RU2768048C1 - Способ получения мышиной модели для изучения синдрома Леша-Нихена путем внесения делеции p.Val8del в ген hprt1 - Google Patents
Способ получения мышиной модели для изучения синдрома Леша-Нихена путем внесения делеции p.Val8del в ген hprt1 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2768048C1 RU2768048C1 RU2021110495A RU2021110495A RU2768048C1 RU 2768048 C1 RU2768048 C1 RU 2768048C1 RU 2021110495 A RU2021110495 A RU 2021110495A RU 2021110495 A RU2021110495 A RU 2021110495A RU 2768048 C1 RU2768048 C1 RU 2768048C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mice
- gene
- val8del
- deletion
- lesch
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 238000012217 deletion Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 230000037430 deletion Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 208000009625 Lesch-Nyhan syndrome Diseases 0.000 title abstract 3
- 208000035317 Total hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase deficiency Diseases 0.000 title abstract 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 title description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 25
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 13
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims description 10
- 101150003028 Hprt1 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 6
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 claims description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 5
- 230000000056 copulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 3
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 3
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 3
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 210000001177 vas deferen Anatomy 0.000 description 3
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 210000003815 abdominal wall Anatomy 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000007879 vasectomy Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000721047 Danaus plexippus Species 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 101000687332 Homo sapiens Phosphoribosyltransferase domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 201000001431 Hyperuricemia Diseases 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010029148 Nephrolithiasis Diseases 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 102100024906 Phosphoribosyltransferase domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 1
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 1
- 102100038517 Pyridoxal kinase Human genes 0.000 description 1
- 208000035977 Rare disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 208000033712 Self injurious behaviour Diseases 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029036 donor selection Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 208000038009 orphan disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к плазмидной конструкции, кодирующей белок spCas9 под контролем CAG промотора и экспрессирующей сгРНК против фрагмента последовательности 1 экзона гена hprt1 под контролем U6 промотора. Также раскрыт способ получения линии мышей для моделирования синдрома Леша-Нихена, содержащих делецию p.Val8del в гене mHprt1, с помощью вышеуказанной плазмидной конструкции. Изобретение эффективно для детального изучения патогенеза и разработки терапии синдрома Леша-Нихена. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к областям молекулярных биотехнологии и медицины и касается мышиной модели, содержащей делецию p.Val8del в гене mhprt1. Изобретение может быть использовано для детального изучения патогенеза и разработки терапии синдрома Леша-Нихена.
Изобретение создано при финансовой поддержке Министерства Науки и Высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения № 075-15-2019-1661 от 31.10.2019.
Уровень техники
Синдром Леша-Нихена (СЛН) - орфанное заболевание, причина которого - недостаточная активность фермента гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (HPRT1), который катализирует реутилизацию гуанина и гипоксантина. При такой недостаточности в клетках организма происходит накопление мочевины. Как правило, к снижению активности фермента приводят мутации в гене HPRT1, расположенном на Х-хромосоме.
СЛН встречается у одного из 380000 новорожденных и может проявляться состояниями разной степени тяжести. Из-за нарушения метаболизма развивается гиперурикемия, накопление в тканях организма мочевой кислоты. Она может становиться причиной нефролитиаза. Кроме метаболических нарушений, наблюдаются неврологические, психические и когнитивные. Характерным симптомом СЛН является самотравмирующее поведение (кусание пальцев, губ, внутренней поверхности щек). При неблагоприятном течении заболевания летальный исход наступает на первом или втором десятилетии жизни. Для разработки терапевтических подходов и доклинических исследований перспективных препаратов необходимы адекватные животные модели.
Известны трансгенные мыши (Hooper et al., 1987) и крысы (Isotani et al., 2016) с нокаутом гена mhprt1. Однако у них наблюдаются менее выраженные, чем у людей, биохимические изменения и не обнаруживаются поведенческие черты, свойственные СЛН (Finger et al., 1988). Было выдвинуто предположение (Keebaugh et al., 2011), что фенотип СЛН вызван не отсутствием белка HPRT, а заметной на фоне его отсутствия аномальной активностью его паралога PRTFDC1. У мышей данный паралог представляет собой инактивированный псевдоген. В данном изобретении реализована мутация, приводящая не к нокауту гена, а к делеции одной аминокислоты, однако вызвавшая тяжелое течение СЛН у человека. Существует вероятность, что мыши с мутантной формой белка HPRT будут демонстрировать фенотип заболевания, отсутствующий у мышей с нокаутом гена.
Краткое описание изобретения
В Научно-исследовательский клинический институт педиатрии имени академика Ю.Е. Вельтищева ФГАОУ ВО РНИМУ поступил пациент с клинической картиной СЛН. У него была обнаружена мутация c.23_25delTCG, p.Val8del в гене hprt1. Для внесения аналогичной делеции в геном мыши мы использовали систему CRISPR/Cas9, состоящую из белка spCas9 и сгРНК, ПАМ-сайт которой расположен в 4-х нуклеотидах от 5’-цонца делеции.
Задачей заявляемого изобретения является создание мышиной модели синдрома Леша-Нихена путем внесения в геном мыши делеции p.Val8del в гене hprt1.
Задача решается тем, что с использованием системы CRISPR/Cas9 получена новая линия генетически модифицированных мышей, содержащих в геноме делецию p.Val8del в гене hprt, для чего:
1. Была получена плазмидная конструкция px330+HPRTsg SEQ ID NO: 1, содержащая сгРНК SEQ ID NO: 2 против соответствующего участка гена hprt, под контролем U6 промотора и ОРС гена spCas9 под контролем CAG промотора.
2. Был разработан способ получения конструкции px330+HPRTsg, характеризующийся следующими стадиями:
а) биоинформатический анализ последовательности гена hprt и подбор сгРНК в непосредственной близости от места целевой мутации,
б) клонирование соответствующей последовательности сгРНК в вектор px330.
3. Способ получения линии мышей, содержащих делецию p.Val8del в гене mHprt1,, характеризующийся следующими стадиями:
а) микроинъекция конструкции px330+HPRTsg из п. 1 в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыши гибрида F1(CBA×C57BL/6);
б) выявление жизнеспособных зигот;
в) пересадка выживших зигот из пункта (б) псевдобеременным самкам-реципиентам, имеющим копулятивную пробку после ссаживания с вазэктомированными самцами;
г) получение новорожденных мышей на 19 день после пересадки зигот из пункта (в);
д) проведение анализа наличия мутации через 8-14 дней после рождения мышей (г), путем амплификации целевого участка гена hprt с праймерами SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 с последующим секвенированием фрагмента;
е) отбор мышей, несущих целевую мутацию;
ж) проведение скрещивания мышей из пункта (е) с мышами дикого типа для получения самок-гетерозигот или мутантных самцов, несущих целевую мутацию;
з) проведение скрещивания мышей из пункта (ж) для получения итоговой линии мышей, несущих мутацию p.Val8del.
Технический результат изобретения: разработан способ получения линии трансгенных мышей c мутацией p.Val8del в гене hprt1 и выведена соответствующая линия мышей.
Изобретение иллюстрируется фигурами 1 и 2 и перечнем использованных последовательностей.
Краткое описание рисунков
На Фигуре 1 представлена схема задействованной в данной работе части hprt1 локуса. Указаны 3 делетируемых нуклеотида, сгРНК, ПАМ-сайт, праймеры для генотипирования, 1-й экзон и его кодирующая белок часть.
На Фигуре 2 представлен двоящийся сиквенс, соответствующий мозаичному трансгену F0.
Осуществление изобретения
Способ осуществляется следующим образом.
Пример 1. Получение генетических конструкций. Для введения выбранной нами делеции мы подобрали с помощью онлайн инструмента: http://crispor.tefor.net/ сгРНК, ПАМ-сайт которой находится на расстоянии 4-х нуклеотидов от места делеции (Фиг. 1). Выбранная сгРНК имела последовательность CCCTTGGCTCACCACGACGC-TGG. Поскольку место разрезания белка spCas9 находится в непосредственной близости от вводимой делеции, мы выдвинули предположение, что целевая делеция может произойти без гомологической рекомбинации, а только за счет негомологического соединения концов. Выбранную сгРНК мы заклонировали в плазмидный вектор px330, предназначенный для одновременной экспрессии белка spCas9 и сгРНК. Последовательность сгРНК была синтезирована с использованием двух олигонуклеотидов SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.
Разрезание вектора производили с использованием рестриктазы BbsI-HF (New England Biolabs), затем дефосфорилировали вектор с помощью фермента FastAP (Thermofisher Scientific), и очищали в агарозном геле и последующим выделением с помощью набора Monarch DNA Gel Extraction Kit. Олигонуклеотиды для последовательности сгРНК были заказаны с таким расчетом, чтобы их некомплиментарные концы образовали липкие концы для клонирования в вектор px330. Олигонуклеотиды фосфорилировали с использованием фермента PNK kinase (Thermofisher Scientific), отжигали друг с другом и лигировали с приготовленным ранее вектором и использованием фермента T4 DNA ligase (Thermofisher Scientific). Лигазную смесь трансформировали в компетентные клетки штамма XL1blue (Евроген). Скрининг колоний осуществляли с использованием пцр-наборов компании Изоген и праймеров к U6 промотору (SEQ ID NO: 5) и обратного праймера для синтеза сгРНК (SEQ ID NO: 4). По две колонии, содержащие сгРНК, наращивали в ночной культуре и выделяли с помощью набора Monarch Plasmid Miniprep Kit. Анализ полученных плазмид проводили методом секвенирования по Сэнгеру. Сиквенс полученных плазмид осуществляли с использованием праймера SEQ ID NO: 5 в компании Евроген. Анализ сиквенсов проводили с использованием программного обеспечения SnapGene.
Проверенную конструкцию разводили до концентрации используемой при микроинъекциях – 1 нг/мкл.
Пример 2. Получение яйцеклеток мышей. Яйцеклетки для микроинъекции получали методом индукции суперовуляции. Для этого неполовозрелым самкам гибридам F1(CBA×C57BL/6) весом 12-13 г внутрибрюшинно вводили 8 ед. гонадотропина сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК) и через 48 час - 8 ед. хорионического гонадотропина человека (ХгЧ). После такой обработки самок ссаживали с самцами-производителями F1(CBA×C57BL/6). Факт спаривания констатировали на следующее утро по наличию копулятивной пробки.
Схема индукции суперовуляции: 12:00 - ГСЖК, через 48 часов - ХгЧ. В 17:00 этого же дня - подсадка к самцам-производителям. Отбор доноров производили на следующий день в 9:00. Световой режим в виварии был установлен с 7:00 до 19:00.
Отобранных самок-доноров умерщвляли, извлекали яйцеводы, затем вымывали яйцеклетки в среде HEPES-KSOM с добавлением гиалуронидазы. Процедуру проводили под бинокуляром (Zeiss Stemi DV4) с увеличением в 32 раза. Для вымывания яйцеклеток использовали стеклянные капилляры с внутренним диаметром примерно 100 мкм, изготовленные на пуллере Narishige PC-10 (Япония) и микрокузнице Narishige MF-900 (Япония).
3. Микроинъекции. Полученные зиготы культивировали в течение двух часов при t=37°C и 5% СО2 в капле среды KSOM под минеральным маслом (Sigma, США), затем помещали в микроинъекционную камеру. Микроинъекции проводили в среде HEPES-KSOM под микроскопом Zeiss Axiovert 200М при увеличении в 400-600 раз, используя микроманипуляторы Narishige. Для изготовления игл для микроинъекций использовали пуллер Sutter instrument Со Р-97 (США), для изготовления удерживающей пипетки использовали пуллер Narishige PC-10 и микрокузницу Narishige MF-900.
После окончания микроинъекций выжившие зиготы переносили в каплю среды KSOM под минеральное масло (Sigma) и культивировали в течение 1 часа для выявления жизнеспособных эмбрионов.
4. Получение самок-реципиентов. Самок-реципиентов яйцеклеток получали следующим образом: половозрелых самок F1(CBA×C57BL/6) весом не менее 24 г ссаживали с вазэктомированными самцами той же линии. Через 18 часов псевдобеременных реципиентов отбирали по наличию копулятивных пробок. Выжившие после микроинъекции зиготы трансплантировали в яйцеводы псевдобеременной самки. Одной псевдобеременной самке пересаживали 6-10 эмбрионов. Операцию проводили под наркозом (смесь золетила и рометара, вводился внутрибрюшинно).
5. Операция вазэктомирования. Операцию вазэктомирования проводили заранее под наркозом (смесь золетила и рометара, вводился внутрибрюшинно). Через надрез в коже и брюшной стенке вытягивали из брюшной полости семенник, придатки семенника и семявыносящий проток, после чего раскаленным пинцетом разрушали семявыносящий проток. Органы возвращали в брюшную полость, и повторяли всю процедуру на другом семявыносящем протоке. На завершающем этапе на брюшную стенку и на кожу накладывали швы с последующей антисептической обработкой операционного поля.
6. Получение новорожденных мышей. На 19 день после пересадки микроинъецированных эмбрионов реципиента умерщвляли путем цервикальной дислокации и проводили кесарево сечение, после чего выживших детенышей помещали к заранее подготовленной кормилице. Через 8-14 дней после рождения у мышат брали образец ткани, выделяли ДНК и анализировали наличие трансгена методом ПЦР.
7. Анализ наличия трансгена в геноме мышей производили методом секвенирования ПЦР-фрагмента. ДНК для ПЦР выделяли из тканей по стандартному протоколу. Амплификацию фрагментов ДНК проводили с помощью набора GenPak™ PCR Core (Isogene) в присутствии 10 пМ праймеров HPRT-f (SEQ ID NO:6) и HPRT-r (SEQ ID NO:7) в следующих режимах: денатурация 95°С - 3 мин; далее следовало 35 циклов: 95°С - 40 сек, 58°С - 40 сек; 72°С - 40 сек; и последний синтез 72°С - 2 мин. После прохождения реакции ПЦР-смесь очищали в 1,5% агарозном геле, полученный продукт выделяли набором Monarch DNA Gel Extraction Kit и секвенировали в компании Евроген и использованием праймера SEQ ID NO:6. Полученные сиквенсы можно подразделить на три категории: сиквенсы дикого типа, последовательность в которых соответствует дикому типу, двоящиеся сиквенсы (Фиг. 2), соответствующие мозаичным животным F0 или гетерозиготным самкам следующих поколений, и сиквенсы, на которых присутствует только мутантны вариант ДНК, соответствующие трансгенным самцам и гомозиготным трансгенным самкам.
Источники информации
Finger S, Heavens RP, Sirinathsinghji DJ, Kuehn MR, Dunnett SB. Behavioral and neurochemical evaluation of a transgenic mouse model of Lesch-Nyhan syndrome. J Neurol Sci. 1988 Sep; 86(2-3).
Hooper M, Hardy K, Handyside A et al, HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells, Nature, 1987 Mar 19-25; 326(6110): 292-5.
Isotani, A., Yamagata, K., Okabe, M. et al. Generation of Hprt-disrupted rat through mouse←rat ES chimeras. Sci Rep 2016, 6, 24215.
Keebaugh AC, Mitchell HA, Gaval-Cruz M, Freeman KG, Edwards GL, Weinshenker D, Thomas JW. PRTFDC1 is a genetic modifier of HPRT-deficiency in the mouse. PLoS One. 2011; 6(7): e22381.
Claims (10)
1. Плазмидная конструкция px330+HPRTsg последовательностью SEQ ID NO: 1 для получения линии мышей, содержащих делецию p.Val8del в гене mHprt1, кодирующая белок spCas9 под контролем CAG промотора и экспрессирующая сгРНК последовательностью SEQ ID NO: 2 против фрагмента последовательности 1 экзона гена hprt1 под контролем U6 промотора.
2. Способ получения линии мышей для моделирования синдрома Леша-Нихена, содержащих делецию p.Val8del в гене mHprt1, с помощью плазмидной конструкции по п. 1, и характеризующийся следующими стадиями:
а) микроинъекция конструкции px330+HPRTsg из п. 1 в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыши гибрида F1 CBA×C57BL/6;
б) выявление жизнеспособных зигот;
в) пересадка выживших зигот из пункта (б) псевдобеременным самкам-реципиентам, имеющим копулятивную пробку после ссаживания с вазэктомированными самцами;
г) получение новорожденных мышей на 19 день после пересадки зигот из пункта (в);
д) проведение анализа наличия мутации через 8-14 дней после рождения мышей (г) путем амплификации целевого участка гена hprt с праймерами SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 с последующим секвенированием фрагмента;
е) отбор мышей, несущих целевую мутацию;
ж) проведение скрещивания мышей из пункта (е) с мышами дикого типа для получения самок-гетерозигот или мутантных самцов, несущих целевую мутацию;
з) проведение скрещивания мышей из пункта (ж) для получения итоговой линии мышей, несущих мутацию p.Val8del.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2021110495A RU2768048C1 (ru) | 2021-04-14 | 2021-04-14 | Способ получения мышиной модели для изучения синдрома Леша-Нихена путем внесения делеции p.Val8del в ген hprt1 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2021110495A RU2768048C1 (ru) | 2021-04-14 | 2021-04-14 | Способ получения мышиной модели для изучения синдрома Леша-Нихена путем внесения делеции p.Val8del в ген hprt1 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2768048C1 true RU2768048C1 (ru) | 2022-03-23 |
Family
ID=80819224
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2021110495A RU2768048C1 (ru) | 2021-04-14 | 2021-04-14 | Способ получения мышиной модели для изучения синдрома Леша-Нихена путем внесения делеции p.Val8del в ген hprt1 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2768048C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115058456A (zh) * | 2022-06-23 | 2022-09-16 | 五邑大学 | Hprt基因敲除的动物模型的构建方法和应用 |
RU2815936C1 (ru) * | 2023-10-31 | 2024-03-25 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) | Способ получения мышиной модели для изучения миодистрофии Дюшенна и вариантов ее терапии |
-
2021
- 2021-04-14 RU RU2021110495A patent/RU2768048C1/ru active
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
AYAKO ISOTANI et al., Generation of Hprt-disrupted rat through mouse←rat ES chimeras, Scientific Reports, 2016, Vol.6:24215, DOI: 10.1038/srep24215. * |
HOOPER M. et al., HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells, 1987, Nature, 326(6110), pp. 292-295. База данных GenBank: KU341332.1 от 21.03.2016. * |
VLADISLAV A. KALMYKOV et al., New personalized genetic mouse model of LeschNyhan syndrome for pharmacology and gene therapy, Research Results in Pharmacology, 2018, 4(4), pp. 115-122. * |
VLADISLAV A. KALMYKOV et al., New personalized genetic mouse model of LeschNyhan syndrome for pharmacology and gene therapy, Research Results in Pharmacology, 2018, 4(4), pp. 115-122. AYAKO ISOTANI et al., Generation of Hprt-disrupted rat through mouse←rat ES chimeras, Scientific Reports, 2016, Vol.6:24215, DOI: 10.1038/srep24215. HOOPER M. et al., HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells, 1987, Nature, 326(6110), pp. 292-295. База данных GenBank: KU341332.1 от 21.03.2016. ДИМИТРИЕВА Т.В. и др., Модификация метода анализа результатов редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9 на предимплантационных эмбрионах мыши, ВЕСТНИК РГМУ, 2016, 3. * |
ДИМИТРИЕВА Т.В. и др., Модификация метода анализа результатов редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9 на предимплантационных эмбрионах мыши, ВЕСТНИК РГМУ, 2016, 3. * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115058456A (zh) * | 2022-06-23 | 2022-09-16 | 五邑大学 | Hprt基因敲除的动物模型的构建方法和应用 |
CN115058456B (zh) * | 2022-06-23 | 2023-09-19 | 五邑大学 | Hprt基因敲除的动物模型的构建方法和应用 |
RU2815936C1 (ru) * | 2023-10-31 | 2024-03-25 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) | Способ получения мышиной модели для изучения миодистрофии Дюшенна и вариантов ее терапии |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108660161B (zh) | 基于CRISPR/Cas9技术的制备无嵌合基因敲除动物的方法 | |
Shrock et al. | CRISPR in animals and animal models | |
CN106459951A (zh) | 驯养的大型动物的受精卵中的靶向基因组编辑 | |
JP6192865B2 (ja) | lincRNA欠失非ヒト動物 | |
WO2018057790A1 (en) | Animal models for cardiomyopathy | |
JP2019502400A (ja) | キメラ胚補助臓器作製用の組成物及び方法 | |
Hammond et al. | Improved CRISPR-based suppression gene drives mitigate resistance and impose a large reproductive load on laboratory-contained mosquito populations | |
Yu | New personalized genetic mouse model of Lesch-Nyhan syndrome for pharmacology and gene therapy | |
US20240052304A1 (en) | Sterile avian embryos, production and uses thereof | |
RU2768048C1 (ru) | Способ получения мышиной модели для изучения синдрома Леша-Нихена путем внесения делеции p.Val8del в ген hprt1 | |
CN105950654A (zh) | 一种人源化的转基因动物 | |
JP2019507610A (ja) | CRISPR−Casゲノム編集に基づく、Fel d1ノックアウト並びに関連組成物及び方法 | |
Jin et al. | Generation of PDE4 knockout mice by gene targeting | |
Ghassemi et al. | Pipeline for the generation of gene knockout mice using dual sgRNA CRISPR/Cas9-mediated gene editing | |
US20220192163A1 (en) | Hemophilia b rat model | |
RU2764650C1 (ru) | Способ получения линии гуманизированных мышей, содержащих инсерцию 3974insT в гене mGrin2a (mice glutamate [NMDA] receptor subunit epsilon-1), приводящую к преждевременному прекращению трансляции белка grin2a | |
Brakebusch | Generation and analysis of genetically modified mice | |
CN114958762A (zh) | 一种构建神经组织特异过表达人源snca的帕金森病模型猪的方法及应用 | |
Lai et al. | Skeletal Genetics: From Gene Identification to Murine Models of Disease | |
CN114958761B (zh) | 一种胃癌模型猪的构建方法及应用 | |
Leong | An inducible and reversible genetics platform for novel drug target discovery | |
WO2006085673A1 (ja) | 無毛トランスジェニック動物 | |
WO2024092216A2 (en) | Methods and compositions regarding modulation of poultry genes | |
Rabbits | 15 Methods to Create Transgenic | |
Wong et al. | Generation of adenylyl cyclase knockout mice |