikroorganismus oder Virus, der/das das in b) definierte Nucleinsäurefragment trägt, zur Herstellung eines Medikaments, das das Agens enthält, zur Behandlung und/oder Prävention und/oder Verbesserung der Alzheimer-Krankheit oder anderen Krankheiten und Zustände, die durch Aβ-Ablagerungen in dem Tier gekennzeichnet sind.
  • Folglich ist von der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Analoga natürlich vorkommender Antigene umfasst, wobei die Analoga in der Lage sind, kreuzreaktive Immunreaktionen zu induzieren.
  • Die Erfindung betrifft außerdem Analoga der Aβ- und APP-Polypeptide sowie Nuc leinsäurefragmente, die eine Untergruppe von diesen codieren. Auch immunogene Zusammensetzungen, die die Analoga oder die Nucleinsäurefragmente umfassen, sind Teil der Erfindung.
  • LEGENDE ZU DER FIGUR
  • 1: Schematische Darstellung von Autovac-Varianten, abgeleitet von dem Amyloidprecursorprotein mit dem Zweck, Antikörperreaktionen gegen das Aβ-Protein Aβ-43 (oder C-100) zu erzeugen. Das APP ist schematisch am oberen Ende der Figur gezeigt, und die verbleibenden schematischen Konstrukte zeigen, dass die Modell-Epitope P2 und P30 substituiert sind oder eingefügt sind in verschiedene Verkürzungen von APP. In der Figur zeigt das schwarze Muster die APP-Signalsequenz an, ist die Zick-Zack-Schraffur der extrazelluläre Teil von APP, ist die dunkle vertikale Schraffur die Transmembran-Domäne von APP, ist die helle vertikale Schraffur die intrazelluläre Domäne von APP, zeigt die grobe Schrägschraffur das P30-Epitop an und zeigt die dünne Schrägschraffur das P2-Epitop an. Der Kasten mit vollständiger Linie zeigt Aβ-42/43 an, und der Kasten mit der vollständigen Linie und der Kasten mit der gepunkteten Linie zusammen zeigen C-100 an. "Abeta" bezeichnet Aβ.
  • DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Definitionen
  • Im Folgenden wird eine Anzahl an Ausdrücken, die in der vorliegenden Beschreibung und den vorliegenden Ansprüchen verwendet werden, definiert werden und im Detail erklärt werden, um die Grenzen der Erfindung klarzustellen.
  • Die Ausdrücke "Amyloid" und "Amyloidprotein", welche hierin austauschbar verwendet werden, bezeichnen eine Klasse proteinöser unverzweigter Fibrillen unbestimmter Länge. Amyloidfibrillen zeigen eine charakteristische Färbung mit Kongo-Rot und teilen eine cross-β-Struktur, bei welcher die Polypeptidkette in β-Faltblättern organisiert ist. Amyloid stammt im Allgemeinen von amyloidogenen Proteinen, welche stark unterschiedliche Vorläuferstrukturen aufweisen, welche jedoch alle eine strukturelle Umwandlung zu einer fehlgefalteten Form durchlaufen können, die der Baustein des β-Faltblatt-Helix-Protofilaments ist.
  • Normalerweise variiert der Durchmesser von Amyloidfibrillen zwischen etwa 70 und etwa 120 Å.
  • Der Ausdruck "amyloidogenes Protein" soll ein Polypeptid bezeichnen, welches an der Bildung von Amyloidablagerungen, entweder dadurch, dass es als solches Teil der Ablagerungen ist, oder dadurch, dass es Teil des biosynthetischen Wegs ist, der zur Bildung der Ablagerungen führt, beteiligt ist. Folglich sind Beispiele amyloidogener Proteine APP und Aβ. Proteine, die am Stoffwechsel von diesen beteiligt sind, können jedoch auch amyloidogene Proteine sein. Eine Anzahl amyloidogener Polypeptide werden hierin im Detail diskutiert.
  • Ein "Amyloidpolypeptid" bzw. "amyloides Polypeptid" soll hierin Polypeptide bezeichnen, umfassend die Aminosäuresequenz der oben diskutierten amyloidogenen Proteine, abgeleitet von Menschen oder anderen Säugern (oder Verkürzungen davon, die eine wesentliche Menge an B-Zellepitopen mit einem intakten amyloidogenen Protein gemeinsam haben) – ein amyloidogenes Polypeptid kann deshalb z.B. wesentliche Teile eines Vorläufers für das amyloidogene Polypeptid umfassen (im Fall von Aβ könnte ein mögliches Amyloidpolypeptid APP-abgeleitet sein). Auch nicht-glycosylierte Formen amyloidogener Polypeptide, welche im prokaryotischen System hergestellt werden, sind innerhalb der Grenzen des Ausdrucks eingeschlossen, wie es auch Formen sind, die variierende Glycosylierungsmuster aufgrund der Verwendung von z.B. Hefen oder anderen eukaryotischen Nicht-Säuger-Expressionssystemen aufweisen. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass, wenn der Ausdruck "ein amyloidogenes Polypeptid" verwendet wird, es beabsichtigt ist, dass das zur Debatte stehende Polypeptid normalerweise nicht-immunogen ist, wenn es dem zu behandelnden Tier präsentiert wird. In anderen Worten ist das amyloidogene Polypeptid ein Selbst-Protein oder ist ein Analogon eines solchen Selbst-Proteins, welches normalerweise keine Immunreaktion gegen das Amyloidogene des zur Debatte stehenden Tiers hervorrufen wird.
  • Ein "Analogon eines amyloidogenen Polypeptids" ist ein amyloidogenes Polypeptid, welches Veränderungen in seiner Primärstruktur unterzogen worden ist. Eine solche Änderung kann in der Form von Insertionen und/oder Deletionen und/oder Substitutionen in der Aminosäuresequenz des amyloidogenen Polypeptids sein. Von dem Ausdruck außerdem umfasst sind derivatisierte amyloidogene Moleküle, vgl. die unten stehende Diskussion von Modifikationen amyloidogener Polypeptide. Im Falle, dass das amyloidogene Polypeptid ein Amyloid oder ein Vorläufer davon ist, kann das Analogon so konstruiert werden, dass es weniger in der Lage ist, oder gar nicht in der Lage ist, Antikörper gegen das normale Vorläufer protein/die normalen Vorläuferproteine des Amyloids hervorzurufen, wodurch man unerwünschte Interferenz mit der (physiologisch normalen) nicht-aggregierten Form des Polypeptids, die ein Vorläufer des Amyloidproteins ist, vermeidet.
  • Es sollte angemerkt werden, dass man sich vorstellen kann, dass die Verwendung eines Xeno-Analogons (z.B. eines Hunde- oder Schweine-Analogons) eines menschlichen amyloidogenen Polypeptids als ein Impfstoff in einem Menschen, die gewünschte Immunität gegen das amyloidogene Polypeptid produziert. Eine solche Verwendung eines Xeno-Analogons zur Immunisierung wird auch als Teil der Erfindung angesehen.
  • Der Ausdruck "Polypeptid" soll im vorliegenden Kontext sowohl kurze Peptide von 2 bis 10 Aminosäureresten, Oligopeptide von 11 bis 100 Aminosäureresten und Polypeptide von mehr als 100 Aminosäureresten bedeuten. Weiterhin soll der Ausdruck außerdem Proteine einschließen, d.h. funktionelle Biomoleküle, umfassend wenigstens ein Polypeptid; wenn sie wenigstens zwei Polypeptide umfassen, können diese Komplexe bilden, kovalent verknüpft sein, oder sie können nicht-kovalent verknüpft sein. Das Polypeptid/die Polypeptide in einem Protein kann/können glycosyliert sein und/oder mit Lipid versehen ("lipidated") sein und/oder prosthetische Gruppen umfassen.
  • Die Ausdrücke "T-Lymphozyt" und "T-Zelle" werden austauschbar für Lymphozyten mit Thymusursprung verwendet werden, welche verantwortlich sind für verschiedene zellvermittelte Immunreaktionen sowie für Helferaktivität bei der humoralen Immunantwort. Auf ähnliche Weise werden die Ausdrücke "B-Lymphozyt" und "B-Zelle" austauschbar für Antikörperproduzierende Lymphozyten verwendet werden.
  • Der Ausdruck "Untersequenz" bedeutet irgendeinen zusammenhängenden Abschnitt ("stretch") von wenigstens drei Aminosäuren oder, wenn zutreffend, von wenigstens drei Nucleotiden, direkt abgeleitet von einer natürlich vorkommenden Amyloidaminosäuresequenz bzw. -nucleinsäuresequenz.
  • Der Ausdruck "Tier" soll im vorliegenden Kontext im allgemeinen eine Tierart (vorzugsweise Säugertierart) bezeichnen, wie beispielsweise Homo sapiens, Canis domesticus, etc., und nicht nur ein einzelnes Tier. Jedoch bezeichnet der Ausdruck außerdem eine Population solch einer Tierart, da es wichtig ist, dass die Individuen, die gemäß dem Verfahren der Erfindung immunisiert sind, alle im wesentlichen das gleiche amyloidogene Polypeptid beherbergen, was die Immunisierung der Tiere mit dem gleichen Immunogen/den gleichen Immunogenen erlaubt. Wenn beispielsweise genetische Varianten des amyloidogenen Polypep tids in unterschiedlichen Menschenpopulationen existieren, kann es notwendig sein, in diesen unterschiedlichen Populationen unterschiedliche Immunogene zu verwenden, um in der Lage zu sein, die Autotoleranz gegenüber dem amyloidogenen Polypeptid in jeder Population auf eine optimale Art und Weise zu brechen bzw. abzubauen. Dem Fachmann wird klar sein, dass ein Tier im vorliegenden Kontext ein Lebewesen ist, welches ein Immunsystem aufweist. Es ist bevorzugt, dass das Tier ein Vertebrat, wie beispielsweise ein Säuger, ist.
  • Mit dem Ausdruck "in vivo-Herabregulierung von Amyloid" ist hierin Reduktion der Gesamtmenge von abgelagertem Amyloid des relevanten Typs im lebenden Organismus gemeint. Die Herabregulierung kann mittels verschiedener Mechanismen erhalten werden: Von diesen ist einfache Interferenz mit Amyloid durch Antikörper-Binden, um Missaggregation zu verhindern, die einfachste. Jedoch ist es auch innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung, dass das Antikörper-Binden im Entfernen von Amyloid durch Phagozyten (wie beispielsweise Makrophagen und andere phagozytische Zellen) resultiert, und dass die Antikörper mit anderen amyloidogenen Polypeptiden, welche zu Amyloidbildung führen, interferieren.
  • Der Ausdruck "Präsentation ... gegenüber dem Immunsystem bewirken" soll bezeichnen, dass das Immunsystem des Tiers auf eine kontrollierte Weise einer immunogenen Herausforderung unterzogen wird. Wie aus der unten stehenden Offenbarung sichtbar werden wird, kann eine solche Herausforderung des Immunsystems auf eine Anzahl von Wegen bewirkt werden, von welchen die wichtigsten Impfung mit Polypeptid-enthaltenden "Pharmakzinen" ("pharmaccines") (d.h. ein Impfstoff, welcher verabreicht wird, um eine laufende Krankheit zu behandeln oder zu verbessern) oder Nucleinsäure-"Pharmakzine"-Impfung. Das wichtige zu erreichende Ergebnis ist, dass immunkompetente Zellen in dem Tier mit dem Antigen auf eine immunologisch wirksame Weise konfrontiert werden, wohingegen die präzise Art, dieses Ergebnis zu erreichen, von geringerer Wichtigkeit für die Erfindungsidee, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, ist.
  • Der Ausdruck "immunogen wirksame Menge" hat seine gewöhnliche Bedeutung im Fachgebiet, d.h. eine Menge eines Immunogens, welche in der Lage ist, eine Immunreaktion zu induzieren, die sich wesentlich mit pathogenen Mitteln befasst, die immunologische Eigenschaften mit dem Immunogen gemeinsam haben.
  • Wenn der Ausdruck verwendet wird, dass das amyloidogene Polypeptid "modifiziert" worden ist, ist hierin eine chemische Modifikation des Polypeptids gemeint, welches das Rückgrat des amyloidogenen Polypeptids darstellt. So eine Modifikation kann z.B. Derivatisierung (z.B. Alkylierung) gewisser Aminosäurereste in der Sequenz des amyloidogenen Polypeptids sein, jedoch umfassen, wie von der unten stehenden Offenbarung erkannt werden wird, die bevorzugten Modifikationen Änderungen der Primärstruktur der Aminosäuresequenz.
  • Wenn "Autotoleranz gegenüber einem amyloidogenen Polypeptid" diskutiert wird, versteht sich von selbst, dass, weil das amyloidogene Polypeptid ein Selbst-Protein in der zu impfenden Population ist, normale Individuen in der Population keine Immunreaktion gegen das amyloidogene Polypeptid einrichten, es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass gelegentlich Individuen einer Tierpopulation in der Lage sein könnten, Antikörper gegen natives amyloidogenes Polypeptid, z.B. als Teil einer Autoimmunstörung, zu produzieren. Jedenfalls wird ein Tier normalerweise nur gegenüber seinem eigenen amyloidogenen Polypeptid autotolerant sein, es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass Analoga, abgeleitet von anderen Tierarten oder von einer Population, die einen unterschiedlichen Phänotyp aufweist, auch von dem Tier toleriert würden.
  • Ein "fremdes T-Zell-Epitop" (oder: "fremdes T-Lymphozyt-Epitop") ist ein Peptid, welches in der Lage ist, an ein MHC-Molekül zu binden, und welches T-Zellen in einer Tierart stimuliert. Bevorzugte fremde T-Zell-Epitope in der Erfindung sind "promiskuitive" Epitope, d.h. Epitope, welche an eine wesentliche Fraktion einer bestimmten Klasse von MHC-Molekülen in einer Tierart oder -Population binden. Nur eine sehr begrenzte Anzahl solcher promiskuitiver T-Zell-Epitope sind bekannt, und sie werden im Detail unten diskutiert werden. Promiskuitive T-Zell-Epitope werden außerdem als "universale" T-Zell-Epitope bezeichnet. Es sollte angemerkt werden, dass, damit die Immunogene, welche gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, in einer so großen Fraktion einer Tierpopulation wie üblich wirksam sind, es notwendig sein kann, 1) mehrere fremde T-Zell-Epitope in das gleiche Analogon zu insertieren oder 2) mehrere Analoga herzustellen, wobei jedes Analogon ein unterschiedliches promiskuitives Epitop eingefügt hat. Es sollte außerdem angemerkt werden, dass das Konzept fremder T-Zell-Epitope außerdem die Verwendung kryptischer T-Zell-Epitope, d.h. Epitope, welche von einem Selbst-Protein abgeleitet sind und welche nur immunogenes Verhalten ausüben, wenn sie in isolierter Form existieren ohne Teil des zur Debatte stehenden Selbst-Proteins sein, umfasst.
  • Ein "fremdes T-Helfer-Lymphozyt-Epitop" (ein fremdes TH-Epitop) ist ein fremdes T-Zell-Epitop, welches ein MHC-Klasse II-Molekül bindet und auf der Oberfläche einer Antigen präsentierenden Zelle (APC), gebunden an das MHC-Klasse II-Molekül, präsentiert werden kann.
  • Ein "funktioneller Teil" eines (Bio)moleküls soll in der vorliegenden Erfindung den Teil des Moleküls bedeuten, welcher verantwortlich ist für wenigstens eine der biochemischen oder physiologischen Wirkungen, die von dem Molekül ausgeübt werden. Es ist im Fachgebiet gut bekannt, dass viele Enzyme und andere Effektormoleküle ein aktives Zentrum haben, welches verantwortlich ist für die Effekte, die von dem zur Debatte stehenden Molekül ausgeübt werden. Andere Teile des Moleküls können einem stabilisierenden oder Löslichkeitserhöhenden Zweck dienen und können deshalb ausgelassen werden, wenn diese Zwecke im Kontext einer gewissen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nicht von Relevanz sind. Beispielsweise ist es möglich, gewisse Cytokine als eine modifizierende Gruppierung in einem amyloidogenen Polypeptid zu verwenden (vgl. die detaillierte Diskussion unten), und in so einem Fall kann das Stabilitätsproblem irrelevant sein, weil das Koppeln des amyloidogenen Polypeptids die notwendige Stabilität liefern kann.
  • Der Ausdruck "Adjuvans" hat seine gewöhnliche Bedeutung im Fachgebiet von Impfstofftechnologie, d.h. eine Substanz oder eine Zusammensetzung, welche 1) nicht an sich fähig ist, eine spezifische Immunreaktion gegen das Immunogen des Impfstoffs einzurichten, welche jedoch 2) trotzdem fähig ist, die Immunreaktion gegen das Immunogen zu verstärken. Oder, in anderen Worten, sorgt eine Impfung mit dem Adjuvans alleine nicht für eine Immunreaktion gegen das Immunogen, kann Impfung mit dem Immunogen eine Immunreaktion gegen das Immunogen hervorrufen oder nicht, jedoch induziert die kombinierte Impfung mit Immunogen und Adjuvans eine Immunreaktion gegen das Immunogen, welche stärker ist als die, die von dem Immunogen allein induziert wird.
  • "Targetieren" bzw. "Targeting" eines Moleküls soll in dem vorliegenden Kontext die Situation bezeichnen, in der ein Molekül beim Einführen in das Tier bevorzugt in einem gewissen Gewebe/in gewissen Geweben auftreten wird oder bevorzugt mit gewissen Zellen oder Zellarten assoziiert sein wird. Der Effekt kann auf eine Anzahl von Wegen erreicht werden, einschließlich der Formulierung des Moleküls in eine Zusammensetzung, die das Targetieren ermöglicht, oder durch Einführen von Gruppen in das Molekül, welche das Targetieren ermöglichen. Diese Themen werden im Detail unten diskutiert werden.
  • "Stimulation des Immunsystems" bedeutet, dass eine Substanz oder Zusammensetzung einen allgemeinen, nicht-spezifischen immunstimulatorischen Effekt aufweist. Eine Anzahl von Adjuvanzien und mutmaßlichen Adjuvanzien (wie z.B. gewisse Cytokine) haben die Fähigkeit gemeinsam, das Immunsystem zu stimulieren. Das Ergebnis des Verwendens eines immunstimulierenden Mittels ist eine gesteigerte "Aufmerksamkeit" des Immunsystems, was bedeutet, dass gleichzeitige oder nachfolgende Immunisierung mit einem Immunogen eine signifikant effektivere Immunreaktion verglichen mit der isolierten Verwendung des Immunogens induziert.
  • Bevorzugte Ausführungsformen von Amyloid-Herabregulierung
  • Es ist bevorzugt, dass das amyloidogene Polypeptid, das im erfindungsgemäßen Verfahren als ein Immunogen verwendet wird, ein modifiziertes Molekül ist, wobei wenigstens eine Änderung in der Aminosäuresequenz des amyloidogenen Polypeptids vorhanden ist, weil die Chancen, das überaus wichtige Brechen bzw. Abbau der Autotoleranz gegenüber dem amyloidogenen Polypeptid zu erhalten, auf diese Weise stark erleichtert werden. Dies ist z.B. aus den Ergebnissen ersichtlich, die hierin in Beispiel 2 präsentiert sind, in dem Immunisierung mit Wildtyp Aβ mit Immunisierung mit einem varianten Aβ-Molekül verglichen wird. Es sollte angemerkt werden, dass die Verwendung eines modifizierten Moleküls nicht die Möglichkeit der Verwendung solch eines modifizierten amyloidogenen Polypeptids in Formulierungen ausschließt, welche das Brechen von Autotoleranz gegen das amyloidogene Polypeptid weiter erleichtern, z.B. Formulierungen, die Adjuvanzien enthalten.
  • Es ist gezeigt worden (in Dalum I. et al., 1996, J. Immunol. 157: 4796-4804), dass potentiell selbst-reaktive B-Lymphozyten, die Selbst-Proteine erkennen, physiologisch in normalen Individuen vorhanden sind. Allerdings ist Unterstützung von Cytokinproduzierenden T-Helfer-Lymphozyten (TH-Zellen oder TH-Lymphozyten) erforderlich, damit diese B-Lymphozyten induziert werden, um tatsächlich Antikörper zu produzieren, die mit den relevanten Selbst-Proteinen reaktiv sind. Normalerweise wird diese Hilfe nicht geliefert, weil T-Lymphozyten im Allgemeinen keine T-Zell-Epitope erkennen, die von Selbst-Proteinen stammen, wenn sie von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) präsentiert werden. Jedoch werden durch Bereitstellen eines Elements an "Fremdheit" in einem Selbst-Protein (d.h. durch Einführen einer immunologisch bedeutsamen Modifikation) T-Zellen, die das fremde Element erkennen, beim Erkennen des fremden Epitops auf einer APC (wie z.B., ursprünglich, einer mononukleären Zelle) aktiviert. Polyklonale B-Lymphozyten (welche auch APCs sind), fähig zum Erkennen von Selbst-Epitopen auf dem modifizierten Selbst-Protein, internalisieren außerdem das Antigen und präsentieren nachfolgend das fremde T-Zell-Epitop/die fremden T-Zell-Epitope davon, und die aktivierten T-Lymphozyten liefern nachfolgend Cytokin-Hilfe für diese selbst-reaktiven polyklonalen B-Lymphozyten. Da die Antikörper, die von diesen polyklonalen B-Lymphozyten produziert werden, reaktiv mit unterschiedlichen Epitopen auf dem modifizierten Polypeptid, einschließlich jener, welche auch in dem nativen Polypeptid vorhanden sind, sind, wird ein Antikörper induziert, der kreuz-reaktiv mit dem nicht-modifizierten Selbst-Protein ist. Schließlich können die T-Lymphozyten dazu gebracht werden, sich so zu verhalten, wie wenn die Population polyklonaler B-Lymphozyten ein gänzlich fremdes Antigen erkannt hätte, wohingegen tatsächlich nur das eingeführte Epitop/die eingeführten Epitope für den Wirt fremd ist/sind. Auf diese Weise werden Antikörper induziert, die fähig sind, mit den nicht-modifizierten Selbst-Antigenen kreuz-zu-reagieren. Im Fachgebiet sind mehrere Wege bekannt, ein Peptid-Selbst-Antigen zu modifizieren, um den Abbau bzw. das Brechen von Autotoleranz zu erhalten. Folglich kann die Modifikation erfindungsgemäß einschließen, dass
    • – wenigstens eine erste Gruppierung eingeführt ist, die ein Targeting des modifizierten Moleküls zu einer Antigen-präsentierenden Zelle (APC) bewirkt, und/oder
    • – wenigstens eine zweite Gruppierung eingeführt ist, die das Immunsystem stimuliert, und/oder
    • – wenigstens eine dritte Gruppierung eingeführt ist, die die Präsentation des modifizierten amyloidogenen Polypeptids gegenüber dem Immunsystem optimiert.
  • Jedoch sollten alle diese Modifikationen durchgeführt werden, während eine wesentliche Fraktion der ursprünglichen B-Lymphozyten-Epitope in dem amyloidogenen Polypeptid aufrecht erhalten werden, weil die B-Lymphozyten-Erkennung des nativen Moleküls dadurch verstärkt wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind Seitengruppen (in der Form fremder T-Zell-Epitope oder der oben erwähnten ersten, zweiten und dritten Gruppierungen) kovalent oder nicht-kovalent eingeführt. Dies soll bedeuten, dass Abschnitte von Aminosäureresten, abgeleitet von dem amyloidogenen Polypeptid, derivatisiert sind, ohne die primäre Aminosäuresequenz zu verändern oder wenigstens ohne Änderungen in den Peptidbindungen zwischen den individuellen Aminosäuren in der Kette einzuführen.
  • Eine alternative und bevorzugte Ausführungsform verwendet Aminosäuresubstitution und/oder -deletion und/oder -insertion und/oder -addition (welche mit rekombinanten Mitteln oder mittels Peptidsynthese bewirkt werden können). Eine besonders bevorzugte Version dieser Ausführungsform ist die in WO 95/05849 beschriebene Technik, welche ein Verfahren zur Herabregulierung von Selbst-Proteinen durch Immunisieren mit Analoga der Selbst-Proteine beschreibt, wobei eine Anzahl von Aminosäuresequenz(en) mit einer entsprechenden Anzahl von Aminosäuresequenz(en) substituiert worden ist, welche jede ein fremdes immundominantes T-Zell-Epitop umfassen, während zur selben Zeit die Gesamttertiärstruktur des Selbst-Proteins in dem Analogon aufrecht erhalten wird. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist es jedoch ausreichend, wenn die Modifikation (sei es eine Insertion, Addition, Deletion oder Substitution) ein fremdes T-Zell-Epitop erzeugt und zur gleichen Zeit eine wesentliche Anzahl der B-Zell-Epitope in dem amyloidogenen Polypeptid erhält. Um jedoch maximale Wirksamkeit der induzierten Immunreaktion zu erhalten, ist es bevorzugt, dass die Gesamttertiärstruktur des amyloidogenen Polypeptids in dem modifizierten Molekül aufrecht erhalten wird.
  • Folglich sind in der folgenden Erfindung modifizierte amyloidogene Polypeptide enthalten, die erhalten sind durch Weglassen von Teilen der Sequenz des amyloidogenen Polypeptids, welche z.B. nachteilige Effekte in vivo aufweisen, oder Weglassen von Teilen, welche normalerweise intrazellulär sind und folglich unerwünschte immunologische Reaktionen erzeugen könnten.
  • Eine bevorzugte Version der oben umrissenen Konstrukte sind, wenn anwendbar, jene, bei denen die B-Zell-Epitop-enthaltende Untersequenz eines Amyloidproteins nicht extrazellulär im Vorläuferpolypeptid, von welchem das Amyloid abstammt, exponiert ist. Durch Vornehmen einer solchen Auswahl der Amyloidepitope wird sichergestellt, dass keine Antikörper erzeugt werden, welche reaktiv mit den Zellen wären, die den Amyloidvorläufer produzieren, und dadurch die Immunreaktion, welche erzeugt wird, auf eine Immunreaktion gegen die unerwünschten Amyloidablagerungen begrenzt wird. Eine ähnliche Auswahl kann, wenn anwendbar, für andere amyloidogene Polypeptide als Amyloid vorgenommen werden. In diesen Fällen wird es z.B. möglich sein, Immunität gegen Epitope des amyloidogenen Polypeptids zu induzieren, welche nur der extrazellulären Phase gegenüber exponiert sind, wenn sie frei von jeglichem Koppeln an die Zellen, von denen sie produziert werden, sind.
  • Das Aufrechterhalten einer wesentlichen Fraktion von B-Zell-Epitopen oder sogar der Gesamttertiärstruktur eines Proteins, welches, wie hierin beschrieben, einer Modifikation unterworfen wird, kann auf verschiedene Art und Weise erreicht werden. Eine ist, einfach ein polyklonales Antiserum herzustellen, das gegen das amyloidogene Polypeptid gerichtet ist (z.B. ein in einem Kaninchen hergestelltes Antiserum) und dieses Antiserum danach als ein Testreagens (z.B. in einem kompetitiven ELISA) gegen die modifizierten Proteine, welche hergestellt werden, zu verwenden. Modifizierte Versionen (Analoga), welche in dem selben Ausmaß mit dem Antiserum reagieren, wie es das amyloidogene Polypeptid tut, müssen erachtet werden als solche, die die gleiche Gesamttertiärstruktur wie das amyloidogene Polypeptid aufweisen, wohingegen Analoga, die eine begrenzte (jedoch nach wie vor signifikante und spezifische) Reaktivität mit so einem Antiserum aufweisen, als solche angesehen werden, die eine wesentliche Fraktion der ursprünglichen B-Zell-Epitope aufrecht erhalten haben.
  • Alternativ kann eine Auswahl monoklonaler Antikörper hergestellt werden, die mit einzelnen Epitopen auf dem amyloidogenen Polypeptid reaktiv sind, und kann als ein Testformat verwendet werden. Diese Herangehensweise hat den Vorteil, 1) eine Epitopkartierung des amyloidogenen Polypeptids zu erlauben und 2) eine Kartierung der Epitope zu erlauben, welche in den hergestellten Analoga aufrecht erhalten sind.
  • Freilich wäre eine dritte Vorgehensweise, die 3-dimensionale Struktur des amyloidogenen Polypeptids oder einer biologisch aktiven Verkürzung davon (vgl. oben) zu klären, und diese mit der aufgeklärten dreidimensionalen Struktur der hergestellten Analoga zu vergleichen. Die dreidimensionale Struktur kann mit Hilfe von Röntgenstrahlenbeugungsstudien und NMR-Spektroskopie aufgeklärt werden. Weitere Informationen betreffend die Tertiärstruktur können in gewissem Ausmaß erhalten werden von Zirkulardichroismus-Studien, welche den Vorteil haben, dass sie lediglich das Polypeptid in reiner Form erfordern (wohingegen Röntgenstrahlenbeugung das Bereitstellen von kristallisiertem Polypeptid erfordert und NMR das Bereitstellen von Isotop-Varianten des Polypeptids erfordert), um nützliche Informationen über die Tertiärstruktur eines gegebenen Moleküls bereitzustellen. Jedoch sind letztlich Röntgenstrahlenbeugung und/oder NMR notwendig, um schlüssige Daten zu erhalten, weil Zirkulardichroismus nur einen indirekten Hinweis auf die korrekte dreidimensionale Struktur über Informationen der Sekundärstrukturelemente liefern kann.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung verwendet mehrfache Präsentationen von B-Lymphozyt-Epitopen des amyloidogenen Polypeptids (d.h. Formel I, worin wenigstens ein B-Zell-Epitop in zwei Positionen vorhanden ist). Dieser Effekt kann auf verschiedene Weisen erreicht werden, z.B. indem man einfach Fusionspolypeptide herstellt, die die Struktur (amyloidogenes Polypeptid)m umfassen, wobei m eine ganze Zahl ≥ 2 ist, und dann die hierin diskutierten Modifikationen in wenigstens eine der Amyloidsequenzen einführt. Es ist bevorzugt, dass die eingeführten Modifikationen wenigstens eine Duplikation eines B-Lymphozyt-Epitops und/oder das Einführen eines Haptens einschließen. Diese Ausführungsformen einschließlich Mehrfachpräsentationen ausgewählter Epitope sind insbesondere in Situationen bevorzugt, wo nur kleine Teile des amyloidogenen Polypeptids als Bestandteile in einem Impfstoff-Mittel verwendbar sind.
  • Wie oben erwähnt, kann das Einführen eines fremden T-Zell-Epitops durch Einführen wenigstens einer Aminosäureinsertion, -addition, -deletion oder -substitution erreicht werden. Natürlich wird die normale Situation das Einführen von mehr als einer Änderung in der Aminosäuresequenz sein (z.B. Insertion von oder Substitution durch ein vollständiges T-Zell-Epitop), aber das wichtige zu erreichende Ziel ist, dass das Analogon, wenn es von einer Antigen-präsentierenden Zelle (APC) prozessiert wird, solch ein fremdes immundominantes T-Zell-Epitop erzeugen wird, das im Zusammenhang eines MCH-Klasse II-Moleküls auf der Oberfläche der APC präsentiert wird. Folglich kann, wenn die Aminosäuresequenz des amyloidogenen Polypeptids in geeigneten Positionen eine Anzahl von Aminosäureresten umfasst, welche auch in einem fremden TH-Epitop gefunden werden können, dann das Einführen eines fremden TH-Epitops erreicht werden, indem man die verbleibenden Aminosäuren des fremden Epitops mittels Aminosäureinsertion, -addition, -deletion und -substitution bereitstellt. In anderen Worten ist es nicht notwendig, ein vollständiges TH-Epitop durch Insertion oder Substitution einzuführen, um den Zweck der vorliegenden Erfindung zu erfüllen.
  • Es ist bevorzugt, dass die Anzahl an Aminosäureinsertionen, -deletionen, -substitutionen oder -additionen wenigstens 2, wie beispielsweise 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 und 25 Insertionen, Substitutionen, Additonen oder Deletionen, ist. Es ist ferner bevorzugt, dass die Anzahl an Aminosäureinsertionen, -substitutionen, -additionen oder -deletionen nicht über 150 ist, wie beispielsweise höchstens 100, höchstens 90, höchstens 80 und höchstens 70. Es ist besonders bevorzugt, dass die Anzahl an Substitutionen, Insertionen, Deletionen oder Additionen 60 nicht überschreitet, und insbesondere sollte die Anzahl 50 oder selbst 40 nicht überschreiten. Am stärksten bevorzugt ist eine Anzahl von nicht mehr als 30. Hinsichtlich der Aminosäureadditionen sollte angemerkt werden, dass die se, wenn das resultierende Konstrukt in der Form eines Fusionspolypeptids ist, oft erheblich höher als 150 ist.
  • Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung schließen Modifikation durch Einführen wenigstens eines fremden immundominanten T-Zell-Epitops ein. Es wird selbstverständlich sein, dass die Frage der Immundominanz eines T-Zell-Epitops von der zur Debatte stehenden Tierart abhängt. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Immundominanz" lediglich auf Epitope, welche in dem geimpften Individuum/der geimpften Population eine signifikante Immunreaktion erzeugen, jedoch ist eine gut bekannte Tatsache, dass ein T-Zell-Epitop, welches in einem Individuum/einer Population immundominant ist, nicht notwendigerweise in einem anderen Individuum der gleichen Art immundominant ist, obwohl es in der Lage sein kann, MHC-II-Moleküle im letzteren Individuum zu binden. Folglich ist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ein immundominantes T-Zell-Epitop ein T-Zell-Epitop, welches beim Bereitstellen von T-Zell-Hilfe wirksam sein wird, wenn es in einem Antigen vorhanden ist. Typischerweise haben immundominante T-Zell-Epitope als eine inhärente Eigenschaft, dass sie im Wesentlichen immer gebunden an ein MHC-Klasse II-Molekül präsentiert werden, unabhängig von dem Polypeptid, in dem sie auftreten.
  • Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Frage der MHC-Restriktion von T-Zell-Epitopen. Im Allgemeinen sind natürlich vorkommende T-Zell-Epitope MHC-beschränkt, d.h., gewisse Peptide, die ein T-Zell-Epitop darstellen, werden nur an eine Untergruppe von MHC-Klasse II-Molekülen effektiv binden. Dies hat wiederum den Effekt, dass in den meisten Fällen die Verwendung eines spezifischen T-Zell-Epitops in einer Impfstoff-Komponente resultieren wird, welche nur in einem Teil der Population wirksam ist, und abhängig von der Größe dieser Fraktion kann es notwendig sein, mehr T-Zell-Epitope in dem gleichen Molekül einzuschließen, oder alternativ einen Multi-Komponenten-Impfstoff herzustellen, wobei die Komponenten-Varianten des amyloidogenen Polypeptids sind, welche sich voneinander durch die Art des eingeführten T-Zell-Epitops unterscheiden.
  • Wenn die MHC-Restriktion der verwendeten T-Zellen vollständig unbekannt ist (beispielsweise in einer Situation, wo das geimpfte Tier eine schlecht definierte MHC-Zusammensetzung aufweist), kann der Bruchteil der von einer speziellen Impfstoffzusammensetzung abgedeckten Population mittels der folgenden Formel bestimmt werden:
    Figure 00250001
    • – wobei pi die Häufigkeit von Ansprechenden ("responders") auf das i-te fremde T-Zell-Epitop, das in der Impfstoffzusammensetzung vorhanden ist, ist, und n die Gesamtzahl fremder T-Zell-Epitope in der Impfstoffzusammensetzung ist. Folglich würde eine Impfstoffzusammensetzung, die drei fremde T-Zell-Epitope enthält, die Ansprechhäufigkeiten in der Population von 0,8, 0,7 bzw. 0,6 aufweisen, ergeben: 1 – 0,2 × 0,3 × 0,4 = 0,976
    • – d.h. 97,6 % der Population werden statistisch eine MHC-II-vermittelte Reaktion auf den Impfstoff einrichten.
  • Die obige Formel trifft nicht auf Situationen zu, wo ein mehr oder weniger präzises MHC-Restriktionsmuster der verwendeten Peptide bekannt ist. Wenn beispielsweise ein gewisses Peptid nur die von HLA-DR-Allelen DR1, DR3, DR5 und DR7 codierten menschlichen MHC-II-Moleküle bindet, dann wird die Verwendung dieses Peptids zusammen mit einem weiteren Peptid, welches die verbleibenden MHC-II-Moleküle, codiert von HLA-DR-Allelen bindet, eine 100%ige Abdeckung in der zur Debatte stehenden Population erreichen. Ähnlich wird, wenn das zweite Peptid nur DR3 und DR5 bindet, die Addition dieses Peptids die Abdeckung überhaupt nicht erhöhen. Wenn man die Berechnung der Populationsreaktion rein auf MHC-Restriktion von T-Zell-Epitopen in dem Impfstoff basiert, kann der Bruchteil der Population, der von einer spezifischen Impfstoffzusammensetzung abgedeckt ist, mittels der folgenden Formel bestimmt werden:
    Figure 00250002
    • – wobei φj die Summe der Häufigkeiten in der Population von Allel-Haplotypen, codierend MHC-Moleküle, ist, welche irgendeines der T-Zell-Epitope in dem Impfstoff binden und welche zu dem j-ten der drei bekannten HLA-Loci (DP, DR und DQ gehören; in der Praxis wird zuerst bestimmt, welche MHC-Moleküle jedes T-Zell-Epitop in dem Impfstoff erkennen werden, und danach werden diese nach Typ (DP, DR und DQ aufgelistet – dann werden die einzelnen Häufigkeiten der unterschiedlichen aufgelisteten Allel-Haplotypen für jeden Typ summiert, wodurch φ1, φ2, φ3 erhalten werden.
  • Es kann vorkommen, dass der Wert pi in Formel II den entsprechenden theoretischen Wert pi übertrifft:
    Figure 00260001
    • – wobei υj die Summe von Häufigkeiten in der Population des Allel-Haplotyps, codierend MHC-Moleküle, welche das i-te T-Zell-Epitop in dem Impfstoff binden, und welche zu dem j-ten der drei bekannten HLA-Loci (DP, DR und DQ) gehören, ist. Dies bedeutet, dass in 1-pi der Population eine Häufigkeit von Ansprechenden von fresidual_i = (pi – pi)/(1 – pi) besteht. Deshalb kann Formel III angepasst werden, um Formel V zu ergeben:
      Figure 00260002
    • – wobei der Ausdruck 1-φresidual-i auf Null gesetzt wird, falls er negativ ist. Es sollte angemerkt werden, dass Formel V erfordert, dass alle Epitope gegen identische Sätze an Haplotypen Haplotypen-kartiert worden sind.
  • Folglich ist es, wenn man in das Analogon einzuführende T-Zell-Epitope auswählt, wichtig, das gesamte Wissen über die Epitope, welches verfügbar ist, einzuschließen: 1) Die Häufigkeit von Ansprechenden in der Population für jedes Epitop, 2) MHC-Restriktions-Daten und 3) die Häufigkeit in der Population der relevanten Haplotypen.
  • Es gibt eine Anzahl natürlich vorkommender "promiskuitiver" T-Zell-Epitope, welche in einem großen Anteil von Individuen einer Tierart oder einer Tierpopulation aktiv sind, und diese werden vorzugsweise in den Impfstoff eingeführt, wodurch das Bedürfnis für eine sehr große Anzahl unterschiedlicher Analoga in dem gleichen Impfstoff reduziert wird.
  • Das promiskuitive Epitop kann erfindungsgemäß ein natürlich vorkommendes menschliches T-Zell-Epitop sein, wie beispielsweise Epitope von Tetanustoxoid (z.B. die P2- und P30-Epitope), Diphtherietoxoid, Influenzavirus Hämagluttinin (HA) und P. falciparum-CS-Antigen.
  • Im Lauf der Jahre sind eine Anzahl anderer promiskuitiver T-Zell-Epitope identifiziert worden. Insbesondere Peptide, die fähig sind, einen großen Anteil von HLA-DR-Molekülen, codiert von den unterschiedlichen HLA-DR-Allelen, zu binden, sind identifiziert worden und diese sind alle mögliche T-Zell-Epitope, einzuführen in die Analoga, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Vergleiche außerdem die Epitope, die in den folgenden Referenzen diskutiert werden, welche hiermit alle durch Referenz hierin inkorporiert sind: WO 98/23635 (Frazer I.H. et al., der University of Queensland zugeschrieben); Southwood S. et al., J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F. et al., 1988, Nature 336: 778-780; Chicz R.M. et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 27-47; Hammer J. et al., 1993, Cell 74: 197-203; und Falk K. et al., 1994, Immunogenetics 39: 230-242. Die letztere Referenz beschäftigt sich auch mit HLA-DQ- und -DP-Liganden. Alle in diesen fünf Referenzen aufgelisteten Epitope sind als natürliche Epitop-Kandidaten zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung relevant, wie es auch Epitope sind, welche gemeinsame Motive mit diesen teilen.
  • Alternativ kann das Epitop irgendein künstliches T-Zell-Epitop sein, welches in der Lage ist, einen großen Anteil von MHC-Klasse II-Molekülen zu binden. In diesem Kontext sind die "pan DR-Epitop-Peptide" ("PADRE"), beschrieben in WO 95/07707 und in dem entsprechenden Dokumenten Alexander J. et al., 1994, Immunity 1: 751-761 (beide Offenbarungen sind hierin durch Referenz inkorporiert), interessante Kandidaten für Epitope zur erfindungsgemäßen Verwendung. Es sollte angemerkt werden, dass die effektivsten PADRE-Peptide, die in diesen Dokumenten offenbart sind, D-Aminosäuren in den C- und N-Termini tragen, um die Stabilität bei der Verabreichung zu verbessern. Jedoch zielt die vorliegende Erfindung vorwiegend darauf ab, die relevanten Epitope als Teil des modifizierten amyloidogenen Polypeptids zu inkorporieren, welches dann nachfolgend innerhalb des lysosomalen Kompartiments von APCs enzymatisch abgebaut werden sollte, um eine nachfolgende Präsentation im Kontext eines MHC-II-Moleküls zu erlauben, und deshalb ist es nicht angebracht, D-Aminosäuren in die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Epitope zu inkorporieren.
  • Ein besonders bevorzugtes PADRE-Peptid ist eines, das die Aminosäuresequenz AKFVAAWTLKAAA oder eine immunologisch wirksame Untersequenz davon aufweist. Dieses und andere Epitope, die das gleiche Fehlen von MHC-Restriktion aufweisen, sind be vorzugte T-Zell-Epitope, welche in den im erfinderischen Verfahren verwendeten Analoga vorhanden sein sollten. Solche super-promiskuitiven Epitope werden die einfachsten Ausführungsformen der Erfindung erlauben, wobei nur ein einzelnes modifiziertes amyloidogenes Polypeptid dem Immunsystem eines geimpften Tiers gegenüber präsentiert wird.
  • Wie oben erwähnt, kann die Modifikation des amyloidogenen Polypeptids auch das Einführen einer ersten Gruppierung beinhalten, welche das modifizierte amyloidogene Polypeptid zu einer APC- oder einem B-Lymphozyten targetiert. Beispielsweise kann die erste Gruppierung ein spezifischer Bindungspartner für ein B-Lymphozyten-spezifisches Oberflächenantigen oder für ein APC-spezifisches Oberflächenantigen sein. Im Fachgebiet sind viele solche spezifischen Oberflächenantigene bekannt. Beispielsweise kann die Gruppierung ein Kohlenhydrat, für das es einen Rezeptor auf dem B-Lymphozyt oder der APC gibt (z.B. Mannan oder Mannose) sein. Alternativ kann die zweite Gruppierung ein Hapten sein. Auch ein Antikörperfragment, welches spezifisch ein Oberflächenmolekül auf APCs oder Lymphozyten erkennt, kann als eine erste Gruppierung verwendet werden (das Oberflächenmolekül kann z.B. ein FCγ-Rezeptor von Makrophagen und Monozyten sein, wie beispielsweise FCγRI, oder, alternativ, jeder andere spezifische Oberflächenmarker, wie beispielsweise CD40 oder CTLA-4). Es sollte angemerkt werden, dass alle diese beispielhaften Targeting-Moleküle auch als Teil eines Adjuvans verwendet werden können, vgl. unten.
  • Als eine Alternative oder Ergänzung für das Targeting des modifizierten amyloidogenen Polypeptids zu einem gewissen Zelltyp, um eine verstärkte Immunreaktion zu erreichen, ist es möglich, den Grad des Ansprechens des Immunsystems zu erhöhen, indem die oben genannte zweite Gruppierung eingeschlossen wird, welche das Immunsystem stimuliert. Typische Beispiele solcher zweiten Gruppierungen sind Cytokine und Hitzeschockproteine oder molekulare Chaperone, sowie wirksame Teile davon.
  • Geeignete Cytokine zur erfindungsgemäßen Verwendung sind jene, welche normalerweise auch als Adjuvanzien in einer Impfstoffzusammensetzung dienen werden, d.h. beispielsweise Interferon-γ (IFN-γ), Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-12 (IL-12), Interleukin-13 (IL-13), Interleukin-15 (IL-15), und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF); alternativ kann der funktionelle Teil des Cytokinmoleküls als die zweite Gruppierung ausreichen. Hinsichtlich der Verwendung solcher Cytokine als Adjuvans-Substanzen, vgl. die unten stehende Diskussion.
  • Gemäß der Erfindung können geeignete Hitzeschockproteine oder molekulare Chaperone, verwendet als die zweite Gruppierung, HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 (auch bekannt als gp96, vgl. Wearsch P.A. et al., 1998, Biochemistry 37: 5709-19) und CRT (Calreticulin) sein.
  • Alternativ kann die zweite Gruppierung ein Toxin, wie beispielsweise Listeriolycin (LLO), Lipid A und hitzelabiles Enterotoxin sein. Außerdem sind eine Anzahl mycobakterieller Derivate, wie z.B. MDP (Muramyldipeptid), CFA (vollständiges Freund'sches Adjuvans, "complete Freund's adjuvant") und die Trehalosediester TDM und TDE, interessante Möglichkeiten.
  • Auch die Möglichkeit des Einführens einer dritten Gruppierung, welche die Präsentation des modifizierten amyloidogenen Polypeptids gegenüber dem Immunsystem verstärkt, ist eine wichtige Ausführungsform der Erfindung. Das Fachgebiet hat mehrere Beispiele dieses Prinzips gezeigt. Beispielsweise ist es bekannt, dass der Palmitoyl-Lipidierungsanker in dem Borrelia burgdorferi-Protein OspA verwendet werden kann, um selbst-adjuvierende Polypeptide bereitzustellen (vgl. z.B. WO 96/40718) – es scheint, dass die lipidierten Proteine Mizellen-ähnliche Strukturen mit einem Kern, bestehend aus den Lipidierungsankerteilen der Polypeptide, und wobei die verbleibenden Teile des Moleküls daraus hervorragen, ausbilden, was in Mehrfachpräsentationen der antigenen Determinanten resultiert. Folglich sind die Verwendung dieser und verwandter Vorgehensweisen unter Verwendung unterschiedlicher Lipidierungsanker bzw. Lipidanker (z.B. einer Myristylgruppe, einer Myristylgruppe, einer Farnesylgruppe, einer Geranyl-Geranyl-Gruppe, eines GPI-Ankers und einer N-Acyldiglyceridgruppe) bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung, insbesondere weil das Bereitstellen solch eines Lipidankers in einem rekombinant hergestellten Protein relativ einfach ist und lediglich die Verwendung z.B. einer natürlich vorkommenden Signalsequenz als Fusionspartner für das modifizierte amyloidogene Polypeptid erfordert. Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung des C3d-Fragments von Komplementfaktor C3 oder C3 selbst (vgl. Dempsey et al., 1996, Science 271, 348-350 und Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462).
  • Eine alternative Ausführungsform der Erfindung, welche auch in der bevorzugten Präsentation multipler (z.B. wenigstens zwei) Kopien der wichtigen Epitop-Regionen des amyloidogenen Polypeptids gegenüber dem Immunsystem resultiert, ist das kovalente Koppeln des amyloidogenen Polypeptids, der Untersequenz davon oder von Varianten davon an gewis se Moleküle. Beispielsweise können Polymere verwendet werden, z.B. Kohlenhydrate wie beispielsweise Dextran, vgl. z.B. Lees A. et al., 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A. et al., 1990, J. Immunol. 145: 3594-3600, jedoch sind auch Mannose und Mannan verwendbare Alternativen. Integrale Membranproteine von z.B. E. coli und anderen Bakterien sind auch verwendbare Konjugationspartner. Die traditionellen Trägermoleküle wie beispielsweise keyhole limpet Hämocyanin (KLH), Tetanustoxoid, Diphtherietoxoid und Rinderserumalbumin (BSA) sind auch bevorzugte und verwendbare Konjugationspartner.
  • Überlegungen, die den ausgewählten Gebieten des Einführens von Modifikationen in amyloidogene Polypeptide zugrunde liegen sind a) Präservation bzw. Erhalt bekannter und vorhergesagter B-Zell-Epitope, b) Präservation bzw. Erhalt von Tertiärstruktur, c) Vermeiden von B-Zell-Epitopen, vorhanden auf "Produzierzellen" etc. Auf jeden Fall ist es, wie oben diskutiert, relativ leicht, einen Satz modifizierter amyloidogener Moleküle, welche alle der Einführung eines T-Zell-Epitops, an unterschiedlichen Stellen, unterzogen worden sind, zu durchmustern.
  • Weil die vorliegende Erfindung Herabregulierung von menschlichem Aβ einbezieht, ist es konsequenterweise bevorzugt, dass das oben diskutierte Amyloidpolypeptid ein menschliches Aβ-Polypeptid ist. In dieser Ausführungsform ist es insbesondere bevorzugt, dass das menschliche amyloidogene Polypeptid durch Substituieren wenigstens einer Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2 mit wenigstens einer Aminosäuresequenz gleicher oder unterschiedlicher Länge, und enthaltend ein fremdes TH-Epitop, modifiziert worden ist. Beispiele von modifiziertem amyloidogenem APP und Aβ sind schematisch in 1 unter Verwendung der P2- und P30-Epitope als Beispiele gezeigt. Das Grundprinzip hinter solchen Konstrukten wird im Detail in dem Beispiel diskutiert.
  • Formulierung der modifizierten amyloidogenen Polypeptide
  • Wenn die Präsentation des amyloidogenen Polypeptids oder des modifizierten amyloidogenen Polypeptids gegenüber dem Immunsystem eines Tiers mittels dessen Verabreichung an das Tier bewirkt wird, folgt die Formulierung des Polypeptids den allgemein im Fachgebiet anerkannten Prinzipien.
  • Die Zubereitung von Impfstoffen, welche Peptidsequenzen als aktive Bestandteile enthalten, wird im Allgemeinen im Fachgebiet gut verstanden, wie durch US-Patente 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; und 4,578,770 exemplifiziert, die alle hierin durch Referenz inkorporiert sind. Typischerweise werden solche Impfstoffe als Injektionsmittel, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen hergestellt; auch feste Formen, geeignet zur Lösung in oder Suspension in einer Flüssigkeit vor der Verabreichung können zubereitet werden. Die Zubereitung kann auch emulgiert werden. Der aktive immunogene Bestandteil wird oft mit Exzipienzien vermischt, welche pharmazeutisch annehmbar und kompatibel mit dem aktiven Bestandteil sind. Geeignete Exzipienzien sind beispielsweise Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder dergleichen, und Kombinationen davon. Zusätzlich kann der Impfstoff, falls erwünscht, geringe Mengen von Hilfsstoffen, wie beispielsweise Benetzungsmitteln oder Emulgatoren, pH-Puffer-Mitteln, oder Adjuvanzien, welche die Effektivität der Impfstoffe steigern, enthalten; vgl. die detaillierte Diskussion von Adjuvanzien unten.
  • Die Impfstoffe werden konventionell parenteral, mittels Injektion, beispielsweise entweder subkutan, intrakutan, intradermal, subdermal oder intramuskulär, verabreicht. Zusätzliche Formulierungen, welche für andere Arten der Verabreichung geeignet sind, schließen Suppositorien und in manchen Fällen orale, bukkale, sublinguale, intraperitoneale, intravaginale, anale, epidurale, spinale und intrakranielle Formulierungen ein. Suppositorien können traditionelle Binder und Träger beispielsweise Polyalkylenglykole oder Triglyceride einschließen. Solche Suppositorien können aus Gemischen geformt werden, die den aktiven Bestandteil im Bereich von 0,5 % bis 10 %, vorzugsweise 1 bis 2 %, enthalten. Orale Formulierungen schließen derartige normalerweise eingesetzte Exzipienzien ein, wie beispielsweise pharmazeutische Grade von Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat und dergleichen. Diese Zusammensetzungen nehmen die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit verzögerter Freigabe oder Pulvern ein und enthalten 10 bis 95 % des aktiven Bestandteils, vorzugswei se 25 bis 70 %. Für orale Formulierungen ist Choleratoxin ein interessanter Formulierungspartner (und außerdem ein möglicher Konjugationspartner).
  • Die Polypeptide können in den Impfstoff als neutrale oder Salzformen formuliert werden. Pharmazeutisch annehmbare Salze schließen Säureadditionssalze (gebildet mit den freien Aminogruppen des Peptids) und welche mit anorganischen Säuren, wie beispielsweise Salz- oder Phosphorsäuren, oder derartigen organischen Säuren, wie Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Mandelsäure und dergleichen, gebildet sind, ein. Salze, gebildet mit freien Carboxylgruppen, können außerdem abgeleitet sein von anorganischen Basen, wie beispielsweise Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen(III)-hydroxiden, und solchen organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und dergleichen.
  • Die Impfstoffe werden auf mit der Dosierungsformulierung kompatible Weise und in einer solchen Menge, wie sie therapeutisch wirksam und immunogen sein wird, verabreicht. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Subjekt ab, einschließlich z.B. der Kapazität des Immunsystems des Individuums, eine Immunreaktion aufzustellen, und dem gewünschten Grad an Schutz. Geeignete Dosierungsbereiche sind in der Größenordnung von mehreren 100 μg aktiver Bestandteil pro Impfung mit einem bevorzugten Bereich von etwa 0,1 μg bis 2.000 μg (obwohl höhere Mengen im Bereich von 1-10 mg erwägt werden), wie beispielsweise in dem Bereich von etwa 0,5 μg bis 1.000 μg, vorzugsweise im Bereich von 1 μg bis 500 μg und insbesondere im Bereich von etwa 10 μg bis 100 μg. Geeignete Schemata zur anfänglichen Verabreichung und für Booster-Einspritzungen sind auch variabel, jedoch werden sie durch eine anfängliche Verabreichung, gefolgt von nachfolgenden Impfungen oder anderen Verabreichungen typifiziert.
  • Die Verabreichungsweise kann breit variiert werden. Beliebige der konventionellen Verfahren zur Verabreichung eines Impfstoffs sind anwendbar. Diese schließen orale Verabreichung auf einer festen physiologisch annehmbaren Basis oder in einer physiologisch annehmbaren Dispersion, parenteral, durch Injektion oder dergleichen, ein. Die Dosierung des Impfstoffs wird von der Verabreichungsroute abhängen und wird gemäß dem Alter der zu impfenden Person und der Formulierung des Antigens variieren.
  • Einige der Polypeptide des Impfstoffs sind in einem Impfstoff hinreichend immunogen, aber für manche der anderen wird die Immunreaktion verstärkt sein, wenn der Impfstoff ferner eine Adjuvans-Substanz umfasst.
  • Verschiedene Verfahren zum Erreichen eines Adjuvans-Effekts des Impfstoffs sind bekannt. Allgemeine Prinzipien und Verfahren sind detailliert in "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (Herausg.), John Wiley & Sons Ltd., ISBN 0-471-95170-6, und außerdem in "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G. et al. (Herausg.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9, beschrieben, von welchen beide hierin durch Referenz inkorporiert sind.
  • Es ist insbesondere bevorzugt, ein Adjuvans zu verwenden, von welchem gezeigt werden kann, dass es das Brechen der Autotoleranz gegenüber Autoantigenen erleichtert bzw. ermöglicht; tatsächlich ist dies essentiell in Fällen, wo unmodifiziertes amyloidogenes Polypeptid als der aktive Bestandteil in der Autoimpfung verwendet wird. Nicht beschränkende Beispiele geeigneter Adjuvanzien sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Immun-Targeting-Adjuvans, einem immun-modulierenden Adjuvans, wie beispielsweise einem Toxin, einem Cytokin und einem mycobakteriellen Derivat; einer Ölformulierung; einem Polymer; einem Micellen-bildenden Adjuvans; einem Saponin; einer immunstimulierenden Komplex-Matrix (ISCOM-Matrix); einem Partikel; DDA; Aluminiumadjuvanzien; DNA-Adjuvanzien; γ-Inulin; und einem Verkapselungsadjuvans. Im Allgemeinen sollte angemerkt werden, dass die obigen Offenbarungen, welche sich auf Verbindungen und Mittel beziehen, die in den Analoga als erste, zweite und dritte Gruppierungen verwendbar sind, sich außerdem mutatis mutandis auf ihre Verwendung in dem Adjuvans eines erfindungsgemäßen Impfstoffs beziehen.
  • Die Applikation von Adjuvanzien beinhaltet die Verwendung von Mitteln wie beispielsweise Aluminiumhydroxid oder -phosphat (Alaun), gewöhnlich als 0,05 bis 0,1 %ige Lösung in gepufferter Salzlösung verwendet, Vermischen mit synthetischen Polymeren von Zuckern (z.B. Carbopol®), verwendet als 0,25 %ige Lösung, Aggregation des Proteins in dem Impfstoff durch Hitzebehandlung mit Temperaturen im Bereich von 70° bis 101 °C in Zeiträumen von 30 Sekunden bis 2 Minuten entsprechend, und auch Aggregation mittels Quervernetzungsmitteln sind möglich. Aggregation durch Reaktivierung mit Pepsin-behandelten Antikörpern (Fab-Fragmenten) gegen Albumin, Mischung mit bakteriellen Zellen, wie beispielsweise C. parvum, oder Endotoxinen oder Lipopolysaccharidbestandteilen Gramnegativer Bakterien, Emulsion in physiologisch annehmbaren Ölvehikeln, wie beispielsweise Mannidmonooleat (Aracel A) oder Emulsion mit einer 20%igen Lösung eines Perfluorkohlenstoffs (Fluosol-DA), verwendet als ein Blutersatz ("block substitute"), können auch einge setzt werden. Auch das Vermischen mit Ölen, wie beispielsweise Squalen und IFA, ist bevorzugt.
  • Gemäß der Erfindung ist DDA (Dimethyldioctadecylammoniumbromid) ein interessanter Kandidat für ein Adjuvans, wie es auch DNA und γ-Inulin ist, jedoch sind außerdem Freund'sches vollständiges und unvollständiges Adjuvans sowie quillaja-Saponine, wie z.B. Qui1A und QS21, interessant, sowie es auch RIBI ist. Weitere Möglichkeiten sind Monophosphoryl-Lipid A (MPL), die oben genannten C3 und C3d und Muramyldipeptid (MDP).
  • Liposomenformulierungen sind auch dafür bekannt, Adjuvans-Effekte zu verleihen, und deshalb sind Liposomenadjuvanzien gemäß der Erfindung bevorzugt.
  • Auch Adjuvanzien vom immunstimulierenden Komplex-Matrix-Typ (ISCOM®-Matrix) sind bevorzugte Auswahlen gemäß der Erfindung, insbesondere weil es gezeigt worden ist, dass diese Art Adjuvanzien in der Lage ist, MHC Klasse II-Expression durch APCs heraufzuregulieren. Eine ISCOM®-Matrix besteht aus (gegebenenfalls fraktionierten) Saponinen (Triterpenoiden) von Quillaja saponaria, Cholesterin und Phospholipid. Wenn vermischt mit dem immunogenen Protein, ist die resultierende partikuläre Formulierung, was als ein ISCOM-Partikel bekannt ist, wobei das Saponin 60-70 % Gew./Gew., das Cholesterin und Phospholipid 10-15 % Gew./Gew., und das Protein 10-15 % Gew./Gew. darstellen. Details betreffend die Zusammensetzung und Verwendung immunstimulierender Komplexe können z.B. in den oben genannten Lehrbüchern gefunden werden, die sich mit Adjuvanzien befassen, jedoch liefern auch Morein B. et al., 1995, Clin. Immunother. 3: 461-475 sowie Barr LG. und Mitchell G.F., 1996, Immunol. And Cell Biol. 74: 8-25 (beide hierin durch Referenz inkorporiert) nützliche Instruktionen zur Herstellung kompletter immunstimulierender Komplexe.
  • Eine andere hoch interessante (und folglich bevorzugte) Möglichkeit, einen Adjuvans-Effekt zu erzielen, ist es, die in Gosselin et al., 1992 (welche hierin durch Referenz inkorporiert ist) beschriebene Technik einzusetzen. Kurz erwähnt kann die Präsentation eines relevanten Antigens, wie z.B. eines Antigens der vorliegenden Erfindung, durch Konjugieren des Antigens an Antikörper (oder Antigen-bindende Antikörperfragmente) gegen die Fcγ-Rezeptoren auf Monozyten/Makrophagen verstärkt werden. Insbesondere ist gezeigt worden, dass Konjugate zwischen Antigen und Anti-FcγRI Immunogenität für die Zwecke einer Impfung verstärken.
  • Andere Möglichkeiten beteiligen die Verwendung der Targeting- und Immunmodulationssubstanzen (u.a. Cytokine), die oben als Kandidaten für die ersten und zweiten Gruppierungen bei den modifizierten Versionen amyloidogener Polypeptide erwähnt wurden. In diesem Zusammenhang sind auch synthetische Inducer von Cytokinen, wie Poly-I:C, Möglichkeiten.
  • Geeignete mycobakterielle Derivate sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Muramyldipeptid, vollständigem Freund'schen Adjuvans, RIBI und ein Trehalose-Diester, wie z.B. TDM und TDE.
  • Geeignete Immuntargetingadjuvanzien sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus CD40-Ligand und CD40-Antikörpern oder spezifisch bindenden Fragmenten davon (vgl. die obige Diskussion), Mannose, einem Fab-Fragment und CTLA-4.
  • Geeignete Polymeradjuvanzien sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Kohlenhydrat, wie z.B. Dextran, PEG, Stärke, Mannan und Mannose; z.B. einem Kunststoffpolymer; und Latex, wie z.B. Latexkügelchen.
  • Eine noch weitere interessante Weise, eine Immunreaktion zu modulieren, ist es, das Immunogen (gegebenenfalls zusammen mit Adjuvanzien und pharmazeutisch annehmbaren Trägern und Vehikeln) in einen "virtuellen Lymphknoten" (VLN, "virtual lymph node") einzuschließen (ein von Immuno Therapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501 entwickeltes geschütztes medizinisches Gerät). Der VLN (ein dünnes röhrenförmiges Gerät) ahmt die Struktur und Funktion eines Lymphknotens nach. Das Einfügen eines VLN unter die Haut erzeugt eine Stelle steriler Entzündung mit einer Aufwallung von Cytokinen und Chemokinen. T- und B-Zellen sowie APCs reagieren rasch auf die Gefahrensignale, richten sich auf die entzündete Stelle und akkumulieren innerhalb der porösen Matrix des VLN. Es ist gezeigt worden, dass die notwendige Antigendosis, erforderlich, eine Immunreaktion gegen ein Antigen aufzustellen, reduziert ist, wenn der VLN verwendet wird, und dass Immunschutz, verliehen durch Impfung unter Verwendung eines VLN, konventionelle Immunisierung unter Verwendung von Ribi als Adjuvans übertraf. Die Technologie ist u.a. kurz in Gelber C. et al., 1998, "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node", in: "From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, October 12th – 15th 1998, Seascape Resort, Aptos, California" beschrieben.
  • In vielen Fällen ist gezeigt worden, dass Mikropartikelformulierung von Impfstoffen die Immunogenität von Proteinantigenen erhöht, und diese ist folglich eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung. Mikropartikel werden entweder als Co-Formulierungen von Antigen mit einem Polymer, einem Lipid, einem Kohlenhydrat oder anderen Molekülen, geeignet zur Herstellung der Partikel, hergestellt, oder die Mikropartikel können homogene Partikel sein, die nur aus dem Antigen selbst bestehen.
  • Beispiele Polymer-basierter Mikropartikel sind PLGA- und PVP-basierte Partikel (Gupta, R.K. et al., 1998), wobei das Polymer und das Antigen in ein festes Partikel kondensiert sind. Lipid-basierte Partikel können als Micellen des Lipids (sogenannte Liposomen) hergestellt werden, die das Antigen innerhalb der Micelle einfangen (Pietrobon, P.J., 1995). Kohlenhydrat-basierte Partikel werden typischerweise aus einem geeigneten abbaubaren Kohlenhydrat, wie beispielsweise Stärke oder Chitosan, hergestellt. Das Kohlenhydrat und das Antigen werden in einem Verfahren vermischt und in Partikel kondensiert, das ähnlich dem für Polymerpartikel verwendeten (Kas, H.S. et al., 1997) ist.
  • Partikel, die nur aus dem Antigen bestehen, können durch verschiedene Sprüh- und Gefriertrocknungstechniken hergestellt werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung besonders geeignet ist die super-kritische Flüssigkeits-Technologie, die verwendet wird, um sehr gleichmäßige Partikel kontrollierter Größe herzustellen (York, P., 1999 & Shekunov, B. et al., 1999).
  • Es wird erwartet, dass der Impfstoff 1 bis 6-mal pro Jahr an ein Individuum, das dessen bedarf, verabreicht werden sollte, wie beispielsweise 1, 2, 3, 4, 5 oder 6-mal im Jahr. Es ist zuvor gezeigt worden, dass die durch die Verwendung der bevorzugten Autovakzinen gemäß der Erfindung induzierte Gedächtnisimmunität nicht permanent ist, und deshalb muss das Immunsystem periodisch mit dem amyloidogenen Polypeptid oder den modifizierten amyloidogenen Polypeptiden herausgefordert werden.
  • Aufgrund genetischer Variation können unterschiedliche Individuen mit Immunreaktionen variierender Stärke auf das gleiche Polypeptid reagieren. Deshalb kann der Impfstoff gemäß der Erfindung mehrere unterschiedliche Polypeptide umfassen, um die Immunreaktion zu erhöhen, vgl. auch die oben stehende Diskussion betreffend die Auswahl fremder 7-Zell-Epitop-Einführungen. Der Impfstoff kann zwei oder mehrere Polypeptide umfassen, wobei alle Polypeptide wie oben definiert sind.
  • Der Impfstoff kann somit 3-20 unterschiedliche modifizierte oder unmodifizierte Polypeptide, wie z.B. 3-10 unterschiedliche Polypeptide, umfassen.
  • Nucleinsäureimpfung
  • Als eine Alternative zur klassischen Verabreichung eines Peptid-basierten Impfstoffs bietet die Technologie der Nucleinsäureimpfung (auch bekannt als "Nucleinsäureimmunisierung", "genetische Immunisierung", und "Gen-Immunisierung") eine Anzahl attraktiver Eigenschaften.
  • Zunächst erfordert Nucleinsäureimpfung im Gegensatz zu der traditionellen Impfstoffherangehensweise keine Ressourcen-verbrauchende Produktion des immunogenen Mittels in großem Maßstab (z.B. in der Form der Fermentation von Mikroorganismen, in industriellem Maßstab die modifizierte amyloidogene Polypeptide produzieren). Ferner besteht kein Bedarf für Gerätereinigung ("device purification") und Rückfaltungsschemata für das Immunogen. Und schließlich erwartet man, dass das optimale post-translationale Prozessieren des Expressionsprodukts auftritt, weil sich Nucleinsäureimpfung auf den biochemischen Apparat des geimpften Individuums verlässt, um das Expressionsprodukt der eingeführten Nucleinsäure zu produzieren; dies ist insbesondere wichtig im Fall von Autoimpfung, weil, wie oben erwähnt, ein signifikanter Bruchteil der ursprünglichen B-Zell-Epitope in dem modifizierten Molekül aufbewahrt sein sollte, und weil B-Zell-Epitope im Prinzip von Teilen eines beliebigen (Bio)moleküls (z.B. Kohlenhydrat, Lipid, Protein etc.) dargestellt werden können. Deshalb können native Glycosylierungs- und Lipidierungsmuster des Immunogens sehr wohl von Bedeutung für die Gesamtimmunogenität sein, und diese wird am Besten sichergestellt, indem man den Wirt das Immunogen herstellen lässt.
  • Folglich umfasst eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung das Bewirken von Präsentation von modifiziertem amyloidogenem Polypeptid gegenüber dem Immunsystem durch Einführen einer Nucleinsäure/von Nucleinsäuren, codierend das modifizierte amyloidogene Polypeptid, in die Zellen des Tiers und dadurch das Erhalten von in vivo-Expression der eingefügten Nucleinsäure/Nucleinsäuren durch die Zellen.
  • In dieser Ausführungsform ist die eingeführte Nucleinsäure vorzugsweise DNA, welche in der Form von nackter DNA, DNA, die mit geladenen oder ungeladenen Lipiden formuliert ist, DNA, die in Liposomen formuliert ist, DNA, die in einem viralen Vektor enthalten ist, DNA, die mit einem Transfektion-erleichternden Protein oder Polypeptid formuliert ist, DNA, die mit einem Targeting-Protein oder -Polypeptid formuliert ist, DNA, die mit Calci umpräzipitationsmitteln formuliert ist, DNA, die an ein inertes Trägermolekül gekoppelt ist, DNA, die in ein Polymer eingekapselt ist, z.B. in PLGA (vgl. die Mikroverkapselungstechnologie, beschrieben in WO 98/31398) oder in Chitin oder Chitosan, und DNA, die mit einem Adjuvans formuliert ist, sein kann. In diesem Zusammenhang wird angemerkt, dass praktisch alle Überlegungen betreffend die Verwendung von Adjuvanzien in traditioneller Impfstoffformulierung für die Formulierung von DNA-Impfstoffen gelten. Folglich gelten alle Offenbarungen hierin, welche sich auf die Verwendung von Adjuvanzien im Zusammenhang Polypeptid-basierter Impfstoffe beziehen, mutatis mutandis für ihre Verwendung in Nucleinsäure-Impfungstechnologie.
  • Was Verabreichungsrouten und Verabreichungsschemata Polypeptid-basierter Impfstoffe angeht, welche oben im Detail beschrieben worden sind, so sind diese auch für die Nucleinsäure-Impfstoffe der Erfindung anwendbar, und alle obigen Diskussionen betreffend Verabreichungsrouten und Verabreichungsschemata für Polypeptide gelten mutatis mutandis für Nucleinsäuren. Dem sollte hinzugefügt werden, dass Nucleinsäureimpfstoffe geeignet intravenös und intraarteriell verabreicht werden können. Ferner ist im Fachgebiet gut bekannt, dass Nucleinsäureimpfstoffe durch Verwendung einer sogenannten Genkanone verabreicht werden können, und folglich werden auch diese und äquivalente Verabreichungsarten als Teil der vorliegenden Erfindung angesehen. Schließlich ist berichtet worden, dass auch die Verwendung eines VLN bei der Verabreichung von Nucleinsäuren gute Ergebnisse erzielt, und folglich ist diese spezielle Verabreichungsart insbesondere bevorzugt.
  • Ferner kann können die Nucleinsäure(n), die als ein Immunisierungsmittel verwendet wird/werden, Regionen, codierend die ersten, zweiten und/oder dritten Gruppierungen, z.B. in der Form der oben beschriebenen immunmodulierenden Substanzen, wie beispielsweise die als verwendbare Adjuvanzien diskutierten Cytokine, enthalten. Eine bevorzugte Version dieser Ausführungsform umfasst, dass man die codierende Region für das Analogon und die codierende Region für den Immunmodulator in unterschiedlichen Leserahmen oder wenigstens unter der Kontrolle unterschiedlicher Promotoren hat. Dadurch wird vermieden, dass das Analogon oder Epitop als ein Fusionspartner zu dem Immunmodulator produziert wird. Alternativ können zwei verschiedene Nucleotidfragmente verwendet werden, jedoch ist dies, wegen des Vorteils gesicherter Co-Expression, wenn man beide codierenden Regionen in dem selben Molekül eingeschlossen hat, weniger bevorzugt.
  • Dementsprechend betrifft die Erfindung außerdem eine Zusammensetzung zum Induzieren der Produktion von Antikörpern gegen ein amyloidogenes Polypeptid, wobei die Zusammensetzung umfasst:
    • – ein Nucleinsäurefragment oder einen Vektor der Erfindung (vgl. die obige Diskussion von Vektoren), und
    • – ein pharmazeutisch und immunologisch annehmbares Vehikel und/oder einen pharmazeutisch und immunologisch annehmbaren Träger und/oder ein pharmazeutisch und immunologisch annehmbares Adjuvans, wie oben diskutiert.
  • Unter normalen Umständen wird die Varianten-codierende Nucleinsäure in der Form eines Vektors eingeführt, wobei die Expression unter der Kontrolle eines viralen Promotors ist. Für detailliertere Diskussionen von erfindungsgemäßen Vektoren, vgl. die Diskussion unten. Außerdem sind detaillierte Offenbarungen betreffend die Formulierung und Verwendung von Nucleinsäure-Impfstoffen verfügbar, vgl. Donnelly J.J. et al., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 und Donnelly J.J. et al., 1997, Life Sciences 60: 163-172. Diese beiden Referenzen sind hierin durch Referenz inkorporiert.
  • Lebendimpfstoffe
  • Eine dritte Alternative für das Bewirken von Präsentation modifizierten amyloidogenen Polypeptids gegenüber dem Immunsystem ist die Verwendung von Lebendimpfstoff-Technologie. Bei der Lebendimpfung wird Präsentation gegenüber dem Immunsystem durch Verabreichen eines nicht-pathogenen Mikroorganismus, welcher mit einem Nucleinsäurefragment transformiert worden ist, das ein modifiziertes amyloidogenes Polypeptid codiert, oder mit einem Vektor transformiert worden ist, der solch ein Nucleinsäurefragment einschließt, an ein Tier bewirkt. Der nicht-pathogene Mikroorganismus kann ein beliebiger geeigneter abgeschwächter bzw. attenuierter Bakterienstamm (abgeschwächt mittels Passagieren oder mittels des Entfernens pathogener Expressionsprodukte durch rekombinante DNA-Technologie), z.B. Mycobacterium bovis BCG., nicht-pathogene Streptococcus spp., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella, etc. sein. Übersichtsartikel, die sich mit der Herstellung von Stand der Technik-Lebendimpfstoffen befassen, können z.B. in Saliou P., 1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 und Walker P.D., 1992, Vaccine 10: 977-990, die beide durch Referenz hierin inkorporiert sind, gefunden werden. Für Details über die in solchen Lebendimpfstoffen verwendeten Nucleinsäurefragmente und Vektoren vgl. die Diskussion unten.
  • Als eine Alternative zu bakteriellen Lebendimpfstoffen kann das unten diskutierte Nucleinsäurefragment der Erfindung in einen nicht-virulenten viralen Impfstoffvektor, wie beispielsweise einen Vaccinia-Stamm oder irgendein anderes geeignetes Pocken-Virus inkorporiert werden.
  • Normalerweise wird der nicht-pathogene Mikroorganismus oder das nicht-pathogene Virus dem Tier nur einmal verabreicht, es kann jedoch in gewissen Fällen notwendig sein, den Mikroorganismus mehr als einmal in der Lebenszeit zu verabreichen, um schützende Immunität aufrechtzuerhalten. Es wird sogar erwägt, dass Immunisierungs-Schemata, wie jene, die oben im Detail beschrieben wurden, für Polypeptid-Impfung verwendbar sein werden, wenn Lebend- oder Virusimpfstoffe verwendet werden.
  • Alternativ wird Lebend- oder Virusimpfung mit vorangehender oder nachfolgender Polypeptid- und/oder Nucleinsäureimpfung kombiniert. Beispielsweise ist es möglich, Primärimmunisierung mit einem Lebend- oder Virus-Impfstoff zu erreichen, gefolgt von nachfolgenden Booster-Immunisierungen unter Verwendung der Polypeptid- oder Nucleinsäurevorgehensweise.
  • Der Mikroorganismus oder das Virus kann mit Nucleinsäure(n), enthaltend Regionen, codierend die 1., 2. und/oder 3. Gruppierungen, z.B. in der Form der oben beschriebenen immunmodulierenden Substanzen, wie beispielsweise den als verwendbare Adjuvanzien diskutierten Cytokinen, transformiert werden. Eine bevorzugte Version dieser Ausführungsform umfasst, dass man die codierende Region für das Analogon und die codierende Region für den Immunmodulator in unterschiedlichen Leserahmen oder wenigstens unter der Kontrolle unterschiedlicher Promotoren hat. Dadurch vermeidet man, dass das Analogon oder die Epitope als Fusionspartner an den Immunmodulator produziert werden. Alternativ können zwei unterschiedliche Nucleotidfragmente als transformierende Mittel verwendet werden. Natürlich kann, wenn man die ersten und/oder zweiten und/oder dritten Gruppierungen in dem gleichen Leserahmen hat, dies als ein Expressionsprodukt ein erfindungsgemäßes Analogon bereitstellen, und eine solche Ausführungsform ist gemäß der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt.
  • Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei Krankheitsbehandlung
  • Wie von den obigen Diskussionen gewürdigt werden wird, erlaubt die Bereitstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Kontrolle von Krankheiten, die durch Amyloidablagerungen gekennzeichnet sind. In diesem Zusammenhang ist AD das Schlüsselziel des erfinderischen Verfahrens, jedoch sind auch andere Krankheiten, die durch Amyloidablagerungen gekennzeichnet sind, denkbare Ziele. Folglich umfasst eine wichtige Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herabregulierung von Amyloid-Aktivität die Behandlung und/oder Prävention und/oder Verbesserung von AD oder anderer Krankheiten, gekennzeichnet durch Amyloidablagerung, wobei das Verfahren die Herabregulierung von Amyloid gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren in solch einem Ausmaß, dass die Amyloidmenge signifikant verringert wird, umfasst.
  • Es ist besonders bevorzugt, dass die Reduktion an Amyloid in einer Umkehr des Gleichgewichts zwischen Amyloidbildung und Amyloidabbau/-entfernen resultiert, d.h. dass die Rate von Amyloidabbau/-entfernen dazu gebracht wird, die Rate der Amyloidbildung zu übertreffen. Durch vorsichtiges Kontrollieren der Anzahl und des immunologischen Einflusses der Immunisierungen des Individuums, das deren bedarf, wird es möglich sein, eine Balance über die Zeit zu erhalten, welche in einer Netto-Reduktion von Amyloidablagerungen resultiert, ohne exzessive nachteilige Effekte aufzuweisen.
  • Alternativ kann, wenn das erfindungsgemäße Verfahren in einem Individuum existierende Amyloidablagerungen nicht entfernen oder reduzieren kann, das erfindungsgemäße Verfahren dazu verwendet werden, eine klinisch signifikante Reduktion bei der Bildung neuen Amyloids zu erzielen, wodurch die Zeit, in der der Krankheitszustand nicht-schwächend ist, signifikant verlängert wird. Es sollte möglich sein, die Rate der Amyloidablagerung entweder durch Messen der Serumkonzentration von Amyloid (von welcher man annimmt, dass sie im Gleichgewicht mit dem abgelagerten Material ist) oder unter Verwendung von Positron-Emissionstomographie (PET)-Scannen, vgl. Small G.W. et al., 1996, Ann. N.Y. Acad. Sci. 802: 70-78, zu verfolgen.
  • Andere Krankheiten und Zustände, wo die vorliegenden Mittel und Verfahren bei der Behandlung oder Verbesserung auf analoge Weise verwendet werden können, sind oben im "Hintergrund der Erfindung" genannt worden (systemische Amyloidose, Altersdiabetes, Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit, fronto-temporale Demenz und die Prion verwandten übertragbaren spongiformen Enzephalopathien) oder sind unten in dem Abschnitt mit der Überschrift "andere Amyloidkrankheiten und damit assoziierte Proteine" aufgelistet".
  • Erfindungsgemäße Peptide, Polypeptide und Zusammensetzungen
  • Wie von dem Obigen ersichtlich sein wird, basiert die vorliegende Erfindung auf dem Konzept der Immunisierung von Individuen gegen das amyloidogene Antigen, um eine reduzierte Menge Pathologie-bedingter Amyloidablagerungen zu erhalten. Die bevorzugte Weise, so eine Immunisierung zu erzielen, ist, modifizierte Versionen von amyloidogenem Polypeptid zu verwenden, wodurch Moleküle bereitgestellt werden, welche zuvor im Fachgebiet noch nicht offenbart worden sind.
  • Man glaubt, dass die hierin diskutierten modifizierten Moleküle in ihrem eigenen Recht erfinderisch sind, und folglich betrifft ein wichtiger Teil der Erfindung ein Analogon eines amyloidogenen Polypeptids, welches von einem autologen Aβ oder APP eines Tiers abgeleitet ist, wobei wenigstens ein isoliertes fremdes TH-Epitop eingeführt ist, wie es für die P2- und P30-Epitope in 1 schematisch gezeigt ist, so dass Immunisierung des Tiers mit dem Analogon die Produktion von Antikörpern gegen das amyloidogene Polypeptid induziert. Vorzugsweise ist die Art der Modifikation mit den oben beschriebenen Modifikationstypen konform, wenn verschiedene Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens diskutiert werden, wenn modifiziertes amyloidogenes Polypeptid verwendet wird. Folglich sind jegliche hierin präsentierte Offenbarungen betreffend modifizierte amyloidogene Moleküle relevant für die Zwecke des Beschreibens des erfindungsgemäßen amyloidogenen Analogons, und es finden jegliche solche Offenbarungen mutatis mutandis auf die Beschreibung dieser Analoga Anwendung.
  • Es sollte angemerkt werden, dass bevorzugte modifizierte amyloidogene Moleküle Modifikationen umfassen, welche in einem Polypeptid resultieren, das eine Sequenzidentität von wenigstens 70 % mit einem amyloidogenen Protein oder mit einer Teilsequenz davon von wenigstens 10 Aminosäuren-Länge aufweist. Höhere Sequenzidentitäten sind bevorzugt, z.B. wenigstens 75 % oder sogar wenigstens 80, 85, 90 oder 95 %. Die Sequenzidentität für Proteine und Nucleinsäuren kann als (Nref – Ndif)·100/Nref berechnet werden, wobei Ndif die Gesamtanzahl der nicht-identischen Reste in den beiden Sequenzen, wenn sie vergleichend angeordnet sind, ist, und wobei Nref die Anzahl an Resten in einer der Sequenzen ist. Folglich wird die DNA-Sequenz AGTCAGTC eine Sequenzidentität von 75 % mit der Sequenz AATCAATC haben (Ndif = 2 und Nref = 8).
  • Die Erfindung betrifft außerdem Zusammensetzungen, verwendbar im Ausüben des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • Die Erfindung betrifft deshalb eine immunogene Zusammensetzung, umfassend eine immunologisch wirksame Menge eines oben definierten Analogons, wobei die Zusammensetzung ferner ein(en) pharmazeutisch und immunologisch annehmbares/annehmbaren Verdünnungsmittel und/oder Vehikel und/oder Träger und/oder Exzipiens und gegebenenfalls ein Adjuvans umfasst. Mit anderen Worten betrifft dieser Teil der Erfindung Formulierungen von modifiziertem amyloidogenem Polypeptid, im Wesentlichen wie oben beschrieben. Die Auswahl von Adjuvanzien, Trägern und Vehikeln ist folglich in Übereinstimmung mit dem, was oben diskutiert worden ist, wenn Bezug genommen wurde auf Formulierung von modifiziertem und unmodifiziertem amyloidogem Polypeptid zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herabregulierung von Amyloid.
  • Die Polypeptide werden gemäß im Fachgebiet gut bekannter Verfahren hergestellt. Längere Polypeptide werden normalerweise mittels rekombinanter Gentechnik hergestellt, einschließlich des Einführens einer Nucleinsäuresequenz, codierend das Analogon, in einen geeigneten Vektor, Transformation einer geeigneten Wirtszelle mit dem Vektor, Expression der Nucleinsäuresequenz durch die Wirtszelle, Gewinnung des Expressionsprodukts von den Wirtszellen oder ihrem Kulturüberstand und nachfolgende Reinigung und optional weiterer Modifikationen, z.B. Rückfaltung oder Derivatisierung.
  • Kürzere Peptide werden vorzugsweise mittels der gut bekannten Techniken der Fest- oder Flüssigphasenpeptidsynthese hergestellt. Jedoch haben kürzliche Fortschritte in dieser Technologie die Produktion von Volllängenpolypeptiden und -proteinen mit diesen Mitteln möglich gemacht, und folglich liegt auch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, die langen Konstrukte mit synthetischen Mitteln herzustellen.
  • Erfindungsgemäße Nucleinsäurefragmente und Vektoren
  • Von der obigen Offenbarung wird man zu würdigen wissen, dass modifizierte amyloidogene Polypeptide mittels rekombinanter Gentechnik, jedoch auch mittels chemischer Synthese oder Semisynthese hergestellt werden können; die letzteren zwei Optionen sind insbesondere relevant, wenn die Modifikation im Koppeln an nicht-proteinöse Moleküle, wie z.B. Kohlenhydratpolymere, besteht, und natürlich auch, wenn die Modifikation die Addition von Seitenketten oder Seitengruppen an eine Peptidkette, die von amyloidogenem Polypeptid abgeleitet ist, umfasst.
  • Für den Zweck rekombinanter Gentechnik, und natürlich für den Zweck von Nucleinsäureimmunisierung, sind Nucleinsäurefragmente, codierend modifiziertes amyloidogenes Polypeptid, wichtige chemische Produkte. Folglich betrifft ein wichtiger Teil der Erfindung ein Nucleinsäurefragment, welches ein Analogon eines amyloidogenen Polypeptids codiert, d.h. ein amyloidogenes Polypeptid-abgeleitetes Polypeptid, welches entweder die natürliche Sequenz umfasst, an welche ein Fusionspartner addiert oder in welcher ein Fusionspartner insertiert worden ist, oder vorzugsweise ein amyloidogenes Polypeptid-abgeleitetes Polypeptid, worin kein fremdes T-Zell-Epitop mittels Insertion und/oder Addition, vorzugsweise mittels Substitution und/oder Deletion, eingeführt worden ist. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragmente sind entweder DNA- oder RNA-Fragmente.
  • Die erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragmente werden normalerweise in geeignete Vektoren insertiert, um Klonierungs- oder Expressionsvektoren zu bilden, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragmente tragen; solche neuen Vektoren sind auch Teil der Erfindung. Details betreffend die Konstruktion dieser Vektoren der Erfindung werden im Zusammenhang mit transformierten Zellen und Mikroorganismen unten diskutiert werden. Die Vektoren können, abhängig vom Zweck und Typ der Anwendung, in der Form von Plasmiden, Phagen, Cosmiden, Mini-Chromosomen oder einem Virus sein, jedoch ist auch nackte DNA, welche nur transient in gewissen Zellen exprimiert wird, ein wichtiger Vektor. Bevorzugte Klonierungs- und Expressionsvektoren der Erfindung sind der autonomen Replikation fähig, wodurch hohe Kopienanzahlen für die Zwecke der Expression auf hohem Level oder Replikation auf hohem Level für nachfolgendes Klonieren ermöglicht werden.
  • Die allgemeinen Grundzüge eines erfindungsgemäßen Vektors umfassen die folgenden Eigenschaften in 5'→3'-Richtung und in funktioneller Verknüpfung: einen Promotor zum Steuern der Expression des erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragments, gegebenenfalls eine Nucleinsäuresequenz, codierend ein Leader-Peptid, das Sekretion des Polypeptidfragments (in die extrazelluläre Phase oder, wo zutreffend, in das Periplasma) oder Integration des Polypeptidfragments in die Membran ermöglicht, das erfindungsgemäße Nucleinsäurefragment, und gegebenenfalls eine Nucleinsäuresequenz, codierend einen Terminator. Wenn man mit Expressionsvektoren in Produzier-Stämmen oder -Zelllinien arbeitet, ist es für die Zwecke der genetischen Stabilität der transformierten Zelle bevorzugt, dass der Vektor, wenn eingeführt in eine Wirtszelle, in das Wirtszellgenom integriert wird. Im Gegensatz dazu ist es, wenn man mit Vektoren arbeitet, die für das Bewirken von in vivo-Expression in einem Tier verwendet werden (d.h., wenn man den Vektor bei der DNA-Impfung verwendet), ist es aus Sicherheitsgründen bevorzugt, dass der Vektor unfähig ist, in das Wirtszellengenom integriert zu werden; typischerweise werden nackte DNA oder nicht-integrierende virale Vektoren verwendet, deren Auswahlmöglichkeiten dem Fachmann gut bekannt sind.
  • Die erfindungsgemäßen Vektoren werden dazu verwendet, Wirtszellen zu transformieren, um das modifizierte amyloidogene Polypeptid der Erfindung zu produzieren. Solche transformierten Zellen, welche auch Teil der Erfindung sind, können kultivierte Zellen oder Zelllinien, verwendet zur Propagierung der erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragmente und Vektoren, oder verwendet zur rekombinanten Produktion der modifizierten amyloidogenen Polypeptide der Erfindung, sein. Alternativ können die transformierten Zellen geeignete Lebendimpfstoff-Stämme sein, wobei die Nucleinsäurefragmente (eine einzelne oder multiple Kopien) insertiert worden sind, um die Sekretion des modifizierten amyloidogenen Polypeptids oder dessen Integration in die bakterielle Membran oder Zellwand zu bewirken.
  • Bevorzugte transformierte Zellen der Erfindung sind Mikroorganismen, wie beispielsweise Bakterien (wie z.B. die Arten Escherichia [z.B. E. coli], Bacillus [z.B. Bacillus subtilis], Salmonella oder Mycobacterium [vorzugsweise nicht-pathogen, z.B. M. bovis BCG]), Hefen (wie z.B. Saccharomyces cerevisiae) und Protozoen. Alternativ können die transformierten Zellen von einem multizellulären Organismus stammen, wie z.B. einem Pilz, einer Insektenzelle, einer Pflanzenzelle oder einer Säugerzelle. Am stärksten bevorzugt sind Zellen, abgeleitet von einem Menschen, vgl. die Diskussion von Zelllinien und Vektoren unten. Kürzlich erhaltene Ergebnisse waren sehr vielversprechend hinsichtlich der Verwendung einer kommerziell erhältlichen Drosophila melanogaster-Zelllinie (der Schneider 2 (S2)-Zelllinie und des Schneider 2-Vektorsystems, erhältlich von Invitrogen) für die rekombinante Herstellung von Polypeptiden im Labor der Anmelderin, und deshalb ist dieses Expressionssystem insbesondere bevorzugt.
  • Für die Zwecke der Klonierung und/oder optimierten Expression ist es bevorzugt, dass die transformierte Zelle in der Lage ist, das erfindungsgemäße Nucleinsäurefragment zu replizieren. Zellen, die das Nuclein-Fragment exprimieren, sind bevorzugte verwendbare Ausführungsformen der Erfindung; sie können für Präparation des modifizierten amyloidogenen Polypeptids in kleinem Maßstab oder großem Maßstab verwendet werden, oder, im Fall nicht-pathogener Bakterien, als Impfstoff Bestandteile in einem Lebendimpfstoff.
  • Wenn man die modifizierten Moleküle der Erfindung mittels transformierter Zellen produziert, ist es praktisch, jedoch bei weitem nicht essentiell, dass das Expressionsprodukt entweder in das Kulturmedium heraus exportiert wird oder auf der Oberfläche der transformierten Zelle getragen wird.
  • Wenn eine effektive Produzierer-Zelle identifiziert worden ist, ist es bevorzugt, auf deren Basis eine stabile Zelllinie zu etablieren, welche den erfindungsgemäßen Vektor trägt und welche das Nucleinsäurefragment, codierend das modifizierte amyloidogene Polypeptid, exprmiert. Vorzugsweise sezerniert diese stabile Zelllinie das Analogon der Erfindung oder trägt das Analogon der Erfindung, wodurch dessen Reinigung ermöglicht wird.
  • Im Allgemeinen werden Plasmidvektoren, enthaltend Replikon- und Kontrollsequenzen, welche von Arten stammen, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, in Verbindung mit den Wirten verwendet. Der Vektor trägt für gewöhnlich eine Replikationsstelle sowie markierende Sequenzen, welche in der Lage sind, phänotypische Selektion in transformierten Zellen bereitzustellen. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322, einem Plasmid, abgeleitet von einer E. coli-Art (siehe z.B. Bolivar et al., 1977), transformiert. Das pBR322-Plasmid enthält Gene für Ampicillin und Tetracyclinresistenz und liefert folglich einfache Mittel zum Identifizieren transformierter Zellen. Das pBR-Plasmid oder ein anderes mikrobielles Plasmid oder ein Phage müssen außerdem Promotoren enthalten, welche von dem prokaryotischen Mikroorganismus zur Expression verwendet werden können, oder es/er muss modifiziert sein, diese zu enthalten.
  • Jene Promotoren, die am gebräuchlichsten bei der rekombinanten DNA-Konstruktion verwendet werden, schließen die B-Lactamase (Penicillinase)- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) und ein Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., 1979; EP-A-0 036 776) ein. Während diese am weit verbreitetsten verwendet werden, sind andere mikrobielle Promotoren entdeckt und verwendet worden, und Details betreffend ihre Nucleotidsequenzen sind publiziert worden, was einen Fachmann befähigt, sie funktionell mit Plasmidvektoren zu ligieren (Siebwenlist et al., 1980). Gewisse Gene von Prokaryoten können in E. coli effizient von ihren eigenen Promotorsequenzen exprmiert werden, was das Bedürfnis nach der Addition eines anderen Promotors mit künstlichen Mitteln ausschließt.
  • Zusätzlich zu Prokaryoten können außerdem eukaryotische Mikroben, wie z.B. Hefekulturen, verwendet werden, und hier sollte der Promotor in der Lage sein, die Expression zu steuern. Saccharomyces cerevisiae, oder gewöhnliche Bäckerhefe, ist unter eukaryotischen Mikroorganismen der am häufigsten verwendete, obwohl eine Anzahl anderer Stämme allgemein erhältlich ist. Für Expression in Saccharomyces wird beispielsweise das Plasmid YRp7 allgemein verwendet (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, welches einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm von Hefe liefert, dem das Vermögen fehlt, in Tryptophan zu wachsen, z.B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, 1977). Die Gegenwart der trp1-Läsion als Charakteristikum des Hefewirtszellgenoms liefert dann eine effektive Umgebung zur Detektion von Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan.
  • Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren schließen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzman et al., 1980) oder andere Glycolyseenzyme (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), wie z.B. Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase ein. Beim Konstruieren geeigneter Expressionsplasmide werden die Terminationssequenzen, assoziiert mit diesen Genen, auch in den Expressionsvektor ligiert, 3' von der gewünschten, zu exprimierenden Sequenz, um für Polyadenylierung der mRNA und Termination zu sorgen.
  • Andere Promotoren, welche den zusätzlichen Vorteil haben, dass Transkription von Wachstumsbedingungen kontrolliert wird, sind die Promotorregion für Alkoholdehydrogenase-2, Isocytochrom-C, saure Phosphatase, abbauende Enzyme, assoziiert mit dem Stickstoffstoffwechsel, und die zuvor genannte Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, und Enzyme, verantwortlich für Maltose- und Galactoseverwendung. Jeder Plasmidvektor, enthaltend einen Hefe-kompatiblen Promotor, Replikationsursprung und Hefe-kompatible Terminationssequenzen, ist geeignet.
  • Zusätzlich zu Mikroorganismen können Kulturen von Zellen, abgeleitet von multizellulären Organismen, auch als Wirte verwendet werden. Im Prinzip ist jede solche Zellkultur zu gebrauchen, ob von Vertebraten- oder Invertebratenkultur. Jedoch ist das Interesse an Vertebratenzellen am größten gewesen und die Propagierung von Vertebraten in Kultur (Gewebekultur) ist in den letzten Jahren eine Routinevorgehensweise geworden (tissue culture, 1973). Beispiele solcher verwendbaren Wirtszelllinien sind VERO- und HeLa-Zellen, Eizelllinien vom Chinesischen Hamster (CHO) ("Chinese hamster ovary"), und W138, BHK, COS-7 293, Spodoptera frugiperda (SF)-Zellen (kommerziell erhältlich als komplette Expressionssysteme von u.a. Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, USA, und von Invitrogen) und MDCK-Zelllinien. In der vorliegenden Erfindung ist eine besonders bevorzugte Zelllinie S2, erhältlich von Invitrogen, Postfach 2312, 9704 CH Groningen, Niederlande.
  • Expressionsvektoren für solche Zellen beinhalten gewöhnlicherweise (falls notwendig) einen Replikationsursprung, einen Promotor, lokalisiert vor dem zu exprimierenden Gen, zusammen mit irgendwelchen notwendigen Ribosomenbindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstelle und Transkriptionsterminatorsequenzen.
  • Zur Verwendung in Säugerzellen werden die Kontrollfunktionen auf den Expressionsvektoren oft durch virales Material bereitgestellt. Beispielsweise stammen allgemein verwendete Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2 und am häufigsten Affenvirus 40 (SV40; "Simian Virus 40"). Die früheren und späteren Promotoren des SV40-Virus sind insbesondere verwendbar, weil beide leicht aus dem Virus als ein Fragment, welches außerdem den viralen SV40-Replikationsursprung (Fiers et al., 1978) enthält, erhalten werden. Kleinere oder größere SV40-Fragmente können auch verwendet werden, vorausgesetzt dass die ungefähr 250 Basenpaare lange Sequenz, die sich von der HindIII-Stelle zu der Bg1I-Stelle, lokalisiert im viralen Replikationsursprung, erstreckt, dort eingeschlossen ist. Ferner ist es auch möglich, und oft wünschenswert, Promotor- oder Kontrollsequenzen zu verwenden, die normalerweise mit der gewünschten Gensequenz assoziiert sind, vorausgesetzt solche Kontrollsequenzen sind mit den Wirtszellsystemen kompatibel.
  • Ein Replikationsursprung kann entweder durch Konstruktion des Vektors, damit dieser einen exogenen Ursprung einschließt, wie er z.B. vom SV40- oder einem anderen Virus (z.B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) abgeleitet werden kann, bereitgestellt werden, oder kann von dem chromosomalen Wirtszell-Replikationsmechanismus bereitgestellt werden. Wenn der Vektor in das Wirtszellchromosom integriert wird, ist letzteres oft ausreichend.
  • Identifikation verwendbarer Analoga
  • Es wird dem Fachmann klar sein, dass nicht alle möglichen Varianten oder Modifikationen natürlich vorkommender amyloidogener Polypeptide die Fähigkeit haben werden, Antikörper in einem Tier hervorzurufen, welche mit der natürlichen Form kreuz-reaktiv sind. Es ist jedoch nicht schwierig, einen effektiven Standard-Screen für modifizierte amyloidogene Moleküle aufzustellen, welche die Minimalanforderungen für hierin diskutierte immunologi sche Reaktivität erfüllen. Folglich umfasst ein Verfahren zur Identifikation eines modifizierten amyloidogenen Polypeptids, welches in der Lage ist, Antikörper gegen unmodifiziertes amyloidogenes Polypeptid in einer Tierart zu induzieren, wobei das unmodifizierte amyloidogene Polypeptid ein (nicht-immunogenes) Selbst-Protein ist,
    • – Herstellen, mittels Peptidsynthese oder Gentechnik, eines Satzes gegenseitig unterschiedlicher modifizierter amyloidogener Polypeptide, worin Aminosäuren in die Aminosäuresequenz eines amyloidogenen Polypeptids der Tierart addiert worden sind, darin insertiert worden sind, davon deletiert worden sind oder darin substituiert worden sind, und dadurch Aminosäuresequenzen in dem Satz erzeugt haben, welche T-Zell-Epitope umfassen, welche für die Tierart fremd sind, oder Herstellen eines Satzes von Nucleinsäurefragmenten, codierend den Satz gegenseitig verschiedener modifizierter amyloidogener Polypeptide,
    • – Testen von Mitgliedern des Satzes modifizierter amyloidogener Polypeptide oder Nucleinsäurefragmente auf ihre Fähigkeit, Produktion von Antikörpern durch die Tierart gegen das unmodifizierte amyloidogene Polypeptid zu induzieren, und
    • – Identifizieren und gegebenenfalls Isolieren des Mitglieds/der Mitglieder des Satzes modifizierter amyloidogener Polypeptide, welche(s) signifikant Antikörperproduktion gegen unmodifiziertes amyloidogenes Polypeptid in der Art induziert/induzieren, oder Identifizieren und gegebenenfalls Isolieren der Polypeptidexpressionsprodukte, codiert von Mitgliedern des Satzes von Nucleinsäurefragmenten, welche Antikörperproduktion gegen unmodifiziertes amyloidogenes Polypeptid in der Tierart signifikant induzieren.
  • In diesem Kontext ist der "Satz gegenseitig unterschiedlicher modifizierter amyloidogener Polypeptide" eine Sammlung nicht-identischer, modifizierter amyloidogener Polypeptide, welche z.B. auf Basis der oben diskutierten Kriterien (z.B. in Kombination mit Studien von Zirkulardichroismus, NMR-Spektren und/oder Röntgenstrahlenbeugungsmustern) selektiert worden sind. Der Satz kann nur aus wenigen Mitgliedern bestehen, es wird jedoch erwägt, dass der Satz einige hundert Mitglieder enthalten kann.
  • Der Test von Mitgliedern des Satzes kann letztlich in vivo durchgeführt werden, aber eine Anzahl von in vitro-Tests kann angewendet werden, welche die Anzahl modifizierter Moleküle, welche dem Zwecke der Erfindung dienen werden, einengt.
  • Weil es das Ziel des Einführens der fremden T-Zell-Epitope ist, die B-Zell-Antwort durch T-Zell-Hilfe zu unterstützen, ist eine Voraussetzung, dass T-Zell-Proliferation durch das modifizierte amyloidogene Polypeptid induziert wird. T-Zell-Proliferation kann durch standardisierte Proliferationsassays in vitro getestet werden. In Kürze wird eine Probe, angereichert für T-Zellen, von einem Subjekt erhalten und nachfolgend in Kultur gehalten. Die kultivierten T-Zellen werden mit APCs des Subjekts, welche zuvor das modifizierte Molekül aufgenommen haben und es prozessiert haben, um seine T-Zell-Epitope zu präsentieren, in Kontakt gebracht. Die Proliferation von T-Zellen wird überwacht und mit einer geeigneten Kontrolle (z.B. T-Zellen in Kultur, kontaktiert mit APCs, welche intaktes natives amyloidogenes Polypeptid prozessiert haben) verglichen. Alternativ kann Proliferation durch Bestimmen der Konzentration relevanter Cytokine, freigesetzt von den T-Zellen in Reaktion auf ihr Erkennen fremder T-Zellen, gemessen werden.
  • Nachdem es hoch wahrscheinlich geworden ist, dass wenigstens ein modifiziertes amyloidogenes Polypeptid von irgendeinem der Sätze in der Lage ist, Antikörperproduktion gegen amyloidogenes Polypeptid zu induzieren, ist es möglich, eine immunogene Zusammensetzung herzustellen, die wenigstens ein modifiziertes Amyloid-Polypeptid umfasst, welches in der Lage ist, Antikörper gegen unmodifiziertes amyloidogenes Polypeptid in einer Tierart zu induzieren, wo das unmodifizierte amyloidogene Polypeptid ein Selbst-Protein ist, wobei das Verfahren Vermischen des Mitglieds/der Mitglieder des Satzes, welcher signifikant die Produktion von Antikörpern in der Tierart induziert, welche mit dem amyloidogenen Polypeptid reaktiv sind, mit einem pharmazeutisch und immunologisch annehmbaren Träger und/oder Vehikel und/oder Verdünnungsmittel und/oder Exzipiens, gegebenenfalls in Kombination mit wenigstens einem pharmazeutisch und immunologisch annehmbaren Adjuvans, umfasst.
  • Die obigen Verfahren, betreffend das Testen von Polypeptid-Sätzen, werden zweckmäßig durch ursprüngliches Herstellen einer Anzahl gegenseitig verschiedener Nucleinsäuresequenzen oder Vektoren der Erfindung, deren Insertion in geeignete Expressionsvektoren, das Transformieren geeigneter Wirtszellen (oder Wirtstiere) mit den Vektoren und Bewirken von Expression der Nucleinsäuresequenzen der Erfindung durchgeführt. Diese Schritte können gefolgt sein von Isolation der Expressionsprodukte. Es ist bevorzugt, dass die Nucleinsäuresequenzen und/oder Vektoren durch Verfahren hergestellt werden, die das Ausüben einer molekularen Amplifikationstechnik, wie z.B. PCR, oder mittels Nucleinsäuresynthese hergestellt werden.
  • Andere Amyloidkrankheiten und damit assoziierte Proteine
  • Es gibt eine relativ große Anzahl an Krankheiten ungleich AD, wo Amyloidbildung beim Auslösen der Krankheit oder beim Verursachen der Krankheitssymptome beteiligt ist. Obwohl die in diesen Krankheiten involvierten Proteine variieren, haben sie in der Natur die gleichen Eigenschaften gemeinsam, welche Amyloid definieren, vgl. oben. Die folgende Tabelle listet eine Anzahl dieser Amyloidstörungen und der Proteine, die diese verursachen, auf. Vielfalt von Amyloidfibrillenproteinen
    Figure 00510001
  • Es wird erwägt, dass die meisten Verfahren für die Immunisierung gegen amyloidogene Polypeptide beschränkt sein sollten auf die Immunisierung, die Antikörper erzeugt, die kreuz-reaktiv mit dem nativen amyloidogenen Polypeptid sind. Nichtsdestotrotz wird es in manchen Fällen von Interesse sein, zelluläre Immunität in der Form von CTL-Reaktionen gegen Zellen zu induzieren, welche MHC-Klasse I-Epitope von den amyloidogenen Polypeptiden präsentieren – dies kann in solchen Fällen angebracht sein, in denen die Reduktion in der Anzahl von Zellen, die die amyloidogenen Polypeptide produzieren, keinen ernsthaften nachteiligen Effekt darstellt. In solchen Fällen, wo CTL-Reaktionen gewünscht sind, ist es bevorzugt, die Lehre der PCT/DK 99/00525 der Anmelderin (entsprechend USSN 09/413,186) zu verwenden. Die Offenbarungen dieser zwei Dokumente sind hierdurch hierin durch Referenz inkorporiert.
  • In dem folgenden nicht-begrenzenden Beispiel wurde ein Fokus auf die Entwicklung eines Aβ-basierten Autoimpfstoffs gegen AD gelegt.
  • BEISPIEL 1
  • Die Autoimpfungs-Vorgehensweise zur Immunisierung gegen AD
  • Die Tatsache, dass Aβ-Protein-knock-out-Mäuse keine Anormalitäten oder nachteiligen Nebenwirkungen zeigen, legt nahe, dass Entfernen oder Verringerung der Mengen von Aβ sicher sein wird, Zheng H. (1996).
  • Publizierte Experimente, bei denen transgene Tiere gegen das transgene humane Aβ-Protein immunisiert werden, deuten darauf hin, dass Herabregulierung von Aβ durch autoreaktive Antikörper erreicht werden könnte, wenn es möglich wäre, Selbst-Toleranz zu brechen. Diese Experimente deuten ferner darauf hin, dass eine solche Herabregulierung von Aβ potentiell sowohl die Bildung von Plaques verhindern würde, als auch selbst bereits gebildete Aβ-Plaques aus dem Gehirn beseitigen würde, vgl. Schenk et al. (1999). Herkömmlich ist es jedoch nicht möglich, Antikörper gegen Selbst-Proteine zu erzeugen.
  • Die publizierten Daten stellen folglich nicht die Mittel für das Brechen wahrer Selbst-Toleranz gegen wahre Selbst-Proteine bereit. Die Daten stellen auch keine Informationen bereit, wie man sicherstellt, dass die Immunreaktion allein oder vorwiegend gegen die Aβ-Ablagerungen gerichtet ist und nicht gegen das Zellmembran-gebundene Aβ-Vorläuferprotein (APP), falls dies als notwendig erwartet wird. Eine Immunreaktion, erzeugt unter Verwendung der existierenden Technologie, würde vermutlich eine Immunreaktion gegenüber Selbst-Proteinen auf eine nicht-regulierte Weise erzeugen, so dass unerwünschte und exzessive Autoreaktivität gegenüber Teilen des Aβ-Proteins erzeugt werden könnte. Folglich wird man unter Verwendung existierender Immunisierungsstrategien höchstwahrscheinlich nicht in der Lage sein, starke Immunreaktionen gegenüber Selbst-Proteinen zu erzeugen, und wird ferner, bedingt durch potenzielle starke Kreuz-Reaktivität gegenüber Membran-gebundenem APP, welches auf einer großen Anzahl von Zellen im ZNS vorhanden ist, unsicher sein.
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Mittel bereit, effektiv eine starke regulierte Immunreaktion gegenüber wahren Selbst-Proteinen zu erzeugen, welche potentiell Plaques bilden könnten und eine ernsthafte Krankheit im ZNS oder in anderen Kompartimenten des Körpers verursachen könnten. Ein sicherer und wirksamer therapeutischer Human-Aβ-Protein-Impfstoff wird unter Verwendung dieser Technologie für die Behandlung von AD entwickelt werden.
  • Im Lichte davon ist es möglich anzunehmen, dass AD, eine Krankheit, von der vorhergesagt wird, dass sie das Gesundheitssystem im nächsten Jahrhundert lahm legen wird, geheilt werden könnte oder solche beschriebenen Impfstoffe wenigstens eine effektive therapeutische Herangehensweise zur Behandlung der Symptome und des Fortschreitens dieser Krankheit darstellen könnten.
  • Diese Technik stellt einen vollständig neuen immunologischen Ansatz zum Blockieren von Amyloidablagerung bei AD und auch anderen neurologischen Krankheiten dar.
  • In der folgenden Tabelle sind 35 erwägte Konstrukte angezeigt. Alle in der Tabelle angegebenen Positionen sind relativ zum Start-Methionin von APP (erste Aminosäure in SEQ ID NO: 2) und schließen sowohl die Start- als auch End-Aminosäure ein, z.B. schließt das 672 – 714-Fragment sowohl Aminosäure 672 als auch 714 ein. Die Start- und End-Positionen für P2 und P30 zeigen an, dass das Epitop einen Teil des APP-Fragments bei den angezeigten Positionen (beide Positionen in der Substitution eingeschlossen) substitutiert – in den meisten Konstrukten substituieren die eingeführten Epitope ein Fragment von der Länge des Epitops. Die Sterne in der Tabelle haben die folgende Bedeutung:
    • *) Nur eine Position für P2 und P30 zeigt an, dass das Epitop in das APP-Derivat an der angezeigten Position insertiert worden ist (das Epitop beginnt bei der Aminosäure, C-terminal benachbart zu der gegebenen Position).
    • **) Konstruktion 34 enthält drei identische APP-Fragmente, getrennt von P30 bzw. P2.
    • ***) Konstruktion 35 enthält neun identische APP-Fragmente, getrennt durch abwechselnde P30- und P2-Epitope.
  • Figure 00540001
  • Der Teil von APP, gegen welchen es am interessantesten ist, eine Reaktion zu erzeugen, ist das 43 Aminosäure-Aβ-Core-Peptid (Aβ-43, entsprechend SEQ ID NO: 2, Reste 672-714), das der Hauptbestandteil von Amyloidplaques in AD-Gehirnen ist. Dieses APP-Fragment ist Teil aller oben aufgelisteten Konstruktionen.
  • Varianten 1 und 2 umfassen einen Anteil von APP stromaufwärts von Aβ-43, wo die Modellepitope P2 und P30 platziert worden sind. Varianten 1 und 3-8 umfassen alle das C-100-Fragment, von welchem gezeigt worden ist, dass es neurotoxisch ist – das C-100-Fragment entspricht den Aminosäureresten 714-770 von SEQ ID NO: 2. In Varianten 3-5 ersetzen die Epitope einen Teil des C-100-Fragments, während sie in Varianten 6-8 in C-100 insertiert worden sind.
  • Varianten 9-35 enthalten nur das Core-Aβ-43-Protein. In Varianten 9-13 sind P2 und P30 an eines der beiden Enden von Aβ-43 fusioniert; in 14-21 substituiert P2 und P30 einen Teil von Aβ-43; in 22-33 sind P2 und P30 in Aβ-43 insertiert; 34 enthält drei identische Aβ-43-Fragmente, getrennt ("spaced") von P30 bzw. P2; 35 enthält 9 Aβ-43-Wiederholungen, getrennt ("spaced") durch Alternieren der P2- und P30-Epitope.
  • Hinsichtlich Details, siehe 1 und die obige Tabelle.
  • Ein weiterer Konstrukt-Typ ist insbesondere bevorzugt. Nachdem es das Ziel der vorliegenden Erfindung ist, Zerstörung der Zellen, die APP produzieren, zu vermeiden, wohingegen das Entfernen von Aβ gewünscht ist, scheint es möglich, Autoimpfstoff-Konstrukte, umfassend nur Teile von Aβ, welche nicht der extrazellulären Phase ausgesetzt sind, wenn sie in APP vorhanden sind, herzustellen. Folglich müssen solche Konstrukte wenigstens ein B-Zell-Epitop, abgeleitet von dem Aminosäurefragment, definiert durch die Aminosäuren 700-714 in SEQ ID NO: 2 enthalten. Da vorhergesagt wird, dass solch ein kurzes Polypeptidfragment nur schwach immunogen ist, ist es bevorzugt, dass solch ein Autoimpfstoff-Konstrukt aus mehreren Kopien des B-Zell-Epitops, z.B. in der Form eines Konstrukts, das die in Formel I in der detaillierten Offenbarung der vorliegenden Erfindung gezeigte Struktur, vgl. oben, aufweist, besteht. In dieser Version von Formel I sind die Ausdrücke Amyloidel-Amyloidex × B-Zell-Epitope, enthaltend Aminosäuresequenzen, abgeleitet von dem Aminosäuren 700-714 von SEQ ID NO: 2. Eine bevorzugte Alternative ist die oben im Detail beschriebene Möglichkeit des Koppelns des amyloidogenen (Poly)peptids und des ausgewählten fremden T-Helfer-Epitops über eine Amidbindung an ein Polysaccharidträgermolekül – auf diese Weise werden Mehrfachpräsentationen des "schwachen" Epitops, dargestellt durch die Aminosäuren 700- 714 von SEQ ID NO: 2, möglich, und es wird außerdem möglich, ein optimales Verhältnis zwischen B-Zell- und T-Zell-Epitopen auszuwählen.
  • BEISPIEL 2
  • Immunisierung transgener Mäuse mit Aβ und modifizierten Proteinen gemäß der Erfindung
  • Konstruktion der hAB43+-34-codierenden DNA. Das hAB43+-34-Gen wurde in mehreren Stufen konstruiert. Zuerst wurde mit den Primern ME#801 (SEQ ID NO: 10) und ME#802 (SEQ ID NO: 11) unter Verwendung von Primer ME#800 (SEQ ID NO: 9) als Matrize ein PCR-Fragment erzeugt. ME#800 codiert das humane Aβ-43-Fragment mit E. coli-optimierten Codonen. ME#801 und 802 addieren geeignete Restriktionsstellen an das Fragment.
  • Das PCR-Fragment wurde gereinigt, mit NcoI und HindIII verdaut, nochmals gereinigt und in einen NcoI-HindIII-verdauten und gereinigten pET28b+ E. coli-Expressionsvektor kloniert. Das resultierende Plasmid, codierend humanes Wildtyp-Aβ-43 wird pAB1 genannt.
  • Im nächsten Schritt wird das T-Helfer-Epitop P2 an den C-Terminus des Moleküls addiert. Primer ME#806 (SEQ ID NO: 12) enthält die Sequenz, codierend das P2-Epitop, wodurch folglich eine Fusion von P2 und Aβ-43 durch die PCR-Reaktion erzeugt wird.
  • Das Klonieren wurde durchgeführt, indem ein PCR-Fragment mit den Primern ME#178 (SEQ ID NO: 8) und ME#806 unter Verwendung von pAB1 als Matrize hergestellt wurde. Das Fragment wurde gereinigt, mit NcoI und HindIII verdaut, wieder gereinigt und in einen NcoI-HindIII-verdauten und gereinigten pET28b+-Vektor kloniert. Das resultierende Plasmid wird pAB2 genannt.
  • Auf eine analoge Weise wurde ein anderes Plasmid hergestellt, das die Aβ-43-codierende Sequenz mit einem anderen T-Helfer-Epitop, P30, addiert an den N-Terminus, beherbergt. Dies wurde durchgeführt, indem ein PCR-Fragment mit den Primern ME#105 (SEQ ID NO: 7) und ME#807 (SEQ ID NO: 13) unter Verwendung von pAB1 als Matrize hergestellt wurde.
  • Das Fragment wurde gereinigt, mit NcoI und HindIII verdaut, wieder gereinigt und in einen NcoI-HindIII-verdauten und gereinigten pET28b+-Vektor kloniert. Das resultierende Plasmid wird pAB3 genannt.
  • In einem dritten Schritt wird eine zweite Aβ-43-Wiederholung C-terminal zu dem P2-Epitop von Plasmid pAB2 durch Primer ME#809 (SEQ ID NO: 14) addiert. ME#809 erzeugt zur gleichen Zeit eine BamHI-Stelle unmittelbar nach der Aβ-43-Wiederholung. Ein PCR-Fragment wurde mit den Primern ME#178 und ME#809 unter Verwendung von pAB2 als Matrize hergestellt. Das Fragment wurde mit NcoI und HindIII verdaut, gereinigt und in einem NcoI-HindIII-verdauten und gereinigten pET28b+-Vektor kloniert. Dieses Plasmid wird pAB4 genannt.
  • Schließlich wurde die P30-Epitop-Aβ-43-Wiederholung-Sequenz von pAB3 in das pAB4-Plasmid kloniert. Dies wurde getan, indem ein PCR-Fragment mit den Primern ME#811 (SEQ ID NO: 16) und ME#105 unter Verwendung von pAB3 als Matrize hergestellt wurde. Das Fragment wurde gereinigt und in einer nachfolgenden PCR mit ME#810 (SEQ ID NO: 15) unter Verwendung von pAB3 als Matrize als Primer verwendet. Das resultierende Fragment wurde gereinigt, mit BamHI und HindIII verdaut und in ein BamHI-HindIII-verdautes und gereinigtes pAB4-Plasmid kloniert. Das resultierende Plasmid, pAB5, codiert das hAB43+-34-Molekül.
  • Alle PCR- und Klonierungsverfahren wurden im Wesentlichen, wie von Sambrook J., Fritsch E.F. & Maniatis T., 1989, "Molecular cloning: a laboratory manual", zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. beschrieben, durchgeführt.
  • Für alle Klonierungsverfahren wurden E. coli-K-12-Zellen, Stamm Top-10 F' (Stratagene, USA), verwendet. Der pET28b+-Vektor wurde von Novagen, USA, erworben. Alle Primer wurden bei DNA Technology, Dänemark, synthetisiert.
  • Expression und Reinigung von hAB43+-34. Das hAB43+-34-Protein, codiert von pAB5, wurde in BL21-Gold (Novagen)-E. coli-Zellen wie von den Anbietern des pET28b+-Systems (Novagen) beschrieben, exprimiert.
  • Das exprimierte hAB43+-34-Protein wurde zu mehr als 85 % Reinheit durch Waschen von Einschlusskörpern ("inclusion bodies"), gefolgt von Kationenaustauschchromatographie unter Verwendung einer BioCad-Reinigungs-Arbeitsstation (PerSeptive Biosystems, USA) in der Gegenwart von 6 M Harnstoff gereinigt. Der Harnstoff wurde danach durch stufenweise Dialyse gegen eine Lösung, enthaltend abnehmende Mengen an Harnstoff, entfernt. Der End-Puffer war 10 mM Tris, pH 8,5.
  • Immunisierungsstudie. Mäuse, transgen für menschliches APP (Alzheimer-Vorläuferprotein), wurden für die Studie verwendet. Diese Mäuse, genannt TgRND8+, exprimieren eine mutierte Form von APP, die in hoher Konzentration von Aβ-40 und Aβ-42 in den Maus-Gehirnen resultiert (Janus, C. et al.).
  • Die Mäuse (8-10 Mäuse pro Gruppe) wurden entweder mit Aβ-42 (SEQ ID NO: 2, Reste 673-714, synthetisiert mittels einer Standard-Fmoc-Strategie) oder der hAB43+-34- Variante (Konstrukt 34 in der Tabelle in Beispiel 1, rekombinant hergestellt) viermal in Zwei-Wochen-Intervallen immunisiert. Dosen waren entweder 100 mg für Aβ oder 50 mg für hAB43+-34. Den Mäusen wurde am Tag 43 (nach drei Injektionen) und nach Tag 52 (nach vier Injektionen) Blut entnommen, und die Seren wurden verwendet, um den Level von Anti-Aβ-42-spezifischen Titern unter Verwendung eines direkten Aβ-42-ELISA zu bestimmen.
  • Die folgende Tabelle zeigt die mittleren relativen Anti-Aβ-42-Titer:
    Figure 00580001
  • Wie klar sein wird, sind die Antikörper-Titer, erhalten wenn mit der hAB43+-34-Aβ-Variante immunisiert wird, nach drei bzw. vier Immunisierungen 4-mal bzw. 7,5-mal höher als die Titer, erhalten wenn man das unveränderte Wildtyp-Aβ-43 als immunogen verwendet. Diese Tatsache wird weiter ins rechte Licht gerückt, wenn man die Tatsache bedenkt, dass die Menge der Variante, verwendet zur Immunisierung, nur 50 % der Menge der Wildtyp-Sequenz, verwendet zur Immunisierung, war.
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Claims (38)

  1. Verwendung eines Agenzes, ausgewählt aus a) wenigstens einem Analogon eines autologen Aβ (beta-Amyloid)- oder APP (Amyloidprecursorprotein = Amyloidvorläuferprotein)-Polypeptids eines Tiers, in das wenigstens ein isoliertes fremdes T-Helfer-Epitop (TH-Epitop) mittels Aminosäureinsertion, -addition, -deletion oder -substitution eingeführt ist, wobei das fremde TH-Epitop von D-Aminosäuren frei ist und in das autologe Aβ oder APP eingeführt ist, wie es für die P2- und P30-Epitope in 1 schematisch gezeigt wird, b) einer Nucleinsäuresequenz, die für wenigstens ein in a) definiertes Analogon codiert und c) einem nicht-pathogenen Mikroorganismus oder Virus, der/das das in b) definierte Nucleinsäurefragment trägt, zur Herstellung eines Medikaments, das das Agens enthält, zur Behandlung und/oder Prävention und/oder Verbesserung der Alzheimer-Krankheit oder anderer Krankheiten und Zustände, die durch Aβ-Ablagerungen in dem Tier gekennzeichnet sind.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Einführung als ein Resultat hat, dass eine wesentliche Fraktion von B-Zell-Epitopen von Aβ oder APP konserviert wird und dass – wenigstens eine erste Gruppierung eingeführt ist, die ein Targeting des Analogons auf eine Antigen-präsentierende Zelle (APC) oder einen B-Lymphozyten bewirkt und/oder – wenigstens eine zweite Gruppierung eingeführt ist, die das Immunsystem stimuliert, und/oder – wenigstens eine dritte Gruppierung eingeführt ist, die eine Präsentation des Analogons gegenüber dem Immunsystem optimiert.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Analogon durch Einführung der ersten und/oder der zweiten und/oder der dritten Gruppierung als Seitengruppen, durch kovalente oder nicht-kovalente Bindung an geeignete chemische Gruppen im Aβ, APP oder einer Untersequenz davon modifiziert ist.
  4. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Analogon eine Verdoppelung wenigstens eines B-Zell-Epitops von Aβ oder APP und/oder eine Einführung eines Haptens umfasst.
  5. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das fremde T-Zell-Epitop in dem Tier immundominant ist.
  6. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das fremde T-Zell-Epitop promiskutiv ist, zum Beispiel ein fremdes T-Zell-Epitop ist, das aus einem natürlichen promiskutiven T-Zell-Epitop und einer künstlichen MHC-II-Bindungspeptidsequenz ausgewählt ist.
  7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei das natürliche T-Zell-Epitop aus einem Tetanus-Toxoid-Epitop, zum Beispiel P2 oder P30, einem Diphterie-Toxoid-Epitop, einem Influenza-Virus-Hämagglutinin-Epitop und einem P.-falciparum-CS-Epitop ausgewählt ist.
  8. Verwendung nach einem der Ansprüche 2-7, wobei die erste Gruppierung ein im Wesentlichen spezifischer Bindungspartner für ein B-Lymphozyt-spezifisches Oberflächenantigen oder für ein APC-spezifisches Oberflächenantigen, zum Beispiel ein Hapten oder ein Kohlenhydrat, für das es einen Rezeptor an dem B-Lymphozyt oder der APC gibt, ist.
  9. Verwendung nach einem der Ansprüche 2-8, wobei die zweite Gruppierung aus einem Cytokin, zum Beispiel Interferon-γ (IFN-γ) oder einem wirksamen Teil davon, Flt3L oder einem wirksamen Teil davon, Interleukin 1 (IL-1) oder einem wirksamen Teil davon, Interleukin 2 (IL-2) oder einem wirksamen Teil davon, Interleukin 4 (IL-4) oder einem wirksamen Teil davon, Interleukin 6 (IL-6) oder einem wirksamen Teil davon, Interleukin 12 (IL-12) oder einem wirksamen Teil davon, Interleukin 13 (IL-13) oder einem wirksamen Teil davon, Interleukin 15 (IL-15) oder einem wirksamen Teil davon und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) oder einem wirksamen Teil davon; einem Hormon und einem Hitzeschockprotein, zum Beispiel HSP70 oder einem wirksamen Teil davon, HSP90 oder einem wirksamen Teil davon, HSC70 oder einem wirksamen Teil davon, GRP94 oder einem wirksamen Teil davon und Calreticulin (CRT) oder einem wirksamen Teil davon ausgewählt ist.
  10. Verwendung nach einem der Ansprüche 2-9, wobei die dritte Gruppierung Lipidnatur hat, zum Beispiel eine Palmitoylgruppe, eine Myristylgruppe, eine Farnesylgruppe, eine Geranyl-Geranyl-Gruppe, ein GPI-Anker und eine N-Acyldiglycerid gruppe, oder wobei die dritte Gruppierung ein Polyhydroxypolymer, zum Beispiel ein Polysaccharid, ist.
  11. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das autologe Aβ oder APP so modifiziert wurde, dass es B-Zell-Epitope konserviert, die nicht der extrazellulären Phase ausgesetzt waren, wenn sie in zellgebundener Form des autologen APP vorliegen.
  12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Aβ oder das APP so modifiziert wurde, dass ihm wenigstens ein B-Zell-Epitop fehlt, das der extrazellulären Phase ausgesetzt ist, wenn es in zellgebundener Form des autologen APP vorliegt.
  13. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die ein Substitution wenigstens einer Aminosäuresequenz innerhalb des autologen Aβ oder APP durch eine Aminosäuresequenz gleicher oder unterschiedlicher Länge, die zu einem fremden TH-Epitop in dem Analogon führt, umfasst.
  14. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Analogon die Aminosäuresequenz umfasst, die den Aminosäuren 672-714 in SEQ ID NO:2 entspricht, worin eine Aminosäuresequenz insertiert ist, die zu einem fremden TH-Epitop in dem Analogon führt, oder wobei das Analogon eine Aminosäuresequenz umfasst, die den Aminosäuren 672-714 von SEQ ID NO:2 entspricht, worin wenigstens eine Aminosäuresequenz durch eine Aminosäuresequenz gleicher oder unterschiedlicher Länge substituiert ist, so dass ein fremdes TH-Epitop gebildet wird.
  15. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei wenigstens zwei Kopien des Analogons kovalent oder nicht-kovalent an ein Trägermolekül, das zur Durchführung einer Präsentation von mehreren Kopien antigener Determinanten fähig ist, gebunden sind.
  16. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Analogon mit einem Adjuvans formuliert wurde, das den Abbau von Autotoleranz gegenüber Autoantigenen erleichtert.
  17. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine wirksame Menge des Analogons dem Tier über einen Weg verabreicht wird, der aus dem parenteralen Weg, zum Beispiel intrakutaner, subkutaner und intramuskulärer Weg; dem peritonealen Weg; dem oralen Weg; dem bukkalen Weg; dem sublingualen Weg; dem epiduralen Weg; dem spinalen Weg; dem analen Weg und dem intrakranialen Weg ausgewählt ist.
  18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei die wirksame Menge zwischen 0,5 μg und 2000 μg des Analogons liegt.
  19. Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, wobei das Analogon in einer virtual lymph node (VLN)-Vorrichtung enthalten ist.
  20. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-14, wobei die Herabregulierung Einführen von Nucleinsäure(n), die für das Analogon codiert/codieren, in die Zellen des Tiers und dadurch Erhalt einer in-vivo-Expression der eingeführten Nucleinsäure(n) durch die Zellen umfasst.
  21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei die eingeführte(n) Nucleinsäure(n) aus nackter DNA, DNA, die mit geladenen oder ungeladenen Lipiden formuliert ist, DNA, die in Liposomen formuliert ist, DNA, die in einem viralen Vektor enthalten ist, DNA, die mit einem Transfektion erleichternden Protein oder Polypeptid formuliert ist, DNA, die mit einem Targeting-Protein oder -Polypeptid formuliert ist, DNA, die mit Kalziumpräzipitierungsmitteln formuliert ist, DNA, die an ein inertes Trägermolekül gebunden ist, DNA, die in Chitin oder Chitosan eingekapselt ist, und DNA, die mit einem Adjuvans formuliert ist, ausgewählt ist/sind.
  22. Verwendung nach Anspruch 21, wobei die Nucleinsäure(n) in einer VLN-Vorrichtung enthalten ist/sind.
  23. Verwendung nach einem der Ansprüche 18-22, die wenigstens eine Verabreichung/Einführung pro Jahr, zum Beispiel wenigstens 2, wenigstens 3, wenigstens 4, wenigstens 6 und wenigstens 12 Verabereichungen/Einführungen, umfasst.
  24. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-14, wobei die Behandlung, Prävention oder Verbesserung eine Verabreichung eines nicht-pathogenen Mikroorganismus oder Virus, der/das ein Nucleinsäurefragment trägt, das für das Analogon codiert und es exprimiert, umfasst.
  25. Analogon eines amyloidogenen Polypeptids, das von einem autologen Aβ (β-Amyloid) oder APP (Amyloidvorläuferprotein) abgeleitet ist, worin wenigstens ein isoliertes fremdes TH (T-Helfer)-Epitop eingeführt ist, wie es in 1 für die P2- und P30-Epitope schematisch dargestellt ist, so dass eine Immunisierung des Tiers mit dem Analogon die Produktion von Antikörpern gegen das amyloidogene Polypeptid induziert.
  26. Analogon nach Anspruch 24, wobei die Modifikation in einem der Ansprüche 2-14 definiert ist.
  27. Immunogene Zusammensetzung, die eine immunogenwirksame Menge eines Analogons nach Anspruch 24 oder 25 umfasst, wobei die Zusammensetzung außerdem einen pharmazeutisch und immunologisch akzeptablen Träger und/oder ein pharmazeutisch und immunologisch akzeptables Vehikel und gegebenenfalls ein Adjuvans umfasst.
  28. Nucleinsäurefragment, das für ein Analogon nach Anspruch 24 oder 25 codiert.
  29. Vektor, der das Nucleinsäurefragment nach Anspruch 27 trägt, zum Beispiel ein Vektor, der zur autonomen Replikation fähig ist.
  30. Vektor nach Anspruch 28, der aus der Gruppe, bestehend aus einem Plasmid, einem Phagen, einem Cosmid, einem Minichromosom und einem Virus ausgewählt ist.
  31. Vektor nach Anspruch 28 oder 29, umfassend in 5'→3'-Richtung und in funktioneller Verknüpfung einen Promotor zur Steuerung der Expression des Nucleinsäurefragments nach Anspruch 27, gegebenenfalls eine Nucleinsäuresequenz, die für ein Leaderpeptid codiert, das eine Sekretion oder Integration in die Membran des Polypeptidfragments ermöglicht, das Nucleinsäurefragment nach Anspruch 27 und gegebenenfalls einen Terminator.
  32. Vektor nach einem der Ansprüche 28-30, der, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird, zur Integration in das Wirtszellgenom fähig ist oder unfähig ist.
  33. Vektor nach Anspruch 30 oder 31, wobei ein Promotor eine Expression in einer eukaryotischen Zelle und/oder in einer prokaryotischen Zelle steuert.
  34. Transformierte Zelle, die den Vektor nach einem der Ansprüche 28-32 trägt, zum Beispiel eine transformierte Zelle, die fähig ist, das Nucleinsäurefragment nach Anspruch 27 zu replizieren.
  35. Transformierte Zelle nach Anspruch 33, die ein Mikroorganismus, ausgewählt aus einem Bakterium, einer Hefe, einem Protozoon, oder eine Zelle, die aus einem vielzelligen Organismus stammt, ausgewählt aus einem Fungus, eine Insektenzelle, zum Beispiel eine S2- oder SF-Zelle, eine Pflanzenzelle und eine Säugerzelle, ist.
  36. Transformierte Zelle nach Anspruch 33 oder 34, die das Nucleinsäurefragment nach Anspruch 27 exprimiert, zum Beispiel eine transformierte Zelle, die das Analogon nach Anspruch 25 oder 26 sezerniert oder an ihrer Oberfläche trägt.
  37. Zusammensetzung zum Induzieren der Produktion von Antikörpern gegen Aβ oder APP in einem Tier, wobei diese Proteine autolog sind, wobei die Zusammensetzung umfasst: – ein Nucleinsäurefragment nach Anspruch 27 oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 28-32 und – einen pharmazeutisch und immunologisch akzeptablen Träger und/oder ein pharmazeutisch und immunologisch akzeptables Vehikel und/oder ein pharmazeutisch und immunologisch akzeptables Adjuvans.
  38. Stabile Zelllinie, die den Vektor nach einem der Ansprüche 28-32 trägt und die das Nucleinsäurefragment nach Anspruch 27 exprimiert und die gegebenenfalls das Analogon gemäß Anspruch 24 oder 25 sezerniert oder an ihrer Oberfläche trägt.
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