JP2005245361A - てんかんモデル動物（ｃｈｒｎａ４：ｓ２８４ｌ） - Google Patents

Abstract

【課題】ヒト染色体優性夜間前頭葉てんかんと相同の遺伝子異常を有し、かつヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんと同様の症状（睡眠中のてんかん発作）を有するてんかんモデル動物を提供する。
【解決手段】ヒトCHRNA4遺伝子の第284位SerがLeuに置換したヒト変異型CHRNA4に相当する非ヒト変異型CHRNA4をコードするポリヌクレオチドを導入した全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物またはその子孫動物であって、体細胞染色体中に上記ポリヌクレオチドを保有し、睡眠中にてんかん発作を自然発症するてんかんモデル動物（CHRNA4：S284L）。
【選択図】なし

Description

この出願の発明は、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんと相同の遺伝子異常を有し、睡眠中にてんかん発作を自然発症するてんかんモデル動物に関するものである。

てんかんは、脳細胞の過剰な発射が原因となる反復発作によって特徴づけられる慢性的な脳疾患である。脳細胞の過剰な発射は様々な病因の結果であり、それ故に発作の進行や予後もてんかんの種類によって大きく異なる。従って、てんかんの治療にあたっては、正確な診断と適切な処置が求められている。

てんかんの診断法や処理方法の開発、発展のための手段として「てんかんモデル動物」が使用されている。従来、てんかんモデル動物としては、カイニン酸（kainic acid）の投与による薬物誘導てんかん動物やキンドリング（閾値以下の電気脳刺激を繰り返す方法）誘導てんかん動物が使用されてきた。

しかしながら、これら従来のモデル動物は、強制的にけいれん発作を誘導させた動物に過ぎず、「けいれん発作」のモデル動物とはなり得たが、ヒトてんかんの真のモデル動物とはなり得なかった。

一方、近年の分子生物学的研究の進展によって、幾つかのてんかん病型で遺伝子異常が同定され初めている。この出願の発明者らも、ヒト染色体優性夜間前頭葉てんかんがニューロンニコチン性アセチルコリン受容体α4サブユニット（CHRNA4）遺伝子の変異に関係すること（非特許文献１）、そしてCHRNA4遺伝子の変異が具体的には第284位SerがLeuに置換することであることを見出している（非特許文献２）。
Hirose, S. et al., Neurology 53:1749-1753, 1999. Matsushima, N. et al., Epilepsy Res. 48:181-186, 2002

この出願の発明は、前記のとおりの従来のてんかんモデル動物の問題点に鑑みてなされたものであり、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんと相同の遺伝子異常（変異型CHRNA4の発現）を有し、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんと同一の身体症状（睡眠中のてんかん発作）を自然発症する新しいてんかんモデル動物を提供することを課題としている。

この出願は、前記の課題を解決するための発明として、配列番号１の第284位SerがLeuに置換したヒト変異型CHRNA4に相当する非ヒト変異型CHRNA4をコードするポリヌクレオチドを導入した全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物またはその子孫動物であって、体細胞染色体中に上記ポリヌクレオチドを保有し、睡眠中にてんかん発作を自然発症することを特徴とするてんかんモデル動物（CHRNA4：S284L）を提供する。

またこのてんかんモデル動物（CHRNA4：S284L）においては、非ヒト変異型CHRNA4をコードするポリヌクレオチドが、脳皮質・海馬特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域に相当するポリヌクレオチドとの融合ポリヌクレオチドであることを好ましい態様としている。

さらにこの発明のてんかんモデル動物（CHRNA4：S284L）においては、非ヒト動物がラットであり、ラット変異型CHRNA4をコードするポリヌクレオチドが、配列番号２の第865位cがt、第866位tがcに置換したヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであることを好ましい態様としている。

なお、この発明において「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ-N-グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ヌクレオチドATP、GTP、CTP、UTP；またはdATP、dGTP、dCTP、dTTP）が複数個結合した分子を言う。

また「ヒト変異型CHRNA4に相当する非ヒト変異型CHRNA4」とは、ヒトCHRNA4（配列番号２）の第284位Serに相当する非ヒトCHRNA4のSerがLeuに置換していることを意味する。

この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。

この発明のてんかんモデル動物（CHRNA4：S284L）は、あらゆる種類の非ヒト哺乳動物を対象として作出することができる。例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、ウシ等を対象として作出することができるが、実験動物としての汎用性や利便性を考慮してマウス、ラット等の使用が好ましい。

導入する「非ヒト変異型CHRNA4をコードするポリヌクレオチド」としては、対象とする動物種に対応した変異型CHRNA4ポリヌクレオチドを使用する。例えば、マウスCHRNA4のアミノ酸配列（配列番号５）とこれをコードするポリヌクレオチド（cDNA）配列（配列番号４）は公知（GenBank/NM-015730）であり、配列番号５の第286位SerがヒトCHRNA4の第284位Serに相当する。従って、「マウス変異型CHRNA4をコードするポリヌクレオチド」は、配列番号４における第960−962位のSerコドン（tct）をLeuコドン（ctt、ctc、cta、ctg、ttaまたはttg）に置換することによって作成することができる。また、ラットCHRNA4のアミノ酸配列（配列番号３）とこれをコードするポリヌクレオチド（cDNA）配列（配列番号２）は公知（GenBank/NM-024354）であり、配列番号３の第286位SerがヒトCHRNA4の第284位Serに相当する。従って、「ラット変異型CHRNA4をコードするポリヌクレオチド」は、配列番号２における第865−867位のSerコドン（tct）をLeuコドン（ctt、ctc、cta、ctg、ttaまたはttg）に置換することによって作成することができる。ヌクレオチドの置換は、市販の変異導入キットを用いる方法や、変異導入型PCR法等の公知の方法で行うことができる。

この非ヒト変異型CHRNA4をコードするポリヌクレオチドはまた、脳皮質・海馬特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域に相当するポリヌクレオチドとの融合ポリヌクレオチドとして導入することも好まし。このようなプロモーター領域としては、例えばPDGF-β鎖プロモーター等を使用することができる。

この発明のてんかんモデル動物（CHRNA4：S284L）は、公知のトランスジェニック動物作成法（例えば、Proc. Natl. Acad. Scl. USA 77;7380-7384, 1980）に従って作成することができる。すなわち、前記のポリヌクレオチド（好ましくは融合ポリヌクレオチド）を非ヒト動物の分化全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入ポリヌクレオチドが組み込まれた個体を選別することによって目的とするトランスジェニック動物を作製することができる。

ポリヌクレオチドを導入する分化全能性細胞としては、受精卵や初期胚を用いることができる。また培養細胞への遺伝子導入法としては、トランスジェニック動物個体の産出高率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、DNAの物理的注入（マイクロインジェクション）法が最適である。遺伝子を注入した受精卵は、次に仮親の卵管に移植され、個体まで発生し出生した動物を里親につけて飼育させたのち、体の一部（尾部先端等）からDNAを抽出し、サザン解析やPCR法により導入したポリヌクレオチドの存在を確認する。導入ポリヌクレオチドの存在が確認された個体（ヘテロ接合体）を初代（Founder：F0）とすれば、導入遺伝子はその子（F1）の50%に伝達される。さらに、このF1個体の雌雄を交配させることにより、２倍体染色体の両方に導入遺伝子を有する個体（F2）を作出することができる。

なお、外来遺伝子を動物個体の染色体DNAに導入する方法としては、公知の標的遺伝子組換え法（ジーンターゲティング法：Science 244:1288-1292, 1989）を用いたノックイン（Knock In）法が知られている。このノックイン法では、動物個体の染色体DNAに存在する内在性遺伝子が外来性遺伝子に完全に置換される。従って、このノックイン法で作出された遺伝子導入動物は、内在性タンパク質は産生せず、この内在性タンパク質に相同な外来性（変異型）タンパク質のみを産生する。一方、この発明のてんかんモデル動物の作出に用いたトランスジェニック方法は、内在性遺伝子（CHRNA4遺伝子）は正常のままの状態で、新たにその染色体DNAの任意の位置に変異型CHRNA4をコードするポリヌクレオチドを導入する。このため、この発明のてんかんモデル動物では、正常なCHRNA4と変異型CHRNA4が共に産生されている。ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体はイオンチャンネル（αサブユニット2個、βサブユニット3個）として機能するタンパク質であるが、このようなイオンチャンネルはいずれかのサブユニットが変異していればチャンネル機能が変更する。従って、正常サブユニットと変異サブユニットが同時に発現してもよく、この出願の発明者らは、ノックイン法のように変異サブユニットを発現させるよりも、正常サブユニットと変異サブユニットを同時に発現さえることがヒト型てんかん発作を呈するモデル動物として適切であるとのコンセプトに基づき、この出願の発明を完成させた。

この発明のてんかんモデル動物（CHRNA4：S284L）は、後記の実施例に示すように、ヒト染色体優性夜間前頭葉てんかんと同様に、睡眠中にてんかん発作を自然発症するという優れた特性を有している。

以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。

（1）方法
（1-1）トランスジェニックラットの作成
ラットChrna4およびChrnb2のcDNAは、ラット胎児cDNAパネル(Clontech, Palo Alto, CA)からPCR増幅し、pCRTOPOIIベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)にサブクローニングした。ヒト夜間前頭葉てんかんと相同のミスセンス変位を生じさせるヌクレオチド置換(配列番号２の第865位C→>T、第866位T→C; S286L)をQuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA)を用いてChrna4 cDNAに導入した。野性型Chrana4とChrnb2のcDNA、および変異型Chrna4 cDNAをpSP64 Poly(A)ベクター(Promega, Madison, WI)に導入して対応するcRNAsを作成し、アフリカツメガエル卵母細胞を用いたin vitro電気生理学的研究に使用した。変異型Chrna4 cDNAは、pCI-neoベクター(Promega)のヒトPDGF-β鎖プロモーターを保有する発現ベクターに挿入した。各クローニングステップ毎に、一連のシークエンシングプライマーを用いた複数回のシークエンシングによってクローンの完全性を確認した。変異型Chrna4 cDNA を保有するベクターをSna BI and Nae Iで開裂し、変異型cDNAとPDGF-βプロモーターを含む直鎖状断片を精製した。この断片を、Japan SLC, Inc社（浜松市）においてラット卵母細胞（SD）に注入し、トランスジェニックラットを作出した。
（1-2）トランスジェニックラットの遺伝子型の確認
トランスジェニックラットの尾部切断組織を、緩衝液［50 mM Tris (pH 8), 10 mM EDTA, 100 mM sodium chloride, 1% (w/v) SDS, and 50 mg/ml proteinase K (Sigma)］中で55℃で一晩消化した。RNase A 処理 (100 μg/ml、37°Cで1時間)の後、酢酸アンモニウムを終濃度2 Mとなるように加え、冷却し、遠心してタンパク質を沈殿させた。上清中のDNAを0.6 volの冷イソプロパノールで沈殿させ70%エタノールで洗浄した。DNAペレットを4℃で一晩水に溶解した。DNA量は260 nmの吸光度で評価し、そのDNAの一部(50ng)をPCR増幅した。PCR産物は、自動配列決定装置(ABI 3100：Perkin Elmer Biosystems, Foster City, CA)によってシークエンシングした。

その結果、作出されたトランスジェニックラットは、導入した変異型Chrna4 cDNAを体細胞染色体に保有することが確認された。
（1-3）トランスジェニックラットの脳波（EEG）測定
8−10週齢のトランスジェニックラットに対して脳波(EEG)を測定した。ハロタン（halothane）麻酔（ハロタンとO₂の1.5%混合物とN₂O）の後、ラットを脳固定装置に固定し、脳波測定用のテフロン（登録商標）被覆ステンレス電極を左右大脳半球の前頭葉（ブレグマよりA = 3.2 mm、L = 0.8 mm）に装着し、歯科用セメントで固定した。不関電極は、小脳部位の上部に埋め込んだ。脳波は、0.1 ± 3 kHz 帯域に設定したテレメーター(Unimec Co., Tokyo, Japan)を用いて、電極装着の7日後から自由運動条件下で測定した。脳波分析は、Chart for windows(Adinstruments, Sydney, Australlia)も用いて行った。

結果は図１に示したとおりである。軽睡眠期特有の紡錘波の後に、てんかん発作に特徴的な棘波群発（図1中段）が十数秒持続した後に、極徐波複合に移行し、次第にその周波数が減少・振幅が増大（図1下段）し、てんかん発作は部分発作から二次性全般化発作に移行した。

以上のとおり、作出されたトランスジェニックラットは、変異型CHRNA4を発現し、睡眠中にてんかん発作を生じさせた。この変異型CHRNA4の発現という遺伝子型と、睡眠中のてんかん発作という身体症状から、このトランスジェニックラットがヒト染色体優性夜間前頭葉てんかんのモデル動物として適格であることが確認された。

以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、ヒト染色体優性夜間前頭葉てんかんと相同の遺伝子異常を有し、かつヒト染色体優性夜間前頭葉てんかんと同様の症状（睡眠中のてんかん発作）を有する動物が提供される。このてんかんモデル動物は、ヒト染色体優性夜間前頭葉てんかんの診断法の開発や、その治療法の開発等に極めて有用である。

この発明のてんかんモデル動物の睡眠中の脳波記録である。上段は60秒間の記録であり、中段は棘波群発の記録（15秒間）、下段は棘波群発が極徐波複合に移行し、次第にその周波数が減少・振幅が増大したことを示す記録（15秒間）である。

Claims (3)

1. 配列番号１の第284位SerがLeuに置換したヒト変異型CHRNA4に相当する非ヒト変異型CHRNA4をコードするポリヌクレオチドを導入した全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物またはその子孫動物であって、体細胞染色体中に上記ポリヌクレオチドを保有し、睡眠中にてんかん発作を自然発症することを特徴とするてんかんモデル動物（CHRNA4：S284L）。
2. 非ヒト変異型CHRNA4をコードするポリヌクレオチドが、脳皮質・海馬特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域に相当するポリヌクレオチドとの融合ポリヌクレオチドである請求項１のてんかんモデル動物（CHRNA4：S284L）。
3. 非ヒト動物がラットであり、ラット変異型CHRNA4をコードするポリヌクレオチドが、配列番号２の第865位cがt、第866位tがcに置換したヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである請求項１または２のてんかんモデル動物（CHRNA4：S284L）。