JP2001299141A - ノックイン非ヒト哺乳動物 - Google Patents
ノックイン非ヒト哺乳動物Info
- Publication number
- JP2001299141A JP2001299141A JP2000126776A JP2000126776A JP2001299141A JP 2001299141 A JP2001299141 A JP 2001299141A JP 2000126776 A JP2000126776 A JP 2000126776A JP 2000126776 A JP2000126776 A JP 2000126776A JP 2001299141 A JP2001299141 A JP 2001299141A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- gene
- rag1
- knock
- human mammal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000001183 RAG-1 Human genes 0.000 claims abstract description 60
- 108060006897 RAG1 Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 101150013400 rag1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 143
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 67
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 66
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 64
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 64
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 29
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 9
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 8
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 5
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 3
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 claims description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 241000009328 Perro Species 0.000 claims 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 8
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 abstract description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 37
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 31
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 13
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 11
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 9
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 8
- 108091005971 Wild-type GFP Proteins 0.000 description 8
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 101001061851 Homo sapiens V(D)J recombination-activating protein 2 Proteins 0.000 description 5
- 102100029591 V(D)J recombination-activating protein 2 Human genes 0.000 description 5
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 4
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 3
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 description 3
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 3
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001280 germinal center Anatomy 0.000 description 3
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VUFNLQXQSDUXKB-DOFZRALJSA-N 2-[4-[4-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]butanoyloxy]ethyl (5z,8z,11z,14z)-icosa-5,8,11,14-tetraenoate Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)OCCOC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 VUFNLQXQSDUXKB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000007035 DNA breakage Effects 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036738 Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-11 Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101100283445 Homo sapiens GNA11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101150003028 Hprt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150075516 RAG2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 230000037308 hair color Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000007854 ligation-mediated PCR Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000005211 primary lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＲＡＧ１をコードする遺伝子領域中にレポー
ター遺伝子が挿入されているノックインマウスを作出す
ることによって、自己免疫マウスのＢ−１細胞の抗体特
異性獲得の機構を解析する手段を提供すること。 【解決手段】 ｒａｇ１遺伝子中にレポーター遺伝子が
挿入されてなる導入遺伝子を有する、ノックイン非ヒト
哺乳動物。
ター遺伝子が挿入されているノックインマウスを作出す
ることによって、自己免疫マウスのＢ−１細胞の抗体特
異性獲得の機構を解析する手段を提供すること。 【解決手段】 ｒａｇ１遺伝子中にレポーター遺伝子が
挿入されてなる導入遺伝子を有する、ノックイン非ヒト
哺乳動物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、緑色蛍光タンパク
質（green fluorescent protein：ＧＦＰ）遺伝子など
のレポーター遺伝子がＲＡＧ１をコードする遺伝子中に
挿入されているノックイン非ヒト哺乳動物に関する。よ
り詳細には、本発明は、レポーター遺伝子の発現産物を
検出することによりＲＡＧ１の発現状態を分析すること
ができる、ノックイン非ヒト哺乳動物に関する。
質（green fluorescent protein：ＧＦＰ）遺伝子など
のレポーター遺伝子がＲＡＧ１をコードする遺伝子中に
挿入されているノックイン非ヒト哺乳動物に関する。よ
り詳細には、本発明は、レポーター遺伝子の発現産物を
検出することによりＲＡＧ１の発現状態を分析すること
ができる、ノックイン非ヒト哺乳動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｂ細胞は、Ｉｇ遺伝子の再構成を調節す
る特異的分子機構によって造血前駆細胞から生成する
（Melchers, F.他,1973, Transplant.Rev. 14,76；及び
Alt,F.W.他,1980,Cell, 20,293）。リコンビナーゼ成分
であるＲＡＧ１及びＲＡＧ２の発現が調節されて、一次
リンパ器官で生成した１セットのＢ細胞クローンのレパ
ートリーが形成される。各種の最初の遺伝子ソースの再
構成の研究により、胎児腹腔内網および胎児肝臓に存在
するが成熟骨髄にはほとんど存在しない前駆細胞に由来
する機能的に別個の集団のＢ細胞がＢ−１細胞として存
在することが判明してきた（Hayakawa,K．他，1985, J.
Exp.Med. 161, 1554；及びKantor,A.B.他, 1993, Annu.
Rev.Immunol. 11:501）。骨髄に存在する再構成されて
いない前駆細胞の分化によって生涯補充され続ける通常
のＢ細胞（Ｂ−２細胞と称する）とは対照的に、Ｂ−１
細胞は成熟動物では自己補充によってその数が維持され
る（Kantor,A.B.他, 1993, Annu.Rev.Immunol. 11:50
1）。Ｂ−１レパトアは発生の初期の段階で固定され、
加齢に伴い少しずつ制限されていく。Ｂ−１プールへの
新たな参入はフィードバック機構のために妨げられ、ク
ローン集団は膨張して徐々に大きなプールの集団を占め
るようになる。これまでの研究により、自己抗体産生細
胞は、自己免疫になり易いマウスおよび自己抗体産生ト
ランスジェニックマウスにおいてＢ−１細胞から生成す
ることが示唆されている（Murakami,M.他,1992, Natur
e, 357,77；及びKasaian,M.T.他，1993, Autoimmunity,
15, 315）。
る特異的分子機構によって造血前駆細胞から生成する
（Melchers, F.他,1973, Transplant.Rev. 14,76；及び
Alt,F.W.他,1980,Cell, 20,293）。リコンビナーゼ成分
であるＲＡＧ１及びＲＡＧ２の発現が調節されて、一次
リンパ器官で生成した１セットのＢ細胞クローンのレパ
ートリーが形成される。各種の最初の遺伝子ソースの再
構成の研究により、胎児腹腔内網および胎児肝臓に存在
するが成熟骨髄にはほとんど存在しない前駆細胞に由来
する機能的に別個の集団のＢ細胞がＢ−１細胞として存
在することが判明してきた（Hayakawa,K．他，1985, J.
Exp.Med. 161, 1554；及びKantor,A.B.他, 1993, Annu.
Rev.Immunol. 11:501）。骨髄に存在する再構成されて
いない前駆細胞の分化によって生涯補充され続ける通常
のＢ細胞（Ｂ−２細胞と称する）とは対照的に、Ｂ−１
細胞は成熟動物では自己補充によってその数が維持され
る（Kantor,A.B.他, 1993, Annu.Rev.Immunol. 11:50
1）。Ｂ−１レパトアは発生の初期の段階で固定され、
加齢に伴い少しずつ制限されていく。Ｂ−１プールへの
新たな参入はフィードバック機構のために妨げられ、ク
ローン集団は膨張して徐々に大きなプールの集団を占め
るようになる。これまでの研究により、自己抗体産生細
胞は、自己免疫になり易いマウスおよび自己抗体産生ト
ランスジェニックマウスにおいてＢ−１細胞から生成す
ることが示唆されている（Murakami,M.他,1992, Natur
e, 357,77；及びKasaian,M.T.他，1993, Autoimmunity,
15, 315）。
【０００３】最近の研究によれば、正常および自己免疫
のＮＺＢマウス由来の腹腔（Ｐｃ）Ｂ−１細胞における
ｒａｇ遺伝子のｍＲＮＡの増加が実証された（Qin,X.F.
他、Nature, 397, 355）。この結論は、胎児肝臓または
腹腔網から補充される前に生成されるＢ−１細胞の抗体
能力はかなり制限されているという以前の知見とは一致
しない。Ｂ−１細胞においてｒａｇ遺伝子のｍＲＮＡが
増加しているという知見は、Ｂ−１プールにおける二次
的レパトア形成の機構の存在を示唆している。Ｉｇ再構
成が連続的に生じることにより、自己抗体産生Ｂ−１細
胞の生成が誘導される可能性が高いように思われた。し
かしながら、Ｂ−１細胞における免疫グロブリン遺伝子
再構成の誘導の機構は未だ十分には解明されていない。
のＮＺＢマウス由来の腹腔（Ｐｃ）Ｂ−１細胞における
ｒａｇ遺伝子のｍＲＮＡの増加が実証された（Qin,X.F.
他、Nature, 397, 355）。この結論は、胎児肝臓または
腹腔網から補充される前に生成されるＢ−１細胞の抗体
能力はかなり制限されているという以前の知見とは一致
しない。Ｂ−１細胞においてｒａｇ遺伝子のｍＲＮＡが
増加しているという知見は、Ｂ−１プールにおける二次
的レパトア形成の機構の存在を示唆している。Ｉｇ再構
成が連続的に生じることにより、自己抗体産生Ｂ−１細
胞の生成が誘導される可能性が高いように思われた。し
かしながら、Ｂ−１細胞における免疫グロブリン遺伝子
再構成の誘導の機構は未だ十分には解明されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＲＡＧ１を
コードする遺伝子領域中にレポーター遺伝子が挿入され
ているノックインマウスを作出することによって、自己
免疫マウスのＢ−１細胞の抗体特異性獲得の機構を解析
する手段を提供することを解決すべき課題とした。本発
明はさらに、ＲＡＧ１をコードする遺伝子領域中にレポ
ーター遺伝子が挿入されているノックインマウスの利用
方法を提供することを解決すべき課題とした。
コードする遺伝子領域中にレポーター遺伝子が挿入され
ているノックインマウスを作出することによって、自己
免疫マウスのＢ−１細胞の抗体特異性獲得の機構を解析
する手段を提供することを解決すべき課題とした。本発
明はさらに、ＲＡＧ１をコードする遺伝子領域中にレポ
ーター遺伝子が挿入されているノックインマウスの利用
方法を提供することを解決すべき課題とした。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討した結果、レポーター遺伝子
であるｇｆｐ遺伝子の発現を安定的に維持できるように
ＲＡＧ１をコードする遺伝子領域中にレポーター遺伝子
が挿入されているノックインマウスを作出することに成
功し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明によれ
ば、ｒａｇ１遺伝子中にレポーター遺伝子が挿入されて
なる導入遺伝子を有する、ノックイン非ヒト哺乳動物が
提供される。
を解決するために鋭意検討した結果、レポーター遺伝子
であるｇｆｐ遺伝子の発現を安定的に維持できるように
ＲＡＧ１をコードする遺伝子領域中にレポーター遺伝子
が挿入されているノックインマウスを作出することに成
功し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明によれ
ば、ｒａｇ１遺伝子中にレポーター遺伝子が挿入されて
なる導入遺伝子を有する、ノックイン非ヒト哺乳動物が
提供される。
【０００６】好ましくは、レポーター遺伝子は緑色蛍光
タンパク質（ＧＦＰ）又はその変異体をコードする遺伝
子である。好ましくは、本発明のノックイン非ヒト哺乳
動物では、導入遺伝子が腹腔Ｂ−１細胞よりも腹腔Ｂ−
２細胞で高発現している。好ましくは、非ヒト哺乳動物
は、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサ
ギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシおよびサル
から成る群から選ばれる非ヒト哺乳動物である。
タンパク質（ＧＦＰ）又はその変異体をコードする遺伝
子である。好ましくは、本発明のノックイン非ヒト哺乳
動物では、導入遺伝子が腹腔Ｂ−１細胞よりも腹腔Ｂ−
２細胞で高発現している。好ましくは、非ヒト哺乳動物
は、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサ
ギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシおよびサル
から成る群から選ばれる非ヒト哺乳動物である。
【０００７】本発明の別の側面によれば、上記した本発
明のノックイン非ヒト哺乳動物の作製に用いるための、
ｒａｇ１遺伝子中にレポーター遺伝子が挿入されてなる
導入遺伝子を導入した非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞が提
供される。本発明のさらに別の側面によれば、本発明の
ノックイン非ヒト哺乳動物の細胞が提供される。該細胞
は好ましくは、胚性幹細胞、卵および精子からなる群か
ら選ばれる細胞である。本発明のさらに別の側面によれ
ば、本発明のノックイン非ヒト哺乳動物の細胞の核が提
供される。
明のノックイン非ヒト哺乳動物の作製に用いるための、
ｒａｇ１遺伝子中にレポーター遺伝子が挿入されてなる
導入遺伝子を導入した非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞が提
供される。本発明のさらに別の側面によれば、本発明の
ノックイン非ヒト哺乳動物の細胞が提供される。該細胞
は好ましくは、胚性幹細胞、卵および精子からなる群か
ら選ばれる細胞である。本発明のさらに別の側面によれ
ば、本発明のノックイン非ヒト哺乳動物の細胞の核が提
供される。
【０００８】本発明のさらに別の側面によれば、本発明
のノックイン非ヒト哺乳動物、あるいは該動物の組織、
器官または細胞を用いて、レポーター遺伝子の発現を検
出することにより細胞内におけるｒａｇ１の発現状態を
分析する方法が提供される。本発明のさらに別の側面に
よれば、本発明のノックイン非ヒト哺乳動物、或いは該
動物の組織、器官または細胞に試験化合物を投与し、レ
ポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする、Ｒ
ＡＧ１タンパク質の発現を調節する化合物のスクリーニ
ング方法が提供される。
のノックイン非ヒト哺乳動物、あるいは該動物の組織、
器官または細胞を用いて、レポーター遺伝子の発現を検
出することにより細胞内におけるｒａｇ１の発現状態を
分析する方法が提供される。本発明のさらに別の側面に
よれば、本発明のノックイン非ヒト哺乳動物、或いは該
動物の組織、器官または細胞に試験化合物を投与し、レ
ポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする、Ｒ
ＡＧ１タンパク質の発現を調節する化合物のスクリーニ
ング方法が提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施態様および実
施方法について説明する。（Ａ）本発明のノックイン非ヒト哺乳動物の作製方法 本発明のノックイン非ヒト哺乳動物の対象動物はヒト以
外の哺乳動物であればその種類は特に限定されないが、
例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウ
サギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシおよびサ
ルから成る群から選ばれる動物であり、好ましくは、マ
ウス、ラット、モルモット、ハムスター又はウサギなど
の齧歯類動物であり、特に好ましくはマウスである。本
発明のノックイン非ヒト哺乳動物は、公知の遺伝子組換
え法（ジーン・ターゲティング法）を用いることによ
り、例えば以下の操作に従って作成することができる。
施方法について説明する。（Ａ）本発明のノックイン非ヒト哺乳動物の作製方法 本発明のノックイン非ヒト哺乳動物の対象動物はヒト以
外の哺乳動物であればその種類は特に限定されないが、
例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウ
サギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシおよびサ
ルから成る群から選ばれる動物であり、好ましくは、マ
ウス、ラット、モルモット、ハムスター又はウサギなど
の齧歯類動物であり、特に好ましくはマウスである。本
発明のノックイン非ヒト哺乳動物は、公知の遺伝子組換
え法（ジーン・ターゲティング法）を用いることによ
り、例えば以下の操作に従って作成することができる。
【００１０】先ず、対象とする非ヒト哺乳動物が有する
ＲＡＧ１をコードするＤＮＡを単離し、そのエキソン部
分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺
伝子等の薬剤耐性遺伝子、及び、ｇｆｐ遺伝子（緑色蛍
光タンパク質遺伝子）、ｌａｃＺ遺伝子（β−ガラクト
シダーゼ遺伝子）、ｃａｔ遺伝子（クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）などのレポータ
ー遺伝子を挿入することによって、ターゲティングベク
ターを構築する。
ＲＡＧ１をコードするＤＮＡを単離し、そのエキソン部
分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺
伝子等の薬剤耐性遺伝子、及び、ｇｆｐ遺伝子（緑色蛍
光タンパク質遺伝子）、ｌａｃＺ遺伝子（β−ガラクト
シダーゼ遺伝子）、ｃａｔ遺伝子（クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）などのレポータ
ー遺伝子を挿入することによって、ターゲティングベク
ターを構築する。
【００１１】本明細書においてレポーター遺伝子とは、
外部から測定可能な信号を発する能力をもつタンパク質
をコードする遺伝子を意味する。レポーター遺伝子は好
ましくは、蛍光性タンパク質をコードする遺伝子又は酵
素タンパク質をコードする遺伝子である。酵素タンパク
質の具体例としては、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ア
ルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフ
ェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ、およびそれらの変異
体が挙げられる。蛍光性タンパク質の具体例としては、
緑色蛍光タンパク質またはその変異体が挙げられる。好
ましくは、レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質又
はその変異体をコードする遺伝子である。
外部から測定可能な信号を発する能力をもつタンパク質
をコードする遺伝子を意味する。レポーター遺伝子は好
ましくは、蛍光性タンパク質をコードする遺伝子又は酵
素タンパク質をコードする遺伝子である。酵素タンパク
質の具体例としては、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ア
ルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフ
ェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ、およびそれらの変異
体が挙げられる。蛍光性タンパク質の具体例としては、
緑色蛍光タンパク質またはその変異体が挙げられる。好
ましくは、レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質又
はその変異体をコードする遺伝子である。
【００１２】本発明においてはレポーター遺伝子は、野
生型緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子のみなら
ず、緑色蛍光タンパク質の変異体をコードする遺伝子を
使用してもよい。緑色蛍光タンパク質の変異体とは、例
えば、（１）野生型の緑色蛍光タンパク質の有するアミ
ノ酸配列において１以上（例えば１〜２０個、好ましく
は１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ま
しくは１〜５個の）のアミノ酸が欠失、置換または付加
されたアミノ酸配列を有し、野生型の緑色蛍光タンパク
質と同等以上の蛍光を発することができるタンパク質、
あるいは（２）野生型の緑色蛍光タンパク質の有するア
ミノ酸配列と一定以上の相同性（例えば、６０％以上、
好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さ
らに好ましくは９０％以上）を有し、野生型の緑色蛍光
タンパク質と同等以上の蛍光を発することができるタン
パク質を挙げることができる。
生型緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子のみなら
ず、緑色蛍光タンパク質の変異体をコードする遺伝子を
使用してもよい。緑色蛍光タンパク質の変異体とは、例
えば、（１）野生型の緑色蛍光タンパク質の有するアミ
ノ酸配列において１以上（例えば１〜２０個、好ましく
は１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ま
しくは１〜５個の）のアミノ酸が欠失、置換または付加
されたアミノ酸配列を有し、野生型の緑色蛍光タンパク
質と同等以上の蛍光を発することができるタンパク質、
あるいは（２）野生型の緑色蛍光タンパク質の有するア
ミノ酸配列と一定以上の相同性（例えば、６０％以上、
好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さ
らに好ましくは９０％以上）を有し、野生型の緑色蛍光
タンパク質と同等以上の蛍光を発することができるタン
パク質を挙げることができる。
【００１３】上記のような緑色蛍光タンパク質の変異体
の変異体をコードする遺伝子を得る方法としては、化学
合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当分野で
既知の任意の方法を用いることができる。例えば、野生
型の緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を得て、こ
れを基にし変異遺伝子のＤＮＡを得ることができる。変
異導入は任意の方法により行うことができる。例えば、
野生型緑色蛍光タンパク質遺伝子または野生型緑色蛍光
タンパク質遺伝子を含む組み換えＤＮＡに対し、変異原
となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方
法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。
の変異体をコードする遺伝子を得る方法としては、化学
合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当分野で
既知の任意の方法を用いることができる。例えば、野生
型の緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を得て、こ
れを基にし変異遺伝子のＤＮＡを得ることができる。変
異導入は任意の方法により行うことができる。例えば、
野生型緑色蛍光タンパク質遺伝子または野生型緑色蛍光
タンパク質遺伝子を含む組み換えＤＮＡに対し、変異原
となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方
法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。
【００１４】遺伝子工学的手法の一つである部位特異的
変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法
であることから有用であり、Molecular Cloning, A Lab
oratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Mol
ecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)等に
記載の方法に準じて行うことができる。
変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法
であることから有用であり、Molecular Cloning, A Lab
oratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Mol
ecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)等に
記載の方法に準じて行うことができる。
【００１５】本発明のノックイン非ヒト哺乳動物を作成
するためには、上記したようなターゲティングベクター
を所望の非ヒト哺乳動物（例えば、マウスなど）の胚性
幹細胞（ＥＳ細胞）に導入し、細胞ゲノムＤＮＡのｒａ
ｇ１遺伝子がターゲティングベクター中の変異配列に相
同組換えされた細胞を選択する。このような遺伝子組換
え細胞の選択は、例えば、薬剤耐性遺伝子としてネオマ
イシン耐性遺伝子を使用した場合には、Ｇ４１８を細胞
培地に添加してネオマイシン耐性遺伝子を持たない非組
換え細胞を除去することによって行うことができる。選
択された遺伝子組換え細胞のｒａｇ１遺伝子は、そのコ
ード配列中にｇｆｐ遺伝子が挿入されている。
するためには、上記したようなターゲティングベクター
を所望の非ヒト哺乳動物（例えば、マウスなど）の胚性
幹細胞（ＥＳ細胞）に導入し、細胞ゲノムＤＮＡのｒａ
ｇ１遺伝子がターゲティングベクター中の変異配列に相
同組換えされた細胞を選択する。このような遺伝子組換
え細胞の選択は、例えば、薬剤耐性遺伝子としてネオマ
イシン耐性遺伝子を使用した場合には、Ｇ４１８を細胞
培地に添加してネオマイシン耐性遺伝子を持たない非組
換え細胞を除去することによって行うことができる。選
択された遺伝子組換え細胞のｒａｇ１遺伝子は、そのコ
ード配列中にｇｆｐ遺伝子が挿入されている。
【００１６】上記で得られたＥＳ細胞を、ＲＡＧ１をコ
ードするＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプロ
ーブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいは
ターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッテ
ィングベクター作製に使用したＲＡＧ１をコードするＤ
ＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰ
ＣＲ法により解析することにより、所望の相同組換えを
起こした細胞を選別することができる。
ードするＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプロ
ーブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいは
ターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッテ
ィングベクター作製に使用したＲＡＧ１をコードするＤ
ＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰ
ＣＲ法により解析することにより、所望の相同組換えを
起こした細胞を選別することができる。
【００１７】相同組換え法等によりｒａｇ１遺伝子をノ
ックインさせる元のＥＳ細胞としては、例えば、既に樹
立された公知のＥＳ細胞を用いてもよく、また公知の方
法〔Robertson, E. T., Teratocarcinomas and Embryon
ic Stem Cells: A PracticalApproach (ed. E.J. Rober
tson), IBL Press, Oxford. など〕に準じて新しく樹立
した細胞でもよい。また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一
般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以
外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いること
により効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常、
雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに好ま
しい。
ックインさせる元のＥＳ細胞としては、例えば、既に樹
立された公知のＥＳ細胞を用いてもよく、また公知の方
法〔Robertson, E. T., Teratocarcinomas and Embryon
ic Stem Cells: A PracticalApproach (ed. E.J. Rober
tson), IBL Press, Oxford. など〕に準じて新しく樹立
した細胞でもよい。また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一
般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以
外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いること
により効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常、
雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに好ま
しい。
【００１８】次に、このレポーター遺伝子が挿入された
ｒａｇ１遺伝子を有するＥＳ細胞を用いて本発明のノッ
クイン非ヒト哺乳動物を作製する。非ヒト哺乳動物胚幹
細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、ｒａｇ
１遺伝子が不活性化された細胞株をクローニングし、そ
の細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動
物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠
させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された
哺乳動物は正常なｒａｇ１の遺伝子座をもつ細胞とレポ
ーター遺伝子が挿入されているｒａｇ１の遺伝子座をも
つ細胞の両方から構成されるキメラ哺乳動物である。該
キメラ哺乳動物の生殖細胞の一部が変異した遺伝子座を
もつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配する
ことにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に
変異を加えた遺伝子座をもつ細胞で構成された個体を、
例えば、毛色の判定等により選別することにより得られ
る。このようにして得られた個体は、通常、レポーター
遺伝子がノックインされているｒａｇ１遺伝子をヘテロ
に有する個体であり、このようなヘテロの個体同志を交
配し、それらの産仔からレポーター遺伝子がノックイン
されているｒａｇ１遺伝子をホモに有する個体を得るこ
とができる。卵細胞を使用する場合は、例えば公知のマ
イクロインジェクション法で、卵細胞核内にＤＮＡ溶液
を注入することによりターゲッティングベクターを染色
体内に導入したノックイン非ヒト哺乳動物を得ることが
でき、遺伝子相同組換えによりｒａｇ１遺伝子中にレポ
ーター遺伝子が挿入されているものを選択できる。
ｒａｇ１遺伝子を有するＥＳ細胞を用いて本発明のノッ
クイン非ヒト哺乳動物を作製する。非ヒト哺乳動物胚幹
細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、ｒａｇ
１遺伝子が不活性化された細胞株をクローニングし、そ
の細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動
物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠
させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された
哺乳動物は正常なｒａｇ１の遺伝子座をもつ細胞とレポ
ーター遺伝子が挿入されているｒａｇ１の遺伝子座をも
つ細胞の両方から構成されるキメラ哺乳動物である。該
キメラ哺乳動物の生殖細胞の一部が変異した遺伝子座を
もつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配する
ことにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に
変異を加えた遺伝子座をもつ細胞で構成された個体を、
例えば、毛色の判定等により選別することにより得られ
る。このようにして得られた個体は、通常、レポーター
遺伝子がノックインされているｒａｇ１遺伝子をヘテロ
に有する個体であり、このようなヘテロの個体同志を交
配し、それらの産仔からレポーター遺伝子がノックイン
されているｒａｇ１遺伝子をホモに有する個体を得るこ
とができる。卵細胞を使用する場合は、例えば公知のマ
イクロインジェクション法で、卵細胞核内にＤＮＡ溶液
を注入することによりターゲッティングベクターを染色
体内に導入したノックイン非ヒト哺乳動物を得ることが
でき、遺伝子相同組換えによりｒａｇ１遺伝子中にレポ
ーター遺伝子が挿入されているものを選択できる。
【００１９】このようにしてｒａｇ１遺伝子がノックイ
ンされている個体は、交配により得られた哺乳動物個体
も該ＤＮＡがノックインされていることを確認した後、
通常の飼育環境で継代飼育を行なうことができる。さら
に、生殖系列の取得および保持についても常法に従えば
よい。即ち、ノックインＤＮＡを保有する雌雄の哺乳動
物を交配することにより、該ノックインＤＮＡを相同染
色体の両方に持つホモ接合型非ヒト哺乳動物を取得する
ことができる。本発明のノックインされたｒａｇ１遺伝
子を有する非ヒト哺乳動物細胞（好ましくは胚幹細胞）
は、本発明のノックイン非ヒト哺乳動物を作出する上
で、非常に有用である。
ンされている個体は、交配により得られた哺乳動物個体
も該ＤＮＡがノックインされていることを確認した後、
通常の飼育環境で継代飼育を行なうことができる。さら
に、生殖系列の取得および保持についても常法に従えば
よい。即ち、ノックインＤＮＡを保有する雌雄の哺乳動
物を交配することにより、該ノックインＤＮＡを相同染
色体の両方に持つホモ接合型非ヒト哺乳動物を取得する
ことができる。本発明のノックインされたｒａｇ１遺伝
子を有する非ヒト哺乳動物細胞（好ましくは胚幹細胞）
は、本発明のノックイン非ヒト哺乳動物を作出する上
で、非常に有用である。
【００２０】本発明のノックイン非ヒト哺乳動物では、
ｒａｇ１遺伝子の発現の程度をレポーター遺伝子の発現
を追跡することで追跡することができる。例えば、レポ
ーター遺伝子として蛍光性タンパク質（例えば、緑色蛍
光タンパク質（GFP）やその変異体）をコードする遺伝
子を使用した場合には、蛍光強度を測定することにより
ＲＡＧ１の発現の程度を評価することができる。蛍光強
度の測定は公知の定法に従って行うことができる。
ｒａｇ１遺伝子の発現の程度をレポーター遺伝子の発現
を追跡することで追跡することができる。例えば、レポ
ーター遺伝子として蛍光性タンパク質（例えば、緑色蛍
光タンパク質（GFP）やその変異体）をコードする遺伝
子を使用した場合には、蛍光強度を測定することにより
ＲＡＧ１の発現の程度を評価することができる。蛍光強
度の測定は公知の定法に従って行うことができる。
【００２１】あるいは、レポーター遺伝子として 酵素
タンパク質をコードする遺伝子を使用した場合にはその
酵素の基質を用いて染色することによりＲＡＧ１の発現
状態を観察することができる。例えば、ｒａｇ１遺伝子
のＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換した場合、本来、ＲＡＧ１
が発現する組織で、ＲＡＧ１の代わりにβ−ガラクトシ
ダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ
−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる
試薬を用いて染色することにより、簡便にＲＡＧ１の哺
乳動物生体内における発現状態を観察することができ
る。具体的には、本発明のノックイン非ヒト哺乳動物ま
たはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、
リン酸酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａ
ｌを含む染色液で、約３０分〜１時間反応させた後、組
織標本を１ｍＭのＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄すること
によって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色
を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコー
ドするｍＲＮＡを検出してもよい。
タンパク質をコードする遺伝子を使用した場合にはその
酵素の基質を用いて染色することによりＲＡＧ１の発現
状態を観察することができる。例えば、ｒａｇ１遺伝子
のＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換した場合、本来、ＲＡＧ１
が発現する組織で、ＲＡＧ１の代わりにβ−ガラクトシ
ダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ
−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる
試薬を用いて染色することにより、簡便にＲＡＧ１の哺
乳動物生体内における発現状態を観察することができ
る。具体的には、本発明のノックイン非ヒト哺乳動物ま
たはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、
リン酸酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａ
ｌを含む染色液で、約３０分〜１時間反応させた後、組
織標本を１ｍＭのＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄すること
によって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色
を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコー
ドするｍＲＮＡを検出してもよい。
【００２２】このような本発明のノックイン非ヒト哺乳
動物は、ＲＡＧ１の発現を活性化または不活化する物質
をスクリーニングする上で極めて有用であり、ｒａｇ１
遺伝子の発現の異常に起因する各種疾患の原因究明また
は治療薬の開発に大きく貢献することができる。また、
本発明のノックイン非ヒト哺乳動物は、ｒａｇ１遺伝子
の発現変化を伴う疾病のモデルとなり得るので、これら
の疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
動物は、ＲＡＧ１の発現を活性化または不活化する物質
をスクリーニングする上で極めて有用であり、ｒａｇ１
遺伝子の発現の異常に起因する各種疾患の原因究明また
は治療薬の開発に大きく貢献することができる。また、
本発明のノックイン非ヒト哺乳動物は、ｒａｇ１遺伝子
の発現変化を伴う疾病のモデルとなり得るので、これら
の疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００２３】（Ｂ）本発明のノックイン非ヒト哺乳動物
の利用方法 自己免疫疾患の病因・誘因の１つとしてウイルスあるい
は細菌感染が挙げられる。腹腔のＢ−１細胞ではＲＡＧ
１分子の発現が高く、また高頻度に抗体遺伝子の再構成
が誘導されている。腸管や泌尿生殖器系からの異物や病
原菌の侵入によってＢ−１細胞が活性化され、抗体遺伝
子の再構成が再び起こることが自己反応性クローン出現
の原因であると考えられる。この現象は自己免疫疾患発
症の機序と密接な関連をもつものと考えられ、この機序
の解明することにより自己免疫疾患の発症や進行の制御
に役立つものと期待される。
の利用方法 自己免疫疾患の病因・誘因の１つとしてウイルスあるい
は細菌感染が挙げられる。腹腔のＢ−１細胞ではＲＡＧ
１分子の発現が高く、また高頻度に抗体遺伝子の再構成
が誘導されている。腸管や泌尿生殖器系からの異物や病
原菌の侵入によってＢ−１細胞が活性化され、抗体遺伝
子の再構成が再び起こることが自己反応性クローン出現
の原因であると考えられる。この現象は自己免疫疾患発
症の機序と密接な関連をもつものと考えられ、この機序
の解明することにより自己免疫疾患の発症や進行の制御
に役立つものと期待される。
【００２４】本発明のノックイン非ヒト哺乳動物を用い
ることにより、腹腔内でのＢ−１細胞のＲＡＧ１の発現
誘導を高感度に検出することができ、インビボ及びイン
ビトロの両方でＢ−１細胞の自己反応性クローンへの転
化を調べることが可能である。即ち、本発明のノックイ
ン非ヒト哺乳動物を利用することにより、実際の自己反
応性Ｂ−１細胞出現の危険因子を同定し、自己免疫疾患
の制御及び治療の方法を確立することが可能になる。上
記のようにして作成したノックイン非ヒト哺乳動物は、
具体的には以下に述べる試験方法に用いることができ
る。
ることにより、腹腔内でのＢ−１細胞のＲＡＧ１の発現
誘導を高感度に検出することができ、インビボ及びイン
ビトロの両方でＢ−１細胞の自己反応性クローンへの転
化を調べることが可能である。即ち、本発明のノックイ
ン非ヒト哺乳動物を利用することにより、実際の自己反
応性Ｂ−１細胞出現の危険因子を同定し、自己免疫疾患
の制御及び治療の方法を確立することが可能になる。上
記のようにして作成したノックイン非ヒト哺乳動物は、
具体的には以下に述べる試験方法に用いることができ
る。
【００２５】（１）腹腔Ｂ−１細胞でのＲＡＧ１分子の
出現と免疫グロブリン遺伝子再構成 本発明のＲＡＧ１／ＧＦＰヘテロマウスを用いた場合、
単一対立遺伝子への導入にもかかわらず、ＲＡＧ１の発
現について十分検出可能なレベルのシグナルがＧＦＰの
発現として得られる。このマウスの様々な週齢でＢ−１
細胞の出現とＲＡＧ１発現の頻度をクローンレベルで確
認することができる。Ｂ−１細胞の出現とＲＡＧ１発現
の頻度は、加齢とともに変化するのか、ＬＰＳの経口投
与や直接の注入で腹腔内の炎症を起こし、その際のＢ−
１細胞の活性化でＲＡＧ１の発現が亢進するのかを検証
する。これまでの報告では、Ｂ−２細胞と比較してＢ−
１細胞でははるかに高頻度の再構成が誘導されているの
で、ＲＡＧ１発現Ｂ−１細胞をＦＡＣＳで選別して細胞
内での再構成活性を検出することが可能である。
出現と免疫グロブリン遺伝子再構成 本発明のＲＡＧ１／ＧＦＰヘテロマウスを用いた場合、
単一対立遺伝子への導入にもかかわらず、ＲＡＧ１の発
現について十分検出可能なレベルのシグナルがＧＦＰの
発現として得られる。このマウスの様々な週齢でＢ−１
細胞の出現とＲＡＧ１発現の頻度をクローンレベルで確
認することができる。Ｂ−１細胞の出現とＲＡＧ１発現
の頻度は、加齢とともに変化するのか、ＬＰＳの経口投
与や直接の注入で腹腔内の炎症を起こし、その際のＢ−
１細胞の活性化でＲＡＧ１の発現が亢進するのかを検証
する。これまでの報告では、Ｂ−２細胞と比較してＢ−
１細胞でははるかに高頻度の再構成が誘導されているの
で、ＲＡＧ１発現Ｂ−１細胞をＦＡＣＳで選別して細胞
内での再構成活性を検出することが可能である。
【００２６】（２）腹腔Ｂ−１細胞でのＲＡＧ及び再構
成誘導の危険因子の解析 本発明のノックイン非ヒト哺乳動物を用いて、ＲＡＧ１
の発現がどのような刺激でおこるのかを調べることがで
きる。具体的には、例えば、本発明のノックインマウス
での刺激、ノックインマウス由来の脾臓Ｂ細胞でのイン
ビトロ刺激、ノックインマウス由来の腹腔Ｂ−１細胞で
のインビトロ刺激を検討する。従来報告されている抗原
刺激であるＩＬ５又はＬＰＳによる刺激が最も有効な刺
激であるかどうかを調べ、そのシグナルはどのような伝
達経路を介して行われているのかを明らかにする。ま
た、その伝達経路はどのようなサイトカインにより制御
されているのかを明らかにする。これらの結果に基づい
て、哺乳動物での腹腔Ｂ−１細胞でのＲＡＧ１誘導機構
が解明され、その制御手段の確立が可能になる。
成誘導の危険因子の解析 本発明のノックイン非ヒト哺乳動物を用いて、ＲＡＧ１
の発現がどのような刺激でおこるのかを調べることがで
きる。具体的には、例えば、本発明のノックインマウス
での刺激、ノックインマウス由来の脾臓Ｂ細胞でのイン
ビトロ刺激、ノックインマウス由来の腹腔Ｂ−１細胞で
のインビトロ刺激を検討する。従来報告されている抗原
刺激であるＩＬ５又はＬＰＳによる刺激が最も有効な刺
激であるかどうかを調べ、そのシグナルはどのような伝
達経路を介して行われているのかを明らかにする。ま
た、その伝達経路はどのようなサイトカインにより制御
されているのかを明らかにする。これらの結果に基づい
て、哺乳動物での腹腔Ｂ−１細胞でのＲＡＧ１誘導機構
が解明され、その制御手段の確立が可能になる。
【００２７】（３）自己免疫疾患哺乳動物における腹腔
Ｂ−１細胞のＲＡＧ１発現亢進の分子機序の解析 ＮＺＢマウスではインビボで腹腔Ｂ−１細胞でのＲＡＧ
１発現上昇が見られると報告されている。バッククロス
によりＮＺＢマウスでの発現を検証し、この場合に、ど
のような細胞分化のステージから発現上昇が起こるの
か、並びにその頻度を解明する。特には、加齢による変
化を解析する。また、マウスを様々な飼育条件で飼育さ
せ、腹腔Ｂ−１細胞の出現とＲＡＧ１発現を追跡して調
べる。さらに、多様な治療薬やサイトカインなどを投与
して、ＲＡＧ１誘導の制御の効率的な指針を示すための
基礎的解析及び方法論の確立を行う。
Ｂ−１細胞のＲＡＧ１発現亢進の分子機序の解析 ＮＺＢマウスではインビボで腹腔Ｂ−１細胞でのＲＡＧ
１発現上昇が見られると報告されている。バッククロス
によりＮＺＢマウスでの発現を検証し、この場合に、ど
のような細胞分化のステージから発現上昇が起こるの
か、並びにその頻度を解明する。特には、加齢による変
化を解析する。また、マウスを様々な飼育条件で飼育さ
せ、腹腔Ｂ−１細胞の出現とＲＡＧ１発現を追跡して調
べる。さらに、多様な治療薬やサイトカインなどを投与
して、ＲＡＧ１誘導の制御の効率的な指針を示すための
基礎的解析及び方法論の確立を行う。
【００２８】上記した通り、本発明のノックイン非ヒト
哺乳動物は、自己免疫疾患の原因の解明やその予防法や
治療法を確立するための実験動物として有用である。以
下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、
本発明は実施例によって限定されることはない。
哺乳動物は、自己免疫疾患の原因の解明やその予防法や
治療法を確立するための実験動物として有用である。以
下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、
本発明は実施例によって限定されることはない。
【００２９】
【実施例】１．材料と方法 （ａ）ターゲッティングベクターの構築 ｒａｇ１遺伝子を含む９．０ｋｂのClaI-ClaIゲノムＤ
ＮＡ断片をｒａｇ１遺伝子を保持するゲノムＥＭＢＬ３
ＳＰ６／Ｔ７ファージクローンから単離し、pBluescrip
t II KS(-)（Stratagene, La Jolla, CA）にサブクロー
ニングした。ウサギβ−グロビンポリＡ遺伝子を含む
０．９ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＳｔｕＩ断片をｐＣＸＮ２
（Yagi,T他、1993, Anal.Biochem.214, 77）から単離
し、ｐＥＧＦＰ（ＧＦＰ）（CLONTECH, Heidelberg, Ge
rmany）のEcoRI-StuI部位にライゲートした。ｒａｇ１
開始コドン付近の配列は、５’−ＧＣＴＴＡＧＣＣＡＡ
ＣＡＴＧＧ−３’（配列番号１）である。ｒａｇ１遺伝
子の５’フランキング領域のEspI部位（EspI-CAACATG
G）を使用して、ＧＦＰの５’配列の新たに生成したEsp
I部位に連結した。先ず、pBluescript II KS(-)のBamHI
−EcoRI部位（pBluescriptアダプターと命名）に新たな
EspI-CA-Ncol配列を調製し、そこにNcoI-HindIII部位を
用いてNcoI-HindIIIｐＥＧＦＰポリＡ断片をライゲーシ
ョンした。次に、１．３ｋｂのEspI-ApaIＧＦＰ断片を
取得し、内因性のｒａｇ１EspI部位とpBluescript IIの
ApaI部位を有するｒａｇ１遺伝子中にライゲーションし
た。ｒａｇ１遺伝子のEspIからATGコドンまでの４塩基
の配列（ＣＡＡＣ）をＧＦＰの４塩基の配列（ＣＡＣ
Ｃ）と置換し、非コード領域の５’フランキング配列内
に１個のヌクレオチドの相違を生じさせた。ｒａｇ１遺
伝子の５’−フランキング領域（長腕）、ＧＦＰ遺伝子
のコード領域、ｎｅｏ遺伝子カセット、ｒａｇ１遺伝子
の３’フランキング領域（短腕）を順番に含む構築物を
ｐＭＣＤＴ−Ａネガティブ選択ベクターに挿入した。
ＮＡ断片をｒａｇ１遺伝子を保持するゲノムＥＭＢＬ３
ＳＰ６／Ｔ７ファージクローンから単離し、pBluescrip
t II KS(-)（Stratagene, La Jolla, CA）にサブクロー
ニングした。ウサギβ−グロビンポリＡ遺伝子を含む
０．９ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＳｔｕＩ断片をｐＣＸＮ２
（Yagi,T他、1993, Anal.Biochem.214, 77）から単離
し、ｐＥＧＦＰ（ＧＦＰ）（CLONTECH, Heidelberg, Ge
rmany）のEcoRI-StuI部位にライゲートした。ｒａｇ１
開始コドン付近の配列は、５’−ＧＣＴＴＡＧＣＣＡＡ
ＣＡＴＧＧ−３’（配列番号１）である。ｒａｇ１遺伝
子の５’フランキング領域のEspI部位（EspI-CAACATG
G）を使用して、ＧＦＰの５’配列の新たに生成したEsp
I部位に連結した。先ず、pBluescript II KS(-)のBamHI
−EcoRI部位（pBluescriptアダプターと命名）に新たな
EspI-CA-Ncol配列を調製し、そこにNcoI-HindIII部位を
用いてNcoI-HindIIIｐＥＧＦＰポリＡ断片をライゲーシ
ョンした。次に、１．３ｋｂのEspI-ApaIＧＦＰ断片を
取得し、内因性のｒａｇ１EspI部位とpBluescript IIの
ApaI部位を有するｒａｇ１遺伝子中にライゲーションし
た。ｒａｇ１遺伝子のEspIからATGコドンまでの４塩基
の配列（ＣＡＡＣ）をＧＦＰの４塩基の配列（ＣＡＣ
Ｃ）と置換し、非コード領域の５’フランキング配列内
に１個のヌクレオチドの相違を生じさせた。ｒａｇ１遺
伝子の５’−フランキング領域（長腕）、ＧＦＰ遺伝子
のコード領域、ｎｅｏ遺伝子カセット、ｒａｇ１遺伝子
の３’フランキング領域（短腕）を順番に含む構築物を
ｐＭＣＤＴ−Ａネガティブ選択ベクターに挿入した。
【００３０】（ｂ）トランスフェクション及びＧＦＰノ
ックインＥＳクローンのスクリーニング ＴＴ２細胞をｒａｇ１／ｇｆｐノックイン胚幹（ＥＳ）
細胞として使用した（Yagi,T他、1993, Anal.Biochem.2
14, 77）。ＴＴ２細胞を常法により培養し、トリプシン
で処理し、ＨＢＳ（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０
５）；１３７ｍＭのＮａＣｌ；５ｍＭのＫＣｌ、０．７
ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4；６ｍＭのデキストロース）中に
２．５×１０7細胞／ｍｌの濃度になるように再懸濁し
た。細胞懸濁物（０．４ｍｌ）を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ遺伝
子パルサー（２５０Ｖ、９６０μＦ）を用いて１２ｎＭ
のSalIで線状化したＤＮＡ（上記（ａ）で構築したター
ゲッティングベクター）と一緒に室温で０．４ｃｍのパ
ッチ長を有するキュベット中で室温にてエレクトロポレ
ートした。細胞を１０分間放置してから、９ｃｍ皿に３
×１０6細胞をプレーティングした。Ｇ４１８（正味量
１５０〜２００〜２００μｇ／ｍｌ、GIBCO BRL、Rockv
ille, MD）を３６〜４８時間後に添加し、９〜１０日間
選択した。ｒａｇ１／ｇｆｐＥＳクローンは、フォワー
ドプライマー（ｎｅｏ１：５’−ＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡ
ＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣＧＣＴＣＣＣＧＡＴＴ−３’）
（配列番号２）及びリバースプライマー（コントロール
２；５’−ＣＴＧＧＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＣＧＧＣＴＣ
ＡＧＧＣＡＡＴＣＴＣ−３’）（配列番号３）を用いる
ＰＣＲによって同定した。陽性ＥＳクローンはさらに精
製したゲノムＤＮＡを用いたサザンブロット分析により
調べた。ＤＮＡ試料はBamHI及びNcoIで二重切断し、ア
ガロースゲル電気泳動で分離した。ナイロン膜にトラン
スファーした後、ブロットをＡＭプローブ又は３ＵＴプ
ローブの何れかとハイブリダイズさせた。ＡＭ及び３Ｕ
Ｔプローブは各々、１９３３ｂｐ〜３１１５ｂｐの領域
及び３４８９ｂｐ〜４７０６ｂｐの領域に対応するｒａ
ｇ１ｃＤＮＡから調製した。ＤＮＡ断片はAlkPhos DIRE
CT（Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, E
ngland）を取扱説明書に従って使用して可視化した。
ックインＥＳクローンのスクリーニング ＴＴ２細胞をｒａｇ１／ｇｆｐノックイン胚幹（ＥＳ）
細胞として使用した（Yagi,T他、1993, Anal.Biochem.2
14, 77）。ＴＴ２細胞を常法により培養し、トリプシン
で処理し、ＨＢＳ（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０
５）；１３７ｍＭのＮａＣｌ；５ｍＭのＫＣｌ、０．７
ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4；６ｍＭのデキストロース）中に
２．５×１０7細胞／ｍｌの濃度になるように再懸濁し
た。細胞懸濁物（０．４ｍｌ）を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ遺伝
子パルサー（２５０Ｖ、９６０μＦ）を用いて１２ｎＭ
のSalIで線状化したＤＮＡ（上記（ａ）で構築したター
ゲッティングベクター）と一緒に室温で０．４ｃｍのパ
ッチ長を有するキュベット中で室温にてエレクトロポレ
ートした。細胞を１０分間放置してから、９ｃｍ皿に３
×１０6細胞をプレーティングした。Ｇ４１８（正味量
１５０〜２００〜２００μｇ／ｍｌ、GIBCO BRL、Rockv
ille, MD）を３６〜４８時間後に添加し、９〜１０日間
選択した。ｒａｇ１／ｇｆｐＥＳクローンは、フォワー
ドプライマー（ｎｅｏ１：５’−ＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡ
ＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣＧＣＴＣＣＣＧＡＴＴ−３’）
（配列番号２）及びリバースプライマー（コントロール
２；５’−ＣＴＧＧＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＣＧＧＣＴＣ
ＡＧＧＣＡＡＴＣＴＣ−３’）（配列番号３）を用いる
ＰＣＲによって同定した。陽性ＥＳクローンはさらに精
製したゲノムＤＮＡを用いたサザンブロット分析により
調べた。ＤＮＡ試料はBamHI及びNcoIで二重切断し、ア
ガロースゲル電気泳動で分離した。ナイロン膜にトラン
スファーした後、ブロットをＡＭプローブ又は３ＵＴプ
ローブの何れかとハイブリダイズさせた。ＡＭ及び３Ｕ
Ｔプローブは各々、１９３３ｂｐ〜３１１５ｂｐの領域
及び３４８９ｂｐ〜４７０６ｂｐの領域に対応するｒａ
ｇ１ｃＤＮＡから調製した。ＤＮＡ断片はAlkPhos DIRE
CT（Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, E
ngland）を取扱説明書に従って使用して可視化した。
【００３１】（ｃ）ＥＧＦＰノックインマウスの樹立 一つの変異ｒａｇ１対立遺伝子を含む４種のＥＳクロー
ンをＩＣＲマウスの胚盤胞に注入した。雄キメラマウス
をＣ５７ＢＬ／６雌とつがいにし、ＥＳバックグラウン
ドの胚芽系列の伝達を子孫の毛色で判定した。先ず、３
系統のＦ１マウスを得た。Ｆ１マウス同士を交配するこ
とにより、Ｆ２マウスを作成した。ヘテロ接合又はホモ
接合の変異を有する子孫を尾部ゲノムＤＮＡを用いたサ
ザンブロット分析により判定した。Ｆ２子孫の遺伝子型
は、フォワードプライマー（ＲＡＧ１−５−２；５’−
ＡＧＧＴＡＧＣＴＴＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧＧ−３’）
（配列番号４）及びリバースプライマーＲ６及びＧＦＰ
３（Han,S.他, 1996, Science 274, 2094）を用いてゲ
ノムＰＣＲによりスクリーニングした。
ンをＩＣＲマウスの胚盤胞に注入した。雄キメラマウス
をＣ５７ＢＬ／６雌とつがいにし、ＥＳバックグラウン
ドの胚芽系列の伝達を子孫の毛色で判定した。先ず、３
系統のＦ１マウスを得た。Ｆ１マウス同士を交配するこ
とにより、Ｆ２マウスを作成した。ヘテロ接合又はホモ
接合の変異を有する子孫を尾部ゲノムＤＮＡを用いたサ
ザンブロット分析により判定した。Ｆ２子孫の遺伝子型
は、フォワードプライマー（ＲＡＧ１−５−２；５’−
ＡＧＧＴＡＧＣＴＴＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧＧ−３’）
（配列番号４）及びリバースプライマーＲ６及びＧＦＰ
３（Han,S.他, 1996, Science 274, 2094）を用いてゲ
ノムＰＣＲによりスクリーニングした。
【００３２】（ｄ）フローサイトメトリー分析 マウス（生後の週齢は様々）の骨髄及び脾臓由来の単一
細胞懸濁物を定法に従って調製した。表面染色は以下の
モノクローナル抗体を用いて行った；ＰＥ−抗マウスＢ
２２０（ＲＡ３−６Ｂ２、Pharmingen, San Diego, C
A）；ビオチン標識−抗−ｍＣＤ４３（Ｓ７）；ビオチ
ン標識−抗−マウスｌｇＭ（Ｒ６−６０．２，Pharming
en）；ビオチン標識−抗−マウスＣＤ５（５３−７．３
（Pharmingen）。ストレプトアビジン−ＲＥＤ６７０
（GIBCO BRL, Rockville, MD）をビオチン化抗体と組み
合わせて二次抗体として使用した。データはＦＡＣＳｃ
ａｎで回収し、Cell Quest Softwareを用いて解析した
（Becton Dickinson, San Jose,CA）。
細胞懸濁物を定法に従って調製した。表面染色は以下の
モノクローナル抗体を用いて行った；ＰＥ−抗マウスＢ
２２０（ＲＡ３−６Ｂ２、Pharmingen, San Diego, C
A）；ビオチン標識−抗−ｍＣＤ４３（Ｓ７）；ビオチ
ン標識−抗−マウスｌｇＭ（Ｒ６−６０．２，Pharming
en）；ビオチン標識−抗−マウスＣＤ５（５３−７．３
（Pharmingen）。ストレプトアビジン−ＲＥＤ６７０
（GIBCO BRL, Rockville, MD）をビオチン化抗体と組み
合わせて二次抗体として使用した。データはＦＡＣＳｃ
ａｎで回収し、Cell Quest Softwareを用いて解析した
（Becton Dickinson, San Jose,CA）。
【００３３】（ｅ）全ＲＮＡの調製及びＲＴ（逆転写）
−ＰＣＲ 骨髄のＢ２２０陽性細胞を磁気細胞分離機ＭＡＣＳ（Mi
ltenyi Biotec, Auburn, CA）を用いて単離した。マイ
クロビーズをモノクローナル抗体ＲＡ３−６Ｂ２と混合
した。Ｂ２２０陽性細胞をＦＡＣＳｖａｎｔａｇｅ（Be
cton Dickinson）によりＧＦＰ陽性または陰性のフラク
ションに分別した。Ｔｈｙ１．２Ｄｙｎａｂｅａｄｓ
（登録商標）（ＤＹＮＡＬ（登録商標）, Oslo, Norwa
y）によりＴ細胞を除去した後、細胞をＰＥ−Ｂ２２０
で染色し、ＧＦＰ陽性又は陰性のフラクションに分別し
た。全ＲＮＡをRneasy Mini Kit（QIAGEN, Valencia, C
A）を用いて分別した細胞（０．４〜２．０×１０5）か
ら調製し、逆転写をGeneAmp（PE Applied Biosystems,
Foster City, CA）を用いて行った。ＲＴ−ＰＣＲのた
めに、ｃＤＮＡを、AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ（P
E Applied Biosystems）を用いて、９５℃で９分間、９
４℃で１．５分間、６０℃で１．５分間及び７２℃で２
分間の１サイクル、続いて、９４℃で４５秒間、６０℃
で４５秒間及び７２℃で４５秒間の３５、４０又は４５
サイクルで増幅した。ｃＤＮＡを、ｒａｇ１遺伝子につ
いてはセンスＦ３及びアンチセンスＲ６（Han,S.他, 19
96, Science 274, 2094）、ｇｆｐ遺伝子についてはセ
ンスＦ３及びアンチセンス（ＧＦＰ３；５’−ＧＣＴＣ
ＡＧＧＴＡＧＴＧＧＴＴＧＴＣＧＧ−３’）（配列番号
５）、ｈｐｒｔ遺伝子についてはセンス（ＨＰＲＴ５；
５’−ＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＧＧＡＣＣＴＣ−３’）
（配列番号６）およびアンチセンス（ＨＰＲＴ３；５’
−ＣＡＣＡＧＧＡＣＴＡＧＡＡＣＡＣＣＴＧＣ−３’）
（配列番号７）により増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を
１．５％アガロースゲルで分離し、ｒａｇ１プラスミド
ＤＮＡ又は標的構築物から増幅した同種のｃＤＮＡとハ
イブリダイズさせた。
−ＰＣＲ 骨髄のＢ２２０陽性細胞を磁気細胞分離機ＭＡＣＳ（Mi
ltenyi Biotec, Auburn, CA）を用いて単離した。マイ
クロビーズをモノクローナル抗体ＲＡ３−６Ｂ２と混合
した。Ｂ２２０陽性細胞をＦＡＣＳｖａｎｔａｇｅ（Be
cton Dickinson）によりＧＦＰ陽性または陰性のフラク
ションに分別した。Ｔｈｙ１．２Ｄｙｎａｂｅａｄｓ
（登録商標）（ＤＹＮＡＬ（登録商標）, Oslo, Norwa
y）によりＴ細胞を除去した後、細胞をＰＥ−Ｂ２２０
で染色し、ＧＦＰ陽性又は陰性のフラクションに分別し
た。全ＲＮＡをRneasy Mini Kit（QIAGEN, Valencia, C
A）を用いて分別した細胞（０．４〜２．０×１０5）か
ら調製し、逆転写をGeneAmp（PE Applied Biosystems,
Foster City, CA）を用いて行った。ＲＴ−ＰＣＲのた
めに、ｃＤＮＡを、AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ（P
E Applied Biosystems）を用いて、９５℃で９分間、９
４℃で１．５分間、６０℃で１．５分間及び７２℃で２
分間の１サイクル、続いて、９４℃で４５秒間、６０℃
で４５秒間及び７２℃で４５秒間の３５、４０又は４５
サイクルで増幅した。ｃＤＮＡを、ｒａｇ１遺伝子につ
いてはセンスＦ３及びアンチセンスＲ６（Han,S.他, 19
96, Science 274, 2094）、ｇｆｐ遺伝子についてはセ
ンスＦ３及びアンチセンス（ＧＦＰ３；５’−ＧＣＴＣ
ＡＧＧＴＡＧＴＧＧＴＴＧＴＣＧＧ−３’）（配列番号
５）、ｈｐｒｔ遺伝子についてはセンス（ＨＰＲＴ５；
５’−ＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＧＧＡＣＣＴＣ−３’）
（配列番号６）およびアンチセンス（ＨＰＲＴ３；５’
−ＣＡＣＡＧＧＡＣＴＡＧＡＡＣＡＣＣＴＧＣ−３’）
（配列番号７）により増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を
１．５％アガロースゲルで分離し、ｒａｇ１プラスミド
ＤＮＡ又は標的構築物から増幅した同種のｃＤＮＡとハ
イブリダイズさせた。
【００３４】（ｆ）ライゲーション仲介ＰＣＲ（ＬＭ−
ＰＣＲ） ＬＭ−ＰＣＲのために、分別した細胞（０．５〜１×１
０6細胞）から定法に従いゲノムＤＮＡをＳＤＳ／プロ
テアーゼ消化及びフェノール／クロロホルム抽出により
粗精製した。ＤＮＡを定法に従い２０ｐＭでＢＷリンカ
ーにライゲーションした（Schlissel,M.他、1993, Gene
s Dev. 7, 2520）。ＰＣＲはAmpliTaq Gold DNAポリメ
ラーゼを使用して行った。ＰＣＲの第一工程では、リン
カープライマーＢＷ−１Ｈ及びＭｕＯ２を使用し、続い
てネスティッドＰＣＲではＢＷ−１Ｈ及びＭｕＯを使用
した。試料を、９５℃で９分間、９４℃で１．５分間、
６６℃で１．５分間及び７２℃で２分間の１サイクル、
続いて、９４℃で４０秒間、６６℃で４０秒間及び７２
℃で１分間の２０サイクル、そして最後に７２℃で１０
分間の伸長反応で増幅した。１μｌのアリコートを第２
サイクルで追加の４０サイクルのネスティッドＰＣＲの
ために使用した。ＰＣＲ試料をアガロースゲル上で電気
泳動により分離し、ナイロン膜に移し、それを、ＩｇＭ
遺伝子のマウスゲノム領域を有するプラスミドＤＮＡを
用いてフォワードプライマー（ＬＭＰＣＲ１；５’−Ａ
ＴＣＣＴＡＣＡＧＡＴＧＧＧＣＣＣ−３’）（配列番号
８）及びリバースプライマー（ＬＭＰＣＲ２；５’−Ｃ
ＴＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＣＣＴＴＡ−３’）（配列番号
９）のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせた。プローブは
プライマーＭｕＯ及びＪＨ１の間の内部配列にハイブリ
ダイズする。ＰＣＲ条件はＣＤ１４特異的プライマーを
用いてモニターした。
ＰＣＲ） ＬＭ−ＰＣＲのために、分別した細胞（０．５〜１×１
０6細胞）から定法に従いゲノムＤＮＡをＳＤＳ／プロ
テアーゼ消化及びフェノール／クロロホルム抽出により
粗精製した。ＤＮＡを定法に従い２０ｐＭでＢＷリンカ
ーにライゲーションした（Schlissel,M.他、1993, Gene
s Dev. 7, 2520）。ＰＣＲはAmpliTaq Gold DNAポリメ
ラーゼを使用して行った。ＰＣＲの第一工程では、リン
カープライマーＢＷ−１Ｈ及びＭｕＯ２を使用し、続い
てネスティッドＰＣＲではＢＷ−１Ｈ及びＭｕＯを使用
した。試料を、９５℃で９分間、９４℃で１．５分間、
６６℃で１．５分間及び７２℃で２分間の１サイクル、
続いて、９４℃で４０秒間、６６℃で４０秒間及び７２
℃で１分間の２０サイクル、そして最後に７２℃で１０
分間の伸長反応で増幅した。１μｌのアリコートを第２
サイクルで追加の４０サイクルのネスティッドＰＣＲの
ために使用した。ＰＣＲ試料をアガロースゲル上で電気
泳動により分離し、ナイロン膜に移し、それを、ＩｇＭ
遺伝子のマウスゲノム領域を有するプラスミドＤＮＡを
用いてフォワードプライマー（ＬＭＰＣＲ１；５’−Ａ
ＴＣＣＴＡＣＡＧＡＴＧＧＧＣＣＣ−３’）（配列番号
８）及びリバースプライマー（ＬＭＰＣＲ２；５’−Ｃ
ＴＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＣＣＴＴＡ−３’）（配列番号
９）のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせた。プローブは
プライマーＭｕＯ及びＪＨ１の間の内部配列にハイブリ
ダイズする。ＰＣＲ条件はＣＤ１４特異的プライマーを
用いてモニターした。
【００３５】２．結果と考察 （Ａ）ｒａｇ１遺伝子にＧＦＰをノックインさせたマウ
スの作出 ｒａｇ１遺伝子の１つの内因性対立遺伝子のコード領域
中にｇｆｐ遺伝子をノックインさせると（図１）、リン
パ系列細胞で同一の組織特異性パターンおよび細胞周期
段階依存性パターンにおいてＧＦＰとＲＡＧ１の両方を
発現する可能性がある。ＰＣＲによりスクリーニングし
た２系統のマウスをサザン分析により確認した（図
２）。３ＵＴプローブとＡＭプローブはNcoI／BamHI消
化による６．１ｋｂのバンドとともに観察されたように
ｒａｇ１遺伝子中への適切な挿入を示した。野生型ＤＮ
Ａは８．２ｋｂのバンド上にｒａｇ１遺伝子を示した。
ＰＣＲによりｒａｇ１遺伝子のコード領域へのｇｆｐ遺
伝子の挿入を確認した（図１Ｃ）。内因性５１５ｂｐバ
ンドはホモ接合ｇｆｐ／ｇｆｐマウスでは検出されなか
ったが、ヘテロ接合マウスでは内因性５１５ｂｐのバン
ドと標的化された６２６ｂｐの両方を示した。ＲＴ−Ｐ
ＣＲによりホモ接合ｇｆｐ／ｇｆｐマウスがｒａｇ１遺
伝子のｍＲＮＡを発現しない代りにｇｆｐ遺伝子のｍＲ
ＮＡを発現することを確認した（図１Ｄ）。従って、こ
れらのマウス系統はｒａｇ１が欠損しており、ｇｆｐ遺
伝子で置き換わっていることが実証された。
スの作出 ｒａｇ１遺伝子の１つの内因性対立遺伝子のコード領域
中にｇｆｐ遺伝子をノックインさせると（図１）、リン
パ系列細胞で同一の組織特異性パターンおよび細胞周期
段階依存性パターンにおいてＧＦＰとＲＡＧ１の両方を
発現する可能性がある。ＰＣＲによりスクリーニングし
た２系統のマウスをサザン分析により確認した（図
２）。３ＵＴプローブとＡＭプローブはNcoI／BamHI消
化による６．１ｋｂのバンドとともに観察されたように
ｒａｇ１遺伝子中への適切な挿入を示した。野生型ＤＮ
Ａは８．２ｋｂのバンド上にｒａｇ１遺伝子を示した。
ＰＣＲによりｒａｇ１遺伝子のコード領域へのｇｆｐ遺
伝子の挿入を確認した（図１Ｃ）。内因性５１５ｂｐバ
ンドはホモ接合ｇｆｐ／ｇｆｐマウスでは検出されなか
ったが、ヘテロ接合マウスでは内因性５１５ｂｐのバン
ドと標的化された６２６ｂｐの両方を示した。ＲＴ−Ｐ
ＣＲによりホモ接合ｇｆｐ／ｇｆｐマウスがｒａｇ１遺
伝子のｍＲＮＡを発現しない代りにｇｆｐ遺伝子のｍＲ
ＮＡを発現することを確認した（図１Ｄ）。従って、こ
れらのマウス系統はｒａｇ１が欠損しており、ｇｆｐ遺
伝子で置き換わっていることが実証された。
【００３６】Ｂ２２０+細胞はプロ−Ｂ（Ｇ２；Ｂ２２
０+ＣＤ４３+）、プレ−Ｂ（Ｇ３；Ｂ２２０+ＣＤ４
３-）、及び未成熟又は再循環Ｂ細胞（Ｇ４；Ｂ２２０
highＣＤ４３-）から構成される（図２Ａ）。ヘテロ接
合ｒａｇ１＋／ｇｆｐ＋マウスの骨髄は正常の比率のＢ
細胞発生［Ｇ２（２０％）、Ｇ３（５０％）及びＧ４
（２０％）］を示している。ＧＦＰ陽性細胞は１．３９
％（Ｇ１）、６５．６３％（Ｇ２）、８９．６８％（Ｇ
３）及び５５．２５％（Ｇ４）である（図２Ａ）。次
に、ＧＦＰ陽性細胞がＩｇ遺伝子の再構成を仲介する能
力について調べた。ヘテロ接合のｒａｇ１+／ｇｆｐ+マ
ウスのＢ２２０+細胞をＢＭ+及びＢＭ-としてＧＦＰに
より分離した。内因性ｒａｇ１ｍＲＮＡはＧＦＰ+細胞
で多量に検出された（図２Ｂ）。リコンビナーゼ活性は
ＧＦＰ+細胞及びＧＦＰ-細胞のＬＭ−ＰＣＲにより測定
した（図２Ｃ）。ＤＪ再構成の発生を示すＰＣＲ産物は
様々なサイズでＧＦＰ+細胞で検出された。ＢＭ-細胞お
よびＧＦＰ-Ｂ２２０+脾臓細胞はシグナルを示さなかっ
た。野生型同腹子由来の骨髄細胞はＤＪ再構成の単一バ
ンドを示したが、相同的に置換された（ｇｆｐ+／ｇｆ
ｐ+）マウスは再構成を示さなかった。これらの結果
は、ＧＦＰ発現が内因性ｒａｇ１プロモーターの下で制
御されていることを示し、ＧＦＰ-細胞はＩｇ遺伝子再
構成を経ていることが示唆される。
０+ＣＤ４３+）、プレ−Ｂ（Ｇ３；Ｂ２２０+ＣＤ４
３-）、及び未成熟又は再循環Ｂ細胞（Ｇ４；Ｂ２２０
highＣＤ４３-）から構成される（図２Ａ）。ヘテロ接
合ｒａｇ１＋／ｇｆｐ＋マウスの骨髄は正常の比率のＢ
細胞発生［Ｇ２（２０％）、Ｇ３（５０％）及びＧ４
（２０％）］を示している。ＧＦＰ陽性細胞は１．３９
％（Ｇ１）、６５．６３％（Ｇ２）、８９．６８％（Ｇ
３）及び５５．２５％（Ｇ４）である（図２Ａ）。次
に、ＧＦＰ陽性細胞がＩｇ遺伝子の再構成を仲介する能
力について調べた。ヘテロ接合のｒａｇ１+／ｇｆｐ+マ
ウスのＢ２２０+細胞をＢＭ+及びＢＭ-としてＧＦＰに
より分離した。内因性ｒａｇ１ｍＲＮＡはＧＦＰ+細胞
で多量に検出された（図２Ｂ）。リコンビナーゼ活性は
ＧＦＰ+細胞及びＧＦＰ-細胞のＬＭ−ＰＣＲにより測定
した（図２Ｃ）。ＤＪ再構成の発生を示すＰＣＲ産物は
様々なサイズでＧＦＰ+細胞で検出された。ＢＭ-細胞お
よびＧＦＰ-Ｂ２２０+脾臓細胞はシグナルを示さなかっ
た。野生型同腹子由来の骨髄細胞はＤＪ再構成の単一バ
ンドを示したが、相同的に置換された（ｇｆｐ+／ｇｆ
ｐ+）マウスは再構成を示さなかった。これらの結果
は、ＧＦＰ発現が内因性ｒａｇ１プロモーターの下で制
御されていることを示し、ＧＦＰ-細胞はＩｇ遺伝子再
構成を経ていることが示唆される。
【００３７】（Ｂ）腹腔Ｂ−１細胞は正常マウスでＲＡ
Ｇ１シグナルを発現しない Ｂ−１細胞におけるＲＡＧ１の発現を調べた。腹腔Ｂ細
胞は２種類の細胞：Ｂ２２０lowＩｇＭhighＣＤ５+（Ｂ
−１ａ又はＢ−１）細胞及びＢ２２０highＩｇＭlowＣ
Ｄ５-（Ｂ−２）細胞から構成される。ＲＡＧ１／ＧＦ
ＰはＢ−２細胞で検出される（図３Ａ）。Ｂ−２細胞
は、骨髄から新たに再構成されたＢ細胞移入物を多分継
続的に供給され、それは検出レベル以下でＧＦＰタンパ
ク質崩壊以前に検出される。これらの新たに再集団を構
成する細胞は腹腔におけるＢ−２プールの約１５〜４５
％を構成する。Ｂ−２集団におけるＧＦＰ+細胞はｒａ
ｇ１又はｇｆｐ遺伝子の転写物を発現せず（データは示
さず）、ＲＡＧ１／ＧＦＰのシグナルは、ＲＴ−ＰＣＲ
による測定よりも新たに生成したＢ細胞をより感度よく
追跡できる。Ｂ−１細胞中にはＲＡＧ１／ＧＦＰ+細胞
が存在しない（１．５％未満）。これは、マウスが新生
初期段階にあり、検出限界未満までＧＦＰタンパク質を
崩壊するのに十分な期間に渡り腹腔におけるｒａｇ１遺
伝子の発現なしに維持される場合に、Ｂ−１プールが多
分形成されるという考え方と一致する。マウスＩｇＶH
及びＩｇＶL（Qin,X他、Nussenzweig. 1999. Nature 39
7:355）のイディオタイプ陰性Ｂ−１細胞においてｒａ
ｇ１ｍＲＮＡが増加していることが実証されているの
で、非常に少数のＢ−１細胞がＲＡＧ１／ＧＦＰ発現を
示すという知見は意外である。Ｂ−１細胞の働きを制御
するために同一の抗体を使用した結果、細胞はＣＤ５を
も示し、６週齢のマウス由来の腹腔Ｂ−１細胞はＳＰＦ
条件下で非常に低レベルのＲＡＧ１を示した（図３
Ａ）。Ｂ−１細胞を自己補充によりプールで維持し、腹
腔ではリコンビナーゼ活性は減少していた。
Ｇ１シグナルを発現しない Ｂ−１細胞におけるＲＡＧ１の発現を調べた。腹腔Ｂ細
胞は２種類の細胞：Ｂ２２０lowＩｇＭhighＣＤ５+（Ｂ
−１ａ又はＢ−１）細胞及びＢ２２０highＩｇＭlowＣ
Ｄ５-（Ｂ−２）細胞から構成される。ＲＡＧ１／ＧＦ
ＰはＢ−２細胞で検出される（図３Ａ）。Ｂ−２細胞
は、骨髄から新たに再構成されたＢ細胞移入物を多分継
続的に供給され、それは検出レベル以下でＧＦＰタンパ
ク質崩壊以前に検出される。これらの新たに再集団を構
成する細胞は腹腔におけるＢ−２プールの約１５〜４５
％を構成する。Ｂ−２集団におけるＧＦＰ+細胞はｒａ
ｇ１又はｇｆｐ遺伝子の転写物を発現せず（データは示
さず）、ＲＡＧ１／ＧＦＰのシグナルは、ＲＴ−ＰＣＲ
による測定よりも新たに生成したＢ細胞をより感度よく
追跡できる。Ｂ−１細胞中にはＲＡＧ１／ＧＦＰ+細胞
が存在しない（１．５％未満）。これは、マウスが新生
初期段階にあり、検出限界未満までＧＦＰタンパク質を
崩壊するのに十分な期間に渡り腹腔におけるｒａｇ１遺
伝子の発現なしに維持される場合に、Ｂ−１プールが多
分形成されるという考え方と一致する。マウスＩｇＶH
及びＩｇＶL（Qin,X他、Nussenzweig. 1999. Nature 39
7:355）のイディオタイプ陰性Ｂ−１細胞においてｒａ
ｇ１ｍＲＮＡが増加していることが実証されているの
で、非常に少数のＢ−１細胞がＲＡＧ１／ＧＦＰ発現を
示すという知見は意外である。Ｂ−１細胞の働きを制御
するために同一の抗体を使用した結果、細胞はＣＤ５を
も示し、６週齢のマウス由来の腹腔Ｂ−１細胞はＳＰＦ
条件下で非常に低レベルのＲＡＧ１を示した（図３
Ａ）。Ｂ−１細胞を自己補充によりプールで維持し、腹
腔ではリコンビナーゼ活性は減少していた。
【００３８】老齢マウス由来のＢ−１細胞は、新たに生
成したＢ−１細胞の再集団化又はＧＣ領域で見られるよ
うな二次的Ｉｇ遺伝子再構成の活性化の何れかにより、
Ｂ−１プールの加齢の間にＲＡＧ１の誘導を示している
可能性がある（Han,S.,他、Science 274:2094、及びHik
ida,M.,他、Science 274:2092）。そこで、Ｂ−１細胞
におけるＲＡＧ１／ＧＦＰ発現の制御に及ぼす加齢の影
響を評価した。６月齢のマウス由来の腹腔Ｂ−１細胞は
ＲＡＧ１／ＧＦＰの誘導を示さなかった（図３Ｂ）。Ｂ
−２プールにおけるＲＡＧ１／ＧＦＰ発現は若年マウス
では３３．１５％と検出されるが、ＲＡＧ１／ＧＦＰ発
現は若年マウス及び老年マウスの両方の腹腔Ｂ−１細胞
では存在しない。ＲＴ−ＰＣＲではＢ−１細胞中にはｒ
ａｇ１転写物もｒａｇ２転写物も検出されなかった。Ｌ
ＰＳの投与により腹腔Ｂ−１細胞は活性化し、トランス
ジェニックマウスモデルにおける自己抗体産生又は自己
免疫症状の悪化が誘導された（Murakami, M.,他、J.Ex
p.Med. 180:111）。ＬＰＳの経口投与により腹腔細胞は
コントロールマウスの約５６％増加した（３．２０から
４．９８）。しかしながら、Ｂ−１細胞でＲＡＧ１／Ｇ
ＦＰ発現の増加は検出されなかった（表１）。さらに、
腹腔への直接投与によってＲＡＧ１／ＧＦＰ発現に対す
るＬＰＳの作用を調べた。ＬＰＳによる刺激はインビボ
で腹腔Ｂ−１細胞におけるＲＡＧ１／ＧＦＰの再発現を
誘導しなかったが、Ｂ−２集団におけるＧＦＰ+細胞の
わずかな増加が検出された（ＬＰＳの経口投与で１７．
４８％から２０．０４％、インビボ腹腔内投与で１０．
８５％から１２．１６％）。これらの結果は、Ｉｇ遺伝
子組換えは正常マウスでは抑制されているので、自己補
充により維持される腹腔Ｂ−１細胞プールが抗体特異性
において多分安定であることを示唆している。
成したＢ−１細胞の再集団化又はＧＣ領域で見られるよ
うな二次的Ｉｇ遺伝子再構成の活性化の何れかにより、
Ｂ−１プールの加齢の間にＲＡＧ１の誘導を示している
可能性がある（Han,S.,他、Science 274:2094、及びHik
ida,M.,他、Science 274:2092）。そこで、Ｂ−１細胞
におけるＲＡＧ１／ＧＦＰ発現の制御に及ぼす加齢の影
響を評価した。６月齢のマウス由来の腹腔Ｂ−１細胞は
ＲＡＧ１／ＧＦＰの誘導を示さなかった（図３Ｂ）。Ｂ
−２プールにおけるＲＡＧ１／ＧＦＰ発現は若年マウス
では３３．１５％と検出されるが、ＲＡＧ１／ＧＦＰ発
現は若年マウス及び老年マウスの両方の腹腔Ｂ−１細胞
では存在しない。ＲＴ−ＰＣＲではＢ−１細胞中にはｒ
ａｇ１転写物もｒａｇ２転写物も検出されなかった。Ｌ
ＰＳの投与により腹腔Ｂ−１細胞は活性化し、トランス
ジェニックマウスモデルにおける自己抗体産生又は自己
免疫症状の悪化が誘導された（Murakami, M.,他、J.Ex
p.Med. 180:111）。ＬＰＳの経口投与により腹腔細胞は
コントロールマウスの約５６％増加した（３．２０から
４．９８）。しかしながら、Ｂ−１細胞でＲＡＧ１／Ｇ
ＦＰ発現の増加は検出されなかった（表１）。さらに、
腹腔への直接投与によってＲＡＧ１／ＧＦＰ発現に対す
るＬＰＳの作用を調べた。ＬＰＳによる刺激はインビボ
で腹腔Ｂ−１細胞におけるＲＡＧ１／ＧＦＰの再発現を
誘導しなかったが、Ｂ−２集団におけるＧＦＰ+細胞の
わずかな増加が検出された（ＬＰＳの経口投与で１７．
４８％から２０．０４％、インビボ腹腔内投与で１０．
８５％から１２．１６％）。これらの結果は、Ｉｇ遺伝
子組換えは正常マウスでは抑制されているので、自己補
充により維持される腹腔Ｂ−１細胞プールが抗体特異性
において多分安定であることを示唆している。
【００３９】
【表１】
【００４０】表１の脚注： ａ： ＬＰＳの経口投与及び腹腔内投与は既報の通り行
った（Murakami,M.,他、J.Exp.Med.180:111）。効果は
ＰＢＳ投与のコントロールと比較して腹膜細胞の増加に
より各マウスで確認した。結果は、平均と１×Ｓ．Ｅ．
（ある場合とない場合が）で示した。ＲＡＧ１／ＧＦＰ
陽性細胞の百分率を材料と方法に記載したように腹腔Ｂ
−１細胞とＢ−２細胞をゲートした後に示す。 ｂ： 腹腔から回収された細胞の数（×１０6）
った（Murakami,M.,他、J.Exp.Med.180:111）。効果は
ＰＢＳ投与のコントロールと比較して腹膜細胞の増加に
より各マウスで確認した。結果は、平均と１×Ｓ．Ｅ．
（ある場合とない場合が）で示した。ＲＡＧ１／ＧＦＰ
陽性細胞の百分率を材料と方法に記載したように腹腔Ｂ
−１細胞とＢ−２細胞をゲートした後に示す。 ｂ： 腹腔から回収された細胞の数（×１０6）
【００４１】ｇｆｐトランスジェニック及びノックイン
マウスを用いて成熟Ｂ細胞におけるＲＡＧ２発現の同様
の追跡実験が報告されている（Yu,W.,他、Nature 400:6
82、Yu,W.,他、Science 285:1080、及びMonroe,R.,他、
Immunity 11:201）。これらマウスは、ＲＡＧ２が脾臓
の未成熟Ｂ細胞ではより低いレベルで見られることを示
したが、抗原投与によりＲＡＧ２の再発現を容易には誘
導されない。様々なＢ細胞活性化剤を用いてインビトロ
でＢ−１細胞を刺激した後にＲＡＧ１／ＧＦＰを調べた
が、試みは全て検出レベルでのＲＡＧ１の誘導について
失敗に終わった（データは示さず）。これらの結果は、
ＲＡＧの頻繁な発現及びＴ依存性Ａｇにより刺激による
ＧＣにおける二次的Ｉｇ遺伝子再構成の誘導に関する最
近の知見とは一致しない（Han,S.,他、Science 274:209
4及びHikida,M.,他、Science 274:2092）。
マウスを用いて成熟Ｂ細胞におけるＲＡＧ２発現の同様
の追跡実験が報告されている（Yu,W.,他、Nature 400:6
82、Yu,W.,他、Science 285:1080、及びMonroe,R.,他、
Immunity 11:201）。これらマウスは、ＲＡＧ２が脾臓
の未成熟Ｂ細胞ではより低いレベルで見られることを示
したが、抗原投与によりＲＡＧ２の再発現を容易には誘
導されない。様々なＢ細胞活性化剤を用いてインビトロ
でＢ−１細胞を刺激した後にＲＡＧ１／ＧＦＰを調べた
が、試みは全て検出レベルでのＲＡＧ１の誘導について
失敗に終わった（データは示さず）。これらの結果は、
ＲＡＧの頻繁な発現及びＴ依存性Ａｇにより刺激による
ＧＣにおける二次的Ｉｇ遺伝子再構成の誘導に関する最
近の知見とは一致しない（Han,S.,他、Science 274:209
4及びHikida,M.,他、Science 274:2092）。
【００４２】ｒａｇ１／ｇｆｐノックインマウスは、シ
ングルコピーのｒａｇ１−プロモーターがＲＡＧ１発現
Ｂ−１細胞をインビボでマークするのに十分なＧＦＰの
発現を仲介することを実証した。これらの結果は、腹腔
Ｂ−１細胞におけるｒａｇ１遺伝子のアップレギュレー
ションに関する以前の報告とは対照的な重要な情報であ
る（Qin,X.F.,他、Nature 397:355）。
ングルコピーのｒａｇ１−プロモーターがＲＡＧ１発現
Ｂ−１細胞をインビボでマークするのに十分なＧＦＰの
発現を仲介することを実証した。これらの結果は、腹腔
Ｂ−１細胞におけるｒａｇ１遺伝子のアップレギュレー
ションに関する以前の報告とは対照的な重要な情報であ
る（Qin,X.F.,他、Nature 397:355）。
【００４３】
【発明の効果】本発明により、自己免疫マウスのＢ−１
細胞の抗体特異性獲得の機構を解析するのに有用なノッ
クイン非ヒト哺乳動物が提供される。本発明のノックイ
ン非ヒト哺乳動物は、内因性ｒａｇ１遺伝子の発現と同
様に導入遺伝子を発現することができ、またその検出の
感度が高い。本発明のノックイン非ヒト哺乳動物では、
（１）ＧＦＰの発現が安定で検出するまでの蓄積効果と
して十分な発現を維持できること、並びに（２）導入遺
伝子の５’プロモーター領域には１ヌクレオチドだけの
変異でベクターを構築することができたために、発現レ
ベルの維持を達成できていると考えられる。
細胞の抗体特異性獲得の機構を解析するのに有用なノッ
クイン非ヒト哺乳動物が提供される。本発明のノックイ
ン非ヒト哺乳動物は、内因性ｒａｇ１遺伝子の発現と同
様に導入遺伝子を発現することができ、またその検出の
感度が高い。本発明のノックイン非ヒト哺乳動物では、
（１）ＧＦＰの発現が安定で検出するまでの蓄積効果と
して十分な発現を維持できること、並びに（２）導入遺
伝子の５’プロモーター領域には１ヌクレオチドだけの
変異でベクターを構築することができたために、発現レ
ベルの維持を達成できていると考えられる。
【００４４】また、本発明のノックイン非ヒト哺乳動物
が得られる以前は、末梢リンパ組織でのＲＡＧ１及びＲ
ＡＧ２の発現は、抗体による染色とＲＴ−ＰＣＲ法で調
べられていた。しかし、本発明のノックインマウスでは
これらの従来の知見とは異なる知見が得られている。例
えば、従来の知見によれば、マウスを免疫すると脾臓に
胚中心が形成され、その領域では特にＲＡＧ１、ＲＡＧ
２の発現が上昇し、免疫グロブリン遺伝子の再構成が再
び起こるということが定説であった。しかし、本発明の
ノックインマウスでは、このようなＲＡＧ１の胚中心領
域での発現上昇は観察されない。本発明のノックインマ
ウスから得られる結果は、胚中心領域でのＲＡＧ１の発
現上昇は変化しないという知見であり、従来の知見の見
直しが必要である。
が得られる以前は、末梢リンパ組織でのＲＡＧ１及びＲ
ＡＧ２の発現は、抗体による染色とＲＴ−ＰＣＲ法で調
べられていた。しかし、本発明のノックインマウスでは
これらの従来の知見とは異なる知見が得られている。例
えば、従来の知見によれば、マウスを免疫すると脾臓に
胚中心が形成され、その領域では特にＲＡＧ１、ＲＡＧ
２の発現が上昇し、免疫グロブリン遺伝子の再構成が再
び起こるということが定説であった。しかし、本発明の
ノックインマウスでは、このようなＲＡＧ１の胚中心領
域での発現上昇は観察されない。本発明のノックインマ
ウスから得られる結果は、胚中心領域でのＲＡＧ１の発
現上昇は変化しないという知見であり、従来の知見の見
直しが必要である。
【００４５】また、本発明のノックイン非ヒト哺乳動物
の細胞の分化及び発達はヘテロマウスでは正常であるこ
とが、従来のノックアウトマウスで十分に確認されてい
る。本発明のノックイン非ヒト哺乳動物では、ホモ動物
を作成することもできる。ホモ動物を使用することで、
細胞の追跡比較をより詳細に示すことも可能である。本
発明のノックイン非ヒト哺乳動物を、その他の遺伝的背
景の異なるマウス、例えば、自己免疫疾患マウスである
ＭＲＬ／ｌｐｒ、New Zealand Black（ＮＺＢ）、New Z
ealand White（ＮＺＷ）、ＢＸＳＢとのバッククロスを
行うことによりこれらのマウスのＲＡＧ１誘導の異常を
早期に検出することが可能になる。
の細胞の分化及び発達はヘテロマウスでは正常であるこ
とが、従来のノックアウトマウスで十分に確認されてい
る。本発明のノックイン非ヒト哺乳動物では、ホモ動物
を作成することもできる。ホモ動物を使用することで、
細胞の追跡比較をより詳細に示すことも可能である。本
発明のノックイン非ヒト哺乳動物を、その他の遺伝的背
景の異なるマウス、例えば、自己免疫疾患マウスである
ＭＲＬ／ｌｐｒ、New Zealand Black（ＮＺＢ）、New Z
ealand White（ＮＺＷ）、ＢＸＳＢとのバッククロスを
行うことによりこれらのマウスのＲＡＧ１誘導の異常を
早期に検出することが可能になる。
【００４６】さらにＲＡＧ１はＲＡＧ２とは異なり、脳
神経細胞での発現が報告されている。本発明のＲＡＧ１
／ＧＦＰノックインマウスでは、脳神経細胞での発現を
小脳の神経細胞を用いて検出することができ、その発現
の程度はかなり低レベルであった。神経細胞の単離を行
い発現をフローサイトメトリーで調べると発現細胞は検
出できるが、その頻度は低く、これまで脳神経細胞での
ＲＡＧ１遺伝子の機能が進展していない原因が明らかに
なった。本発明のノックイン非ヒト哺乳動物を用いるこ
とにより、高感度にＲＡＧ１発現神経細胞を検出するこ
とが可能になる。
神経細胞での発現が報告されている。本発明のＲＡＧ１
／ＧＦＰノックインマウスでは、脳神経細胞での発現を
小脳の神経細胞を用いて検出することができ、その発現
の程度はかなり低レベルであった。神経細胞の単離を行
い発現をフローサイトメトリーで調べると発現細胞は検
出できるが、その頻度は低く、これまで脳神経細胞での
ＲＡＧ１遺伝子の機能が進展していない原因が明らかに
なった。本発明のノックイン非ヒト哺乳動物を用いるこ
とにより、高感度にＲＡＧ１発現神経細胞を検出するこ
とが可能になる。
【００４７】
【配列表】SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Electric Industries,Ltd. <120> A knock in non-human mammalian animal <130> 99416MA <160> 9
【００４８】<210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a sequence around the initiation codon of ra
g 1 gene <400> 1 gcttagccaa catgg 15
g 1 gene <400> 1 gcttagccaa catgg 15
【００４９】<210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt 30
【００５０】<210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ctggcctcac taaacggctc aggcaatctc 30
【００５１】<210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 aggtagctta gccaacatgg 20
【００５２】<210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gctcaggtag ggttgtcgg 19
【００５３】<210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 gctggtgaaa aggacctc 18
【００５４】<210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 cacaggacta gaacacctgc 20
【００５５】<210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 atcctacaga tgggccc 17
【００５６】<210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 ctccacatcc tgcctta 17
【図１】図１はｒａｇ１／ｇｆｐノックインマウスの作
製を示す。図１（Ａ）ではターゲティングベクターを、
ｒａｇ１ローカスと相同組換えした対立遺伝子と比較す
る。ＤＴＡは選択用のジフテリア毒素Ａである。Ａ＋Ｔ
はＧ−ＣＳＦのｍＲＮＡ脱安定化配列であり、ｐａｕは
ＭＶＭの停止シグナルを示す（Yagi,T.,他、Anal.Bioch
em.214:77）。斜線の領域はＲＡＧ１コード領域であ
る。ＰＣＲは、ｎｅｏ１：５’−ＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡ
ＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣＧＣＴＣＣＣＧＡＴＴ−３’（配
列番号２）及びコントロール２；５’−ＣＴＧＧＣＣＴ
ＣＡＣＴＡＡＡＣＧＧＣＴＣＡＧＧＣＡＡＴＣＴＣ−
３’（配列番号３）を用いて行った。図１（Ｂ）は、ゲ
ノムＤＮＡのサザン分析を示す。ＤＮＡをNcoI及びBamH
Iで消化し、ＡＭ及び３ＵＴとハイブリダイズさせた。
プローブは野生型の８．２ｋｂと標的化された対立遺伝
子の６．１ｋｂの位置にバンドを示す。図１（Ｃ）は、
マウス尾ＤＮＡのＰＣＲを示す。ゲノムＤＮＡをＲＡＧ
１−５−２、Ｒ６及びＧＦＰ３のプライマーを用いて増
幅した。正常遺伝子及び標的化対立遺伝子は、ＲＡＧ１
−５−２及びＲ６の組み合わせ（５１５ｂｐ）又はＲＡ
Ｇ１−５−２及びＧＦＰ３（６２６ｂｐ）の組み合わせ
の何れかで検出された。図１（Ｄ）は、骨髄を用いたＲ
Ｔ−ＰＣＲを示す。ＲＮＡをｃＤＮＡに転写に、ｒａｇ
１、ｇｆｐ及びｈｐｒｔのプライマーで増幅した。
製を示す。図１（Ａ）ではターゲティングベクターを、
ｒａｇ１ローカスと相同組換えした対立遺伝子と比較す
る。ＤＴＡは選択用のジフテリア毒素Ａである。Ａ＋Ｔ
はＧ−ＣＳＦのｍＲＮＡ脱安定化配列であり、ｐａｕは
ＭＶＭの停止シグナルを示す（Yagi,T.,他、Anal.Bioch
em.214:77）。斜線の領域はＲＡＧ１コード領域であ
る。ＰＣＲは、ｎｅｏ１：５’−ＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡ
ＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣＧＣＴＣＣＣＧＡＴＴ−３’（配
列番号２）及びコントロール２；５’−ＣＴＧＧＣＣＴ
ＣＡＣＴＡＡＡＣＧＧＣＴＣＡＧＧＣＡＡＴＣＴＣ−
３’（配列番号３）を用いて行った。図１（Ｂ）は、ゲ
ノムＤＮＡのサザン分析を示す。ＤＮＡをNcoI及びBamH
Iで消化し、ＡＭ及び３ＵＴとハイブリダイズさせた。
プローブは野生型の８．２ｋｂと標的化された対立遺伝
子の６．１ｋｂの位置にバンドを示す。図１（Ｃ）は、
マウス尾ＤＮＡのＰＣＲを示す。ゲノムＤＮＡをＲＡＧ
１−５−２、Ｒ６及びＧＦＰ３のプライマーを用いて増
幅した。正常遺伝子及び標的化対立遺伝子は、ＲＡＧ１
−５−２及びＲ６の組み合わせ（５１５ｂｐ）又はＲＡ
Ｇ１−５−２及びＧＦＰ３（６２６ｂｐ）の組み合わせ
の何れかで検出された。図１（Ｄ）は、骨髄を用いたＲ
Ｔ−ＰＣＲを示す。ＲＮＡをｃＤＮＡに転写に、ｒａｇ
１、ｇｆｐ及びｈｐｒｔのプライマーで増幅した。
【図２】図２はＲＡＧ１及びＤＮＡ破断のためのマーカ
ーとしてのＧＦＰ発現を示す。図２（Ａ）において、Ｇ
ＦＰは、Ｂ２２０及びＣＤ４３の発現を伴う骨髄細胞で
検出される。Ｂ２２０陰性細胞はＧＦＰを発現しない。
Ｇ３はＧ２よりも高いレベルのＧＦＰを発現する。Ｇ４
の半分はＧＦＰ陰性であった。図２（Ｂ）において、ｒ
ａｇ１及びｇｆｐのｍＲＮＡを確認した。骨髄又は脾臓
のＧＦＰ陽性細胞から単離した全ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ
により評価した。コントロールＨＰＲＴはサイクルに比
例して増加した。細胞の集団は以下の通りである：ＧＦ
Ｐ+Ｂ２２０+骨髄細胞（ＢＭ+）、ＧＦＰ-Ｂ２２０+骨
髄細胞（ＢＭ-）、ＧＦＰ-Ｂ２２０+脾臓細胞（ＳＰ
Ｌ-）。図２（Ｃ）は骨髄及び脾臓細胞におけるシグナ
ル破断のＬＭ−ＰＣＲを示す。ＤＮＡは、ＧＦＰ+Ｂ２
２０+骨髄細胞（レーン１）、ＧＦＰ-骨髄細胞（レーン
２）、ＧＦＰ-Ｂ２２０+脾臓細胞（レーン３）、野生型
マウス骨髄細胞（レーン４）、ホモ接合型ノックインマ
ウス骨髄細胞（レーン５）から精製した。
ーとしてのＧＦＰ発現を示す。図２（Ａ）において、Ｇ
ＦＰは、Ｂ２２０及びＣＤ４３の発現を伴う骨髄細胞で
検出される。Ｂ２２０陰性細胞はＧＦＰを発現しない。
Ｇ３はＧ２よりも高いレベルのＧＦＰを発現する。Ｇ４
の半分はＧＦＰ陰性であった。図２（Ｂ）において、ｒ
ａｇ１及びｇｆｐのｍＲＮＡを確認した。骨髄又は脾臓
のＧＦＰ陽性細胞から単離した全ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ
により評価した。コントロールＨＰＲＴはサイクルに比
例して増加した。細胞の集団は以下の通りである：ＧＦ
Ｐ+Ｂ２２０+骨髄細胞（ＢＭ+）、ＧＦＰ-Ｂ２２０+骨
髄細胞（ＢＭ-）、ＧＦＰ-Ｂ２２０+脾臓細胞（ＳＰ
Ｌ-）。図２（Ｃ）は骨髄及び脾臓細胞におけるシグナ
ル破断のＬＭ−ＰＣＲを示す。ＤＮＡは、ＧＦＰ+Ｂ２
２０+骨髄細胞（レーン１）、ＧＦＰ-骨髄細胞（レーン
２）、ＧＦＰ-Ｂ２２０+脾臓細胞（レーン３）、野生型
マウス骨髄細胞（レーン４）、ホモ接合型ノックインマ
ウス骨髄細胞（レーン５）から精製した。
【図３】図３は、腹腔におけるＢ−１又はＢ−２細胞の
ＧＦＰ発現を示す。図３（Ａ）では、腹腔細胞は若年マ
ウス（４〜８週齢）から単離し、Ｂ２２０、ＩｇＭ及び
ＣＤ５に対するモノクローナル抗体で染色した。Ｂ−１
及びＢ−２は、Ｂ−１細胞としてはＩｇＭhighＢ２２０
low又はＣＤ５+Ｂ２２０lowの発現でゲートし、Ｂ−２
細胞としてはＩｇＭlowＢ２２０high又はＣＤ５-Ｂ２２
０hi ghの発現でゲートした。ゲートされた細胞のＧＦＰ
を示す。数字はＧＦＰ陽性細胞の百分率を示す。図３
（Ｂ）では、若年又は老年マウスからの腹腔Ｂ−１及び
Ｂ−２細胞におけるＧＦＰ+細胞を示す。
ＧＦＰ発現を示す。図３（Ａ）では、腹腔細胞は若年マ
ウス（４〜８週齢）から単離し、Ｂ２２０、ＩｇＭ及び
ＣＤ５に対するモノクローナル抗体で染色した。Ｂ−１
及びＢ−２は、Ｂ−１細胞としてはＩｇＭhighＢ２２０
low又はＣＤ５+Ｂ２２０lowの発現でゲートし、Ｂ−２
細胞としてはＩｇＭlowＢ２２０high又はＣＤ５-Ｂ２２
０hi ghの発現でゲートした。ゲートされた細胞のＧＦＰ
を示す。数字はＧＦＰ陽性細胞の百分率を示す。図３
（Ｂ）では、若年又は老年マウスからの腹腔Ｂ−１及び
Ｂ−２細胞におけるＧＦＰ+細胞を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｑ 1/02 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 五十嵐 英哉 熊本県熊本市本荘２−２−１ 熊本大学医 学部免疫学講座内 (72)発明者 大村 孝文 熊本県熊本市本荘２−２−１ 熊本大学医 学部免疫学講座内 (72)発明者 相澤 慎一 熊本県熊本市本荘２−２−１ 熊本大学医 学部附属遺伝発生医学研究施設形態発生部 門内 (72)発明者 清田 久美子 熊本県熊本市本荘２−２−１ 熊本大学医 学部免疫学講座内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA04 DA02 EA04 FA20 GA11 HA11 HA15 HA20 4B063 QA01 QQ08 QQ79 QQ96 QR66 QS33 QX02 4B065 AA90X AA91X AB01 AC10 AC20 BA03 CA24 CA46
Claims (10)
- 【請求項１】 ｒａｇ１遺伝子中にレポーター遺伝子が
挿入されてなる導入遺伝子を有する、ノックイン非ヒト
哺乳動物。 - 【請求項２】 レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質
（ＧＦＰ）又はその変異体をコードする遺伝子である、
請求項１に記載のノックイン非ヒト哺乳動物。 - 【請求項３】 導入遺伝子が腹腔Ｂ−１細胞よりも腹腔
Ｂ−２細胞で高発現している、請求項１又は２に記載の
ノックイン非ヒト哺乳動物。 - 【請求項４】 非ヒト哺乳動物が、マウス、ラット、モ
ルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、
ブタ、ヤギ、ウシおよびサルから成る群から選ばれる非
ヒト哺乳動物である、請求項１から３の何れか１項に記
載のノックイン非ヒト哺乳動物。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のノ
ックイン非ヒト哺乳動物の作製に用いるための、ｒａｇ
１遺伝子中にレポーター遺伝子が挿入されてなる導入遺
伝子を導入した非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞。 - 【請求項６】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のノ
ックイン非ヒト哺乳動物の細胞。 - 【請求項７】 細胞が、胚性幹細胞、卵および精子から
なる群から選ばれる細胞である、請求項６に記載の細
胞。 - 【請求項８】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のノ
ックイン非ヒト哺乳動物の細胞の核。 - 【請求項９】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のノ
ックイン非ヒト哺乳動物、あるいは該動物の組織、器官
または細胞を用いて、レポーター遺伝子の発現を検出す
ることにより細胞内におけるｒａｇ１の発現状態を分析
する方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の
ノックイン非ヒト哺乳動物、或いは該動物の組織、器官
または細胞に試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の
発現を検出することを特徴とする、ＲＡＧ１タンパク質
の発現を調節する化合物のスクリーニング方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000126776A JP2001299141A (ja) | 2000-04-27 | 2000-04-27 | ノックイン非ヒト哺乳動物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000126776A JP2001299141A (ja) | 2000-04-27 | 2000-04-27 | ノックイン非ヒト哺乳動物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001299141A true JP2001299141A (ja) | 2001-10-30 |
Family
ID=18636482
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000126776A Pending JP2001299141A (ja) | 2000-04-27 | 2000-04-27 | ノックイン非ヒト哺乳動物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001299141A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006009297A1 (ja) * | 2004-07-20 | 2006-01-26 | Yasumitsu Nagao | Es細胞を用いたキメラ作製 |
-
2000
- 2000-04-27 JP JP2000126776A patent/JP2001299141A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006009297A1 (ja) * | 2004-07-20 | 2006-01-26 | Yasumitsu Nagao | Es細胞を用いたキメラ作製 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7582741B2 (en) | Conditional disruption of dicer1 in cell lines and non-human mammals | |
| JP2023104002A (ja) | エクソンヒト化マウス | |
| Giel‐Moloney et al. | Ubiquitous and uniform in vivo fluorescence in ROSA26‐EGFP BAC transgenic mice | |
| JP2010516258A (ja) | Ｃ反応性タンパク質（ｃｒｐ）ノックアウトマウス | |
| JP2001211782A (ja) | ｔｏｂ遺伝子欠損ノックアウト非ヒト哺乳動物 | |
| JP2003144141A (ja) | ＲＮＡｉ効果が増強したＥＳ細胞 | |
| US6284944B1 (en) | Gene-targeted non-human mammal with a human fad presenilin mutation and generational offspring | |
| US20020194635A1 (en) | Transgenic animals resistant to transmissible spongiform encephalopathies | |
| US6642433B1 (en) | Fgl-2 knockout mice | |
| WO1997035967A2 (en) | Transgenic organisms with altered telomerase activity | |
| JP2000515386A (ja) | Ｋｕ欠損細胞と非ヒトトランスジェニック動物 | |
| US6194633B1 (en) | Non-human animal having a functionally disrupted SLP-76 gene | |
| JP2001299141A (ja) | ノックイン非ヒト哺乳動物 | |
| US9295239B2 (en) | MO-1 conditional knock-out non-human animal and uses thereof | |
| AU741340B2 (en) | Non human transgenic animal in which the expression of the gene coding for insulin is deleted | |
| JP5046413B2 (ja) | ヒトｆａｄプレセニリン突然変異をもつ標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物および生殖による子孫 | |
| US20050229266A1 (en) | Method for producing non-human mammal RNAi phenotype using papilloma virus vector | |
| WO2006085673A1 (ja) | 無毛トランスジェニック動物 | |
| JP2002518056A (ja) | アッセイにおけるＰｅｇ３遺伝子の使用、並びに肥満、体温調節および行動障害に関連する産物 | |
| JPH1056915A (ja) | Ｌｄｌレセプター遺伝子不活性化動物 | |
| JP3483552B2 (ja) | 新規時計遺伝子プロモーター | |
| US20090007283A1 (en) | Transgenic Rodents Selectively Expressing Human B1 Bradykinin Receptor Protein | |
| US20090077680A1 (en) | Genetically Engineered and Photyped Mice and Stem Cell Clones for Producing the Same | |
| US6794147B1 (en) | Methods for identifying contraceptive compounds | |
| JP2004267002A (ja) | セネッセンスマーカープロテイン３０欠損動物、抗体およびその作製方法 |