CN117568404B - 多指（趾）相关的基因片段以及动物模型构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多指（趾）相关的基因片段以及动物模型构建方法及应用，属于动物模型领域。本发明动物模型构建方法为：多指（趾）及三指节拇指（趾）模型构建方法，它是使用基因编辑技术在目标动物的DUP基因组片段5’端敲入人源DUP基因组片段；所述人源DUP基因组片段为人源7号染色体：156,586,663‑156600609（hg19）。本发明成功构建得到多指（趾）和三趾节拇指（趾）的肢体发育异常模型，可以应用于肢体发育异常疾病研究，应用前景优良。
Description
技术领域
本发明属于动物模型领域，具体涉及多指（趾）相关的基因片段以及动物模型构建方法及应用。
背景技术
多指（趾）畸形是常见的遗传性肢体畸形，发病率高，出生活胎患儿并指发生率约为0.3-1/1,000，在家系间和家系内均存在表型差异，上肢较下肢更易受累。对多指（趾）畸形进行研究以提高临床诊断和治疗功效是极为重要的，构建相应的动物模型是多指（趾）畸形的研究非常关键的环节。
多趾小鼠模型是一种被广泛用于研究肢体发育及多指畸形机制的实验工具。这些模型中的小鼠表现出多趾或少趾的肢体畸形。多趾小鼠模型在研究多趾畸形的发病机制、候选药物的筛选以及潜在治疗方法的评估中起到关键作用。然而，现有技术报道的多趾小鼠模型仍然有一些限制：首先，人类多指疾病的遗传方式通常为常染色体显性遗传，然而，在现有的多指模型小鼠中，其遗传方式多为常染色体隐性遗传；第二，目前多指小鼠模型，多指常常与多器官异常的综合征同时出现，而单纯性多指的小鼠非常罕见。例如Pdn、XtH和XtJ小鼠是Greig 头多指并指综合征 (GCPS)的疾病模型，纯合时除出现轴前多指、胫骨等半肢畸形外，还伴有大脑、脊髓和感觉器官异常以及水肿，杂合时可无表型。Etv5基因的错义突变也会导致小鼠多指畸形，还伴随着不育、胚胎和围产期死亡增加、出生后生长受限、肾脏不对称等。Tbx2和Tbx3突变除指发育异常外，可导致心脏、骨盆和骨骼缺陷。这些限制使得目前的多趾小鼠模型与人类真实疾病差异性较大，不能满足作为动物模型参与后续机制研究的需要。
因此亟需提供一种呈常染色体显性遗传，不表现多器官异常的综合征，只表现为轴前多指的小鼠模型。
Lmbr1肢体发展膜蛋白1基因，基因登录号为human: 64327/ house mouse:56873，目前暂未有有关Lmbr1基因上ZRS侧翼序列与非综合征多指（趾）及三指节拇指（趾）相关的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多指（趾）相关的基因片段以及动物模型构建方法及应用，具体的多指（趾）指轴前多指（趾）及三指节拇指（趾）。
本发明提供了一种多指（趾）动物模型构建方法，它是使用基因编辑技术在目标动物的DUP基因组片段5’端敲入人源DUP基因组片段；所述人源DUP基因组片段为人源7号染色体：156,586,663-156600609。
进一步地，所述构建方法为：所述目标动物为大鼠、小鼠。
进一步地，所述动物为小鼠，小鼠DUP基因组片段为小鼠5号染色体：29317977-29332658。
进一步地，所述基因编辑技术为CRISPR-Cas9技术。
进一步地，所述CRISPR-Cas9技术中的gRNA靶序列的序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述敲入的位置位于目标动物5号染色体29317931-29317950之间。
进一步地，所述构建方法的步骤如下：
1）取目标动物的受精卵细胞，在其DUP基因组片段5’端敲入人源DUP基因组片段，获得突变的受精卵细胞，移植到雌性目标动物中，雌性目标动物生产获得F0代；
2）将F0代与野生型动物杂交，获得F1代；
所述F0代、F1代及其子代中有人源DUP基因组片段敲入阳性的杂合子或者纯合子即为多指（趾）及三指节拇指（趾）模型。
本发明还提供了一种上方法构建的多指（趾）动物模型在肢体发育异常疾病研究中的应用，所述研究是以非疾病的诊断或治疗为目的。
进一步地，多指（趾）模型在轴前多指（趾）和三指（趾）节拇指（趾）疾病治疗药物的筛选中的应用。
本发明还提供了一种基因片段构建多指小鼠模型中的应用，所述基因片段为人源DUP基因组片段为人源7号染色体：156,586,663-156600609，或鼠源DUP基因组片段位于5号染色体：29317977-29332658。
本发明多指（趾）包括多指、多趾或多指和多趾。
本发明有益效果：本发明提供了一种多指（趾）相关的基因片段以及动物模型构建方法及应用，本发明通过在小鼠基因组DUP基因组片段位置5’端再敲入了一个人源DUP基因组片段，构建得到轴前多指（趾）及三指节拇指（趾）小鼠模型，该模型轴前多指（趾）及三指节拇指（趾）疾病呈常染色体显遗传、同时只表现为轴前多指（趾）的小鼠模型，不表现多器官异常的综合征，较现有的多指（趾）动物模型更能模拟人类多指疾病状态，可以用于轴前多指（趾）疾病研究，为轴前多指（趾）疾病的研究例如对高危患儿早期基因筛查、轴前多指病因与突变基因致病机制提供一种新的模型，还可以用于肢体发育异常疾病研究，特别是轴前多指（趾）和三指节拇指（趾）疾病治疗药物的筛选。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：构建的突变模式以及用于PCR 和sanger测序的引物标注流程图。
图2：在构建的突变模式上标注出Southern印迹杂交（Southern Blot）鉴定酶切和探针位置图。
图3：A为F1代野生型小鼠和F1代突变型小鼠用第一对引物进行PCR的扩增结果图；B为F1代野生型小鼠和F1代突变型小鼠用第二对引物进行PCR的扩增结果图；C为F1代突变型小鼠的sanger测序结果图。
图4： A为F1代野生型小鼠和F1代突变型小鼠用5’探针-AhdI进行Southern Blot鉴定结果图；B: 为F1代野生型小鼠和F1代突变型小鼠用3’探针-SacI进行Southern Blot鉴定结果图。
图5：A：F1代野生型小鼠四肢CT三维重建图；B：F1突变型小鼠四肢CT三维重建图。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
Cas9蛋白购买自NEB，货号为M0646。
AhdI限制性内切酶购买自NEB，货号R0584V。
ScaI限制性内切酶购买自NEB，货号R3122V。
实施例1 构建多指（趾）及三指节拇指（趾）模型
一、实验方法
1.1材料
实验动物: C57BL/6J Nifdc小鼠，18~21g, 雌雄性各10只。繁育环境为SPF级，实验在清洁级环境中进行，饲喂SPF级小鼠颗粒饲料，饮用灭菌自来水。
本实验所有研究均按照四川大学华西医院实验动物福利伦理委员会批准的动物方案进行，伦理审批号︰20221103004。
1.2建模方法
1.2.1模型的构建:
根据NCBI中提供的基因序列参考可知，小鼠Lmbr1基因(NCBI Gene ID：56873；参考序列：NM_020295.3)位于小鼠5号染色体上，已鉴定出17个外显子，其中起始密码子ATG位于外显子1，终止密码子TGA位于外显子17（转录本：201-ENSMUST00000055195）。其中Zrs位于其内含子内(NCBI Gene ID：105804842；参考序列：NC_000071.7)。
人源LMBR1基因（NCBI参考序列：NM_022458.4）位于人类第7号染色体。
人源DUP基因组片段是本发明在一IV型并多指家系中发现的一个出现重复转位结构突变的基因，该基因之前未被发现与研究过，暂未被NCBI收录，它是ZRS基因的侧翼序列，同位于7号染色体：156,586,663-156600609 (hg19)，鼠源DUP基因组片段位于5号染色体：29317977-29332658（mm10）。
本发明构建模型的方式是：在小鼠基因组DUP基因组片段（即小鼠5号染色体：29317977-29332658（mm10））位置5’端再敲入了一个人源DUP基因组片段（即人源7号染色体：156,586,663-156600609 （hg19）），具体构建策略见图1，敲入的位置位于小鼠5号染色体29317931-29317950之间。
1.2.2采用CRISPR-Cas9技术设计模型SgRNA表达载体:
通过http: //crispor.tefor.net/在线网站设计，确认 gRNA靶序列，（匹配基因的反向链gRNA(SEQ ID NO.1):3’-CTTGGTGTGCCAGCGAAGTCAGG -5’，最终得到的gRNA的序列为将前述DNA序列中的T直接替换为U而得)，并于金斯瑞合成。采用片段扩增（5’arm、KI、3’arm）→连接（骨架+片段）/转化→菌检→阳性克隆提质粒→酶切鉴定→送测→制备注射用质粒的方法进行Donor载体构建。
1.2.3胞质注射及胚胎移植:
筛选3-4周野生型雌鼠，与成年可育雄鼠交配受精后，次日安乐死，从从输卵管内收集受精卵备用。将制备好的SgRNA与Cas9蛋白混合为RNP注射复合物蛋白。在 200-400 倍的倒置显微镜下，将外源基因注射溶液通过显微注射的方式注射到受精卵细胞核内。将注射完毕的受精卵转移到 M16 培养基中，并放入 37℃恒温 5%的 CO2 培养箱内，培养 0.5-1h后，移植到与结扎雄鼠合笼的见栓假孕母鼠输卵管膨大部，缝合后将移植母鼠饲养于IVC环境中，移植母鼠生产后，得到F0代。
将其与野生型小鼠进行种系传代获得F1代小鼠，随后用PCR、序列分析法和Southern Blot对F1代小鼠进行基因鉴定。
1.3 模型检测
1.3.1 F1代小鼠基因型PCR、测序分析及Southern Blot鉴定
取F1代小鼠，逐只提取鼠尾基因组DNA（每只取100 ng DNA），通过PCR检测基因型。引物设计针对转入基因的编码序列，引物设计2对（F1/R1和F2/R2），PCR条件为: 94 ℃ 3min预变性；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s, 65 ℃ 50 s/kb，33个循环；65 ℃ 10 min额外延伸。
将阳性小鼠基因组进行sanger测序，对新插入片段两端接头进行检测，测序引物为F3及F4 (设计策略见图1、具体序列见表1)。
取F1代的野生型小鼠和上述鉴定得到的阳性小鼠基因组进行Southern Blot鉴定，Southern Blot的预期片段大小∶5’探针-AhdI: 19.47kb-WT, 7.68kb-MT; 3’探针-ScaI 7.55 kb-WT, 18.39 kb-MT (设计策略见图2、具体序列见表2)。
表1 小鼠基因组PCR和sanger测序引物
表2 Southern Blot鉴定探针所用引物
1.3.2 小鼠外形鉴定与四肢远端CT三维重建鉴定
肉眼观F1代野生型和F1代突变型小鼠，并使用正置显微镜对四肢远端外形进行拍照。随后取F1代突变型小鼠的四肢进行CT三维重建，观察骨的形态。
二、实验结果
2.1 PCR对小鼠基因型进行验证
通过对PCR产物进行核酸胶凝胶电泳和曝光，在F1代小鼠中成功验证到突变阳性条带（图3A-图3B）。随后F1代突变型小鼠基因组sanger测序的结果也证实其突变确切（图3C）。
图3A和图3B看出第一对引物和第二对引物进行PCR扩增后F1代野生型无条带，F1代突变型可见目的大小条带；图3C为通过sanger测序对插入片段两端接头进行检测，均为阳性结果；从图3C中可以看出DUP基因组片段插入正常基因组后的两端接头序列。
2.2 Southern Blot对小鼠基因型进行验证
用Southern Blot的方法对突变小鼠再次进行验证，实验结果如图4所示，可以看出：5’探针-AhdI在野生型中为19.47 kb，在突变型中为7.68kb（图4A）; 3’探针-Scal在野生型中为 7.55 kb，在突变型中为18.39 kb（图4B），与预期结果一致，表明突变成功，成功插入人源DUP基因组片段。
2.3外形和CT三维重建显示小鼠的远端四肢异常
通过肉眼观察F1代小鼠四肢远端外形，相对于F1代野生型而言，F1代突变型小鼠后肢出现了轴前多趾的表现，前肢未见异常，杂合小鼠未见其他部位畸形，生育正常，饮食和生活习性与野生型一致。
对F1代突变型小鼠的四肢进行CT三维重建，可以看到后肢轴前出现额外趾，且额外趾呈三趾节表现（图5）。繁育得到的纯合突变鼠与杂合小鼠表型一致。显示，相较于野生型小鼠，杂合突变小鼠双后肢呈现轴前多趾表现，且多趾为三趾节。
F1代突变型小鼠共8只（4雌4雄），F1代突变型小鼠均携带了人源DUP基因组片段，均表现为轴前多指（趾）及三指节拇指(趾)。
本发明提供了一种多指（趾）相关的基因片段以及动物模型构建方法及应用，本发明通过在小鼠基因组DUP基因组片段位置5’端再敲入了一个人源DUP基因组片段，构建得到轴前多指（趾）及三指节拇指（趾）小鼠模型，该模型轴前多指（趾）及三指节拇指（趾）疾病呈常染色体显遗传、同时只表现为轴前多指（趾）的小鼠模型，不表现多器官异常的综合征，较现有的多指（趾）动物模型更能模拟人类多指疾病状态，可以用于轴前多指（趾）疾病研究，为轴前多指（趾）疾病的研究例如对高危患儿早期基因筛查、轴前多指病因与突变基因致病机制提供一种新的模型，还可以用于肢体发育异常疾病研究，特别是轴前多指（趾）和三指节拇指（趾）疾病治疗药物的筛选。
Claims (7)
1.一种多指（趾）动物模型构建方法，其特征在于，它是使用基因编辑技术在目标动物的DUP基因组片段5’端敲入人源DUP基因组片段；所述人源DUP基因组片段为人源7号染色体：156,586,663-156600609；
所述目标动物为大鼠、小鼠；
所述敲入的位置位于目标动物5号染色体29317931-29317950之间。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述基因编辑技术为CRISPR-Cas9技术。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas9技术中的gRNA靶序列的序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法的步骤如下：
1）取目标动物的受精卵细胞，在其DUP基因组片段5’端敲入人源DUP基因组片段，获得突变的受精卵细胞，移植到雌性目标动物中，雌性目标动物生产获得F0代；
2）将F0代与野生型动物杂交，获得F1代；
所述F0代、F1代及其子代中有人源DUP基因组片段敲入阳性的杂合子或者纯合子即为多指（趾）及三指节拇指（趾）模型。
5.权利要求1~4任一项构建的多指（趾）动物模型在肢体发育异常疾病研究中的应用，所述研究是以非疾病的诊断或治疗为目的。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，多指（趾）模型在轴前多指（趾）和三指（趾）节拇指（趾）疾病治疗药物的筛选中的应用。
7.一种基因片段构建多指小鼠模型中的应用，其特征在于，所述基因片段为人源DUP基因组片段为人源7号染色体：156,586,663-156600609，和鼠源DUP基因组片段位于5号染色体：29317977-29332658。
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