JP2017513510A - ブタにおける多重遺伝子編集 - Google Patents

Abstract

細胞における多重遺伝子編集を行うための材料および方法が提示される。さらに、方法はそれを作製する動物および方法を含む。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１４年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／９８５，３２７号明細書（ここで参照により本明細書中に援用される）に対する優先権を主張する。

本技術分野は、複数の部位での遺伝子編集、脊椎動物細胞内での複数の遺伝子編集、およびその使用に関する。

細胞、およびかかる細胞から作製された動物に対する遺伝子改変は、遺伝子の発現を改変するのに有用である。遺伝子操作の分野は極めて盛んである。

大型脊椎動物を単一世代にてそれらの遺伝暗号に対して複数の変化を有するように作製する場合、非常に有用となる。本明細書で開示されるとき、同作製は、細胞または胚における複数の遺伝子を同時に編集することによって可能である。複数の遺伝子が、脊椎動物の細胞または胚において標的化ヌクレアーゼおよび相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型を用いて編集するため、標的化され得る。これらの細胞または胚は、研究用に、または全動物を作製するため、用いることができる。複数の編集は、例えば繁殖または遺伝子操作改変を順次行うことにより、単一世代にて実施可能でも、それ以外では行うことができない。

２つのノックアウトについてホモ接合性の動物を単一の編集を用いて作製するための方法を示す。 単一の編集を同時に行うことによる複数の編集を用いて動物を作製する仮定上の方法を示す。 Ｆ０世代のファウンダーを樹立するために用いられる多重遺伝子編集を示す。 ブタＲＡＧ２およびＩＬ２Ｒγの多重遺伝子編集。パネルａ）遺伝子導入後３日目の細胞集団に対する非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同依存性修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｐａｉｒ）ＨＤＲの効率を判定するためのＳｕｒｖｅｙｏｒおよびＲＦＬＰ分析。パネルｂ）遺伝子導入後１１日目の細胞集団に対する相同組換え修復についてのＲＦＬＰ分析。パネルｃ）ＩＬ２Ｒγ、ＲＡＧ２または双方でのＨＤＲが陽性であるコロニーの百分率。細胞は、パネルａの「Ｃ］で表示される集団から蒔かれた。パネルｄ）ＩＬ２ＲγおよびＲＡＧ２に対して２μｇおよび１μｇの量のＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡならびに各々に対して１μＭのＨＤＲ鋳型が遺伝子導入された細胞からのコロニー分析。コロニー遺伝子型の分布が下方に示される。 ブタＡＰＣおよびｐ５３の多重遺伝子編集。パネルａ）遺伝子導入後３日目の細胞集団に対する非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同依存性修復ＨＤＲの効率を判定するためのＳｕｒｖｅｙｏｒおよびＲＦＬＰ分析。パネルｂ）遺伝子導入後１１日目の細胞集団に対する相同組換え修復についてのＲＦＬＰ分析。パネルｃおよびｄ）表示される細胞集団（パネルａの「Ｃ」および「Ｄ」で表示される）に由来する、ＡＰＣ、ｐ５３または双方でのＨＤＲが陽性のコロニーの百分率。３以上のＨＤＲ対立遺伝子を有するコロニーが下方に列挙される。 ５遺伝子多重ＨＤＲ効率に対するオリゴヌクレオチドＨＤＲ鋳型濃度の効果。ブタＲＡＧ２、ＩＬ２Ｒｇ、ｐ５３、ＡＰＣおよびＬＤＬＲに特異的な表示量のＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡが、２ｕＭ（パネルａ）または１ｕＭ（パネルｂ）の各々の同族ＨＤＲ鋳型とともにブタ線維芽細胞に同時遺伝子導入された。パーセントＮＨＥＪおよびＨＤＲは、ＳｕｒｖｅｙｏｒおよびＲＦＬＰアッセイにより測定された。 ５遺伝子多重ＨＤＲ効率に対するオリゴヌクレオチドＨＤＲ鋳型濃度の効果についての実験データのプロットを示す、５遺伝子多重データセットである。ブタＲＡＧ２、ＩＬ２Ｒｇ、ｐ５３、ＡＰＣおよびＬＤＬＲに特異的な表示量のＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡが、２ｕＭ（パネルａ）または１ｕＭ（パネルｂ）の各々の同族ＨＤＲ鋳型とともにブタ線維芽細胞に同時遺伝子導入された。パーセントＮＨＥＪおよびＨＤＲは、ＳｕｒｖｅｙｏｒおよびＲＦＬＰアッセイにより測定された。（５遺伝子多重ＨＤＲからのコロニー遺伝子型）コロニー遺伝子型はＲＦＬＰ分析により評価された。パネルａ）各ラインは、各々の特定の遺伝子座での１つのコロニーの遺伝子型を表す。３つの遺伝子型、すなわち、ヘテロ接合性またはホモ接合性ＨＤＲの想定されるＲＦＬＰ遺伝子型を有するもの、ならびにＲＦＬＰ陽性断片とともに挿入または欠失（インデル）対立遺伝子を示すサイズ的に可視的変化を有する第２の対立遺伝子を有するものが同定され得る。特定の遺伝子座に編集を有するコロニーの百分率は、各カラムの下部に示される。パネルｂ）０〜５の遺伝子座で編集されたコロニーの総数。 ５遺伝子多重ＨＤＲ効率に対するオリゴヌクレオチドＨＤＲ鋳型濃度の効果を含む、第２の実験における実験データのプロットを示す別の５遺伝子多重データセットである。第２の５遺伝子多重試験でのコロニー遺伝子型。パネルａ）各ラインは、各々の特定の遺伝子座での１つのコロニー遺伝子型を表す。３つの遺伝子型、すなわち、ヘテロ接合性またはホモ接合性ＨＤＲの想定されるＲＦＬＰ遺伝子型を有するもの、ならびにＲＦＬＰ陽性断片とともに挿入または欠失（インデル）対立遺伝子を示すサイズ的に可視的変化を有する第２の対立遺伝子を有するものが同定され得る。特定の遺伝子座に編集を有するコロニーの百分率は、各カラムの下部に示される。パネルｂ）０〜５の遺伝子座で編集されたコロニーの総数。 コロニー遺伝子型を示す別の５遺伝子多重試験データセットである。パネルａ）各ラインは、各々の特定の遺伝子座での１つのコロニーの遺伝子型を表す。３つの遺伝子型、すなわち、ヘテロ接合性またはホモ接合性ＨＤＲの想定されるＲＦＬＰ遺伝子型を有するもの、ならびにＲＦＬＰ陽性断片とともに挿入または欠失（インデル）対立遺伝子を示すサイズ的に可視的変化を有する第２の対立遺伝子を有するものが同定され得る。特定の遺伝子座に編集を有するコロニーの百分率は、各カラムの下部に示される。パネルｂ）０〜５の遺伝子座で編集されたコロニーの総数。 所望される遺伝子ノックアウトまたは対立遺伝子の選択をもたらす標的化ヌクレアーゼを用いてＦ０世代キメラを作製する方法を示す。 正常な表現型を有するＦ０世代動物ならびに高度虚弱（ＦＴＴ）表現型および遺伝子型を有する子孫の樹立を示す。 ドナー胚の遺伝的性質を有する配偶子とのキメラ動物を作製するための方法を示す。 ＮＫＸ−２、ＧＡＴＡ４、およびＭＥＳＰ１の３つの標的化遺伝子座での多重編集を示す。パネルａ）は実験の模式図であり、パネルｂ）は、配列番号１〜３として各々列挙されるＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４、およびＭＥＳＰ１の場合での遺伝子の標的化を示す。パネルｃ）実験におけるアッセイの結果を示す。各標的遺伝子に対するオリゴ配列。新規なヌクレオチドは大文字で表される。ＰＴＣはボックス状の明色文字で表され、新規なＨｉｎｄＩＩＩ ＲＦＬＰ部位は下線が引かれる。 ＴＡＬＥＮおよびＲＧＥＮの組み合わせを用いる多重遺伝子編集を示し、ＲＦＬＰによって評価される遺伝子導入細胞のアッセイにより、両方の部位でのＨＤＲが明示された。

多重遺伝子編集のための方法が記載される。複数の遺伝子は、研究用または全動物の作製に使用可能な細胞または胚にて改変され得る。他の実施形態は、宿主微小環境の選択的過疎による細胞または器官の欠損の補完を含む。これらの発明は、産業や医療における細胞および無細胞産物のモデルや食物として、また供給源として機能するような動物の迅速な作出を提供する。

図１Ａは、２つの編集された対立遺伝子のみを有する家畜を作製するのに単一の編集を用いて数年かかる（同期間はウシにおいて約６年である）理由を図示するタイムラインを有する。この文脈において、編集は、遺伝子を選択し、それを改変することを指す。まず、目的の遺伝子は、標的化ＫＯを伴うヘテロ接合性の子ウシを作出するためにクローン化される培養体細胞内で編集され、例えばノックアウト（ＫＯ）される必要がある。ヘテロ接合体であれば、第一世代（Ｆ１）の雄および雌のヘテロ接合性子ウシを作製するため、繁殖のために成熟期（ウシの場合で約２歳）まで飼育され、その場合、ホモ接合性ノックアウト子ウシ（Ｆ２）を作製するため、互いに繁殖させられる。ウシにおける従来手法を用いて複数の標的化突然変異に関連したホモ接合体を作製するとしたら、非実用的なものとなる。図１Ｂに図示される通り、さらなる編集を行うのに必要とされる年数および必要とされる動物数は、用いられる特定のスキームに応じて、ほぼ指数関数的に増加する。にもかかわらず、脊椎動物の中で、たとえ１世代あたりより多くの子孫を有しかつウシよりも短い妊娠期間を有する動物であっても、複数の編集を達成するには過剰に長い期間を要することになる。例えばブタは、１回の交配あたりより多くの子孫とウシの場合の約半分の妊娠期間とを有するが、複数の編集を行うための期間は長年を必要とし得る。さらに、積極的な近親交配で時間を最小化するスキームは、複数の編集にとって妥当でない可能性がある。また、連続クローニングは、方法およびアウトカムの立場から、特に動物が家畜または実験モデルとして有用とされる場合には望ましくない。

本発明によって提示される機会は図２に図示され、それは複数の編集が第一世代動物（Ｆ０）で行われていることを示す。胚は、直接的に、またはヘテロ接合体もしくはホモ接合体であるように独立に選択された２つ以上の編集を伴うクローニングにより調製され、懐胎するように代理雌に移される。得られた動物はＦ０世代ファウンダーである。複数の胚を調製し、両方の性別の子孫を産むように１つ以上の代理に移してもよく、または複数のクローン胚を作製するため、胚分割に関する周知の技術を用いてもよい。典型的には両方の性別を有する同腹仔を産むブタなどの家畜を交雑させ、増殖させてもよい。

複数の対立遺伝子は、破壊され得るか、またはそれ以外では、細胞または胚において標的化エンドヌクレアーゼおよび相同組換え修復（ＨＤＲ）を用いて本明細書に記載のように編集され得る。実施形態は、脊椎動物の細胞または胚における複数の標的染色体ＤＮＡ部位で遺伝子編集を行う方法であって、脊椎動物の細胞または胚に、第１の標的染色体ＤＮＡ部位に特異的な第１の標的化エンドヌクレアーゼおよび第１の標的部位配列に相同な第１の相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型；ならびに第２の標的染色体ＤＮＡ部位に特異的な第２の標的化エンドヌクレアーゼおよび第２の標的部位配列に相同な第２のＨＤＲ鋳型を導入するステップを含み、第１のＨＤＲ鋳型配列は第１の標的部位で天然染色体ＤＮＡ配列を置換し、かつ第２のＨＤＲ鋳型配列は第２の標的部位配列で天然染色体ＤＮＡ配列を置換する、方法である。

ノックアウトまたは置換などの複数の編集が得られ得ることを知ることは、意外な驚くべき予測不能な結果であった。１つの学説的な機構は、細胞周期内のある特定のステージであることが理由で、複数の編集に受容性がある細胞が少数存在することである。それらは、エンドヌクレアーゼおよびＨＤＲ鋳型に曝露される場合、容易に応答する。操作に関する理論は、１つの標的化部位における細胞修復機構の活性化が、他の部位でも同様に修復すなわちＨＤＲ鋳型を支持することから、ＨＤＲ鋳型による方法が複数の置換に適合するということである。ＨＤＲは、複数のＨＤＲ編集が明らかに試行、観察、または認識されることがなく、歴史的には低効率な方法とされてきた。

本明細書中の結果は、過多または過少のエンドヌクレアーゼおよび／またはＨＤＲ鋳型が負の効果を有し得、それがこの領域における先行研究に混乱を来し得ることを示す。事実、本発明者らは、標的化エンドヌクレアーゼが、正確に設計し、作製することができるにもかかわらず、過度に効率的であることから奏功しないことを認めている。さらに、巧みに改変された細胞の集団は、長期的に改善しないことが多い。細胞を改変する当業者は通常、細胞の寿命および改変を、巧みなクローン化または他の使用における安定性および健全性の指標として追及する。しかしその期待は、本明細書中の多重化方法において有用でなかったことが多い。さらに、本発明者らは、相同組換え（ＨＲ）の遺伝子移入効率が多重化手法において単一遺伝子座の遺伝子移入と比べて変動することを認めている。一部の遺伝子座は非常に感受性が高かったが、それ以外は効率が極めて低かった。エンドヌクレアーゼ間で明らかに干渉が認められるが、正味の効果を、例えばエンドヌクレアーゼが共通の資源を求めて競合していると仮定することによって単純に説明することはできない。

多数の遺伝子を染色体ＤＮＡ中の複数の位置に無作為または不正確に挿入するか、または複数の遺伝子を破壊する多数のランダム編集を行うには、様々な周知の技法がある。明らかに、ランダムまたは不正確な方法は、効果を得ようと複数の特異的に標的化された遺伝子を編集する必要がある科学者を支援することを意図するものではない。したがって、本明細書で教示されるＨＤＲ方法は、編集によって容易に区別することができ、得られる生物は意図される標的部位に限って作製され得る。１つの違いは、本発明のＨＤＲ編集の実施形態が、余分な遺伝子コピーの挿入なしに、かつ／またはエンドヌクレアーゼによって標的化される以外の遺伝子の破壊なしに実施され得ることである。また、ＨＤＲ鋳型配列が適切な相同性を伴わない部位にコピーされないことから、特異的編集は１つの位置で行われる。実施形態は、外因性対立遺伝子が染色体ＤＮＡにその同族対立遺伝子の部位に限りコピーされる場合の生物および方法を含む。

ＨＤＲに基づく編集の利点は、編集が選択可能である点である。それに対し、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）法による他の試みでは、フレームシフトを生じさせることなくインデルが互いに打ち消し合うように、複数の位置にインデルを設けることができる。この問題は、多重化が関係する場合に顕著になる。しかし、ＨＤＲの巧みな使用により、必要に応じて標的遺伝子が意図されるフレームシフトを確実に有するように編集可能であることが示される。さらに、対立遺伝子置換は、ＨＤＲを必要とし、ＮＨＥＪ、核酸のベクター駆動による挿入、トランスポゾン挿入などにより達成することができない。さらに、望まれない編集を含まない生物を選択することは、さらに困難度を上げる。

しかし一般に、本明細書に記載の多重編集は、家畜または大型脊椎動物に関連した細胞または動物における標的化部位で先行的に達成されていないと考えられている。高継代細胞からの動物のクローン化により、実験モデルまたは家畜のＦ０ファウンダーとして有用でない程度に遺伝子損傷が大きい動物が作出されることは周知である。

また、遺伝子編集は確率過程であり、結果として、同分野では、巧みに編集されている数パーセントの細胞を同定するような様々なスクリーニング技術を伝統的に重視している。それが確率過程であることから、複数の編集を行う困難さが、意図される編集の数が増加するにつれて指数関数的に増えることが当業者によって想定され得る。

本発明の実施形態は、単細胞または胚において複数の標的化遺伝子ノックアウトまたは他の編集を作出するための方法、つまり本明細書中で多重遺伝子ノックアウトまたは編集と称される方法を提供する。標的化遺伝子という用語は、エンドヌクレアーゼ系、例えばＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲの設計による、エンドヌクレアーゼの攻撃用に選択される染色体ＤＮＡの部位を指す。ノックアウト、不活化される、および破壊されるという用語は、標的化部位が、遺伝子発現産物が除去されるように改変されるか、または遺伝子の発現がもはや全体として動物に対する有意な影響を有しないように大幅に低減されることを意味するように、本明細書中で交換可能に用いられる。これらの用語は時として、遺伝子の役割を、その役割を本質的に排除することなく観察できる程度に低下させることを指すように他所で用いられる。

遺伝子編集は、同用語が本明細書で用いられるとき、遺伝子を選択し、それを改変することを指す。ランダム挿入、ジーントラップなどは遺伝子編集ではない。遺伝子編集の例として、標的化部位での、遺伝子ノックアウト、核酸の付加、核酸の除去、すべての機能の排除、対立遺伝子の遺伝子移入、ハイパーモルフィック変化、ハイポモルフィック変化、および１つ以上の対立遺伝子の置換が挙げられる。

対立遺伝子の置換は、内因性対立遺伝子を上回って外因性対立遺伝子をコピーする非減数分裂過程を指す。対立遺伝子の置換という用語は、インデルまたは場合によっては縮重置換を除く他の改変でない、天然対立遺伝子から外因性対立遺伝子への改変がなされることを意味する。縮重置換という用語は、コドン中の塩基がコードされるアミノ酸を改変することなく別の塩基に改変されることを意味する。縮重置換は、エクソン中またはイントロン中に存在するように選択してもよい。縮重置換についての１つの用途は、遺伝子移入配列の存在の簡易な試験のために制限部位を作出することである。内因性対立遺伝子はまた、本明細書で天然対立遺伝子と称される。遺伝子という用語は広義であり、機能的産物を作製するために発現される染色体ＤＮＡを指す。遺伝子は対立遺伝子を有する。遺伝子型は、２つの同一の対立遺伝子が特定の遺伝子座に存在する場合、ホモ接合性であり、２つの対立遺伝子が異なる場合、ヘテロ接合性である。対立遺伝子は、特定の染色体上の特定の位置に位置する遺伝子の他方の形態（１対の一方のメンバー）である。対立遺伝子は、特徴的な形質を決定する。対立遺伝子は、特徴的な形質を生じさせるそれらのＤＮＡ配列内の特定の位置（識別位置またはｂｐ）に塩基対（ｂｐ）差を有し、それらを相互に識別し、またこれらの識別位置は対立遺伝子マーカーとして機能する。対立遺伝子は、一般に説明されており、本明細書では識別位置に同じ塩基を有する場合に同一であると説明され、動物は天然に他の位置における他のｂｐに特定の変異を有する。当業者は通常、対立遺伝子を比較するとき、天然変異を受け入れる。正確に同一であるという用語は、ＤＮＡの整列化においてｂｐ差またはインデルが全くないことを意味するように本明細書で用いられる。

対立遺伝子の同一性に対する類似試験は、天然に認識されるものとしての外因性対立遺伝子の染色体ＤＮＡを有する改変生物において染色体ＤＮＡを整列させることである。外因性対立遺伝子は、１つ以上の対立遺伝子マーカーを有することになる。マーカーの上流および下流でのＤＮＡの整列化は、特定の距離において同一となる。所望される試験に応じて、この距離は、例えば１０〜４０００ｂｐであってもよい。ＨＤＲ鋳型が正確に同一である配列を作出することが想定され得る一方、鋳型面積の片側の塩基は、当然ながら、幾つかの天然変異を有することになる。当業者は通常、天然変異が存在しても対立遺伝子を識別する。当業者は、明示される境界（ｂｏｕｎｄｓ）の間のすべての範囲および値が検討されるとともに、以下の距離、すなわち、１５、２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、８００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、４０００のいずれかが上限または下限として利用可能であることを直ちに理解するであろう。

当業者はまた、遺伝子編集の結果である、対立遺伝子に対する遺伝子編集を有性生殖に対して識別することができる。対立遺伝子が対立遺伝子を混合するように性的に繁殖できない別種に由来する場合、それは平凡なことである。また、多数の編集が単純に天然に見出されることはない。編集はまた、対立遺伝子がある品種から次の品種に移される場合、たとえ別品種中に天然に見出される対立遺伝子を正確に複製する置換が行われる場合であっても容易に識別され得る。対立遺伝子は、ほぼ常時、ＤＮＡ上に安定に配置される。しかし、配偶子形成中の減数分裂は時折、雄および雌のＤＮＡで、クロスオーバーと称される事象である、対立遺伝子の交換を引き起こす。クロスオーバー頻度および遺伝学的地図は、広範に研究され、開発されている。家畜の場合、動物の家系は、多世代にわたり極めて詳細に追跡され得る。遺伝学では、センチモルガン（ｃＭ、図単位（ｍ．ｕ．）とも称される）は、遺伝連鎖を評価する単位である。それは、単一世代での染色体クロスオーバーに介在する想定される平均数が０．０１である場合の染色体位置（遺伝子座または遺伝子座のマーカー）間の距離と定義される。相互に近縁の遺伝子は、染色体に対して相互に遠縁の遺伝子と比べてより低いクロスオーバー率を有する。２つの遺伝子が染色体上で相互に隣接する場合、クロスオーバーは極めて希少な事象である。単一の対立遺伝子のその２つの隣接する対立遺伝子に対するクロスオーバーの可能性が極めて低いことから、かかる事象は遺伝子操作の産物でなければならない。たとえ同じ品種の動物に関係する場合であっても、天然に対して操作される対立遺伝子置換は、両親が既知である場合、容易に判定され得る。また、親子関係は、潜在的な親の遺伝子型判定により、高精度に判定され得る。親判定は、ウシおよびヒトでは日常的である。

実施形態は、同時になされる多重遺伝子編集方法を含む。同時という用語は、連続ノックアウトまたは連続クローニングまたは動物繁殖の介在周期など、複数の編集を行うための細胞を複数回処理する仮定上の方法とは対照的である。同時は、例えば複数の標的化エンドヌクレアーゼが存在するなど、同時に有用な濃度で存在することを意味する。同方法は、すべての細胞または本質的にすべての細胞が編集された対立遺伝子またはノックアウトを有するような生物を作製するため、接合子および胚に適用され得る。本質的にすべての細胞は、例えばノックアウトとの関連では、遺伝子が、その遺伝子産物が生物の機能にとって無効であることから実用目的では不在であるように、多数の細胞から遺伝子をノックアウトすることを指す。同方法は、細胞、および胚内の細胞を、最小数の細胞分裂、好ましくは約０〜約２回の分裂にわたり改変する。実施形態は、迅速な方法または様々な回数にわたって行われる方法を含むか、あるいは細胞分裂の数、例えば０〜２０回の複製（細胞分裂）が検討される。当業者は、明示される制限内のすべての値および範囲、例えば、約０〜約２回の複製、約０〜約３回の複製、約４回以下の複製、約０〜約１０回の複製、１０〜１７回；約７日未満、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、もしくは約６日未満、約０．５〜約１８日などが検討されることを直ちに理解するであろう。低継代という用語は、約２０回以下の複製を経ている初代細胞を指す。

その他として、本発明者らは、ウシ胚およびブタ胚における母系性、父系性または双方の対立遺伝子が単一の胚内で編集され得ること、またそれ故に両方の対立遺伝子の鋳型編集が胚内でＨＤＲを用いて生じ得ることを示している。これらの編集は、同じ遺伝子座で行われた。詳細には、姉妹染色分体からの遺伝子移入が検出された。Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ４３（１０９）：１７３８２−１７３８７，２０１２を参照のこと。

実施例１（図３を参照）は、２つの遺伝子を直ちにノックアウトし、さらに両方のノックアウトについてホモ接合性であるかまたは各ノックアウトについてヘテロ接合性である細胞を選択できるように、ＨＤＲ編集を用いる試みが奏効した実験を説明する。選択するという用語は、さらなる使用のため、細胞を同定しかつ単離する能力を指すように用いられ、同方法において発現可能なレポーター遺伝子は全く存在せず、これはこの方法を多数の他の手法と区別する極めて有意な利点である。細胞は、第１の遺伝子（組換え活性化遺伝子２、ＲＡＧ２）および第２の遺伝子標的（インターロイキン受容体２、γ、ＩＬ２ＲｇまたはＩＬＲ２γ）に各々特異的な第１および第２の標的化エンドヌクレアーゼ（各々がＴＡＬＥＮペアである）を導入するように処理された。ＴＡＬＥＮは、目的部位を標的化するように設計し、適量で作製される必要があった。細胞の処理には５分未満を要した。エレクトロポレーションが用いられたが、本明細書に記載の多数の他の好適なタンパク質またはＤＮＡを導入する方法がある。次に、細胞は、各々が単一の処理細胞に由来し、個別の細胞のコロニーを形成するように培養された。様々なコロニー由来の細胞が、３日後または１１日後に試験された。ＲＡＧ２のノックアウトの比率はＩＬ２Ｒｇのノックアウトの比率よりも約６倍高かったが、明らかに一部の遺伝子はその他よりもノックアウトするのがより困難である。両方の遺伝子をノックアウトする効率は高く、両方のノックアウトについてヘテロ接合性またはホモ接合性の細胞の同定は奏功した。有意には、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡおよびＨＤＲ鋳型の用量は、特異的および非特異的効果を有した。ＩＬ２Ｒｇに対するＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡの増加は、ＩＬ２Ｒｇに対するＮＨＥＪおよびＨＤＲの双方の増加をもたらしたが、ＲＡＧ２に対するＮＨＥＪレベルは不変であった。ＩＬ２Ｒｇ ＨＤＲ鋳型の増加はＲＡＧ２遺伝子座でのＨＤＲを低下させたが、これはオリゴヌクレオチドの濃度の増大による相同組換え修復の非特異的阻害を示唆している。この用量感受性は、特にこれらの低用量では、おそらく他方を多重方法の追及から除外する方に導いている。実施例１からの細胞はクローン化されており、出願時には、２つの動物がそれに由来する胚で妊娠している。

実施例２（図４を参照）は、多重ＨＤＲ編集での、異なる遺伝子であっても同じ目標を有した実験を説明する。第１の遺伝子標的は腺腫様多発結腸ポリープ（ＡＰＣ）であった。第２の遺伝子標的はｐ５３（ＴＰ５３遺伝子）であった。両方のノックアウトについてホモ接合性の細胞および両方のノックアウトについてヘテロ接合性の細胞が検出され、単離された。

実施例３（図５〜８を参照）は、２〜５の遺伝子をノックアウトするための多重ＨＤＲ編集を説明する。遺伝子型について試験される細胞コロニーの数が各実験につき７２〜１９２の範囲である場合の３つの実験が行われた。細胞は、遺伝子ＡＰＣ、ｐ５３、ＲＡＧ２、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、ＩＬ２Ｒｇ、キスペプチン受容体（ＫＩＳＳＲまたはＧＰＲ５４）、および真核生物翻訳開始因子４ＧＩ（ＥＩＦ４ＧＩ）の様々な組み合わせの多重ノックアウトについて処理された。遺伝子ＬＤＬＲは、一貫して改変に対して他の遺伝子よりも適しなかった。結果から明らかなように、複数の対立遺伝子は、ＴＡＬＥＮに特異的な相同組換え修復（ＨＤＲ）を用いて同時に破壊され得る。各々が２０％を超えるＨＤＲ／部位をもたらした５つのＴＡＬＥＮペアおよびそれらの同族ＨＤＲ鋳型は、３つの組み合わせで同時に同時遺伝子導入された（表Ａ）。ある比率の各複製物由来のコロニーは少なくとも４つの遺伝子におけるＨＤＲ事象が陽性であり、複製物Ａからの２つのコロニーは５つすべての遺伝子においてＨＤＲ事象を有した。５つの遺伝子における同時的なインデルの形成がマウス胚性幹細胞内でのＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ刺激性のＮＨＥＪによって実証されているが、標的化ヌクレアーゼ刺激性のＨＤＲによる５つの遺伝子（最大で７つの対立遺伝子）の正確な改変は想定外で意外であり、他に例がない。複製物のＴＡＬＥＮがＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲに置き換えられると（発現のため、ベクターが細胞に導入された）、改変レベルは検出未満であったが（データは示さず）、他のデータはＲＧＥＮ多重を示す（例えば下の実施例９）。４つの遺伝子がすべての実験で、また５つの遺伝子が１つの実験で編集されることが見出された。

この方法の速度および効率は、５つを超える遺伝子の多重ノックアウトがその方法の性質を変化させることなく達成可能であるようなスケールアップに適合する。表Ａを参照すると、約７２〜１９２の細胞が試験されたが、今やこの方法が確立されていることから、より多数の遺伝子／対立遺伝子の多重を想定できるように、試験数を極めてより多数の細胞数まで増やすことは不合理なことではない。多重遺伝子または対立遺伝子の数は２〜２５であってもよく、当業者は、明示される境界（ｂｏｕｎｄｓ）の間のすべての範囲および値が検討されるとともに、以下、すなわち、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０、２５のいずれかを、相互に組み合わせて上限または下限として利用可能であることを直ちに理解するであろう。

明らかなように、多重ノックアウトを伴う細胞および胚、ならびにそれにより作製される動物は、本発明の実施形態である。

実施例４は、様々な動物を作製するための幾つかの詳細な方法を説明し、例として特異的遺伝子を指す。実施例５は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の設計および作製の例を説明する。

実施例６は、ＨＤＲ法を駆動する、標的化ヌクレアーゼを用いた多重遺伝子編集のさらなる例を提供する。フレームシフト突然変異および中途での終止コドンを各遺伝子に導くため、ＧＡＴＡ結合タンパク質４（ＧＡＴＡ４）；ホメオボックスタンパク質ＮＫＸ２−５（ＮＫＸ２−５）および中胚葉後方タンパク質１（ＭＥＳＰ１）が、ＴＡＬＥＮおよびＨＤＲ鋳型を用いて同時に標的化された。目的は、相補性試験で用いるため、各遺伝子に対する二対立遺伝子ノックアウトを作出することであった。２クローンが各遺伝子で意図される二対立遺伝子ＨＤＲを有したことで、同方法は約０．５％効率的であった。単独でまたは遺伝子の組み合わせとしてノックアウトされた所与の遺伝子は、高度虚弱遺伝子型および初期胚の致死性を補完なしに生じさせることになる。当業者は、ＦＴＴおよび相補性試験用に三重ノックアウトを得るための（約１／６６の確率）、個別でのこれらの遺伝子のノックアウトおよびヘテロ接合体の交配が、家畜では実行不能であることを理解するであろう。

実施例７は、遺伝子の多重編集を行うため、ＴＡＬＥＮおよびＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲが混合され得るというデータを提供する。一部の遺伝子／対立遺伝子は、ＴＡＬＥＮまたはＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲにより一層容易に標的化され、また多重化がこれらのツールの組み合わせを用いて行われる必要があるという状況が生じ得る。この例では、真核生物翻訳開始因子４ＧＩ（ＥＩＦ４ＧＩ）がＴＡＬＥＮによって標的化され、ｐ６５（ＲＥＬＡ）遺伝子がＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲによって標的化された。細胞は、ＨＤＲ事象を示すＲＦＬＰアッセイによって分析され、ＨＤＲは両方の部位で明白であった。したがって、ＴＡＬＥＮおよびＲＧＥＮは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０のＴＡＬＥＮと１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０のＲＧＥＮ試薬を含む組み合わせを任意の組み合わせで多重化するため、一緒にまたは別々に用いてもよい。

キメラ
キメラは、宿主胚盤胞を調製し、ドナー動物由来のドナー細胞を加えることによって作製され得る。得られた動物は、宿主およびドナーの双方に由来する細胞を有するキメラとなる。一部の遺伝子は、特定種の細胞および細胞系譜を作出するための胚にとって必要とされる。かかる遺伝子が宿主細胞内でノックアウトされると、欠損遺伝子を有するドナー細胞の導入により、それら細胞および細胞系譜が宿主胚に回復され、回復された細胞がドナー遺伝子型を有する事態が生じ得る。かかる方法は補完法と称される。

Ｍａｔｓｕｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ１１０：４５５７−４５６２，２０１３は、ドナー由来のブタ膵臓を作製するための補完法について記述した。彼らは、機能的膵臓の形成を阻止するように改変された宿主ブタ胚盤胞を作製した。彼らは、宿主胚盤胞を体細胞クローン化により作製した。体細胞は、膵臓の発生を阻害することで公知のＰｄｘ１（膵臓および十二指腸ホメオボックス１）のプロモーター下でＨｅｓ１を過剰発現するように改変されていた。この改変を有していない宿主胚盤胞に加えられたドナー細胞であるドナー細胞は、膵臓を作製するのに必要な細胞系譜を供給した。彼らは他に、機能的器官が、器官形成不全マウス胚における胚盤胞補完により、インビボで多能性幹細胞（ＰＳＣ）から作製され得ることを既に実証していた。彼らは、ヒト誘導性ＰＳＣを含む異種間多能性幹細胞（ＰＳＣ）を用いる未来研究について提起した。確かに、異種移植は、４０年を超える間、器官／組織不足に対する有望な解決策であると考えられている。膵臓の形成を不能にするのに遺伝子が全くノックアウトされなかったという事実は重大である。

大型脊椎動物におけるたとえ１つでも遺伝子をノックアウトすることは、従来の方法の利用では資源の多大な投資である。それに対し、細胞内での遺伝子産物の過剰発現は、例えば複数の遺伝子カセットコピーをゲノムに挿入するプラスミドまたはベクターを伴う、現行の最先端技術を用いると容易に達成される。遺伝子の発現を追加することは、遺伝子を標的化し、それをノックアウトするよりも容易である。遺伝子産物の過剰発現によって器官形成を阻止する能力は、現時点では普通ではないと考えられている。事実、大型動物ゲノムを操作する能力における制限は重大であり得る。にもかかわらず、ブタは、ヒトに対するサイズおよび生理学におけるその類似性ならびにその高い繁殖力および成長速度が原因で、異種移植にとって好ましいドナー動物である。

図９は、キメラとの関連で適用されるとき、遺伝子ノックアウトまたは他の遺伝子編集を行うための、本明細書で用いられる多重方法を示す。低継代の初代体細胞は、遺伝子ノックアウトを用いて作製される。ノックアウトのため、正確にヘテロ接合性およびホモ接合性の所望される分布を伴う細胞が単離される。これらの細胞は、宿主胚盤胞として発生することが可能になる胚を作製するためのクローン化において用いられる。胚盤胞という用語は、２個の細胞から約３週目までの胚を指すように本明細書で広義に用いられる。胚という用語は、接合子から出生までの動物を指すように広義に用いられる。ノックアウトによって作出される微小環境を集合させるための遺伝子を提供するドナー細胞の供給源として、ドナー胚が樹立され、用いられる。宿主およびドナー細胞の双方を有するキメラを形成するため、ドナー細胞は宿主胚盤胞に導入され、宿主細胞とともに再生する。胚は代理雌に移植され、懐胎がなされる。キメラの子孫は、宿主細胞が配偶子を形成するとき、宿主遺伝子型を有する。キメラは、それらの宿主胚盤胞によって決定されるそれらの性別を有する。

図１０は、高度虚弱表現型（ＦＴＴ）の補完法を図示する。ＦＴＴは、性的成熟の年齢まで生存することが想定されない動物を指す。宿主胚には、ＦＴＴ遺伝子型および表現型が提供される。多重法は、ただ1つの遺伝子のノックアウトによって利用可能なFTTは限られており、いくつかの臓器および組織については知られていないため、多重プロセスが理想的である。ドナー細胞は、ＦＴＴにおいて欠損する遺伝子を提供し、欠損細胞型を提供する。胚は大型脊椎動物であり得、ノックアウトは多重、例えば２〜２５の遺伝子であり得る。さらに、ノックアウトを得るため、標的化エンドヌクレアーゼを用いることができる。免疫不全の実施形態では、ＩＬ２Ｒｇ−／ｙ ＲＡＧ２−／−ノックアウトは、宿主における免疫機能が本質的に損なわていることからＦＴＴである。しかし、ドナー細胞はそうした欠損遺伝子を有することなく、得られたキメラは、動物を飼育し、維持できることを目的として、本質的に正常な表現型を有する。しかし、子孫はＦＴＴ表現型を有する。このように、動物は維持され、ＦＴＴ動物は容易に作製され得る。キメラは、ノックアウトについてヘテロ接合性およびホモ接合性の任意の組み合わせであり得る。したがって、高度虚弱（ＦＴＴ）表現型を産むＦ０世代動物であるキメラを作製するための方法が、他の方法が追加的な作製またはそれ以外を必要とする場合には説明される。

キメラは通常、宿主細胞の遺伝的性質を伝える。しかし、本明細書で開示されるのは、宿主細胞の遺伝的性質ではなくドナー細胞の遺伝的性質をそれらの子孫に伝える別のキメラである。遺伝的形質を転換することにより、幾つかの有用な機会が創出され得ることが判明している。図１１を参照すると、Ｇ宿主と命名された胚が示される。胚は、非機能的配偶子を用いて調製されている。ドナー胚盤胞は、ドナー細胞の供給源として調製され、用いられる。ドナー細胞は、ドナー配偶子を作製するのに必要とされる遺伝子および細胞系譜を提供する。得られたキメラは、ドナー細胞の配偶子を有し、ドナー細胞の遺伝的性質を有する子孫を作出する。図面では、宿主胚は雄のブラフマン牛（Ｂｒａｈｍａｎ ｂｕｌｌ）である。ドナー細胞は、筋肉肥大した雄ウシから得られる。キメラは、ブラフマン牛表現型を有するが、その子孫は筋肉肥大している。宿主およびドナーは、同品種もしくは異品種または同種もしくは異種から得られ得る。宿主は不稔性であるように調製されており、それは宿主が性的に繁殖できないことを意味している。一部の不稔動物は、非機能性の配偶子、例えば不動精子を作製するか、または例えば早期配偶子形成が破壊された状態で配偶子を全く作製しないように用いてもよい。ドナー細胞は、例えば、野生型細胞、望ましい形質を有する動物品種由来の細胞、または遺伝子組換え細胞であってもよい。

本発明の実施形態は、配偶子形成または精子形成を阻止する染色体に対して遺伝子改変を有するキメラ不稔動物、例えばキメラ家畜を含む。染色体は、Ｘ染色体、Ｙ染色体、または常染色体であってもよい。改変は、既存の遺伝子の破壊を含んでもよい。破壊は、既存の染色体遺伝子を、それが発現できないように改変することにより、または遺伝子の転写または翻訳を阻害する因子を遺伝的に発現することにより、作出され得る。配偶子形成という用語は、各々が各親の胚芽細胞系由来の両親の遺伝的相補物の半分を保有する一倍体生殖細胞（卵および精子）の産生を意味する。精子の産生は精子形成である。受精中の精子および卵の融合は、二倍体ゲノムを有する接合体細胞をもたらす。配偶子形成細胞という用語は、卵または精子に対する前駆細胞、典型的には胚細胞または精原細胞を指す。１つの実施形態は、宿主内での精原幹細胞（ＳＳＣ）のノックアウトである。動物は、望ましい遺伝的性質を有するドナー細胞を用いて作製してもよく、ドナー遺伝子型を有する配偶子を作製するＳＳＣ細胞を供給する。一部の遺伝子は、不妊を引き起こす１つ以上の効果をもたらすように組み合わせて、例えば、Ａｃｒ／Ｈ１．１／Ｓｍｃｐ、Ａｃｒ／Ｔｎｐ２／Ｓｍｃｐ、Ｔｎｐ２／Ｈ１．１／Ｓｍｃｐ、Ａｃｒ／Ｈ１ｔ／Ｓｍｃｐ、Ｔｎｐ２／Ｈ１ｔ／Ｓｍｃｐ（Ｎａｙｅｒｎｉａ Ｋ；Ｄｒａｂｅｎｔ Ｂ；Ｍｅｉｎｈａｒｄｔ Ａ；Ａｄｈａｍ ＩＭ；Ｓｃｈｗａｎｄｔ Ｉ；Ｍｕｌｌｅｒ Ｃ；Ｓａｎｃｋｅｎ Ｕ；Ｋｌｅｅｎｅ ＫＣ；Ｅｎｇｅｌ Ｗ Ｔｒｉｐｌｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔｓ ｒｅｖｅａｌ ｇｅｎｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍａｌｅ ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ７０（４）：４０６−１６，２００５）を組み合わせて破壊される。実施形態は、第１の１つもしくは複数の遺伝子のノックアウトを有する第１の動物系統および第２の１つもしくは複数の遺伝子のノックアウトを有する第２の動物系統であって、両系統の雄子孫が不妊であるものを含む。

遺伝子組換え大型脊椎動物を作出するための遺伝子操作の使用は、望ましい形質を有する動物の作出を促進することになる。伝統的家畜の繁殖は、世代的再生産のための遺伝的形質および待機時間（ｌｅｎｇｔｈｙ ｗａｉｔｓ）の慎重な選択を含む、高価で時間がかかる方法である。慎重な形質選択の場合であっても、有性生殖の多様性が、望ましい形質の組み合わせに対して培養および継代を行う上で多くの課題を提示する。しかし、ドナー形質を伝えるキメラの作出は、望ましい遺伝的形質の迅速な散在、ならびに形質の独自制御の保護を可能にする動物生殖の方法を創出する。実施形態は、供与された遺伝子材料における宿主として機能し得る遺伝的かつゲノム的に不稔性の動物の作製を含む。宿主による性交は、ドナーの遺伝子材料の再生をもたらすことになる。遺伝的不稔性の動物群は、単一ドナー由来の同一遺伝子を有性生殖により散在させることで、多数のドナー子孫が迅速に作製され得るように、用いることができる。実施形態は、一方の性別のみの動物を作製するように改変された動物を含み、それにより動物を受け取る利用者はその形質を有する動物を容易には繁殖させられないことになる。

実施形態は、配偶子形成または精子の活性に対して選択的な１つもしくは複数の遺伝子を不活性化するため、細胞または胚に遺伝子改変を施すことを含む。遺伝子改変の１つの方法は、遺伝子に特異的に結合する標的化ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮペアに対するｍＲＮＡの導入を含む。動物が細胞からクローン化されるか、または改変された胚が代理母において直接的に産生される。動物は、家畜動物または他の動物であってもよい。配偶子形成は早期段階で遮断してもよい。あるいは、稔性に必須であるが、それ以外では動物にとって必須でない精子の活性は破壊してもよい。それ故、動物は、性的に繁殖できないことから不稔性であるが、改変された精子から子孫を作出するため、ＡＲＴを用いてもよい。（繁殖および／または遺伝子操作の結果として）望ましい遺伝的形質を有するドナー動物が選択される。

２つ以上のノックアウトを有するＦ０世代ファウンダー動物系統の迅速な樹立
多重の場合、所望される組み合わせの対立遺伝子を有するＦ０世代を作製するため、２つ、３つ、またはそれより多くの遺伝子（２〜２５）を同時にノックアウトしてもよい。ノックアウトのすべてについてのホモ接合性はＦＴＴを作出し、次いで１つの選択肢は、ノックアウトの１つ（状況に応じて最低限のヘテロ接合性が必要であるべきあらゆる場合など）を除くすべてについてホモ接合性であるファウンダーを作製することである。その１つのヘテロ接合性遺伝子は、非ＦＴＴ表現型を許容し得る。あるいは、ＦＴＴ子孫を有するキメラを繁栄させるため、多重ノックアウトは相補性と併用され得る。この方法は、複数のノックアウト動物の作出において世代を排除させ得る。

いずれの場合でも、その利点は大きく、それにより多数の方法が実際に達成可能な領域まで移行される。Ｆ２世代の場合、子孫の約６％しか所望される表現型を有することにならないことから、２つの遺伝子座のノックアウトを有する動物を従来式繁殖により作製するには法外な費用がかかる（表Ｂ）。それに対し、多重手法は、Ｆ０世代における所望される遺伝子型の作製を可能にすることから、従来式のノックアウトおよび繁殖をしのぐ大きな利点がある。時間および動物の節約が非理論的であることは強調されるべきであるが、失敗よりも成功が想定されることから、ある種の改変を可能にすることは進歩である。さらに、その例を踏まえると、１つまたは２つのキメラＲＧ−ＫＯ親の間での繁殖は、ＲＧ−ＫＯ子孫の作製率を各々、２５および１００パーセントに有意に高めることになる（表Ｂ）。

免疫不全動物
実施形態の１群は、免疫不全ブタまたは他の家畜およびそれらを作製する方法に関する。これらの実施形態は、ホモ接合性およびヘテロ接合性のノックアウト遺伝子型の選択を管理するための機会を利用する、多重編集例、例えばノックアウトである。これらは、ファウンダー系統を迅速に樹立するための多重の能力を示している。それらはまた、キメラの作製を含む本発明の態様をさらに含む。

ブタは、ヒトのサイズおよび生理学を模倣する、最も関連性の高い非霊長類動物モデルである。残念ながら、（１）複数の遺伝子ノックアウト（ＫＯ）が必要とされる、（２）複数の遺伝子座ヌル動物を作製するための交雑に極めてコストがかかり、ノックアウトの数に左右され得る、また（３）ブタに対しては小規模の無菌施設のみが利用可能であることから、完全に免疫不全のブタは広範に利用可能ではない。本明細書では、実施形態は、ＲＡＧ２およびＩＬ２Ｒｇの双方のノックアウト（すなわちＲＧ−ＫＯ）を伴う大型脊椎動物を含む。大型脊椎動物という用語は、サル、家畜、イヌ、およびネコを指す。家畜という用語は、習慣的に食用に飼育された動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、トリ（ニワトリ、シチメンチョウ）、ブタ、水牛、および魚類を指す。遺伝子は、体細胞でノックアウトされ得、次いで全動物を作製するためのクローン化に用いられる。あるいは、胚は遺伝子をノックアウトするように処理され得、ここで動物は直接的に胚に由来する。多重遺伝子の標的化プラットフォームは、ブタにおけるＴ、ＢおよびＮＫ細胞の発生を同時に破壊し得る。したがって、かかる細胞なしに作製される動物は、Ｆ０ファウンダーとして、本明細書中の方法を用いて直接的に作製され得るが、表現型はＦＴＴである。

多重編集における農業標的
食用動物ゲノムの編集は、極めて多数の遺伝子座を同時に編集し、同時に１つでなく作製される対立遺伝子を結び付けることが必要となる動物の繁殖で世代を保存することにより、大いに促進され得る。さらに、一部の農業形質は複雑であり、２つ以上（２から数百）の遺伝子での対立遺伝子の影響の結果として顕現することをそれは意味する。例えば、ＤＧＡＴ、ＡＢＣＧ２での多型、および染色体１８での多型は、併せて、乳牛におけるＮｅｔ Ｄａｉｒｙ Ｍｅｒｉｔの変動の大部分を占める。家畜の細胞または胚は、様々な農業標的、すなわち、ＡＣＡＮ、ＡＭＥＬＹ、ＢＬＧ、ＢＭＰ １Ｂ（ＦｅｃＢ）、ＤＡＺＬ、ＤＧＡＴ、Ｅｉｆ４ＧＩ、ＧＤＦ８、Ｈｏｒｎ−ｐｏｌｌ ｌｏｃｕｓ、ＩＧＦ２、ＣＷＣ１５、ＫｉｓｓＲ／ＧＲＰ５４、ＯＦＤ１Ｙ、ｐ６５、ＰＲＬＲ、Ｐｒｍｄ１４、ＰＲＮＰ、Ｒｏｓａ、Ｓｏｃｓ２、ＳＲＹ、ＺＦＹ、β−ラクトグロブリン、ＣＬＰＧの１つ以上を含む、極めて多数の遺伝子の多重編集がなされ得る。

多重化するための疾患モデリング標的
がんのような一部の形質は、複数の遺伝子での突然変異に基づいて引き起こされる（ＡＰＣ／ｐ５３を参照）。さらに、極めて多数の疾患形質は、２つ以上の遺伝子で対立遺伝子の影響の結果として現れる、いわゆる複合形質である。例えば、糖尿病、代謝、心疾患、および神経性疾患は複合形質と考えられる。実施形態は、個別の対立遺伝子において、または他の遺伝子での対立遺伝子と異なる組み合わせで組み合わせて、ヘテロ接合性およびホモ接合性である動物モデルを含む。例えば、ＭＯＤＹ１（ＨＮＦ４α）、ＭＯＤＹ２（ＧＣＫ）、ＭＯＤＹ３（ＨＮＦ１α）、ＭＯＤＹ４（Ｐｄｘ１）、ＭＯＤＹ５（ＨＮＦ−１β）、ＭＯＤＹ６（神経原性分化１）、ＭＯＤＹ７（ＫＬＦ１１）、ＭＯＤＹ８（ＣＥＬ）、ＭＯＤＹ９（ＰＡＸ４）、ＭＯＤＹ１０（ＩＮＳ）、ＭＯＤＹ１１（ＢＬＫ）を含む、若年成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）の遺伝子座は、糖尿病を個別かつ相加的に引き起こす。家畜の細胞または胚は、様々な疾患モデリング標的を含む動物モデリングのため、極めて多数の遺伝子、すなわち、ＡＰＣ、ＡｐｏＥ、ＤＭＤ、ＧＨＲＨＲ、ＨＲ、ＨＳＤ１１Ｂ２、ＬＤＬＲ、ＮＦ１、ＮＰＰＡ、ＮＲ３Ｃ２、ｐ５３、ＰＫＤ１、Ｒｂｍ２０、ＳＣＮＮ１Ｇ、ｔＰ５３、ＤＡＺＬ、ＦＡＨ、ＨＢＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＰＤＸ１、ＰＩＴＸ３、Ｒｕｎｘ１、ＲＡＧ２、ＧＧＴＡの多重編集が施され得る。実施形態は、上記標的の１つ以上が編集、例えばノックアウトされている、細胞、胚、および動物を含む。

１つの種における遺伝子は常に、他種においてオルソログを有する。ヒトおよびマウス遺伝子は常に、家畜、特に雌ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、およびウサギにおいてオルソログを有する。これらの種と魚類との間の遺伝子オルソログは、遺伝子の機能に応じて一致することが多い。生物学者は、遺伝子オルソログを見出すための方法に精通していることから、遺伝子は、他種のオルソログを列挙することなく、それらの種の１つという観点で本明細書に記載され得る。したがって、遺伝子の破壊について説明する実施形態は、他種における同じまたは異なる名称を有するオルソログの破壊を含む。一般的な遺伝子データベース、ならびに遺伝子オルソログの同定に特化されたデータベースが存在する。さらに、当業者は、遺伝子について一般的に用いられる略称や、ある遺伝子に対して２つ以上の略称があるかまたは２つの遺伝子が同じ略称によって参照される場合、いずれの遺伝子が参照されているかを文脈を活用して同定することに精通している。

精原幹細胞は、第２の方法として家畜の遺伝子改変を提示する。遺伝子改変または遺伝子編集は、ドナー精巣から単離された精原幹細胞においてインビトロで実行され得る。改変細胞は、レシピエントの生殖細胞が枯渇した精巣に移植される。移植された精原幹細胞は、ファウンダー動物を誘導するため、人工授精または体外受精（ＩＶＦ）を介して繁殖に使用可能な１つもしくは複数の遺伝子改変を保有する精子を産生する。

宿主微小環境の選択的過疎による形態欠損（ｎｕｌｌｏｍｏｒｐｈｉｃ）細胞または器官欠損の補完
多重編集は、細胞または器官を特定の胚または動物の微小環境から意図的に切り出し、より優れたドナー細胞の組込み、増殖、および分化に寄与する環境を作出し、胚、胎児または動物におけるオルソロガスな細胞、組織または器官での補完によりそれらの寄与を増強するように用いることができる。空の微小環境を有する動物は、ドナー細胞および遺伝子によって満たされ得る欠損を有するように作出されていることから、欠損キャリアである。具体的な例として、レシピエントの除去、および配偶子形成細胞系譜（ＤＡＺＬ、ＶＡＳＡ、ＭＩＷＩ、ＰＩＷＩなど）のドナーレスキュー（ｄｏｎｏｒ−ｒｅｓｃｕｅ）を含む。

別の実施形態では、多重遺伝子編集は、先天性脱毛症を誘導し、ドナー由来細胞が毛髪での濾胞形成に関与するための機会を提供するために用いることができる。脱毛症を引き起こす、多重遺伝子編集において検討される遺伝子は、ＯＭＩＭおよびＨｕｍａｎ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙデータベースの中で同定されたもの；ＤＣＡＦ１７、ＶＤＲ、ＰＮＰＬＡ１、ＨＲＡＳ、Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ−ｖｅｒｔ、ＤＳＰ、ＳＮＲＰＥ、ＲＰＬ２１、ＬＡＭＡ３、ＵＲＯＤ、ＥＤＡＲ、ＯＦＤ１、ＰＥＸ７、ＣＯＬ３Ａ１、ＡＬＯＸ１２Ｂ、ＨＬＣＳ、ＮＩＰＡＬ４、ＣＥＲＳ３、ＡＮＴＸＲ１、Ｂ３ＧＡＬＴ６、ＤＳＧ４、ＵＢＲ１、ＣＴＣ１、ＭＢＴＰＳ２、ＵＲＯＳ、ＡＢＨＤ５、ＮＯＰ１０、ＡＬＭＳ１、ＬＡＭＢ３、ＥＯＧＴ、ＳＡＴ１、ＲＢＰＪ、ＡＲＨＧＡＰ３１、ＡＣＶＲ１、ＩＫＢＫＧ、ＬＰＡＲ６、ＨＲ、ＡＴＲ、ＨＴＲＡ１、ＡＩＲＥ、ＢＣＳ１Ｌ、ＭＣＣＣ２、ＤＫＣ１、ＰＯＲＣＮ、ＥＢＰ、ＳＬＩＴＲＫ１、ＢＴＫ、ＤＯＣＫ６、ＡＰＣＤＤ１、ＺＩＰ４、ＣＡＳＲ、ＴＥＲＴ、ＥＤＡＲＡＤＤ、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ２、ＰＶＲＬ１、ＭＧＰ、ＫＲＴ８５、ＲＡＧ２、ＲＡＧ−１、ＲＯＲ２、ＣＬＡＵＤＩＮ１、ＡＢＣＡ１２、ＳＬＡ−ＤＲＡ１、Ｂ４ＧＡＬＴ７、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＨＰ２、ＧＮＡ１１、ＷＮＴ５Ａ、ＵＳＢ１、ＬＭＮＡ、ＥＰＳ８Ｌ３、ＮＳＤＨＬ、ＴＲＰＶ３、ＫＲＡＳ、ＴＩＮＦ２、ＴＧＭ１、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＰＫＰ１、ＷＲＡＰ５３、ＫＤＭ５Ｃ、ＥＣＭ１、ＴＰ６３、ＫＲＴ１４、ＲＩＰＫ４を含む。濾胞形成（ｆｏｌｌｉｃｕｌｏｇｅｎｉｃ）の可能性を有するドナー細胞とのキメラ化は、ヒト毛包を成長させるため、用いてもよい。ブタまたは他の脊椎動物における器官または組織の切り出しおよびヒトに由来する器官または組織の成長は、医療用の器官または組織の供給源として特に有用である。

さらに、多重化のための相補標的は、ＰＲＫＤＣ、ＢＣＬ１１ａ、ＢＭＩ１、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＤＫＫ１、ＥＴＶ２、ＦＬＩ１、ＦＬＫ１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＨＥＸ、ＫＩＴ、ＬＭＸ１Ａ、ＭＹＦ５、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＮＫＸ２−５、ＮＲ４Ａ２、ＰＡＸ３、ＰＤＸ１、ＰＩＴＸ３、Ｒｕｎｘ１、ＲＡＧ２、ＧＧＴＡ、ＨＲ、ＨＡＮＤＩＩ、ＴＢＸ５である。

実施形態は、多重手法で、または他の手法により、上記標的の１つ、２つ、またはそれより多く（２〜２５）を標的化することを含む。

編集された遺伝子
特定の標的および標的化エンドヌクレアーゼに関連する本明細書に記載の方法および発明は、幅広く適用可能である。本発明者らは、以下の遺伝子のすべてを用いた編集を伴うクローン化に適した初代家畜細胞を調製している。

遺伝子改変動物
遺伝的に発現可能なマーカーを定位置に残し、動物外でのその交配を可能とする方法を用い、または動物中にマーカーを配置しない方法により、染色体改変について単アレル性または両アレル性の動物が作製され得る。例えば、本発明者らは、動物の染色体の変化、または動物の染色体中への外因性遺伝子の挿入を作製するため、相同依存性組換え（ＨＤＲ）の方法を用いている。ＴＡＬＥＮおよびリコンビナーゼ融合タンパク質などのツール、ならびに従来の方法が、本明細書の他の箇所で考察される。本明細書に開示の遺伝子改変を支持する実験データの一部が次のようにまとめられる。本発明者らは、改変細胞の多遺伝子集団からクローン化する場合の例外的なクローン化効率を先行的に実証し、単離コロニーについての体細胞核移植（ＳＣＮＴ）によるクローン化効率の変動を回避するためにこの手法を提唱している（Ｃａｒｌｓｏｎら，２０１１）。しかしさらに、ＴＡＬＥＮ媒介ゲノム改変、およびリコンビナーゼ融合分子による改変は、単一世代における両アレル改変の達成をもたらす。例えば、ノックアウト遺伝子についてホモ接合性の動物は、ＳＣＮＴにより、ホモ接合性をもたらすための同系交配を伴わずに作製され得る。ブタおよびウシなどの家畜についての妊娠期間および生殖齢への成熟は、研究および生産に対する大きな障壁である。例えば、クローン化および交配によるヘテロ接合性突然変異細胞（両方の性）からのホモ接合性ノックアウトの作製には、ブタおよびウシの各々について１６および３０ヵ月が必要となる。一部は、遺伝子改変およびＳＣＮＴ（Ｋｕｒｏｉｗａら、２００４）の連続サイクルによりこの負荷を低減させているが、これは技術的に困難であり、法外な費用がかかり、その上、大型脊椎動物実験モデルまたは家畜に対して実際に有用であるべき、Ｆ０動物を作製するための連続クローニングを回避するのに多くの理由がある。ＳＣＮＴ前に両アレルＫＯ細胞を定型的に作製する能力は、大型動物の遺伝子操作における大きな進歩である。両アレルノックアウトは、ＺＦＮおよび希釈クローン化などの他の方法を用いて不死細胞系において達成されている（Ｌｉｕら、２０１０）。別のグループは近年、市販のＺＦＮ試薬を用いてブタＧＧＴＡ１の両アレルＫＯを実証し（Ｈａｕｓｃｈｉｌｄら、２０１１）、両アレルヌル細胞をＧＧＴＡ１依存性表面エピトープの不存在についてＦＡＣＳにより濃縮することができる。これらの研究は、ある有用な概念を実証する一方、彼らは動物または家畜が改変され得ることを示すものではない。というのは、簡易なクローン希釈は一般に初代線維芽細胞単離株に適しておらず（線維芽細胞は低密度における成長が不十分である）、ヌル細胞についての生物学的濃縮が大多数の遺伝子に利用可能でないためである。

標的化ヌクレアーゼに誘導される相同組換えは、関連する選択マーカーに対する必要性を失くすために用いることができる。相同組換え修復（ＨＤＲ）によって特定の対立遺伝子を家畜ゲノムに正確に導入するため、ＴＡＬＥＮを用いてもよい。パイロット研究では、特定の１１ｂｐの欠失（ベルギアン・ブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ Ｂｌｕｅ）対立遺伝子）（Ｇｒｏｂｅｔら、１９９７；Ｋａｍｂａｄｕｒら、１９９７）がウシＧＤＦ８遺伝子座に導入された（米国特許出願公開第２０１２／０２２２１４３号明細書を参照）。単独での遺伝子導入時、ｂｔＧＤＦ８．１ ＴＡＬＥＮペアは標的遺伝子座で最大１６％の染色体を切断した。１１ｂｐの欠失を内包するスーパーコイルの相同ＤＮＡ修復鋳型との同時導入の結果、所望される事象についての選択なしに、３日目に最大５％の遺伝子変換頻度（ＨＤＲ）が得られた。遺伝子変換は、スクリーニングされた、単離コロニーの１．４％で同定された。これらの結果により、関連する選択マーカーの援助なしにＨＤＲを有効に誘導するため、ＴＡＬＥＮを用いることができることが実証された。

相同組換え修復（ＨＤＲ）
相同性指向修復（ＨＤＲ）は、ｓｓＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）損傷を修復するための細胞内機構である。この修復機構は、損傷部位と有意な相同性を有する配列を有するＨＤＲ鋳型が存在する場合、細胞により用いられ得る。特異的結合は、生物学分野において一般に使用される用語であり、非標的組織と比べて相対的に高い親和性で標的に結合し、一般に複数の非共有結合性相互作用、例えば、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などを含む分子を指す。特異的ハイブリダイゼーションは、相補配列を有する核酸間の特異的結合の形態である。タンパク質もまた、例えば、ＴＡＬＥＮもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系において、またはＧａｌ４モチーフによりＤＮＡに特異的に結合し得る。対立遺伝子の遺伝子移入は、テンプレートガイド型プロセスを用いて内因性対立遺伝子を上回って外因性対立遺伝子をコピーするプロセスを指す。内因性対立遺伝子は実際に切り出され、一部の状況において外因性核酸対立遺伝子により置換され得るが、現行の理論では同プロセスはコピー機構であるということである。対立遺伝子は遺伝子対であるため、それらの間には有意な相同性が存在する。対立遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子であり得るか、あるいはそれは他の機能、例えば生物活性ＲＮＡ鎖をコードすることまたは調節タンパク質もしくはＲＮＡを受容するための部位を提供することを有し得る。

ＨＤＲ鋳型は、遺伝子移入されている対立遺伝子を含む核酸である。鋳型は、ｄｓＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であり得る。ｓｓＤＮＡ鋳型は、好ましくは約２０〜約５０００残基であるが、他の長さを用いることができる。当業者は、明示範囲内のすべての範囲および値、例えば５００〜１５００残基、２０〜１００残基などが企図されることを直ちに理解するであろう。鋳型は、内因性対立遺伝子に隣接したＤＮＡまたは置換されるべきＤＮＡとの相同性を提供するフランキング配列をさらに含み得る。鋳型はまた、標的化ヌクレアーゼ系に結合される配列を含み得、したがって、その系のＤＮＡ結合メンバーについての同族結合部位である。同族という用語は、典型的には、相互作用する２つの生体分子、例えば受容体およびそのリガンドを指す。ＨＤＲプロセスに関して、生体分子の一方は目的の、すなわち、同族ＤＮＡ部位またはタンパク質部位と結合する配列を用いて設計され得る。

標的化エンドヌクレアーゼ系
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）および亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）などのゲノム編集ツールは、バイオテクノロジー、遺伝子療法および多くの生物における機能的ゲノム研究の分野に影響を及ぼしている。ごく最近、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）が、相補的ＲＮＡ分子によりその標的部位に誘導される。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ系は、ＲＥＧＥＮである。ｔｒａｃｒＲＮＡは、別のそのようなツールである。これらは、標的化ヌクレアーゼ系の例であり：これらの系は、ヌクレアーゼを標的部位に局在化させるＤＮＡ結合メンバーを有する。次に、同部位はヌクレアーゼによって切断される。ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮは、ＤＮＡ結合メンバーに融合されたヌクレアーゼを有する。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲは同族であり、標的ＤＮＡ上で互いに遭遇する。ＤＮＡ結合メンバーは、染色体ＤＮＡ中に同族配列を有する。ＤＮＡ結合メンバーは、典型的には、目的部位においても、その近傍においても核酸分解作用が生じないように意図される同族配列に照らして設計される。ある実施形態は、全てのかかる系、例として限定されないが、ヌクレアーゼ再切断を最小化する実施形態、目的残基において正確にＳＮＰを作製するための実施形態、およびＤＮＡ結合部位において遺伝子移入されつつある対立遺伝子の配置に適用可能である。

ＴＡＬＥＮ
ＴＡＬＥＮという用語は、本明細書で用いられるとき、広義であり、別のＴＡＬＥＮからの支援なしで二本鎖ＤＮＡを切断し得る単量体ＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語はまた、同一部位においてＤＮＡを切断するために一緒に機能するように遺伝子操作されたＴＡＬＥＮのペアの一方または両方のメンバーを指すために用いられる。一緒に機能するＴＡＬＥＮは、ＤＮＡまたはＴＡＬＥＮペアの掌性を参照する左側ＴＡＬＥＮおよび右側ＴＡＬＥＮと称される場合がある。

各々のＤＮＡ結合リピートが標的ＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を担うＴＡＬについての暗号が報告されている（ＰＣＴ公開の国際公開第２０１１／０７２２４６号パンフレット）。残基は、ＤＮＡ配列を標的化するようにアセンブルされ得る。手短に述べると、ＴＡＬＥＮの結合のための標的部位が決定され、ヌクレアーゼおよび標的部位を認識する一連のＲＶＤを含む融合分子が作出される。結合時、ヌクレアーゼがＤＮＡを切断し、その結果、切断末端における遺伝子改変を行うように細胞修復機構が作動し得る。ＴＡＬＥＮという用語は、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含むタンパク質を意味し、本質的に機能的な単量体ＴＡＬＥＮおよび別の単量体ＴＡＬＥＮとの二量体化を要求する他のものを含む。二量体化は、両方の単量体ＴＡＬＥＮが同一である場合にはホモ二量体ＴＡＬＥＮを生じ得るか、または単量体ＴＡＬＥＮが異なる場合にはヘテロ二量体ＴＡＬＥＮを生じ得る。ＴＡＬＥＮは、２つの主要な真核ＤＮＡ修復経路、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換え修復により不死化ヒト細胞における遺伝子改変を誘導することが示されている。ＴＡＬＥＮは、ペアで用いられることが多いが、単量体ＴＡＬＥＮも公知である。ＴＡＬＥＮ（および他の遺伝子ツール）による処理のための細胞として、培養細胞、不死化細胞、初代細胞、初代体細胞、接合子、生殖細胞、始原生殖細胞、胚盤胞、または幹細胞が挙げられる。一部の実施形態では、ＴＡＬエフェクターは、他のタンパク質ドメイン（例えば非ヌクレアーゼタンパク質ドメイン）を特異的ヌクレオチド配列に標的化するために用いることができる。例えば、ＴＡＬエフェクターは、限定されないが、ＤＮＡ２０相互作用酵素（例えば、メチラーゼ、トポイソメラーゼ、インテグラーゼ、トランスポゼース、またはリガーゼ）、転写活性化因子もしくはリプレッサー、またはヒストンなどの他のタンパク質と相互作用し、またはそれを改変するタンパク質からのタンパク質ドメインに連結され得る。かかるＴＡＬエフェクター融合物の適用として、例えば、エピジェネティック調節エレメントの作出または改変、ＤＮＡ中の部位特異的挿入、欠失、または修復の作製、遺伝子発現の制御、およびクロマチン構造の改変が挙げられる。

ヌクレアーゼという用語は、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含む。エンドヌクレアーゼという用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子内の核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒し得る任意の野生型または変異体酵素を指す。エンドヌクレアーゼの非限定例として、ＦｏｋＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｂｖＣｌ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＡｌｗＩなどのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼが挙げられる。エンドヌクレアーゼはまた、典型的には約１２〜４５塩基対（ｂｐ）長、より好ましくは１４〜４５ｂｐ長のポリヌクレオチド認識部位を有する場合でのレアカットエンドヌクレアーゼを含む。レアカットエンドヌクレアーゼは、規定の遺伝子座におけるＤＮＡ二本鎖分解（ＤＳＢ）を誘導する。レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、標的化エンドヌクレアーゼ、遺伝子操作された亜鉛フィンガードメインとＦｏｋＩなどの制限酵素または化学エンドヌクレアーゼの触媒ドメインとの融合物から得られるキメラ亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり得る。化学エンドヌクレアーゼでは、化学またはペプチド性切断因子は、核酸のポリマーまたは特異的標的配列を認識する別のＤＮＡのいずれかにコンジュゲートされ、それにより切断活性を特異的配列に標的化する。化学エンドヌクレアーゼはまた、特異的ＤＮＡ配列に結合することが公知のオルトフェナントロリン、ＤＮＡ切断分子、および三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）の合成ヌクレアーゼ様コンジュゲートを包含する。かかる化学エンドヌクレアーゼは、本発明による用語「エンドヌクレアーゼ」に含まれる。かかるエンドヌクレアーゼの例として、Ｉ−ＳｅｅＩ、Ｉ−ＣｈｕＬＩ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、ＰＩ−ＳｅｅＬＰＩ−ＴｔｉＬＰＩ−ＭｔｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＳｅｅＩＬ１−ＳｅｅＩＩＩ、ＨＯ、ＰＩ−ＣｉｖＩ、ＰＩ−ＣｔｒＬＰＩ−ＡａｅＩ、ＰＩ−ＢｓｕＩ、ＰＩ−ＤｈａＩ、ＰＩ−ＤｒａＬＰＩ−ＭａｖＬＰＩ−ＭｅｈＩ、ＰＩ−ＭｆｕＬＰＩ−ＭｆｌＩ、ＰＩ−ＭｇａＬＰＩ−ＭｇｏＩ、ＰＩ−ＭｉｎＬＰＩ−ＭｋａＬＰＩ−ＭｌｅＩ、ＰＩ−ＭｍａＩ、ＰＩ−３０ＭｓｈＬＰＩ−ＭｓｍＩ、ＰＩ−ＭｔｈＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｘｅＩ、ＰＩ−ＮｐｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＬＰＩ−ＲｍａＩ、ＰＩ−ＳｐｂＩ、ＰＩ−ＳｓｐＬＰＩ−ＦａｅＬＰＩ−ＭｊａＩ、ＰＩ−ＰｈｏＬＰＩ−ＴａｇＬＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｋｏＩ、ＰＩ−ＴｓｐＩ、Ｉ−ＭｓｏＩが挙げられる。

ＴＡＬＥＮまたは他のツールによって作製される遺伝子改変は、例えば、挿入、欠失、外因性核酸断片の挿入、および置換からなるリストから選択してもよい。挿入という用語は、染色体中への文字どおりの挿入または修復のための鋳型としての外因性配列の使用のいずれかを意味するように広義に用いられる。一般に、標的ＤＮＡ部位が同定され、同部位に特異的に結合することになるＴＡＬＥＮペアが作出される。ＴＡＬＥＮは、例えば、タンパク質、ｍＲＮＡとして、またはＴＡＬＥＮをコードするベクターにより、細胞または胚に送達される。ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡを切断して二本鎖分解を作製し、次いでそれを修復し、多くの場合にインデルの作出がもたらされ、または染色体中に挿入され、もしくは改変配列による分解の修復のための鋳型として機能する、同伴する外因性核酸中に含有される配列もしくは多型が取り込まれる。この鋳型に駆動される修復は、染色体を変化させるための有用なプロセスであり、細胞染色体に対して効率的な変化をもたらす。

外因性核酸という用語は、細胞または胚に付加される核酸を意味し、核酸が天然に細胞内に存在する核酸配列と同じかまたは異なるかとは無関係である。核酸断片という用語は広義であり、染色体、発現カセット、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはそれらの一部を含む。細胞または胚は、例えば、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、トリ、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択してもよい。

一部の実施形態は、ＴＡＬＥＮペアを家畜および／または偶蹄目細胞または胚中に導入し、ＴＡＬＥＮペアにより特異的に結合される部位における細胞または胚のＤＮＡの遺伝子改変を行い、細胞から家畜動物／偶蹄目を生産することを含む、遺伝子改変家畜動物および／または偶蹄目を作製する組成物または方法を含む。例えば、接合子、線維芽細胞、または胚への直接注射を、細胞または胚に対して用いてもよい。あるいは、ＴＡＬＥＮおよび／または他の要素は、タンパク質、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、またはベクターを導入するための多数の公知の技術のいずれかを用いて細胞に導入してもよい。遺伝子改変動物は、公知の方法、例えば妊娠宿主への胚の移植、または様々なクローン化法に従い、胚または細胞から作製してもよい。「ＴＡＬＥＮにより特異的に結合される部位での細胞のＤＮＡに対する遺伝子改変」などの語句は、ＴＡＬＥＮがその標的部位に特異的に結合されるとき、ＴＡＬＥＮ上のヌクレアーゼにより切断される部位で遺伝子改変が行われることを意味する。ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮペアが結合する場所を正確に切断するのではなく、２つの結合部位間の規定部位にて切断する。

一部の実施形態は、動物のクローン化に用いられる細胞の組成物または処理を含む。細胞は、家畜および／または偶蹄目細胞、培養細胞、初代細胞、初代体細胞、接合子、生殖細胞、始原生殖細胞、または幹細胞であってもよい。例えば、実施形態は、培養下の複数の初代細胞をＴＡＬＥＮタンパク質または１つもしくは複数のＴＡＬＥＮをコードする核酸に曝露することを含む、遺伝子改変を作出する組成物または方法である。ＴＡＬＥＮは、ｍＲＮＡまたはベクター内のＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質として、または核酸断片として導入してもよい。

亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより生成される人工的制限酵素である。亜鉛フィンガードメインは、所望のＤＮＡ配列を標的化するように遺伝子操作することができ、これにより、亜鉛フィンガーヌクレアーゼが複合体ゲノム内のユニーク配列を標的化することが可能となる。内因性ＤＮＡ修復機構を利用することにより、これらの試薬は、高等生物のゲノムを改変するために用いることができる。ＺＦＮは、遺伝子を不活性化させる方法において用いてもよい。

亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、約３０アミノ酸を有し、安定的構造にフォールドする。各フィンガーは主に、ＤＮＡ基質内のトリプレットに結合する。キー位置でのアミノ酸残基は、ＤＮＡ部位との配列特異的相互作用の大部分に寄与する。これらのアミノ酸は、必要な構造を保つために残存アミノ酸を維持しながら変化し得る。長い方のＤＮＡ配列への結合は、幾つかのドメインをタンデムに連結することにより達成される。非特異的ＦｏｋＩ切断ドメイン（Ｎ）、転写活性化因子ドメイン（Ａ）、転写リプレッサードメイン（Ｒ）およびメチラーゼ（Ｍ）のような他の機能性は、ＺＦＰに融合されることで、各々のＺＦＮ、亜鉛フィンガー転写活性化因子（ＺＦＡ）、亜鉛フィンガー転写抑制因子（ＺＦＲ、および亜鉛フィンガーメチラーゼ（ＺＦＭ）が形成され得る。遺伝子改変動物の作製のために亜鉛フィンガーおよび亜鉛フィンガーヌクレアーゼを用いるための材料および方法は、例えば、米国特許第８，１０６，２５５号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１９２２９８号明細書、米国特許出願公開第２０１１／００２３１５９号明細書、および米国特許出願公開第２０１１／０２８１３０６号明細書に開示されている。

ベクターおよび核酸
種々の核酸は、ノックアウト目的のため、遺伝子の不活性化のため、遺伝子の発現を得るため、または他の目的のため、細胞に導入してもよい。本明細書で用いられるとき、核酸という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸アナログ、および二本鎖または一本鎖（すなわちセンスまたはアンチセンス一本鎖）である核酸を含む。核酸アナログは、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善するため、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において改変され得る。デオキシリボースリン酸骨格は、各々の塩基部分が六員のモルホリノ環に連結しているモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸骨格がシュードペプチド骨格により置換され、かつ４つの塩基が保持されたペプチド核酸を生産するように改変され得る。

標的核酸配列は、プロモーターなどの調節領域に作動可能に連結され得る。調節領域は、ブタ調節領域であり得るかまたは他種由来であり得る。本明細書で用いられるとき、作動可能に連結させるとは、標的核酸の転写を可能にするかまたは容易にするような方法で核酸配列に対する調節領域を位置づけることを指す。

一般に、あるタイプのプロモーターは、標的核酸配列に作動可能に連結可能である。プロモーターの例として、限定はされないが、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および特定の刺激に応答性または不応答性のプロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、顕著な組織または時間的特異性を伴わずに核酸分子の発現を容易にするプロモーターを用いてもよい（すなわち構成的プロモーター）。例えば、ニワトリβ−アクチン遺伝子プロモーターなどのβ−アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、ミニＣＡＧプロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、または３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを用いることができるとともに、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどのウイルスプロモーターを用いることができる。一部の実施形態では、ニワトリβアクチン遺伝子プロモーターとＣＭＶエンハンサーとの融合物がプロモーターとして用いられる。例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５６３，２００１；およびＫｉｗａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：８２１，１９９６を参照のこと。

核酸構築物において有用であり得る追加的な調節領域として、限定はされないが、ポリアデニル化配列、翻訳調節配列（例えば、内部リボソーム進入セグメント、ＩＲＥＳ）、エンハンサー、誘導性エレメント、またはイントロンが挙げられる。かかる調節領域は、必須でない場合があるが、それらはｍＲＮＡの転写、安定性、翻訳効率などに影響することにより発現を増大させ得る。かかる調節領域は、１つもしくは複数の細胞内での核酸の最適な発現を得ることが望まれる核酸構築物中に含めることができる。しかし、十分な発現は、時としてかかる追加的な要素がなくても得られ得る。

シグナルペプチドまたは選択可能な発現マーカーをコードする核酸構築物を用いてもよい。シグナルペプチドは、コードポリペプチドが特定の細胞位置（例えば細胞表面）に特異的であるように用いることができる。選択可能なマーカーの非限定例として、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスフトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。かかるマーカーは、培養下の安定的な形質転換体を選択するのに有用である。他の選択マーカーとして、蛍光ポリペプチド、例えば、緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質が挙げられる。

一部の実施形態では、選択可能なマーカーをコードする配列は、例えばＣｒｅもしくはＦｌｐなどのリコンビナーゼについての認識配列により隣接され得る。例えば、選択可能なマーカーは、選択可能なマーカーを構築物から切り出すことができるようにｌｏｘＰ認識部位（Ｃｒｅリコンビナーゼにより認識される３４ｂｐ認識部位）またはＦＲＴ認識部位により隣接され得る。Ｃｒｅ／ｌｏｘ技術の概説については、Ｏｒｂａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：６８６１，１９９２、およびＢｒａｎｄ ａｎｄ Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ，６：７，２００４を参照のこと。選択可能なマーカー遺伝子により中断されるＣｒｅもしくはＦｌｐを活性化可能な導入遺伝子を含有するトランスポゾンもまた、導入遺伝子の条件的発現を有するトランスジェニック動物を得るために用いることができる。例えば、マーカー／導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターは、偏在的または組織特異的のいずれかであり得、その場合、Ｆ０動物（例えばブタ）におけるマーカーの偏在的または組織特異的発現をもたらすことになる。導入遺伝子の組織特異的な活性化は、例えば、マーカーに中断された導入遺伝子を偏在的に発現するブタと、ＣｒｅもしくはＦｌｐを組織特異的方法で発現するブタとを掛け合わせることにより、またはマーカーに中断された導入遺伝子を組織特異的方法で発現するブタと、ＣｒｅもしくはＦｌｐリコンビナーゼを偏在的に発現するブタとを掛け合わせることにより達成され得る。導入遺伝子の発現の制御またはマーカーの切り出しの制御により、導入遺伝子の発現が可能となる。

一部の実施形態では、外因性核酸は、ポリペプチドをコードする。ポリペプチドをコードする核酸配列は、後続するコードポリペプチドの操作を容易にするため（例えば、局在化または検出を容易にするため）に設計された「タグ」をコードするタグ配列を含み得る。タグ配列は、コードされるタグがポリペプチドのカルボキシもしくはアミノ末端のいずれか位置するようにポリペプチドをコードする核酸配列内に挿入され得る。コードされるタグの非限定例として、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）が挙げられる。

核酸構築物は、任意のタイプの胚、胎児または生体偶蹄目／家畜細胞、例えば、卵母細胞または卵などの生殖細胞、前駆細胞、成体または胚性幹細胞、始原生殖細胞、ＰＫ−１５細胞などの腎細胞、島細胞、β細胞、肝細胞、または皮膚線維芽細胞などの線維芽細胞などに種々の技術を用いて導入され得る。技法の非限定例として、トランスポゾン系、細胞に感染し得る組換えウイルス、もしくはリポソームまたは核酸を細胞に送達し得る、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、もしくはリン酸カルシウム沈殿などの他の非ウイルス的方法の使用が挙げられる。

トランスポゾン系では、核酸構築物の転写単位、すなわち外因性核酸配列に作動可能に連結される調節領域は、トランスポゾンの反転リピートにより隣接される。幾つかのトランスポゾン系、例として、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（米国特許第６，６１３，７５２号明細書および米国特許出願公開第２００５／０００３５４２号明細書を参照）；Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ（Ｍｉｓｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３１：６８７３，２００３）；Ｔｏｌ２（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ７，２００７；Ｍｉｎｏｓ（Ｐａｖｌｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２，２００７）；Ｈｓｍａｒ１（Ｍｉｓｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２７：４５８９，２００７）；およびＰａｓｓｐｏｒｔなどが、核酸をマウス、ヒト、およびブタ細胞を含む細胞に導入するために開発されている。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンが特に有用である。トランスポゼースは、外因性核酸と同じ核酸構築物上でコードされるタンパク質として送達され得るか、別個の核酸構築物上で導入され得るか、またはｍＲＮＡ（例えば、インビトロ転写およびキャップ化ｍＲＮＡ）として提供され得る。

核酸は、ベクター中に取り込むことができる。ベクターは、担体から標的ＤＮＡ中に移動するように設計された任意の特定のＤＮＡセグメントを含む広義語である。ベクターは、発現ベクター、またはゲノムもしくは他の標的化ＤＮＡ配列、例えば、エピソーム、プラスミド、もしくはさらにはウイルス／ファージＤＮＡセグメントへのＤＮＡ挿入を生じさせるために必要とされる構成要素のセットであるベクター系と称してもよい。動物における遺伝子送達用に用いられるベクター系、例えば、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび統合ファージウイルス）、および非ウイルスベクター（例えば、トランスポゾン）は、２つの基本構成要素、すなわち、１）ＤＮＡ（またはｃＤＮＡに逆転写されるＲＮＡ）からなるベクターと、２）トランスポゼース、リコンビナーゼ、またはベクターおよびＤＮＡ標的配列の双方を認識し、ベクターを標的ＤＮＡ配列に挿入する他のインテグラーゼ酵素とを有する。ベクターは、１つ以上の発現調節配列を含む１つ以上の発現カセットを有することが最も多く、発現調節配列は、それぞれ別のＤＮＡ配列またはｍＲＮＡの転写および／または翻訳を調節および制御するＤＮＡ配列である。

多くの異なるタイプのベクターが公知である。例えば、プラスミドおよびウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターが公知である。哺乳動物発現プラスミドは、典型的には、複製起点、好適なプロモーターおよび任意選択的なエンハンサーとともに、任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５’フランキング非転写配列を有する。ベクターの例として、プラスミド（別のタイプのベクターの担体でもあり得る）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（例えば、改変ＨＩＶ−１、ＳＩＶまたはＦＩＶ）、レトロウイルス（例えば、ＡＳＶ、ＡＬＶまたはＭｏＭＬＶ）、およびトランスポゾン（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｐエレメント、Ｔｏｌ−２、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、ｐｉｇｇｙＢａｃ）が挙げられる。

本明細書で用いられるとき、核酸という用語は、ＲＮＡおよびＤＮＡの双方を指し、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば化学合成）ＤＮＡ、ならびに天然および化学修飾核酸、例えば合成塩基または他の骨格を含む。核酸分子は、二本鎖または一本鎖（すなわちセンスまたはアンチセンスの一本鎖）であり得る。トランスジェニックという用語は、本明細書で広義に用いられ、遺伝子材料が遺伝子操作技術を用いて改変されている遺伝子組換え生物または遺伝子操作生物を指す。それ故、ノックアウト偶蹄目は、外因性遺伝子または核酸が動物またはその子孫において発現されるか否かに無関係にトランスジェニックである。

遺伝子改変動物
動物は、ＴＡＬＥＮまたは他の遺伝子操作ツール、例として、リコンビナーゼ融合タンパク質、または公知の種々のベクターを用いて改変してもよい。かかるツールによって行われる遺伝子改変は、遺伝子の破壊を含んでもよい。遺伝子の破壊という用語は、機能的遺伝子産物の形成を阻止することを指す。遺伝子産物は、その正常な（野生型）機能を実行する場合に限り機能的である。遺伝子の破壊は、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を阻止し、遺伝子によりコードされる配列ならびに／または動物における遺伝子の発現に必要なプロモーターおよび／もしくはオペレーターの中での１つ以上の塩基の挿入、欠失、または置換を含む。破壊される遺伝子は、例えば、動物のゲノムからの遺伝子の少なくとも一部の除去、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を阻止するための遺伝子の改変、干渉ＲＮＡ、または外因性遺伝子によるドミナントネガティブ因子の発現により破壊してもよい。遺伝子改変動物の材料および方法は、全ての目的のために参照により本明細書中に援用される、米国特許第８，５１８，７０１号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０２５１３９５号明細書；および米国特許出願公開第２０１２／０２２２１４３号明細書にさらに詳述されており、矛盾する場合、本明細書が優先する。トランス作用性という用語は、異なる分子からの標的遺伝子に対して（すなわち分子間で）作用するプロセスを指す。トランス作用因子は通常、遺伝子を有するＤＮＡ配列である。この遺伝子は、標的遺伝子の調節において用いられるタンパク質（またはマイクロＲＮＡもしくは他の拡散性分子）をコードする。トランス作用性遺伝子は、標的遺伝子と同じ染色体上に存在し得るが、活性は、中間タンパク質またはそれがコードするＲＮＡを介するものである。トランス作用性遺伝子の実施形態は、例えば標的化エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子である。ドミナントネガティブを用いた遺伝子の不活性化は、一般にトランス作用因子を含む。シス調節性またはシス作用性という用語は、タンパク質もＲＮＡもコードしない場合の作用を意味する一方、遺伝子不活性化との関連では、これは一般に、遺伝子のコード部分、または機能的遺伝子の発現に必要なプロモーターおよび／もしくはオペレーターの不活性化を意味する。

ノックアウト動物を作製するのに遺伝子を不活化するため、および／またはファウンダー動物を作製するのに核酸構築物を動物に導入するため、ノックアウトまたは核酸構築物がゲノム中に組み込まれている動物系列を作製するため、当該技術分野で公知の様々な技術を用いることができる。かかる技術として、限定はされないが、前核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号明細書）、生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子導入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：６１４８−１６５２，１９８５）、胚性幹細胞への遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，５６：３１３−３２１，１９８９）、胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：１８０３−１８１４，１９８３）、精子媒介遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４２３０−１４２３５，２００２；Ｌａｖｉｔｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．，１８：１９−２３，２００６）、および体細胞、例えば卵丘もしくは乳腺細胞、または生体、胎児、もしくは胚性幹細胞のインビトロ形質転換とそれに続く核移植（Ｗｉｌｍｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８５：８１０−８１３，１９９７；およびＷａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９４：３６９−３７４，１９９８）が挙げられる。前核マイクロインジェクション、精子媒介遺伝子導入、および体細胞核移植が特に有用な技術である。ゲノム改変されている動物は、その生殖系列細胞を含むその細胞のすべてが遺伝子改変を有する動物である。遺伝子改変がモザイクである動物を作製する方法が用いられる場合、動物を同系交配してもよく、ゲノム改変されている子孫を選択してもよい。例えば、モザイク動物を作製する上で、その細胞が胚盤胞状態で改変される場合、クローン化を用いてもよく、または単一細胞が改変される場合、ゲノム改変が生じ得る。性的に成熟しないように改変されている動物は、用いられる特定の手法に応じて改変についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。特異的遺伝子がノックアウト改変により不活性化される場合、ホモ接合性が通常要求される。特異的遺伝子がＲＮＡ干渉またはドミナントネガティブ法により不活性化される場合、ヘテロ接合性が適切であることが多い。

典型的には、前核マイクロインジェクションでは、核酸構築物が受精卵に導入され、精子頭部および卵に由来する遺伝子材料を有する前核が原形質内で可視的であるため、１または２つの細胞受精卵が用いられる。前核段階の受精卵は、インビトロまたはインビボ（すなわち、ドナー動物の卵管から外科的に回収される）で得ることができる。体外受精卵は、以下のとおり作製され得る。例えば、ブタ卵巣は、食肉処理場において回収され、輸送の間２２〜２８℃で維持され得る。卵巣が洗浄され、卵胞吸引のために単離され得、４〜８ｍｍに及ぶ卵胞が、５０ｍＬのコニカル遠心管中に１８ゲージ針を用いて真空下で吸引され得る。卵胞液および吸引された卵母細胞は、市販のＴＬ−ＨＥＰＥＳ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）によりプレフィルターに通してリンスされ得る。コンパクトな卵丘塊により包囲される卵母細胞を選択し、０．１ｍｇ／ｍＬのシステイン、１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子、１０％のブタ卵胞液、５０μＭの２−メルカプトエタノール、０．５ｍｇ／ｍｌのｃＡＭＰ、１０ＩＵ／ｍＬずつの妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を添加したＴＣＭ−１９９卵母細胞成熟培地（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）中に加湿空気下で３８．７℃および５％のＣＯ_２において約２２時間配置することができる。続いて、卵母細胞は、ｃＡＭＰも、ｍＰＭＳＧも、ｈＣＧをも含有しない新たなＴＣＭ−１９９成熟培地に移され、さらに２２時間インキュベートされ得る。成熟卵母細胞は、それらの卵丘細胞から、０．１％のヒアルロニダーゼ中での１分間のボルテックス処理により剥がされ得る。

ブタにおいては、成熟卵母細胞を、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ製５ウェル受精用ディッシュ内、５００μｌのＭｉｎｉｔｕｂｅ ＰＯＲＣＰＲＯ ＩＶＦＭＥＤＩＵＭ ＳＹＳＴＥＭ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）で受精させることができる。体外受精（ＩＶＦ）の準備では、新たに採取したまたは凍結した成熟雄精液を洗浄し、ＰＯＲＣＰＲＯ ＩＶＦ Ｍｅｄｉｕｍ中に４×１０^５個の精子になるように再懸濁することができる。精子濃度は、コンピューター支援精液分析（ＳＰＥＲＭＶＩＳＩＯＮ，Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）により分析することができる。最終的な体外授精は、成熟雄に応じて約４０運動精子／卵母細胞の最終濃度にて、１０μｌの量で実施することができる。すべての授精卵母細胞を３８．７℃、５．０％ＣＯ_２雰囲気で６時間インキュベートする。授精から６時間後、推定される接合体をＮＣＳＵ−２３で２回洗浄し、０．５ｍＬの同じ培地に移すことができる。この系では通常、大部分の成熟雄において２０〜３０％胚盤胞を作製することができ、多精受精率は１０〜３０％である。

線状核酸構築物は、前核の１つに注射され得る。次に、注射された卵を、レシピエント雌に（たとえば、レシピエント雌の卵管に）導入し、レシピエント雌での発生を可能にすることで、トランスジェニック動物を作製することができる。特に、インビトロ受精胚は、１５，０００×ｇで５分間遠心して脂質を沈降させ、前核を可視化することができる。胚は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＦＥＭＴＯＪＥＴ注射器を用いて注射することができ、胚盤胞が形成されるまで培養することができる。胚の卵割および胚盤胞形成の割合ならびに品質は記録され得る。

胚は、非同調性レシピエントの子宮に外科的に移植され得る。典型的には、１００〜２００（例えば１５０〜２００）個の胚が、５．５インチＴＯＭＣＡＴ（登録商標）カテーテルを用いて、卵管の膨大部−峡部接合部に堆積され得る。手術後、妊娠のリアルタイム超音波検査が実施され得る。

体細胞核移植では、複合細胞を樹立するため、上記の核酸コンストラクトを含むトランスジェニック偶蹄目細胞（例えば、トランスジェニックブタ細胞またはウシ細胞）、例えば胚割球、胎仔線維芽細胞、成体耳部線維芽細胞、または顆粒膜細胞が、除核卵母細胞に導入され得る。卵母細胞は、極体近傍の透明帯部分切開後、切開領域で細胞質を押し出すことにより除核され得る。典型的には、鋭い斜角先端を有するインジェクションピペットを用いて、トランスジェニック細胞が第２減数分裂時に停止した除核卵母細胞に注射される。慣習として、第２減数分裂時に停止した卵母細胞は「卵」と称される。ブタまたはウシ胚の作製後（例えば卵母細胞の融合および活性化により）、活性化から約２０〜２４時間後、胚はレシピエント雌の輸卵管に移植される。例えば、Ｃｉｂｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０，１２５６−１２５８，１９９８および米国特許第６，５４８，７４１号明細書を参照のこと。ブタにおいては、胚の移植から約２０〜２１日後にレシピエント雌における妊娠を確認することができる。

標準的な繁殖技術は、初期のヘテロ接合型ファウンダー動物から外因性核酸のホモ接合体である動物を作製するため、用いることができる。しかし、ホモ接合型が必要とされない場合がある。本明細書に記載のトランスジェニックブタは、他の目的のブタと交配され得る。

一部の実施形態では、目的の核酸および選択可能なマーカーは、別々のトランスポゾン上に提供され、選択可能なマーカーを有するトランスポゾンの量が目的の核酸を有するトランスポゾンを大きく上回る（５〜１０倍過剰）同等でない量で胚または細胞のいずれかに提供され得る。目的の核酸を発現するトランスジェニック細胞または動物は、選択可能なマーカーの存在および発現に基づいて単離され得る。トランスポゾンが正確かつ非連鎖的（独立した転位事象）にゲノムに組み込まれるため、目的の核酸および選択可能なマーカーは遺伝的に連鎖しておらず、標準的な繁殖を介した遺伝的分離により容易に分離され得る。したがって、その後の世代において選択可能なマーカーを保持すること（公共の安全の立場からある程度懸念される課題）に制約されないトランスジェニック動物が作製され得る。

一旦トランスジェニック動物が作製されていると、外因性核酸の発現は、標準的な技術を用いてアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、構築物の組込みが行われているか否かを判定するためのサザンブロット分析により、達成され得る。サザン分析の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ；ＮＹのセクション９．３７−９．５２を参照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術もまた、初期スクリーニングで用いることができる。ＰＣＲとは、標的核酸を増幅する手順または技術を指す。一般に、目的の領域またはそれを超える領域の末端の配列情報が、増幅されるべき鋳型の逆鎖と配列が同一または類似するオリゴヌクレオチドプライマーを設計するのに利用される。ＰＣＲは、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡに由来する配列を含むＤＮＡおよびＲＮＡの特定の配列を増幅するため、用いることができる。プライマーは典型的には、１４〜４０ヌクレオチド長であるが、１０ヌクレオチド長から数百ヌクレオチド長の範囲であり得る。ＰＣＲは、例えば、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ編，Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載されている。核酸はまた、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自己保持配列複製、または核酸配列に基づく増幅により増幅され得る。たとえば、Ｌｅｗｉｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ １２：１，１９９２；Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４，１９９０；およびＷｅｉｓｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１２９２，１９９１を参照すること。胚は、胚盤胞期に、ＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション、およびｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ ＰＣＲによる分析用に個別に処理され得る（例えば、Ｄｕｐｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９９：４４９５，２００２を参照）。

トランスジェニックブタの組織内でのポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、例えば、動物から得られる組織試料のノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、ウエスタン分析、酵素結合免疫吸着アッセイなどの免疫測定、および逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む技術を用いて評価され得る。

干渉ＲＮＡ
種々の干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）は公知である。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、相同遺伝子転写物の配列特異的分解を誘導する。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）は、ｄｓＲＮＡを低分子の２１〜２３ヌクレオチドの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に代謝する。ＲＩＳＣは、二本鎖リボヌクレアーゼ（ｄｓＲＮアーゼ、例えばダイサー）およびｓｓＲＮアーゼ（例えば、Ａｒｇｏｎａｕｔ２またはＡｇｏ２）を有する。ＲＩＳＣは、切断可能な標的を見出すためのガイドとしてアンチセンス鎖を利用する。ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の双方は公知である。遺伝子改変動物における遺伝子を破壊する方法は、標的遺伝子および／または核酸の発現が低減するように、標的遺伝子および／または核酸に対するＲＮＡ干渉を誘導することを含む。

例えば、外因性核酸配列は、ポリペプチドをコードする核酸に対するＲＮＡ干渉を誘導し得る。例えば、標的ＤＮＡと相同な二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、そのＤＮＡの発現を低下させるため、用いることができる。ｓｉＲＮＡにおける構築物は、例えば、Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６，１９９８；Ｒｏｍａｎｏ ａｎｄ Ｍａｓｉｎｏ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６：３３４３，１９９２；Ｃｏｇｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１５：３１５３，１９９６；Ｃｏｇｏｎｉ ａｎｄ Ｍａｓｉｎｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３９９：１６６，１９９９；Ｍｉｓｑｕｉｔｔａ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：１４５１，１９９９；およびＫｅｎｎｅｒｄｅｌｌ ａｎｄ Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｃｅｌｌ，９５：１０１７，１９９８に記載の通りに作製され得る。ｓｈＲＮＡにおける構築物は、ＭｃＩｎｔｙｒｅ ａｎｄ Ｆａｎｎｉｎｇ（２００６）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１によって記載の通りに作製され得る。一般に、ｓｈＲＮＡは、アニールし、短鎖ヘアピンを形成し得る相補的領域を有する一本鎖ＲＮＡ分子として転写される。

特異的遺伝子に特異的な単一の個別の機能的ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを見出す確率は高い。ｓｉＲＮＡの特異的配列の予測可能性は、例えば約５０％であるが、多数の干渉ＲＮＡが、それらの少なくとも１つが効率的な良好な信頼性で作製可能である。

実施形態は、遺伝子、例えば発生段階において選択的な遺伝子に対して特異的なＲＮＡｉを発現する、インビトロ細胞、インビボ細胞、および家畜動物などの遺伝子改変動物を含む。ＲＮＡｉは、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＲＩＳＣおよびｍｉＲＮＡからなる群から選択してもよい。

誘導性系
誘導性系は、遺伝子の発現を制御するため、用いてもよい。遺伝子の発現の時空間的調節を可能とする様々な誘導性系が公知である。幾つかは、トランスジェニック動物においてインビボで機能的であることが判明している。誘導性系という用語は、慣習的なプロモーターおよび誘導性遺伝子発現因子を含む。

誘導性系の一例は、核酸の転写を制御するために用いることができるテトラサイクリン（ｔｅｔ）−ｏｎプロモーター系である。この系では、突然変異Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）が単純ヘルペスウイルスＶＰ１６トランス活性化因子タンパク質の活性化ドメインに融合されることで、テトラサイクリン制御性転写活性化因子（ｔＴＡ）を作出し、これはｔｅｔまたはドキシサイクリン（ｄｏｘ）により制御される。抗生物質の不在下では転写が最小限である一方、ｔｅｔまたはｄｏｘの存在下では転写が誘導される。代替的な誘導性系としては、エクジソンまたはラパマイシン系が挙げられる。エクジソンは、エクジソン受容体およびウルトラスピラクル遺伝子（ＵＳＰ）の産物のヘテロ二量体により生産が調節される昆虫脱皮ホルモンである。発現は、エクジソンまたはムリステロンＡなどのエクジソンの類似体による処理により誘導される。誘導性系を惹起するために動物に投与される薬剤は、誘導剤と称される。

より一般的に用いられる誘導性系の中には、テトラサイクリン誘導性系およびＣｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系（構成的または誘導性のいずれか）がある。テトラサイクリン誘導性系は、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）／逆ｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を含む。これらの系をインビボで用いるための方法は、２系統の遺伝子改変動物を作製することを含む。１つの動物系統は、選択されたプロモーターの制御下で活性化因子（ｔＴＡ、ｒｔＴＡ、またはＣｒｅリコンビナーゼ）を発現する。トランスジェニック動物の別のセットは、目的の遺伝子（または改変すべき遺伝子）の発現がｔＴＡ／ｒｔＴＡトランス活性化因子についての標的配列の制御下にある（またはｌｏｘＰ配列により隣接されている）アクセプターを発現する。２つのマウス株を交配させることにより、遺伝子発現の調節がもたらされる。

テトラサイクリン依存性調節系（ｔｅｔ系）は、２つの構成要素、すなわちテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡまたはｒｔＴＡ）および下流ｃＤＮＡの発現を調節するｔＴＡ／ｒｔＴＡ依存性プロモーターに、テトラサイクリンに依存する様式で依存する。テトラサイクリンまたはその誘導体（例えばドキシサイクリン）の不在下では、ｔＴＡはｔｅｔＯ配列に結合し、ｔＴＡ依存性プロモーターの転写活性化を可能とする。しかし、ドキシサイクリンの存在下では、ｔＴＡはその標的と相互作用し得ず、転写は生じない。ｔＴＡを用いるｔｅｔ系は、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンが転写下方調節を可能とするため、ｔｅｔ−ＯＦＦと称される。テトラサイクリンまたはその誘導体の投与により、インビボでの導入遺伝子発現の時間的制御が可能になる。ｒｔＴＡは、ドキシサイクリンの不在下では機能的でないが、トランス活性化のためにリガンドの存在を必要とするｔＴＡのバリアントである。したがって、このｔｅｔ系はｔｅｔ−ＯＮと称される。ｔｅｔ系は、例えば、レポーター遺伝子、癌遺伝子、またはシグナリングカスケードに関与するタンパク質、をコードする幾つかの導入遺伝子の誘導性発現のため、インビボで用いられている。

Ｃｒｅ／ｌｏｘ系では、２つの区別されるＣｒｅ認識配列、すなわちｌｏｘＰ部位の間のクロスオーバーによる部位特異的組換えを触媒するＣｒｅリコンビナーゼが用いられる。２つのｌｏｘＰ配列の間に導入されたＤＮＡ配列（ｆｌｏｘｅｄ ＤＮＡと称される）がＣｒｅ媒介組換えにより切り出される。空間的制御（組織特異的または細胞特異的プロモーターによる）または時間的制御（誘導性系による）のいずれかを用いるトランスジェニック動物におけるＣｒｅ発現の制御は、２つのｌｏｘＰ部位間のＤＮＡの切り出しの制御をもたらす。１つの適用は、条件的遺伝子不活性化（条件的ノックアウト）を対象とする。別の手法は、ｌｏｘＰが導入された終止コドンがプロモーター配列および目的のＤＮＡの間に挿入されるタンパク質過剰発現を対象とする。遺伝子改変動物は、Ｃｒｅが発現されてｌｏｘＰが導入された終止コドンの切り出しがもたらされるまで導入遺伝子を発現しない。この系は、組織特異的腫瘍形成およびＢリンパ球におけるアンチジーン受容体発現の制御に適用されている。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼもまた開発されている。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは、専ら外因性リガンドの投与により活性化される。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは、元のＣｒｅリコンビナーゼおよび特異的リガンド結合ドメインを有する融合タンパク質である。Ｃｒｅリコンビナーゼの機能的活性は、融合タンパク質中のこの特異的ドメインに結合し得る外部リガンドに依存的である。

実施形態は、誘導性系の制御下にある遺伝子を含むインビトロ細胞、インビボ細胞、および家畜動物などの遺伝子改変動物を含む。動物の遺伝子改変は、ゲノミックまたはモザイクであってもよい。誘導性系は、例えば、Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、Ｃｒｅ−ｌｏｘ、およびＨｉｆ１αからなる群から選択してもよい。実施形態は、本明細書に記載の遺伝子である。

ドミナントネガティブ
したがって、遺伝子は、除去またはＲＮＡｉ抑制だけでなく、その遺伝子産物の通常の機能に対して阻害効果を有するタンパク質のドミナントネガティブバリアントの作出／発現によっても破壊され得る。ドミナントネガティブ（ＤＮ）遺伝子の発現は、表現型の変更をもたらし得、ａ）タイトレーション効果；（ＤＮは、同一の活性を構成せずに内因性遺伝子の協調的因子または通常標的のいずれかについて内因性遺伝子産物と受動的に競合する）、ｂ）ドミナントネガティブ遺伝子産物が通常の遺伝子機能に要求されるプロセスと能動的に干渉するポイズンピル（またはモンキーレンチ）効果、ｃ）ＤＮが遺伝子機能の負の制御因子を能動的に刺激するフィードバック効果により発揮される。

ファウンダー動物、動物系統、形質、および生殖
ファウンダー動物（Ｆ０世代）は、クローン化および本明細書に記載の他の方法により作製してもよい。ファウンダーは、接合体または初代細胞がホモ接合性の改変を受ける場合のように、遺伝子改変についてホモ接合性であり得る。同様に、ファウンダーはまた、ヘテロ接合性に作製され得る。ファウンダーはゲノム的に改変されていてもよく、このことは、そのゲノムにおける細胞が改変を受けていることを意味する。ファウンダーは、ベクターが典型的には胚盤胞段階で胚における複数の細胞の１つに導入される場合に生じ得るように、改変についてモザイクであり得る。モザイク動物の子孫は、ゲノム的に改変されている子孫を同定するため、試験してもよい。動物系統は、有性生殖させることができ、または生殖補助技術により生殖させることができ、異種またはホモ接合性の子孫が常に改変を発現する動物のプールが作出されている場合、樹立される。

家畜では、多数の対立遺伝子が、生産形質、体型形質、作業性形質、および他の機能的形質などの様々な形質に関連づけられることは公知である。当業者は、これらの形質を監視し、定量化することに慣れている、例えば、Ｖｉｓｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，４０：１２３−１３７，１９９４、米国特許第７，７０９，２０６号明細書、米国特許出願公開第２００１／００１６３１５号明細書、米国特許出願公開第２０１１／００２３１４０号明細書、および米国特許出願公開第２００５／０１５３３１７号明細書。動物系統は、生産形質、体型形質、作業性形質、受精能形質、母性形質、および疾患耐性形質からなる群の形質から選択される形質を含んでもよい。さらなる形質としては、組換え遺伝子産物の発現が挙げられる。

リコンビナーゼ
本発明の実施形態は、標的化ヌクレアーゼ系を、リコンビナーゼ（例えば、ＲｅｃＡタンパク質、Ｒａｄ５１）またはＤＮＡ組換えに関連する他のＤＮＡ結合タンパク質とともに投与することを含む。リコンビナーゼは、核酸断片とフィラメントを形成し、事実上、細胞ＤＮＡを探索してその配列と実質的に相同なＤＮＡ配列を見出す。例えば、リコンビナーゼは、ＨＤＲに対する鋳型として機能する核酸配列と複合し得る。次いで、リコンビナーゼはＨＤＲ鋳型と複合してフィラメントを形成し、細胞内に配置される。リコンビナーゼおよび／またはリコンビナーゼと複合するＨＤＲ鋳型は、細胞または胚の中に、タンパク質、ｍＲＮＡとして、またはリコンビナーゼをコードするベクターを用いて配置され得る。米国特許出願公開第２０１１／００５９１６０号明細書（米国特許出願第１２／８６９，２３２号明細書）の開示は、本明細書によりあらゆる目的のために参照により本明細書中に援用され、矛盾する場合、本明細書が優先する。リコンビナーゼという用語は、細胞内で２つの比較的長いＤＮＡ鎖間での比較的短いＤＮＡ片の連結を酵素的に触媒する遺伝子組換え酵素を指す。リコンビナーゼとして、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、ＲｅｃＡ、ＲＡＤ５１、Ｃｒｅ、およびＦＬＰが挙げられる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位間のＤＮＡの部位特異的組換えを触媒するＰ１バクテリオファージ由来のＩ型トポイソメラーゼである。Ｈｉｎリコンビナーゼは、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌中に見出される１９８アミノ酸から構成される２１ｋＤのタンパク質である。Ｈｉｎは、ＤＮＡ切断および組換えの開始を活性部位セリンに依存するＤＮＡインベルターゼのセリンリコンビナーゼファミリーに属する。ＲＡＤ５１はヒト遺伝子である。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、ＤＮＡ二本鎖分解の修復を支援するＲＡＤ５１タンパク質ファミリーのメンバーである。ＲＡＤ５１ファミリーメンバーは、細菌ＲｅｃＡおよび酵母Ｒａｄ５１と相同である。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位により隣接される特定の配列を欠失させるための実験において用いられる酵素である。ＦＬＰは、パン酵母の出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μプラスミドに由来するフリッパーゼ組換え酵素（ＦＬＰまたはＦｌｐ）を指す。

本明細書では、「ＲｅｃＡ」または「ＲｅｃＡタンパク質」は、同じ機能、特に：（ｉ）その後のＤＮＡポリメラーゼによる伸長のために、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをその相同な標的に適切に配置する能力；（ｉｉ）ＤＮＡ合成のために二本鎖核酸を形態的に調製する能力；および（ｉｉｉ）ＲｅｃＡ／オリゴヌクレオチドまたはＲｅｃＡ／ポリヌクレオチド複合体が効率的に相補配列を発見して結合する能力、の本質的に全部または大部分を有するＲｅｃＡ様組換えタンパク質のファミリーを指す。最も特性が明らかにされたＲｅｃＡタンパク質は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来し、そのタンパク質の元の対立遺伝子型に加えて、幾つかの突然変異体ＲｅｃＡ様タンパク質、例えばＲｅｃＡ８０３が同定されている。さらに、多数の生物、例えば、酵母、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ヒトを含む哺乳動物、および植物などは、ＲｅｃＡ様鎖転移タンパク質を有する。これらのタンパク質として、例えば、Ｒｅｃ１、Ｒｅｃ２、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５１Ｅ、ＸＲＣＣ２、およびＤＭＣ１が挙げられる。組換えタンパク質の一実施形態は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質である。あるいは、ＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異体ＲｅｃＡ−８０３タンパク質、別の細菌源由来のＲｅｃＡタンパク質、または別の生物由来の相同組換えタンパク質であり得る。

組成物およびキット
本発明はまた、例えば、部位特異的エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、Ｃａｓ９、ＺＮＦ、ＴＡＬＥＮ、ＲｅｃＡ−ｇａｌ４融合物をコードする核酸分子、そのポリペプチドを含有する組成物およびキット、かかる核酸分子もしくはポリペプチド、または遺伝子操作された細胞系を含有する組成物を提供する。示される対立遺伝子の遺伝子移入に対して有効なＨＤＲもまた、提供され得る。かかるアイテムは、例えば研究ツールとして、または治療的に用いることができる。

方法は、特に断りがない限り、次の通りである。

組織培養および遺伝子導入．
ブタを、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｉ．Ｕ．／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシン、および２ｍＭのＬ−グルタミンを添加したＤＭＥＭ中、５％ＣＯ_２、３７℃で維持した。遺伝子導入においては、すべてのＴＡＬＥＮおよびＨＤＲ鋳型を、ＮＥＯＮ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて遺伝子導入を介して送達した。つまり、１００％コンフルエントに達した低継代のＯｓｓａｂａｗ、Ｌａｎｄｒａｃｅを１：２に分割し、７０〜８０％コンフルエントで翌日採取した。各遺伝子導入物は、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡおよびオリゴと混合した緩衝液「Ｒ」に再懸濁される５００，０００〜６００，０００個の細胞からなり、次のパラメータ、すなわち入力電位；１８００Ｖ；パルス幅；２０ｍｓ；およびパルス数；１により１００μｌの作動体積をもたらす１００μｌの先端部を用いて電気穿孔した。典型的には、目的の遺伝子に特異的な１〜２μｇのＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡおよび１〜４μＭのＨＤＲ鋳型（一本鎖オリゴヌクレオチド）を各遺伝子導入物に含めた。それらの量からの偏差を図や説明文に表示する。遺伝子導入後、細胞を６ウェルディッシュのウェルに３日間蒔き、各々３０℃で培養した。編集の安定性を評価するため、３日後、細胞集団をコロニー分析用に蒔いて、かつ／または３７℃で少なくとも１０日目まで展開した。

Ｓｕｒｖｅｙｏｒ突然変異検出およびＲＦＬＰ分析
目的部位に隣接するＰＣＲを、製造業者の推奨に従い、１μｌの細胞ライセートを有する白金Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＨｉＦｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。集団内での突然変異の頻度を、上記のように１０μｌのＰＣＲ産物を用いて、製造業者の推奨に従い、ＳＵＲＶＥＹＯＲ突然変異検出キット（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）を用いて分析した。ＲＦＬＰ分析は、表示の制限酵素を用いて、１０μｌの上記ＰＣＲ反応物に対して実施した。ＳｕｒｖｅｙｏｒおよびＲＦＬＰ反応は、１０％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル上で分解し、臭化エチジウム染色により可視化した。バンドのデンシトメトリー測定を、ＩＭＡＧＥＪを用いて実施し、またＧｕｓｃｈｉｎら、２０１０（１）に記載の通りにＳｕｒｖｅｙｏｒ反応物の突然変異率を算出した。パーセント相同組換え修復（ＨＤＲ）を、ＲＦＬＰ断片の強度和を親バンド＋ＲＦＬＰ断片の強度和で除することによって算出した。コロニーのＲＦＬＰ分析は、ＰＣＲ産物が１×ＭＹＴＡＱ ＲＥＤ ＭＩＸ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）により増幅され、２．５％アガロースゲル上で分解されたことを除けば、同様に扱った。

希釈クローニング
遺伝子導入後の３日目、５０〜２５０個の細胞を、１０ｃｍのディッシュ上に播種し、個々のコロニーの直径が約５ｍｍに達するまで培養した。この時点で、ＰＢＳで希釈した６ｍｌのＴＲＹＰＬＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１：５（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を添加し、コロニーを吸引し、２４ウェルディッシュウェルのウェルに移し、同じ条件下で培養した。コンフルエントに達したコロニーを採取し、凍結保存および遺伝子型判定のために分割した。

試料の調製．
３日目および１０日目、遺伝子導入した細胞集団を６ウェルディッシュのウェルから採取し、１０〜３０％を、２００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを新たに添加した、５０μｌの１×ＰＣＲに互換性の溶解用緩衝液：１０ｍＭのトリス−Ｃｌ ｐＨ８．０、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．４５％ＴＲＹＴＯＮ Ｘ−１００（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、０．４５％ツイーン−２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に再懸濁した。ライセートを、５５℃で６０分間、９５℃で１５分間というプログラムを用いて、サーマルサイクラー内で処理した。希釈クローニングからのコロニー試料を、上記のように２０〜３０μｌの溶解用緩衝液を用いて処理した。

実施例１ 多重遺伝子編集
ブタＲＡＧ２およびＩＬ２Ｒγに特異的な６つの条件のＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡおよびＨＤＲ鋳型を、ブタ線維芽細胞に同時遺伝子導入した。各遺伝子導入に対して一定量のＲＡＧ２ ｍＲＮＡおよび鋳型を用いたが、ＩＬ２Ｒｇ ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡおよびＨＤＲ鋳型の量は、表示される各条件に応じて変更する。ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡおよびＨＤＲ鋳型の用量は、的確な効果および的外れの効果の双方を有する。ＩＬ２Ｒγに対するＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡの増加は、ＩＬ２Ｒγに対するＮＨＥＪおよびＨＤＲの双方の増加をもたらしたが、ＲＡＧ２に対するＮＨＥＪレベルは不変であった。ＩＬ２Ｒγ ＨＤＲ鋳型の増加はＲＡＧ２遺伝子座でのＨＤＲを低下させたが、これはオリゴヌクレオチドの濃度の増大による相同組換え修復の非特異的阻害を示唆している。ＲＡＧ２およびＩＬ２Ｒγに両アレルＨＤＲを伴うコロニーが、２つの条件から４および２パーセント（予想された２パーセントの頻度とそれを超える頻度）で得られた（図３パネルｃ、パネルｄ）。予想された頻度は、各ＨＤＲ対立遺伝子を独立事象として扱う、３日目のＨＤＲレベルの掛け算により算出される。（図３を参照）ブタＲＡＧ２およびＩＬ２Ｒγの多重遺伝子編集。ａ）遺伝子導入後３日目での細胞集団に対する非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換え修復ＨＤＲの効率を判定するためのＳＵＲＶＥＹＯＲおよびＲＦＬＰ分析。ｂ）遺伝子導入後１１日目での細胞集団に対する相同組換え修復におけるＲＦＬＰ分析。ｃ）ＩＬ２Ｒγ、ＲＡＧ２または双方でのＨＤＲが陽性であるコロニーの百分率。細胞は、パネルａ中の「Ｃ」で表示される集団から蒔いた。コロニー遺伝子型の分布を以下に示す。ｄ）ＩＬ２ＲγおよびＲＡＧ２に対して２μｇおよび１μｇの量のＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡならびに各々に対して１μＭでのＨＤＲ鋳型を遺伝子導入した細胞からのコロニー分析。コロニー遺伝子型の分布を以下に示す。

実施例２ 多重遺伝子編集
ブタＡＰＣおよびｐ５３に特異的な４つの条件のＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡおよびＨＤＲ鋳型を、ブタ線維芽細胞に同時遺伝子導入した。ＡＰＣ ｍＲＮＡの量は、左から右へ順次減少し（図４パネルｂ）、その量以外は表示の通り一定のままであった。パーセントＨＤＲは、ＡＰＣ ｍＲＮＡの減少とともに、線形的に低下した。ＡＰＣ ＴＡＬＥＮの用量変更に伴うｐ５３ ＨＤＲに対する効果はほとんど認められなかった。コロニーの遺伝子型判定によると、１１日目の値に関連するＡＰＣおよびｐ５３の双方におけるクローンとＨＤＲ対立遺伝子との想定される結合より高く、図４パネルｃおよび図４パネルｄの場合、１３．７および７．１パーセントに対して各々、１８および２０パーセントであることが示された。（図４を参照）ブタＡＰＣおよびｐ５３の多重遺伝子編集。パネルａ）遺伝子導入後３日目での細胞集団に対する非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換え修復ＨＤＲの効率を判定するためのＳＵＲＶＥＹＯＲおよびＲＦＬＰ分析。パネルｂ）遺伝子導入後１１日目での細胞集団に対する相同組換え修復におけるＲＦＬＰ分析。パネルｃ）およびｄ）ＡＰＣ、ｐ５３または双方でのＨＤＲに対する表示される細胞集団（パネルａの「Ｃ」および「Ｄ」で表示される）由来の陽性コロニーの百分率。３以上のＨＤＲ対立遺伝子を有するコロニーを以下に示す。

実施例３ 少なくとも３つの遺伝子での多重
実施例１では、ＨＤＲの非特異的低下が高濃度のＨＤＲオリゴで認められ、それ故、２＋ＨＤＲオリゴがＨＤＲの非特異的阻害を伴わずに有効であり得るか否かは未知であった。各標的部位に対して２つの濃度、１ｕＭおよび２ｕＭについて試験した。ＴＡＬＥＮ活性は２つの条件間で有意に変化しなかったが、ＨＤＲは各鋳型に対して２ｕＭの濃度で有意に平滑末端化された。１ｕＭの条件に由来するクローンは種々の遺伝子型を有し、それらの一部は各遺伝子および最大で７つの対立遺伝子において編集を有した（図６）。独立事象として処理される場合、７つの対立遺伝子が編集された、「ａ」で表示される予想される遺伝子型の頻度は０．００１パーセントである。二項分布は、かかる遺伝子型の２＋コロニーを７２のサイズの試料中に同定する尤度を予測し、この場合の予測では、０．００００２６パーセント未満である。この高い奏効率は予測できなかったが、想定外でかつ意外である。この結果は、ＴＡＬＥＮ／ＨＤＲ鋳型の２つのさらなる組み合わせで繰り返された（図７および８）。最初の試験結果と同様、最大で７つの対立遺伝子および最大で４つの遺伝子においてＨＤＲ編集を伴うコロニーが得られた（表Ａ）。幾つかの遺伝子型が偶然、予想をはるかに上回る頻度で回収された。幾つかの遺伝子座での同時二本鎖切断に関する懸念として意図しない染色体再配列の誘導が挙げられるが、試験３の細胞からの試験した５０中５０の核型が正常であった（データは示さず）。

（図５を参照）５遺伝子多重ＨＤＲ効率に対するオリゴヌクレオチドＨＤＲ鋳型濃度の効果。ブタＲＡＧ２、ＩＬ２Ｒｇ、ｐ５３、ＡＰＣおよびＬＤＬＲに特異的な表示量のＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡを、２ｕＭ（パネルａ）または１ｕＭ（パネルｂ）の各々の同族ＨＤＲ鋳型とともに、ブタ線維芽細胞に同時遺伝子導入した。パーセントＮＨＥＪおよびＨＤＲ、ＳｕｒｖｅｙｏｒおよびＲＦＬＰアッセイにより測定した。（図６を参照）５遺伝子多重ＨＤＲから得られたコロニー遺伝子型。コロニー遺伝子型は、ＲＦＬＰ分析により評価した。パネルａ）各ラインは、各々の特定の遺伝子座での１つのコロニーの遺伝子型を表す。３つの遺伝子型、すなわちヘテロ接合性またはホモ接合性ＨＤＲの予想されるＲＦＬＰ遺伝子型を有するもの、ならびにＲＦＬＰ陽性断片に加え、挿入または欠失（インデル）対立遺伝子を示すサイズ的に可視的変化を有する第２の対立遺伝子を有するものを同定することができた。特定の遺伝子座に編集を有する伴うコロニーの百分率を各カラムの下部に表示する。パネルｂ）０〜５の遺伝子座で編集されたコロニーの総数。（図７を参照）第２の５遺伝子多重試験のコロニー遺伝子型。パネルａ）各ラインは、各々の特定の遺伝子座での１つのコロニーの遺伝子型を表す。３つの遺伝子型、すなわちヘテロ接合性またはホモ接合性ＨＤＲの予想されるＲＦＬＰ遺伝子型を有するもの、ならびにＲＦＬＰ陽性断片に加え、挿入または欠失（インデル）対立遺伝子を示すサイズ的に可視的変化を有する第２の対立遺伝子を有するものを同定することができた。特定の遺伝子座に編集を有するコロニーの百分率を各カラムの下部に表示する。パネルｂ）０〜５の遺伝子座で編集されたコロニーの総数。（図８を参照）第３の５遺伝子多重試験のコロニー遺伝子型。パネルａ）各ラインは、各々の特定の遺伝子座での１つのコロニーの遺伝子型を表す。３つの遺伝子型、すなわちヘテロ接合性またはホモ接合性ＨＤＲの予想されるＲＦＬＰ遺伝子型を有するもの、ならびにＲＦＬＰ陽性断片に加え、挿入または欠失（インデル）対立遺伝子を示すサイズ的に可視的変化を有する第２の対立遺伝子を有するものを同定することができた。特定の遺伝子座に編集を有するコロニーの百分率を各カラムの下部に表示する。パネルｂ）０〜５の遺伝子座で編集されたコロニーの総数。

実施例４Ａ〜４ＤＤ
実施例４Ａ：多重遺伝子編集によりＲＡＧ２／ＩＬ２Ｒｇヌル（ＲＧ−ＫＯ）ブタ線維芽細胞を発生させる。
雄ブタ胎児線維芽細胞に、本発明者らが先行的に規定した方法を用いて、ＲＡＧ２およびＩＬ２Ｒｇの破壊のため、ＴＡＬＥＮおよびオリゴヌクレオチド鋳型を遺伝子導入することになる（Ｔａｎ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｎｏｎｍｅｉｏｔｉｃ ａｌｌｅｌｅ ｉｎｔｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ｕｓｉｎｇ ｃｕｓｔｏｍ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．ＰＮＡＳ，１１０（４１）：１６５２６−１６５３１，２０１３）。ＲＧ−ＫＯ候補は、配列決定によって確認される通り、例えば制限酵素長多型（ＲＦＬＰ）により同定することになる。少なくとも約５つの確認されたＲＧ−ＫＯコロニーは、クローン化およびキメラ作製における資源としてプールすることになる。

実施例４Ｂ：ＲＧ−ＫＯ宿主胚盤胞を用いてのキメラ胚の作製。
宿主ＲＧ−ＫＯ胚および雌ＥＧＦＰ標識ドナー細胞を、クロマチン移植技術とそれに続く胚盤胞段階までのインビトロ培養を用いて作製することになる。実施例１からのＲＧ−ＫＯ細胞を用いてもよい。７日目のＥＧＦＰ胚盤胞由来の細胞間凝集塊を、同期させた雌ブタへの胚移植前、６日目のＲＧ−ＫＯ胚に注射することになる。この手法を用いて、Ｎａｇａｓｈｉｍａおよび同僚は、５０パーセントを上回る生産子ブタでキメラ化を認めた（Ｎａｇａｓｈｉｍａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｘ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｉｇｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，７０（３）：７０２−７０７，２００４）。雄表現型は、マウスおよびブタの双方におけるインジェクションキメラにおいて優性である。したがって、雌ドナー細胞を注射したＸＹ ＲＧ−ＫＯ宿主は、雄宿主の遺伝的性質を排他的に伝えることになる。妊娠検査は、適切な時期、例えば２５、５０、および１００日目に行うことになる。妊娠の約１００日目の妊娠雌ブタは、約１１４日目までに、子ブタの帝王切開出産に先立ち１日４回監視することになる。

実施例４Ｃ：非キメラ子孫におけるＴ、ＢおよびＮＫ細胞が欠損しているか否かを判定する。
非キメラ子孫は、Ｔ、ＢおよびＮＫ細胞が欠損しているか否かを判定するため、試験することになる。以下の方法は、そのための１つの技法である。帝王切開出産は、推定上のキメラを保有する各雌ブタおよび野生型子ブタを保有する１つの繁殖雌ブタに対して行うことになる。臍帯血は、帝王切開出産の直後、各子ブタから単離することになる。臍帯血白血球は、Ｔ、ＢおよびＮＫ細胞集団ならびにドナーに由来するＥＧＦＰ発現について、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）により評価することになる。さらに、キメラ化は、臍帯血、耳および尾の生検からＰＣＲにより評価することになる。この初期分析は、非キメラ子ブタを密に監視し、感染の徴候とともに人道的に安楽死させることができるように、出生から６時間以内に完了することになる。非キメラ動物の一部、または免疫細胞が欠如したものは、剖検用に安楽死させることになる。

実施例４Ｄ：キメラブタを同定し、Ｔ、ＢおよびＮＫ細胞の起源を判定する。
キメラブタは、Ｔ、ＢおよびＮＫ細胞の起源を判定するため、試験することになる。以下の方法は、そのための１つの技法である。キメラ子ブタは、上記の方法を用いて同定することになる。リンパ球および血清免疫グロブリンの循環に関する週毎の評価では、キメラ、非キメラおよび野生型子ブタの間で２か月の期間にわたり比較することになる。選別されたＴ、ＢおよびＮＫ細胞の集団は、ドナーの起源を確認するため、ＥＧＦＰ発現およびマイクロサテライト分析について評価することになる。キメラブタ由来の試料および精液収集物の維持は、第ＩＩ相の資金提供が可能になるまで、ＲＣＩにより支持されることになる。

実施例Ａ〜Ｄにおける試料の手順：
臍帯血および末梢血のＦＡＣＳ
血液リンパ球およびＥＧＦＰキメラ化に関する評価は、ブタ標本への適応とともに前述の（２）の通りに実施することになる。臍帯血は、帝王切開出産の直後、各子ブタから採取することになる。臍帯血の一部は、潜在的同種移植片処理のために処理し、凍結保存することになる一方、残りはリンパ球のＦＡＣＳ分析用に用いることになる。末梢血試料は、標準的方法により、２、４、６および８週齢目に採取することになる。ＲＢＣを除去し、１−２Ｅ＋５個の細胞を管に分布させることになる。アリコートは、Ｔ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８）、Ｂ細胞（ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ３）、ＮＫ細胞（ＣＤ１６およびＣＤ３）および骨髄系細胞（ＣＤ３）の同定のため、抗ブタ抗体で標識することになる。抗原発現は、ＬＳ ＲＩＩ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で定量化することになる。フルオロフォアは、表面抗原とともにドナー由来のＥＧＦＰ細胞の多重評価を可能にするように慎重に選択することになる。脾臓由来の単一細胞懸濁液は、同じ方法により分析することになる。

試験
すべての主要な器官および組織は、適切な解剖学的発生について全体的に試験することになり、また、膵臓、肝臓、心臓、腎臓、肺、胃腸、免疫系（末梢および粘膜リンパ節および脾臓）、およびＣＮＳを含むすべての主要な器官および組織に由来する適切な試料は、ＤＮＡ単離用に採取することになる。単一細胞懸濁液は、ＦＡＣＳ分析用に脾臓から調製することになる。組織は、キメラ化をさらに評価するための組織学的検査のため、キメラ状態に関連し得る任意の改変のため、また任意の基礎疾患の存在について、調製することになる。

キメラ化の評価
定量ＰＣＲは、臍帯血、耳、および尾の生検に対して、ＥＧＦＰ導入遺伝子に特異的なプライマーを用いて行い、野生型細胞に対するＥＧＦＰの既知の比を用いた検量線と比較することになる。標本におけるＲＧ−ＫＯ対立遺伝子についても、前述のＲＦＬＰアッセイを介して評価することになる。ＥＧＦＰ＋細胞の生着は、すべての動物および器官に対して剖検中に巨視的に評価することになる。宿主細胞に対するドナーの比を決定するため、主要な器官由来の組織は、ＥＧＦＰ免疫組織化学用に切片を作成し、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で対比染色することになる。

マイクロサテライト分析
動物は、宿主およびドナーの遺伝的性質に対して有益なマイクロサテライトについて、我々の研究室で通常用いるものからスクリーニングすることになる。組織および血液由来の試料（選別されたリンパ球または骨髄系統、ＥＧＦＰ陽性および陰性）を評価することになる。ドナー対宿主細胞の相対量は、ＭＩＳＥＱ装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）での多重化アンプリコン配列決定により評価することになる。

動物
臍帯血中および末梢血中でＴ、ＢおよびＮＫ細胞の不在を有する非キメラブタを作製することになる。キメラブタは、概ね野生型レベルに実質的に類似したレベルを有することになる。さらに、Ｔ、ＢおよびＮＫ細胞が陽性のキメラは、標準的条件下で飼育する場合、実質的に正常な免疫機能を有し、かつ健常性を維持することになる。

実施例５ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の設計および作製
遺伝子に特異的なｇＲＮＡ配列を、Ｃｈｕｒｃｈ ｌａｂ ｇＲＮＡベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：４１８２４）に、その方法に従ってクローン化した。Ｃａｓ９ヌクレアーゼを、ｈＣａｓ９プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：４１８１５）またはＲＣＩＳｃｒｉｐｔ−ｈＣａｓ９から合成したｍＲＮＡの同時遺伝子導入のいずれかにより準備した。このＲＣＩＳｃｒｉｐｔ−ｈＣａｓ９は、ＸｂａＩ−ＡｇｅＩ断片を（ｈＣａｓ９ ｃＤＮＡを包含する）ｈＣａｓ９プラスミドからＲＣＩＳｃｒｉｐｔプラスミドへサブクローン化することにより構築した。ｍＲＮＡの合成は、ＫｐｎＩを用いて直線化を行ったこと以外は上記のように行った。

実施例６ 標的化エンドヌクレアーゼおよびＨＤＲを用いた多重遺伝子編集。パネル（ａ）は、（縞模様で表示されるｃＤＮＡ−エクソンとして示される）多重実験における各遺伝子の模式図であり、ＴＡＬＥＮによって標的化される部位を示す。各遺伝子におけるＤＮＡ結合ドメインをコードする配列を下記に示す。ブタ線維芽細胞に、遺伝子型判定のため、中途での終止コドンおよび新規なＨｉｎｄＩＩＩ ＲＦＬＰ部位を挿入するように設計した、各遺伝子を標的化する、１ｕｇの各ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡおよび０．１ｎモルの各ＨＤＲオリゴ（図１２パネルｂ）を同時遺伝子導入した。遺伝子型判定のため、全部で３８４のコロニーを単離した。ＧＡＴＡ４およびＮｋｘ２−５ ＲＦＬＰアッセイを実施し（図１２のパネルｃ）、ＭＥＳＰ１を配列決定により評価した（データは示さず）。２つのコロニー（２／３８４、０．５２％）は、３つすべての遺伝子についてホモ接合性ＨＤＲノックアウトであった。三重ノックアウトはアスターリスクで表示する（図１２パネルｃ）。さらなる遺伝子型が、パネルｃ、例えばＨＤＲ編集を伴わないコロニー４９；ＮＫＸ２−５に対するヘテロ接合性編集を伴うコロニー５２および６３；ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４の双方などに対するヘテロ接合性編集を伴うコロニー５９において認めることができる。

実施例７ ＴＡＬＥＮおよびＲＧＥＮの組み合わせを用いた多重遺伝子編集（図１３を参照）。ブタ線維芽細胞に、各遺伝子に対するＴＡＬＥＮ（１ｕｇのＥＩＦ４Ｇ １４．１ ｍＲＮＡ）＋Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ成分（２ｕｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡ＋２ｕｇのｐ６５ Ｇ１ガイドＲＮＡ）および０２ｎモルのＨＤＲオリゴを同時遺伝子導入した。遺伝子導入細胞はＲＦＬＰアッセイにより評価し、両部位でＨＤＲを示した。この集団由来の細胞は、コロニーの単離を意図して蒔くことになり、両方の遺伝子中に編集を有する単離物を同定する。

さらなる開示
本明細書中に記載の特許、特許出願、出版物、および論文は、ここで参照により援用され、矛盾する場合、本明細書が優先する。本実施形態は、様々な特徴を有し、これらの特徴は、機能的な実施形態を作成する必要性によって導かれるものとして混合され、一致され得る。見出しおよび副見出しは、便宜的に提供されるが、本質的なものでなく、説明内容の範囲を限定するものではない。以下の番号付けされたステートメントは、本発明の実施形態を提示する。
１Ａ．複数の標的染色体ＤＮＡ部位で脊椎動物の細胞または胚における遺伝子編集を行う方法であって、
第１の標的染色体ＤＮＡ部位に特異的な第１の標的化エンドヌクレアーゼおよび第１の標的部位配列に相同な第１の相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型；および
第２の標的染色体ＤＮＡ部位に特異的な第２の標的化エンドヌクレアーゼおよび第２の標的部位配列に相同な第２のＨＤＲ鋳型
を脊椎動物の細胞または胚に導入するステップを含み、
第１のＨＤＲ鋳型配列が第１の標的部位で天然染色体ＤＮＡ配列を置換し、かつ第２のＨＤＲ鋳型配列が第２の標的部位配列で天然染色体ＤＮＡ配列を置換する、
方法。
１Ｂ．動物の複数の対立遺伝子を編集する方法であって、
各々が異なる対立遺伝子の遺伝子座を標的にする複数の標的化ヌクレアーゼおよび各々の標的化された対立遺伝子の遺伝子座に対する相同組換え修復鋳型を、初代家畜細胞または家畜胚に導入するステップを含み、
標的化エンドヌクレアーゼは複数の標的化エンドヌクレアーゼの各々と同族の対立遺伝子の遺伝子座において二重鎖分解を作成し、かつ細胞は相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型核酸配列を各々のＨＤＲ鋳型に同族の遺伝子座に複製し、それにより対立遺伝子を編集する、方法。
２．第３、第４、第５、第６および第７の標的染色体ＤＮＡ部位に各々特異的な第３、第４、第５、第６および第７の標的化エンドヌクレアーゼ、ならびに
第３、第４、第５、第６および第７の標的染色体ＤＮＡ部位に各々相同な第３、第４、第５、第６および第７のＨＤＲ鋳型
の１つ以上を細胞または胚に導入するステップをさらに含む、１のいずれかに記載の方法。
３．標的化エンドヌクレアーゼがＴＡＬＥＮを含む、１〜２のいずれかに記載の方法。
４．標的化エンドヌクレアーゼが亜鉛フィンガーヌクレアーゼまたはＣａｓ９を含む、１〜３のいずれかに記載の方法。
５．少なくとも第１の標的染色体ＤＮＡ部位が対立遺伝子における遺伝子座である、１〜４のいずれかに記載の方法。
６．前記ＨＤＲ鋳型の少なくとも１つが、鋳型に同族のＤＮＡ標的部位のノックアウトをコードする、５に記載の方法。
７．前記ＨＤＲ鋳型の少なくとも１つが、外因性対立遺伝子における、鋳型に同族のＤＮＡ標的部位での対立遺伝子の置換をコードする、５に記載の方法。
８．細胞または胚が家畜の第一種または第一品種であり、かつ複数の編集が天然対立遺伝子と動物の第二種または第二品種に由来する外因性対立遺伝子との置換を含む、１に記載の方法。
９．動物が第二品種または別種の対応する外因性対立遺伝子と置換された少なくとも３つの天然対立遺伝子を有する動物の第一品種であり、前記外因性対立遺伝子は減数分裂組換えを伴わない対応する天然対立遺伝子の置換であり、ここで動物は外因性マーカー遺伝子を含まない、１に記載の方法。
１０．少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、または７つの標的染色体ＤＮＡ部位が各々、異なる対立遺伝子における遺伝子座である、２に記載の方法。
１１．ＨＤＲ鋳型の１つ以上が、鋳型に同族のＤＮＡ標的部位のノックアウトをコードする、１０に記載の方法。
１２．前記ＨＤＲ鋳型の少なくとも１つが、外因性対立遺伝子における、鋳型に同族のＤＮＡ標的部位での対立遺伝子の置換をコードする、１０に記載の方法。
１３．細胞または胚が標的ＤＮＡ部位での複数の遺伝子編集についてホモ接合性であり、前記編集が前記標的ＤＮＡ部位に同族のＨＤＲ鋳型によってコードされる、１〜１２のいずれかに記載の方法。
１４．細胞または胚が標的ＤＮＡ部位での複数の遺伝子編集についてヘテロ接合性であり、前記編集が前記標的ＤＮＡ部位に同族のＨＤＲ鋳型によってコードされる、１〜１２のいずれかに記載の方法。
１５．遺伝子編集が、動物の別品種または動物の別種に由来する対立遺伝子のノックアウトまたは遺伝子移入を含む、１１〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．細胞または胚が家畜の第一種または第一品種であり、かつ複数の編集が天然対立遺伝子と動物の第二種または第二品種に由来する外因性対立遺伝子との置換を含む、１１〜１４のいずれかに記載の方法。
１７．外因性対立遺伝子および天然対立遺伝子のＤＮＡ配列が１つ以上の位置で異なり、ここで天然対立遺伝子と外因性対立遺伝子との置換により、動物の第二品種または第二種に対して同一の細胞または胚の染色体ＤＮＡ配列が、前記位置にわたる整列化による評価によると、前記位置のいずれかの各側で少なくとも２００塩基対（ｂｐ）の距離で作製される、１６に記載の方法。
１８．距離が２００〜２０００ｂｐの間の数である、１７に記載の方法。
１９．細胞または胚が標的ＤＮＡ部位での複数の遺伝子編集についてホモ接合性であり、前記編集が前記標的ＤＮＡ部位に同族のＨＤＲ鋳型によってコードされる、１〜１７のいずれかに記載の方法。
２０．細胞または胚が標的ＤＮＡ部位での複数の遺伝子編集についてヘテロ接合性であり、前記編集が前記標的ＤＮＡ部位に同族のＨＤＲ鋳型によってコードされる、１〜１７のいずれかに記載の方法。
２１．細胞または胚が、大型脊椎動物、家畜、サル、イヌ、ネコ、トリ、鳥類、魚類、ウサギ、ブタ、ウシ、水牛、ヤギ、ヒツジ、および偶蹄目からなる群から選択される、１〜２０のいずれかに記載の方法。
２２．細胞が、接合体、幹細胞、成体幹細胞、多能性細胞、前駆細胞、および初代細胞からなる群から選択される、１〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．胚が、接合体、胚盤胞、桑実胚であるか、または１〜２００の多数の細胞を有する、１〜２１のいずれかに記載の方法。
２４．エンドヌクレアーゼの１つ以上および／またはＨＤＲ鋳型の１つ以上をコードするｍＲＮＡを導入するステップを含む、１〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．エンドヌクレアーゼの１つ以上がタンパク質として細胞または胚に導入される、１〜２４のいずれかに記載の方法。
２６．エンドヌクレアーゼの１つ以上（例えばその各々）が、ｍＲＮＡとして提供され、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度を有する溶液から細胞または胚に導入され（当業者は、明示される制限以内のすべての値および範囲、例えば、約２０、約１〜約２０、約０．５〜約５０などが検討されることを直ちに理解するであろう）；および／または
ＨＤＲ鋳型の１つ以上（例えばその各々）が、ｍＲＮＡとして提供され、約０．２μＭ〜約２０μＭの濃度を有する溶液から細胞または胚に導入される、
１〜２５のいずれかに記載の方法。
２７．エンドヌクレアーゼおよび／またはＨＤＲ鋳型の導入のためのエレクトロポレーションを含む、１〜２６のいずれかに記載の方法。
２８．エンドヌクレアーゼおよび／またはＨＤＲが、化学に基づく方法、非化学的方法、粒子に基づく方法、およびウイルスによる方法からなる群から選択される方法によって導入される、１〜２７のいずれかに記載の方法。
２９．エンドヌクレアーゼおよび／またはＨＤＲ鋳型を発現させるため、１つ以上のベクターを細胞または胚に導入するステップを含む、１３〜２８のいずれかに記載の方法。
３０．標的化エンドヌクレアーゼが、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ、またはＴＡＬＥＮとＣＲＩＳＰＲとの組み合わせである、１〜２９のいずれかに記載の方法。
３１．編集が遺伝子ノックアウトである、３０に記載の方法。
３２．標的部位配列の１つ以上が以下のリストから選択されるか、または外因性対立遺伝子または天然対立遺伝子の１つ以上が以下のリスト：ＩＬ２Ｒｇｙ／−、ＲＡＧ２−／−、ＩＬ２Ｒｇ^−／−、ＲＡＧ２^−／−、ＩＬ２Ｒｇｙ／−、ＲＡＧ２−／−、ＩＬ２Ｒｇ＋／−、ＲＡＧ２＋／−、ＩＬ２Ｒｇ^ｙ／＋、ＲＡＧ２^＋／−、ＩＬ２Ｒｇ^＋／−、ＲＡＧ２^＋／−、ＤＧＡＴ（ジグリセリドアシルトランスフェラーゼ）、ＡＢＣＧ２（ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２）、ＡＣＡＮ（アグリカン）、ＡＭＥＬＹ（アメロゲニン、Ｙ連鎖性）、ＢＬＧ（プロゲスターゲン関連子宮内膜タンパク質）、ＢＭＰ１Ｂ（ＦｅｃＢ）（骨形成タンパク質受容体、１Ｂ型）、ＤＡＺＬ（無精子症様における欠失）、Ｅｉｆ４ＧＩ（真核生物翻訳開始因子４γ、１）、ＧＤＦ８（成長／分化因子８）、Ｈｏｒｎ−ｐｏｌｌ ｌｏｃｕｓ、ＩＧＦ２（インスリン様成長因子２）、ＣＷＣ１５（ＣＷＣ１５スプライソゾーム関連タンパク質）、ＫｉｓｓＲ／ＧＲＰ５４（キスペプチン）、ＯＦＤ１Ｙ（Ｙ連鎖性口−顔−指症候群１型偽遺伝子）、ｐ６５（ｖ−ｒｅｌ細網内皮症ウイルス癌遺伝子相同体Ａ）、ＰＲＬＲ（プロラクチン受容体）、Ｐｒｍｄ１４（ＰＲドメイン含有１４）、ＰＲＮＰ（プリオンタンパク質）、Ｒｏｓａ、Ｓｏｃｓ２（サイトカインシグナル伝達２のサプレッサー）、ＳＲＹ（Ｙ染色体の性決定領域）、ＺＦＹ（亜鉛フィンガータンパク質、Ｙ連鎖性）、β−ラクトグロブリン、ｃａｌｌｉｐｙｇｅ（ＣＬＰＧ）、ＭＯＤＹ１（ＨＮＦ４α）（肝細胞核内因子４、α）、ＭＯＤＹ２（ＧＣＫ）（グルコキナーゼ）、ＭＯＤＹ３（ＨＮＦ１α）（肝細胞核内因子４、α）、ＭＯＤＹ４（Ｐｄｘ１）（膵臓および十二指腸ホメオボックス１）、ＭＯＤＹ５（ＨＮＦ−１β）（ＨＮＦ１ホメオボックスＢ）、ＭＯＤＹ６（神経原性分化１）、ＭＯＤＹ７（ＫＬＦ１１）（クルッペル様因子１１）、ＭＯＤＹ８（ＣＥＬ）（カルボキシルエステルリバーゼ）、ＭＯＤＹ９（ＰＡＸ４）（ペアードボックス４）、ＭＯＤＹ１０（ＩＮＳ）（インスリン）、ＭＯＤＹ１１（ＢＬＫ）（ＢＬＫ癌原遺伝子、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ）、ＡＰＣ（腺腫症（大腸腺腫症））、ＡｐｏＥ（アポリポタンパク質Ｅ）、ＤＭＤ（ジストロフィン筋ジストロフィー）、ＧＨＲＨＲ（成長ホルモン放出ホルモン受容体）、ＨＲ（毛髪成長関連）、ＨＳＤ１１Ｂ２（ヒドロキシステロイド（１１−β）デヒドロゲナーゼ２）、ＬＤＬＲ（低密度リポタンパク質受容体）、ＮＦ１（ニューロフィブロミン１）、ＮＰＰＡ（ナトリウム利尿ペプチドＡ）、ＮＲ３Ｃ２（核受容体サブファミリー３、グループＣ、メンバー２）、ｐ５３（細胞腫瘍抗原ｐ５３様）、ＰＫＤ１（多発性嚢胞腎疾患１）、Ｒｂｍ２０（ＲＮＡ結合モチーフタンパク質２０）、ＳＣＮＮ１Ｇ（ナトリウムチャネル、非電位依存性１γサブユニット）、ｔＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＦＡＨ（フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ）、ＨＢＢ（ヘモグロビンβ）、ＩＬ２ＲＧ（インターロイキン２受容体、ガンマ鎖）、ＰＤＸ１（膵臓および十二指腸ホメオボックス１）、ＰＩＴＸ３（ペアード様ホメオドメイン転写因子３）、Ｒｕｎｘ１（ｒｕｎｔ関連転写因子１）、ＧＧＴＡ（二官能性セファロスポリンアシラーゼ／γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）、ＶＡＳＡ（脈管タンパク質）、ＭＩＷＩ（ｐｉｗｉ様ＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシング１）、ＰＩＷＩ（転写物ＣＧ６１２２−ＲＡ由来のＣＧ６１２２遺伝子産物）、ＤＣＡＦ１７（ＤＤＢ１およびＣＵＬ４関連因子１７）、ＶＤＲ（ビタミンＤ受容体）、ＰＮＰＬＡ１（パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有１）、ＨＲＡＳ（ハーベイラット肉腫ウイルス癌遺伝子相同体）、Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ−ｖｅｒｔ、ＤＳＰ（デスモプラキン）、ＳＮＲＰＥ（小核リボ核タンパク質ポリペプチドＥ）、ＲＰＬ２１（リボソームタンパク質）、ＬＡＭＡ３（ラミニン、α３）、ＵＲＯＤ（ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ）、ＥＤＡＲ（エクトジスプラシンＡ受容体）、ＯＦＤ１（口−顔−指症候群１）、ＰＥＸ７（ペルオキシソーム生合成因子７）、ＣＯＬ３Ａ１（コラーゲン、ＩＩＩ型、α１）、ＡＬＯＸ１２Ｂ（アラキドン酸１２０リポキシゲナーゼ１２Ｒ型）、ＨＬＣＳ（ホロカルボキシラーゼシンテターゼ（ビオチン−（プロピオニル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼ）ＡＴＰ−加水分解））リガーゼ））、ＮＩＰＡＬ４（ＮＩＰＡ様ドメイン含有４）、ＣＥＲＳ３（セラミドシンターゼ３）、ＡＮＴＸＲ１（炭疽菌毒素受容体１）、Ｂ３ＧＡＬＴ６（ＵＤＰ−Ｇａｌ：βＧＡｌβ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチド６）、ＤＳＧ４（デスモグレイン４）、ＵＢＲ１（ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３成分ｎ−レコグニン１）、ＣＴＣ１（ＣＴＳテロメア維持複合体成分１）、ＭＢＴＰＳ２（膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位２）、ＵＲＯＳ（ウロポルフィリノーゲンＩＩＩシンターゼ）、ＡＢＨＤ５（アブヒドロラーゼドメイン含有５）、ＮＯＰ１０（ＮＯＰ１０リボ核タンパク質）、ＡＬＭＳ１（アルストレーム症候群タンパク質１）、ＬＡＭＢ３（ラミニン、β３）、ＥＯＧＴ（ＥＧＦドメイン特異的Ｏ結合型Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ））、ＳＡＴ１（スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ１）、ＲＢＰＪ（免疫グロブリンκＪ領域における組換えシグナル結合タンパク質）、ＡＲＨＧＡＰ３１（Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質３１）、ＡＣＶＲ１（アクチビンＡ受容体、Ｉ型）、ＩＫＢＫＧ（Ｂ細胞内のκ軽ポリペプチド遺伝子エンハンサーの阻害剤、キナーゼγ）、ＬＰＡＲ６（リゾホスファチジン酸受容体６）、ＨＲ（毛髪成長関連）、ＡＴＲ（ＡＴＲセリン／トレオニンキナーゼ）、ＨＴＲＡ１（ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１）、ＡＩＲＥ（自己免疫調節遺伝子）、ＢＣＳ１Ｌ（ＢＣ１（ユビキノール−チトクロームｃレダクターゼ）合成様）、ＭＣＣＣ２（メチルクロトノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ２（β））、ＤＫＣ１（角化異常症先天性１、ジスケリン）、ＰＯＲＣＮ（ヤマアラシ相同体）、ＥＢＰ（エモパミル結合タンパク質（ステロールイソメラーゼ））、ＳＬＩＴＲＫ１（ＳＬＩＴおよびＮＴＲＫ様ファミリー、メンバー１）、ＢＴＫ（ブルトン無ガンマグロブリン血症チロシンキナーゼ）、ＤＯＣＫ６（細胞質分裂のデディケイター６）、ＡＰＣＤＤ１（腺腫症（大腸腺腫症）下方制御１）、ＺＩＰ４（亜鉛トランスポーター４前駆体）、ＣＡＳＲ（カルシウムセンシング受容体）、ＴＥＲＴ（テロメラーゼ逆転写酵素）、ＥＤＡＲＡＤＤ（ＥＤＡＲ（エクトジスプラシンＡ受容体）関連死ドメイン）、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ２（ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋輸送性、リソソームＶ０サブユニットａ２）、ＰＶＲＬ１（ポリオウイルス受容体関連１（ヘルペスウイルス侵入メディエーターＣ））、ＭＧＰ（マトリックスＧｌａタンパク質）、ＫＲＴ８５（ケラチン８５、ＩＩ型）、ＲＡＧ２（組換え活性化遺伝子２）、ＲＡＧ−１（組換え活性化遺伝子１）、ＲＯＲ２（受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体２）、ＣＬＡＵＤＩＮ１（クローディン７）、ＡＢＣＡ１２（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー１２）、ＳＬＡ−ＤＲＡ１（ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ−α）、Ｂ４ＧＡＬＴ７（キシロシルプロテインβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ポリペプチド７）、ＣＯＬ７Ａ１（コラーゲンＶＩＩ型、α１）、ＮＨＰ２（ＮＨＰ２リボ核タンパク質）、ＧＮＡ１１（グアニンヌクレオチド結合タンパク質（ｇタンパク質）、α１１（Ｇｑクラス））、ＷＮＴ５Ａ（無翅型ＭＭＴＶ組込み部位ファミリーメンバー５Ａ）、ＵＳＢ１（Ｕ６ ｓｎＲＮＡ生合成１）、ＬＭＮＡ（ラミンＡ／Ｃ）、ＥＰＳ８Ｌ３（ＥＰＳ８様３）、ＮＳＤＨＬ（ＮＡＤ（Ｐ）依存性ステロイドデヒドロゲナーゼ様）、ＴＲＰＶ３（一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶ、メンバー３）、ＫＲＡＳ（カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子相同体）、ＴＩＮＦ２（ＴＥＲＦ１相互作用核内因子２）、ＴＧＭ１（トランスグルタミナーゼ１）、ＤＣＬＲＥ１Ｃ（ＤＮＡ架橋修復１Ｃ）、ＰＫＰ１（プラコフィリン１）、ＷＲＡＰ５３（ＴＰ５３に対するＷＤリピート含有アンチセンス）、ＫＤＭ５Ｃ（リジン（ｋ）特異的デメチラーゼ５Ｃ）、ＥＣＭ１（細胞外マトリックスタンパク質１）、ＴＰ６３（腫瘍タンパク質ｐ６３）、ＫＲＴ１４（ケラチン１４）、ＲＩＰＫ４（受容体相互作用セリン−トレオニンキナーゼ４）、ＰＲＫＤＣ（タンパク質キナーゼ、ＤＮＡ活性化、触媒ポリペプチド）、ＢＣＬ１１ａ（Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａ（亜鉛フィンガータンパク質））、ＢＭＩ１（ＢＭＩ１癌原遺伝子、ポリコームリングフィンガー）、ＣＣＲ５（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（遺伝子／偽遺伝子））、ＣＸＣＲ４（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４）、ＤＫＫ１（ディックコップ（ｄｉｃｋｋｏｐｆ）ＷＮＴシグナル伝達経路阻害剤１）、ＥＴＶ２（ｅｔｓ変異体２）、ＦＬＩ１（Ｆｌｉ−１癌原遺伝子、ＥＴＳ転写因子）、ＦＬＫ１（キナーゼ挿入ドメイン受容体）、ＧＡＴＡ２（ＧＡＴＡ結合タンパク質２）、ＧＡＴＡ４（ＧＡＴＡ結合タンパク質４）、ＨＨＥＸ（造血発現ホメオボックス）、キット（ｋｉｔ癌遺伝子）、ＬＭＸ１Ａ（ＬＩＭホメオボックス転写因子１α）、ＭＹＦ５（筋原性因子５）、ＭＹＯＤ１（筋原性分化１）、ＭＹＯＧ（ミオゲニン）、ＮＫＸ２−５（ＮＫ２ホメオボックス５）、ＮＲ４Ａ２（核受容体サブファミリー４、グループＡ、メンバー２）、ＰＡＸ３（ペアードボックス３）、ＰＤＸ１（膵臓および十二指腸ホメオボックス１）、ＰＩＴＸ３（ペアード様ホメオドメイン転写因子３）、Ｒｕｎｘ１（ｒｕｎｔ関連転写因子１）、ＲＡＧ２（組換え活性化遺伝子２）、ＧＧＴＡ（二官能性セファロスポリンアシラーゼ／γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）、ＨＡＮＤＩＩ（心臓および神経冠誘導体発現タンパク質２）、ＴＢＸ５（Ｔボックス５）、ＥＴＶ２（ｅｔｓ変異体２）、ＰＤＸ１（膵臓および十二指腸ホメオボックス１）、ＴＢＸ４（Ｔボックス４）、ＩＤ２（ＤＮＡ結合の阻害剤２）、ＳＯＸ２（ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２）、ＴＴＦ１／ＮＫＸ２−１（ＮＫ２ホメオボックス１）、ＭＥＳＰ１（中胚葉後方１）、ＮＫＸ２−５（ＨＫ２ホメオボックス５）、ＦＡＨ（フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ）、ＰＲＫＤＣ（タンパク質キナーゼ、ＤＮＡ活性化、触媒ポリペプチド）、ＲＵＮＸ１（ｒｕｎｔ関連転写因子１）、ＦＬＩ１（ｆｌｉ−１癌原遺伝子、ＥＴＳ転写因子）、ＰＩＴＸ３（ペアード様ホメオドメイン転写因子３）、ＬＭＸ１Ａ（ＬＩＭホメオボックス転写因子１α）、ＤＫＫ１（ディックコップ（ｄｉｃｋｋｏｐｆ）ＷＮＴシグナル伝達経路阻害剤１）、ＮＲ４Ａ２／ＮＵＲＲ１（核受容体サブファミリー４、グループＡ、メンバー２）、ＦＬＫ１（キナーゼ挿入ドメイン受容体）、ＨＨＥＸ１（造血発現ホメオボックスタンパク質ＨＨＥＸ）、ＢＣＬ１１Ａ（Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａ（亜鉛フィンガータンパク質）、ＲＡＧ２（組換え活性化遺伝子２）、ＲＡＧ１（組換え活性化遺伝子１）、ＩＬ２ＲＧ（インターロイキン２受容体、ガンマ鎖）、ｃ−ＫＩＴ／ＳＣＦＲ（ｖ−キットハーディ−ズッカーマン（ｖ−ｋｉｔ Ｈａｒｄｙ−Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ）４ネコ肉腫ウイルス癌遺伝子相同体）、ＢＭＩ１（ＢＭＩ１癌原遺伝子ポリコームリングフィンガー）、ＴＢＸ５（Ｔボックス５）、ＯＬＩＧ１（オリゴデンドロサイト転写因子１）、ＯＬＩＧ２（オリゴデンドロサイト転写因子２）、それらのヘテロ接合体、それらのホモ接合体、およびそれらの組み合わせ、から選択される、１〜３１のいずれかに記載の方法。
３３．初代脊椎動物の細胞または胚において多重遺伝子ノックアウトを作製する方法であって、細胞または胚に、異なる標的遺伝子に標的化された複数のＴＡＬＥＮを、前記異なる標的遺伝子に対する相同性を有するＨＤＲ鋳型の存在下で導入するステップを含む、方法。
３４．動物を作製する方法であって、１〜３３のいずれかに記載の方法を含み、かつ細胞をクローン化するかまたは胚を代理母に配置するステップをさらに含む、方法。
３５．１〜３４のいずれかに記載の方法によって作製される動物。
３６．細胞が編集され、またキメラ胚を形成するため、細胞をクローン化し、宿主胚を細胞から作製し、ドナー細胞を宿主胚に加えるステップをさらに含む、１〜３４のいずれかに記載の方法によって作製されるキメラ胚または動物。
３７．宿主細胞およびドナー細胞におけるキメラである脊椎動物胚であって、
異なる染色体ＤＮＡ部位に複数の宿主細胞の遺伝子編集を伴う宿主胚、および
キメラ胚を形成するため、宿主細胞に組み込まれたドナー細胞
を含む、脊椎動物胚。
３８．異なる染色体ＤＮＡ遺伝子部位に複数の多重遺伝子編集を伴う胚を含む脊椎動物欠損キャリアであって、編集がドナー細胞による補完に遺伝的微小環境を提供する、脊椎動物欠損キャリア。
３９．ドナー細胞が、霊長類、齧歯類、または偶蹄目に由来する胚性幹細胞、多能性幹細胞、割球などである、３７〜３８のいずれかに記載の胚またはキャリア。
４０．宿主またはキャリア細胞の遺伝子編集が、遺伝子のノックアウトまたは天然対立遺伝子と脊椎動物の別品種もしくは動物の別種の外因性対立遺伝子との置換を含む、３７〜３９のいずれかに記載の胚。
４１．宿主細胞の遺伝子編集の数が、２、３、４、５、６、もしくは７であるか、または少なくとも２、３、４、５、６、もしくは７である、３７〜４１のいずれかに記載の胚。
４２．天然対立遺伝子と脊椎動物の別品種もしくは動物の別種の外因性対立遺伝子との置換の数が、２、３、４、５、６、もしくは７であるか、または少なくとも２、３、４、５、６、もしくは７である、３７〜４１のいずれかに記載の胚。
４３．発現可能なレポーター遺伝子および／または合成遺伝子および／または外因性蛍光タンパク質を含まない、３７〜４２のいずれかに記載の胚。
４４．遺伝子編集のすべてが両アレルであるか、編集の少なくとも２、３、４、もしくは５が両アレルであるか、遺伝子編集の少なくとも２、３、４、もしくは５が単アレルであるか、またはそれらの任意の組み合わせである、３７〜４３のいずれかに記載の胚。
４５．ドナー細胞が宿主細胞に対する相補物である、３７〜４４のいずれかに記載の胚。
４６．宿主胚が高度虚弱（ＦＴＴ）表現型として運命づけられている、３７〜４５のいずれかに記載の胚。
４７．ドナー細胞が胚をＦＴＴ表現型から救出する、４６に記載の胚。
４８．ドナー細胞が１つ以上の遺伝子編集を含む、３７〜４７のいずれかに記載の胚。
４９．大型脊椎動物、家畜、サル、イヌ、ネコ、トリ、鳥類、魚類、ウサギ、ブタ、ウシ、水牛、ヤギ、ヒツジ、および偶蹄目からなる群から選択される、３７〜４７のいずれかに記載の胚。
５０．宿主細胞およびドナー細胞におけるキメラである脊椎動物であって、
異なる染色体ＤＮＡ部位に複数の宿主細胞の遺伝子編集、およびキメラ動物を形成するための宿主細胞に組み込まれたドナー細胞を含む、脊椎動物。
５１．大型脊椎動物、家畜、サル、イヌ、ネコ、トリ、鳥類、魚類、ウサギ、ブタ、ウシ、水牛、ヤギ、ヒツジ、および偶蹄目からなる群から選択される、５０に記載の動物。
５２．宿主細胞およびドナー細胞におけるキメラである脊椎動物胚を作製する方法であって、
宿主の脊椎動物細胞に
第１の標的染色体ＤＮＡ部位に特異的な第１の標的化エンドヌクレアーゼおよび第１の標的部位配列に相同な第１の相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型；および
第２の標的染色体ＤＮＡ部位に特異的な第２の標的化エンドヌクレアーゼおよび第２の標的部位配列に相同な第２のＨＤＲ鋳型
を導入するステップと、
宿主胚を発生させるため、細胞をクローン化するステップと、
ドナー細胞を宿主胚内に配置するステップと、
を含み、第１のＨＤＲ鋳型配列は第１の標的部位で天然染色体ＤＮＡ配列を置換し、また第２のＨＤＲ鋳型配列は第２の標的部位配列で天然染色体ＤＮＡ配列を置換する、方法。
５３．細胞が初代細胞である、５２に記載の方法。
５４．大型脊椎動物、家畜、サル、イヌ、ネコ、トリ、鳥類、魚類、ウサギ、ブタ、ウシ、水牛、ヤギ、ヒツジ、および偶蹄目からなる群から選択される、５２〜５３のいずれかに記載の方法。
５５．発現可能なレポーター遺伝子および／または合成遺伝子および／または外因性蛍光タンパク質を含まない、１〜５４のいずれかに記載の方法、細胞、胚、または動物。
５６．宿主細胞およびドナー細胞を含むキメラ大型脊椎動物であって、宿主細胞が、ドナー細胞の遺伝子によって補完される、配偶子形成または精子形成遺伝子に対する少なくとも１つの非減数分裂の遺伝子編集を含み、動物はドナー細胞の遺伝子型を有する配偶子を含む、キメラ大型脊椎動物。
５７．宿主細胞の遺伝子型を有する機能的配偶子を含まない、５６に記載の動物。
５８．宿主細胞およびドナー細胞を含むキメラ大型脊椎動物であって、宿主細胞が高度虚弱（ＦＴＴ）宿主細胞の遺伝子型を樹立するための少なくとも１つの非減数分裂の遺伝子編集を含み、ＦＴＴ遺伝子型がドナー細胞によって補完される、キメラ大型脊椎動物。
５９．宿主細胞が、高度虚弱（ＦＴＴ）宿主細胞遺伝子型を樹立する、複数の非減数分裂の遺伝子編集を含む、５８に記載の動物。
６０．ＦＴＴ表現型が免疫不全である、５８または５９のいずれかに記載の動物。
６１．多重遺伝子編集を含む大型脊椎動物。
６２．第二品種または別種の対応する外因性対立遺伝子で置換された少なくとも３つの天然対立遺伝子を有するブタの第一品種またはウシの第一品種であり、前記外因性対立遺伝子は減数分裂組換えを伴わない対応する天然対立遺伝子の置換であり、動物は外因性マーカー遺伝子を含まない、６１に記載の動物。
６３．前記外因性置換対立遺伝子の少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、または７つを含み、各々が減数分裂組換えを伴わない、６１または６２に記載の動物。
６４．家畜、サル、イヌ、ネコ、トリ、鳥類、魚類、ウサギ、ブタ、ウシ、水牛、ヤギ、ヒツジ、および偶蹄目からなる群から選択される、６１〜６３のいずれかに記載の動物。
６５．３〜２５の数の編集を有する、６１〜６４のいずれかに記載の動物。
６６．多重編集についてＦ０世代である、６１〜６５のいずれかに記載の動物。
６７．２〜２５の数の対立遺伝子置換を有する、６１〜６６のいずれかに記載の動物。
６８．２〜２５の数のＫＯ遺伝子編集を有する、６１〜６７のいずれかに記載の動物。
６９．第二品種または別種の対応する外因性対立遺伝子で置換された少なくとも３つの天然対立遺伝子を有するブタの第一品種またはウシの第一品種であり、前記外因性対立遺伝子は減数分裂組換えを伴わない対応する天然対立遺伝子の置換であり、動物は外因性マーカー遺伝子を含まない、６１に記載の動物。
７０．前記外因性置換対立遺伝子の少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、または７つを含み、各々が減数分裂組換えを伴わない、６９に記載の動物。

Claims (41)

1. 多重遺伝子編集を含む大型脊椎動物。
2. 少なくとも３つの天然対立遺伝子を有するウシの第一品種またはブタの第一品種は第二品種または別種の対応する外因性対立遺伝子と置換され、前記外因性対立遺伝子は減数分裂組換えを伴わない前記対応する天然対立遺伝子の置換であり、ここで前記動物は外因性マーカー遺伝子を含まない、請求項１に記載の動物。
3. 前記３つの対立遺伝子の各々が３つの異なる遺伝子に対応する、請求項２に記載の動物。
4. 前記外因性置換対立遺伝子の少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、または７つを含み、各々が減数分裂組換えを伴わない、請求項２または３に記載の動物。
5. 第二品種または別種の対応する外因性対立遺伝子で置換された少なくとも２つの天然対立遺伝子を有する第１の動物であり、前記外因性対立遺伝子は、減数分裂組換えを伴わない前記対応する天然対立遺伝子の置換である、請求項１に記載の動物。
6. ３〜２５の数の対立遺伝子置換を含むかまたは２〜２５の数のノックアウト遺伝子編集を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の動物。
7. ホモ接合性編集、ヘテロ接合性編集、またはそれらの組み合わせを含む前記遺伝子編集を伴う、請求項１〜６のいずれか一項に記載の動物。
8. 宿主動物由来の宿主細胞とドナー動物由来のドナー細胞とのキメラであり、前記宿主細胞は前記多重遺伝子編集を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の動物。
9. 前記動物の有性生殖により、前記ドナー細胞の遺伝子型を有する配偶子が子孫に伝えられる、請求項８に記載の動物。
10. マーカー遺伝子を含まない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の動物。
11. 家畜、サル、イヌ、ネコ、トリ、鳥類、魚類、ウサギ、ブタ、ウシ、水牛、ヤギ、ヒツジ、および偶蹄目からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の動物。
12. 前記多重遺伝子編集が、以下の遺伝子：ＩＬ２Ｒｇ−、ＲＡＧ２、ＩＬ２Ｒｇ；ＲＡＧ２、ＩＬ２Ｒｇｙ、ＲＡＧ２、ＩＬ２Ｒｇ、ＲＡＧ２、ＩＬ２Ｒｇ；ＲＡＧ２、ＩＬ２Ｒｇ；ＲＡＧ２、ＤＧＡＴ、ＡＢＣＧ２、ＡＣＡＮ、ＡＭＥＬＹ、ＢＬＧ、ＢＭＰ１Ｂ（ＦｅｃＢ）、ＤＡＺＬ、ＤＧＡＴ、Ｅｉｆ４ＧＩ、ＧＤＦ８、Ｈｏｒｎ−ｐｏｌｌ ｌｏｃｕｓ、ＩＧＦ２、ＣＷＣ１５、ＫｉｓｓＲ／ＧＲＰ５４、ＯＦＤ１Ｙ、ｐ６５、ＰＲＬＲ、Ｐｒｍｄ１４、ＰＲＮＰ、Ｒｏｓａ、Ｓｏｃｓ２、ＳＲＹ、ＺＦＹ、β−ラクトグロブリン、ＣＬＰＧ、ＭＯＤＹ１（ＨＮＦ４α）、ＭＯＤＹ２（ＧＣＫ）、ＭＯＤＹ３（ＨＮＦ１α）、ＭＯＤＹ４（Ｐｄｘ１）、ＭＯＤＹ５（ＨＮＦ−１β）、ＭＯＤＹ６（神経原性分化１）、ＭＯＤＹ７（ＫＬＦ１１）、ＭＯＤＹ８（ＣＥＬ）、ＭＯＤＹ９（ＰＡＸ４）、ＭＯＤＹ１０（ＩＮＳ）、ＭＯＤＹ１１（ＢＬＫ）、ＡＰＣ、ＡｐｏＥ、ＤＭＤ、ＧＨＲＨＲ、ＨＲ、ＨＳＤ１１Ｂ２、ＬＤＬＲ、ＮＦ１、ＮＰＰＡ、ＮＲ３Ｃ２、ｐ５３、ＰＫＤ１、Ｒｂｍ２０、ＳＣＮＮ１Ｇ、ｔＰ５３、ＤＡＺＬ、ＦＡＨ、ＨＢＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＰＤＸ１、ＰＩＴＸ３、Ｒｕｎｘ１、ＲＡＧ２、ＧＧＴＡ、ＤＡＺＬ、ＶＡＳＡ、ＭＩＷＩ、ＰＩＷＩ、ＤＣＡＦ１７、ＶＤＲ、ＰＮＰＬＡ１、ＨＲＡＳ、Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ−ｖｅｒｔ、ＤＳＰ、ＳＮＲＰＥ、ＲＰＬ２１、ＬＡＭＡ３、ＵＲＯＤ、ＥＤＡＲ、ＯＦＤ１、ＰＥＸ７、ＣＯＬ３Ａ１、ＡＬＯＸ１２Ｂ、ＨＬＣＳ、ＮＩＰＡＬ４、ＣＥＲＳ３、ＡＮＴＸＲ１、Ｂ３ＧＡＬＴ６、ＤＳＧ４、ＵＢＲ１、ＣＴＣ１、ＭＢＴＰＳ２、ＵＲＯＳ、ＡＢＨＤ５、ＮＯＰ１０、ＡＬＭＳ１、ＬＡＭＢ３、ＥＯＧＴ、ＳＡＴ１、ＲＢＰＪ、ＡＲＨＧＡＰ３１、ＡＣＶＲ１、ＩＫＢＫＧ、ＬＰＡＲ６、ＨＲ、ＡＴＲ、ＨＴＲＡ１、ＡＩＲＥ、ＢＣＳ１Ｌ、ＭＣＣＣ２、ＤＫＣ１、ＰＯＲＣＮ、ＥＢＰ、ＳＬＩＴＲＫ１、ＢＴＫ、ＤＯＣＫ６、ＡＰＣＤＤ１、ＺＩＰ４、ＣＡＳＲ、ＴＥＲＴ、ＥＤＡＲＡＤＤ、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ２、ＰＶＲＬ１、ＭＧＰ、ＫＲＴ８５、ＲＡＧ２、ＲＡＧ−１、ＲＯＲ２、ＣＬＡＵＤＩＮ１、ＡＢＣＡ１２、ＳＬＡ−ＤＲＡ１、Ｂ４ＧＡＬＴ７、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＨＰ２、ＧＮＡ１１、ＷＮＴ５Ａ、ＵＳＢ１、ＬＭＮＡ、ＥＰＳ８Ｌ３、ＮＳＤＨＬ、ＴＲＰＶ３、ＫＲＡＳ、ＴＩＮＦ２、ＴＧＭ１、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＰＫＰ１、ＷＲＡＰ５３、ＫＤＭ５Ｃ、ＥＣＭ１、ＴＰ６３、ＫＲＴ１４、ＲＩＰＫ４、ＰＲＫＤＣ、ＢＣＬ１１ａ、ＢＭＩ１、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＤＫＫ１、ＥＴＶ２、ＦＬＩ１、ＦＬＫ１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＨＥＸ、キット、ＬＭＸ１Ａ、ＭＹＦ５、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＮＫＸ２−５、ＮＲ４Ａ２、ＰＡＸ３、ＰＤＸ１、ＰＩＴＸ３、Ｒｕｎｘ１、ＲＡＧ２、ＧＧＴＡ、ＨＲ、ＨＡＮＤＩＩ、ＴＢＸ５、ＥＴＶ２、ＰＤＸ１、ＴＢＸ４、ＩＤ２ＳＯＸ２、ＴＴＦ１／ＮＫＸ２−１、ＭＥＳＰ１、ＧＡＴＡ４、ＮＫＸ２−５、ＦＡＨ、ＰＲＫＤＣ、ＲＵＮＸ１、ＦＬＩ１、ＰＩＴＸ３、ＬＭＸ１Ａ、ＤＫＫ１、ＮＲ４Ａ２／ＮＵＲＲ１、ＦＬＫ１、ＨＨＥＸ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＲＡＧ２、ＲＡＧ１、ＩＬ２ＲＧ、ｃ−キット／ＳＣＦＲ、ＢＭＩ１、ＨＡＮＤＩＩ、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ２、ＤＡＺＬ、ＯＬＩＧ１、ＯＬＩＧ２、それらのヘテロ接合体、それらのホモ接合体、およびそれらの組み合わせ、の１つ以上において行われる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の動物。
13. 脊椎動物の細胞または胚における複数の標的染色体ＤＮＡ部位でインビトロでの遺伝子編集を行う方法であって、
    第１の標的染色体ＤＮＡ部位に特異的な第１の標的化エンドヌクレアーゼおよび第１の標的部位配列に相同な第１の相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型；および
    第２の標的染色体ＤＮＡ部位に特異的な第２の標的化エンドヌクレアーゼおよび第２の標的部位配列に相同な第２のＨＤＲ鋳型
    を脊椎動物の細胞または胚に導入するステップを含み、
    前記第１のＨＤＲ鋳型配列が前記第１の標的部位で前記天然染色体ＤＮＡ配列を置換し、かつ前記第２のＨＤＲ鋳型配列が前記第２の標的部位配列で前記天然染色体ＤＮＡ配列を置換する、
    方法。
14. 第３、第４、第５、第６、および第７の標的染色体ＤＮＡ部位に各々特異的な第３、第４、第５、第６、および第７の標的化エンドヌクレアーゼ、ならびに
    第３、第４、第５、第６、および第７の標的染色体ＤＮＡ部位に各々相同な第３、第４、第５、第６、および第７のＨＤＲ鋳型
    の１つ以上を前記細胞または胚に導入するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記標的化エンドヌクレアーゼが、ＴＡＬＥＮ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ９を含む、請求項１３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 少なくとも第１の標的染色体ＤＮＡ部位が対立遺伝子における遺伝子座である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記ＨＤＲ鋳型の少なくとも１つが前記鋳型に同族の前記ＤＮＡ標的部位のノックアウトをコードする、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ＨＤＲ鋳型の少なくとも１つが、外因性対立遺伝子における前記鋳型に同族の前記ＤＮＡ標的部位での対立遺伝子の置換をコードする、請求項１６に記載の方法。
19. 前記細胞または胚が家畜の第一種または第一品種であり、また複数の前記編集が天然対立遺伝子と動物の第二種または第二品種に由来する外因性対立遺伝子との置換を含む、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記細胞または胚が前記標的ＤＮＡ部位での複数の遺伝子編集においてホモ接合性であり、前記編集が前記標的ＤＮＡ部位に同族のＨＤＲ鋳型によってコードされる、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記細胞または胚が前記標的ＤＮＡ部位での複数の遺伝子編集においてヘテロ接合性であり、前記編集が前記標的ＤＮＡ部位に同族のＨＤＲ鋳型によってコードされる、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記細胞または胚が、大型脊椎動物、家畜、サル、イヌ、ネコ、トリ、鳥類、魚類、ウサギ、ブタ、ウシ、水牛、ヤギ、ヒツジ、および偶蹄目からなる群から選択される、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記細胞が、接合体、幹細胞、成体幹細胞、多能性細胞、前駆細胞、および初代細胞からなる群から選択される、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記胚が、接合体、胚盤胞、桑実胚であるか、または１〜２００の数の細胞を有する、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記標的化エンドヌクレアーゼがＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲの組み合わせである、請求項１３〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記標的部位配列の１つ以上が、以下のリスト：ＩＬ２Ｒｇｙ／−、ＲＡＧ２−／−、ＩＬ２Ｒｇ^−／−、ＲＡＧ２^−／−、ＩＬ２Ｒｇｙ／−、ＲＡＧ２−／−、ＩＬ２Ｒｇ＋／−、ＲＡＧ２＋／−、ＩＬ２Ｒｇ^ｙ／＋、ＲＡＧ２^＋／−、ＩＬ２Ｒｇ^＋／−、ＲＡＧ２^＋／−、ＤＧＡＴ、ＡＢＣＧ２、ＡＣＡＮ、ＡＭＥＬＹ、ＢＬＧ、ＢＭＰ１Ｂ（ＦｅｃＢ）、ＤＡＺＬ、ＤＧＡＴ、Ｅｉｆ４ＧＩ、ＧＤＦ８、Ｈｏｒｎ−ｐｏｌｌ ｌｏｃｕｓ、ＩＧＦ２、ＣＷＣ１５、ＫｉｓｓＲ／ＧＲＰ５４、ＯＦＤ１Ｙ、ｐ６５、ＰＲＬＲ、Ｐｒｍｄ１４、ＰＲＮＰ、Ｒｏｓａ、Ｓｏｃｓ２、ＳＲＹ、ＺＦＹ、β−ラクトグロブリン、ＣＬＰＧ、ＭＯＤＹ１（ＨＮＦ４α）、ＭＯＤＹ２（ＧＣＫ）、ＭＯＤＹ３（ＨＮＦ１α）、ＭＯＤＹ４（Ｐｄｘ１）、ＭＯＤＹ５（ＨＮＦ−１β）、ＭＯＤＹ６（神経原性分化１）、ＭＯＤＹ７（ＫＬＦ１１）、ＭＯＤＹ８（ＣＥＬ）、ＭＯＤＹ９（ＰＡＸ４）、ＭＯＤＹ１０（ＩＮＳ）、ＭＯＤＹ１１（ＢＬＫ）、ＡＰＣ、ＡｐｏＥ、ＤＭＤ、ＧＨＲＨＲ、ＨＲ、ＨＳＤ１１Ｂ２、ＬＤＬＲ、ＮＦ１、ＮＰＰＡ、ＮＲ３Ｃ２、ｐ５３、ＰＫＤ１、Ｒｂｍ２０、ＳＣＮＮ１Ｇ、ｔＰ５３、ＤＡＺＬ、ＦＡＨ、ＨＢＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＰＤＸ１、ＰＩＴＸ３、Ｒｕｎｘ１、ＲＡＧ２、ＧＧＴＡ、ＤＡＺＬ、ＶＡＳＡ、ＭＩＷＩ、ＰＩＷＩ、ＤＣＡＦ１７、ＶＤＲ、ＰＮＰＬＡ１、ＨＲＡＳ、Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ−ｖｅｒｔ、ＤＳＰ、ＳＮＲＰＥ、ＲＰＬ２１、ＬＡＭＡ３、ＵＲＯＤ、ＥＤＡＲ、ＯＦＤ１、ＰＥＸ７、ＣＯＬ３Ａ１、ＡＬＯＸ１２Ｂ、ＨＬＣＳ、ＮＩＰＡＬ４、ＣＥＲＳ３、ＡＮＴＸＲ１、Ｂ３ＧＡＬＴ６、ＤＳＧ４、ＵＢＲ１、ＣＴＣ１、ＭＢＴＰＳ２、ＵＲＯＳ、ＡＢＨＤ５、ＮＯＰ１０、ＡＬＭＳ１、ＬＡＭＢ３、ＥＯＧＴ、ＳＡＴ１、ＲＢＰＪ、ＡＲＨＧＡＰ３１、ＡＣＶＲ１、ＩＫＢＫＧ、ＬＰＡＲ６、ＨＲ、ＡＴＲ、ＨＴＲＡ１、ＡＩＲＥ、ＢＣＳ１Ｌ、ＭＣＣＣ２、ＤＫＣ１、ＰＯＲＣＮ、ＥＢＰ、ＳＬＩＴＲＫ１、ＢＴＫ、ＤＯＣＫ６、ＡＰＣＤＤ１、ＺＩＰ４、ＣＡＳＲ、ＴＥＲＴ、ＥＤＡＲＡＤＤ、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ２、ＰＶＲＬ１、ＭＧＰ、ＫＲＴ８５、ＲＡＧ２、ＲＡＧ−１、ＲＯＲ２、ＣＬＡＵＤＩＮ１、ＡＢＣＡ１２、ＳＬＡ−ＤＲＡ１、Ｂ４ＧＡＬＴ７、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＨＰ２、ＧＮＡ１１、ＷＮＴ５Ａ、ＵＳＢ１、ＬＭＮＡ、ＥＰＳ８Ｌ３、ＮＳＤＨＬ、ＴＲＰＶ３、ＫＲＡＳ、ＴＩＮＦ２、ＴＧＭ１、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＰＫＰ１、ＷＲＡＰ５３、ＫＤＭ５Ｃ、ＥＣＭ１、ＴＰ６３、ＫＲＴ１４、ＲＩＰＫ４、ＰＲＫＤＣ、ＢＣＬ１１ａ、ＢＭＩ１、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＤＫＫ１、ＥＴＶ２、ＦＬＩ１、ＦＬＫ１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＨＥＸ、キット、ＬＭＸ１Ａ、ＭＹＦ５、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＮＫＸ２−５、ＮＲ４Ａ２、ＰＡＸ３、ＰＤＸ１、ＰＩＴＸ３、Ｒｕｎｘ１、ＲＡＧ２、ＧＧＴＡ、ＨＲ、ＨＡＮＤＩＩ、ＴＢＸ５、ＥＴＶ２、ＰＤＸ１、ＴＢＸ４、ＩＤ２ＳＯＸ２、ＴＴＦ１／ＮＫＸ２−１、ＭＥＳＰ１、ＧＡＴＡ４、ＮＫＸ２−５、ＦＡＨ、ＰＲＫＤＣ、ＲＵＮＸ１、ＦＬＩ１、ＰＩＴＸ３、ＬＭＸ１Ａ、ＤＫＫ１、ＮＲ４Ａ２／ＮＵＲＲ１、ＦＬＫ１、ＨＨＥＸ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＲＡＧ２、ＲＡＧ１、ＩＬ２ＲＧ、ｃ−キット／ＳＣＦＲ、ＢＭＩ１、ＨＡＮＤＩＩ、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ２、ＤＡＺＬ、ＯＬＩＧ１、ＯＬＩＧ２、それらのヘテロ接合体、それらのホモ接合体、およびそれらの組み合わせ、から選択される、請求項１３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 初代脊椎動物の細胞または胚において多重遺伝子ノックアウトを行う方法であって、異なる標的遺伝子に標的化された複数のＴＡＬＥＮを、前記異なる標的遺伝子に対する相同性を有するＨＤＲ鋳型の存在下で前記細胞または胚に導入するステップを含む、方法。
28. 宿主細胞およびドナー細胞におけるキメラである脊椎動物胚であって、
    異なる染色体ＤＮＡ部位で複数の宿主細胞の遺伝子編集を伴う宿主胚、および
    前記キメラ胚を形成するため、前記宿主細胞に組み込まれたドナー細胞
    を含む、脊椎動物胚。
29. 前記ドナー細胞が、霊長類、齧歯類、または偶蹄目に由来する胚性幹細胞、多能性幹細胞、割球などである、請求項２８に記載の胚。
30. 前記宿主またはキャリア細胞の遺伝子編集が、遺伝子のノックアウトまたは天然対立遺伝子と脊椎動物の別品種もしくは動物の別種の外因性対立遺伝子との置換を含む、請求項２８〜２９のいずれか一項に記載の胚。
31. 前記宿主細胞の遺伝子編集の数が、２、３、４、５、６、もしくは７、または少なくとも２、３、４、５、６、もしくは７である、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の胚。
32. 天然対立遺伝子と脊椎動物の別品種もしくは動物の別種の外因性対立遺伝子との置換の数が、２、３、４、５、６、もしくは７、または少なくとも２、３、４、５、６、もしくは７である、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の胚。
33. 発現可能なレポーター遺伝子および／または合成遺伝子および／または外因性蛍光タンパク質を含まない、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の胚。
34. 前記遺伝子編集のすべてが両アレルであるか、または前記編集の少なくとも２、３、４、もしくは５つが両アレルであるか、または前記遺伝子編集の少なくとも２、３、４、もしくは５つが単アレルであるか、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の胚。
35. 前記宿主胚が高度虚弱（ＦＴＴ）表現型として運命づけられている、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の胚。
36. 宿主細胞およびドナー細胞におけるキメラである脊椎動物であって、異なる染色体ＤＮＡ部位での複数の宿主細胞の遺伝子編集、および前記キメラ動物を形成するための前記宿主細胞に組み込まれたドナー細胞を含む、脊椎動物。
37. 宿主細胞およびドナー細胞におけるキメラである脊椎動物胚を作製する方法であって、
    宿主の脊椎動物細胞に、
    第１の標的染色体ＤＮＡ部位に特異的な第１の標的化エンドヌクレアーゼおよび前記第１の標的部位配列に相同な第１の相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型；および
    第２の標的染色体ＤＮＡ部位に特異的な第２の標的化エンドヌクレアーゼおよび前記第２の標的部位配列に相同な第２のＨＤＲ鋳型
    を導入するステップと、
    宿主胚を発生させるため、前記細胞をクローン化するステップと、
    ドナー細胞を前記宿主胚内に配置するステップと、
    を含み、前記第１のＨＤＲ鋳型配列は前記第１の標的部位で前記天然染色体ＤＮＡ配列を置換し、また前記第２のＨＤＲ鋳型配列は前記第２の標的部位配列で前記天然染色体ＤＮＡ配列を置換する、方法。
38. 前記細胞が初代細胞である、請求項３７に記載の方法。
39. 大型脊椎動物、家畜、サル、イヌ、ネコ、トリ、鳥類、魚類、ウサギ、ブタ、ウシ、水牛、ヤギ、ヒツジ、および偶蹄目からなる群から選択される、請求項３７〜３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 宿主細胞およびドナー細胞を含むキメラ大型脊椎動物であって、前記宿主細胞が、前記ドナー細胞の遺伝子によって補完される、配偶子形成または精子形成遺伝子に対する少なくとも１つの非減数分裂の遺伝子編集を含み、前記動物は前記ドナー細胞の遺伝子型を有する配偶子を含む、キメラ大型脊椎動物。
41. 宿主細胞およびドナー細胞を含むキメラ大型脊椎動物であって、前記宿主細胞は、高度虚弱（ＦＴＴ）宿主細胞の遺伝子型を樹立するための少なくとも１つの非減数分裂の遺伝子編集を含み、前記ＦＴＴ遺伝子型は前記ドナー細胞によって補完される、キメラ大型脊椎動物。

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