WO2005084428A1

WO2005084428A1 - てんかんモデル動物(ｃｈｒｎａ４:ｓ２８４ｌ)

Info

Publication number: WO2005084428A1
Application number: PCT/JP2005/003430
Authority: WO
Inventors: Shinichi Hirose; Sunao Kaneko; Motohiro Okada; Ryo Saito
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2004-03-05
Filing date: 2005-02-23
Publication date: 2005-09-15
Also published as: JP2005245361A; US20080148417A1; US8173859B2

Abstract

配列番号1の第284位SerがLeuに置換したヒト変異型CHRNA4に相当する非ヒト変異型CHRNA4をコードするポリヌクレオチドを導入した全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物またはその子孫動物であって、体細胞染色体中に上記ポリヌクレオチドを保有するてんかんモデル動物(CHRNA4:S284L)。ヒト染色体優性夜間前頭葉てんかんと相同の遺伝子異常を有し、かつヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんと同様の症状(睡眠中のてんかん発作)を有する。

Description

明細書

てんかんモデル動物（CHRNA4： S2&4L)

技術分野この出願の発明は、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんと相同の遺伝子異常を有し、睡眠中にてんかん発作を自然発症するてんかんモデル動物に関するものである。

背景技術てんかんは、脳細胞の過剰な発射が原因となる反復発作によって特徴づけられる慢性的な脳疾患である。脳細胞の過剰な発射は様々な病因の結果であり、それ故に発作の進行や予後もてんかんの種類によって大きく異なる。従って、てんかんの治療にあたっては、正確な診断と適切な処置が求められている。てんかんの診断法や処理方法の開発、発展のための手段として「てんかんモデル動物」が使用されている。従来、てんかんモデル動物としては、カイニン酸 (kainic acid) の投与による薬物誘導てんかん動物やキンドリング（閾値以下の電気脳刺激を繰り返す方法）誘導てんかん動物が使用されてきた。しかしながら、これら従来のモデル動物は、強制的にけいれん発作を誘導させた動物に過ぎず、「けいれん発作」のモデル動物とはなり得たが、ヒトてんかんの真のモデル動物とはなり得なかった。一方、近年の分子生物学的研究の進展によって、幾つかのてんかん病型で遺伝子異常が同定され初めている。この出願の発明者らも、ヒト染色体優性夜間前頭葉てんかんがニューロンニコチン性アセチルコリン受容体 α4 サブユニット ( CHRNA4) 遺伝子の変異に関係すること（非特許文献 1 ) 、そして CHRNA4 遺伝子の変異が具体的には第 284位 Serが Leuに置換することであることを見出している（非特許文献 2 ) 。非特許文献 1 ： Hirose, S. et al.， Neurology 53: 1749- 1753, 1999.

非特許文献 2： Matsushima, N. et al.， Epilepsy Res. 48: 181- 186， 2002

発明の開示この出願の発明は、前記のとおりの従来のてんかんモデル動物の問題点に鑑みてなされたものであり、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんと相同の遺伝子異常（変異型 CHRNA4の発現）を有し、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんと同一の身体症状（睡眠中のてんかん発作）を自然発症する新しいてんかんモデル動物を提供することを課題としている。この出願は、前記の課題を解決するための発明として、配列番号 1の第 284 位 Serが Leuに置換したヒト変異型 CHRNA4に相当する非ヒト変異型 CHRNA4をコードするポリヌクレオチドを導入した全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物またはその子孫動物であって、体細胞染色体中に上記ポリヌクレオチドを保有し、睡眠中にてんかん発作を自然発症することを特徴とするてんかんモデル動物（CHRNA4： S284L) を提供する。またこのてんかんモデル動物（CHRNA4： S284L) においては、非ヒト変異型 CHRNA4 をコードするポリヌクレオチドが、脳皮質 ·海馬特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域に相当するポリヌクレオチドとの融合ポリヌクレオチドであることを好ましい態様としている。さらにこの発明のてんかんモデル動物（CHRNA4： S284L) においては、非ヒト動物がラットであり、ラット変異型 CHRNA4をコードするポリヌクレオチドが、配列番号 2の第 865位 cが t、第 866位 tが cに置換したヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであることを好ましい態様としている。なお、この発明において「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖に β-Ν-グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ヌクレオチド ATP、 GTP、 CTP、 UTP；または dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP) 力複数個結合した分子を言う。また「ヒト変異型 CHRNA4 に相当する非ヒト変異型 CHRNA4」とは、ヒト CHRNA4 (配列番号 2 ) の第 284位 Ser に相当する非ヒト CHRNA4 の Ser が Leuに置換していることを意味する。この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術は Sambrook and Maniatis, m Molecular Clonmg-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al.， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。

図面の簡単な説明図 1 は、この発明のてんかんモデル動物の睡眠中の脳波記録である。上段は 60 秒間の記録であり、中段は棘波群発の記録（15 秒間）、下段は棘波群発が極徐波複合に移行し、次第にその周波数が減少 '振幅が増大したことを示す記録（15 秒間）である。発明を実施するための最良の形態この発明のてんかんモデル動物（CHRNA4： S284L) は、あらゆる種類の非ヒト哺乳動物を対象として作出することができる。例えば、マウス、ラット、ゥサギ、ネコ、ィヌ、ブ夕、ゥマ、ゥシ等を対象として作出することができるが、実験動物としての汎用性や利便性を考慮してマウス、ラット等の使用が好ましい。導入する「非ヒト変異型 CHRNA4をコ一ドするポリヌクレオチド」としては、対象とする動物種に対応した変異型 CHRNA4ポリヌクレオチドを使用する。例えば、マウス CHRNA4のアミノ酸配列（配列番号 5 ) とこれをコードするポリヌクレオチド（cDNA) 配列（配列番号 4 ) は公知（GenBank/NM-015730) であり、配列番号 5の第 286位 Serがヒト CHRNA4の第 284位 Serに相当する。従って、「マウス変異型 CHRNA4をコードするポリヌクレオチド」は、配列番号 4における第 960— 962位の Ser コドン（tct) を Leu コドン（ctt、 ctc、 cta、 ctg、 tta または ttg) に置換することによって作成することができる。また、ラット CHRNA4 のアミノ酸配列（配列番号 3 ) とこれをコードするポリヌクレオチド (cDNA) 配列（配列番号 2 ) は公知（GenBank/NM-024354) であり、配列番号 3の第 286位 Serがヒト CHRNA4の第 284位 Serに相当する。従って、「ラット変異型 CHRNA4をコードするポリヌクレオチド」は、配列番号 2における第 865 - 867位の Ser コドン（tct) を Leu コドン（ctt、 etc；、 cta、 ctg、 tta または ttg) に置換することによって作成することができる。ヌクレオチドの置換は、市販の変異導入キッ卜を用いる方法や、変異導入型 PCR法等の公知の方法で行うことができる。この非ヒト変異型 CHRNA4をコードするポリヌクレオチドはまた、脳皮質 ·海馬特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域に相当するポリヌクレオチドとの融合ポリヌクレオチドとして導入することも好まし。このようなプロモー夕一領域としては、例えば PDGF-β鎖プロモー夕一等を使用することができる。この発明のてんかんモデル動物（CHRNA4： S284L) は、公知のトランスジェニック動物作成法（例えば、 Proc. Natl. Acad. Scl. USA 77;7380-7384, 1980) に従って作成することができる。すなわち、前記のポリヌクレオチド（好ましくは融合ポリヌクレオチド）を非ヒト動物の分化全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入ポリヌクレオチドが組み込まれた個体を選別することによって目的とするトランスジエニック動物を作製することができる。ポリヌクレオチドを導入する分化全能性細胞としては、受精卵や初期胚を用いることができる。また培養細胞への遺伝子導入法としては、トランスジエニック動物個体の産出高率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、 DNA の物理的注入（マイクロインジェクション）法が最適である。遺伝子を注入した受精卵は、次に仮親の卵管に移植され、個体まで発生し出生した動物を里親につけて飼育させたのち、体の一部（尾部先端等）から DNA を抽出し、サザン解析や PCR 法により導入したポリヌクレオチドの存在を確認する。導入ポリヌクレオチドの存在が確認された個体（ヘテロ接合体）を初代（Founder： F0) とすれば、導入遺伝子はその子（F1 ) の 50%に伝達される。さらに、この F1 個体の雌雄を交配させることにより、 2倍体染色体の両方に導入遺伝子を有する個体（F2) を作出することができる。なお、外来遺伝子を動物個体の染色体 DNAに導入する方法としては、公知の標的遺伝子組換え法（ジーン夕一ゲティング法： Science 244: 1288- 1292, 1989) を用いたノックイン（Knock In) 法が知られている。このノックイン法では、動物個体の染色体 DNAに存在する内在性遺伝子が外来性遺伝子に完全に置換される。従って、このノックイン法で作出された遺伝子導入動物は、内在性タンパク質は産生せず、この内在性タンパク質に相同な外来性（変異型）タンパク質のみを産生する。一方、この発明のてんかんモデル動物の作出に用いた卜ランスジェニック方法は、内在性遺伝子（CHRNA4 遺伝子）は正常のままの状態で、新たにその染色体 DNAの任意の位置に変異型 CHRNA4 をコードするポリヌクレオチドを導入する。このため、この発明のてんかんモデル動物では、正常な CHRNA4 と変異型 CHRNA4が共に産生されている。ニューロンニコチン性ァセチルコリン受容体はイオンチャンネル（αサブュニッ卜 2個、 βサブュニット 3個）として機能するタンパク質であるが、このようなイオンチヤンネルはいずれかのサブュニッ卜が変異していればチャンネル機能が変更する。従って、正常サブユニットと変異サブユニットが同時に発現してもよく、この出願の発明者らは、ノックイン法のように変異サブュニットを発現させるよりも、正常サブュニットと変異サブュニッ卜を同時に発現さえることがヒ卜型てんかん発作を呈するモデル動物として適切であるとのコンセプトに基づき、この出願の発明を完成させた。この発明のてんかんモデル動物（CHRNA4： S284L) は、後記の実施例に示すように、ヒト染色体優性夜間前頭葉てんかんと同様に、睡眠中にてんかん発作を自然発症するという優れた特性を有している。

実施例以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。

( 1) 方法

( 1- 1) トランスジエニックラットの作成

ラット Chrna4 および Chrnb2 の cDNA は、ラット胎児 cDNA パネル ( Clontech, Palo Alto, CA ) 力、ら PCR 増幅し、 pCRTOPOII ベクター (Invitrogen, Carlsbad, CA) にサブクロ一ニングした。ヒト夜間前頭葉てんかんと相同のミスセンス変位を生じさせるヌクレオチド置換（配列番号 2の第 865 位 C→T、第 866 位 T→C; S286L ) を QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) を用いて Chrna4 cDNAに導入した。野性型 Chrana4 と Chrnb2 の cDNA、および変異型 Chrna4 cDNA を pSP64 Poly(A)ベクタ一（Promega, Madison, Wl) に導入して対応する cRNAs を作成し、アフリカッメガエル卵母細胞を用いた in vitro 電気生理学的研究に使用した。変異型 Chrna4 cDNAは、 pCI-neoベクター（Promega) のヒト PDGF- β 鎖プロモーターを保有する発現ベクターに挿入した。各クローニングステップ毎に、一連のシ一クェンシングプライマーを用いた複数回のシークェンシングによってクローンの完全性を確認した。変異型 Chrna4 cDNA を保有するベクターを Sna BI and Nae Iで開裂し、変異型 cDNAと PDGF-βプロモーターを含む直鎖状断片を精製した。この断片を、 Japan SLC， Inc社（浜松市）においてラット卵母細胞（SD) に注入し、トランスジエニックラットを作出した。

( 1-2) トランスジエニックラットの遺伝子型の確認

トランスジエニックラットの尾部切断組織を、緩衝液 [50 mM Tris (pH 8)， 10 mM EDTA， 100 mM sodium chloride, 1% (w/v) SDS, and 50 mg/ml proteinase K (Sigma)] 中で 55" で一晚消化した。 RNase A処理（100 pg/ml、 37°Cで 1時間）の後、酢酸アンモニゥムを終濃度 2 M となるように加え、冷却し、遠心してタンパク質を沈殿させた。上清中の DNAを 0.6 volの冷イソプロパノールで沈殿させ 70%エタノールで洗浄した。 DNAペレットを 4ででー晚水に溶解した。 DNA 量は 260 nm の吸光度で評価し、その DNA の一部（50ng) を PCR 増幅した。 PCR 産物は、自動配列決定装置（ABI 3100： Perkin Elmer Biosystems, Foster City, CA) によってシークェンシングした。

その結果、作出されたトランスジエニックラットは、導入した変異型 Chrna4 cDNAを体細胞染色体に保有することが確認された。

( 1-3) トランスジエニックラットの脳波（EEG) 測定

8— 10 週齢のトランスジエニックラットに対して脳波 (EEG)を測定した。ハロタン（halothane) 麻酔（ハロタンと 0₂の 1.5%混合物と N₂0) の後、ラットを脳固定装置に固定し、脳波測定用のテフロン（登録商標）被覆ステンレス電極を左右大脳半球の前頭葉（プレダマより A = 3.2 mm、 L = 0.8 mm) に装着し、歯科用セメントで固定した。不関電極は、小脳部位の上部に埋め込んだ。脳波は、 0. 1 ± 3 kHz 帯域に設定したテレメーター（Unimec Co., Tokyo, Japan) を用いて、電極装着の 7 日後から自由運動条件下で測定した。脳波分析は、 Chart for windows (Adinstruments, Sydney, Australia) も用レて仃つた。

結果は図 1に示したとおりである。軽睡眠期特有の紡錘波の後に、てんかん発作に特徴的な棘波群発（図 1 中段）が十数秒持続した後に、極徐波複合に移行し、次第にその周波数が減少 ·振幅が増大（図 1 下段）し、てんかん発作は部分発作から二次性全般化発作に移行した。以上のとおり、作出されたトランスジエニックラットは、変異型 CHRNA4を発現し、睡眠中にてんかん発作を生じさせた。この変異型 CHRNA4の発現という遺伝子型と、睡眠中のてんかん発作という身体症状から、このトランスジエニックラットがヒ卜染色体優性夜間前頭葉てんかんのモデル動物として適格であることが確認された。

産業上の利用可能性以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、ヒト染色体優性夜間前頭葉てんかんと相同の遺伝子異常を有し、かつヒト染色体優性夜間前頭葉てんかんと同様の症状（睡眠中のてんかん発作）を有する動物が提供される。このてんかんモデル動物は、ヒト染色体優性夜間前頭葉てんかんの診断法の開発や、その治療法の開発等に極めて有用である。

Claims

請求の範囲

1. 配列番号 1の第 284位 Serが Leuに置換したヒト変異型 CHRNA4に相当する非ヒ卜変異型 CHRNA4をコードするポリヌクレオチドを導入した全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物またはその子孫動物であって、体細胞染色体中に上記ポリヌクレオチドを保有し、睡眠中にてんかん発作を自然発症することを特徴とするてんかんモデル動物（CHRNA4 ·· S284L) 。

2. 非ヒト変異型 CHRNA4をコードするポリヌクレオチドが、脳皮質 ·海馬特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域に相当するポリヌクレオチドとの融合ポリヌクレオチドである請求項 1 のてんかんモデル動物（ CHRNA4 ： S284L) 。

3. 非ヒト動物がラットであり、ラット変異型 CHRNA4をコ一ドするポリヌクレオチドが、配列番号 2の第 865位 cが t、第 866位 tが cに置換したヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである請求項 1または 2のてんかんモデル動物 (CHRNA4： S284L) 。