ES2257902B1 - Modelo de animal transgenico para el desarrollo de nuevas aproximaciones terapeuticas. - Google Patents
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Abstract
Modelo de animal transgénico para el desarrollo de nuevas aproximaciones terapéuticas. Dicho animal transgénico no humano contiene una mutación dirigida en el gen que codifica para la 6-fosfofructo-1-quinasa muscular. El procedimiento para producir el animal transgénico no humano comprende las etapas de: i) crear una construcción de recombinación; ii) transfectar dicha construcción de recombinación en células pluripotenciales; iii) seleccionar las células transfectadas de la etapa (ii) que expresan dicho(s) marcador(es); iv) introducir dicha célula transfectada en un embrión en estadio de blastocito; v) transferencia de los blastocitos manipulados a hembras receptoras para obtener ratones quimera; vi) cruce de los animales quimera con animales control para producir un animal heterocigoto para la mutación; y vii) cruce de los animales heterocigotos obtenidos en (vi) para obtener animales homocigotos para la mutación en el gen que codifica para la PFK1 muscular. Dicho modelo de animal transgénico se puede utilizar en el desarrollo de nuevas aproximaciones terapéuticas para el tratamiento de enfermedades como la glucogenosis, la diabetes tipo II y el Alzheimer.
Description
Modelo de animal transgénico para el desarrollo
de nuevas aproximaciones terapéuticas.
La presente invención está relacionada con las
enfermedades asociadas a la
6-fosfofructo-1-quinasa
muscular y a la glucogenosis muscular en particular.
La presente invención se refiere a un modelo de
animal transgénico que permite el desarrollo de nuevas
aproximaciones terapéuticas tanto de la glucogenosis como de otras
enfermedades en las que se ve involucrada la PFK1 muscular.
La
6-fosfofructo-1-quinasa
(PFK1, E.C. 2.7.1.11) es una enzima tetramérica derivada de tres
loci genéticos que codifican para las subunidades muscular
(M), hepática (L) y plaquetas (P). La expresión de estos tres genes
es variable dependiendo del tejido. En el músculo se expresa el
tetrámero M4, en hígado y riñón se expresa el tetrámero L4 y en los
eritrocitos se expresa tanto el tetrámero M4 como el L4 y las tres
formas híbridas.
Las enfermedades de almacenamiento de glucógeno,
también denominadas glucogenosis, son enfermedades metabólicas
debidas a deficiencias enzimáticas específicas que llevan a una
alteración en la homeostasis normal del glucógeno. Dependiendo de la
alteración molecular, las glucogenosis se clasifican en diferentes
tipos, que van desde el tipo I hasta el tipo VIII. La glucogenosis
tipo VII, también conocida como enfermedad de Tarui, se presenta en
forma autosómica recesiva asociada a una deficiencia en la actividad
de la enzima PFK-1 muscular. A pesar de que la
incidencia de esta enfermedad en la población es muy baja, con unos
40-50 casos documentados, la incidencia real podría
ser superior, ya que su variante más leve es difícil de conocer. El
diagnóstico se realiza determinando la carencia de actividad
PFK-1 en biopsias musculares.
La enfermedad se presenta con diferentes grados
de severidad en su sintomatología. La mayoría de pacientes sufren
fatiga muscular y calambres, vómitos y mioblobinuria al practicar
ejercicio físico, de manera que se considera que son "intolerantes
al ejercicio". Algunos pacientes también pueden sufrir otras
alteraciones como: ictericia, gota o artritis. De las diferentes
formas en las que se presenta la enfermedad, la infantil, que
aparece durante el primer año de vida, es la más severa. Los niños
desarrollan ceguera e importantes deficiencias respiratorias,
cardíacas y problemas psicomotrices que llevan a la muerte del
paciente antes de los cuatro años. Otros pacientes, desarrollan una
forma de aparición tardía que se presenta con una debilidad muscular
progresiva.
Los tejidos deficientes en la actividad
PFK-1 no pueden metabolizar, por vía glucolítica, la
glucosa procedente de la dieta o la
glucosa-6-P derivada de la
degradación de glucógeno. Como consecuencia, el músculo se ve
imposibilitado de obtener suficiente ATP para mantener la capacidad
contráctil. A la vez, se produce una acumulación de
glucosa-6-fosfato,
fructosa-6-fosfato y
glucosa-1-fosfato. Este incremento
de hexosas monofosfato lleva a la activación de la glucógeno sintasa
que produce un aumento en la síntesis de glucógeno.
De esta manera, cuando se agota el ATP por la
actividad muscular se produce una degradación acelerada de
nucleótidos de adenina. Además, el incremento en hexosas monofosfato
también lleva a un aumento en la producción de nucleótidos. Estos
dos fenómenos provocan un aumento de las concentraciones sanguíneas
de amonio, inosina e hipoxantina que, al ser metabolizadas en el
hígado, producirán ácido úrico. El incremento en sangre de ácido
úrico es el responsable de la aparición de la gota y de la artritis.
Por otro lado, el bloqueo de la via glucolítica en los eritrocitos
produce una disminución de los niveles de
2,3-difosfoglicerato. Este descenso hace aumentar la
afinidad de la hemoglobina por el oxígeno, dando lugar a un aumento
en la producción de eritrocitos. Esta producción compensa la
hemólisis de manera que no se presenta anemia en los pacientes.
Como modelo animal, se ha utilizado,
principalmente, una raza de perros (English springer spaniel) la
cual desarrolla, de manera natural, una deficiencia parcial en la
actividad de la PFK1 y presentan anemia hemolítica como consecuencia
de dicha deficiencia en los hematíes y una leve patología muscular
(Vora S et al., Proc Natl Acad Sci U S A. Dec;
82(23):8109-13 1985; Skibild E et al.,
J Small Anim Pract. Jun; 42(6):298-300
2001).
También se ha propuesto como modelo de la
enfermedad de Tarui (también conocida como glucogenosis tipo VII) en
humanos la inhibición de la
gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa mediante una inyección intraaórtica con yodoacetato a
una rata (Brumback, Roger A., Journal of the Neurological Sciences,
48(3), 383-98, 1980).
En los últimos años, además, se han realizado
diversas investigaciones que evidencian una relación entre los
niveles de expresión/actividad de la
6-fosfofructo-1-quinasa
y enfermedades como la diabetes tipo II y el Alzheimer (Ristow M
et al., Deficiency of
phosphofructo-1-kinase/muscle
subtype in humans impairs insulin secretion and causes insulin
resistance. J Clin Invest. Dec
1;100(11):2833-41. 1997; T. A. Lakka, et
al., A Quantitative Trait Locus on 7q31 for the Changes in
Plasma Insulin in Response to Exercise Training: The HERITAGE Family
Study Diabetes, June 1, 2003; 52(6): 1583 - 1587; Bigl M,
et al., Changes of activity and isozyme pattern of
phosphofructokinase in the brains of patients with Alzheimer's
disease, J Neurochem. 1996 Sep;67(3):1164-71;
Bigl M, Eschrich K. Interaction of rat brain phosphofructokinase
with Alzheimer's beta A4-amyloid. Neurochem Int.
1995 Jan;26(1):69-75; Sims NR, et
al., Phosphofructokinase activity in the brain in Alzheimer's
disease, Ann Neurol. 1987
May;21(5):509-10).
Sin embargo, el hecho de que la glucogenosis de
tipo VII sea una de las menos frecuentes junto con la ausencia de un
modelo animal transgénico con una patología muscular por deficiencia
de la PFK-1 muscular, no ha permitido un estudio
sistemático de la fisiopatología de esta enfermedad, ni la
evaluación de las adaptaciones del músculo deficiente en
PFK-1 ante una situación en la que se encuentra
bloqueada la principal fuente de energía en condiciones anaerobias
ni el estudio de la relación entre los niveles de expresión o
actividad de la PFK-1 con otras enfermedades como
son el Alzheimer y la diabetes tipo II.
En un primer aspecto, la presente invención se
refiere a un animal transgénico no humano que se caracteriza por el
hecho de que dicho animal contiene una mutación dirigida en el gen
que codifica para la
6-fosfofructo-1-quinasa
muscular.
En un segundo aspecto, la presente invención se
refiere a una célula aislada o línea celular que se caracteriza por
el hecho de que dicha célula o línea celular contiene una mutación
dirigida en el gen que codifica para la
6-fosfofructo-1-quinasa
muscular.
En un tercer aspecto, la presente invención se
refiere a una construcción de recombinación caracterizada por el
hecho de que comprende:
- i)
- dos regiones homólogas al gen codificante de la 6-fosfofructo-1-quinasa muscular; y
- ii)
- uno o más genes, diferentes entre sí, que permiten la selección de eventos de recombinación homóloga.
En un cuarto aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento para producir un animal transgénico no
humano con una mutación dirigida en el gen que codifica para la
6-fosfofructo-1-quinasa
muscular de acuerdo con el primer aspecto de la invención, que
comprende las etapas de:
- (a)
- crear una construcción de recombinación, de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención,
- (b)
- transfectar dicha construcción de recombinación en células pluripotenciales,
- (c)
- seleccionar las células transfectadas de la etapa (b) que expresan dicho(s) marcador(es),
- (d)
- introducir dicha célula transfectada en un embrión en estadio de blastocito,
- (e)
- transferencia de los blastocitos manipulados a hembras receptoras para obtener ratones quimera,
- (f)
- cruce de de los animales quimera con animales control para producir a un animal heterocigoto para la mutación,
- (g)
- cruce de los animales heterozigotos obtenidos en (f) para obtener animales homocigotos para la mutación en el gen que codifica para la PFK1 muscular.
En un quinto aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento para evaluar la efectividad de un agente
frente a la glucogenosis muscular que comprende:
- (i)
- administrar un agente a evaluar en un animal de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención;
- (ii)
- determinar si el agente es efectivo en la mejora de la glucogenosis muscular.
En un sexto aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento para evaluar la efectividad de un agente
frente a la diabetes tipo II que comprende:
- (i)
- administrar un agente a evaluar en un animal de acuerdo el primer aspecto de la invención;
- (ii)
- determinar si el agente es efectivo para el tratamiento de la diabetes tipo II.
En un séptimo aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento para evaluar la efectividad de un agente
frente a Alzheimer que comprende:
- (i)
- administrar un agente a evaluar en un animal de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención;
- (ii)
- determinar si el agente es efectivo en la mejora del Alzheimer.
En un octavo aspecto, la presente invención se
refiere a la utilización de un animal transgénico no humano, de
acuerdo con el primer aspecto de la invención, para el desarrollo de
aproximaciones terapéuticas en el tratamiento de la glucogenosis
muscular.
En un noveno aspecto, la presente invención se
refiere a la utilización de un animal transgénico no humano, de
acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, para el
desarrollo de aproximaciones terapéuticas en el tratamiento de la
diabetes tipo II.
En un décimo aspecto, la presente invención se
refiere a la utilización de un animal transgénico no humano, de
acuerdo con el primer aspecto de la invención, para el desarrollo de
aproximaciones terapéuticas en el tratamiento del Alzheimer.
Figura 1: corresponde a un esquema de obtención
del vector de recombinación descrito en el Ejemplo de más abajo. En
dicho esquema se indican las dianas de restricción más relevantes
tanto del clon \lambdaPFKM14 como de los plásmidos utilizados en
las diferentes etapas de la construcción del vector de
recombinación.
Figura 2: mapa parcial del gen de la
PFK-1M (tipo salvaje), del vector de recombinación
pPNT/PFK-1MKO linealizado y del alelo recombinante
(KO) resultado de la recombinación homóloga. Las sondas utilizadas
se indican como los fragmentos 1-Xho y I-Hind-III (5’)
y 2-Pst y I-SalI (3’). Los cebadores
utilizados para la PCR fueron a) PFK-Fw i b)
PFK-Rev c) TS-Neo.
Figura 3: A) Análisis por Northern Blot de RNA
total de músculo esquéletico de los ratones. B) Actividad
PFK-1M en extractos musculares de los ratones. La actividad se representa como tanto por ciento respecto al valor de los animales control. La barrera de color blanco, representa el control; la barra de color gris representa la actividad en heterocigotos y la barra de color negro representa la actividad en homocigotos.
PFK-1M en extractos musculares de los ratones. La actividad se representa como tanto por ciento respecto al valor de los animales control. La barrera de color blanco, representa el control; la barra de color gris representa la actividad en heterocigotos y la barra de color negro representa la actividad en homocigotos.
En un primer aspecto, la presente invención se
refiere a un animal transgénico no humano que se caracteriza por el
hecho de que dicho animal contiene una mutación dirigida en el gen
que codifica para la
6-fosfofructo-1-quinasa
muscular.
La isoforma muscular de la
6-fosfofructo-1-quinasa
(PFK-1 M) está codificada por un gen de
aproximadamente 35 Kb localizado en el cromosoma 15 murino o en el
12 humano. La secuencia de dicho gen se puede consultar en cualquier
base de datos asequible para cualquier experto en la materia, como
la Locus (I.D. 18642). Brevemente, el gen codificante de la
PFK1-M está constituido por 22 exones que dan lugar
a un RNA mensajero de 2781 pares de bases. La región 5’ del gen
presenta un putativo sistema de doble promotor similar al descrito
en el gen humano: uno distal situado entre -4800 y -3600 pb, que se
expresaría de manera constitutiva, y otro proximal, entre -335 y
+99, que presenta motivos CAAT, TATA y M-CAT, que
contribuirían a la expresión específica muscular. Este sistema da
lugar a un mensajero que presenta "splicing" alternativo
para generar tres transcritos diferentes. La expresión diferencial
de estos transcritos se ha relacionado con los procesos de
diferenciación muscular.
En la presente invención, por "mutación
dirigida" se entiende una modificación en la secuencia del gen
codificante de la PFK1 muscular, consistiendo, dicha modificación,
en una inserción, deleción o sustitución de un nucleótido o una
región de dicho gen y llevándose a cabo dicha modificación mediante
la utilización de técnicas y protocolos bien conocidos para un
experto en la materia, que incluyen pero no se limitan a,
"knock-out" y "knock-in",
entre otros.
En una realización preferida, el animal
transgénico no humano del primer aspecto de la invención se
caracteriza por el hecho de que dicha mutación dirigida da lugar a
una reducción o supresión de la expresión del gen que codifica para
la
6-fosfofructo-1-quinasa
muscular.
En la presente invención por "reducción o
supresión de la expresión del gen de la
6-fosfofructo-1-quinasa
muscular" se entiende la pérdida, total o parcial, de la
expresión del gen que codifica para la PFK1-M como
consecuencia de la mutación dirigida generada en dicho gen,
produciéndose la PFK1-M en unos niveles de
concentración bajos o nulos respecto a un animal que no comprenda
disrupciones en la secuencia de dicho gen.
En otra realización preferida, el animal
transgénico no humano del primer aspecto de la invención se
caracteriza por el hecho de que dicha mutación dirigida da lugar a
una reducción o supresión de la actividad de la enzima
6-fosfofructo-1-quinasa
muscular.
En la presente invención por "reducción o
supresión de la actividad de la PFK1 muscular" se entiende la
pérdida, total o parcial, de actividad de la PFK1-M
codificada por el gen que comprende una mutación.
Ventajosamente, el animal transgénico no humano
de la presente invención se caracteriza por el hecho de que dicha
mutación es homocigótica, consistiendo, preferiblemente, dicha
mutación en la eliminación de los inicios de trascripción y
traducción, así como del primer exón del gen codificante de la
PFK1-M.
Dicha mutación homocigótica da lugar a una
supresión de la expresión del gen que codifica para la
6-fosfofructo-1-quinasa
muscular.
En una realización de la invención, el animal
transgénico no humano se caracteriza por el hecho de que dicha
mutación dirigida es heterocigótica.
Dicha mutación heterocigótica da lugar a una
reducción de la expresión del gen que codifica para la
6-fosfofructo-1-quinasa
muscular.
En otra realización de la invención, el animal
transgénico no humano se caracteriza por el hecho de que dicho
animal presenta un fenotipo de glucogenosis muscular,
preferiblemente de glucogenosis muscular tipo VII.
En todavía otra realización de la invención, el
animal transgénico no humano se caracteriza por el hecho de que
dicho animal presenta un fenotipo de diabetes tipo II.
En todavía aún otra realización preferida del
primer aspecto de la invención, dicho animal transgénico no humano
es un mamífero, preferiblemente un ratón.
El animal transgénico del primer aspecto de la
invención permite continuar con los estudios moleculares
relacionados con las alteraciones que se producen no únicamente en
el músculo esquelético sinó que también en otros tejidos (corazón,
cerebro, bazo, sangre, pancreas) que se pueden ver afectados por la
expresión del gen de la PFK1-M.
Los inventores de la presente invención han
diseñado un animal transgénico no humano que permitirá conocer mejor
la patología de los pacientes que sufren de enfermedades
relacionadas con la expresión y/o actividad de la
PFK1-M, no únicamente referidas a las glucogenosis musculares y, además, permitirá el estudio de la relación existente entre la PFK1-M y la diabetes tipo II o el Alzheimer.
PFK1-M, no únicamente referidas a las glucogenosis musculares y, además, permitirá el estudio de la relación existente entre la PFK1-M y la diabetes tipo II o el Alzheimer.
Otro aspecto ventajoso del animal transgénico de
la presente invención respecto a los animales modelo utilizados
hasta la fecha (de la raza English springer spaniel), a parte del
precio, es que se pueden controlar los diferentes factores que
pueden afectar a la expresión y/o actividad de la enzima
PFK1-M, mediante una modificación particular
(mutación dirigida) de la secuencia del gen que codifica para dicha
enzima. Los modelos animales (perros de la raza English springer
spaniel) utilizados hasta la fecha, para el estudio de la
glucogenosis asociada con la
PFK1-M, desarrollan dicha patología como consecuencia de una mutación natural (es decir, no provocada "in vitro") en el gen que codifica para la PFK1-M, con el inconveniente de que este modelo puede presentar otras alteraciones no controladas y/o identificadas, las cuales pueden dificultar o interferir en el estudio de enfermedades asociadas con los niveles de la PFK1-M.
PFK1-M, desarrollan dicha patología como consecuencia de una mutación natural (es decir, no provocada "in vitro") en el gen que codifica para la PFK1-M, con el inconveniente de que este modelo puede presentar otras alteraciones no controladas y/o identificadas, las cuales pueden dificultar o interferir en el estudio de enfermedades asociadas con los niveles de la PFK1-M.
En un segundo aspecto, la presente invención se
refiere a una célula aislada o línea celular que se caracteriza por
el hecho de que dicha célula o línea celular contiene una mutación
dirigida en el gen de la PFK1 muscular.
Preferiblemente, dicha célula aislada o línea
celular es una célula pluripotencial o una célula pluripotencial
embrionaria.
En una realización del segundo aspecto de la
presente invención, dicha célula aislada o línea celular se
caracteriza por el hecho de que dicha mutación consiste en la
eliminación de los inicios de transcripción y traducción, así como
el primer exón del gen.
En otra realización del segundo aspecto de la
presente invención, dicha célula aislada o línea celular se
caracteriza por el hecho de que dicha mutación da lugar a una
reducción o supresión de la actividad de la enzima PFK1 mus-
cular.
cular.
Preferiblemente, la célula aislada o línea
celular, del segundo aspecto de la invención se caracteriza por el
hecho de que procede de un animal transgénico no humano de acuerdo
con el primer aspecto de la invención.
En un tercer aspecto, la presente invención se
refiere a una construcción de recombinación que se caracteriza por
el hecho de que comprende:
- i)
- dos regiones homólogas al gen codificante de la PFK1 muscular; y
- ii)
- uno o más genes, diferentes entre sí, que permiten la selección de eventos de recombinación homóloga.
En la presente invención, por "regiones
homólogas al gen codificante de la PFK1 muscular" se entiende
fragmentos de ADN que presentan una homología de por lo menos el 90%
respecto a la secuencia del gen que codifica para la
PFK1-M (Locus I.D. 18642, MGI:97548).
Se debe de tener en cuenta que cuanta mayor
homología presenten las regiones (i), tendrá lugar una mayor
frecuencia de recombinación de homóloga.
En una realización del tercer aspecto, la
presente invención se refiere a una construcción de recombinación
que se caracteriza por el hecho de que dichos genes de selección
(ii) se seleccionan entre: timidina quinasa, neomicina, zeocina y
higromicina.
En otra realización del tercer aspecto, la
presente invención se refiere a una construcción de recombinación,
que se caracteriza por el hecho de que se localiza un gen de
selección entre las dos regiones homólogas (i), y un segundo gen de
selección localizado en el extremo de una de las regiones de
homología.
En la presente invención, por "en el extremo
de una de las regiones homólogas" se entiende la región de la
secuencia de DNA homóloga opuesta al lugar donde esta se une al
primer gen de selección.
En aún otra realización del tercer aspecto, la
presente invención se refiere a una construcción de recombinación
que se caracteriza por el hecho de que las dos regiones (i) tienen
una homología del 100% respecto al gen codificante de la PFK1
muscular y los genes de selección (ii) son neomicina y timidina
quinasa.
En un cuarto aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento para producir un animal transgénico no
humano con una mutación dirigida en el gen de la PFK1 muscular de
acuerdo con el primer aspecto de la invención que comprende las
etapas de:
- (a)
- crear una construcción de recombinación, de acuerdo con el tercer aspecto de la invención,
- (b)
- transfectar dicha construcción de recombinación en células pluripotenciales,
- (c)
- seleccionar las células transfectadas de la etapa (b) que expresan dicho(s) marcador(es),
- (d)
- introducir dicha célula transfectada en un embrión en estadio de blastocito,
- (e)
- transferencia de los blastocitos manipulados a hembras receptoras para obtener ratones quimera,
- (f)
- cruce de los animales quimera con animales control para producir a un animal heterocigoto para la mutación,
- (g)
- cruce de los animales heterocigotos obtenidos en (f) para obtener animales homocigotos para la mutación en el gen que codifica para la PFK1 muscular.
Preferiblemente, en la etapa (b) se lleva a cabo
la transfección mediante electroporación.
Las técnicas que se pueden utilizar para cada
una de las etapas (a) a (g) son las utilizadas de manera rutinaria
por los expertos en la materia.
En un quinto aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento para evaluar la efectividad de un agente
frente a la glucogenosis muscular que comprende:
- (i)
- administrar un agente a evaluar en un animal de acuerdo con el primer aspecto de la invención;
- (ii)
- determinar si el agente es efectivo en la mejora de la glucogenosis muscular.
En una realización del quinto aspecto de la
invención, dicho procedimiento determina la efectividad de un agente
contra la glucogenosis tipo VII.
En un sexto aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento para evaluar la efectividad de un agente
frente a la diabetes tipo II que comprende:
- (i)
- administrar un agente a evaluar en un animal de acuerdo con el primer aspecto de la invención;
- (ii)
- determinar si el agente es efectivo para el tratamiento de la diabetes tipo II.
En un séptimo aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento para evaluar la efectividad de un agente
frente a Alzheimer que comprende:
- (i)
- administrar un agente a evaluar en un animal con el primer aspecto de la invención;
- (ii)
- determinar si el agente es efectivo en la mejora del Alzheimer.
En la presente invención, por "agente" se
entiende una compuesto químico de origen natural o sintético, con
una actividad terapéutica génica o una actividad terapéutica
farmacológica. Los conceptos de terapia génica así como el de
terapia farmacológica son bien conocidos para un experto en la
materia.
En la presente invención, por "es efectivo en
la mejora" se entiende que al administrar el agente remiten,
total o parcialmente, los síntomas asociados con una determinada
patología.
En un octavo aspecto, la presente invención se
refiere a la utilización de un animal transgénico no humano, según
el primer aspecto de la invención, en el desarrollo de
aproximaciones terapéuticas para el tratamiento de la glucogenosis
muscular, preferiblemente de la glucogenosis muscular tipo VII.
En un noveno aspecto, la presente invención se
refiere a la utilización de un animal transgénico no humano, según
el primer aspecto de la invención, en el desarrollo de
aproximaciones terapéuticas para el tratamiento de la diabetes tipo
II.
En un décimo aspecto, la presente invención se
refiere a la utilización de un animal transgénico no humano, según
el primer aspecto de la invención, en el desarrollo de
aproximaciones terapéuticas para el tratamiento del Alzheimer.
A modo ilustrativo y no limitativo, se incluyen
los siguientes ejemplos de realización de la presente invención.
Dado que el vector de recombinación tenía que
incluir dos regiones de homología, necesitábamos obtener clones
genómicos de la PFK-1M. Con esta finalidad
utilizamos una genoteca de la cepa de ratón 129Sv. Se escogió esta
genoteca debido a que las células ES más ampliamente utilizadas para
la obtención de ratones KO son de esta cepa. Así podríamos obtener
el máximo de homología entre el vector de recombinación y el gen
endógeno. Esto es importante para incrementar la frecuencia de
recombinación homóloga.
Nuestra estrategia consistía en producir una
mutación basada en la eliminación, mediante recombinación homóloga,
de los inicios de transcripción y traducción así como del primer
exon del gen de la PFK-1M para eliminar su
expresión. Con esta finalidad generamos sondas específicas del gen
de la PFK-1M que hibridarían con estas regiones.
Así, obtuvimos RNA total de músculo de ratón y se realizaron
diferentes RT-PCR utilizando como cebadores
oligonucleótidos diseñados a partir de secuencias parciales del gen
de ratón publicadas (Nakajima H et al. 1994, Biochemical J.
303:449-453). Estos oligonucleótidos fueron:
- PS3: SEC. ID Nº: 1;
- RM7: SEC. ID. Nº: 2;
- AMP: SEC. ID Nº: 3; y
- P650: SEC. ID Nº: 4.
Dichos cebadores incorporaban en sus extremos
secuencias correspondientes a dianas de encimas de restricción para
facilitar su posterior clonage. Así se obtuvieron 4 productos de PCR
de 180, 226, 668, y 714 pb que correspondían a las 4 combinaciones
de los cebadores que amplificaban la región 5’ del cDNA. Decidimos
utilizar como sonda para el cribage de la librería genómica el
fragmento de 226 pb producto de la amplificación con los cebadores
PS3 y AMP. Este fragmento fue purificado y clonado en un plásmido
utilizando las dianas de restricción introducidas en los cebadores.
Posteriormente este fragmento fue secuenciado y pudimos confirmar
que correspondía a la región 5’ no traducida más los dos primeros
exones del gen de la PFK-1M. Por lo tanto, esta
sonda nos permitiría la identificación de los clones genómicos que
contenían esta región.
A continuación se plaqueó la genoteca y se
realizó el cribage con la sonda que habíamos obtenido siguiendo
técnicas ampliamente documentadas (Sambrook J, Russell DW.
Molecular cloning: a laboratory manual. 3nd Ed. Cold
Spring Harbor Laboratory Press., NY, 2001). Se realizaron cuatro
cribages consecutivos hasta conseguir aislar tres clones que
hibridaban con la sonda. Estos clones se denominaron: \lambdaPFKM1
(16Kb), \lambdaPFKM10 (16Kb), \lambdaPFKM14 (17Kb). Para
facilitar su posterior amplificación y análisis estos fragmentos
fueron subclonados en diferentes plásmidos.
Los tres clones fueron mapeados mediante
análisis de restricción utilizando múltiples enzimas de restricción
para obtener la máxima información posible, así como para facilitar
la posterior obtención de los fragmentos que posteriormente se
utilizarán como brazos 5’ y 3’ del vector de recombinación. Los
fragmentos que podían incluir las dianas de interés fueron
subclonados en plásmidos para realizar un análisis más exhaustivo.
Paralelamente, se obtuvieron por RT-PCR sondas
específicas para diferentes exones así como para la región
promotora. Con estas sondas se realizó un análisis por Southern
blot para caracterizar mejor los clones. El mapeo de estos
clones permitió identificar en el clon \lambdaPFKM14 la región
promotora con los inicios de transcripción y traducción y el primer
exón coincidiendo con los mapas de los fragmentos publicados del gen
de ratón (Gekakis N and Sul HS, 1994, Biochemistry
33:1771-1777) (Figura 2). Para confirmar la
identidad del clon \lambdaPFKM14, se analizó mediante la tecnica
de secuenciación cíclica con 4 fluorocromos un fragmento
EcoRI-EcoRI de 198(SEC. ID Nº: 5) pb que
correspondía al primer exón del gen de la PFK-1M así
como parte del intrón posterior. Esta secuencia se correspondía con
la ya publicada, confirmando la identidad del clon (Nakajima H et
al. 1994, Biochemical J. 303:449-453).
Así, se utilizó este clon para obtener las regiones de homología
necesarias para realizar el vector de recombinación.
La construcción del vector de recombinación se
llevó a cabo utilizando técnicas estandar de biología molecular
(Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning: a laboratory
manual. 3nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press., NY, 2001)
y como base el plásmido pPNT (cedido por el Dr. Tony Pawson (Samuel
Lunefeld Research Institute, Toronto, Canadá)). Este vector
incorpora el gen de resistencia a neomicina eucariota (Neo) así como
el gen de la Timidina Quinasa (TK). Estos genes permitirían realizar
una doble selección, positiva y negativa, para los eventos de
recombinación homóloga.
La construcción del vector de recombinación se
inició a partir de los diferentes fragmentos que habíamos subclonado
del clon \lambdaPFKM14. Decidimos utilizar un fragmento
XhoI-XbaI de 3,5Kb para la obtención del brazo 5’ y
un fragmento EcoRI/Sal I de 1,4 Kb para el brazo 3’. Después
de varios pasos de subclonación en diferentes plásmidos intermedios
se obtuvo el vector de recombinación pPNT/PFK1MKO que se utilizó
posteriormente para la mutación del gen de la PFK-1M
(Figura 1). Este vector incorporaba dos regiones de homología que
permitirían dirigir la recombinación de manera que se eliminaría una
región 3’ del promotor que incluye el inicio de transcripción, así
como el primer exón con el inicio de traducción del gen de la
PFK-1M. Con esto esperábamos poder reducir o anular
la expresión del gen y la actividad de la proteína.
Una vez obtenido el vector de recombinación,
este se introdujo en células ES para realizar la recombinación
homóloga y la posterior selección, siguiendo técnicas ampliamente
descritas en la bibliografía (Joyner AL. Gene targeting : a
practical approach. 2nd Ed. Oxford University Press, Oxford,
2000). Con esta finalidad, las células ES fueron electroporadas en
presencia del vector de recombinación linearizado. Posteriormente,
se sometieron las células ES a selección positiva con G418 y
negativa con ganciclovir. La presencia de G418 en el medio permitía
seleccionar los clones que habían incorporado el gen de resistencia
a la neomicina. Los clones que habían integrado el vector de manera
no homóloga, también habían integrado el gen de la timidina quinasa,
por lo que esta catalizaría la conversión del ganciclovir hasta un
producto citotóxico que produciría la muerte de estas células. Esta
estrategia permite el enriquecimiento del cultivo en eventos de
recombinación homóloga.
A continuación se aislaron los clones que
superaron el proceso de doble selección y se amplificaron. Para
comprobar si habían incorporado la modificación en el gen de la
PFK-1M se obtuvo ADN genómico de estos clones. Este
análisis se realizó utilizando la técnica de Southern blot
con sondas específicas que nos permitían diferenciar los clones en
los que se había producido la recombinación homóloga. Dos de los
clones identificados se utilizaron para ser inyectados en
blastocitos de ratón.
La obtención de ratones quimera se realizó
mediante la técnica de microinyección de células ES en blastocito.
Esta técnica es la metodología mas utilizada y se encuentra
ampliamente descrita (Joyner AL. Gene targeting: a practical
approach. 2nd Ed. Oxford University Press, Oxford, 2000).
Para obtener embriones se cruzaron hembras de la
cepa C57Bl6 (donadoras de blastocistos compradas a Charles River
Laboratories) con machos de la misma cepa. Estas hembras fueron
sacrificadas 3,5 días después de la fecundación para obtener los
embriones en estadio de blastocisto del útero.
Después de ser amplificados, los clones
seleccionados fueron tripsinizados con el fin de obtener células
aisladas que fueron microinyectadas en el blastocele de los
embriones obtenidos (15 células ES/blastocisto aproximadamente). Los
blastocistos que superaron la inyección fueron transferidos al útero
de hembras CD1 (compradas a Charles River Laboratories)
pseudogestantes de 2,5 días (obtenidas tras haber sido cruzadas con
machos vasectomizados) para que llevaran a cabo su gestación.
A los 17 días de la transferencia, las hembras
receptoras parieron. Los embriones que habían incorporado células
modificadas dieron lugar a ratones quimera, caracterizados por
proceder tanto del embrión de la cepa C57Bl6 como de las células ES
de la cepa 129/Sv manipuladas geneticamente.
La quimeras obtenidas se cruzaron con hembras de
la cepa C57/Bl6 para identificar qué animales eran capaces de
transmitir la mutación a la descendencia. El análisis de esta
descendencia mediante la técnica de Southern blot nos
permitió identificar los animales que habían incorporado la
modificación en su genoma. Dado el carácter heterocigoto de la
mutación en estos animales, posteriormente se realizaron cruces
entre ellos para conseguir obtener los animales en homocigosis.
Estos animales fueron analizados confirmando la reducción de los
niveles de expresión y de actividad PFK-1M en los
animales heterocigotos y la supresión de los mismos en los animales
homocigotos.
<110> UNIVERSITAT AUTÒNOMA DE BARCELONA,
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> MODELO DE ANIMAL TRANSGÉNICO PARA EL
DESARROLLO DE NUEVAS APROXIMACIONES TERAPÉUTICAS
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> P-157529
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\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: SEC. ID. Nº: 1
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipgcgtcgacaa tctgcaagaa agcag
\hfill25
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<210> 2
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:SEC ID. Nº: 2
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipgcatcgatga cccatgaaga gcaccatg
\hfill28
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<210> 3
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: SEC. ID. Nº: 3
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<210> 4
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<211> 35
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Artificial: SEC. ID. Nº: 4
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<400> 4
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\hfill35
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<210> 5
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<211> 198
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<212> ADN
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: SEC. ID Nº: 5
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<400> 5
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Claims (27)
1. Construcción de recombinación
caracterizada por el hecho de que comprende como esqueleto
un plásmido pPNT y en la dirección 5' a 3':
- a)
- una diana única NotI;.
- b)
- un brazo 5' que corresponde a un fragmento genómico XhoI/XhoI de 3,5 Kb obtenido a partir del plásmido pTX5';
- c)
- un fragmento de 1,3 kb correspondiente al gen de resistencia a neomicina bajo el control del promotor de la Fosfoglicerato Quinasa I;
- d)
- un brazo 3' que corresponde a un fragmento genómico EcoRI/SalI de 1,4 kb clonado con las dianas XbaI/Asp178; y
- e)
- un fragmento de 2,8 kb correspondiente al gen de Timidina Quinasa bajo el control del promotor de la fosfoglicerato quinasa 1.
2. Animal transgénico no humano
caracterizado por el hecho de que dicho animal contiene una
construcción de recombinación según la reivindicación 1.
3. Animal transgénico no humano según la
reivindicación 2 caracterizado por el hecho de que dicha
construcción da lugar a una reducción o supresión de la expresión
del gen que codifica para la
6-fosfofructo-1-quinasa
mus-
cular.
cular.
4. Animal transgénico no humano según la
reivindicación 2 caracterizado por el hecho de que dicha
construcción da lugar a una reducción ó supresión de la actividad
de la enzima
6-fosfofructo-1-quinasa
muscular.
5. Animal transgénico no humano, según la
reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que dicha
mutación es homocigótica.
6. Animal transgénico no humano, según la
reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que dicha
mutación es heterocigótica.
7. Animal transgénico no humano, según la
reivindicación 5, caracterizado por el hecho que la mutación
consiste en la eliminación de los inicios de trascripción y
traducción, así como el primer exón del gen.
8. Animal transgénico no humano según cualquiera
de las reivindicaciones 2 a 7 caracterizado por el hecho de
que dicho animal presenta un fenotipo de glucogenosis muscular.
9. Animal transgénico no humano según cualquiera
de las reivindicaciones 2 a 8 caracterizado por el hecho de
que dicho animal presenta un fenotipo de diabetes tipo II.
10. Animal transgénico no humano según la
reivindicación 9 caracterizado por el hecho de que dicho
animal presenta un fenotipo de glucogenosis muscular tipo VII.
11. Animal transgénico no humano, según
cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, caracterizado por
el hecho de que es un mamífero.
12. Animal transgénico no humano, según la
reivindicación 11, caracterizado por el hecho de que es
un
ratón.
ratón.
13. Célula aislada o línea celular
caracterizada por el hecho de que dicha célula o línea
celular contiene una construcción de recombinación según la
reivindicación 1.
14. Célula aislada o línea celular, según la
reivindicación 13, caracterizada por el hecho de que dicha
célula es una célula pluripotencial o una célula pluripotencial
embrionaria.
15. Célula aislada o línea celular, según las
reivindicaciones 13 a 14, caracterizada por el hecho de que
dicha construcción de recombinación da lugar a una mutación
consiste en la eliminación de los inicios de transcripción y
traducción, así como el primer exón del gen.
16. Célula aislada o línea celular según
cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 caracterizada por
el hecho de que dicha mutación da lugar a una reducción ó supresión
de la actividad de la enzima
6-fosfofructo-1-quinasa
muscular.
17. Célula aislada o línea celular, según las
reivindicaciones 13 a 16, caracterizada por el hecho de que
dicha célula aislada o línea celular procede de un animal
transgénico no humano según cualquiera de las reivindicaciones 2 a
12.
18. Procedimiento para producir un animal
transgénico no humano con una mutación dirigida en el gen de la
6-fosfofructo-1-quinasa
muscular según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, que
comprende las etapas de:
- (i)
- crear una construcción de recombinación, según la reivindicación 1,
- (ii)
- transfectar dicha construcción de recombinación en células pluripotenciales,
- (iii)
- seleccionar las células transfectadas de la etapa (ii) que expresan dicho(s) marcador(es),
- (iv)
- introducir dicha célula transfectada en un embrión en estadio de blastocito,
- (v)
- transferencia de los blastocitos manipulados a hembras receptoras para obtener ratones quimera,
- (vi)
- cruce de los animales quimera con animales control para producir un animal heterocigoto para la mutación,
- (vii)
- cruce de los animales heterocigotos obtenidos en (vi) para obtener animales homocigotos para la mutación en el gen que codifica para la PFK1 muscular.
19. Procedimiento para producir un animal
transgénico no humano según la reivindicación 18,
caracterizado por el hecho de que en la etapa (ii) se lleva
a cabo la transfección mediante electroporación.
20. Procedimiento para evaluar la efectividad de
un agente frente a la glucogenosis muscular que comprende:
- (i)
- administrar un agente a evaluar a un animal según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12;
- (ii)
- determinar si el agente es efectivo en la mejora de la glucogenosis muscular.
21. Procedimiento para evaluar la efectividad de
un agente frente a la diabetes tipo II que comprende:
- (i)
- administrar un agente a evaluar a un animal según la reivindicación 1;
- (ii)
- determinar si el agente es efectivo para el tratamiento de la diabetes tipo II.
22. Procedimiento para evaluar la efectividad de
un agente frente a Alzheimer que comprende:
- (i)
- administrar un agente a evaluar a un animal según la reivindicación 1;
- (ii)
- determinar si el agente es efectivo en la mejora del Alzheimer.
23. Procedimiento según la reivindicación 20
caracterizado por el hecho de que se evalúa la efectividad
de dicho agente para la glucogenosis muscular tipo VII.
24. Utilización de un animal transgénico no
humano según la reivindicación 1 en el desarrollo de aproximaciones
terapéuticas para el tratamiento de la glucogenosis muscular.
25. Utilización de un animal transgénico no
humano según la reivindicación 1 en el desarrollo de aproximaciones
terapéuticas para el tratamiento de la diabetes tipo II.
26. Utilización de un animal transgénico no
humano según la reivindicación 1 en el desarrollo de aproximaciones
terapéuticas para el tratamiento del Alzheimer.
27. Utilización de un animal transgénico no
humano según la reivindicación 24 para el desarrollo de
aproximaciones terapéuticas en el tratamiento de la glucogenosis
tipo VII.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| ES200302044A ES2257902B1 (es) | 2003-08-29 | 2003-08-29 | Modelo de animal transgenico para el desarrollo de nuevas aproximaciones terapeuticas. |
| PCT/ES2004/000385 WO2005020680A1 (es) | 2003-08-29 | 2004-08-26 | Modelo de animal transgénico para el desarrollo de nuevas aproximaciones terapéuticas |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200302044A ES2257902B1 (es) | 2003-08-29 | 2003-08-29 | Modelo de animal transgenico para el desarrollo de nuevas aproximaciones terapeuticas. |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| WO (1) | WO2005020680A1 (es) |
-
2003
- 2003-08-29 ES ES200302044A patent/ES2257902B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-08-26 WO PCT/ES2004/000385 patent/WO2005020680A1/es not_active Ceased
Non-Patent Citations (3)
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|---|
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| STRAUSBERG R.L. et al. "Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences" 4 abril 2001 EMBL Nucleotide Database [en línea] [recuperado el 29 de noviembre de 2004] Accession nº BC005526, Sequence Identification BC005526.1 * |
| THOMAS et al. "Site-Directed Mutagenesis by Gene Targeting in Mouse Embryo-Derived Stem Cells." Cell, 1987, Vol. 51, nov 6, páginas 503-512. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2005020680A1 (es) | 2005-03-10 |
| ES2257902A1 (es) | 2006-08-01 |
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