CN111500640A - Rp疾病模型的构建方法以及培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种RP疾病模型的构建方法和应用,涉及医学工程技术领域。本发明发现敲除动物体中的C2cd2l基因可导致动物体表现出RP疾病相关特征,本发明为RP疾病的研究以及为筛选治疗该疾病的药物提供了一种新的RP疾病模型,丰富了RP疾病研究的模型。
Description
技术领域
本发明属于医学工程技术领域,具体涉及RP疾病模型的构建方法以及培育方法。
背景技术
视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa,RP)是一种导致视力丧失的进行性、遗传性致盲 眼底病,通常为视网膜光感受器异常所致,临床要表现为慢性进行性视野缺失,夜盲,色素 性视网膜病变和视网膜电图异常,最终可导致失明。目前比较缺乏研究RP的疾病模型。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种RP疾病模型的构建方法以及培育方法。本发明发现敲除动 物体中的C2cd2l基因可导致动物体表现出RP疾病相关特征,该动物体可以作为RP疾病模 型,本发明为RP疾病的研究以及为筛选治疗该疾病的药物提供了一种新的RP疾病模型, 丰富了RP疾病研究的模型。
本发明是这样实现的:
一方面,本发明提供了一种RP疾病模型的构建方法,其包括:敲除目标动物视网膜视 杆细胞基因组中的C2cd2l基因。
C2CD2L蛋白最初在神经母细胞瘤中被鉴定,是细胞内一种磷脂转运蛋白,主要定位于 内质网和细胞质膜之间,负责这两个双层膜之间磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PI)的转 运,从而建立这两个双层膜之间动态联系。C2CD2L的磷脂转运功能需要依赖钙离子浓度驱 动。在钙离子浓度驱动下,C2CD2L可将磷脂酰肌醇的视杆4,5-二磷酸(PI(4,5)P2)从内质 网运输到细胞膜上,从而为磷脂酰肌醇信号通路提供物质前体。C2CD2L参与的磷脂酰肌醇 信号通路对细胞生命活动至关重要。在此信号通路中,胞外信号分子与细胞表面G蛋白耦 联受体结合,激活质膜上的磷脂酶C,磷脂酶C可催化PI(4,5)P2分解产生1,4,5-三磷酸 肌醇(IP3)和二酰基甘油(DG)两个第二信使,胞外信号转换为胞内信号,这两个信使有 不同的功能。其中,IP3可作用于肌质网,促使其释放钙离子,导致肌动蛋白-肌球蛋白相关 信号通路激活,引发肌肉运动;而DAG可激活蛋白激酶C(PKC),后者可激活下游多种 蛋白,比如钠离子/氢离子交换蛋白,使得细胞内氢离子浓度升高。磷脂酰肌醇信号通路能 够帮助不同细胞内膜系统发挥重要不同作用,在物质转运、脂质代谢、病毒感染等等过程中 发挥重要作用。
C2CD2L主要表达在脑和神经元样的细胞中,例如胰腺内分泌细胞。目前针对C2CD2L 蛋白功能的研究报道并不多,对其功能也知之甚少,有文献表明其对于神经分泌活动以及胰 岛素分泌释放起到至关重要的作用,但其详细作用机制以及其在视网膜中的生物学功能还不 甚明了。因此,深入研究C2CD2L对RP疾病的治疗及病因探讨潜力巨大。但是目前对 C2CD2L的研究还处于初期阶段,其在小鼠以及其他哺乳动物体内的具体作用机制尚不清楚, 限制了其开发应用。
C2CD2L蛋白在视网膜中有重要功能,能够介导磷脂酰肌醇的细胞内转运来影响视网膜 功能,直接或间接影响感光细胞存活,导致RP。但其具体的致病分子机制尚不清楚,值得 进一步研究。
本发明的发明人首次发现,在目标动物的视网膜视杆细胞中敲除C2cd2l基因即沉默或 抑制该基因的表达,可以使得目标动物表现出RP疾病相关特征。因此,视网膜视杆细胞中 的C2cd2l基因被敲除的动物可以作为RP疾病模型,用于RP疾病研究等领域中,为该疾病 的研究例如发病过程、机制以及相关药物的筛选提供一种新的模型。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,敲除C2cd2l基因是指敲除C2cd2l基因的外显 子序列。
敲除C2cd2l基因可以是敲除C2cd2l基因全长序列,也可以是敲除C2cd2l基因部分序 列例如部分外显子序列,无论敲除那种类型(部分或全长)的序列,只要是能够在视杆细胞 中沉默C2cd2l基因的表达,使动物表现出RP疾病相应特征即属于本发明的保护范围。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述目标动物为哺乳动物。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述哺乳动物选自小鼠、大鼠、兔、牛、狗、猪、马、羊、猴以及猿中的任意一种。
需要说明是,本发明所述的目标动物并不限于上述的动物,也可以是其他类型的哺乳动 物。无论选用何种动物,只要是具有C2cd2l基因的动物,均可作为本发明所述构建方法中 的目标动物,在其视杆细胞中敲除C2cd2l基因,使其表现出RP性疾病特征,作为RP疾病 模型,用于到RP性疾病研究领域中,均属于本发明的保护范围。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,目标动物为小鼠,敲除C2cd2l基因的外显子 序列是指敲除C2cd2l基因上第1到第14号外显子中的任意一个或多个外显子序列。小鼠C2cd2l基因(C2 domain-containing protein 2-like,MGI:1919014)位于小鼠9号染色体44,309,237-44,320,285bp,全长11.05kb,其cDNA全长2121bp,包含14个外显子。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,敲除C2cd2l基因的外显子序列是指敲除C2cd2l 基因上的第2-7号外显子序列。
需要说明的是,当选用其他非小鼠哺乳动物作为疾病模型时,本领域技术人员容易获得 与小鼠C2cd2l基因同源的基因,敲除该同源基因即可得到RP疾病模型。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述构建方法包括:
1)合成与小鼠C2cd2l基因同源的两端有同向排列loxP位点的如SEQ ID NO:3所示的 同源模板序列,以用于替换欲敲除的C2cd2l基因第2-7号外显子;另外合成靶序列SEQID NO.1的gRNA1和靶序列SEQ ID NO.2的gRNA2。
2)将步骤1)得到的小鼠C2cd21基因的同源模板序列,gRNA和Cas9 mRNA共注射到受精的小鼠卵中;
3)将步骤2)得到的受精卵移植到假孕鼠子宫中,分娩出子代鼠,测序鉴定,获得C2cd2l 基因条件性敲除的首建小鼠;
4)将步骤3)得到的首建小鼠和野生型小鼠交配繁育,在后代中筛选出C2cd2l基因条件 性敲除的杂合子小鼠;
5)将步骤4)得到的C2cd2l基因条件性敲除杂合子小鼠相互交配繁育,得到C2cd2l基因 条件性敲除纯合子小鼠;
6)将步骤5)得到的C2cd2l基因条件性敲除的纯合子小鼠与转Rod-Cre基因小鼠交配, 得到视网膜视杆细胞C2cd2l基因敲除的小鼠动物,即可作为视网膜色素变性疾病模型。
上述敲除策略是采用Cre-loxP敲除技术敲除C2cd2l基因。但在其他的实施例中,在明 确了所敲除基因的前提下,采用本领域常规的基因编辑技术是容易实现基因敲除目的。实现 基因敲除的技术手段有很多,例如CRISPR/Cas9技术、人工核酸酶介导的锌指核酸酶技术 (zinc-finger nucleases,ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶技术(transceription activator-like effector nucleases,TALEN)等。因此,在其他的实施例中采用CRISPR/Cas9技术或其他的 技术手段敲除C2cd2l基因,也是属于本发明的保护范围。
另一方面,本发明提供了由上述的RP疾病模型的构建方法所得到的RP疾病模型在RP 性疾病研究中的应用。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述研究是以非疾病的治疗为目的。
通过本发明的构建方法得到的动物模型其具有典型RP性疾病特征,其具有非常广阔的 应用前景,例如将其用于研究RP性疾病的发病过程、发病机制,为深入了解研究RP性疾 病提供基础。又或者将其用于筛选用于预防或治疗RP性疾病药物、用于评价药物的疗效或 预后等。
另一方面,本发明提供了由上述的RP疾病模型的构建方法所得到的RP疾病模型在筛 选用于预防或治疗RP性疾病药物中的应用。
再一方面,本发明提供了RP疾病模型的培育方法,其包括:将由上述构建方法所得到 的RP疾病模型相互交配。
在首次通过上述构建方法得到RP疾病模型后,为了获取更多数量的RP疾病模型,本 领域技术人员容易想到通过将RP疾病模型进行相互交配的育种方法以获得更多数量的RP 疾病模型,这样的培育RP疾病模型的方法也是属于本发明的保护范围。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简 单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的 限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图 获得其他相关的附图。
图1:检测C2cd2l基因在不同组织器官中的表达;
图中:A:C2cd2l基因在不同组织器官的RT-PCR检测结果;图中:Heart:心脏;Kidney: 肾脏;Liver:肝脏;Brain:脑组织Retina:视网膜;Lung:肺;Spleen:脾;Pancreas:胰腺;Relative mRNA level:相对信使RNA表达水平;Fold change:变化倍数;
B:免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)染色结果表明C2cd2l在视网膜中广泛表 达;小鼠年龄:3个月;OS:outer-segment(外节);IS:Inner-segment(内节);ONL: Outernuclear layer(外核层);INL:Inner nuclear layer(内核层);C2cd2l:C2cd2l抗体; DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole),细胞核染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚。
图2:视网膜视杆细胞敲除C2cd2l基因小鼠(cKO)的构建路线。
图3:长距离PCR鉴定子一代鼠5’端长臂结果;图中:扩增5’端长臂使用引物对5’arm-F1 和3’loxP-R1,扩增产物为3.9kb;其中9,10,11,12,13,14为阳性,WT:野生型;water:纯 净水对照。
图4:长距离PCR鉴定子一代鼠3’端长臂结果;扩增3’端长臂使用引物对5’arm-F2,3’loxP-R2扩增产物为4.2kb,其中9,10,11,12,13,14为阳性,WT:野生型;water:纯净水 对照。
图5:C2cd2l基因敲除小鼠的基因型鉴定结果;图中cKO表示纯合子;WT是指野生型;Het是指杂合子。
图6:C2cd2l基因敲除效率检测;A:实时定量PCR实验分析C2cd2l敲除小鼠视网膜中基因敲除效率;B:Western blot实验分析C2cd2l敲除小鼠视网膜中基因敲除效率;C:视网膜视杆细胞特异敲除C2cd2l基因小鼠IHC染色结果,证明C2cd2l在敲除小鼠视网膜视杆细胞中不再表达。
图7:暗适应视网膜电图(Electroretinogram,ERG)检测结果:
图中:A-D:不同光强下视网膜视杆细胞C2cd2l基因敲除小鼠的暗适应视网膜电图轨 迹图;E:不同光强下视网膜视杆细胞C2cd2l基因敲除小鼠的暗适应视网膜电图a波统计; F:不同光强下视网膜视杆细胞C2cd2l基因敲除小鼠的暗适应视网膜电图b波统计.Scotopic amplitude:暗光测定峰值;Flash intensity:闪光强度;a-wave:a波;b-wave:b波。
图8:视网膜视杆细胞敲除C2cd2l基因小鼠视网膜石蜡切片H&E染色结果;A:视网膜视杆细胞特异敲除C2cd2l基因小鼠视网膜石蜡切片H&E染色结果,外核层及内核层均变薄;B:对不同部位的C2cd2l敲除鼠视网膜外核层厚度统计;小鼠年龄:3个月;cKO表示C2cd2l基因敲除小鼠纯合子;WT是指野生型;OS:outer-segment(外节);IS:Inner-segment(内节);ONL:Outer nuclear layer(外核层);INL:Inner nuclear layer(内核层);RGC:Retinal ganglion cell(视神经节细胞);Distance ON:Distance to optic nerve(距离视神经距离)。
图9:视网膜视杆细胞特异敲除C2cd2l基因小鼠抗体免疫染色结果,表明在C2cd2l敲 除鼠视网膜外节变短退化,小鼠年龄:3个月;OS:outer-segment(外节);IS:Inner-segment (内节);ONL:Outer nuclear layer(外核层);INL:Inner nuclear layer(内核层);DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole);细胞核染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚;Rhodopsin,视紫红质 抗体。
图10:视网膜视杆细胞特异敲除C2cd2l基因小鼠IHC染色结果,表明在C2cd2l敲除鼠视网膜出现损伤,引发炎症反应,小鼠年龄:3个月;OS:outer-segment(外节);IS:Inner-segment(内节);ONL:Outer nuclear layer(外核层);INL:Inner nuclear layer(内 核层);DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole),细胞核染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚;GFAP,胶 质细胞纤维酸性蛋白抗体;Fluorescence intensity;荧光强度。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术 方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条 件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
1采用RT-PCR方法检测C2cd2l基因在不同组织器官的表达情况。
方法:分别提取小鼠脑、肝脏、视网膜、肠、肌肉、心脏、肾脏以及脾的总RNA,具 体步骤如下:
1)将组织置于1.5ml离心管,加入1ml Trizol提取液,室温20分钟;
2)加入200ul氯仿,充分混匀,室温静置10分钟;
3)将样品置于4度离心机,10000转离心15分钟;
4)小心吸取上清液,加入等体积异丙醇,充分混匀,10000转离心沉淀RNA;
5)75%乙醇清洗析出的总RNA,离心再次沉淀,然后晾干加入DEPC水溶解;
6)以总RNA为模板,然后用cDNA合成试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。根据C2cd2l的cDNA序列设计引物。C2cd2l的cDNA序列如SEQ ID NO.4所示:
ATGGATCCGGACTGGGGGCAGCGGGATGTGGGCTGGGCGGCCCTGCTGGTTCTCT TCGCCGCCTCGCTGATCACGGTATTGGGCTGGATGCTGCAGTATGCCCGGGGTTTGTGG CTGTCGCGAGCCGATGGGGGCCGAGACTCCCGACCTGCCTCAGCTGCTGAGCCCGGG GGTTCACTGCGCGAGCTGGGTGTGTGGCGTTCGCTGCTGCGTTTGCGGGCGACCCGGA CCAGCACCCCCGAGGAAGCCGGCGTACGGGGCCTCCTGGCTTCGCTCTTTGCCTTCAA GTCTTTCCGGGAGAACTGGCAACGGGCTTGGGTGCGAGCCTTGAATGAGCAGGCCTG CAGGGACGGGAGCTCCATCCAAATCGCCTTTGAAGAGATACCCCAACTCCCACCAAGA GCCAGCATCAGTCATGTGACCTGCGTTGACCAATCAGAGCGCACCATGGTGCTGCATT GCCAGCTCTCTGCTGAGGAGGTGCGCTTCCCCATCTCTGTGACCCAGCAGTCCCCCGC TGCCGTCTCCATGGAGACCTACCACGTCACTCTGACACTGCCACCAACACAGTTGGAA GTCAGCCTGGAGGAAATCCCTGATGAGGGGCTCCTGGTGTCCTGGGCCTTCACTGACC GCCCAGAACTCAGCCTAAAGGTGCTTCCCAAGTTGCAGACTAGGGAGAGAGATGAGG AACAACCAGAGCTCTCAACAGTTGAGGAACTGATCAAGGACGCTATAGTCAGCACTC AGCCCGCCATGATGGTCAACCTCAGGGCCTGCTCTGCCCCAGGAGGCCTGGTACCCAG TGAGAAGCCACCCACGATGTCCCAGGCCCAGCCATCCATCCCCAGACCTACCCGATTAT TCTTACGGCAGCTTCGAGCATCTCACCTGGGAAGTGAGCTAGGAGGTACTGAGGAACT GTGCTGTGCCGCTGAGCTTGACAACCCCATGCAACAAAAGTGGACCAAACCCATGAG GGCGGGCCCCGAGGTGGAATGGACCGAGGACCTAGCTCTGGATCTGGGTCCCCAGAG CCGGGAGCTGACCCTCAAAGTGCTCCGGAGCAGCAGCTGTGGAGATGCTGAACTCCT TGGCCAAGCCACACTGCCTGTGGGCTCACCCTCTAGACCGATGTCACGAAGACAGGTG TGCCCACTGACTCCAGGGCCCGGGAAATCCCTGAGCCCGGCAGCCACCGTGACAGCG GAGCTACATTATGAGCAGGGTTCCCCTCGGAATCTGGGCACGCCCACCTCCTCCACCC CTCGCCCCAGCATCACACCCACCAAGAAGATTGAGTTGGACCGGACCATCATGCCCGA CGGCACAGTCGTCACCACTGTCACTACCGTCCAGTCCCGCCCCCGTGTAGATGGCAAA CTAGACTCCCCCTCCCGCTCCCCGTCCAAGGTGGAGGTGACTGAGAAGATGACAACCG TGCTGAGTGAGAGCAGCGGCCCCAGCAATGCCTCCCACAGCAGCAGCCGGGAGAGCC ACCTTTCCAATGGCTTGGATCCAGTAGCAGAGACAGCCATTCGCCAGCTGACTGAGCC CAGTGGGCGGGCAGCCAAGAAGACACCCACCAAGAGGAGCACGCTCATCATCTCTGG TGTTTCCAAGGTGCCCATCGCCCAGGACGAGTTGGCTCTCTCCTTGGGTTACGCGGCAT CTCTGGAAGCCTCGATGCAAGATGATGCAGGAACCAGTGGTGGTCCTTCGTCACCTCC CTCAGACCCCTCAGCCACATCCCCAGGACCTGTTGATGCCCTCTCCAGTCCCACAAGT GTCCAGGAGGCAGATGAGACAACACGTTCAGACATCTCTGAGAGGCCGTCTGTGGAT GATGTTGAGTCAGAAACAGGGTCCACTGGTGCCCTGGAGACCAGAAGCCTCAAGGAT CACAAAGTGAGTTTCCTGCGCAGTGGCACAAAGCTCATCTTCCGCCGGAGGCCCCGA CAGAAGGAAGCTGGTCTGAGCCAGTCACACGATGACCTGTCCAACACGACGGCCACA CCTAGCGTCCGGAAGAAGGCTGGCAGCTTTTCCCGTCGCCTTATCAAGCGTTTTTCCTT CAAATCCAAACCCAAGGCCAATGGCAACCCTAGCCCCCAGCTCTGA;
引物序列如下:
C2cd2l-cDNA-F(SEQ ID NO.5):
5’-CATCCATCCCCAGACCTACC-3';
C2cd2l-cDNA-R(SEQ ID NO.6):
5’-CTAGGTCCTCGGTCCATTCC-3'。
7)以提取的cDNA为模板,进行RT-PCR。
8)扩增后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳:称取1g琼脂糖放于100ml TAE buffer中, 微波炉中融化后制成1%的琼脂糖胶。取10ul PCR产物于加样孔中,120V恒压琼脂糖电泳 15min,用凝胶成像系统成像。
结果见图1中A,可以看出,通过RT-PCR方法检测C2cd2l基因在小鼠脑、肝脏、视 网膜、肌肉、肺、心脏、肾脏以及脾中的表达,结果发现在这些组织器官中,C2cd2l均有 表达,说明该基因可能在体内发挥重要功能。
2采用免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)的方法检测C2cd2l基因在小鼠视网膜 中的表达。
方法:
取3月龄的野生型小鼠断颈处死后,快速取眼球,并放入4%的PFA中,冰上固定15min 后,在角膜上剪口,然后继续冰上固定。2h后,PBS缓冲液冲洗3遍,然后将眼球置于30% 蔗糖溶液中脱水2h,然后解剖镜下剪去角膜及晶体,OCT包埋并迅速置于-80℃冰箱冷冻。 大约10min后,取出OCT包埋的眼球,置于冰冻切片机-25℃平衡约30min后即可切片。切片厚度为12μm。
切片完成后,选取质量较高的片子于37℃烘箱放置30min,然后免疫组化笔在有视网 膜组织的地方画圈,PBS洗三遍以去除OCT,然后5%的NDS(含有0.25%Triton)封闭通透2h,孵育一抗,4℃过夜。第二天,PBS清洗三次后,孵育相应的荧光二抗,然后再用 PBS清洗三次,封片,观察。
结果见图1中B,可以看出,C2cd2l广泛表达于小鼠视网膜中。
实施例2
1本实施例提供视网膜色素变性疾病模型的构建方法,敲除C2cd2l基因的路线参考图2, 操作步骤如下:
1)合成与小鼠C2cd2l基因同源的两端有同向排列loxP位点的如SEQ ID NO.3所示的同 源模板序列,以用于替换欲敲除的C2cd2l基因第2-7号外显子;另外合成gRNA1和gRNA2。
gRNA1:其靶序列为CTTTCGAGAGCTAAGCTAATCGG(SEQ ID NO.1);
gRNA2:其靶序列为GCGGTGCTACCCTTGCTTGAAGG(SEQ ID NO.2)。
SEQ ID NO:3如下:
TCCGCTCCCTAATACTCCTGCTGTCCACCCTAAGGAATTAAGATCTATAACTTCGTATAGCATACATT ATACGAAGTTATtctaggcttgggacccctgagccctccctctgagcttgcttctcttcctagcacttctgat ggggtttcctggagacatgataagttagtctttatttctaagaacttaagcagcgtgataggataccattgaccattcacatcctgtttgtttgggga aaggcttagccttatttcttcatcttattttatagcacatgacacaaccatttcacttcagccttgcccagcagtgaccatgtcactctcttgttgtcatt gtcacttacctctatttgtgattacagtgaatgatgaggtggaggggtgaagagggaaacagggagtacagagaggttccagggatttgaaga attacccaaggttcaaaggcaagctggcctctaaggtagcctctggaagctgcagatccctggagacagtggggctgcaggggaaaccttct gccctaagctgttgagccaagaaggggccagaggccagcctggagccgaggcctctgcagtgctagaatcaagccagcaattgggcaga ccagccctgcaggggacagctccagagacttgatcttgtgcccacattacttcctcagAGCTCCATCCAAATCGCCTTTG AAGAGATACCCCAACTCCCACCAAGAGCCAGCATCAGTCATGTGACCTGCGTTGACCA ATCAGAGCGCACCATGgtaagggtctggtgggcactacaagatggggcagaccccaaggttccctttagtatgaggggtctta atttggagtttctgtgtgtcttaaggacctaaggatttgtttcaggaggtctgagaacctcactgacgtgataggcaaagtaagtgtgtgtgtatgt gggggtctgtttctagggagagaagagtttttgtctttgttttgagacaggattttactgtgtaggtctgcctgtcctggaactcactctgtagacca ggaaatctgcctgcctctgcctccagagtactgggattaaaggcgtgcgccaccaccacctggctgagatttttgcttttgtctaattcattgaga agcttagggcccccaaaaggacatcatcccaaggatgatagaagtggggaagggcagagccaggtgggtgtcctccgcagtgcctgacac tgttccctgtttcagGTGCTGCATTGCCAGCTCTCTGCTGAGGAGGTGCGCTTCCCCATCTCTGT GACCCAGCAGTCCCCCGCTGCCGTCTCCATGGAGACCTACCACGTCACTCTGACACTG CCACCAACACAGgtggagggaaatgggggaaactgagttgggcagagggcagttgagttggcccagcattttctccctgcttcct ctctaccgttggattcgggaaggaagggtccgagtagttagcagggtggggggatggggtcctgaagaatggggtagatcacagtaatcctt ccgttcttgtctctagTTGGAAGTCAGCCTGGAGGAAATCCCTGATGAGGGGCTCCTGGTGTCCT GGGCCTTCACTGACCGCCCAGAACTCAGCCTAAAGGTGCTTCCCAAGTTGCAGACTAG GGAGgtaagaagggggcagcagaggagagactgaactggcgcaatggagcagggcggaggctccacctcttctcctctctgcagAG AGATGAGGAACAACCAGAGCTCTCAACAGTTGAGGAACTGATCAAGGACGCTATAGT CAGCACTCAGCCCGCCATGATGGTCAACCTCAGGGCCTGCTCTGCCCCAGGAGGCCTG gtgagtggacacccaaagggaaggtttgcgtgtatcccacctccaggttactatatcgggattatttctctttttactcccttttgctcttagGTA CCCAGTGAGAAGCCACCCACGATGTCCCAGGCCCAGCCATCCATCCCCAGACCTACCC GATTATTCTTACGGCAGCTTCGAGCATCTCACCTGGGAAGTGAGCTAGGAGgtgagaattccg ctgcccaggacatagcttctctattccgcggacttggtttcttccgtctgagcatcctctaagctctgcttcctgacagGTACTGAGGAA CTGTGCTGTGCCGCTGAGCTTGACAACCCCATGCAACAAAAGTGGACCAAACCCATG AGGGCGGGCCCCGAGGTGGAATGGACCGAGGACCTAGCTCTgtaagtcacactctgctcctcccctct gtccccatgggcagtcaggatgaagaaacttttccaggctagccctggcatgaggaagccagccttgttttcagtagcctgtagtgtggacctc cactgtatgccaggccctggggacacagactaggagtagatacagccctacctctgggtggatcacagacccgaagcagagacacatagg gaagaaaggacaaagttgccagttgagattggtgcacagcatgccgtggaggcgcttcagtaggggagatgacgaattctcaaaacggactaaagaactgatgaaatgtcatggaagaagtctatttaaaccacgccttcaaATAACTTCGTATAGCATACATTATA CGAAGTTATACATGTGCAAGGGTAGCACCGCAACAGAATGTGAAAGTCTTCTTGA。
第1-40位是5’arm同源序列,第41-80位是loxP序列(下划线),第2599-2638位是loxP序列(下划线),第2639-第2678位是3’arm同源序列,第81-2598位是第2-7号外显 子和内含子序列。
2)将步骤1)得到的小鼠C2cd21基因的同源模板序列,gRNA和Cas9 mRNA共注射到受精的小鼠卵中;
3)将步骤2)得到的受精卵移植到假孕鼠子宫中,分娩出子代鼠,测序鉴定,获得C2cd2l 基因条件性敲除的首建小鼠;
鉴定方法如下:采用长距离PCR鉴定阳性子一代鼠,操作如下:
(a)扩增5’端长臂使用引物对:5’arm-F1和3’loxP-R1,PCR退火温度60度,预期扩增产物为3.9Kb;
5’arm-F1(SEQIDNO.7):
5’-TTGGGTGCGAGCCTTGAATGA-3’;
3’loxP-R1(SEQIDNO.8):
5’-GTGGATTCGGACCAGTCTGA-3’。
结果见图3,其中,9、10、11、12、13和14号样本的扩增产物为3.9kb,为阳性扩增 结果。
(b)扩增3’端长臂使用引物:5’arm-F2和3’loxP-R2,PCR退火温度60度,预期扩增产物为4.2Kb;
5’arm-F2(SEQ ID NO.9):
5’-ACGTAAACGGCCACAAGTTC-3’;
3’loxP-R2(SEQ ID NO.10):
5’-CAGTCACCTCCACCTTGGAC-3’。
结果见图4,其中,9、10、11、12、13和14号样本的扩增产物为4.92kb,阳性扩增结果。
选取出现上述阳性扩增结果的首建小鼠进行后续步骤;
4)将步骤3)得到的首建小鼠和野生型小鼠交配繁育,在后代中筛选出C2cd2l基因条件 性敲除杂合子小鼠;
5)将步骤4)得到的C2cd2l基因条件性敲除杂合子小鼠相互交配繁育,得到C2cd2l基因 条件性敲除纯合子小鼠;
6)将步骤5)得到的C2cd2l基因条件性敲除纯合子小鼠与转Rod-Cre基因动物交配,得 到在视网膜视杆细胞中敲除C2cd2l基因的纯合子小鼠,即可作为视网膜色素变性疾病模型。
Rod-Cre转基因小鼠(MGI:4417915)购自美国杰克森实验室(JacksonLaboratory)。此转 基因小鼠的Cre基因在视网膜视杆细胞由特异视蛋白启动子(Rod)驱动表达,Cre蛋白可以进 入视杆细胞的细胞核,识别基因组上LoxP位点,实现基因条件性敲除。
2视网膜视杆细胞中敲除C2cd2l基因的纯合子小鼠的鉴定
方法:
1)剪小鼠尾梢少许组织样本,置于干净的1.5ml离心管中;
2)在离心管中加入100μl裂解液(40mM NaOH,0.2mM EDTA溶液),并在金属浴 100℃加热1h;
3)取出离心管,冷却至室温后,加入100μl的中和液(40mM Tris-HCl,pH5.5),10000g 离心2min后,取上清用于小鼠基因型鉴定。
4)PCR扩增:按照如下体系配置PCR反应体系
2×Taq Mix 10μL
尾巴组织裂解液 2μL
引物1(C2cd2l-loxP-Forward或Rod-Cre-Forward),1μL(浓度:10mM);
引物2(C2cd2l-loxP-Reverse或Rod-Cre-Reverse),1μL(浓度:10mM);
ddH2O 6μL。
引物序列如下:
C2cd2l-loxP-Forward序列(SEQ ID NO.11):
5’-GTTGCCAGTTGAGATTGGTGCACAG-3’;
C2cd2l-loxP-Reverse序列(SEQ ID NO.12):
5’-GCTGCCTTCCGTCCTGTTTTAGT-3’;
Rod-Cre-Forward序列(SEQ ID NO.13):
5’-TCAGTGCCTGGAGTTGCGCTGTGG-3’;
Rod-Cre-Reverse序列(SEQ ID NO.14):
5’-CTTAAAGGCCAGGGCCTGCTTGGC-3’。
扩增程序:
预热:95℃,5min;变性:95℃、30s,退火:58℃、30s,延伸:72℃、30s,循环: 25次;72℃、5min;4℃保存。
5)凝胶电泳
取10ul PCR产物于加样孔中,于1%的琼脂糖胶中,120V恒压琼脂糖电泳15min.用凝 胶成像系统成像。
结果如图5,上方是C2cd2l基因敲除鉴定结果,WT表示野生型对照,条带大小为243bp; Het表示杂合子,有两个条带,分别是243bp和368bp;cKO表示纯合子,有单一条带,大 小为368bp。下方是Rod-Cre基因鉴定结果,Rod-Cre大小为500bp,根据图5的结果,显 示该鉴定方法可对小鼠基因型进行有效鉴定,选取具有cKO所示条带的小鼠,即为视网膜 色素变性疾病模型。
实施例3
1RT-PCR实验分析C2cd2l基因敲除小鼠中的基因敲除效率。
RT-PCR实验方法:
分别获取野生型和实施例2的C2cd2l基因敲除小鼠的视网膜组织,提取小鼠视网膜的 总RNA,然后用cDNA合成试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。以提取的cDNA为模板,进 行RT-PCR扩增。扩增后进行电泳,结果见图6中A。可以看出,通过RT-PCR方法检测 C2cd2l在cKO小鼠的视网膜中表达量显著降低。图6中WT是指野生型对照,cKO是指实 施例2得到的视网膜视杆细胞C2cd2l基因敲除的纯合子小鼠,Relative mRNA level是指RNA 表达水平相对变化,以野生型表达水平为1。
2免疫印迹(Western blot)实验分析C2cd2l基因敲除小鼠中基因敲除效率。
方法:
1)分别获取野生型和实施例2的C2cd2l基因敲除小鼠的视网膜组织,充分研磨后加入 200ul蛋白裂解液RIPA。
2)超声破碎细胞后,在冰上裂解20min。
3)4℃,16000g离心10min后,取上清转移至另一干净离心管,加入50μl的蛋白上样液,混匀后95℃加热5min。
4)待样本冷却后,分别取20μl,160V电压进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以分离蛋白。
5)SDS-PAGE结束后,根据需要,裁剪适当大小的硝酸纤维素膜,按顺序铺上滤纸、胶、硝酸纤维素膜及滤纸,并赶去气泡,转膜槽放入冰水浴中,采用恒流0.28A的电流进 行转膜,转膜2h。
6)转膜完毕后,纯水冲洗硝酸纤维素膜一遍,晾干并标记。然后用8%的脱脂牛奶封 闭2h。
7)封闭完成后,加入一定量的按一定比例(按照抗体使用说明书)稀释于封闭液的一 抗(抗C2CD2L抗体(Novus Biologicals,NBP2-14401)),4℃孵育过夜。
8)回收一抗,1×TBST缓冲液洗膜4次,每次10min,根据一抗来源,选择合适二抗(Bio-Rad Laboratories),用1×TBST稀释辣根过氧化氢酶(HRP)标记的二抗,室温于摇床上孵育2h。
9)二抗孵育结束后,用1×TBST洗膜3次,每次10min,用Thermo的ELC发光试剂 盒检测蛋白,所用仪器为Bio-Rad的化学发光凝胶成像系统。
结果见图6中B,可以看出,cKO小鼠的视网膜中C2CD2L含量明显降低,说明在cKO小鼠中,C2CD2L的表达被沉默。
3免疫组化(IHC)实验分析C2cd2l基因敲除小鼠视网膜中的基因敲除效率。
视网膜冰冻切片免疫染色:取3月龄的实施例2构建得到的C2cd2l基因敲除小鼠,断 颈处死后,快速取眼球,并放入4%的PFA中,冰上固定15min后,在角膜上剪口,然后 继续冰上固定。2h后,PBS缓冲液冲洗3遍,然后将眼球置于30%蔗糖溶液中脱水2h, 然后解剖镜下剪去角膜及晶体,OCT包埋并迅速置于-80℃冰箱冷冻。大约10min后,取出 OCT包埋的眼球,置于冰冻切片机-25℃平衡约30min后即可切片。切片厚度为12μm。
切片完成后,选取质量较高的片子于37℃烘箱放置30min,然后免疫组化笔在有视网 膜组织的地方画圈,PBS洗三遍以去除OCT,然后5%的NDS(含有0.25%Triton)封闭通透2h,孵育一抗(根据目标物的不同选择相应的抗体),4℃过夜。第二天,PBS清洗三次 后,孵育相应的荧光二抗,然后再用PBS清洗三次,封片,观察。
结果见图6中C,可以看出,在小鼠3月龄时,通过视网膜冰冻组织切片染色C2CD2L抗体后发现,相较于野生型小鼠,C2cd2l基因敲除小鼠视网膜外核层以及视杆细胞内节C2CD2L表达消失,表明其在视网膜视杆细胞中C2cd2l基因被特异性敲除。
实施例4
对3月龄的C2cd2l基因敲除小鼠进行ERG视力检测:
1)暗适应动物应整夜暗适应,环境应做到绝对没有光线;
2)次日麻醉:称重,腹腔内注射;宜深度麻醉;
3)动物固定及散瞳:麻醉完成后,在暗红光照明下将小鼠用胶带固定在动物试验平台 的前方:需保证小鼠正"趴",即相对于闪光刺激器的刺激口,双眼高度一致,充分暴露,滴 加散瞳剂。
4)电极安装:将视网膜电图仪(Espion Visual Electrophysiology System,DiagnosysLLC,Littleton,MA,USA)预热后,在电极涂上导电膏,夹住小鼠尾巴,插入放大器“地”接口;双头的针电极插入后颈皮(大约在两耳中间),同时接两个通道的“负”接口;金环电极夹在动物实验平台的电极支架上,仔细调整其角度,轻微的接触角膜的中心顶端。一通道正极接右眼,二通道正极接左眼。通过针管对双眼滴生理盐水,改善金环电极及角膜的接触效果。保证两个金环电极以相同的角度、方式接触两眼角膜中心正端的相同位置。
5)记录示波信号确认无误后,关闭暗红光。可以先尝试记录一下暗适应光强为0.003 cd/s·m2的ERG检测,确认一下信号的质量:如果双眼的振幅出现了与预期不同的较大差异, 建议再次检查金环电极的安装位置。然后依次记录暗适应光强为0.03/0.3/3.0/20.0cd/sm2的 信号,记录后系统将自动打开背景光。
结果发现在3个月时,相较于WT小鼠,cKO小鼠的a波和b波在暗适应和明适应条 件下均明显降低,表明C2cd2l基因在视杆细胞敲除后导致小鼠的视力受损(图7)。
实施例5
视网膜石蜡切片H&E染色:
对3月龄小鼠的视网膜进行石蜡切片、苏木精-伊红染色法(H&E染色方法)染色,具体操作如下:
1)快速取小鼠眼球组织,并置于固定液中固定24h;
2)石蜡包埋,切片,厚度为4μm;
3)切片常规用二甲苯脱蜡,经多级乙醇至水洗:二甲苯(I)5min→二甲苯(Ⅱ)5min→100% 乙醇2min→95%的乙醇1min→80%乙醇1min→75%乙醇1min→蒸馏水洗2min;
4)苏木素染色5分钟,自来水冲洗;
5)盐酸乙醇分化30秒;
6)自来水浸泡15分钟;
7)置伊红液2分钟。
8)常规脱水,透明,封片:95%乙醇(I)1min→95%乙醇(Ⅱ)1min→100%乙醇(I)1min→100%乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯石碳酸(3:1)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性树脂封固。
9)显微镜下拍照。
结果发现在3个月时,相较于WT小鼠,cKO小鼠的视网膜外核层已经开始变薄,表明感光细胞死亡(图8)。
实施例6
视网膜冰冻切片免疫染色外节抗体Rhodopsin检测视网膜外节变化。
结果见图9,在小鼠3月龄时,通过视网膜冰冻组织切片染色外节抗体Rhodopsin后发 现,相较于WT小鼠,cKO小鼠视网膜外节明显缩短,出现明显退化的现象。
实施例7
视网膜冰冻切片免疫染色神经胶质细胞标记物GFAP检测胶质细胞变化。
结果见图10,在小鼠3月龄时,通过视网膜冰冻组织切片染色神经胶质细胞标记物GFAP 后发现,相较于野生型小鼠,C2cd2l基因敲除小鼠视网膜出现明显胶质细胞增生,炎症反 应增强,表明视网膜损伤。
综上,可以看出,本发明实施例以小鼠为例,在其视网膜视杆细胞敲除C2cd2l基因后, 该小鼠出现了视网膜色素变性疾病的特征例如:视力受损,视细胞外节变短、退化,以及视 细胞丢失等,充分说明,视网膜视杆细胞中C2cd2l基因敲除后的小鼠可以作为视网膜色素 变性疾病模型。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员 来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等 同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川省人民医院
<120> RP疾病模型的构建方法以及培育方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctttcgagag ctaagctaat cgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcggtgctac ccttgcttga agg 23
<210> 3
<211> 2678
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tccgctccct aatactcctg ctgtccaccc taaggaatta agatctataa cttcgtatag 60
catacattat acgaagttat tctaggcttg ggacccctga gccctccctc tgagcttgct 120
tctcttccta gcacttctga tggggtttcc tggagacatg ataagttagt ctttatttct 180
aagaacttaa gcagcgtgat aggataccat tgaccattca catcctgttt gtttggggaa 240
aggcttagcc ttatttcttc atcttatttt atagcacatg acacaaccat ttcacttcag 300
ccttgcccag cagtgaccat gtcactctct tgttgtcatt gtcacttacc tctatttgtg 360
attacagtga atgatgaggt ggaggggtga agagggaaac agggagtaca gagaggttcc 420
agggatttga agaattaccc aaggttcaaa ggcaagctgg cctctaaggt agcctctgga 480
agctgcagat ccctggagac agtggggctg caggggaaac cttctgccct aagctgttga 540
gccaagaagg ggccagaggc cagcctggag ccgaggcctc tgcagtgcta gaatcaagcc 600
agcaattggg cagaccagcc ctgcagggga cagctccaga gacttgatct tgtgcccaca 660
ttacttcctc agagctccat ccaaatcgcc tttgaagaga taccccaact cccaccaaga 720
gccagcatca gtcatgtgac ctgcgttgac caatcagagc gcaccatggt aagggtctgg 780
tgggcactac aagatggggc agaccccaag gttcccttta gtatgagggg tcttaatttg 840
gagtttctgt gtgtcttaag gacctaagga tttgtttcag gaggtctgag aacctcactg 900
acgtgatagg caaagtaagt gtgtgtgtat gtgggggtct gtttctaggg agagaagagt 960
ttttgtcttt gttttgagac aggattttac tgtgtaggtc tgcctgtcct ggaactcact 1020
ctgtagacca ggaaatctgc ctgcctctgc ctccagagta ctgggattaa aggcgtgcgc 1080
caccaccacc tggctgagat ttttgctttt gtctaattca ttgagaagct tagggccccc 1140
aaaaggacat catcccaagg atgatagaag tggggaaggg cagagccagg tgggtgtcct 1200
ccgcagtgcc tgacactgtt ccctgtttca ggtgctgcat tgccagctct ctgctgagga 1260
ggtgcgcttc cccatctctg tgacccagca gtcccccgct gccgtctcca tggagaccta 1320
ccacgtcact ctgacactgc caccaacaca ggtggaggga aatgggggaa actgagttgg 1380
gcagagggca gttgagttgg cccagcattt tctccctgct tcctctctac cgttggattc 1440
gggaaggaag ggtccgagta gttagcaggg tggggggatg gggtcctgaa gaatggggta 1500
gatcacagta atccttccgt tcttgtctct agttggaagt cagcctggag gaaatccctg 1560
atgaggggct cctggtgtcc tgggccttca ctgaccgccc agaactcagc ctaaaggtgc 1620
ttcccaagtt gcagactagg gaggtaagaa gggggcagca gaggagagac tgaactggcg 1680
caatggagca gggcggaggc tccacctctt ctcctctctg cagagagatg aggaacaacc 1740
agagctctca acagttgagg aactgatcaa ggacgctata gtcagcactc agcccgccat 1800
gatggtcaac ctcagggcct gctctgcccc aggaggcctg gtgagtggac acccaaaggg 1860
aaggtttgcg tgtatcccac ctccaggtta ctatatcggg attatttctc tttttactcc 1920
cttttgctct taggtaccca gtgagaagcc acccacgatg tcccaggccc agccatccat 1980
ccccagacct acccgattat tcttacggca gcttcgagca tctcacctgg gaagtgagct 2040
aggaggtgag aattccgctg cccaggacat agcttctcta ttccgcggac ttggtttctt 2100
ccgtctgagc atcctctaag ctctgcttcc tgacaggtac tgaggaactg tgctgtgccg 2160
ctgagcttga caaccccatg caacaaaagt ggaccaaacc catgagggcg ggccccgagg 2220
tggaatggac cgaggaccta gctctgtaag tcacactctg ctcctcccct ctgtccccat 2280
gggcagtcag gatgaagaaa cttttccagg ctagccctgg catgaggaag ccagccttgt 2340
tttcagtagc ctgtagtgtg gacctccact gtatgccagg ccctggggac acagactagg 2400
agtagataca gccctacctc tgggtggatc acagacccga agcagagaca catagggaag 2460
aaaggacaaa gttgccagtt gagattggtg cacagcatgc cgtggaggcg cttcagtagg 2520
ggagatgacg aattctcaaa acggactaaa gaactgatga aatgtcatgg aagaagtcta 2580
tttaaaccac gccttcaaat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atacatgtgc 2640
aagggtagca ccgcaacaga atgtgaaagt cttcttga 2678
<210> 4
<211> 2121
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggatccgg actgggggca gcgggatgtg ggctgggcgg ccctgctggt tctcttcgcc 60
gcctcgctga tcacggtatt gggctggatg ctgcagtatg cccggggttt gtggctgtcg 120
cgagccgatg ggggccgaga ctcccgacct gcctcagctg ctgagcccgg gggttcactg 180
cgcgagctgg gtgtgtggcg ttcgctgctg cgtttgcggg cgacccggac cagcaccccc 240
gaggaagccg gcgtacgggg cctcctggct tcgctctttg ccttcaagtc tttccgggag 300
aactggcaac gggcttgggt gcgagccttg aatgagcagg cctgcaggga cgggagctcc 360
atccaaatcg cctttgaaga gataccccaa ctcccaccaa gagccagcat cagtcatgtg 420
acctgcgttg accaatcaga gcgcaccatg gtgctgcatt gccagctctc tgctgaggag 480
gtgcgcttcc ccatctctgt gacccagcag tcccccgctg ccgtctccat ggagacctac 540
cacgtcactc tgacactgcc accaacacag ttggaagtca gcctggagga aatccctgat 600
gaggggctcc tggtgtcctg ggccttcact gaccgcccag aactcagcct aaaggtgctt 660
cccaagttgc agactaggga gagagatgag gaacaaccag agctctcaac agttgaggaa 720
ctgatcaagg acgctatagt cagcactcag cccgccatga tggtcaacct cagggcctgc 780
tctgccccag gaggcctggt acccagtgag aagccaccca cgatgtccca ggcccagcca 840
tccatcccca gacctacccg attattctta cggcagcttc gagcatctca cctgggaagt 900
gagctaggag gtactgagga actgtgctgt gccgctgagc ttgacaaccc catgcaacaa 960
aagtggacca aacccatgag ggcgggcccc gaggtggaat ggaccgagga cctagctctg 1020
gatctgggtc cccagagccg ggagctgacc ctcaaagtgc tccggagcag cagctgtgga 1080
gatgctgaac tccttggcca agccacactg cctgtgggct caccctctag accgatgtca 1140
cgaagacagg tgtgcccact gactccaggg cccgggaaat ccctgagccc ggcagccacc 1200
gtgacagcgg agctacatta tgagcagggt tcccctcgga atctgggcac gcccacctcc 1260
tccacccctc gccccagcat cacacccacc aagaagattg agttggaccg gaccatcatg 1320
cccgacggca cagtcgtcac cactgtcact accgtccagt cccgcccccg tgtagatggc 1380
aaactagact ccccctcccg ctccccgtcc aaggtggagg tgactgagaa gatgacaacc 1440
gtgctgagtg agagcagcgg ccccagcaat gcctcccaca gcagcagccg ggagagccac 1500
ctttccaatg gcttggatcc agtagcagag acagccattc gccagctgac tgagcccagt 1560
gggcgggcag ccaagaagac acccaccaag aggagcacgc tcatcatctc tggtgtttcc 1620
aaggtgccca tcgcccagga cgagttggct ctctccttgg gttacgcggc atctctggaa 1680
gcctcgatgc aagatgatgc aggaaccagt ggtggtcctt cgtcacctcc ctcagacccc 1740
tcagccacat ccccaggacc tgttgatgcc ctctccagtc ccacaagtgt ccaggaggca 1800
gatgagacaa cacgttcaga catctctgag aggccgtctg tggatgatgt tgagtcagaa 1860
acagggtcca ctggtgccct ggagaccaga agcctcaagg atcacaaagt gagtttcctg 1920
cgcagtggca caaagctcat cttccgccgg aggccccgac agaaggaagc tggtctgagc 1980
cagtcacacg atgacctgtc caacacgacg gccacaccta gcgtccggaa gaaggctggc 2040
agcttttccc gtcgccttat caagcgtttt tccttcaaat ccaaacccaa ggccaatggc 2100
aaccctagcc cccagctctg a 2121
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
catccatccc cagacctacc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctaggtcctc ggtccattcc 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttgggtgcga gccttgaatg a 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtggattcgg accagtctga 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
acgtaaacgg ccacaagttc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cagtcacctc caccttggac 20
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gttgccagtt gagattggtg cacag 25
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gctgccttcc gtcctgtttt agt 23
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tcagtgcctg gagttgcgct gtgg 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cttaaaggcc agggcctgct tggc 24
Claims (10)
1.一种RP疾病模型的构建方法,其特征在于,其包括:敲除目标动物视网膜视杆细胞基因组中的C2cd2l基因。
2.根据权利要求1所述的RP疾病模型的构建方法,其特征在于,敲除C2cd2l基因是指敲除C2cd2l基因的外显子序列。
3.根据权利要求2所述的RP疾病模型的构建方法,其特征在于,所述目标动物为哺乳动物。
4.根据权利要求3项所述的构建方法,其特征在于,所述哺乳动物选自小鼠、大鼠、兔、牛、狗、猪、马、羊、猴以及猿中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的RP疾病模型的构建方法,其特征在于,所述目标动物为小鼠;
敲除C2cd2l基因的外显子序列是指敲除C2cd2l基因上第1到第14号外显子中的任意一个或多个外显子序列。
6.根据权利要求5所述的RP疾病模型的构建方法,其特征在于,敲除C2cd2l基因的外显子序列是指敲除C2cd2l基因上的第2-7号外显子序列。
7.由权利要求1-6中任一项所述的RP疾病模型的构建方法所得到的RP疾病模型在RP疾病研究中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述研究是以非疾病的治疗为目的。
9.由权利要求1-6中任一项所述的RP疾病模型的构建方法所得到的RP疾病模型在筛选用于预防或治疗RP疾病药物中的应用。
10.RP疾病模型的培育方法,其特征在于,其包括:将由权利要求1-6中任一项所述的构建方法所得到的RP疾病模型相互交配。
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CN113621649A (zh) * | 2021-09-14 | 2021-11-09 | 商丘市第一人民医院 | 一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法及其应用 |
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