RU2815936C1 - Способ получения мышиной модели для изучения миодистрофии Дюшенна и вариантов ее терапии - Google Patents
Способ получения мышиной модели для изучения миодистрофии Дюшенна и вариантов ее терапии Download PDFInfo
- Publication number
- RU2815936C1 RU2815936C1 RU2023128055A RU2023128055A RU2815936C1 RU 2815936 C1 RU2815936 C1 RU 2815936C1 RU 2023128055 A RU2023128055 A RU 2023128055A RU 2023128055 A RU2023128055 A RU 2023128055A RU 2815936 C1 RU2815936 C1 RU 2815936C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insdqualifier
- insdfeature
- insdseq
- sequence
- name
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 13
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 title abstract description 22
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 title description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 31
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 25
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 23
- 101150015424 dmd gene Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 17
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 17
- 101001053945 Mus musculus Dystrophin Proteins 0.000 claims description 16
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 claims description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 claims description 5
- 230000000056 copulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 3
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 claims description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 11
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 9
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 8
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 7
- 101100286947 Escherichia coli (strain K12) insG gene Proteins 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 7
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 7
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 6
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 210000000876 intercostal muscle Anatomy 0.000 description 5
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000001921 locked nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 3
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 3
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 3
- 210000001177 vas deferen Anatomy 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 2
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 2
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 2
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 2
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 210000003815 abdominal wall Anatomy 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 2
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 2
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- MUSLHCJRTRQOSP-UHFFFAOYSA-N rhodamine 101 Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MUSLHCJRTRQOSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007879 vasectomy Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000721047 Danaus plexippus Species 0.000 description 1
- 208000011345 Duchenne and Becker muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 101001053946 Homo sapiens Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 102100035460 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000011856 Utrophin Human genes 0.000 description 1
- 108010075653 Utrophin Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- -1 and upon completion Proteins 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000012942 design verification Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000029036 donor selection Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000000918 epididymis Anatomy 0.000 description 1
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003680 myocardial damage Effects 0.000 description 1
- 210000003365 myofibril Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- PTLRDCMBXHILCL-UHFFFAOYSA-M sodium arsenite Chemical compound [Na+].[O-][As]=O PTLRDCMBXHILCL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к плазмидной конструкции, полученной на основе вектора pSK-T7 и использованной для in vitro синтеза гидовой РНК против фрагмента последовательности 51-го экзона гена Dmd, а также к способу получения линии мышей, содержащих мутацию в 51-м экзоне. Изобретение позволяет создавать линии генетически модифицированных мышей для моделирования миодистрофии Дюшенна и разработки терапевтических подходов. 3 н.п. ф-лы, 11 ил., 5 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к областям молекулярных биотехнологии и медицины и касается мышиной модели миодистрофии Дюшенна, несущей мутацию в 51-м экзоне гена дистрофина мыши Dmd. Изобретение может быть использовано для детального изучения патогенеза и разработки терапии миодистрофии Дюшенна.
Изобретение создано при финансовой поддержке Министерства Науки и Высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения № 075-15-2019-1661 от 31.10.2019 на базе Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ИБГ РАН (ЦВРГТБ ИБГ РАН).
Уровень техники
Миодистрофия Дюшенна - моногенное X-сцепленное заболевание, вызываемое мутациями в гене дистрофина DMD. Носители мутации мужского пола, обладающие единственной Х-хромосомой, становятся инвалидами в начале второго десятилетия жизни, а средняя продолжительность их жизни составляет около 25 лет, хотя к этому моменту больные уже не дышат самостоятельно. Болезнь довольно распространенная - мутацию в гене дистрофина DMD имеет один новорожденный мальчик из 5000. Мутации, вызывающие миодистрофию Дюшенна, неравномерно распределены по последовательности гена: наиболее часто мутации затрагивают первые экзоны, а также экзоны с 43 по 55-й (Chen C, Ma H, Zhang F, Chen L, Xing X, Wang S, Zhang X, Luo Y. Screening of Duchenne muscular dystrophy (DMD) mutations and investigating its mutational mechanism in Chinese patients. PLoS One. 2014 Sep 22;9(9):e108038. doi: 10.1371/journal.pone.0108038). Несмотря на то, что миодистрофия Дюшенна - моногенное заболевание, в разработке генной терапии против неё есть определенные сложности. Главная сложность связана с тем, что кодирующая последовательность дистрофина слишком велика (около 14 тысяч пар оснований), чтобы быть эффективно доставленной в клетки. В связи с этим ведется разработка генно-терапевтических подходов, направленных на альтернативный сплайсинг гена дистрофина DMD с пропуском экзонов, содержащих мутации, и восстановление нарушенной рамки считывания. Для испытания такой терапии требуются адекватные мышиные модели, в которых мутации имитировали бы распространенные мутации человека.
Самая распространенная линия мышей, используемая как модель миодистрофии Дюшенна - линия mdx. У данной линии мутация, приводящая к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного стоп-кодона, расположена в 23-м экзоне. Эта модель характеризуется крайне мягкими проявлениями, заметными только на гистологическом уровне. У мышей, у которых полностью отсутствует локус гена мыши Dmd (Kudoh H, Ikeda H, Kakitani M, Ueda A, Hayasaka M, Tomizuka K, Hanaoka K. A new model mouse for Duchenne muscular dystrophy produced by 2.4 Mb deletion of dystrophin gene using Cre-loxP recombination system. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Mar 11;328(2):507-16. doi: 10.1016/j.bbrc.2004.12.191) исключена вероятность смягчения состояния из-за механизма пропуска экзонов и наблюдается наиболее тяжелый фенотип, которого теоретически можно добиться, внося мутации в ген дистрофина мыши Dmd. Однако для тестирования генной терапии, манипулирующей сплайсингом, они также не являются подходящей моделью. Для большей выраженности фенотипа были получены мыши с мутациями одновременно в дистрофине и его гомологе - утрофине. Патологические процессы у таких мышей становятся заметны в возрасте 4-х месяцев. Существуют и другие линии мышей, у которых патологическая картина близкая к картине у людей с миодистрофией Дюшенна достигается за счёт нокаута второго гена (Yucel N, Chang AC, Day JW, Rosenthal N, Blau HM. Humanizing the mdx mouse model of DMD: the long and the short of it. NPJ Regen Med. 2018 Feb 16;3:4. doi: 10.1038/s41536-018-0045-4. Erratum in: NPJ Regen Med. 2020 Dec 21;5(1):25). Такие модели, однако, ограниченно годятся для оценки эффективности генной терапии, направленной на восстановление функций гена дистрофина DMD.
Краткое описание изобретения
Целью заявляемого изобретения было получение такой модели мыши, которая сочетала бы в себе выраженный фенотип и пригодность для испытаний современных подходов генной терапии - т.е. небольшую мутацию примерно в области 50-го экзона, поскольку это место с наибольшей вероятностью мутаций у пациентов.
Для внесения мутации, приводящей к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного стоп-кодона, в геном мыши была использована система CRISPR/Cas9, состоящая из белка spCas9 и гидовой РНК (сгРНК), PAM-сайт которой расположен в 51-м экзоне гена дистрофина мыши Dmd.
Задачей заявляемого изобретения является создание мышиной модели миодистрофии Дюшенна путем внесения мутаций в 51-й экзон гена дистрофина мыши Dmd. На этой модели можно тестировать прототипы генной терапии, направленные на альтернативный сплайсинг в этом районе.
Задача решается тем, что с использованием системы CRISPR/Cas9 получены две новых линии генетически модифицированных мышей, содержащих в геноме мутацию (инсерцию - вставку одного нуклеотида) в гене дистрофина мыши Dmd, приводящие к образованию укороченной формы белка дистрофина, для чего:
1) Была получена плазмидная конструкция pSK-T7+sgDmd для in vitro синтеза гидовой РНК (называемой также одиночной гидовой РНК, сгРНК, sgRNA), несущая вектор pSK-T7 последовательностью SEQ ID NO: 1 и кодирующая сгРНК (гидовую РНК) последовательностью SEQ ID NO: 2 против соответствующего участка гена дистрофина мыши Dmd, под контролем T7 промотора.
2) Был разработан способ получения конструкции pSK-T7+sgDmd, характеризующийся следующими стадиями:
a) биоинформатический анализ последовательности гена дистрофина мыши Dmd и подбор сгРНК (гидовой РНК) в области экзона 51;
b) клонирование соответствующей последовательности сгРНК (гидовой РНК) в вектор pSK-T7 последовательностью SEQ ID NO: 1.
3) Способ получения линий мышей с мутациями в 51-м экзоне гена дистрофина мыши Dmd, характеризующийся следующими стадиями:
a) c помощью конструкции pSK-T7+sgDmd по п.1 осуществляют синтез in vitro сгРНК (гидовой РНК) последовательностью SEQ ID NO: 2 против 51-го экзона гена дистрофина мыши Dmd, а также мРНК гена spCas9;
b) далее проводят микроинъекцию смеси сгРНК и мРНК spCas9 из пункта (a) в цитоплазму оплодотворенной яйцеклетки мыши гибрида первого поколения F1(CBA×C57BL/6);
c) выявляют жизнеспособных зигот;
d) пересаживают выживших зигот из пункта (c) псевдобеременным самкам-реципиентам, имеющим копулятивную пробку после ссаживания с вазэктомированными самцами;
e) получают новорожденных мышей на 19 день после пересадки зигот из пункта (d);
f) проводят анализ наличия мутации через 8–14 дней после рождения мышей (e), путем амплификации целевого участка гена дистрофина мыши Dmd с двумя праймерами: Dmd–check-f олигонуклеотидом для генотипирования, имеющего последовательность 5'-TGTTCTCTGGTGTACTGCCT-3' (SEQ ID NO: 3) и Dmd-check-r олигонуклеотидом для генотипирования, имеющего последовательность 5'-TGTTCACAGAGAAAAGGTAGCC-3' (SEQ ID NO: 4) – с последующим секвенированием фрагмента;
g) отбирают мышей, несущих целевую мутацию;
h) проводят скрещивание мышей из пункта (g) с мышами дикого типа для получения самок-гетерозигот или мутантных самцов, несущих целевую мутацию.
Технический результат изобретения: разработан способ получения линии трансгенных мышей с мутациями в 51-м экзоне гена дистрофина мыши Dmd, приводящими к сдвигу рамки считывания, и выведены 2 соответствующие линии мышей с отличающимся фенотипом.
Изобретение иллюстрируется десятью фигурами и перечнем использованных последовательностей.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Электрофорез ПЦР-фрагмента для in vitro синтеза сгРНК. Видно, что в ходе ПЦР амплифицировался единственный продукт, его длина соответствует ожидаемой (149 п.н.).
Фигура 2. Электрофорез сгРНК, синтезированной in vitro. Видно, что в ходе реакции синтезировался единственный продукт, его длина соответствует ожидаемой (120 п.н.).
Фигура 3. Электрофорез мРНК Cas9. Видно, что в ходе реакции синтезировался единственный продукт.
Фигура 4. Хроматограмма сиквенса и схематическое изображение события, вызвавшего сдвиг рамки считывания у основателя линии N1.
Фигура 5. Хроматограмма сиквенса и схематическое изображение события, вызвавшего сдвиг рамки считывания у основателя линии N2.
Фигура 6. Сравнение белковых последовательностей нормального (norm) белка дистрофина и мутантных вариантов линий N1 (вариант insT) и N2 (вариант insG).
Фигура 7. Система для генотипирования представителей линий N1 (вариант insT) и N2 (вариант insG). Красным цветом отмечены замкнутые нуклеотиды (LNA). Зелёным цветом отмечены инсерции, определяемые зондами, также стрелкой обозначено место инсерции.
Фигура 8. Пример генотипирования последующих поколений методом ПЦР в реальном времени. Определение аллелей потомства линии N1. Синими точками обозначены пробы, содержащие только мутантные аллели, оранжевым - только дикие, зелёным - гетерозиготы.
Фигура 9. Поперечные срезы мышц, окраска гематоксилином и эозином, 10х. А - икроножные мышцы самца дикого типа, нормальное строение. В - межреберные мышцы самца дикого типа, нормальное строение. С - икроножные мышцы самца линии N2. D - межреберные мышцы мыши линии N2. E - икроножные мышцы самца линии N1. F - межреберные мышцы самца линии N1.
Фигура 10. Поперечные срезы диафрагмы, окраска гематоксилином и эозином, 10х. А, С - диафрагма мыши дикого типа. B - диафрагма мыши линии N2. D - диафрагма мыши линии N1.
Фигура 11. Продольные срезы сердца, окраска железным гематоксилином по Рего, 10х. А, С - миокард мыши дикого типа. B - миокард мыши линии N2. D - миокард мыши линии N1.
Осуществление изобретения
В описании данного изобретения, если не определено отдельно, технические и научные термины имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе. В том числе, сокращение DMD используется для обозначения человеческого гена дистрофина, а сокращение Dmd для обозначения гена дистрофина мыши Mus musculus.
Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что термины «гидовая РНК», «одиночная гидовая РНК», «сгРНК», «огРНК», «гРНК» и «sgRNA» являются взаимозаменяемыми и имеют одни и те же качества и значение.
Способ осуществляется следующим образом:
1. Получение генетических конструкций. Для введения выбранной мутации была подобрана с помощью онлайн инструмента http://crispor.tefor.net/ сгРНК, ПАМ-сайт которой находится в 51-м экзоне гена дистрофина мыши Dmd. Выбранная сгРНК имела последовательность 5'-TACTCTAGTGACACAATCTG/TGG-3' (SEQ ID NO: 2). Выбранная сгРНК была заклонирована в плазмидный вектор pSK-T7 (последовательностью SEQ ID NO: 1), предназначенный для in vitro синтеза сгРНК. Последовательность сгРНК была синтезирована с использованием двух олигонуклеотидов: sgDmd51-f олигонуклеотида для синтеза последовательности сгРНК последовательностью 5'-taggTACTCTAGTGACACAATCTG-3' (SEQ ID NO: 5) и sgDmd51-r олигонуклеотида для синтеза последовательности сгРНК последовательностью 5'-aaacCAGATTGTGTCACTAGAGTA-3' (SEQ ID NO: 6).
Разрезание вектора производили с использованием рестриктазы BbsI-HF (New England Biolabs), затем дефосфорилировали вектор с помощью фермента FastAP (Thermofisher Scientific), и очищали в агарозном геле и последующим выделением с помощью набора Monarch DNA Gel Extraction Kit. Олигонуклеотиды для последовательности сгРНК были заказаны с таким расчетом, чтобы их некомплиментарные концы образовали липкие концы для клонирования в вектор pSK-T7. Олигонуклеотиды фосфорилировали с использованием фермента PNK kinase (Thermofisher Scientific), отжигали друг с другом и лигировали с приготовленным ранее вектором и использованием фермента T4 DNA ligase (Thermofisher Scientific, США). Лигазную смесь трансформировали в компетентные клетки штамма XL1blue (Евроген). Скрининг колоний осуществляли с использованием ПЦР-наборов компании Евроген, прямого праймера для синтеза сгРНК (sgDmd51-f олигонуклеотида для синтеза последовательности сгРНК последовательностью 5'-taggTACTCTAGTGACACAATCTG-3' (SEQ ID NO: 5)) и обратного праймера к вектору (pSK T7 праймера для проверки конструкции и для амплификации фрагмента, используемого для in vitro синтеза гидовой РНК, последовательностью 5'-GCAAAAAAGCACCGACTC-3' (SEQ ID NO: 7)). По две колонии, содержащие сгРНК, наращивали в ночной культуре и выделяли с помощью набора Monarch Plasmid Miniprep Kit. Анализ полученных плазмид проводили методом секвенирования по Сэнгеру. Секвенирование полученных плазмид осуществляли с использованием pSK T7 праймера для проверки конструкции и для амплификации фрагмента, используемого для in vitro синтеза гидовой РНК, последовательностью 5'-GCAAAAAAGCACCGACTC-3' (SEQ ID NO: 7) в компании Евроген. Анализ электрофореграмм (сиквенсов) проводили с использованием программного обеспечения SnapGene.
2. Проверенную конструкцию использовали для in vitro синтеза гидовой РНК. В качестве матрицы для синтеза использовали ПЦР-фрагмент, полученный с использованием плазмиды из п.1 в качестве матрицы, двух праймеров:
pSK T7 праймера для проверки конструкции и для амплификации фрагмента, используемого для in vitro синтеза гидовой РНК, последовательностью 5'-GCAAAAAAGCACCGACTC-3' (SEQ ID NO: 7)
и M13 праймера для амплификации фрагмента, используемого для in vitro синтеза гидовой РНК, последовательностью 5'-GTTGTAAAACGACGGCCAGTG-3' (SEQ ID NO: 8),
а также высокоточной полимеразы Platinum SuperFi (Thermo Scientific). После амплификации 2 мкл реакционной смеси наносили на 1,8% агарозный гель для оценки полученного продукта (Фигура 1).
Далее полученный ПЦР-фрагмент очищали из реакционной смеси путем переосаждения с использованием 3М ацетата натрия, изопропанола и 70% этанола. Очищенный фрагмент использовали для in vitro синтеза гидовой РНК с применением набора HiScribe® T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs). После проведения in vitro синтеза гидовой РНК реакционную смесь обрабатывали ферментом DNase I (New England Biolabs) с целью элиминации ДНК. Полученную гидовую РНК также очищали путем переосаждения и оценивали методом электрофореза (Фигура 2).
Далее проводили in vitro синтез РНК Cas9. В качестве матрицы для синтеза использовали плазмиду pET28a/Cas9-Cys (SEQ ID NO: 9), предварительно обработанную ферментом XhoI (Thermo Scientific). Полученный фрагмент очищали из реакционной смеси путем переосаждения с использованием 3М ацетата натрия, изопропанола и 70% этанола. Очищенный фрагмент использовали для in vitro синтеза РНК Cas9 с применением набора HiScribe™ T7 для синтеза мРНК с кэпированием ARCA, с полиаденилированием 3’-конца (New England Biolabs). После проведения in vitro синтеза реакционную смесь обрабатывали ферментом DNase I (New England Biolabs) с целью элиминации ДНК. Полученную РНК также очищали путем переосаждения и оценивали методом электрофореза (Фигура 3).
3. Получение яйцеклеток мышей. Яйцеклетки для микроинъекции получали методом индукции суперовуляции. Для этого неполовозрелым самкам гибридам F1(CBA×C57BL/6) весом 12-13 г внутрибрюшинно вводили 8 ед. гонадотропина сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК) и через 48 час - 8 ед. хорионического гонадотропина человека (ХгЧ). После такой обработки самок ссаживали с самцами-производителями F1(CBA×C57BL/6). Факт спаривания констатировали на следующее утро по наличию копулятивной пробки.
Схема индукции суперовуляции: 12:00 - ГСЖК, через 48 ч. - ХгЧ. В 17:00 этого же дня - подсадка к самцам-производителям. Отбор доноров производили на следующий день в 9:00. Световой режим в виварии был установлен с 7:00 до 19:00.
Отобранных самок-доноров умерщвляли, извлекали яйцеводы, затем вымывали яйцеклетки в среде HEPES-KSOM с добавлением гиалуронидазы. Процедуру проводили под бинокуляром (Zeiss Stemi DV4) с увеличением в 32 раза. Для вымывания яйцеклеток использовали стеклянные капилляры с внутренним диаметром примерно 100 мкм, изготовленные на пуллере Narishige PC-10 (Япония) и микрокузнице Narishige MF-900 (Япония).
4. Микроинъекции. Полученные зиготы культивировали в течение двух часов при температуре 37 °C и 5% СО2 в капле среды KSOM под минеральным маслом (Sigma, США), затем помещали в микроинъекционную камеру. Микроинъекции проводили в среде HEPES-KSOM под микроскопом Zeiss Axiovert 200М при увеличении в 400–600 раз, используя микроманипуляторы Narishige. Для изготовления игл для микроинъекций использовали пуллер Sutter instrument Со Р-97 (США), для изготовления удерживающей пипетки использовали пуллер Narishige PC-10 и микрокузницу Narishige MF-900.
После окончания микроинъекций выжившие зиготы переносили в каплю среды KSOM под минеральное масло (Sigma) и культивировали в течение 1 часа для выявления жизнеспособных эмбрионов.
5. Получение самок-реципиентов. Самок-реципиентов яйцеклеток получали следующим образом: половозрелых самок F1(CBA×C57BL/6) весом не менее 24 г ссаживали с вазэктомированными самцами той же линии. Через 18 часов псевдобеременных реципиентов отбирали по наличию копулятивных пробок. Выжившие после микроинъекции зиготы трансплантировали в яйцеводы псевдобеременной самки. Одной псевдобеременной самке пересаживали 10-15 эмбрионов. Операцию проводили под наркозом (смесь золетила и рометара, вводился внутрибрюшинно).
6. Операция вазэктомирования. Операцию вазэктомирования проводили заранее под наркозом (смесь золетила и рометара, вводился внутрибрюшинно). Через надрез в коже и брюшной стенке вытягивали из брюшной полости семенник, придатки семенника и семявыносящий проток, после чего раскаленным пинцетом разрушали семявыносящий проток. Органы возвращали в брюшную полость, и повторяли всю процедуру на другом семявыносящем протоке. На завершающем этапе на брюшную стенку и на кожу накладывали швы с последующей антисептической обработкой операционного поля.
7. Получение новорожденных мышей. На 19-й день после пересадки микроинъецированных эмбрионов реципиента умерщвляли путём цервикальной дислокации и проводили кесарево сечение, после чего выживших детёнышей помещали к заранее подготовленной кормилице. Через 8–14 дней после рождения у мышат брали образец ткани, выделяли ДНК и анализировали наличие генетических модификаций.
8. Анализ наличия генетических модификаций в геноме животных производили методом секвенирования ПЦР-фрагмента. ДНК для ПЦР выделяли из тканей по стандартному протоколу. Амплификацию фрагментов ДНК проводили с помощью набора HS-Taq (Евроген, Москва) в присутствии 500 нМ двух праймеров:
Dmd–check-f олигонуклеотида для генотипирования последовательностью 5'-TGTTCTCTGGTGTACTGCCT-3' (SEQ ID NO: 3)
и Dmd-check-r олигонуклеотида для генотипирования последовательностью 5'-TGTTCACAGAGAAAAGGTAGCC-3' (SEQ ID NO: 4) -
в следующих режимах: денатурация 95 °С - 3 мин; далее следовало 35 циклов: 95 °С - 40 с, 58 °С - 40 с; 72 °С - 40 с; и финальная элонгация 72 °С - 2 мин. После прохождения реакции ПЦР-смесь очищали в 1,5% агарозном геле, полученный продукт выделяли набором Monarch DNA Gel Extraction Kit (New England Biolabs, США) и секвенировали в компании Евроген и использованием праймера – Dmd–check-f олигонуклеотида для генотипирования последовательностью 5'-TGTTCTCTGGTGTACTGCCT-3' (SEQ ID NO: 3). Полученные сиквенсы можно подразделить на три категории: сиквенсы дикого типа, последовательность в которых соответствует дикому типу, двоящиеся сиквенсы, соответствующие мозаичным животным F0 или гетерозиготным самкам следующих поколений, и сиквенсы, на которых присутствует только мутантный вариант ДНК, соответствующие трансгенным самцам и гомозиготным трансгенным самкам.
9. Определение генетически модифицированных животных в поколениях, начиная с F1, осуществляли с помощью ПЦР в реальном времени. Для этого применялись флуоресцентно меченные зонды с модифицированными замкнутыми нуклеотидами (LNA, locked nucleic acid, отмечены «[+A]» и «[+C]»), с ковалентно пришитой к 5'-концу последовательности молекулой флуоресцентного красителя 5(6)-карбоксифлуоресцеина (FAM) или флуорофора родамина Х/родамина 101 (ROX) и ковалентно пришитой к 3'-концу последовательности молекулой гасителя флуоресценции BHQ1 (Black Hole Quencher-1) или BHQ2 (Black Hole Quencher-2):
FAM-меченный зонд для определения аллели дикого варианта последовательностью 5'-(FAM)-AGTGACACA[+A]T[+C]TGTGGTTAC-(BHQ1)-3' (SEQ ID NO: 10);
ROX-меченный зонд для определения аллели “insT” последовательностью
5'-(ROX)-AGTGACACA[+A]TT[+C]TGTGGTTACTA-(BHQ2)-3' (SEQ ID NO: 11);
ROX-меченный зонд для определения аллели “insG” последовательностью 5'-(ROX)-TGACACA[+A]TG[+C]TGTGGTTACT-(BHQ2)-3' (SEQ ID NO: 12)
(описано в Примере 4)
и пара праймеров:
Dmd51 rt_gt f олигонуклеотид для ПЦР в реальном времени последовательностью 5'-AACACTAGCTGCCAGTCAGAC-3' (SEQ ID NO: 13);
Dmd51 rt_gt r олигонуклеотид для ПЦР в реальном времени последовательностью 5'-GTAAGTTCTGTCCAAGCTCGG-3' (SEQ ID NO: 14).
Пример 1. Основателем линии N1 стала самка “448”, с инсерцией нуклеотида T (insT). На фигуре 4 приведена хроматограмма сиквенса в районе PAM-сайта, а также реконструкция инсерции. Эта линия характеризуется нормальной продолжительностью жизни и менее выраженным фенотипом.
Пример 2. Основателем линии N2 стал самец 740 с инсерцией нуклеотида G (insG). На фигуре 5 приведена хроматограмма сиквенса в районе PAM-сайта, а также реконструкция инсерции. Эта линия характеризуется выраженным моторным фенотипом среди самцов, а также сокращенной продолжительностью жизни самцов.
Пример 3. Предсказание белковой последовательности мутантных вариантов. На основе электрофореграмм, полученных в результате секвенирования по Сэнгеру, восстанавливали последовательности аллелей модифицированного локуса. По данным последовательностям предсказывали последовательности вариантов продукта модифицированного гена дистрофина. Глобальное выравнивание производили методом Нидлмана-Вунша (Фиг. 6).
Инсерция дополнительного нуклеотида (insT или insG) в кодирующую последовательность гена дистрофина мыши (длина нативного белка - 3678 аминокислот), должна приводить к образованию двух укороченных вариантов. Мутация изменяет белок, начиная с 2441-й аминокислоты (АК). Оба варианта приводят к укорочению белка на 1233 АК - происходит терминация биосинтеза через три АК после мутировавшей.
В варианте insT происходит замена p.S2441F, в варианте insG - p.S2441C. Далее - укороченный трипептид CGY.
Пример 4. Генотипирование мышей линий N1 и N2 с помощью ПЦР в реальном времени. Определение генотипа (генотипирование) особей начиная с поколения F1 осуществляли с помощью ПЦР в реальном времени с применением флуоресцентно меченных зондов (Фиг. 7, SEQ ID NO: 10, 11, 12). Зонды содержат замкнутые нуклеотиды, окружающие определяемую мутацию - это позволяет значительно увеличить чувствительность и точность метода.
Выделяли очищенную ДНК исследуемых особей. В стандартную ПЦР-смесь с Taq-полимеразой с горячим стартом (Евроген, Россия) и праймерами:
Dmd51 rt_gt f олигонуклеотидом для ПЦР в реальном времени последовательностью 5'-AACACTAGCTGCCAGTCAGAC-3' (SEQ ID NO: 13)
и Dmd51 rt_gt r олигонуклеотидом для ПЦР в реальном времени последовательностью 5'-GTAAGTTCTGTCCAAGCTCGG-3' (SEQ ID NO: 14) -
добавляли флуоресцентно меченные зонды с модифицированными замкнутыми нуклеотидами (LNA, locked nucleic acid, отмечены «[+A]» и «[+C]»), с ковалентно пришитой к 5'-концу последовательности молекулой флуоресцентного красителя 5(6)-карбоксифлуоресцеина (FAM) или флуорофора родамина Х/родамина 101 (ROX) и ковалентно пришитой к 3'-концу последовательности молекулой гасителя флуоресценции BHQ1 (Black Hole Quencher-1) или BHQ2 (Black Hole Quencher-2). Для генотипирования животных линии N1 применяли зонды:
FAM-меченный зонд для определения аллели дикого варианта последовательностью 5'-(FAM)-AGTGACACA[+A]T[+C]TGTGGTTAC-(BHQ1)-3' (SEQ ID NO: 10);
ROX-меченный зонд для определения аллели “insT” последовательностью
5'-(ROX)-AGTGACACA[+A]TT[+C]TGTGGTTACTA-(BHQ2)-3' (SEQ ID NO: 11);
для генотипирования животных линии N2 применяли зонды:
FAM-меченный зонд для определения аллели дикого варианта последовательностью 5'-(FAM)-AGTGACACA[+A]T[+C]TGTGGTTAC-(BHQ1)-3' (SEQ ID NO: 10);
ROX-меченный зонд для определения аллели “insG” последовательностью 5'-(ROX)-TGACACA[+A]TG[+C]TGTGGTTACT-(BHQ2)-3' (SEQ ID NO: 12).
Проводили 40 циклов ПЦР с очищенной ДНК, по завершении дискриминировали аллели на основе интенсивности флуоресценции соответствующих зондов в смесях (Фиг. 8).
Система позволяет различить гомозиготные и гетерозиготные варианты генотипа. Поскольку ген дистрофина расположен в X-хромосоме, у самцов возможны только дикий и модифицированный генотипы, но не гетерозиготный.
Пример 5. Гистологический анализ
1. Забор образцов и фиксация. Некропсию и забор материала для гистологического исследования проводили согласно рекомендациям гистологического атласа A Practical Guide to the Histology of the Mouse (Cheryl L. Scudamore. A practical guide to the histology of the mouse. 2013. Print ISBN:9781119941200. Online ISBN:9781118789568. doi:10.1002/9781118789568). Для исследования забирали следующие органы: фрагмент икроножной мышцы, фрагмент межреберных мышц, диафрагму, сердце. Образцы помещали в гистологические кассеты (Биовитрум, Россия), фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (Медикс, Россия) в течение суток.
2. Проводка. Фиксированные образцы отмывали от формалина под проточной водопроводной водой в течение одного часа. Далее осуществляли проводку по батарее дегидратанта (Медикс, Россия) восходящей концентрации (70%, 80%, 90%, 100%), проводили через промежуточные смеси №1 и №2 (Медикс, Россия) и минеральное масло (Медикс, Россия).
3. Заливка. Для заливки использовали парафин гистологический (Медикс, Россия) и парафин гистологический с воском (Медикс, Россия). Заливали в заливочные формы 7х7х6мм (Diapath, Италия). Проводку и заливку осуществляли согласно инструкциям производителя. Формы остужали до температуры 4°С, вынимали готовый блок, крепили на основание гистологической кассеты.
4. Получение срезов. Срезы толщиной 5 мкм получали на ротационном полуавтоматическом микротоме RMD-3000 (МТП, Россия) с использованием одноразовых лезвий Feather R35 (Япония). Полученные срезы расправляли на водяной бане “Слайдбаня-30/60” (КБ Техком, Россия), помещали на предметные стекла (CITOTEST, Китай), покрытые адгезивной жидкостью (Биовитрум, Россия). Стекла сушили не менее двух суток при комнатной температуре.
5. Окрашивание. Срезы депарафинировали при помощи депарафинирующего раствора (Медикс, Россия), проводили по батарее изопропанола (ЭКОС-1, Россия) нисходящей концентрации (100%, 90%, 70%) и помещали в дистиллированную воду. Срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином (Биовитрум, Россия) и железным гематоксилином Рего согласно инструкциям производителя, дегидратировали в изопропаноле (70%, 90%, 100%), просветляли в ксилоле (ЭКОС-1, Россия). Заключали под покровное стекло в монтирующую среду Витрогель (ЭргоПродакшн, Россия).
Микрофото получали при помощи микроскопа Nikon Eclipse Ti (Япония) с объективом Nikon Plan Fluor 10x/30 OFN25 Ph1 DL (Япония) и камеры E3ISPM21000KPA Microscope Camera (Sony, Япония).
Согласно данным литературы (Zweyer M, Sabir H, Dowling P, Gargan S, Murphy S, Swandulla D, Ohlendieck K. Histopathology of Duchenne muscular dystrophy in correlation with changes in proteomic biomarkers. Histol Histopathol. 2022 Feb;37(2):101-116. doi: 10.14670/HH-18-403. Epub 2021 Dec 7. PMID: 34873679.; Dubuisson N, Versele R, Planchon C, Selvais KM, Noel L, Michel Abou-Samra M, Davis-López de Carrizosa MA. Histological methods to assess skeletal muscle degeneration and regeneration in Duchenne muscular dystrophy. Int J Mol Sci. 2022 Dec 16;23(24):16080. doi: 10.3390/ijms232416080. PMID: 36555721.) к основным изменениям в мышечной ткани при миодистрофии Дюшенна относятся: вариабельность размеров миофибрилл, увеличение числа ядер, наличие волокон с центральной нуклеацией, наличие областей некроза и регенерации, наличие фрагментов иммунного воспаления. На поздних стадиях отмечают обширные области фиброза и замещение мышечных клеток адипоцитами.
Гистологический анализ срезов скелетных мышц на примере икроножной мышцы показал наличие у мышей линии N2 аномальной вариабельности диаметра мышечных волокон за счет большого количества гипертрофированных и атрофированных мышечных волокон и большое количество волокон с центральной нуклеацией и волокон с умеренным увеличением количества ядер (Фиг. 9, C). Замещения мышечных волокон жировой тканью не было обнаружено, однако в поле зрения присутствовали множественные очаги некроза с характерными фрагментами иммунного воспаления (Фиг. 9, С, черные стрелки). У самцов линии N1 также было выявлено наличие волокон с центральной нуклеацией и умеренная вариабельность диаметра мышечных волокон, однако областей некроза и иммунного воспаления не было обнаружено (Фиг. 9, E). Гистологический анализ межреберных мышц самцов обеих линий показал наличие очагов некроза на стадии миофагоцитоза (Фиг. 9, D, F, черные стрелки) и умеренную вариабельность диаметра мышечных волокон. Полученные данные соответствуют гистологической картине патологии мышечной ткани при миодистрофии Дюшенна.
Гистологический анализ диафрагмы показал разрастание перимизия, увеличение толщины диафрагмы, наличие обширных очагов замещения мышечных волокон жировой тканью (Фиг. 10, B, черные стрелки) и значительных очагов фиброза (Фиг. 10, B, красные стрелки) у самцов линии N2. У самцов линии N1 толщина диафрагмы также была увеличена и присутствовали локальные очаги фиброза (Фиг. 10, D, черные стрелки).
Наличие очагов жирового замещения в диафрагме является одним из гистологических признаков поздних стадий миодистрофии Дюшенна. На поздних стадиях миодистрофии патологический процесс становится системным и затрагивает другие органы, в частности сердце (Mavrogeni S, Markousis-Mavrogenis G, Papavasiliou A, Kolovou G. Cardiac involvement in Duchenne and Becker muscular dystrophy. World J Cardiol 2015 July 26; 7(7): 410-414. doi: 10.4330/wjc.v7.i7.410. PMID: 26225202; PMCID: PMC4513493.). Для исследования возможных патологий миокарда были исследованы сердца самцов линий N2 и N1. Железный гематоксилин по Рего был выбран с целью выявления ранних повреждений и некроза миокарда, однако никаких патологий в строении миокарда не было обнаружено (Фиг. 11).
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Duchenne
mouse.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"
productionDate="2023-10-18">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>
<FilingDate></FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>no</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное
бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии
наук </ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Institute of Gene Biology Russian Academy of
Sciences</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ получения модели для
изучения миодистрофии Дюшенна и вариантов ее терапии</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>14</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>2543</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..2543</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgcgccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtt
tttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccg
acaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgc
cgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtag
gtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgac
cgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcag
cagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcc
taactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaa
agagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagc
agattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtg
gaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatcctttta
aattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgct
taatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgt
gtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgc
tcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaa
ctttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatag
tttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattc
agctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctcct
tcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgca
taattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattc
tgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacata
gcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgct
gttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagc
gtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgtt
gaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggata
catatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacct
aaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaacca
ataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttcca
gtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagg
gcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaa
tcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaa
gggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccacca
cacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcgcaactgttggga
agggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgatta
agttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattgtaatacgact
cactatagggcgtcttctagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgt
tatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgccgg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tactctagtgacacaatctgtgg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgttctctggtgtactgcct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgttcacagagaaaaggtagcc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>taggtactctagtgacacaatctg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aaaccagattgtgtcactagagta</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcaaaaaagcaccgactc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gttgtaaaacgacggccagtg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>9546</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..9546</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q18">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcgtagaggatcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactat
aggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatac
catgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatggctagc
atgactggtggacagcaaatgggtcgcggatccgaattcgagctccgtcgacaagcttgcggccgcatgg
acaagaagtacagcatcggcctggacatcggtaccaacagcgtgggctgggccgtgatcaccgacgagta
caaggtgcccagcaagaagttcaaggtgctgggcaacaccgaccgccacagcatcaagaagaacctgatc
ggcgccctgctgttcgacagcggcgagaccgccgaggccacccgcctgaagcgcaccgcccgccgccgct
acacccgccgcaagaaccgcatctgctacctgcaggagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacga
cagcttcttccaccgcctggaggagagcttcctggtggaggaggacaagaagcacgagcgccaccccatc
ttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgcgcaagaagc
tggtggacagcaccgacaaggccgacctgcgcctgatctacctggccctggcccacatgatcaagttccg
cggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagctg
gtgcagacctacaaccagctgttcgaggagaaccccatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcc
tgagcgcccgcctgagcaagagccgccgcctggagaacctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaa
cggcctgttcggcaacctgatcgccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctg
gccgaggacgccaagctgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccaga
tcggcgaccagtacgccgacctgttcctggccgccaagaacctgagcgacgccatcctgctgagcgacat
cctgcgcgtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgccagcatgatcaagcgctacgacgagcac
caccaggacctgaccctgctgaaggccctggtgcgccagcagctgcccgagaagtacaaggagatcttct
tcgaccagagcaagaacggctacgccggctacatcgacggcggcgccagccaggaggagttctacaagtt
catcaagcccatcctggagaagatggacggcaccgaggagctgctggtgaagctgaaccgcgaggacctg
ctgcgcaagcagcgcaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggcgagctgcacgcca
tcctgcgccgccaggaggacttctaccccttcctgaaggacaaccgcgagaagatcgagaagatcctgac
cttccgcatcccctactacgtgggccccctggcccgcggcaacagccgcttcgcctggatgacccgcaag
agcgaggagaccatcaccccctggaacttcgaggaggtggtggacaagggcgccagcgcccagagcttca
tcgagcgcatgaccaacttcgacaagaacctgcccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgta
cgagtacttcaccgtgtacaacgagctgaccaaggtgaagtacgtgaccgagggcatgcgcaagcccgcc
ttcctgagcggcgagcagaagaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccgcaaggtgaccgtga
agcagctgaaggaggactacttcaagaagatcgagtgcttcgacagcgtggagatcagcggcgtggagga
ccgcttcaacgccagcctgggcacctaccacgacctgctgaagatcatcaaggacaaggacttcctggac
aacgaggagaacgaggacatcctggaggacatcgtgctgaccctgaccctgttcgaggaccgcgagatga
tcgaggagcgcctgaagacctacgcccacctgttcgacgacaaggtgatgaagcagctgaagcgccgccg
ctacaccggctggggccgcctgagccgcaagcttatcaacggcatccgcgacaagcagagcggcaagacc
atcctggacttcctgaagagcgacggcttcgccaaccgcaacttcatgcagctgatccacgacgacagcc
tgaccttcaaggaggacatccagaaggcccaggtgagcggccagggcgacagcctgcacgagcacatcgc
caacctggccggcagccccgccatcaagaagggcatcctgcagaccgtgaaggtggtggacgagctggtg
aaggtgatgggccgccacaagcccgagaacatcgtgatcgagatggcccgcgagaaccagaccacccaga
agggccagaagaacagccgcgagcgcatgaagcgcatcgaggagggcatcaaggagctgggcagccagat
cctgaaggagcaccccgtggagaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaac
ggccgcgacatgtacgtggaccaggagctggacatcaaccgcctgagcgactacgacgtggaccacatcg
tgccccagagcttcctgaaggacgacagcatcgacaacaaggtgctgacccgcagcgacaagaaccgcgg
caagagcgacaacgtgcccagcgaggaggtggtgaagaagatgaagaactactggcgccagctgctgaac
gccaagctgatcacccagcgcaagttcgacaacctgaccaaggccgagcgcggcggcctgagcgagctgg
acaaggccggcttcatcaagcgccagctggtggagacccgccagatcaccaagcacgtggcccagatcct
ggacagccgcatgaacaccaagtacgacgagaacgacaagctgatccgcgaggtgaaggtgatcaccctg
aagagcaagctggtgagcgacttccgcaaggacttccagttctacaaggtgcgcgagatcaacaactacc
accacgcccacgacgcctacctgaacgccgtggtgggcaccgccctgatcaagaagtaccccaagctgga
gagcgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcgcaagatgatcgccaagagcgagcaggag
atcggcaaggccaccgccaagtacttcttctacagcaacatcatgaacttcttcaagaccgagatcaccc
tggccaacggcgagatccgcaagcgccccctgatcgagaccaacggcgagaccggcgagatcgtgtggga
caagggccgcgacttcgccaccgtgcgcaaggtgctgagcatgccccaggtgaacatcgtgaagaagacc
gaggtgcagaccggcggcttcagcaaggagagcatcctgcccaagcgcaacagcgacaagctgatcgccc
gcaagaaggactgggaccccaagaagtacggcggcttcgacagccccaccgtggcctacagcgtgctggt
ggtggccaaggtggagaagggcaagagcaagaagctgaagagcgtgaaggagctgctgggcatcaccatc
atggagcgcagcagcttcgagaagaaccccatcgacttcctggaggccaagggctacaaggaggtgaaga
aggacctgatcatcaagctgcccaagtacagcctgttcgagctggagaacggccgcaagcgcatgctggc
cagcgccggcgagctgcagaagggcaacgagctggccctgcccagcaagtacgtgaacttcctgtacctg
gccagccactacgagaagctgaagggcagccccgaggacaacgagcagaagcagctgttcgtggagcagc
acaagcactacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttcagcaagcgcgtgatcctggccgacgc
caacctggacaaggtgctgagcgcctacaacaagcaccgcgacaagcccatccgcgagcaggccgagaac
atcatccacctgttcaccctgaccaacctgggcgcccccgccgccttcaagtacttcgacaccaccatcg
accgcaagcgctacaccagcaccaaggaggtgctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggtct
gtacgagacccgcatcgacctgagccagctgggcggcgacggcggctccggacctccaaagaaaaagaga
aaagtatacccctacgacgtgcccgactacgcctgttaagcggccgcactcgagcaccaccaccaccacc
actgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataact
agcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccgga
ttggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgac
cgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgcc
ggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcg
accccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatc
tcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgattt
aacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcggggaaat
gtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattct
tagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatattttt
gaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggta
tcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggtta
tcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttcc
agacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcat
tcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaa
tgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaata
cctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatg
cttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattg
gcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattg
tcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatt
taatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatg
taagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagac
cccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaa
aaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagccaccaactctttttccgaaggtaac
tggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaag
aactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgata
agtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggg
gggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcta
tgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacag
gagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacct
ctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcg
gcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcag
cgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatt
tcacaccgcaatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccg
ctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacggg
cttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggtt
ttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattca
cagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctga
taaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttct
gttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacat
gcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatca
ctcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgc
gatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaa
ccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgc
gtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggag
cacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtg
gcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatca
tcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgag
ttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctg
actgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggcca
acgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaa
cagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagc
aggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatc
ccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccat
ctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaa
ccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttat
gccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtg
acccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatg
ggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcat
cctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgc
tttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcga
gatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagca
acgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttc
cactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagag
acaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctctt
ccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctc
ccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaag
gaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccg
aaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgc
cagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q20">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>5'UTR</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location><1</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q29">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>FAM</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>10</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q30">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>LNA (locked nucleic
acid)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>12</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q31">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>LNA (locked nucleic
acid)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>3'UTR</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>>21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q40">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>BHQ1</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agtgacacaatctgtggttac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q22">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>5'UTR</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location><1</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q32">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>ROX</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>10</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q33">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>LNA (locked nucleic
acid)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>13</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q34">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>LNA (locked nucleic
acid)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>3'UTR</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>>24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q39">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>BHQ2</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agtgacacaattctgtggttacta</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q24">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>5'UTR</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location><1</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q35">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>ROX</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>8</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q36">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>LNA (locked nucleic
acid)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>11</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q37">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>LNA (locked nucleic
acid)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>3'UTR</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>>21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q38">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>BHQ2</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgacacaatgctgtggttact</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="13">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q26">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aacactagctgccagtcagac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="14">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q28">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtaagttctgtccaagctcgg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (13)
1. Плазмидная конструкция для in vitro синтеза гидовой РНК, несущая вектор pSK-T7 последовательностью SEQ ID NO: 1 и кодирующая гидовую РНК последовательностью SEQ ID NO: 2 против соответствующего участка гена дистрофина мыши Dmd под контролем T7 промотора.
2. Способ получения конструкции по п.1, характеризующийся следующими стадиями:
a) биоинформатический анализ последовательности гена дистрофина мыши Dmd и подбор гидовой РНК в области экзона 51;
b) клонирование последовательности гидовой РНК в вектор pSK-T7 последовательностью SEQ ID NO: 1.
3. Способ получения линий мышей с мутациями в 51-ом экзоне гена дистрофина мыши Dmd, приводящими к сдвигу рамки считывания, характеризующийся следующими стадиями:
a) c помощью конструкции по п.1 осуществляют синтез in vitro гидовой РНК последовательностью SEQ ID NO: 2 против 51-го экзона гена дистрофина мыши Dmd, а также мРНК гена spCas9;
b) далее проводят микроинъекцию смеси гидовой РНК и мРНК spCas9 из пункта (a) в цитоплазму оплодотворенной яйцеклетки мыши гибрида первого поколения CBA×C57BL/6;
c) выявляют жизнеспособных зигот;
d) пересаживают выживших зигот из пункта (c) псевдобеременным самкам-реципиентам, имеющим копулятивную пробку после ссаживания с вазэктомированными самцами;
e) получают новорожденных мышей на 19 день после пересадки зигот из пункта (d);
f) проводят анализ наличия мутации через 8-14 дней после рождения мышей (e), путем амплификации целевого участка гена дистрофина мыши Dmd с двумя праймерами: Dmd-check-f олигонуклеотидом для генотипирования, имеющего последовательность 5'-TGTTCTCTGGTGTACTGCCT-3' (SEQ ID NO: 3) и Dmd-check-r олигонуклеотидом для генотипирования, имеющего последовательность 5'-TGTTCACAGAGAAAAGGTAGCC-3' (SEQ ID NO: 4) - с последующим секвенированием фрагмента;
g) отбирают мышей, несущих целевую мутацию;
h) проводят скрещивание мышей из пункта (g) с мышами дикого типа для получения самок-гетерозигот или мутантных самцов, несущих целевую мутацию.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2815936C1 true RU2815936C1 (ru) | 2024-03-25 |
Family
ID=
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017095967A2 (en) * | 2015-11-30 | 2017-06-08 | Duke University | Therapeutic targets for the correction of the human dystrophin gene by gene editing and methods of use |
WO2021222327A1 (en) * | 2020-04-27 | 2021-11-04 | Duke University | A high-throughput screening method to discover optimal grna pairs for crispr-mediated exon deletion |
RU2764650C1 (ru) * | 2021-04-14 | 2022-01-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) | Способ получения линии гуманизированных мышей, содержащих инсерцию 3974insT в гене mGrin2a (mice glutamate [NMDA] receptor subunit epsilon-1), приводящую к преждевременному прекращению трансляции белка grin2a |
RU2768048C1 (ru) * | 2021-04-14 | 2022-03-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) | Способ получения мышиной модели для изучения синдрома Леша-Нихена путем внесения делеции p.Val8del в ген hprt1 |
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017095967A2 (en) * | 2015-11-30 | 2017-06-08 | Duke University | Therapeutic targets for the correction of the human dystrophin gene by gene editing and methods of use |
WO2021222327A1 (en) * | 2020-04-27 | 2021-11-04 | Duke University | A high-throughput screening method to discover optimal grna pairs for crispr-mediated exon deletion |
RU2764650C1 (ru) * | 2021-04-14 | 2022-01-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) | Способ получения линии гуманизированных мышей, содержащих инсерцию 3974insT в гене mGrin2a (mice glutamate [NMDA] receptor subunit epsilon-1), приводящую к преждевременному прекращению трансляции белка grin2a |
RU2768048C1 (ru) * | 2021-04-14 | 2022-03-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) | Способ получения мышиной модели для изучения синдрома Леша-Нихена путем внесения делеции p.Val8del в ген hprt1 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
XU L. et al. CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice, Mol Ther., 2016, Volume 24(3), pp. 564-569. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Hunter et al. | Mrj encodes a DnaJ-related co-chaperone that is essential for murine placental development | |
Lai et al. | Diverse phenotypes and specific transcription patterns in twenty mouse lines with ablated LincRNAs | |
WO2018177351A1 (zh) | 基于CRISPR/Cas9技术的制备无嵌合基因敲除动物的方法 | |
Neesen et al. | Disruption of an inner arm dynein heavy chain gene results in asthenozoospermia and reduced ciliary beat frequency | |
CN108029638B (zh) | 一种视网膜色素变性疾病动物模型的构建方法及应用 | |
Gay et al. | Mouse TU tagging: a chemical/genetic intersectional method for purifying cell type-specific nascent RNA | |
Pook et al. | Rescue of the Friedreich's ataxia knockout mouse by human YAC transgenesis | |
Deacon et al. | Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy | |
CN106987604B (zh) | 一种制备动脉粥样硬化疾病模型犬的方法 | |
Madan et al. | The pluripotency-associated gene Dppa4 is dispensable for embryonic stem cell identity and germ cell development but essential for embryogenesis | |
Geister et al. | LINE-1 mediated insertion into Poc1a (protein of centriole 1 A) causes growth insufficiency and male infertility in mice | |
Yu et al. | Loss of ESRP1 blocks mouse oocyte development and leads to female infertility | |
Navas-Pérez et al. | Characterization of an eutherian gene cluster generated after transposon domestication identifies Bex3 as relevant for advanced neurological functions | |
CN113957074B (zh) | 一种小脑共济失调疾病模型的构建方法及应用 | |
CN111500640A (zh) | Rp疾病模型的构建方法以及培育方法 | |
Wang et al. | Whole exome sequencing in unexplained recurrent miscarriage families identified novel pathogenic genetic causes of euploid miscarriage | |
Kemmler et al. | Conserved enhancers control notochord expression of vertebrate Brachyury | |
RU2815936C1 (ru) | Способ получения мышиной модели для изучения миодистрофии Дюшенна и вариантов ее терапии | |
JP6172699B2 (ja) | 高脂血症モデルブタ | |
CN110195057B (zh) | Hr基因经遗传修饰的非人动物或其子代的制备方法及应用 | |
CN116103292B (zh) | Zdhhc21基因突变动物模型的构建方法及其应用 | |
Azhar et al. | Myocardial deletion of Smad4 using a novel α skeletal muscle actin Cre recombinase transgenic mouse causes misalignment of the cardiac outflow tract | |
Winter et al. | A combined human in silico and CRISPR/Cas9-mediated in vivo zebrafish based approach to provide phenotypic data for supporting early target validation | |
Conway et al. | Role of sodium‐calcium exchanger (Ncx1) in embryonic heart development: A transgenic rescue? | |
JP2000515386A (ja) | Ku欠損細胞と非ヒトトランスジェニック動物 |