RU2764650C1 - Способ получения линии гуманизированных мышей, содержащих инсерцию 3974insT в гене mGrin2a (mice glutamate [NMDA] receptor subunit epsilon-1), приводящую к преждевременному прекращению трансляции белка grin2a - Google Patents
Способ получения линии гуманизированных мышей, содержащих инсерцию 3974insT в гене mGrin2a (mice glutamate [NMDA] receptor subunit epsilon-1), приводящую к преждевременному прекращению трансляции белка grin2a Download PDFInfo
- Publication number
- RU2764650C1 RU2764650C1 RU2021110493A RU2021110493A RU2764650C1 RU 2764650 C1 RU2764650 C1 RU 2764650C1 RU 2021110493 A RU2021110493 A RU 2021110493A RU 2021110493 A RU2021110493 A RU 2021110493A RU 2764650 C1 RU2764650 C1 RU 2764650C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mice
- aag
- grin2a
- gene
- cag
- Prior art date
Links
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 title claims description 13
- 230000037431 insertion Effects 0.000 title claims description 13
- 102100029458 Glutamate receptor ionotropic, NMDA 2A Human genes 0.000 title description 7
- 101710195153 Glutamate receptor ionotropic, NMDA 2A Proteins 0.000 title description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 5
- 230000002028 premature Effects 0.000 title description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 title description 3
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 title description 2
- 101150002245 grin2a gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims abstract description 9
- 201000007201 aphasia Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 8
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 6
- 208000024658 Epilepsy syndrome Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 208000002877 Epileptic Syndromes Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 10
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 7
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 claims description 6
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 claims description 4
- 230000000056 copulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 3
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 14
- 108090001041 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Proteins 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 102000004868 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Human genes 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 5
- 206010052075 Acquired epileptic aphasia Diseases 0.000 description 4
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 4
- 201000005802 Landau-Kleffner Syndrome Diseases 0.000 description 4
- 208000004974 Rolandic Epilepsy Diseases 0.000 description 4
- 201000008916 benign epilepsy with centrotemporal spikes Diseases 0.000 description 4
- 208000033205 childhood epilepsy with centrotemporal spikes Diseases 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 3
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 3
- 230000007958 sleep Effects 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001177 vas deferen Anatomy 0.000 description 3
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 2
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 2
- HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N N-Methyl-D-aspartic acid Chemical compound CN[C@@H](C(O)=O)CC(O)=O HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 2
- 102000014649 NMDA glutamate receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 210000003815 abdominal wall Anatomy 0.000 description 2
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001037 epileptic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000013016 learning Effects 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 238000007879 vasectomy Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000006888 Agnosia Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010003062 Apraxia Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000721047 Danaus plexippus Species 0.000 description 1
- 206010012559 Developmental delay Diseases 0.000 description 1
- 206010013976 Dyspraxia Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241001200922 Gagata Species 0.000 description 1
- 102100022645 Glutamate receptor ionotropic, NMDA 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710121995 Glutamate receptor ionotropic, NMDA 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100038942 Glutamate receptor ionotropic, NMDA 3A Human genes 0.000 description 1
- 101710195181 Glutamate receptor ionotropic, NMDA 3A Proteins 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100080138 Mus musculus Grin2a gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 102100038517 Pyridoxal kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000029036 donor selection Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 108091008634 hepatocyte nuclear factors 4 Proteins 0.000 description 1
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007849 hot-start PCR Methods 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001314 paroxysmal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000037322 slow-wave sleep Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003956 synaptic plasticity Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000031836 visual learning Effects 0.000 description 1
- 230000001755 vocal effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности плазмидной конструкции, полученной на основе вектора px330 и экспрессирующей сгРНК против фрагмента последовательности 14 экзона гена grin2a под контролем U6 промотора и ОРС гена spCas9 под контролем CAG промотора. Также раскрыта линия мышей, полученная путем трансформации мышей вышеуказанной конструкцией, а также способ ее получения. Изобретение эффективно для моделирования синдрома афазии-эпилепсии. 3 н.п. ф-лы.
Description
Область техники
Изобретение относится к областям молекулярных биотехнологии и медицины и касается мышиной модели, содержащей инсерцию 3974insT в гене grin2a. Изобретение может быть использовано для детального изучения патогенеза и разработки терапии детской эпилепсии, сопровождающейся задержкой развития.
Изобретение создано при финансовой поддержке Министерства Науки и Высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения № 075-15-2019-1661 от 31.10.2019.
Уровень техники
Синдром эпилепсии-афазии (EAS) - группа состояний, ключевыми особенностями которых являются нарушение языковых навыков (афазия) и пароксизмальная электрическая активность в головном мозге, зарегистрированная на электроэнцефалографе. Синдром эпилепсии-афазии включает Синдром Ландау-Клеффнера (LKS) или Доброкачественная эпилепсия с центро-темпоральными спайками (BECTS), Эпилептическую энцефалопатию с продолженной спайк-волновой активностью во сне (ECSWS), Аутосомно-доминантную роландическую эпилепсию с речевой диспраксией (ADRESD).
N-метил-d-аспартатный рецептор (NMDA) - гетеротетрамер, образующий ионный канал, который играет ключевую роль в синаптической пластичности, что имеет решающее значение в процессах обучения и формирования памяти. Состоит из двух облигатных субъединиц GluN1 и двух других субъединиц из подсемейств GluN2 или GluN3A.
Мутации в гене GRIN2A вызывают конформационные изменения в субъединице GluN2A (NMDA) что, во-первых, приводит к уменьшению числа рецепторов NMDA с GluN2А-субъединицей, в результате чего передача сигналов в ЦНС осуществляется через другие типы NMDA-рецепторов; во-вторых, возможно формирование аберрантных GluN2A, вызывающих атипичную активность нейронов.
EAS проявляется состояниями различной степени тяжести. В легкой форме развиваются клинические проявления обычной Роландической эпилепсии, часто связанной с речевым и оромоторным дефицитом, а также с нарушениями чтения, внимания и памяти. Эпилептическая энцефалопатия с продолженной спайк-волновой активностью во сне (ECSWS) проявляются более тяжелыми фенотипическими проявлениями синдрома эпилепсии-афазии в виде глобального регресса в обучении, памяти, моторике и социальных навыках. Синдром Ландау-Клеффнера (LKS) характеризуется катастрофической афазией у детей, при этом с сохранными когнитивными функциями.
Для разработки терапевтических подходов и доклинических исследований перспективных препаратов необходимы адекватные животные модели. Известны трансгенные мыши (K. Sakimura, T. Kutsuwada, I. Ito, T. Manabe, C. Takayama, E. Kushiya, T. Yagi, S. Aizawa, Y. Inoue, H. Sugiyama, et al., Reduced hippocampal LTP and spatial learning in mice lacking NMDA receptor epsilon 1 subunit Nature, 373 (1995), pp. 151-155) и (Salmi, Manal et al. “Impaired vocal communication, sleep-related discharges, and transient alteration of slow-wave sleep in developing mice lacking the GluN2A subunit of N-methyl-d-aspartate receptors.” Epilepsia vol. 60,7 (2019): 1424-1437. doi:10.1111/epi.16060) с нокаутом гена mGRIN2A, в результате чего формируется NMDA-рецептор без субъединицы NR2A.
Краткое описание изобретения
В данном изобретении реализована мутация, приводящая не к нокауту гена, а к сдвигу рамки считывания и преждевременной терминации трансляции на уровне 14-го экзона, приводящая к формированию неполноценного белка Glun2A. Существует вероятность, что мыши с мутантной формой белка Glun2A будут демонстрировать фенотип заболевания, отличающийся от мышей с полным нокаутом гена.
Для создания инсерции в геноме мыши мы использовали систему CRISPR/Cas9, состоящую из белка spCas9 и сгРНК, ПАМ-сайт которой расположен в 3-х нуклеотидах от инсерции.
Задачей заявляемого изобретения является создание мышиной модели синдрома афазии-эпилепсии путем внесения в геном мыши инсерции 3974insT в гене grin2a.
Задача решается тем, что с использованием системы CRISPR/Cas9 получена новая линия генетически модифицированных мышей, содержащих в геноме инсерцию 3974insT в гене grin2a, для чего:
1. Была получена плазмидная конструкция px330+GRIN2Asg SEQ ID NO: 1, содержащая сгРНК SEQ ID NO: 2 против соответствующего участка гена grin2a, под контролем U6 промотора и ОРС гена spCas9 под контролем CAG промотора.
2. Был разработан способ получения конструкции px330+GRIN2Asg, характеризующийся следующими стадиями:
а) Биоинформатический анализ последовательности гена grin2a и подбор сгРНК в непосредственной близости от места целевой мутации
б) Клонирование соответствующей последовательности сгРНК в вектор px330.
3. Способ получения линии мышей, трансгенных по hGRIN2A, характеризующийся следующими стадиями:
а) микроинъекция конструкции px330+GRIN2Asg из п. 1 в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыши гибрида F1(CBA×C57BL/6);
б) выявление жизнеспособных зигот;
в) пересадка выживших зигот из стадии (б) псевдобеременным самкам-реципиентам, имеющим копулятивную пробку после ссаживания с вазэктомированными самцами;
г) получение новорожденных мышей на 19 день после пересадки зигот из стадии (в);
д) проведение анализа наличия мутации через 8-14 дней после рождения мышей (г), путем амплификации целевого участка гена grin2a с праймерами SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 с последующим секвенированием фрагмента;
е) отбор мышей, несущих целевую мутацию;
ж) проведение скрещивания мышей из стадии (е) с мышами дикого типа для получения самок-гетерозигот или мутантных самцов, несущих целевую мутацию.
з) проведение скрещивания мышей из стадии (ж) для получения итоговой линии мышей, несущих инсерцию 3974insT в гене grin2a.
Технический результат изобретения: разработан способ получения линии трансгенных мышей c инсерцией 3974insT в гене grin2a и выведена соответствующая линия мышей.
Изобретение иллюстрируется фигурами 1 и 2 и перечнем использованных последовательностей.
Осуществление изобретения
Способ осуществляется следующим образом:
1. Получение генетических конструкций. Для создания выбранной нами инсерции мы подобрали с помощью онлайн инструмента http://crispor.tefor.net/ сгРНК, ПАМ-сайт которой находится на расстоянии 3-х нуклеотидов от места разрыва (Фиг.2). Выбранная сгРНК имела последовательность TACTGGAGGGCAACTTATTAC-GGG. Выбранную сгРНК мы заклонировали в плазмидный вектор px330, предназначенный для одновременной экспрессии белка spCas9 и сгРНК. Последовательность сгРНК была синтезирована с использованием двух олигонуклеотидов SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.
Разрезание вектора производили с использованием рестриктазы BbsI-HF (New England Biolabs), затем дефосфорилировали вектор с помощью фермента FastAP (Thermofisher Scientific), и очищали в агарозном геле и последующим выделением с помощью набора Monarch DNA Gel Extraction Kit. Олигонуклеотиды для последовательности сгРНК были заказаны с таким расчетом, чтобы их некомплиментарные концы образовали липкие концы для клонирования в вектор px330. Олигонуклеотиды фосфорилировали с использованием фермента PNK kinase (Thermofisher Scientific), отжигали друг с другом и лигировали с приготовленным ранее вектором и использованием фермента T4 DNA ligase (Thermofisher Scientific). Лигазную смесь трансформировали в компетентные клетки штамма XL1blue (Евроген). Скрининг колоний осуществляли с использованием ПЦР-наборов компании Изоген и праймеров к U6 промотору (SEQ ID NO: 5) и обратного праймера для синтеза сгРНК (SEQ ID NO: 4). По две колонии, содержащие сгРНК, наращивали в ночной культуре и выделяли с помощью набора Monarch Plasmid Miniprep Kit. Анализ полученных плазмид проводили методом секвенирования по Сэнгеру. Сиквенс полученных плазмид осуществляли с использованием праймера SEQ ID NO: 5 в компании Евроген. Анализ сиквенсов проводили с использованием программного обеспечения SnapGene.
Проверенную конструкцию разводили до концентрации используемой при микроинъекциях - 1нг/мкл.
2. Получение яйцеклеток мышей. Яйцеклетки для микроинъекции получали методом индукции суперовуляции. Для этого неполовозрелым самкам гибридам F1(CBA×C57BL/6) весом 12-13 г внутрибрюшинно вводили 8 ед. гонадотропина сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК) и через 48 час - 8 ед. хорионического гонадотропина человека (ХгЧ). После такой обработки самок ссаживали с самцами-производителями F1(CBA×C57BL/6). Факт спаривания констатировали на следующее утро по наличию копулятивной пробки.
Схема индукции суперовуляции: 12:00 - ГСЖК, через 48 часов - ХгЧ. В 17:00 этого же дня - подсадка к самцам-производителям. Отбор доноров производили на следующий день в 9:00. Световой режим в виварии был установлен с 7:00 до 19:00.
Отобранных самок-доноров умерщвляли, извлекали яйцеводы, затем вымывали яйцеклетки в среде HEPES-KSOM с добавлением гиалуронидазы. Процедуру проводили под бинокуляром (Zeiss Stemi DV4) с увеличением в 32 раза. Для вымывания яйцеклеток использовали стеклянные капилляры с внутренним диаметром примерно 100 мкм, изготовленные на пуллере Narishige PC-10 (Япония) и микрокузнице Narishige MF-900 (Япония).
3. Микроинъекции. Полученные зиготы культивировали в течение двух часов при t=37°C и 5% СО2 в капле среды KSOM под минеральным маслом (Sigma, США), затем помещали в микроинъекционную камеру. Микроинъекции проводили в среде HEPES-KSOM под микроскопом Zeiss Axiovert 200М при увеличении в 400-600 раз, используя микроманипуляторы Narishige. Для изготовления игл для микроинъекций использовали пуллер Sutter instrument Со Р-97 (США), для изготовления удерживающей пипетки использовали пуллер Narishige PC-10 и микрокузницу Narishige MF-900.
После окончания микроинъекций выжившие зиготы переносили в каплю среды KSOM под минеральное масло (Sigma) и культивировали в течение 1 часа для выявления жизнеспособных эмбрионов.
4. Получение самок-реципиентов. Самок-реципиентов яйцеклеток получали следующим образом: половозрелых самок F1(CBA×C57BL/6) весом не менее 24 г ссаживали с вазэктомированными самцами той же линии. Через 18 часов псевдобеременных реципиентов отбирали по наличию копулятивных пробок. Выжившие после микроинъекции зиготы трансплантировали в яйцеводы псевдобеременной самки. Одной псевдобеременной самке пересаживали 6-10 эмбрионов. Операцию проводили под наркозом (смесь золетила и рометара, вводился внутрибрюшинно).
5. Операция вазэктомирования. Операцию вазэктомирования проводили заранее под наркозом (смесь золетила и рометара, вводился внутрибрюшинно). Через надрез в коже и брюшной стенке вытягивали из брюшной полости семенник, придатки семенника и семявыносящий проток, после чего раскаленным пинцетом разрушали семявыносящий проток. Органы возвращали в брюшную полость, и повторяли всю процедуру на другом семявыносящем протоке. На завершающем этапе на брюшную стенку и на кожу накладывали швы с последующей антисептической обработкой операционного поля.
6. Получение новорожденных мышей. На 19 день после пересадки микроинъецированных эмбрионов реципиента умерщвляли путем цервикальной дислокации и проводили кесарево сечение, после чего выживших детенышей помещали к заранее подготовленной кормилице. Через 8-14 дней после рождения у мышат брали образец ткани, выделяли ДНК и анализировали наличие трансгена методом ПЦР.
7. Анализ наличия трансгена в геноме мышей производили методом секвенирования ПЦР-фрагмента. ДНК для ПЦР выделяли из тканей по стандартному протоколу:
1) Добавить в эппендорф с образцом ткани 200 mkl лизирующего буфера (pH 12.0);
2) Инкубировать при температуре 95°, 2 часа (50°, 12-18 часов);
3) Очистить ДНК из полученного лизата фенол-хлороформом;
4) Измерить концентрацию очищенной ДНК на спектрофотометре.
Амплификацию фрагментов ДНК проводили с помощью набора Мастер-микс DreamTaq™ Hot Start PCR в присутствии 10 мкМ праймеров grin2a-seq (for+rev):
1. Master Mix= 10 мкл
2. Праймеры (смесь, 10 мкМ)= 1 мкл
3. ДНК= 1 мкл
4. Деионизированная вода = 8 мкл
Проведение ПЦР:
1. Денатурация 95°С - 3’
2. 95°С - 30 ’’
3. 57°С - 30’’
4. 72°С - 30’’
5. Go to step 3 38X
6. Синтез 72° - 5’
7. Infinite Hold 4°
Протокол секвенирования:
1. После прохождения реакции ПЦР проведён электрофорез в 1% агарозном геле, объем лунок 20 мкл, использован буфер TAE (x1). В первую и последнюю лунку геля добавлены по 15 мкл ДНК-маркера 1 kb;
2. После электрофореза стерильным скальпелем вырезана полоса нужного размера и помещена в заранее подготовленный и пронумерованный чистый эппендорф (1,5 мкл);
3. Выделен продукт ПЦР из 1% геля с помощью набора QiaGen по инструкции производителя. На последнем этапе проведена элюция в 20-30 мкл элюирующего буфера или деионизированной воды (mQ);
4. Измерить концентрацию полученного продукта на спектрофотометре. Для секвенирования подходит очищенная ДНК с концентрацией больше 20 нг/мкл (мкг/мл);
5. Полученный продукт секвенировали в компании Евроген. С использованием праймера grin2a-seq.
Полученные сиквенсы можно подразделить на три категории: сиквенсы дикого типа, последовательность в которых соответствует дикому типу, двоящиеся сиквенсы, соответствующие мозаичным животным F0 или гетерозиготным самкам следующих поколений, и сиквенсы, на которых присутствует только мутантный вариант ДНК, соответствующие трансгенным самцам и гомозиготным трансгенным самкам.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение
науки Институт биологии гена Российской академии
наук (Institute of Gene Biology Russian Academy
of Sciences)
<120> Способ получения линии гуманизированных мышей,
содержащих инсерцию 3974insT в гене mGrin2a (mice
glutamate [NMDA] receptor subunit epsilon-1),
приводящую к преждевременному прекращению трансляции
белка grin2a
<160> 7
<210> 1
<211> 4396
<212> ДНК
<213> artificial sequence
<220>
<223> Последовательность мышиного гена GRIN2A с мутацией
3974insT
<400> 1
atg ggc aga ctg ggc tac tgg acc ttg ctg gta ttg ccg gcc ctt ctg gtc tgg cac ggt 60
ccg gcg cag aac gcg gcg gcg gag aag ggt act cca gcg ctg aac att gcg gtg ctg ctg 120
ggt cac agc cac gac gtg aca gaa cgc gaa ctt cga aat ctg tgg ggc ccg gag cag gca 180
acc ggc ttg ccc ctg gat gtg aac gtg gtg gcg tta ttg atg aac cgc act gac cct aag 240
agc ctc atc acg cat gtg tgc gac ctc atg tcc ggg gcg cgc atc cat ggc ttg gtg ttt 300
gga gat gat acg gac caa gag gct gtg gct cag atg ctg gat ttt atc tcc tca cag act 360
ttc atc ccc atc ttg ggc att cat ggg ggt gca tct atg atc atg gct gac aag gat ccg 420
aca tcc acg ttc ttc cag ttt gga gct tcc atc cag cag caa gcc acg gtc atg ctg aag 480
atc atg cag gac tat gac tgg cat gtc ttc tcc ttg gtc acc acc atc ttc cct ggc tac 540
aga gac ttc atc agc ttc atc aag aca aca gtg gac aac agc ttt gtg ggc tgg gat atg 600
cag aac gtg atc aca ctg gac acc tct ttt gag gac gcc aag aca cag gtc cag ctg aag 660
aag atc cac tcc tct gtc atc ctg ctc tac tgc tcc aag gat gag gct gtc ctc atc ctg 720
agc gag gct cgc tct ctt ggc ctc acc ggc tac gat ttc ttc tgg att gtc ccc agt ttg 780
gtc tcc ggg aac aca gag ctc atc ccc aaa gag ttt cca tcg ggt ctc att tca gtc tct 840
tac gac gac tgg gac tac agt ctg gag gca aga gtg aga gac ggt ctt ggg atc tta acc 900
act gcc gca tct tcc atg ttg gag aaa ttc tcc tac att ccc gag gcc aag gcc agc tgc 960
tac ggg cag aca gag aag ccg gag acc ccg cta cac act ctg cac caa ttt atg gtc aat 1020
gtg act tgg gat ggc aag gac ttg tcc ttc act gag gaa ggc tat cag gtg cac ccc agg 1080
ctt gtg gtg atc gtg ctg aat aag gac cgg gaa tgg gaa aag gtg ggc aag tgg gag aat 1140
cag act ctg agc ctg cgg cat gct gtg tgg cca agg tat aag tcc ttt tct gac tgt gag 1200
cca gat gac aac cac ctc agc att gtc acc ttg gag gaa gcc ccc ttc gtc atc gta gaa 1260
gac ata gac cca ctg act gag acc tgc gtc agg aac acg gta ccc tgt cgg aag ttt gtc 1320
aag atc aac aat tca acc aac gaa ggg atg aat gtg aag aag tgc tgc aag ggg ttc tgc 1380
atc gac atc ctt aag aaa ctg tcc aga act gta aag ttc acc tat gac ctc tac ctg gtg 1440
acc aat ggg aag cat ggg aaa aag gtt aac aat gtg tgg aat gga atg ata ggc gaa gtg 1500
gtc tat caa cga gca gtt atg gcc gtg ggc tcc ctc acc atc aat gag gag cgt tca gaa 1560
gtg gtg gac ttc tcc gtg ccc ttt gtg gag aca gga atc agt gtc atg gtc tcc agg agt 1620
aat ggc act gtt tcc cct tct gct ttc ctt gaa ccc ttc agc gcc tct gtc tgg gtg atg 1680
atg ttc gtg atg ctg ctc att gtc tct gcc att gct gtc ttc gtt ttt gaa tac ttc agt 1740
cct gtt gga tac aac aga aac tta gcc aaa ggg aaa gct ccc cat ggg cct tct ttt acc 1800
att gga aaa gct ata tgg ctc ctc tgg ggc ctg gtc ttc aac aat tct gtg ccc gtc cag 1860
aat cct aaa ggc aca acc agc aag ata atg gta tca gtg tgg gcc ttc ttt gcc gtc atc 1920
ttc ctt gca agt tac aca gcc aac ctg gct gcc ttc atg atc cag gag gag ttt gtg gac 1980
caa gtg act ggc ctc agt gac aag aag ttc cag aga cct cat gac tat tct ccg cct ttc 2040
cga ttt ggg aca gta ccc aat gga agt aca gaa agg aat att cgt aac aac tac ccc tat 2100
atg cac cag tac atg acc aaa ttc aac cag agg ggc gta gag gat gcc ttg gtc agc ttg 2160
aaa act ggg aag ttg gac gct ttc atc tat gac gca gct gtc ttg aac tac aag gcc ggg 2220
agg gat gaa ggc tgt aaa ctg gtg acc att ggg agc ggg tac atc ttt gcc acc aca ggc 2280
tat gga att gct ctg cag aag ggc tca ccc tgg aag agg cag att gac ctc gct ctg ctc 2340
cag ttt gtt ggt gac ggt gag atg gaa gag ctg gag aca ctg tgg ctt acg ggc atc tgc 2400
cac aac gag aag aat gag gtg atg agc agc cag ctg gac atc gac aac atg gca gga gtt 2460
ttc tac atg ctg gct gca gct atg gcc ctc agc ctc atc acc ttc atc tgg gag cac ctc 2520
ttc tac tgg aag ctg cgc ttc tgc ttc aca ggc gtg tgt tct gac cgg ccc ggg ctg ctc 2580
ttc tcc atc agc agg ggc atc tac agt tgc atc cat gga gtg cac att gaa gaa aag aag 2640
aag tct cca gac ttc aat ctg act ggg tca cag agc aac atg cta aag ctt ctc cgc tca 2700
gct aaa aac atc tcc aac atg tcc aac atg aac tcc tcg cga atg gac tca ccc aaa aga 2760
gct gct gac ttc atc caa aga ggc tca ctt att gtg gac atg gtt tca gac aag gga aat 2820
ttg ata tac tca gat aac agg tcc ttt caa ggg aag gac agt ata ttt gga gaa aac atg 2880
aat gaa ctg caa aca ttt gtg gcc aac agg cac aag gat agt ctc agt aac tat gtg ttt 2940
cag gga cag cat cct ctc act ctc aat gag tcc aac ccc aac aca gtg gag gtg gct gtc 3000
agc act gaa tcc aaa ggg aac tcc cga ccc cgg cag ctt tgg aag aaa tcc atg gag tct 3060
cta cgc cag gat tct cta aac cag aac cca gtc tcc cag agg gat gag aag act gca gag 3120
aat agg acc cac tcc cta aag agt cct agg tat ctt cca gaa gag gta gcc cat tct gac 3180
att tct gaa acc tca agc cgg gcc aca tgc cac agg gag cca gat aat aat aag aac cac 3240
aag acc aag gat aac ttc aaa agg tca atg gcc tct aaa tac ccc aag gac tgt agt gag 3300
gtt gaa cgt acc tac gtg aaa acc aaa gca agt tct ccc agg gat aag atc tac acc atc 3360
gat ggt gag aag gag ccc agc ttc cac tta gat cct cca cag ttc att gaa aac ata gtc 3420
ttg cct gag aat gtg gac ttc cca gat acc tac caa gat cac aat gag aat ttc cgc aag 3480
ggg gac tcc aca ctg ccc atg aac agg aac cca cta cac aat gaa gat ggg ctt ccc aac 3540
aat gac cag tat aaa ctc tat gcc aag cac ttt acc ttg aaa gac aag ggt tcc cca cat 3600
agt gag ggc agt gat cga tat cgg cag aac tcc acg cat tgc aga agc tgc ctc tca aac 3654
ctg ccc acc tac tca ggc cac ttt acc atg aga tct cct ttc aag tgt gat gcc tgt ctg 3714
cgg atg ggg aac ctc tat gac att gat gaa gac cag atg ctt cag gag aca ggc aac cca 3774
gct act cgt gag gag gcc tac cag cag gac tgg tca cag aac aac gcc ctc cag ttc cag 3834
aag aac aag cta aag att aat cga cag cac tcc tat gat aac att ctc gac aaa ccc agg 3894
gag ata gac ctt agc agg ccc tct cgt agc ata agc ctc aag gac agg gaa agg cta ctg 3954
gag ggc aac tta ata cgg gag cct gtt cag tgt ccc ctc aag caa act ctt ggg gaa caa 4014
aag ctc cct ttt ccc cca agg tct gga gga cag caa gag gag caa atc tct ctt gcc aga 4074
cca tac ctc tga taa tcc ttt cct cca cac gta cgg gga tga cca acg ctt agt tat tgg 4134
gag atg tcc ctc gga ccc tta caa aca ctc att gcc atc aca ggc agt aaa tga cag cta 4194
tct tcg gtc atc ctt gag gtc aac agc atc ata ttg ctc cag gga cag tcg ggg cca cag 4254
tga tgt gta tat ttc aga gca tgt tat gcc tta tgc tgc aaa taa gaa taa cat gta ctc 4314
tac ccc cag ggt ttt aaa ttc ctg cag caa tag acg tgt gta caa gaa aat gcc tag tat 4374
tga atc tga tgt cta a 4396
<210> 2
<211> 24
<212> ДНК
<213> Mus musculus
<220>
<223> сгРНК против mGrin2a
<400> 2
tactggaggg caacttatta cggg 24
<210> 3
<211> 26
<212> ДНК
<213> artificial sequence
<220>
<223> sgGRIN2A-f олигонуклеотид для синтеза
последовательности сгРНК
<400> 3
caccgtactg gagggcaact tattac 26
<210> 4
<211> 26
<212> ДНК
<213> artificial sequence
<220>
<223> sgGRIN2A-r олигонуклеотид для синтеза
последовательности сгРНК
<400> 4
aaacgtaata agttgccctc cagtac 26
<210> 5
<211> 23
<212> ДНК
<213> Home sapiens, artificial sequence
<220>
<223> U6-f праймер для проверки конструкции
<400> 5
gagggcctat ttcccatgat tcc 23
<210> 6
<211> 27
<212> ДНК
<213> artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-f олигонуклеотид для генотипирования
<400> 6
cactccagtg tctgctgttg atgtatg 27
<210> 7
<211> 27
<212> ДНК
<213> artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-r олигонуклеотид для генотипирования
<400> 7
acgtgtggag gaaaggatta tcagagg 27
<---
Claims (11)
1. Плазмидная конструкция px330+GRIN2Asg для получения трансгенных мышей, полученная на основе вектора px330 и экспрессирующая сгРНК с последовательностью SEQ ID NO: 2 против фрагмента последовательности 14 экзона гена grin2a под контролем U6 промотора и ОРС гена spCas9 под контролем CAG промотора.
2. Линия мышей для моделирования синдрома афазии-эпилепсии, полученная путем трансформации мышей CBA×C57BL/6 плазмидной конструкцией по п.1, содержащая в гене grin2a инсерцию 3974insT и несущая последовательность SEQ ID NO: 1.
3. Способ получения линии мышей по п.2, содержащих инсерцию 3974insT в гене grin2a, созданную с использованием плазмидной конструкции по п.1, характеризующийся следующими стадиями:
а) микроинъекция конструкции px330+GRIN2Asg из п.1 в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыши гибрида F1 CBA×C57BL/6;
б) выявление жизнеспособных зигот;
в) пересадка выживших зигот из стадии (б) псевдобеременным самкам-реципиентам, имеющим копулятивную пробку после ссаживания с вазэктомированными самцами;
г) получение новорожденных мышей на 19 день после пересадки зигот из стадии (в);
д) проведение анализа наличия мутации через 8-14 дней после рождения мышей (г), путем амплификации целевого участка гена grin2a с праймерами SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 с последующим секвенированием фрагмента;
е) отбор мышей, несущих целевую мутацию;
ж) проведение скрещивания мышей из стадии (е) с мышами дикого типа для получения самок-гетерозигот или мутантных самцов, несущих целевую мутацию.
з) проведение скрещивания мышей из стадии (ж) для получения итоговой линии мышей, несущих инсерцию 3974insT в гене grin2a.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021110493A RU2764650C1 (ru) | 2021-04-14 | 2021-04-14 | Способ получения линии гуманизированных мышей, содержащих инсерцию 3974insT в гене mGrin2a (mice glutamate [NMDA] receptor subunit epsilon-1), приводящую к преждевременному прекращению трансляции белка grin2a |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021110493A RU2764650C1 (ru) | 2021-04-14 | 2021-04-14 | Способ получения линии гуманизированных мышей, содержащих инсерцию 3974insT в гене mGrin2a (mice glutamate [NMDA] receptor subunit epsilon-1), приводящую к преждевременному прекращению трансляции белка grin2a |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2764650C1 true RU2764650C1 (ru) | 2022-01-19 |
Family
ID=80040189
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021110493A RU2764650C1 (ru) | 2021-04-14 | 2021-04-14 | Способ получения линии гуманизированных мышей, содержащих инсерцию 3974insT в гене mGrin2a (mice glutamate [NMDA] receptor subunit epsilon-1), приводящую к преждевременному прекращению трансляции белка grin2a |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2764650C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2805173C1 (ru) * | 2022-09-08 | 2023-10-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) | Способ получения генно-модифицированных лабораторных животных с нуль-аллелем гена P2rx3 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5502166A (en) * | 1992-02-26 | 1996-03-26 | Mitsubishi Chemical Corporation | NMDH receptor proteins and genes encoding the same |
-
2021
- 2021-04-14 RU RU2021110493A patent/RU2764650C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5502166A (en) * | 1992-02-26 | 1996-03-26 | Mitsubishi Chemical Corporation | NMDH receptor proteins and genes encoding the same |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| KENJI SAKIMURA et al., Reduced hippocampal LTP and spatial learning in mice lacking NMDA receptor ε1 subunit, 1995, Nature, vol.373, pp.151-155. * |
| MANAL SALMI et al., Impaired vocal communication, sleep‐related discharges, and transient alteration of slow‐wave sleep in developing mice lackingthe GluN2A subunit of N‐methyl‐d‐aspartate receptors, Epilepsia, 2019, Vol.60, pp.1424-1437. * |
| MANAL SALMI et al., Impaired vocal communication, sleep‐related discharges, and transient alteration of slow‐wave sleep in developing mice lackingthe GluN2A subunit of N‐methyl‐d‐aspartate receptors, Epilepsia, 2019, Vol.60, pp.1424-1437. KENJI SAKIMURA et al., Reduced hippocampal LTP and spatial learning in mice lacking NMDA receptor ε1 subunit, 1995, Nature, vol.373, pp.151-155. * |
| VLADISLAV A. KALMYKOV et al., New personalized genetic mouse model of LeschNyhan syndrome for pharmacology and gene therapy, Research Results in Pharmacology, 2018, 4(4), pp. 115-122. * |
| VLADISLAV A. KALMYKOV et al., New personalized genetic mouse model of LeschNyhan syndrome for pharmacology and gene therapy, Research Results in Pharmacology, 2018, 4(4), pp. 115-122. ДИМИТРИЕВА Т. В. и др., Модификация метода анализа результатов редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9 на предимплантационных эмбрионах мыши, ВЕСТНИК РГМУ, 2016, 3. * |
| ДИМИТРИЕВА Т. В. и др., Модификация метода анализа результатов редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9 на предимплантационных эмбрионах мыши, ВЕСТНИК РГМУ, 2016, 3. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2805173C1 (ru) * | 2022-09-08 | 2023-10-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) | Способ получения генно-модифицированных лабораторных животных с нуль-аллелем гена P2rx3 |
| RU2815936C1 (ru) * | 2023-10-31 | 2024-03-25 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) | Способ получения мышиной модели для изучения миодистрофии Дюшенна и вариантов ее терапии |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108660161B (zh) | 基于CRISPR/Cas9技术的制备无嵌合基因敲除动物的方法 | |
| Harel et al. | Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish | |
| Reik et al. | Genomic imprinting determines methylation of parental alleles in transgenic mice | |
| Schmitt et al. | Engineering Xenopus embryos for phenotypic drug discovery screening | |
| US20170152526A1 (en) | Engineering of humanized car t-cell and platelets by genetic complementation | |
| CN106459951A (zh) | 驯养的大型动物的受精卵中的靶向基因组编辑 | |
| JP2017513510A (ja) | ブタにおける多重遺伝子編集 | |
| BR112019025717A2 (pt) | método para produzir célula eucariótica de dna editado e kit usado no mesmo | |
| AU2016344152A1 (en) | Compositions and methods for chimeric embryo-assisted organ production | |
| KR20180090988A (ko) | 증가된 내열성을 갖는 유전자 변형 동물 | |
| KR20210070265A (ko) | 불임 자손을 생성하는 방법 | |
| Yu | New personalized genetic mouse model of Lesch-Nyhan syndrome for pharmacology and gene therapy | |
| US20240052304A1 (en) | Sterile avian embryos, production and uses thereof | |
| US20210037797A1 (en) | Inducible disease models methods of making them and use in tissue complementation | |
| CN111118062B (zh) | Polβ过表达质粒、细胞模型及其在抗卵巢衰老药物中的应用 | |
| RU2768048C1 (ru) | Способ получения мышиной модели для изучения синдрома Леша-Нихена путем внесения делеции p.Val8del в ген hprt1 | |
| CN110195057B (zh) | Hr基因经遗传修饰的非人动物或其子代的制备方法及应用 | |
| RU2764650C1 (ru) | Способ получения линии гуманизированных мышей, содержащих инсерцию 3974insT в гене mGrin2a (mice glutamate [NMDA] receptor subunit epsilon-1), приводящую к преждевременному прекращению трансляции белка grin2a | |
| Ghassemi et al. | Pipeline for the generation of gene knockout mice using dual sgRNA CRISPR/Cas9-mediated gene editing | |
| CN107105634A (zh) | 肿瘤抑制基因的杂合修饰和1型神经纤维瘤病的猪模型 | |
| US11732273B2 (en) | Methods and compositions for in situ germline genome engineering | |
| Delhotal | Characterization of NHLRC2 gene-edited mice: a model for bovine developmental duplications | |
| WO2024090563A1 (ja) | 遺伝子発現用核酸、遺伝子発現ベクター、遺伝子発現ベクターの製造方法および遺伝子発現方法 | |
| WO2024092216A2 (en) | Methods and compositions regarding modulation of poultry genes | |
| Totorikaguena et al. | CRISPR/Cas9 as a Simple Technique for the Generation of Murine Knockout Models for Neuropsychiatric Diseases |