WO2006009297A1 - Es細胞を用いたキメラ作製 - Google Patents

Es細胞を用いたキメラ作製 Download PDF

Info

Publication number
WO2006009297A1
WO2006009297A1 PCT/JP2005/013685 JP2005013685W WO2006009297A1 WO 2006009297 A1 WO2006009297 A1 WO 2006009297A1 JP 2005013685 W JP2005013685 W JP 2005013685W WO 2006009297 A1 WO2006009297 A1 WO 2006009297A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell
cells
gene
pluripotent
animal
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/013685
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yasumitsu Nagao
Takuro Horii
Original Assignee
Yasumitsu Nagao
Takuro Horii
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yasumitsu Nagao, Takuro Horii filed Critical Yasumitsu Nagao
Priority to JP2006527813A priority Critical patent/JPWO2006009297A1/ja
Priority to US11/632,896 priority patent/US20070250943A1/en
Priority to EP05767072A priority patent/EP1779724A4/en
Publication of WO2006009297A1 publication Critical patent/WO2006009297A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric animals, e.g. comprising exogenous cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a chimeric animal using pluripotent cells in which specific genes such as genes involved in germ cell formation and genes involved in the immune system are mutated or deleted.
  • chimeric mice were formed using ES cells and mated with chimeric mice in order to produce mice with modified genes such as knockout mice.
  • mice In order to produce these genetically modified mice, excellent ES cells are established, genetic modification is efficiently performed in the ES cells, and the genetically modified ES cells form a chimeric mouse. Genetic alterations made in ES cells need to be transmitted to the germline and transmitted to the next generation.
  • ES cells The establishment of ES cells depends largely on the mouse strain, and the establishment of ES cells is low, and the ES cells that have been established lose their ability to propagate to the germ line as they are subcultured. Cells should also be used without repeated passages whenever possible. This tendency was particularly significant when using inbred mice.
  • tetraploid dress cue method as a method for selectively producing chimeric mice from ES cells (Nagy A et a Development 110, 815-821 (1990)).
  • ES cells are injected into a tetraploid fertilized egg, and the tetraploid cells develop into the placenta,
  • the obtained chimeric mouse develops a disorder such as respiratory disorder or malformation and cannot survive for a long time (Eggan K et al., PNAS 98, 6209-6214 (2001)). It could not be an effective manufacturing method.
  • the present inventor has solved these problems and has developed a method for effectively producing a reproductive chimera.
  • One is the early embryo that can not form a germ cell C- of ki t mutant mice, W v / + mice and W / + is fertilized embryos obtained by the forward and reverse mating of mouse (W v / W or W / W v ) and cannot form germ cells in both sexes (sterility / infertility) Inject embryonic cells into the early embryos of mice, and create chimeric mice that have only germ cells derived from ES cells.
  • the manufacturing method see Patent Document 1.
  • the present inventors adapted mitochondria DNA and nuclear DNA by substituting mitochondria DNA of ES cells or cells of early embryos into which ES cells were injected with wild-type mitochondrial DNA.
  • a method for producing a chimeric mouse that does not cause disorders such as respiratory disorder and malformation has been developed (see Patent Document 2).
  • the ES cells to be used need to maintain their proliferation ability, undifferentiated state and differentiation ability without repeated passage, which is not efficient in terms of ES cell preparation. .
  • Patent Document 1 W 03/071869 International Publication Pamphlet
  • Patent Document 2 W0 03/072777 International Publication Pamphlet Disclosure of Invention
  • the present invention is a novel method using two or more types of cells including a pluripotent cell in which a specific gene has been mutated or deleted and the function involved in the gene has been lost, and another pluripotent cell having the function.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for producing a chimeric animal, and to produce a chimeric animal produced by the method, producing a protein or tissue of the same or a different animal, or in which a desired pluripotent cell is transmitted to the germ line.
  • the present invention provides a pluripotent cell that lacks a specific gene and loses the function involved in the gene, and the pluripotency It is intended to provide a method for establishing other pluripotent cells using cells.
  • germline chimeric mice can be efficiently produced by using ES cells and embryos derived from mice that cannot modify germ cells such as W v / W mice (W / W v mice). A method for manufacturing the same has been established.
  • ES cells used in the production of chimeric mice have a high proliferation ability, but in reality, it is not easy to establish ES cells having a high proliferation ability. However, the proliferating ability of ES cells that had been subcultured decreased, and the chimeric mouse could not be produced efficiently.
  • ES cells obtained in the past have a male XY sex chromosome, chimera mice become mostly male if ES cells contribute greatly, and the conventional method has a sex ratio of the chimeric mice that are born. I could't control it.
  • the present inventors established ES cells from mouse embryos that cannot form germ cells, and co-cultured these ES cells with cells derived from animal reproductive organs, thereby efficiently producing reproductive organs.
  • ES cells were established from the cells derived from them.
  • ES cells by establishing ES cells from mouse embryos that cannot form germ cells and injecting them into the host embryo at the same time as the desired ES cells, fertilized embryos derived from mice that cannot form the aforementioned germ cells are prepared.
  • the ability of other ES cells to proliferate can be improved by co-culturing ES cells established from mice that cannot form germ cells with other ES cells, for example, ES cells that have been genetically modified. I found what I could do.
  • ES cells established from the above-mentioned mouse embryos that cannot form germ cells are injected into other embryonic stem cells together with other ES cells, for example, genetically modified ES cells, to generate other ES cells.
  • ES cells derived from mouse embryos that have mutations in genes involved in the formation of germ cells and cannot form breeding cells and ES cells that can form germ cells When injected into an early embryo of an animal and generated, ES cells that can form germ cells are propagated to the breeding line, so that the offspring of the chimeric individual is derived from ES cells that can form the germ cells.
  • the present inventors derived from an animal having a specific gene such as an ES cell derived from an embryo such as an immunodeficient mouse or a lymphocyte-deficient mouse that is mutated or deleted and has a disorder in a function related to the gene.
  • a pluripotent cell in which a specific gene is mutated or deleted and the function involved in the gene is lost in a chimeric individual
  • the present inventors have found that cells other than those function and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • Two or more types of cells including a pluripotent cell in which a specific gene has been mutated or deleted and the function involved in the gene is lost and other pluripotent cells other than the pluripotent cell,
  • a method for producing a chimeric animal comprising injecting a host embryo.
  • Two or more types of cells including a pluripotent cell in which a specific gene was mutated or deleted and the function involved in the gene was lost and other pluripotent cells other than the pluripotent cell were co-cultured
  • [4] A chimeric animal in which a gene derived from a cell other than a pluripotent cell in which a specific gene has been mutated or deleted and the function associated with the gene is lost functions. [1] to [3] A method for producing such a chimeric animal.
  • [5] A chimeric animal in which a specific gene is mutated or deleted, and a gene corresponding to the mutated or deleted gene derived from a cell other than a pluripotent cell that has lost the function involved in the gene functions.
  • a pluripotent cell other than a pluripotent cell in which a specific gene is mutated or deleted and the function associated with the gene is lost is a cell that has undergone genetic modification [1] to [5] A method for producing any chimeric animal.
  • a specific gene has been mutated or deleted and the function involved in the gene has been lost »Other cells than the pluripotent cell have a specific gene mutated or deleted and the function that the gene is involved in Lost pluripotent cells are homologous in animal taxonomy [1] to [1
  • a pluripotent cell in which a specific gene has been mutated or deleted and the function involved in the gene has been lost is selected from the group consisting of mouse, rat, buyu, ushi, horse, hidge, goat and monkey
  • mice Other genes other than pluripotent cells that have been mutated or deleted in a specific gene and have lost the functions involved in the gene are mice, rats, buyu, ushi, horse, hidge, goat, monkey And a method for producing a chimeric animal of any one of [1] to [15], which is derived from an animal selected from the group consisting of humans.
  • a pluripotent cell in which a specific gene has been mutated or deleted and the function involved in the gene has been lost is a pluripotent cell that cannot form a germ cell obtained by cross-species hybridization [1]
  • Pluripotent cells in which a specific gene has been mutated or deleted and the function involved in the gene has been lost A pluripotent cell in which a gene involved in germ cell formation has been mutated or deleted and cannot form a germ cell
  • a specific gene is mutated or deleted, and the gene is involved In the production of chimeric animals [17], other pluripotent cells other than those that have lost their function are transmitted to the germ line Method.
  • a pluripotent cell that is unable to form a germ cell derived from a C-kit mutant animal is a pluripotent cell that has failed to form a germ cell because a gene involved in germ cell formation has been mutated or deleted
  • a method for producing a chimeric animal is
  • a pluripotent cell other than a pluripotent cell in which a specific gene has been mutated or deleted and the function involved in the gene has been lost is a cell that has undergone genetic modification, and the gene has been modified
  • a pluripotent cell in which a specific gene has been mutated or deleted and the function involved in the gene has been lost is a pluripotent cell in which a gene involved in the immune system has been mutated or deleted and the immune function is impaired
  • a pluripotent cell in which a gene involved in the immune system has been mutated or deleted and the immune function is impaired is a pluripotent cell in which the gene encoding the antibody has been mutated or deleted and the ability to produce antibodies has been lost
  • the method for producing a chimeric animal [26] The method for producing a chimeric animal according to [24], wherein a gene involved in the immune system is mutated or deleted, and the immune function is impaired.
  • the pluripotent cell is a pluripotent cell derived from an immunodeficient animal.
  • lymphocyte-deficient animal is an animal in which RAG-1 gene and Z or RAG-2 gene are mutated or deleted.
  • a specific gene has been mutated or deleted, and the function involved in the gene has been lost.
  • a gene that is involved in the formation of a specific tissue or organ or a gene that encodes a specific protein has been mutated or [17]
  • a specific gene has been mutated or deleted, and the function given by the gene has been lost.
  • a gene that is involved in the immune system of a pluripotent cell is mutated or deleted, and a gene that is also involved in germ cell formation
  • the method for producing a chimeric animal according to [17] which is a pluripotent cell in which a gene involved in the formation of a specific tissue or organ or a gene encoding a specific protein is mutated or deleted.
  • a gene involved in germ cell formation is mutated or deleted, and the pluripotent cell that does not form a germ cell and a pluripotent cell in which the gene involved in germ cell formation is mutated or deleted Fused cells with the same or different species in animal taxonomy, or
  • a pluripotent cell that is mutated or defective in genes involved in the immune system and has impaired immune function
  • a fusion cell of the pluripotent cell having a mutation in or deficient in a gene involved in the immune system and having impaired immune function and a cell that is heterologous in animal taxonomy with respect to the pluripotent cell, or
  • the gene involved in the immune system is mutated or deleted, and the pluripotent cells having impaired immune function and the heterologous cells contribute to the formation of a chimeric individual.
  • a chimeric animal produced by any one of the methods [17] and [24] to [29] or its progeny, and a gene involved in the immune system is mutated or deleted, resulting in impaired immune function A method for producing an antibody, comprising administering an antigen to a chimeric animal having a gene encoding an antibody derived from another pluripotent cell other than the pluripotent cell having the above or a progeny thereof.
  • [42] [1 7], [30] and [3 1] cause a chimeric animal or its progeny to form a specific tissue or organ or produce a specific protein A method for producing a specific tissue or organ or a specific protein.
  • lymphocyte-deficient animal is an animal in which RAG-1 gene and / or RAG-2 gene is mutated or deleted.
  • the pluripotent cell according to any one of [4 3] to [48], which is a cell selected from the group consisting of ES cells, EG cells, and GS cells.
  • the embryonic or germ cell-derived cell is a cell derived from the inner cell mass of the blastocyst, and the pluripotent cell is an ES cell [54] to [56] How to establish sex cells.
  • [58] A method for establishing a pluripotent cell according to any one of [54] to [56], wherein the early embryo or germ cell-derived cell is a primordial germ cell, and the pluripotent cell is an EG cell. .
  • [5 9] A method for establishing the pluripotent cell according to any one of [54] to [56], wherein the cell derived from an early embryo or germ cell is a germ cell, and the pluripotent cell is a GS cell.
  • a method for improving the proliferation ability of another pluripotent cell comprising co-culturing the pluripotent cell according to any one of [43] to [53] and another pluripotent cell.
  • [6 1] A method of improving the proliferation ability of other pluripotent cells, wherein co-culture is performed in an early embryo of an animal.
  • the other pluripotent cells are cells selected from the group consisting of ES cells, EG cells, and GS cells, and improve the proliferative ability of [60] or [61] pluripotent cells Method.
  • any of the pluripotent cells of [43] to [53] and / or other pluripotent cells are pluripotent cells into which adapted mitochondrial DNA has been introduced or replaced.
  • [6 4 ] A method for producing a germline chimeric animal.
  • [6 6] The method for producing a germline chimeric animal according to [64] or [65], wherein the host embryo of the animal is a host embryo into which adapted mitochondrial DNA is introduced or replaced.
  • [6 7] The method for producing a germline chimeric animal according to any one of [64] to [6 6], wherein the host embryo of the animal is a blastocyst.
  • [6 8] The method for producing a germline chimeric animal according to [6 7], wherein the host embryo of the animal is tetraploid.
  • a germ cell comprising co-culturing one of the pluripotent cells of any of [43] to [53] and another pluripotent cell, and injecting the co-cultured cells together into an animal host embryo.
  • any of the pluripotent cells of [43] to [53] and other pluripotent cells are pluripotent cells into which compatible mitochondrial DNA has been introduced, [7 2] or [7 3] A method for producing a breeding chimeric animal.
  • [7 6] The method for producing a germline chimeric animal according to any one of [7 2] to [7 5], wherein the host embryo of the animal is a blastocyst.
  • [7 8] The method for producing a germline chimeric animal according to any one of [7 2] to [7 7], wherein the other pluripotent cells are cells selected from the group consisting of ES cells, EG cells, and GS cells. .
  • pluripotent cells are pluripotent cells whose genes have been modified [7 2]
  • [79] A method for producing a germline chimeric animal according to any one of [79].
  • [8 1] A chimeric animal produced by any one of the methods [64] to [80].
  • '[8 2] A method of producing germ cells by transplanting pluripotent cells derived from a male or female nucleus developing embryo established by the method of [8 2] [55] into an animal's reproductive organs.
  • the number portability is a diagram showing a newborn pups like.
  • FIG. 2 is a photograph of a chimeric mouse produced by the method of the present invention using 129. B6-YGFP ES cells and W V / W V ES cells.
  • Figure 3 is a photograph showing the fluorescence of work made chimeric mice by the method of the present invention with reference to 129.
  • B6-YGFP ES cells Contact Yopi W V / W V ES cells.
  • FIG. 4 is a photograph of a chimeric mouse prepared by the method of the present invention using BS-neo ES cells and W V / W V ES cells.
  • FIG. 5 is a diagram showing an outline of chimera production by the method of the present invention (Example 7).
  • FIG. 6 is a diagram showing an outline of chimera production by the method of the present invention (Example 8).
  • FIG. 7 is a diagram showing an outline of the method of the present invention.
  • FIG. 8 is a photograph showing the formation of sperm from an eukaryotic embryo-derived ES cell.
  • the gene that has been mutated or deleted is not limited, and any gene that loses a specific function due to the mutation or deletion of the gene is included.
  • “a specific gene is mutated or deleted and the gene is ⁇ Loss of the function to be given '' means that a part or all of the base sequence of the gene is lost or replaced, or a base is added to the gene, and the function of the gene is lost or decreased.
  • “Function of a gene” means that the gene is expressed and a specific substance is produced in the body, or an organ, tissue, etc. is formed, the gene is expressed and a specific substance is produced in the body and the substance is produced. This includes all functions involving genes, such as causing specific reactions in the body.
  • “A pluripotent cell in which a specific gene has been mutated or deleted and the function involved in the gene has been lost” of the present invention is “a pluripotent cell in which a gene related to a target cell, tissue, organ, protein, or the like is deleted.
  • the target cell / tissue / organism / protein refers to an organ / protein intended to be produced by a chimeric animal.
  • the pluripotent cell of the present invention refers to a cell that can differentiate into any cell.
  • Pluripotent cells include totipotent cells that can differentiate into germ cells and tissue stem cells that can differentiate into animal tissues.
  • Totipotent cells include embryonic stem cells (ES cells), EG cells (Embryonic germ cells, embryonic germ cells), _GS cells, and the like.
  • inner cell mass-derived cells are called ES cells
  • primordial germ cell-derived cells are called EG cells
  • germ cell-derived cells are called GS cells.
  • cells that are similar in nature to pluripotent cells and that have pluripotency and can differentiate into germ cells are sometimes referred to as totipotent cell-like cells.
  • ES cell-like cells EG cell-like cells (EG-like cells), GS cell-like cells (GS-like cells), and the like.
  • pluripotent cells include cells called pluripotent cell-like cells.
  • ES cell-like cells can be obtained by transforming animal tissue stem cells or differentiated somatic cells, or by fusing ES cells with animal tissue stem cells or differentiated somatic cells.
  • the chimeric individual obtained by the method of the present invention comprises at least a cell such as a differentiated cell derived from a pluripotent cell in which a specific gene has been mutated or deleted and the function involved in the gene is lost, and the other pluripotency. It is formed from cells such as differentiated cells derived from sex cells. When cells other than these two types of cells are used for the production of a chimeric animal, the chimeric individual is also composed of cells other than the two types of cells. “Cells other than the two types of cells” are not limited, and examples thereof include animal tissue stem cells and animal differentiated somatic cells.
  • Pluripotent cells derived from animal species that differ in animal taxonomics relative to pluripotent cells include pluripotent cells derived from animal species that are identical in animal taxonomy.
  • a cell other than a pluripotent cell-derived cell in which a specific gene is mutated or deleted and the function associated with the gene is lost, the chromosome of the cell, and the gene of the cell are functioning.”
  • a cell other than a pluripotent cell-derived cell produces a specific substance, or the cell forms a specific organ or tissue.
  • a gene possessed by the cell is functioning.
  • a gene corresponding to the mutation or deletion gene possessed by a cell other than a pluripotent cell-derived cell in which a specific gene has been mutated or deleted and the function associated with the gene has been lost is functioning.
  • the “gene corresponding to the mutated or deleted gene” is the same gene as the mutated or deleted gene or a gene having a high homology of the base sequence, and the mutated or deleted gene.
  • pluripotent cell in which a specific gene is mutated or deleted and the function involved in the gene is lost for example, a pluripotent cell in which a gene involved in germ cell formation is mutated or deleted, a gene involved in the immune system
  • pluripotent cells that are mutated or deficient pluripotent cells that are mutated or deficient in other genes such as genes involved in the formation of specific tissues or organs or genes encoding specific proteins.
  • the mutated or deleted gene is (a) a gene involved in germ cell formation, (W immune system) And (c) pluripotent cells that are one or more genes selected from the group consisting of genes involved in the formation of specific tissues or organs or genes that code for specific proteins be able to.
  • the other pluripotent cells other than the pluripotent cell in which a specific gene is mutated or deleted and the function involved in the gene is lost are pluripotent cells in which the gene is not mutated or deleted.
  • pluripotent cells that have the ability to form germ cells, pluripotent cells that do not have a disorder with respect to immune function, or genes or specific proteins involved in the formation of specific tissues or organs. It is a pluripotent cell in which the encoding gene is neither mutated nor defective.
  • the desired gene may be modified in the other pluripotent cell.
  • a pluripotent cell in which a gene involved in germ cell formation is mutated or deleted is used as a pluripotent cell in which a specific gene has been mutated or deleted and the function involved in the gene is lost, the resulting chimera Since germ cells formed in animals are derived from cells in which the desired gene is modified, the offspring individuals obtained from the chimeric animals are transgene animals in which the desired gene has been modified.
  • the desired gene modification may be the introduction of a foreign gene that is not originally possessed by the pluripotent cell, or it may be a knockout of an endogenous gene that is originally possessed by the pluripotent cell. Examples of foreign genes include genes derived from other animal species in animal taxonomy.
  • the desired gene can be modified by a known method.
  • pluripotent cells other than pluripotent cells that have been mutated or deleted in a specific gene and have lost the function that the gene is involved in have lost the function that the specific gene has been mutated or deleted in. It may be a fusion cell of pluripotent cells and other cells, or pluripotent by transforming animal tissue stem cells (organ-specific stem cells, somatic stem cells) or differentiated somatic cells by known means It may be a cell-like cell.
  • a tissue stem cell refers to a cell that is present in a mature animal tissue and can differentiate into the tissue or other tissue cells to form the tissue.
  • Examples include brain stem cells, liver stem cells, knee stem cells, kidney stem cells, heart stem cells, blood vessel stem cells, hematopoietic stem cells, bone marrow stem cells, neural stem cells, retinal stem cells, epidermal stem cells, hair follicle stem cells, and mesenchymal stem cells.
  • Each of these stem cells has a specific surface antigen and is isolated using an antibody specific for the antigen, or is isolated using Celso or the like using the fluorescently labeled antibody. be able to.
  • stem cells can be isolated as SP (side popu lion) cells by using the dye Hoec st 33342. Methods for isolating stem cells are well known to those skilled in the art.
  • stem cells are isolated or desired stem cells are selected according to the descriptions in these documents. can do. It has been confirmed that when fused cells of ES cells and differentiated cells, which are pluripotent cells, are injected into a host embryo and generated, the fused cells can contribute to the individual and function (Tada et al., Dev Dyn. 227, 504-510, 2003).
  • transformed pluripotent cells By transforming these stem cells or differentiated somatic cells with other pluripotent cells such as ES cells, transformed (differentiated) pluripotent cells can be obtained (Andrew et al.. (Nature 430, 350-356, 2004) (Ying et al., Nature 416, 545-548, 2002) (Terada et al., Nature 430, 542-545, 2002) 0
  • pluripotent cells from genital organ-derived cells can be established.
  • pluripotent cells such as ES cells derived from androgenetic embryos and female nuclei
  • Pluripotent cells such as embryonic embryo-derived ES cells
  • Co-culture may be performed in a culture container such as a culture dish. At this time, an appropriate feeder cell may be seeded in a culture vessel.
  • a male nucleated embryo can be produced by removing a female pronucleus from a fertilized egg and transplanting a male pronucleus taken from another fertilized egg.
  • a female nucleated embryo is a male male from a fertilized egg. It can be prepared by removing the pronucleus and transplanting a female pronucleus collected from another fertilized egg. That is, the present invention also includes a method of co-culturing a male nucleated embryo or female nucleated embryo with pluripotent cells such as ES cells and establishing ES cells derived from a male nucleated embryo or a female nucleated embryo. .
  • pluripotent cells in which a specific gene injected into the host embryo of the animal is mutated or deleted and the function involved in the gene is lost can be used. Good.
  • the cell fusion can be carried out by a known method such as an electrovolution method or a PEG method. Transformation results in diploid pluripotent-like cells, and fusion results in tetraploid pluripotent-like cells.
  • a known method such as an electrovolution method or a PEG method. Transformation results in diploid pluripotent-like cells, and fusion results in tetraploid pluripotent-like cells.
  • one of the cells is Micronuclei may be processed by treatment with imide, or they may be treated with mitomycin C or radiation to cause non-uniform fusion.
  • One mitochondrial DNA can be removed by a known method and used for fusion.
  • pluripotent cell other than a pluripotent cell in which a specific gene is mutated or deleted and the function involved in the gene is lost the specific gene is mutated or deleted and the function involved in the gene is lost.
  • pluripotent cells co-cultured with pluripotent cells in which specific genes have been mutated or deleted and the functions involved in the genes have been lost.
  • a pluripotent cell in which a specific gene is mutated or deleted and the function involved in the gene is lost is included in the prepared fused cell or pluripotent-like cell . Even in this case, the pluripotent cells may be simultaneously injected into the host embryo when the chimeric animal is produced.
  • the gene has a function involving the specific gene (heterologous cells, chromosomes). Fusion cells into which unfertilized or enucleated fertilized eggs are fused, activated, and cultured, resulting in blastocyst-stage embryo-derived pluripotent cells, such as ES-like cells, as host embryos It would also be possible to inject.
  • pluripotent cell in which a specific gene used in preparing a fused cell or a pluripotent cell-like cell is mutated or deleted and the function associated with the gene is lost can be simultaneously used as a host embryo.
  • “two or more types of cells including a pluripotent cell in which a specific gene is mutated or deleted and the function involved in the gene is lost and other pluripotent cells other than the pluripotent cell” Is injected into the animal's host embryo.
  • tissue stem cells and somatic cells used may be the same or different in animal taxonomy with respect to the pluripotent cells in which a specific gene has been mutated or deleted and the function involved in the gene has been lost.
  • the pluripotent cell in which the specific gene is mutated or deleted and the function involved in the gene is lost is a gene involved in germ cell formation, for example, the specific gene is mutated or deleted and the gene is involved Germ cells can be formed from cells other than pluripotent cell-derived cells that have lost function.
  • the pluripotent cell in which the specific gene is mutated or deleted and the function involved in the gene is lost is a gene involved in the immune system
  • a cell other than a pluripotent cell-derived cell in which a specific gene has been mutated or deleted and the function associated with the gene has been lost functions as an immunocompetent cell such as an antibody.
  • a cell other than a pluripotent cell-derived cell in which a specific gene is mutated or deleted and the function involved in the gene is lost is a cell in which a gene involved in the immune system is mutated or deleted during the formation of a chimeric individual.
  • cells other than pluripotent cell-derived cells that have lost or lost the function involved in the specific gene in the chimera Produce or form specific organs and tissues.
  • Examples of pluripotent cells that are mutated or deficient in genes involved in germ cell formation and cannot form germ cells include cells derived from C-kit mutant animals (W gene mutant animals).
  • C-kit is one of the receptor-type tyrosine kinases mapped to the W locus and is involved in infertility.
  • Examples of C-kit mutant animals include W v / W v mice. WVW V mice are both male and female and are unable to form germ cells (sterile and infertile).
  • a W v / W v mouse, which is one of C-kit mutant animals, can be obtained, for example, by the method described in Example 1 described later.
  • Other C-kit mutant animals can also be produced according to the W v / W v mouse production method.
  • the pluripotent cell has a mutation or deletion of a gene involved in germ cell formation and lacks the function of germ cell formation.
  • This pluripotent cell and other pluripotent cells that are allogeneic or heterologous to the pluripotent cell and can form a germ cell are mixed and injected into the early embryo of the animal to form a germ cell Chimeric animals can be obtained in which possible pluripotent cells can be transmitted to the germline.
  • genes involved in germ cell formation are mutated or deleted, and cells that are allogeneic or heterologous to pluripotent cells are mice, rats, bushes, bushes, horses, hidges, Selected from the group consisting of gi, monkey and human.
  • pluripotent cells that are injected into the host embryo together with pluripotent cells that are mutated or deficient in genes involved in germ cell formation and cannot form germ cells, such as cells that have undergone genetic modification
  • genetic modifications include introduction of foreign genes or knockout of endogenous genes.
  • pluripotent cells that are injected into the host embryo together are heterologous in terms of animal taxonomy with respect to pluripotent cells that are mutated or defective in the genes involved in germ cell formation and cannot form germ cells.
  • the resulting chimeric animal forms a germ cell of a heterologous animal. Since the germ cells of the heterologous animal have the chromosomes of the heterologous animal, the stem cells, organs and organs themselves of the organs and tissues having the chromosomes of the heterologous animal can be obtained from the obtained animals, and the heterogeneity of the obtained animals. Substances such as proteins from heterologous animals can be obtained from somatic cells having animal chromosomes.
  • “having impaired immune function” means that it cannot form immunocompetent cells such as T cells, B cells, NK cells, dendritic cells, or cannot produce antibodies. This refers to the loss or decline of the function of excluding heterogeneous tissues and substances.
  • a nude mouse is a mouse with a congenital deletion of the thymus and a homozygous nu gene that is a recessive gene on chromosome 11. That is, pluripotent cells derived from nude mice are pluripotent cells that are homozygous for the nu gene.
  • the scid mouse refers to a mouse that exhibits the same pathology as human severe combined immunodeficiency (SCID).
  • SCID human severe combined immunodeficiency
  • the sc id mouse which is a recessive sc id gene is a homozygous mouse, contains NOD / sc. There are id etc. That is, scid mouse-derived pluripotent cells are pluripotent cells that are homozygous for the scid gene.
  • Immunodeficient mice such as nude mice, scid mice, lymphocyte-deficient mice lacking RAG-1 and / or RAG-2 genes (Chen et al, Pro Natl. Acad, Sci. USA90, 4528-4532) 1993) can be obtained commercially or as described in the literature.
  • a gene that is involved in such an immune system is mutated or deleted, and a pluripotent cell that is impaired in immune function and a pluripotent cell that is mutated or deleted in a gene involved in immune system and has impaired immune function
  • Other pluripotent cells that are heterogeneous in animal taxonomics
  • a pluripotent cell that is mutated or defective in a gene involved in the immune system; a pluripotent cell that has an impaired epidemiological function is derived from animals such as mice, rats, butterflies, horses, horses, hidges, goats, monkeys, etc. Cells can be used.
  • a chimeric mouse is produced using a pluripotent cell derived from an immunodeficient mouse and a pluripotent cell containing a gene encoding a human antibody
  • the chimeric mouse contains a human antibody gene.
  • Human antibodies can be produced in chimeric mice by administering antigens to the chimeric mice.
  • pluripotent cells that have lost the ability to form lymphocytes can be cited as pluripotent cells that have a mutated or defective gene involved in the immune system and have impaired immune function.
  • pluripotent cells derived from animals lacking the RAG-1 gene or RAG-2 gene involved in gene rearrangement can be mentioned.
  • Such pluripotent cells are also deficient in immune function, and in the same manner as when using ES cells derived from animals with immune deficiency, chimeric animals can be prepared by mixing with ES cells derived from other species. it can.
  • a gene involved in the formation of a specific tissue or organ or a specific gene examples include pluripotent cells that have lost the ability to form the tissue or organ or the ability to produce the protein due to mutation or deletion of the gene encoding the protein.
  • a gene involved in the formation of a specific tissue or organ is not limited, and examples thereof include a gene involved in the formation of a specific organ.
  • a gene encoding a specific protein is not limited, and examples thereof include a physiologically active substance such as cyto force-in, a gene encoding immunoglobulin and the like.
  • a pluripotent cell in which the gene involved in the formation of such a specific tissue or organ or the gene encoding a specific protein has been mutated or deleted to lose the ability to form the tissue or organ or to produce the protein.
  • tissue or organs derived from other pluripotent cells are formed in the obtained chimeric animal, or protein Is produced.
  • Other pluripotent cells mutate or lack a specific gene and lose the function involved in that gene If the animal is heterogeneous in terms of animal taxonomy for the pluripotent cells, a heterologous tissue or organ is formed in the chimeric animal or a heterologous protein is produced. Mutation or deletion of a specific gene can be performed by a known gene manipulation technique.
  • pluripotent cells in which multiple genes have been mutated or deleted and multiple functions have been lost. That is, a mutated or deleted gene is (a) a gene involved in germ cell formation, (b) a gene involved in the immune system, and (c) a gene or a specific protein involved in the formation of a specific tissue or organ.
  • Pluripotent cells that are one or more genes selected from the group consisting of genes encoding can be used. For example, W v mice homozygous for both genes and nu gene, i.e. can not be formed germ cells can be used mouse derived pluripotent cells is yet immunodeficiency.
  • a pluripotent cell that cannot form a germ cell obtained by cross-breeding can be used as a pluripotent cell in which a plurality of genes are mutated or deleted and the function involved in the gene is lost.
  • Pluripotent cells that cannot form germ cells can be obtained from early embryos that cannot form germ cells, and early embryos that cannot form germ cells, such as fertilized embryos, are germ cells caused by genetic factors. It is produced by utilizing the dysplasia. In other words, it is known that the first generation of a cross-breed is sterilized and lacks germ cells, and is produced using this genetic factor.
  • a heterozygous fertilized embryo is obtained by naturally mating an experimental mouse (Mus musculus domes ticus) with a mouse having a sibling heterogeneity.
  • an experimental mouse Mus musculus domes ticus
  • it is desirable to obtain a cross-fertilized embryo by naturally mating a female female experimental mouse and a male sibling of the sibling.
  • many fertilized embryos can be obtained by mating after induction of superovulation by hormonal treatment of 3- to 4-week-old experimental female mice.
  • the mouse to be mated can be Mus spretus, Mus carol i, Mus infrastructurei, etc., but the information on in vitro fertilization is relatively accumulated.
  • a combination of C57BL / 6 female mice and Mus spretus male mice capable of stably obtaining a cross-breed embryo is preferable.
  • the pluripotent cells of the present invention are not limited to mice and include pluripotent cells of all animals. In other animals, pluripotent cells that cannot form germ cells obtained by cross-breeding can be obtained by operating in the same manner as mice. Pluripotent cells that cannot form germ cells obtained by cross-breeding can also be obtained according to the description in WO 03/071869 International Publications.
  • a chimeric animal can be formed by injecting two or more types of cells into a host embryo, which is an early embryo such as an animal blastocyst, and transplanting the early embryo into the uterus of a foster parent.
  • a chimeric animal in which a gene of a desired pluripotent cell is transmitted to germ cells can also be prepared by the tetraployless cue method.
  • tetraploid cue method tetraploid cells develop into the placenta by injecting pluripotent cells such as ES cells into tetraploid fertilized eggs, and only pluripotent cells such as ES cells are produced.
  • 0 Tetraploid rescue method In order to prevent the death of the born animal due to respiratory disorder, it is desirable to match the tetraploid fertilized egg or ES cell mitochondrial DNA with nuclear DNA. A method for adapting mitochondria DNA to nuclear DNA in the tetraployless cue method will be described later.
  • FIG. 7 shows an outline of a method for producing a chimeric animal by the method of the present invention.
  • the chimeric organ produced by the method of the present invention is a mixture of heterogeneous cells, mouse cells, and various hybrid cells. This situation is considered advantageous for the proliferation and function of heterologous stem cells and hybrid cells with the desired chromosomes and genes. Furthermore, it is considered advantageous when transplanting heterologous organ stem cells into such a chimeric individual. Even if substances (genes) necessary for the growth and differentiation of heterologous stem cells in the future are clarified, genetic modification can be easily performed because mouse ES cells are used.
  • knockout clones lacking enzymes involved in the antigenicity of acute rejection have been created for the purpose of organ transplantation.
  • the present invention also includes chimeric animals and their progeny obtained by the above method. Furthermore, the present invention also encompasses a pluripotent cell itself in which a specific gene is mutated or deleted and the function involved in the gene is lost. The cells contained in the pluripotent cells are as described above.
  • W v / W v is described mouse embryo-derived ES cell in detail as an example, from pluripotent cells in W v / W v mice It includes, but is not limited to, immunodeficient mice such as nu / nu mice and scid mice, lymphocyte-deficient mice, other mice, rats, mice, horses, hidges, goats, monkeys, and other animals.
  • pluripotent cells are not limited to ES cells, and include EG cells and GS cells.
  • ES cells can be established by culturing the inner cell mass of blastocysts in vitro during mammalian development (Evans, M. J. et al., Nature, 292: 154-156,
  • the proliferative ability includes both in vitro proliferative ability and proliferative ability in the embryo.
  • ES cells can be established by culturing cells in the inner cell mass of blastocysts in vitro, but by co-culturing with other ES cells or tetraploid embryos. ES cells with high undifferentiated state, differentiation ability and proliferation ability can be established. The establishment rate is also improved.
  • the ES cells used here need only be able to be identified and separated from the target ES cells, but do not form germ cells when ES cells are established for the purpose of germline chimera production. W v / W v Mouse embryo-derived ES cells are desirable.
  • Co-culture may be performed in a culture vessel such as a culture dish. At this time, an appropriate feeder cell may be seeded in a culture vessel. Furthermore, co-culture may be performed in the early embryo that constitutes the inner cell mass (ICM). In this case, a plurality of cells to be co-cultured may be injected into the early embryo using, for example, Macroupille overnight, and cultured.
  • ICM inner cell mass
  • the co-cultured cells are collected, and the tetraploid may be injected into an early embryo for the production of a chimeric animal such as an embryo (tetraploid).
  • the early embryo used can be used for repeated co-culture.
  • Tetraproid may be used as an early embryo.
  • the above method can efficiently establish ES cells from reconstructed embryos that are difficult to establish ES cells such as nuclear transfer embryos and male embryos.
  • reconstructed embryos cocultured with Wv / Wv mouse embryo-derived ES cells or tetraploid embryos can be used directly for the production of chimeric animals.
  • a plurality of ES cells to be co-cultured may be injected into an early embryo for producing a chimeric animal, and a chimeric animal may be produced as it is.
  • Establishment of other ES cells using the ES cell derived from the W v / W v mouse embryo of the present invention may be performed, for example, by the method described in Example 5 described later.
  • W v / W v mouse embryo-derived ES cells other ES cells of the present invention, for example, ES cells and co-cultures were desired genetic modification knockout like the introduction and the particular gene of a foreign gene, the initial time By placing it in the embryo, the proliferation ability of the desired ES cells during culture is increased. Furthermore, the proliferation of the ES cell after transplantation into the embryo is also improved, and a chimeric mouse in which the gene of the ES cell is transmitted to the germ line can be obtained. In addition, the morphology of other ES cells co-cultured with the ES cells derived from the W / W mouse embryo of the present invention is also kept good. A good ES cell colony has a clear and round outline, and the cells are bulging and growing.
  • ES cells derived from WzoW v mouse embryos do not form germ cells, the ES cells are not transmitted to the germ line. That is, when a chimeric animal is obtained by the method of the present invention, the sperm or egg of the obtained chimeric animal is derived from another ES cell that is not an ES cell derived from a W v / W v mouse embryo, and the next generation Chromosomes derived from the ES cells are always transmitted to the offspring.
  • the desired ES cells can be derived from any mouse strain, but ES cells derived from C57BL / 6 or 129 strains are desirable, and ES cells derived from C57 / BL6 are particularly desirable. At this time, commercially available ES cells may be used.
  • a medium supplemented with WVW V mouse embryo-derived ES cell condition medium was used to establish other ES cells.
  • the condition medium can be prepared, for example, as described in Mart in et aL, Dev Biol 121, 20-28, 1987.
  • ES cells that have been passaged for a long time, for example, ES cells that have been passaged for more than 12 generations or for more than 20 generations can be used.
  • An ES cell derived from the / W mouse embryo of the present invention is injected into an early embryo such as a blastocyst together with other desired ES cells, and the early embryo is transplanted into a foster mother's uterus, thereby efficiently producing a chimeric mouse. Can be formed.
  • a chimeric mouse in which a gene of a desired ES cell is transmitted to germ cells can also be produced by the tetraployless cue method.
  • the tetraploid dress cue method uses ES cells that are injected into tetraploid fertilized eggs, so that tetraploid cells develop into the placenta and only ES cells develop into individuals.
  • the tetraploid dress cue method in order to prevent death due to respiratory failure of the born mice, the tetraploid fertilized eggs or W v / W v mouse embryo-derived ES cells and It is desirable to match the mitochondrial DNA of the ES cells to be mixed with the nuclear DNA.
  • the cells used are hybrid cells, for example, hybrid cells from two inbred animals, there is no problem of respiratory disturbance in the birth mice, so it is not always necessary to match mitochondrial DNA with nuclear DNA. Absent.
  • ES cells derived from Wv / Wv mouse embryos do not necessarily need to adapt mitochondrial DNA to nuclear DNA.
  • Mitochondrial DNA replacement ES cells derived from mouse embryos can be obtained by known methods. For example, mitochondria from an inbred mouse! For the replacement of) ⁇ , an inbred mouse in which the desired type of mitochondrial DNA is substituted by the backcross method or the nuclear replacement method is prepared, and ES cells are established from this mouse. Inbred mouse
  • the mitochondrial DNA of C57BL / 6 was recrossed with wild-type mice Mus muscu lus musculus by the backcross method over 12 times.
  • Inbred mouse in which DNA is replaced with wild-type mouse Mus muscu lus muscul us type B6-mtMus can be produced. From this mouse, ES cells in which mitochondrial DNA is replaced with DNA of compatible mouse Mus musculus musculus type can be established.
  • the pronuclear replacement method follows the conventional method (MoGrath J & Solter D, J. Exp. Zool, 228, 355-362 (1983)) and the male and female pronuclei of pronuclear fertilized eggs of inbred mouse mdx. Is transplanted into an enucleated pronuclear fertilized egg having a mitochondria of a wild-type mouse Mus muscu lus musculus, cultured with an electric pulse, and then transplanted into a mouse oviduct for individual development. Inbred mice mdx-mtMus can be prepared by replacing mitochondrial DNA with Mus musculus musculus evening. From this mouse, ES cells in which mitochondrial DNA is replaced with wild type can also be established.
  • mice prepared in this way such as B6-mtMus or mdx-mtMus E blastocysts, were collected and the conventional method (Evans MJ and Kaufman MK, Nature 292, 154-156 ( 1981)), ES cells can be established.
  • B6-W v / + of male mated female B6- mtMus B6-W v / + - the MtMus mice obtain.
  • BD-WV + -mtMus mice can be obtained by mating early B6-WV + -mtMus and DBA males, and then BDF ⁇ W v / +-mt MUS mice can be mated.
  • W v / W v mouse embryo-derived ES cells of the present invention the establishment of other ES cell, sufficient to produce chimeric mice by co-culture with the desired ES cells subjected to genetic modification growth
  • Using the W v / W v mouse embryo-derived ES cells in these steps may be used in only each step may be a continuous use in two or more steps.
  • ES cells derived from W v / W v mouse embryos are co-cultured with other ES cells that have undergone the desired genetic modification, and chimera of ES cells derived from W So W v mouse embryos and other ES cells as they are You may inject
  • the proliferative ability of the ES cell often decreases, and the ES cell derived from the W v / W v mouse embryo of the present invention is such a gene. It is also possible to improve the proliferative ability of ES cells modified by. In particular, it can also be suitably used for ES cells that have undergone multiple genetic modifications. Further, cells which can be established by WW V mouse embryo-derived ES cell of the present invention, the cells to perform a desired genetic modification, the cells simultaneously injected into blastocysts, not only ES cells, EG cells (embryonic germ cell) or GS cells may be used.
  • EG cells can be obtained by culturing mammalian primordial germ cells with cytokines such as LIF and FGF2 (Matusi, Y., et al., Cell, 70: 841-847, 1992). GS cells can be obtained from testes of infant male mice (Johnson et al. Nature 428, 145-150, 2004))
  • GS cells are established by the following method.
  • Enzyme solution 1 contains 3 mg / ml collagenase and 200 / xg / nil DNase I in 5 ml DMEM / F12.
  • Enzyme solution 2 contains 5 ml])) MEM / F12 with 3 mg / ml collagenase,]) Nase I at 200 zg / ml and hyaluronidase at 3 mg / ml.
  • a Wv / Wv mouse-derived ES cell of the present invention When a Wv / Wv mouse-derived ES cell of the present invention is injected into a blastocyst together with a desired ES cell to produce a chimeric mouse, the sex ratio of the mouse born can be controlled.
  • the sex chromosome is a male XY type cell. In many cases, female cells are difficult to produce.
  • ES cells derived from wvwv mouse embryos of the present invention can easily obtain cells of the female XX type of sex chromosomes, and ES cells derived from W / W mouse embryos of male XY type cells and female type cells. Spider-type cells can also be selected as necessary.
  • a desired male ⁇ type ES cell and an ES cell derived from a male ⁇ w / w mouse embryo are injected into a blastocyst, all the chimeric mice born are male.
  • ES cells derived from desired male rod type ES cells and female rod type W V / W V mouse embryos are injected into blastocysts, male or Female chimeric mice are born.
  • the sexes of the chimeric animals that can be obtained by the method for producing chimeric animals and the types and origins of the obtained germ cells are as follows.
  • ES cells are usually male, so .2, 3 and 6 are not likely to occur. That is, in the conventional method, when a female chimera is born, an egg derived from an ES cell can be obtained only in the case 5 above, but it occurs rarely. Therefore, ES cells are difficult to propagate
  • ES cells derived from W V / W V mouse embryos of the present invention are used, if the embryo in the above case 5 is changed to ES cells derived from W V / W V mouse embryos, the egg when a female chimera is born is All are from ES. Therefore, when the offspring is born, 100% ES cells are reproductively transmitted.
  • the ES cell derived from the W V / W V mouse embryo of the present invention is co-cultured with other ES cells and other
  • chimeric mice By simultaneously injecting ES cells into blastocysts, chimeric mice can be obtained with an almost 100% probability.
  • a chimeric mouse is prepared using the ES cell derived from the W V / W V mouse embryo of the present invention. 100% of chimeric mice in which the gene of the desired ES cell has been transmitted to the germ line, so that even if a mouse that has been born died, the gonad of the mouse can be transplanted to another mouse.
  • a desired chimeric mouse can be prepared.
  • the present invention includes a method for producing germ cells from ES cells derived from male or embryonic embryos. ES cells derived from male or embryonic embryos establish pluripotent cells from cells derived from reproductive organs by co-culturing germ cell-derived cells with pluripotent cells such as ES cells can do.
  • pluripotent cells such as ES cells derived from androgenetic embryos
  • Pluripotent cells such as ES cells derived from female nucleus developing embryos
  • ES cells derived from male nucleated embryos or female nucleated embryos obtained in this way can also establish pluripotent cells by co-culture with cells derived from other early embryonic germ cells. .
  • Germ cells can also be formed from male or embryonic embryonic stem cells.
  • ES cells derived from male or embryonic embryos can be transplanted into the reproductive organs of animals.
  • ES cells derived from male nucleated embryos can be formed by transferring ES cells derived from male nucleated embryos into seminiferous tubules.
  • the animal to be transplanted is of the same species as the ES cell-derived animal.
  • ES cells are preferably treated with mitomycin or the like.
  • ES cells derived from female nucleated embryos can be obtained by transplanting ES cells derived from female nucleated embryos into the oviduct. Whether the germ cells finally obtained are derived from ES cells can be confirmed by checking the imprinting status of the genome.
  • the present invention includes a method for producing germ cells by transplanting pluripotent cells derived from male or embryonic embryos into the reproductive organs of animals.
  • BDF 1- W v / + was selected.
  • BDF ⁇ W v / + Mice are naturally mated with each other.
  • a heterogeneous heterogeneous individual (BDF2- W v / +) was obtained.
  • BDP2- W v / + mice were naturally mated, and the uterus of the individual on the third day from the day when the vaginal plug was confirmed was perfused with M2 medium, and 34 blastocyst stage embryos were collected and obtained.
  • ES cells were established from embryos according to a conventional method (Evans MJ and Kaufman MK, Nature 292, 154-156 (1981)).
  • ES medium (80% (v / v), 20% (v / v) FCS, 13 ⁇ 4 (v / v) lOOmM pyruvic acid solution (Gibco Cat. 11360-070), 13 ⁇ 4 (v / v) essential amino acids
  • the solution (Gibco Cat. 11140-027), ImM 2 -mercaptoethanol (Sigma, Cat. No. M-6250), and 10 3 U / mL LIF were dispensed on the feeder cells of a 4-well plate previously. and the embryos transferred one by one 37 ° C, 5% C0 2 - 5% 0 2 -.. were cultured under conditions of 90% N 2 were selected grown ICM cell mass culture day 7 0.
  • Genotyping of established ES cells was performed by PCR-RFLP method (British Journal of Haematology 98, 1017-1025 (1997)).
  • Primer that recognizes W gene ⁇ 104 'fragment obtained by PCR amplification with 5'-AAAGAGAGGCCCTAATGTCGG-3' (SEQ ID NO: 1) and 5'-CTCGAGACTACCTCCCACC-3 '(SEQ ID NO: 2) was treated with Nsi l restriction enzyme, and non-fragmented wild type and W v type fragmented into 85 bp and 19 bp were assayed.
  • 5 lines were W v / W v type. When these lines were subjected to sex discrimination PCR diay et al. Cel 77, 639-650, 1994), 2 lines were male and 3 lines were female.
  • mice Female 129 / sv mice (NIH) were treated with male C57BL / 6-EGFP # 60 (Y-ink) (Ichida et al., J
  • ES cells were established according to a conventional method (Evans MJ and Kaufman MK, Nature 292, 154-156 (1981)).
  • ES medium 80% (v / v) DMEM, 20% (v / v) FCS, 13 ⁇ 4 (v / v) lOOmM pyruvic acid solution (Gibco Cat. 11360-070), 1% (v / v) Non-essential amino acid solution (Gibco Cat.
  • mice in which C57BL / 6J mice 'mitochondrial DNA was replaced with Mus musculus nmsculus type B6-mtMus females (N15) (Nagao et al., Genes Genet Syst 73, 21-27 (1998)) were replaced by male C57BL / 6J mice And made a natural cross.
  • the uterus of the individual on the third day from the day when the vaginal plug was confirmed was perfused with M2 medium, 20 blastocyst stage embryos were collected, and the resulting embryos were routinely used (Evans MJ and Koufman MK, Nature292, 154 -156 (1981)) ES cells were established.
  • ES medium (80% (v / v), 203 ⁇ 4 (v / v) FCS, 1% (v / v) lOOmM pyruvic acid solution (Gibe o Cat. 11360-070), 1% (v / v) Non-essential amino acid solution (Gibco Cat. 11140-027), ImM 2-mercaptoethanol (Sigma, Cat. No. M-6250), 10 3 U / mL LIF feeder transferred one by one embryos obtained previously on one cell 37 ° C, 5% C0 2 - 5% 0 2 -. were cultured under conditions of 903 ⁇ 4N 2 and proliferated ICM cell masses at day 5 the culture 0. 125% trypsin / 0.
  • ImM EDTA treatment cells were dispersed and then seeded on a freshly prepared 4-well plate feeder cell and cultured for the second passage. Treated with trypsin / EDTA, seeded in a new 3.5 cm culture dish, and obtained 2 lines that grew well, so that the cells that reached so far could grow stably as a cell line Cryopreserved.
  • the neo gene vector is established in a conventional manner on the male line of the established B6-mtMus ES cell line. The gene was introduced and gene targeting was performed.
  • ICR mice subjected to superovulation-inducing treatment were naturally mated with male mice of the same strain, and after the administration of chorionic gonadotropin (hCG) from an individual with a confirmed vaginal plug, late stage 2 by the fallopian tube perfusion method.
  • Cell stage embryos were harvested.
  • the resulting late 2-cell embryos were fused by direct electric pulse in 0.3M mannitol (FUJITA gokku: pulse conditions were 18V, 50 nsec, 3 times at 999_i se interval), and tetraploid embryos were obtained.
  • the tetraploid screened, 37 ° C in M16 culture medium, 5 C0 2 - and cultured for 2 days in Ai r, were obtained tetraploid blastocyst stage.
  • Genotyping was performed by the above-mentioned PCR-RPLP method (British Journal of Haematology 98, 1017-1025 (1997)) using 3 to 5 colonies that grew on the third day of culture. Seven of the 20 lines were BS-neo ES cell lines. Of these, the line with the best colony morphology and growth was stored frozen and used for chimera production.
  • Example 6 Production of chimeric mice by tetraploid dressing method (1) For the tetraploid blastocyst stage embryo obtained in Example 4, the above-mentioned 129. B6- YGFP ES cells
  • the upper left cells are germ cell defect (Wv), immunodeficiency (nude, sc id), lymphocyte deficiency Target cells such as loss (RAG-1, RAG-2) ES cells that have been mutated or deficient in genes related to 'tissue' organs, proteins, etc.
  • the cells in the upper right are neural stem cells and hematopoietic stem cells such as humans , Other differentiated cell and germ cell defects (OVv), immunodeficiency (nude, scid), lymphocyte deficiency (RAG-1, RAG-2), etc. Mutated or deficient ES cells. From the obtained chimeric individual, the target cell / tissue 'organ, protein, etc. can be finally extracted.
  • Figure 2 shows a photograph of a chimeric mouse.
  • the target ES cells 129, B6-YGFP
  • Figure 2a and Figure 2b without rescue of W V / W V ES cells
  • FIG. 18 shows a recipient mouse at the 18th day of pregnancy transplanted with W V / W V ES # 7 + tetraploid embryo.
  • Figure 2d shows 129.
  • Example 7 Production of chimeric mice by tetraploid dress cue method (2)
  • the above-mentioned BS-neo ES cells (male) and About 10 BDF3 W V / W V ES cells (male) were injected overnight.
  • Twenty-nine tetraploid blastocyst-stage embryos injected were transplanted into the uterus of two recipient ICR mice on day 5 after confirming the vaginal plug, and the night before childbirth (18.5 days of pregnancy) At night, 3 male fetuses were removed by caesarean section or spontaneous delivery. After performing resuscitation and confirming active movement, the child was brought up with a foster parent.
  • Fig. 4 shows a photograph of the resulting chimeric mouse (BS-neo ES (black) + W V / W V ES (white) + tetratraploid chimeric mouse, 8 days after birth).
  • the hair color is black BS-neo ES cells contribute to the body, and white individuals are formed only from W V / W V ES cells.
  • Figure 5 shows the results of a series of chimeric mice.
  • Example 8 Production of chimeric mice by tetraploid dress cue method (3) The tetraploid blastocyst stage embryo obtained in Example 4 was established by the same procedure as in Examples 1 and 2.
  • ES cells (B6-GFP PGES) were transformed into BDF3 W About 10 each were injected with v / W v ES cells (female) with a piezo micromanipulator.
  • ES cells including ES-like cells
  • ES-like cells The rate of establishment of ES cells (including ES-like cells) from nuclear transfer embryos is not very high. In addition, established ES cell colonies often do not maintain good morphology. To solve these problems, co-culture with tetraploid embryos was performed.
  • ES cells derived from male embryos have flat colonies and low proliferation ability. It was.
  • a male embryo can be produced by mating a female pronucleus of a pronuclear stage embryo obtained by superovulation of a Fl female and mating with a 129 male mouse, and mating a male female with a B6 male mouse by superovulation treatment of a female female. It was prepared by replacing the male pronucleus of the pronuclear embryo.
  • About 10 male embryo-derived ES cells were injected into the tetraploid blastocyst stage embryo obtained in Example 4 with a piezo micromanipulator. After culturing for about 1 day, it was cultured using the establishment method of Example 1. Normally, the ICM mass grows around 5 days, but the ESM-derived ICM mass grows around 3 days. ES cell colonies obtained by repeating this procedure several times had good morphology and high proliferation ability.
  • Fertilized embryos of KK mice were collected from the uterus at the 8-cell stage. Two blastomeres at the 8-cell stage were introduced into a tetraploid 4-cell stage embryo (Example 4) before the compaction using a micromanipulator. Eight cell stage nuclear transfer embryos 5 to 19 chimeric embryos were prepared and cultured in M16. All embryos developed to the blastocyst stage, and the development of internal cell mass (ICM) was observed, but ES cells could not be established. Next, 12 chimeric embryos were prepared and cultured in the same manner. 1. After 5 days, about 5 W v / W v ES cells treated with mitomycin were injected into the blastocyst stage embryo. Introduced by a recuperator. When ES cells were established as in Example 1, 6 lines of ES cells were established.
  • mice B6. BALBF2, W v / W v, nu / nu.
  • the male nucleated embryo-derived ES cells re-established in the seminiferous tubule when the mice were 8 weeks old were transplanted. Re-establishment was carried out in the same manner as when ES cells were established by injecting about 10 male-nucleated embryo-derived ES cells into the blastocyst of the tetraploid embryo.
  • the first is cell preparation.
  • Pre-mitomycin treatment ES 1-1P8 derived from a male nucleated embryo that had been cultured for 2 days on a prepared MEF and became confluent. After washing the cells with PBS (-), peel the cells from a dish for cell culture using trypsin / EDTA (0.25% / 0.04%) solution, and add 10% FBS-added DMEM medium to react. Was stopped. The cells were detached by pipetting and then filtered through a 40 HI square nylon mesh. This cell suspension was pelleted with a centrifuge. The pellet was resuspended with a sufficient amount of ES medium, and the number of cells was measured with a hemocytometer.
  • the glass tube was pierced there, the needle was inserted into the testis, and the cell suspension was injected into the seminiferous tube by exhalation. The glass tube was pulled out after confirming that it was sufficiently filled.
  • the testis was returned to the abdominal cavity, and the other testicle was transplanted in the same manner.
  • the peritoneum and muscle layer were stitched together with sutures, and the skin was fastened with a metal clip.
  • This operation allowed a large amount of cell suspension to be injected into the left testis and a sufficient amount of cell suspension to be injected into the right testis.
  • testes of B6 -BALBF2, W v / W v and nu / nu were the few testes unique to W v / W v mice.
  • the testes returned to their original position the day after transplantation, and grew to about the same size as normal mice one month later.
  • the male nucleated embryo-derived ES cells have the properties of sperm stem cells.
  • Example 1 2 Analysis of methylation pattern of ES cell derived from male nucleus development embryo
  • the imprinting status of the genome was confirmed by using androgenetic ES (AgES) derived from the eukaryotic embryo used in the experiment and three B6 derived ES cells derived from B6 as a comparative control. Imprinting status is upstream of imprint gene It can be investigated by measuring the methylation state of the CpG site of Differentially Methylated Regions. First,]) NA was extracted from each sample, and bisulfite treatment was performed using CpGenome DNA Modification kit (Intergen).
  • the DNA of the sample was amplified by PCR using the imprint genes Pegl / Mest, Snrpn and Igf2r specific primers which are methylated in a maternal manner.
  • the primers used are as follows.
  • Igf2r (DMR2, Genbank acc.no.L06446)
  • Pegl / Mest and Igi2r amplification products were treated with Taq I for 4 hours at 65 ° C, and Snrpn was treated with Hha I for 4 hours at 37 ° C.
  • the above sample was electrophoresed with 2.5 agarose, and the DNA fragment length was confirmed by staining with ethidiumbumbide.
  • a germ cell derived from the C-kit mutant animal (W gene mutant animal) of the present invention can be formed.
  • the pluripotent cells that could not be established are pluripotent cells that could not be established in the past.
  • Pluripotent cells such as cells can be established.
  • the ability to proliferate established totipotent live cells can be kept high, and the passage was repeated. Enables the use of pluripotent cells for production of chimeric animals.
  • the pluripotent cells that cannot form the germ cells of the present invention are injected into an early embryo of an animal together with other pluripotent cells such as ES cells to generate the other pluripotent cells. It is possible to efficiently produce a chimeric animal transmitted to the lineage, and to control the sex ratio of the chimeric animal born.
  • two or more types of cells including pluripotent cells and other pluripotent cells that have been mutated or deficient in the specific gene of the present invention and have lost the function involved in the gene are injected into the animal's host embryo.
  • two or more types of cells including a pluripotent cell in which a specific gene is altered or deleted and the function involved in the gene is lost and other pluripotent cells are appropriately used. It is possible to make a chimeric animal produce protein of a heterologous animal or to produce a chimeric animal with organ-specific stem cells and organs of the heterologous animal.

Abstract

　同種または異種動物のタンパク質や組織を産生し、または所望の多能性細胞が生殖系列に伝播したキメラ動物ならびに特定の遺伝子を欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞の提供。特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞および該多能性細胞以外の他の多能性細胞を含む２種類以上の細胞を動物の宿主胚に注入することを含む、キメラ動物の作製方法および該方法により製造されたキメラ動物。

Description

ES細胞を用いたキメラ作製 技術分野
本発明は、 生殖細胞形成に関与する遺伝子、 免疫系に関与する遺伝子等の特定 の遺伝子が変異または欠損した多能性細胞を用いてキメラ動物を作成する方法に 関する。
明 背景技術
従来より、 ノックァゥトマウス等のジーン書夕一ゲッティングされた遺伝子が改 変されたマウスの作製のために ES細胞を用いてキメラマウスを形成し、キメラマ ウスを交配していた。
これらの遺伝子改変マウスの作製のためには、 優良な ES細胞を樹立し、 ES細 胞において効率よく遺伝子改変を行い、遺伝子改変された ES細胞がキメラマウス を形成し、 得られたキメラマウスにおいて、 ES細胞で行った遺伝子改変が生殖系 列に伝播され次世代に伝達される必要がある。
ES細胞の樹立はマウスの系統に大きく依存し、 樹立の確立が低く、 また樹立で きた ES細胞は継代を重ねるに従い生殖系列への伝播能を失うため、莫大な労力を つぎ込んで樹立した ES細胞も、できる限り、継代を重ねずに使用する必要があつ た。 特に近交系のマウスを用いる場合は、 その傾向が大きかった。
ES細胞の遺伝子改変が生殖系列に伝播されることについては、 問題が多かった。 特にキメラマウスを作製できても、 生殖系列への伝播がないことは多かった。 実 際には、生殖系列への伝播実績があり、継代を重ねていない ES細胞を入手して使 用していた。
ES 細胞からキメラマウスを選択的に作製する方法としてテトラプロィドレス キュー法があった (Nagy A et a Development 110, 815-821 (1990) )。 該方法 においては、 ES 細胞を 4倍体の受精卵に注入し、 4倍体細胞は胎盤へと発生し、
ES細胞のみが個体へと発生するので、 ES細胞の遺伝子改変が生殖系列に伝播し得 る。
しかしながら、 該方法においては、 得られたキメラマウスは呼吸障害や奇形な どの障害を発症して長く は生存できず （ Eggan K et al.， PNAS 98, 6209-6214 (2001) )生殖系列キメラの有効な作製方法とはなり得なかった。
本発明者は、 これらの問題点を解決し、 生殖キメラを有効に作製する方法を開 発した。 一つは、 生殖細胞を形成することができない初期胚を C- ki t変異マウス の、 Wv/+マウスと W/+マウスとの正逆の交配により得られる受精胚 （Wv/W又は W/Wv) であって、 雌雄両性で生殖細胞を形成することができない （不稔 /不妊） マウスの初期胚に ES細胞を注入し、 ES細胞に由来する生殖細胞のみを有するキ メラマウスを作製する方法 （特許文献 1参照） であった。
また、 本発明者らは、 ES細胞または ES細胞を注入する初期胚の細胞のミ卜コ ンドリア DNAを野生型のミトコンドリア DNAに置換することにより、 ミトコンド リア DNAと核 DNAを適合させることにより、 上記のテトラプロイドレスキュー法 においても、 呼吸障害や奇形等の障害を発症しない、 キメラマウスの作製方法を 開発した （特許文献 2参照）。
しかしながら、 これらの方法によっても、 用いる ES細胞は、 継代を重ねずに増 殖能力および未分化状態および分化能を保っている必要があり、 ES細胞の調製と いう面で効率的ではなかった。 また、 出生するキメラマウスの性比のコントロー ルは不可能であった。
特許文献 1 W 03/071869号国際公開パンフレツ卜
特許文献 2 W0 03/072777号国際公開パンフレツト 発明の開示
本発明は、 特定の遺伝子が変異しまたは欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪 失した多能性細胞および該機能を有する他の多能性細胞を含む 2種類以上の細胞 を用いた新規なキメラ動物.を作製する方法および該方法により作製された、 同種 または異種動物のタンパク質や組織を産生し、 または所望の多能性細胞が生殖系 列に伝播したキメラ動物の提供を目的とする。 さらに、 本発明は特定の遺伝子を 欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞の提供、 ならびに該多能性 細胞を用いて他の多能性細胞を樹立する方法の提供を目的とする。
上述のように、 ES細胞のミトコンドリアを改変し、 あるいは Wv/Wマウス （W /Wvマウス）等の生殖細胞を形成できないマウス由来の胚と ES細胞を用いること により生殖系列キメラマウスを効率的に作製する方法が確立されていた。
しかし、 Wv/Wマウス （W/Wvマウス） 等の生殖細胞を形成できないマウス由 来の受精胚を調製することは非常に手間がかかる作業であり困難であった。
また、キメラマウスを作製する場合に用いる ES細胞は高い増殖能を有している ことが望ましいが、現実的には、高い増殖能を有する ES細胞を樹立することは容 易ではなく、 また樹立した ES細胞も継代を重ねると増殖能が低下し、キメラマウ スを効率的に作製できなくなるという問題があった。 また、 従来得られていた ES 細胞は性染色体が雄 XYであるため、 ES細胞の寄与が大きいとキメラマウスはほ とんどが雄となり、 従来の方法では、 出生するキメラマウスの性比をコント口一 ルすることはできなかった。
近交系マウスの ES細胞は継代を重ねると増殖能が低下するが、 F1交雑系マウ スの細胞と共培養することにより増殖能が低下しないことが知られていた (Axel rod. Dev Biol 101, 225-228, 1984)。
本発明者らは、鋭意検討の結果、生殖細胞を形成しえないマウス胚から ES細胞 を樹立し、該 ES細胞を動物の生殖器官由来の細胞と共培養することにより、効率 的に生殖器官由来の細胞から ES細胞を樹立させることを見出した。 このように、 生殖細胞を形成しえないマウス胚から ES細胞を樹立して宿主胚に所望の ES細胞 と同時に注入することにより、 前述の生殖細胞を形成できないマウス由来の受精 胚を調製することの困難性を解消し得る。 さらに、 前記の生殖細胞を形成しえな いマウスから樹立した ES細胞を、他の ES細胞、例えば遺伝子を改変した ES細胞 と共培養することにより、他の ES細胞の増殖能が改善することができることを見 出した。 さらに、前記の生殖細胞を形成しえないマウス胚から樹立した ES細胞を 他の ES細胞、 例えば遺伝子を改変した ES細胞と共に動物の初期胚に注入し発生 させることにより、他の ES細胞が生殖系列へ伝播されたキメラ動物を作製できる ことを見出した。 このように、 生殖細胞の形成に関与する遺伝子に変異を有し生 殖細胞を形成しえないマウス胚由来の ES細胞と生殖細胞を形成し得る ES細胞を 動物の初期胚に注入し発生させることにより、生殖細胞を形成し得る ES細胞が生 殖系列に伝播するので、キメラ個体の子孫は、該生殖細胞を形成し得る ES細胞由 来となる。
さらに、 本発明者らは、 免疫不全マウスやリンパ球欠損マウス等の胚に由来す る ES細胞などの特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子に関連する機能に障 害を有する動物由来の多能性細胞および他の多能性細胞を動物の初期胚に注入し 発生させることにより、キメラ個体において、特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の細胞が機能することを見出 し本発明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
[1] 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した多 能性細胞および該多能性細胞以外の他の多能性細胞を含む 2種類以上の細胞を動 物の宿主胚に注入することを含む、 キメラ動物の作製方法。
[2] 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した多 能性細胞および該多能性細胞以外の他の多能性細胞を含む 2種類以上の細胞を共 培養した後に動物の宿主胚に同時に注入することを含む、キメラ動物の作製方法。
[3] 共培養が動物の初期胚中で行われる [2]のキメラ動物の作製方法。
[4] 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した多 能性細胞以外の他の細胞由来の遺伝子が機能するキメラ動物である、 [1 ]から [3]のいずれかのキメラ動物の作製方法。
[5] 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した多 能性細胞以外の他の細胞由来の前記変異または欠損した遺伝子に対応する遺伝子 が機能するキメラ動物である、 [1]から [3]のいずれかのキメラ動物の作製方法。
[6] 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した多 能性細胞以外の他の多能性細胞が遺伝子改変を受けた細胞である [ 1 ]から [ 5 ]の いずれかのキメラ動物の作製方法。
[ 7 ] 遺伝子改変が外来遺伝子の導入または内在遺伝子のノックアウトである、 [6]のキメラ動物の作製方法。
[8] 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した多 能性細胞および Zまたは他の多能性細胞が適合型ミトコンドリア篇 Aが導入また は置換された多能性細胞である、 [1]から [7]のいずれかのキメラ動物の作製方 法。
[9] 動物の宿主胚が適合型ミトコンドリア DNAを導入した宿主胚である、 [1] から [8]のいずれかのキメラ動物の作製方法。
[10] 動物の宿主胚が胚盤胞である、 [1]から [9]のいずれかのキメラ動物の 作製方法。
[11〗 動物の宿主胚がテトラプロィドである、 [10]のキメラ動物の作製方法。
[12] 多能性細胞が ES細胞、 EG細胞および GS細胞からなる群から選択される 細胞である [1]から [11]のいずれかのキメラ動物の作製方法。
[13] 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した » 多能性細胞以外の他の細胞が、 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関 与する機能を喪失した多能性細胞に対して動物分類学上同種である [1]から [1
2]のいずれかのキメラ動物の作製方法。
[14] 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した 多能性細胞以外の他の細胞が、 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関 与する機能を喪失した多能性細胞に対して動物分類学上異種である [1]から [1
2 ]のいずれかのキメラ動物の作製方法。
[15] 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した 多能性細胞がマウス、 ラット、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ヒッジ、 ャギおよびサルから なる群から選択される動物由来である [1]から [14]のいずれかのキメラ動物の 作製方法。
[16] 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した 多能性細胞以外の他の細胞がマウス、 ラット、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ヒッジ、 ャギ、 サルおよびヒトからなる群から選択される動物由来である [1]から [15]のいず れかのキメラ動物の作製方法。
[17] 特定の遺伝子が変異または欠損し'、 該遺伝子が関与する機能を喪失した 多能性細胞において、 変異または欠損した遺伝子が
(a) 生殖細胞形成に関与する遺伝子、 (b) 免疫系に関与する遺伝子、 ならびに
(c) 特定の組織もしくは器官の形成に関与する遺伝子または特定のタンパク質を コードする遺伝子
からなる群から選択される 1以上の遺伝子である [1]から [16]のいずれかのキ メラ動物の作製方法。
[18] 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した 多能性細胞が、 異種間交雑により得られた生殖細胞を形成し得ない多能性細胞で ある [1]から [16]のいずれかのキメラ動物の作製方法。
[19] 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した 多能性細胞が、 生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損し、 生殖細胞を 形成し得ない多能性細胞であり、 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が 関与する.機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞が生殖系列に伝播され る [17]のキメラ動物の作製方法。
[20] 生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損し、 生殖細胞を形成し 得ない多能性細胞が C- kit変異動物由来の生殖細胞を形成できない多能性細胞で ある [19]のキメラ動物の作製方法。
[21] C- kit変異動物が Wv/Wvマウスである [20]のキメラ動物の作製方法。
[22] 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した 多能性細胞以外の他の多能性細胞が遺伝子改変を受けた細胞であり、 該遺伝子改 変を受けた多能性細胞が生殖系列に伝播される [19]から [21]のいずれかのキ メラ動物の作製方法。
[23] 遺伝子改変が外来遺伝子の導入または内在遺伝子のノックアウトである、 [22]のキメラ動物の作製方法。
[24] 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した 多能性細胞が、 免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、 免疫機能に障害を 有する多能性細胞である [17]のキメラ動物の作製方法。
[25] 免疫系に関与する遺伝子が変異又は欠損し、 免疫機能に障害を有する多 能性細胞が、 抗体をコードする遺伝子が変異又は欠損し、 抗体産生能を喪失した 多能性細胞である [24]のキメラ動物の作製方法。 [26] 免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、 免疫機能に障害を有する 多能性細胞が免疫不全動物由来の多能性細胞である [24]のキメラ動物の作製方 法。
[273 免疫不全動物が nu/nuマウスまたは scidマウスである [26]のキメラ動 物の作製方法。
[28] 免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、 免疫機能に障害を有する 多能性細胞がリンパ球欠損動物由来の多能性細胞である [24]のキメラ動物の作 製方法。
[2 9] リンパ球欠損動物が RAG- 1遺伝子および Zまたは RAG-2遺伝子が変異ま たは欠損した動物である [28]のキメラ動物の作製方法。
[30] 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した 多能性細胞が特定の組織もしくは器官の形成に関与する遺伝子または特定のタン パク質をコードする遺伝子が変異または欠損した多能性細胞である [ 17 ]のキメ ラ動物の作製方法。
[3 1] 製造されたキメラ動物において、 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該 遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞の前記変異ま たは欠損した遺伝子に対応する遺伝子により、 該遺伝子が関与する特定の組織も しくは器官またはタンパク質が産生される [30]のキメラ動物の作製方法。
[32] 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が閧与する機能を喪失した 多能性細胞が免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損しており、 さらに生殖細 胞形成に関与する遺伝子、 あるいは特定の組織もしくは器官の形成に関与する遺 伝子または特定のタンパク質をコードする遺伝子が変異または欠損している多能 性細胞である [17]のキメラ動物の作製方法。
[33] 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した 多能性細胞以外の他の多能性細胞が、
(a) 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した多能 性細胞以外の他の多能性細胞と該特定の遺伝子が変異または欠損した多能性細胞 に対して動物分類学上同種もしくは異種である細胞との融合細胞、 または
(b) 該特定の遺伝子が変異または欠損した多能性細胞に対して動物分類学上同種 または異種である細胞由来の多能性細胞
である [1]から [32]のいずれかのキメラ動物の作製方法。
[34] 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した 多能性細胞以外の他の多能性細胞に対して動物分類学上同種もしくは異種である 細胞が組織幹細胞または分化細胞である [3 3]のキメラ動物の作製方法。
[3 5] 生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損し、 生殖細胞を 成し 得ない多能性細胞ならびに
(a) 生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損し、 生殖細胞を形成し得な い前記多能性細胞と該生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損した多能 性細胞に対して動物分類学上同種または異種である細胞との融合細胞、 もしくは
(b) 該生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損した多能性細胞に対して 動物分類学上同種または異種である細胞由来の多能性細胞様細胞
を動物の宿主胚に注入することを含む、 前記同種または異種である細胞が生殖系 列に伝播し得る [3 3]または [34]のキメラ動物の作製方法。
[3 6] 免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、 免疫機能に障害を有する 多能性細胞ならびに
(a) 免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、 免疫機能に障害を有する前記 多能性細胞と該多能性細胞に対して動物分類学上異種である細胞との融合細胞、 もしくは
(b) 該多能性細胞に対して異種である細胞由来の多能性細胞様細胞
を動物の宿主胚に注入することを含む、 前記免疫系に関与する遺伝子が変異また は欠損し、 免疫機能に障害を有する多能性細胞および前記異種である細胞がキメ ラ個体の形成に寄与している [3 3]または [34]のキメラ動物の作製方法。
[3 7] [1]から [3 6]のいずれかの方法で製造されたキメラ動物。
[3 8] [1 7]から [2 3]のいずれかの方法で製造されたキメラ動物より、 特定 の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以 外の他の多能性細胞由来の生殖細胞を回収することを含む、 特定の遺伝子が変異 または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性 細胞由来の生殖細胞を製造する方法。 [39] 〖1 7]から [23]のいずれかの方法で製造されたキメラ動物を交配し遺 伝子が改変された動物を子孫として得る遺伝子改変動物の製造方法。
[40〗 [39]の方法で製造された遺伝子改変動物。
[41] [1 7]および [24]から [29]のいずれかの方法で製造されたキメラ動 物またはその子孫であって、 免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、 免疫 機能に障害を有する多能性細胞以外の他の多能性細胞由来の抗体をコードする遺 伝子を有するキメラ動物またはその子孫に抗原を投与することを含む抗体の製造 方法。
[42] [1 7]、 [30]および [3 1]のいずれかの製造方法により製造されたキ メラ動物またはその子孫に、 特定の組織もしくは器官を形成させまたは特定の夕 ンパク質を産生させることを含む、 特定の組織もしくは器官または特定の夕ンパ ク質を製造する方法。
[43] C- kit変異動物由来である、 生殖細胞を形成できない多能性細胞。
[44] C-kit変異動物が Wv/Wvマウスである [43]の多能性細胞。 , [45] 免疫不全動物由来である、 免疫に関与する遺伝子が変異または欠損した 多能性細胞。
[46] 動物が nu/nuマウスまたは scidマウスである [45]の多能性細胞。
[47] リンパ球欠損動物由来である、 免疫に関与する遺伝子が変異または欠損 した多能性細胞。
[48] リンパ球欠損動物が、 RAG- 1遺伝子および/または RAG- 2遺伝子が変異 または欠損した動物である [47]の多能性細胞。
[49] ES細胞、 EG細胞および GS細胞からなる群から選択される細胞である、 [4 3]から [48]のいずれかの多能性細胞。
[50] ミトコンドリア DNAとして適合型ミトコンドリア DNAが導入されている [43]から [49]のいずれかの多能性細胞。
[5 1〗 適合型ミトコンドリア DNAが、 野生型マウス Mus musculus musculus 夕 イブである、 [50]の多能性細胞。
[52] 性染色体型が雄 XY型である、 [43]から [51]のいずれかの多能性細胞。
[53] 性染色体型が雌 XX型である、 [43]から [51]のいずれかの多能性細胞。 [54] [43]から [5 3]のいずれかの多能性細胞と動物の生殖器官由来の細胞 を混合培養して、 初期胚もしくは生殖細胞由来の細胞から多能性細胞を樹立する 方法。
[5 5] 動物の初期胚が雄核発生胚または雌核発生胚である [54]の方法。
[5 6] 混合培養が動物の初期胚中での共培養である [54]または [5 5]の初期 胚もしくは生殖細胞由来の細胞から多能性細胞を樹立する方法。
[57] 初期胚もしくは生殖細胞由来の細胞が、 胚盤胞の内部細胞塊由来の細胞 であり、 多能性細胞が、 ES細胞である [54]から [5 6]のいずれかの多能性細胞 を樹立する方法。
[58] 初期胚もしくは生殖細胞由来の細胞が、 始原生殖細胞であり、 多能性細 胞が、 EG細胞である [54]から [5 6]のいずれかの多能性細胞を樹立する方法。
[5 9] 初期胚もしくは生殖細胞由来の細胞が、生殖細胞であり、多能性細胞が、 GS細胞である [54]から [56]のいずれかの多能性細胞を樹立する方法。
[6 0] [43]から [53]のいずれかの多能性細胞と他の多能性細胞を共培養す ることを含む、 該他の多能性細胞の増殖能を向上させる方法。
[6 1] 共培養が動物の初期胚中で行われる [6 0]の他の多能性細胞の増殖能を 向上させる方法。
[6 2] 他の多能性細胞が、 ES細胞、 EG細胞および GS細胞からなる群から選択 される細胞である [6 0]または [6 1]の多能性細胞の増殖能を向上させる方法。
[6 3] 他の多能性細胞が遺伝子が改変されている多能性細胞である、 [6 0]か ら [6 2]のいずれかの多能性細胞の増殖能を向上させる方法。
[64] [43]から [53]のいずれかの多能性細胞を他の多能性細胞と共に動物 の宿主胚に注入することを含む、 生殖細胞が他の多能性細胞に由来する生殖系列 キメラ動物の作製方法。
[6 5] [43]から [53]のいずれかの多能性細胞および/または他の多能性細 胞が適合型ミトコンドリア DNA が導入または置換された多能性細胞である、 [6 4]の生殖系列キメラ動物の作製方法。
[6 6] 動物の宿主胚が適合型ミトコンドリア DNAを導入または置換した宿主胚 である、 [64]または [6 5]の生殖系列キメラ動物の作製方法。 [6 7] 動物の宿主胚が胚盤胞である、 〖64]から [6 6]のいずれかの生殖系列 キメラ動物の作製方法。
[6 8] 動物の宿主胚がテトラプロイドである、 [6 7]の生殖系列キメラ動物の 作製方法。
[6 9] 他の多能性細胞が、 ES細胞、 EG細胞および GS細胞からなる群から選択 される細胞である [64]から [6 8]のいずれかの生殖系列キメラ動物の作製方法。
[7 0] 動物がマウスである、 [64]から [6 9]のいずれかの生殖系列キメラ動 物の作製方法。
[7 1] 他の多能性細胞が遺伝子が改変されている多能性細胞である、 [64]か ら [70]のいずれかの生殖系列キメラ動物の作製方法。
[72] [43]から [53]のいずれかの多能性細胞と他の多能性細胞を共培養し、 共培養した細胞を共に動物の宿主胚に注入することを含む、 生殖細胞が他の多能 性細胞に由来する生殖系列キメラ動物の作製方法。
[7 3] 共培養が動物の初期胚中で行われる [7 2]の生殖系列キメラ動物の作製 方法。
[74] [43]から [53]のいずれかの多能性細胞および他の多能性細胞が適合 型ミトコンドリア DNAが導入された多能性細胞である、 [7 2]または [7 3]の生 殖系列キメラ動物の作製方法。
[7 5] 動物の宿主胚が適合型ミトコンドリア DNAを導入した宿主胚である、 [7 2]から [74]の生殖系列キメラ動物の作製方法。
[7 6] 動物の宿主胚が胚盤胞である、 [7 2]から [7 5]のいずれかの生殖系列 キメラ動物の作製方法。
[7 7] 動物の宿主胚がテトラプロイドである、 [7 6]の生殖系列キメラ動物の 作製方法。
[7 8] 他の多能性細胞が、 ES細胞、 EG細胞および GS細胞からなる群から選択 される細胞である [7 2]から [7 7]のいずれかの生殖系列キメラ動物の作製方法。
[7 9] 動物がマウスである、 [7 2]から [7 8]のいずれかの生殖系列キメラ動 物の作製方法。
[80] 他の多能性細胞が遺伝子が改変されている多能性細胞である、 [7 2]か ら [7 9]のいずれかの生殖系列キメラ動物の作製方法。
[8 1] [64]から [80]のいずれかの方法により作製されたキメラ動物。 ' [8 2] [55]の方法により樹立した雄核発生胚または雌核発生胚由来の多能性 細胞を動物の生殖器官に移植することにより生殖細胞を作製する方法。
[8 3] 雄核発生胚由来の ES細胞を、動物の輸精管に移植することにより精子を 作製する [82]の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2004- 211887号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、本発明の方法で 129.B6- YGFPES細胞おょぴ WV/WVES細胞を用いてキ メラマウスを作製した場合の、 移植数、 新生仔数等を示す図である。
図 2は、 129. B6-YGFP ES細胞および WV/WVES細胞を用いて本発明の方法で作 製したキメラマウスの写真である。
図 3は、 129. B6-YGFP ES細胞おょぴ WV/WVES細胞を用いて本発明の方法で作 製したキメラマウスの蛍光を示す写真である。
図 4は、 BS- neo ES細胞および WV/WVES細胞を用いて本発明の方法で作製し たキメラマウスの写真である。
図 5は、 本発明の方法によるキメラ作製の概要を示す図である （実施例 7)。 図 6は、 本発明の方法によるキメラ作製の概要を示す図である （実施例 8)。 図 7は、 本発明の方法の概要を示す図である。
図 8は、 雄核発生胚由来 ES細胞からの精子の形成を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した 多能性細胞おょぴ該多能性細胞以外の他の多能性細胞を含む 2種類以上の細胞を 用いてキメラ動物を作製する方法において、 変異または欠損した遺伝子は限定さ れず、 遺伝子の変異または欠損により特定の機能が失われる遺伝子ならばいずれ の遺伝子も含まれる。 ここで、 「特定の遺伝子が変異しまたは欠損し該遺伝子が関 与する機能を喪失した」 とは、 遺伝子の塩基配列の一部または全部において、 欠 失、 置換等が生じ、 あるいは遺伝子に塩基の付加等が生じ、 遺伝子の機能が失わ れあるいは低下することをいう。多能性細胞自体が該機能を喪失している場合も、 多能性細胞由来のキメラ個体やその子孫個体が該機能を喪失している場合も含む。
「遺伝子の機能」 とは、 該遺伝子が発現し体内で特定の物質が産生され、 または 器官、 組織等が形成されること、 該遺伝子が発現し、 体内で特定の物質が産生さ れ該物質により体内で特定の反応が生じること等、 遺伝子が関与するあらゆる機 能を包含する。 本発明の 「特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する 機能を喪失した多能性細胞」 は、 「目的とする細胞，組織，器官、 タンパクなどに 関わる遺伝子を欠損した多能性細胞」 であり、 ここで目的とする細胞 ·組織 ·器 官、タンパクとは、キメラ動物に産生させようと意図する臓器、タンパクをいう。 本発明の多能性細胞とは、 あらゆる細胞に分化し得る細胞をいう。 多能性細胞 には、 生殖細胞に分化し得る全能性細胞や動物の組織に分化し得る組織性幹細胞 がある。全能性細胞には、胚性幹細胞（ES細胞）、 EG細胞（Embryonic germ ce l l、 胚性生殖細胞）、 _ GS細胞等が含まれる。 ここで、 内部細胞塊由来細胞を ES細胞、 始原生殖細胞由来細胞を EG細胞、 生殖細胞由来細胞を GS細胞という。 また、 全 能性細胞と性質が似ており、 多能性を有していて生殖細胞に分化し得る細胞を、 全能性細胞様細胞という場合があり、 例えば ES細胞様細胞（ES様細胞）、 EG細胞 様細胞 （EG様細胞）、 GS細胞様細胞 （GS様細胞） 等があるが、 本発明において多 能性細胞という場合、 これらの多能性細胞様細胞と呼ばれる細胞も含まれる。 例 えば、 ES細胞様細胞は、動物の組織性幹細胞や分化した体細胞を形質転換したり、 あるいは ES 細胞と動物の組織性幹細胞や分化した体細胞を融合することにより 得られる。
本発明の方法により得られたキメラ個体は、 少なくとも特定の遺伝子が変異ま たは欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞由来の分化細胞等の細 胞および前記他の多能性細胞由来の分化細胞等の細胞から形成される。 キメラ動 物の作製にこれらの 2種類の細胞以外の細胞を用いた場合は、 キメラ個体は該 2 種類の細胞以外の細胞からも構成される。 「 2種類の細胞以外の細胞」は限定され ないが、 例えば、 動物の組織幹細胞や動物の分化した体細胞等が挙げられる。 該キメラ個体においては、 特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与す る機能を喪失した多能性細胞由来細胞以外の細胞、 該細胞の有する染色体、 該細 胞の有する遺伝子が機能している。 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子 が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞には、 特定の遺伝子 が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞に対して動物 分類学上異なる動物種由来細胞の多能性細胞も動物分類学上同一の動物種由来の 多能性細胞も含まれる。 ここで、 「特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関 与する機能を喪失した多能性細胞由来細胞以外の細胞、 該細胞の有する染色体、 該細胞の有する遺伝子が機能している」 とは、 例えば、 多能性細胞由来細胞以外 の細胞が特定の物質を産生したり、 該細胞が特定の器官や組織を形成したりする ことをいい、 「該細胞の有する遺伝子が機能している」 の 「遺伝子」 は、 「特定の 遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞」 にお いて変異または欠損した特定の遺伝子と同じ遺伝子であっても、 異なる遺伝子で あってもよい。 好ましくは、 特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与す る機能を喪失した多能性細胞由来細胞以外の細胞の有する前記変異または欠損し た遺伝子に対応する遺伝子が機能している。 ここで、 「前記変異または欠損した遺 伝子に対応する遺伝子」 とは、 前記変異または欠損した遺伝子と同一の遺伝子ま たは塩基配列の相同性の高い遺伝子であって、 前記変異もしくは欠損した遺伝子 が関与する機能と同一もしくは類似の機能を有している遺伝子をいう。
特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細 胞として、 例えば、 生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損した多能性 細胞、 免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損した多能性細胞、 特定の組織も しくは器官の形成に関与する遺伝子または特定のタンパク質をコードする遺伝子 などのその他の遺伝子が変異または欠損した多能性細胞等が挙げられる。 すなわ ち、 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した多能 性細胞において、 変異または欠損した遺伝子が（a) 生殖細胞形成に関与する遺伝 子、 （W 免疫系に関与する遺伝子、 ならびに（c) 特定の組織もしくは器官の形成 に関与する遺伝子または特定のタンパク質をコ一ドする遺伝子からなる群から選 択される 1以上の遺伝子である多能性細胞を用いることができる。 この場合、 特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失し た多能性細胞以外の他の多能性細胞は、 該遺伝子が変異および欠損していない多 能性細胞であり、 例えば、 生殖細胞形成能を有している多能性細胞、 免疫機能に 関して障害を有していない多能性細胞、 あるいは特定の組織もしくは器官の形成 に関与する遺伝子または特定のタンパク質をコードする遺伝子が変異も欠損もし ていない多能性細胞である。
該他の多能性細胞において、所望の遺伝子が改変されていてもよい。この場合、 特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞 として、 生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損した多能性細胞を用い た場合、 得られるキメラ動物において形成される生殖細胞は所望の遺伝子が改変 された細胞由来であるので、 該キメラ動物から得られる子孫個体は、 所望の遺伝 子が改変されたトランスジエニック動物である。 所望の遺伝子の改変は、 多能性 細胞が元々有していない外来遺伝子の導入でもよく、 また多能性細胞が元々有し ている内在性遺伝子のノックアウトであってもよい。 外来遺伝子としては、 例え ば動物分類学上の他種動物由来の遺伝子等が挙げられる。 所望の遺伝子の改変は 公知の方法で行うことができる。
さらに、 特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した 多能性細胞以外の他の多能性細胞は、 特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子 が関与する機能を喪失した多能性細胞と他の細胞との融合細胞であつてもよく、 また動物の組織性幹細胞 （臓器特異性幹細胞、 体性幹細胞） や分化した体細胞を 公知の手段で形質転換した多能性細胞様細胞であつてもよい。組織性幹細胞とは、 成熟した動物の組織に存在し該組織または他の組織細胞へと分化し、 該組織を形 成し得る細胞をいう。 例えば、 脳幹細胞、 肝幹細胞、 膝幹細胞、 腎幹細胞、 心臓 幹細胞、 血管幹細胞、 造血幹細胞、 骨髄幹細胞、 神経幹細胞、 網膜幹細胞、 表皮 幹細胞、 毛嚢幹細胞、 間葉系幹細胞等がある。 これらの幹細胞は、 それぞれ特異 的な表面抗原を有し、 該抗原に特異的な抗体を用いて単離したり、 あるいは蛍光 標識した前記抗体を用いてセルソ一夕一等を利用して単離することができる。 ま た、 幹細胞が色素 Hoec s t 33342を排出することを利用して SP (S ide popu l at i on) 細胞として単離することもできる。 幹細胞を単離する方法は当業者には周知であ る。 これらの組織幹細胞の単離や分化能については、 実験医学， Vol, 18, No. 4, 2000, p. 420 - 460、 実験医学， Vol. 19, No. 3, 2001, 326 - 369、 実験医学， Vol. 19, No. 15, 2001、 実験医学， Vol. 21, No. 8, 2003 等に記載されており、 これらの文 献の記載に従って、 幹細胞を単離し、 あるいは所望の幹細胞を選択することがで きる。多能性細胞である ES細胞と分化細胞の融合細胞を宿主胚に注入し発生させ た場合に、該融合細胞が個体に寄与し、機能し得ることは確認されている（Tada et al. , Dev Dyn. 227, 504-510, 2003)。
これらの幹細胞や分化した体細胞を他の ES 細胞等の多能性細胞と共培養した りすることにより、 形質転換 （分化転換） した多能性細胞を得ることが出来る (Andrew et al. . Nature 430, 350-356, 2004) (Ying et al. , Nature 416, 545-548, 2002) (Terada et al. , Nature 430, 542-545, 2002) 0
生殖細胞由来の細胞を ES細胞等の多能性細胞と共培養することにより、生殖器 官由来の細胞からの多能性細胞を樹立することができる。 例えば、 雄核発生胚 (androgenet ic embryo)や雌核発生胚（gynogenet k embryo)を多能性細胞と共培養 することで、 雄核発生胚由来の ES細胞等の多能性細胞や雌核発生胚由来の ES細 胞等の多能性細胞を樹立することができる。 共培養は、 培養用ディッシュ等の培 養用容器中で行なえばよい。 この際、 培養容器に適当なフィーダ一細胞を播いて おいてもよい。 雄核発生胚は、 受精卵からの雌性前核を除去し、 別の受精卵から 採取した雄性前核を移植することにより作製することができ、 雌核発生胚は、 受 精卵からの雄性前核を除去し、 別の受精卵から採取した雌性前核を移植すること により作製することができる。 すなわち、 本発明は、 雄核発生胚または雌核発生 胚を ES細胞等の多能性細胞と共培養し、 雄核発生胚または雌核発生胚由来の ES 細胞を樹立する方法をも包含する。
共培養する他の多能性細胞としては、 キメラ動物の作製の際に動物の宿主胚に 注入する特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多 能性細胞を用いればよい。
細胞の融合は、 エレクトロボレ一シヨン法、 PEG 法等の公知の方法で行うこと ができる。 形質転換により 2倍体である多能性様細胞が得られ、 融合により 4倍 体である多能性様細胞が得られる。 この際、 一方の細胞をコルヒチン等のコルセ ミドで処理することで微小核体としてもよいし、 マイトマイシン Cや放射線で処 理して不均等融合させてもよい。 一方のミトコンドリア DNAを公知の方法で除去 後、 融合に用いることも出来る。
なお、 特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多 能性細胞以外の他の多能性細胞として、 前記特定の遺伝子が変異または欠損し該 遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞との融合細胞を用いる塲合および組 織幹細胞や体細胞を特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を 喪失した多能性細胞と共培養し多能性細胞様細胞に形質転換して用いる場合、 調 製した融合細胞または多能性様細胞中に特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝 子が関与する機能を喪失した多能性細胞が含まれている。 この場合であっても、 キメラ動物作製の際、 該多能性細胞を同時に宿主胚に注入すればよい。 それ以外 に、 特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性 細胞以外の他の多能性細胞として、 特定の遺伝子が関与する機能を持つ （異種細 胞、染色体などが導入された融合細胞など）と未受精卵または脱核受精卵を融合 · 活性化 ·培養を行つた結果得られる胚盤胞期胚由来多能性細胞、例えば ES様細胞 を宿主胚に注入することも可能であろう。 このように、 融合細胞または多能性細 胞様細胞を調製する際に用いた特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関 与する機能を喪失した多能性細胞をそのまま同時に宿主胚に注入する場合も、「特 定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞 および該多能性細胞以外の他の多能性細胞を含む 2種類以上の細胞を動物の宿主 胚に注入」 するに該当する。
用いる組織幹細胞や体細胞は、 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が 関与する機能を喪失した前記多能性細胞に対して動物分類学上の同種でも異種で あってもよい。
前記特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能 性細胞が生殖細胞形成に関与する遺伝子である場合、 例えば、 特定の遺伝子が変 異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞由来細胞以外の細 胞から生殖細胞が形成され得る。 また、 前記特定の遺伝子が変異または欠損し該 遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞が免疫系に関与する遺伝子である場 合、 例えば、 特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失し た多能性細胞由来細胞以外の細胞が抗体を產生する等免疫担当細胞として機能す る。 あるいは、 特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失 した多能性細胞由来細胞以外の細胞は、 キメラ個体形成の際に、 免疫系が関与す る遺伝子が変異または欠損した細胞の免疫機構により攻撃 ·排除されることがな いので、 キメラ個体において、 特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与 する機能を喪失した多能性細胞由来細胞以外の細胞が特定の物質を産生し、 ある いは特定の器官や組織を形成する。
生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損しており生殖細胞を形成でき ない多能性細胞としては、 例えば、 C- ki t 変異動物 （W遺伝子変異動物） 由来の 細胞がある。 C- ki t は、 W遺伝子座にマップされる、 レセプター型チロシンキナ —ゼのひとつであり、 不妊等に関与する。 C- ki t 変異動物として、 例えば Wv/Wv マウスが挙げられる。 WVWVマウスは、 雌雄両性で生殖細胞を形成することがで きない (不稔 不妊) マウスである。 C- ki t変異動物の一つである Wv/Wvマウス は、 例えば、 後述の実施例 1に記載の方法により得ることができる。 他の C- ki t 変異動物も Wv/Wvマウスの作製法に従って、 作製することができる。 また、 この 場合、 該多能性細胞は、 生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損してお り、 生殖細胞形成という機能を欠損している。 この多能性細胞と該多能性細胞に 対して同種または異種であり、 生殖細胞を形成し得る他の多能性細胞を混合して 動物の初期胚に注入することにより、 生殖細胞を形成し得る多能性細胞が生殖系 列に伝播し得るキメラ動物を得ることができる。
生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損し、 生殖細胞を形成し得ない 多能性細胞に対して同種または異種である細胞がマウス、 ラット、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ヒッジ、 ャギ、 サルおよびヒトからなる群から選択される。
該生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損しており生殖細胞を形成で きない多能性細胞と一緒に宿主胚に注入する他の多能性細胞として、 例えば遺伝 子改変を受けた細胞が挙げられ、 遺伝子改変として外来遺伝子の導入または内在 遺伝子のノックァゥトが挙げられる。 これらの細胞を動物の宿主胚に注入するこ とにより、 前記の遺伝子改変を受けた細胞が生殖系列に伝播し得るキメラ動物を 作製することができる。 このようにして得られたキメラ動物においては、 遺伝子 改変を受けた細胞から生殖細胞が形成され、 またキメラ動物の子孫を得ることに より遺伝子改変を受けた動物がトランスジエニック動物として産生される。また、 一緒に宿主胚に注入する他の多能性細胞は、 該生殖細胞形成に関与する遺伝子が 変異または欠損しており生殖細胞を形成できない多能性細胞に対して動物分類学 上の異種であつてもよく、 この場合得られたキメラ動物は異種動物の生殖細胞を 形成する。 該異種動物の生殖細胞は、 異種動物の染色体を有するため、 得られた 動物より異種動物の染色体を有する器官や組織の幹細胞や器官や臓器自体が得ら れ、 また得られた動物が有する異種動物の染色体を有する体細胞より、 異種動物 の夕ンパク質等の物質を得ることができる。
免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、 免疫機能に障害を有する多能性 細胞として、 例えば、 ヌードマウス（nu/nuマウス） や sc idマウス等の免疫不全 動物由来の多能性細胞が挙げられる。 ここで、 「免疫機能に障害を有する」 とは、 T細胞、 B細胞、 NK細胞、 樹状細胞等の免疫担当細胞を形成できないこと、 ある いは抗体を産生し得ず、 異種由来細胞、 異種由来組織、 異種由来物質等を排除す る機能が喪失または低下していることをいう。
ヌードマウスとは、先天的に胸腺を欠失したマウスであり、第 11染色体の劣性 遺伝子である nu遺伝子がホモ型であるマウスである。すなわち、 ヌードマウス由 来の多能性細胞は、 nu遺伝子に関してホモ型である多能性細胞である。 scidマウ スとは、 ヒトの重症複合免疫不全勝 （SCID)と同様の病態を呈するマウスをいい、 劣性遺伝子である sc id 遺伝子がホモ型であるマウスである sc id マウスには、 NOD/sc idなどがある。 すなわち、 sc idマウス由来の多能性細胞は、 scid遺伝子 に関してホモ型である多能性細胞である。 ヌードマウス、 scidマウス等の免疫不 全マウス、 RAG- 1遺伝子および または RAG-2遺伝子を欠失したリンパ球欠損マ ウス（Chen e t al , Pro Nat l. Acad, Sc i. USA90, 4528-4532, 1993)は市販のも のを入手するかまたは文献の記載に従って入手することができる。
このような免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、 免疫機能に障害を有 する多能性細胞と免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、 免疫機能に障害 を有する多能性細胞に対して動物分類学上の異種である他の多能性細胞を動物の 宿主胚に注入することにより、前記免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、 免疫機能に障害を有する多能性細胞および前記異種である細胞がキメラ個体の形 成に寄与しているキメラ動物を製造することができる。 免疫系に関与する遺伝子 が変異または欠損し； 疫機能に障害を有する多能性細胞がマウス、 ラット、 ブ タ、 ゥシ、 ゥマ、 ヒッジ、 ャギ、 サル等の動物由来の多能性細胞を用いることが できる。 例えば、 免疫不全マウス由来の多能性細胞と、 ヒトの抗体をコードする 遺伝子を含む多能性細胞を用いてキメラマウスを作製した場合、 該キメラマウス はヒト抗体遺伝子を含んでいる。 該キメラマウスに抗原を投与することによりキ メラマウスにヒト抗体を産生させることができる。 さらに、 免疫系に関与する遺 伝子が変異または欠損し、 免疫機能に障害を有する多能性細胞として、 T細胞お よび B細胞等のリンパ球の形成能を喪失した多能性細胞が挙げられ、 例えば、 遺 伝子再構成に関与した RAG-1遺伝子や RAG- 2遺伝子を欠失した動物由来の多能性 細胞が挙げられる。 このような多能性細胞も免疫機能が欠損しており、 上記の免 疫不全動物由来の ES細胞を用いる場合と同様に、 他種動物由来の ES細胞と混合 しキメラ動物を作製することができる。
さらに、 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失し た多能性細胞以外の他の多能性細胞として、 特定の組織もしくは器官の形成に関 与する遺伝子または特定のタンパク質をコードする遺伝子が変異または欠損して、 該組織もしくは器官の形成能または該タンパク質の産生能を喪失した多能性細胞 が挙げられる。 特定の組織もしくは器官の形成に関与する遺伝子は限定されず、 特定の臓器の形成に関与する遺伝子等が挙げられる。 特定のタンパク質をコード する遺伝子も限定されず、 例えばサイト力インなどの生理活性物質、 免疫グロブ リン等をコードする遺伝子が挙げられる。 このような特定の組織もしくは器官の 形成に関与する遺伝子または特定のタンパク質をコードする遺伝子が変異または 欠損して、 該組織もしくは器官の形成能または該タンパク質の産生能を喪失した 多能性細胞を該遺伝子が変異および欠損していない他の多能性細胞とともに用い てキメラ動物を製造することにより、 得られたキメラ動物において、 他の多能性 細胞由来の組織もしくは器官が形成され、 またはタンパク質が産生される。 他の 多能性細胞が特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失 した多能性細胞に対して動物分類学上の異種である場合、 キメラ動物において異 種組織または器官が形成され、 または異種タンパク質が産生される。 特定の遺伝 子が変異または欠損は、 公知の遺伝子操作技術により行うことができる。
また、 複数の遺伝子が変異または欠損し、 複数の機能を喪失した多能性細胞を 用いることもできる。 すなわち、 変異または欠損した遺伝子が（a) 生殖細胞形成 に関与する遺伝子、 （b) 免疫系に関与する遺伝子、 ならびに（c) 特定の組織もし くは器官の形成に関与する遺伝子または特定のタンパク質をコードする遺伝子か らなる群から選択される 1以上の遺伝子である多能性細胞を用いることができる。 例えば、 Wv遺伝子と nu遺伝子の両方に関してホモであるマウス、 すなわち生殖 細胞を形成することができず、 なおかつ免疫不全であるマウス由来の多能性細胞 を用いることができる。
さらに、 複数の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失し た多能性細胞として、 異種間交雑により得られた生殖細胞を形成し得ない多能性 細胞を用いることもできる。 生殖細胞を形成し得ない多能性細胞は、 生殖細胞を 形成し得ない初期胚から得ることができ、 生殖細胞を形成し得ない初期胚、 例え ば受精胚は遺伝的要因により起こる生殖細胞の形成不全を利用することで作製す る。 すなわち、 異種交雑種第 1代は不稔を示し生殖細胞を欠失することが知られ ており、 この遺伝的要因を利用して作製する。 例えば、 マウスを用いる場合、 実 験用マウス（Mus musculus domes t icus)とその同胞異種関係にあるマウスを自然交 配して異種交雑受精胚を得る。 このとき繁殖能力に優れた実験用マウスの雌から 卵子を得る方が望ましい。 すなわち、 実験用マウスの雌とその同胞異種関係にあ る雄を自然交配して異種交雑受精胚を得ることが望ましい。 特に、 3週齢から 4 週齢の若齢期実験用雌マウスをホルモン処理して過剰排卵を誘起した後に交配す ることで多くの受精胚を得ることができる。 更に、 過剰排卵を誘起した若齢期の 実験用雌マウスから採取した卵子と異種マウスの精子を体外受精して得た異種交 雑種胚を効率よく大量に得ることができる。 実験用マウスは C57BL/6などが使用 できる。
一方、 交配相手である異種マウスは Mus spretus や Mus carol i, Mus pahari 等が使用できるが、 体外受精に関する情報が比較的集積されている Mus spre tus が好ましく、異種交雑種胚を安定して得ることができる C57BL/6雌性マウスと Mus spretus 雄性マウスの組み合わせが好ましい。 上記ではマウスについて例示した が、本発明の多能性細胞はマウスに限定されずあらゆる動物の多能性細胞を含む。 他の動物においてもマウスと同様に操作することにより、 異種間交雑により得ら れた生殖細胞を形成し得ない多能性細胞を得ることができる。 なお、 異種間交雑 により得られた生殖細胞を形成し得ない多能性細胞は WO 03/071869号国際公開パ ンフレツ卜の記載に従っても得ることができる。
上記のように 2種類以上の細胞を動物の胚盤胞等の初期胚である宿主胚に注入 し、 該初期胚を仮親の子宮に移植することにより、 キメラ動物を形成することが できる。 また、 この際、 テトラプロイドレスキュー法により所望の多能性細胞の 遺伝子が生殖細胞に伝播されたキメラ動物を作製することもできる。 テトラプロ ィドレスキュー法は、 4倍体の受精卵に ES細胞等の多能性細胞を注入することに より、 4倍体細胞は胎盤へと発生し、 ES細胞等の多能性細胞のみが個体へと発生 することを利用した多能性細胞が生殖系列に伝播したキメラ動物を作製する方法 である （Nagy A et al. , Development 110， 815-821 (1990) ) 0 テトラプロイドレ スキュー法でキメラ動物を作製する場合は、 出生してきた動物の呼吸障害による 死亡を防止するために、 4倍体受精卵または ES細胞のミトコンドリア DNAを核 DNA と適合させておくのが望ましい。 テトラプロイドレスキュー法を行う際のミ トコンドリア DNAを核 DNAと適合させる方法については後述する。
図 7に本発明の方法によるキメラ動物作製法の概要を示す。
このように、 特定の遺伝子が変異しまたは欠損し該遺伝子が関与する機能を喪 失した多能性細胞おょぴ該機能を有する他の多能性細胞を含む 2種類以上の細胞 を用いてキメラ動物を作製することには、 以下に述べる利用法がある。
( 1 ) 遺伝子改変動物由来の生殖細胞の生産
( 2 ) 遺伝子改変動物の生産
( 3 ) 異種動物由来の幹細胞の生産
( 4 ) 異種動物由来の細胞、 組織または器官の生産
( 5 ) 異種動物由来の生殖細胞の生産
( 6 ) 異種動物の生産 ( 7 ) 異種動物由来細胞を含むキメラ組織または器官の生産
( 8 ) 異種体細胞による目的物質の生産
さらに、 これとは別に再生医療の視点からレシピエント （ここでは免疫不全マ ウス） に臓器幹細胞や生殖幹細胞を移植した場合、 生着はするが増殖しないこと や目的の細胞に分化しないことが多々ある。 これは異種細胞を取り巻く細胞環境 が本来の環境と細胞、 分子レベルであまりにも異なるためと考えられる。 一方、 本発明の方法において生産されるキメラの臓器は、 異種細胞、 マウス細胞、 様々 なハイプリッド細胞が混在していると考えられる。 この状況は異種幹細胞や目的 の染色体や遺伝子を持つハイプリット細胞が増殖、 機能するためには有利である と考えられる。 また更に、 このようなキメラ個体に異種臓器幹細胞を移植する場 合にも有利と考えられる。 将来的に異種幹細胞の増殖、 分化に必要な物質 （遺伝 子）が明らかになつた場合にもマウス ES細胞を用いているため遺伝子改変を容易 に行なうことが可能である。
また臓器移植に用いる目的で、 急性拒絶反応の抗原性に関与する酵素を欠損し たノックァゥトクローンブ夕が作成されている。 これらのブ夕から更に免疫不全 ブタを作成し、 本発明の方法で、 ヒト細胞とブ夕細胞の融合細胞を作製し、 キメ ラ動物を作成すればよりヒト臓器に近いものが出来る。
本発明は、 上記の方法で得られたキメラ動物およびその子孫をも包含する。 さらに、 本発明は、 特定の遺伝子が変異しまたは欠損し該遺伝子が関与する機 能を喪失した多能性細胞それ自体も包含する。 該多能性細胞に含まれる細胞は上 記のとおりである。
以下、 本発明の多能性細胞の作製法および利用法を Wv/Wvマウス胚由来の ES 細胞を例に詳細に説明するが、 多能性細胞の由来は Wv/Wvマウスに限られず、 nu/nuマウスや scidマウス等の免疫不全マウス、 リンパ球欠損マウス、 他のマウ ス、 ラット、 ゥシ、 ゥマ、 ヒッジ、 ャギ、 サル等の他の動物も含まれる。 また、 多能性細胞も ES細胞には限定されず、 EG細胞や GS細胞も含まれる。
ES細胞は哺乳類の発生過程において胚盤胞の内部細胞塊を in vi tro で培養す ることにより樹立することができる（Evans, M. J. e t al. , Nature, 292 : 154-156,
1981 ; Thomson, J. A. , Science, 282 : 1145-1147, 1998)。 胚で ES細胞からキメラマウスが形成されるためには、 樹立した ES細胞が高い 増殖能を有している必要がある。増殖能は in vi t roにおける増殖能および胚中で の増殖能の両方を含む。
すなわち、 ES細胞は、 胚盤胞の内部細胞塊の細胞を in v i t ro で培養すること により、樹立することができるが、 この際に他の ES細胞や 4倍体胚と共培養する ことにより、未分化状態、分化能および増殖能が大きい ES細胞を樹立することが 出来る。 また樹立率も向上する。 ここで用いる ES細胞は目的とする ES細胞と識 別、分離が可能であればよいが、生殖系列キメラ作製を目的とする ES細胞の樹立 の場合には生殖細胞を形成しない Wv/Wvマウス胚由来 ES細胞が望ましい。 例え ば、 KKマウスの場合 Wv/Wvマウス胚由来の ES細胞と共培養しない場合の樹立率 が 0 %であるのに対して、 共培養した場合は 5 0 %に上昇する。 共培養は、 培養 用ディッシュ等の培養用容器中で行なえばよい。 この際、 培養容器に適当なフィ ーダ一細胞を播いておいてもよい。 さらに、 共培養は、 内部細胞塊 （I CM) を構成 する初期胚中で行ってもよい。 この場合、 共培養しょうとする複数の細胞をマイ クロマ二ュピレ一夕一等を用いて初期胚中に注入し、 培養すればよい。 一定期間 の共培養後、 共培養した細胞を回収し、 4倍体は胚 （テトラプロイド） 等のキメ ラ動物の作製のための初期胚中に注入すればよい。 用いた初期胚は、 繰り返し共 培養に用いることができる。また、初期胚としてテトラプロイドを用いてもよい。 上記の方法は核移植胚ゃ雄性胚など ES 細胞を樹立する事が困難な再構築胚から も ES細胞を効率的に樹立することが出来る。また Wv/Wvマウス胚由来 ES細胞や 4倍体胚と共培養した再構築胚はそのままキメラ動物の作製に用いることも出来 る。
また、 後述のように、 キメラ動物の作製のための初期胚に共培養しょうとする 複数の ES細胞を注入し、 そのままキメラ動物を作製してもよい。
本発明の Wv/Wvマウス胚由来の ES細胞を用いた他の ES細胞の樹立は、例えば 後述の実施例 5記載の方法で行えば良い。
本発明の Wv/Wvマウス胚由来の ES細胞を他の ES細胞、 例えば、 外来遺伝子の 導入や特定の遺伝子のノックアウト等の所望の遺伝子改変を行った ES 細胞と共 培養し、 同時に初期胚に入れることにより、所望の ES細胞の培養中の増殖能が高 められ、 なおかつ胚に移植した後の該 ES細胞の増殖も良好となり、 該 ES細胞の 遺伝子が生殖系列に伝播されたキメラマウスを得ることができる。 また、 本発明 の W/Wマウス胚由来の ES細胞と共培養した他の ES細胞の形態も良好に保たれ る。良好な ES細胞のコロニーは輪郭が丸くはっきりしており、細胞が盛り上がつ て増殖している。 これに対して悪い ES細胞のコロニーは偏平で形が崩れている。 一方、 Wゾ Wvマウス胚由来の ES細胞は、 生殖細胞が形成されないため、 該 ES 細胞が生殖系列に伝播されることはない。 すなわち、 本発明の方法でキメラ動物 を得た場合、 得られたキメラ動物の精子又は卵子は Wv/Wvマウス胚由来の ES細 胞ではない他の ES細胞に由来し、 次世代の産仔には必ず該 ES細胞に由来した染 色体が伝播する。 この際、所望の ES細胞はいずれのマウス系統由来のものも用い ることができるが、 C57BL/6 または 129 系統由来の ES 細胞が望ましく、 特に C57/BL6由来の ES細胞が望ましい。 また、 このとき市販の ES細胞を用いてもよ い。
また、 この際、 Wv/Wvマウス胚由来の ES細胞と共培養する代わりに、 他の ES 細胞の樹立の際に WVWVマウス胚由来の ES細胞のコンディシヨンメディウムを 添加した培地を用いても、 培養中の増殖能が高められ、 なおかつ胚に移植した後 の増殖能が高められた ES細胞を樹立することができる。コンディションメディゥ ムは、 例えば Mart in et aL , Dev Bi ol 121, 20-28, 1987の記載に従って調製で きる。
この時、 所望の ES細胞と共培養する、 Wv/Wvマウス胚由来の ES細胞の増殖能 が一定の範囲にあることが望ましい。 該 ES細胞の増殖能が低いと共培養する ES 細胞の増殖能を改善することができず、一方該 ES細胞の増殖能が高すぎると、 ES 細胞がすべて、 Wv/Wvマウス胚由来の ES細胞に置き換わってしまう。 該 ES細胞 が未分化状態および分化能を維持して増殖能が高すぎる場合は、 マイトマイシン C、 放射線やローダミンなどで処理することで増殖能を調節することが出来る。 一般的に ES細胞を用いてキメラマウスを作製する場合、 ES細胞の継代数が多 くなると、 増殖能が低下し、 生殖系列に伝播しにくくなる。 このため、 通常継代 数が 1 0代以下の ESを用いる必要がある。 一方、 Wv/Wvマウス胚由来の ES細胞 と共培養して用いる場合は、 Wソ Wvマウス胚由来の ES細胞に増殖等がサポート されるため、 長期継代を行った ES細胞、 例えば 1 2代以上、 あるいは 2 0代以上 継代した ES細胞も用いることができる。
本発明の / Wマウス胚由来の ES細胞を、所望の他の ES細胞とともに胚盤胞 等の初期胚に注入し、 該初期胚を仮親の子宮に移植することにより、 効率的にキ メラマウスを形成することができる。 また、 この際、 テトラプロイドレスキュー 法により所望の ES 細胞の遺伝子が生殖細胞に伝播されたキメラマウスを作製す ることもできる。テトラプロィドレスキュー法は、 4倍体の受精卵に ES細胞を注 入することにより、 4倍体細胞は胎盤へと発生し、 ES細胞のみが個体へと発生す ることを利用した ES 細胞が生殖系列に伝播したキメラマウスを作製する方法で ある （Nagy A et al. , Deve lopment 110, 815-821 (1990) )。 テトラプロイドレス キュー法でキメラマウスを作製する場合は、 出生してきたマウスの呼吸障害によ る死亡を防止するために、 4倍体受精卵または、 Wv/Wvマウス胚由来の ES細胞 と混合する ES細胞のミトコンドリア DNAを核 DNAと適合させておくのが望ましい。 伹し、 用いる細胞が交雑細胞、 例えば 2種類の近交系動物の交雑細胞を用いる場 合は、 出生マウスの呼吸障害という問題は生じないので、 必ずしもミトコンドリ ァ DNA を核 DNA と適合させる必要はない。 例えば、 本発明で用いている Wv/Wv マウスは交雑系マウスであるので、 Wv/Wvマウス胚由来の ES細胞は、 必ずしも ミトコンドリア DNAを核 DNAに適合させる必要はない。 ミトコンドリア' DNAを核 DNA と適合させるためには、 4倍体受精卵または、 Wv/Wvマウス胚由来の ES細 胞と混合する ES細胞のミトコンドリア DNAを野生型マウスのミトコンドリア DNA と置換させればよく、具体的には以下のようにして行う（TO03/071869号国際公開 パンフレツト）。
マウス胚由来のミトコンドリア DNA置換 ES細胞は、公知の方法により得ること ができる。例えば、近交系マウスのミトコンドリア！)^の置換は，バッククロス交 配法または核置換法などにより、所望のタイプのミトコンドリア DNA に置換した 近交系マウスを作製し、このマウスから ES細胞を樹立すればよい。 近交系マウス
C57BL/6 のミトコンドリア DNA をバッククロス交配法により野生型マウス Mus muscu lus musculusと 12回以上の交雑を繰り返すことにより、 ミトコンドリアの
DNA が野生型マウス Mus muscu lus muscul us タイプに置換された近交系マウス B6-mtMusが作製できる。このマウスからミトコンドリア DNAを適合型マウス Mus muscu lus musculusタイプの DNAに置換した ES細胞を樹立できる。
一方、 前核置換法は、 常法 （MoGrath J&Sol t er D, J. Exp. Zoo l, 228, 355-362 (1983) )に従い、 近交系マウス mdxの前核期受精卵の雌雄前核を野生型マ ウス Mus muscu lus musculusタイプのミトコンドリアを有する除核した前核期受 精卵に移植し、 電気パルスによる核融合を行い培養した後にマウス卵管に移植し て個体発生させることにより、 ミトコンドリア DNAを Mus muscu lus musculus夕 イブに置換した近交系マウス mdx- mtMus が作製できる。このマウスから同じくミ トコンドリア DNAを野生型に置換した ES細胞を樹立することができる。
ES 細胞の樹立にあたっては、この様にして作製した近交系マウス、 例えば B6-mtMus 又は mdx- mtMus の E盤胞を採取し、 常法（Evans MJ and Kaufman MK， Nature 292, 154- 156 (1981) )により ES細胞を樹立することができる。
また、 Wv/Wvマウス胚由来の ES細胞についてミトコンドリァ DNAを置換する 場合は、 B6- Wv/+の雄を B6- mtMusの雌に交配させ B6-Wv/+- mtMusマウスを得る。 B6-WV+-mtMusの早と DBAマウスの雄を交配することで BD -WV+- mtMusマウス が得られ、 以後 BDF卜 Wv/+-m t MUSマウス同士を交配させればよい。 上述のよう に、 本発明の Wv/Wvマウス胚由来の ES細胞は、 他の ES細胞の樹立、 遺伝子改変 を行った所望の ES 細胞との共培養によるキメラマウスの作製に十分な増殖能を 有した ES細胞の調製、 および所望の ES細胞と同時に胚盤胞に注入することによ るキメラマウスの作製に用いることができる。 これらの工程における Wv/Wvマウ ス胚由来の ES細胞の使用は、各々の工程のみにおける使用であってもよいし、 2 つ以上の工程における連続的な使用であってもよい。 例えば、 Wv/Wvマウス胚由 来の ES細胞を所望の遺伝子改変を行った他の ES細胞と共培養して、 そのまま W ソ Wvマウス胚由来の ES細胞と他の ES細胞をキメラマウス作製のために、胚盤胞 に注入してもよい。
ノックァゥトマウス等の作出のために ES細胞の遺伝子を改変した場合、 該 ES 細胞の増殖能は低くなる場合が多く、 本発明の Wv/Wvマウス胚由来の ES細胞は このような遺伝子を改変した ES細胞の増殖能等を改善することもできる。 特に、 複数の遺伝的改変を行った ES細胞に対しても好適に用いることができる。 さらに、 本発明の W WVマウス胚由来の ES細胞により樹立できる細胞、 所望 の遺伝子改変を行う細胞、同時に胚盤胞に注入する細胞は、 ES細胞だけではなく、 EG細胞 (embryonic germ cell)または GS細胞を用いてもよい。 EG細胞は哺乳類 始原生殖細胞を LIF、 FGF2等のサイトカインと共に培養することにより得られる (Matusi, Y. , et al., Cell, 70: 841-847, 1992)。 GS 細胞は幼年期の雄マウス の精巣から得ることができる （Johnson et al. Nature 428, 145-150, 2004))
GS細胞の樹立は、 例えば以下の方法で行う。
マウス GS様細胞の樹立
1 - ディッシュはゼラチンコートしておく。
2. 酵素液 1は 5mlの DMEM/F12に collagenaseを 3mg/ml、 DNase Iを 200/xg/nil 含む。
3.酵素液 2は 5 mlの]) MEM/F12に collagenaseを 3mg/ml、])Nase Iを 200 zg/ml、 hyaluronidaseを 3mg/ml sむ。
4. 出生後 10日〜 2週間のマウスの精巣を酵素液 1の中で刻む。
5. 37°Cで 15分間インキュベートする。
6. 2300rpm, 20でで 10分間遠心分離する。
7. 上清をァスピレーターで吸い取り、 そこにチューブ Π'の酵素溶液を加える。 このとき、 トリプシンを 500 g/mlとなるように加える。
8. 37°Cで 30分間インキュベートする。
9. 血清入り培地で反応をとめた後、 2300rpm、 20°Cで 10分間遠心分離をする。
1 0. 上清をァスピレ一ターで吸い取り、 そこに DMEM/F12 (血清入り） を 5ml入 れる。
1 1. 80 ΒΙのナイロンメッシュで濾過する。
1 2. ついで 40 ΠΙのメッシュで濾過する。
1 3. 5〜20%FBS入り DMEM/F12または ES培地で培養する。 培地は丽 EM/F12は 2 日に 1回交換、 ES培地は毎日交換する。
本発明の Wv/Wvマウス由来の ES細胞を所望の ES細胞とともに胚盤胞に注入し、 キメラマウスを作製する場合、 出生するマウスの性比をコントロールすることが できる。 一般的に、 ES細胞を樹立する場合、 性染色体が雄 XYの型の細胞ができ ることが多く、 雌 の型の細胞はできにくい。 一方、 本発明の wvwvマウス胚 由来の ES細胞は、 性染色体が雌 XXの型の細胞も容易に得ることができ、 W/W マウス胚由来の ES細胞については、雄 XY型の細胞も雌 Π型の細胞も必要に応じ て選択することができる。 例えば、 所望の雄 χγ型の ES細胞と雄 π の w/w マウス胚由来の ES細胞を胚盤胞に注入した場合、出生する全てのキメラマウスは、 雄である。 また、 所望の雄 Π型の ES細胞と雌 Π型の WV/WVマウス胚由来の ES 細胞を胚盤胞に注入した場合、所望の ES細胞の増殖能の強さに応じて雄または雌 のキメラマウスが出生する。
キメラ動物作成法により得られる可能性のあるキメラ動物の性および得られる 生殖細胞の種類および由来は以下の通りである。
胚 ES キメラ 生殖細胞
1 · 雄 雄 雄 精子 （胚由来 + ES由来）
2 . 雄 雌 雄 精子 （胚由来）
3 . 雄 雌 雌 卵 (ES由来 +まれに胚由来)
4 . 雌 雄 雄 精子 （ES由来）
5 . 雌 雄 雌 卵 （胚由来 +稀に ES由来）
6 . 雌 雌 雌 卵 （胚由来 + ES由来） 従来法において、 ES細胞は通常雄であるので上記のうち.2、 3、 6は起こり難 い。 すなわち、 従来法において、 雌のキメラが生まれた場合、 ES細胞由来の卵を 得られるのは上記の 5の場合のみであるが、 稀にしか生じない。 従って、 ES細胞 は生殖伝播しにくレ^
本発明の WV/WVマウス胚由来の ES細胞を用いる場合、 上記 5の場合の胚を W V/WVマウス胚由来の ES細胞にすれば、 雌のキメラが生まれた場合の卵は全て ES 由来である。 従って、 その仔が生まれれば 1 0 0 %ES細胞が生殖伝播している。 本発明の WV/WVマウス胚由来の ES細胞を他の ES細胞との共培養および他の
ES細胞を胚盤胞に注入するときに同時に注入することにより、 ほぼ 100 %の確率 でキメラマウスを得ることができる。
また、 本発明の WV/WVマウス胚由来の ES細胞を用いてキメラマウスを作製す る場合、所望の ES細胞の遺伝子が生殖系列に伝播したキメラマウスが 100 %でき るので、 万一出生してきたマウスが死亡した場合でも、 該マウスの生殖巣を他の マウスに移植することにより、 所望のキメラマウスを作製することができる。 さらに、本発明は、雄核発生胚または雌核発生胚由来の ES細胞から生殖細胞を 作製する方法を包含する。雄核発生胚または雌核発生胚由来の ES細胞は、生殖細 胞由来の細胞を ES細胞等の多能性細胞と共培養することにより、生殖器官由来の 細胞からの多能性細胞を樹立することができる。 例えば、 雄核発生胚 (and rogene t i c embryo)や雌核発生胚 (gynogene t ic embryo)を多能性細胞と共培養 することで、 雄核発生胚由来の ES細胞等の多能性細胞や雌核発生胚由来の ES細 胞等の多能性細胞を樹立することができる。 このようにして得られた雄核発生胚 または雌核発生胚由来の ES細胞は、他の初期胚ゃ生殖細胞由来の細胞と共培養す ることにより、 多能性細胞を樹立することもできる。
雄核発生胚または雌核発生胚由来の ES細胞から、生殖細胞を形成することもで きる。生殖細胞を形成するには、雄核発生胚または雌核発生胚由来の ES細胞を動 物の生殖器官に移植すればよい。例えば、雄核発生胚由来の ES細胞を精細管に移 植することにより雄核発生胚由来の ES細胞由来の精子を形成することができる。 この際、 移植する動物は ES細胞の由来動物と同種の動物が望ましい。 移植の際、 好ましくは ES細胞をマイトマイシン等で処理する。また、 同様に雌核発生胚由来 の ES細胞を卵管に移植することにより、 雌核発生胚由来の ES細胞由来の卵子を 得ることができる。最終的に得られた生殖細胞が ES細胞由来かどうかは、ゲノム のィンプリンティングの状態を確認すればよい。
すなわち、 本発明は、 雄核発生胚または雌核発生胚由来の多能性細胞を動物の 生殖器官に移植することにより生殖細胞を作製する方法を包含する。
以下の実施例をもって本発明を詳細に説明するが、これらは単に例示するのみ であり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
〔実施例 1〕 Wv/Wvマウス胚由来 ES細胞株 （WV/W V ES細胞株） の樹立 雌の C 57BL-W V/+マウス（エスエルシー）を雄の]] BA/2J (日本クレア）と自然交配 させて、交雑第一世代を得た。毛色より W v遺伝子をへテロに持つ個体、 すなわち
BDF 1- W v /+を選択した。 BDF卜 W v/+マウス同士を自然交配させ、 同様に交雑第二 世代のへテロ個体（BDF2- Wv/+)を得た。 BDP2- Wv/+マウスの雌雄を自然交配させ、 膣栓を確認した日から 3 日目の個体の子宮を M2培地で灌流し、 34個の胚盤胞期 胚を回収し、 得られた胚を常法 （Evans MJ and Kaufman MK, Nature292, 154- 156 (1981) )に従い ES 細胞を樹立した。 即ち、 ES 培地（80% (v/v) 画, 20% (v/v) FCS, 1¾ (v/v) lOOmM ピルビン酸溶液（Gibco Cat. 11360 - 070)、 1¾ (v/v) 必須アミノ酸溶液（Gibco Cat. 11140-027) , ImM 2 -メルカプトエタノール（Sigma, Cat. No. M- 6250) , 103U/mL LIF を分注した 4穴プレートのフィーダ一細胞上に先 に得られた胚を 1個ずつ移して 37°C, 5%C02- 5%02- 90%N2の条件下で培養した。 培 養 7日目に増殖した ICM細胞塊を選抜した。 0. 125%トリプシン/ 0. lmM EDTA処理 を行い、 細胞を分散した後に新しく準備した 4穴プレートのフィ一ダ一細胞上に 播種して培養した。 2回目の継代ではゥエル全体をトリプシン/ EDTA処理し、 新 しい 3. 5cm培養皿に播種して良好に増殖する 17ラインを得た。ここまで到達でき た細胞は、 その後も安定して増殖することができたため細胞株として凍結保存し た。
樹立した ES 細胞のゲノタイビングは PCR- RFLP 法（Bri t ish Journal of Haematology 98, 1017- 1025 (1997) )により行った。 W遺伝子を認識するプライマ ― 5' -AAAGAGAGGCCCTAATGTCGG-3 ' ( 配 列 番 号 1 ) お よ び 5 ' -CTCGAGACTACCTCCCACC-3' (配列番号 2 ) にて PCR を行い増幅して得られた 104b の断片を Nsi l制限酵素処理し、 断片化されない野生型および 85bpと 19bp に断片化される Wvタイプを検定した。 その結果、 5ラインが Wv/Wvタイプであ つた。これらのラインについて性判別 PCR diay et al. Cel l 77, 639-650, 1994) を行ったところ、 2ラインが雄株、 3ラインが雌株であった。
〔実施例 2〕 129. B6-YGFP ES細胞の樹立
雌の 129/sv マウス（NIH)を雄の C57BL/6- EGFP#60 (Y- l ink) (Ichida et al. , J
Biol C em 26, 275, 15992 - 6001 (2000) )と自然交配させて、 膣栓を確認した日か ら 3 日目の個体の子宮を M2培地で灌流し、 10個の胚盤胞期胚を回収し、 得られ た胚を常法（Evans MJ and Kaufman MK, Nature 292, 154- 156 (1981) )に従い ES 細胞を樹立した。 即ち、 ES 培地（80% (v/v) DMEM, 20% (v/v) FCS, 1¾ (v/v) lOOmM ピ ルビン酸溶液 (Gibco Cat. 11360-070) , 1% (v/v)非必須アミ ノ酸溶液 (Gibco Cat. 11140 - 027) , ImM 2-メルカプトェ夕ノ一ル（Sigma, Cat. No. M-6'250) , 103U LIFを分注した 4穴プレートのフィーダ一細胞上に先に得られた胚を 1個ずつ移 して 37°C, 5%C02- 5%02- 90%N2の条件下で培養した。 培養 7日目に増殖した ICM細 胞塊を選抜した。 0. 125%トリプシン/ 0. ImM EDTA 処理を行い、 細胞を分散した後 に新しく準備した 4穴プレートのフィーダ一細胞上に播種して培養した。 2回目 の継代ではゥエル全体をトリプシン/ EDTA処理し、 新しい 3. 5cm培養皿に播種し て良好に増殖する 5ラインを得た。 ここまで到達できた細胞は、 その後も安定し て増殖することができたため細胞株として凍結保存した。
これらのラインについて性判別 PCR (Kay et al. Cel l 77, .639- 650, 1994)を行 つたところ、 1ラインが雄株、 4ラインが雌株であつた。
〔実施例 3〕 BS- neo ES細胞の樹立
C57BL/6Jマウスのミトコンドリア DNAを Mus musculus nmsculus タイプに置換 したマウス B6- mtMusの雌（N15) (Nagao e t al. , Genes Genet Sys t 73, 21-27 (1998) ) を雄の C57BL/6Jマウスと自然交配させた。膣栓を確認した日から 3日目の個体の 子宮を M2培地で灌流し、 20個の胚盤胞期胚を回収し、得られた胚を常法（Evans MJ and Koufman MK, Nature292, 154- 156 (1981) )に従い ES細胞を樹立した。 即ち、 ES 培地 (80% (v/v)画, 20¾ (v/v) FCS, 1 % (v/v) lOOmM ピルビン酸溶液（Gibe o Cat. 11360-070) , 1% (v/v)非必須アミノ酸溶液（Gibco Cat. 11140 - 027)， ImM 2-メ ルカプトエタノール（Sigma, Cat. No. M- 6250) , 103U/mL LIFを分注した 4穴プレー 卜のフィ ーダ一細胞上に先に得られた胚を 1 個ずつ移して 37 °C , 5%C02- 5%02- 90¾N2の条件下で培養した。 培養 5日目に増殖した ICM細胞塊を選抜 した。 0. 125%トリプシン/ 0. ImM EDTA処理を行い、 細胞を分散した後に新しく準 備した 4穴プレートのフィーダ一細胞上に播種して培養した。 2回目の継代では ゥエル全体をトリプシン/ EDTA処理し、 新しい 3. 5 cm培養皿に播種して良好に増 殖する 2ラインを得た。 ここまで到達できた細胞は、 その後も安定して増殖する ことができたため細胞株として凍結保存した。
これらのラインについて性判別 PCR (Kay et al. Cel l 77, 639-650， 1994)を行 つたところ、 1ラインが雄株、 1ラインが雌株であった。
樹立した B6- mtMus ES細胞株の雄のラインに常法により、 neo遺伝子ベクター を遺伝子導入し、 遺伝子夕ーゲッティングを行った。
〔実施例 4〕 4倍体胚盤胞期胚の調製
過剰排卵誘起処理を施した ICRマウスを同系統の雄マウスと自然交配させ、 膣 栓を確認した個体から絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG)投与後 44〜46時間に卵管灌 流法で後期 2細胞期胚を採取した。得られた後期 2細胞期胚を 0. 3Mマンニトール 中で直流電気パルスにより融合処理（FUJITA製ゴクゥ：パルス条件は 18V, 50 n sec, 999 _i se間隔で 3回）を施し 4倍体胚を調製した。 4倍体を選別し、 M16培地にて 37°C , 5 C02- Ai r中で 2日間培養して、 4倍体胚盤胞期胚を取得した。
〔実施例 5〕 WVWVES細胞との共培養
BS-neo ES 細胞については遺伝子導入後の薬剤選抜等により細胞がダメージを 受けていたため、 WV/WVES細胞との共培養を行った。すなわち 1 X 104個 BS- neo ES細胞と 1 X 104個の WV/WVES細胞を混合し、フィ一ダ一細胞を敷いた 6cmディ ッシュに播種した。通常の ES細胞の維持と同様の方法により、 3日目に継代を行 つた。 さらに 3日培養後、 クローニングを行うために良好な形態をしたコロニー 20個を 0. 125%トリプシン/ 0. lmM EDTA処理し、 細胞を分散した後、 新しく準備し た 4穴プレートのフィーダ一細胞上にそれぞれ別々に移して培養した。 培養 3日 目に増殖したコロニーそれぞれ 3〜5 個を用いて前述の PCR-RPLP 法（Br i t ish Journal of Haematology 98, 1017- 1025 (1997) )によりゲノタイピングを行った。 20ラインのうち 7ラインが BS- neo ES細胞株であった。 この中で最もコロニーの 形態および増殖が良好なラインを凍結保存しておき、 キメラ作製に用いることに した。
〔実施例 6〕 テトラプロィドレスキュ一法によるキメラマウスの作製（1) 実施例 4で得られた 4倍体胚盤胞期胚に対して、 先述の 129. B6- YGFP ES細胞
(雄）および BDF3 WV/WVES細胞（雌）をそれぞれ約 10個ずつピエゾマイクロマ二 ピュレーターで注入した。注入を行った 39個の 4倍体胚盤胞期胚（テトラプロィ ド） を、 膣栓を確認後 2. 5日目のレシピエント ICRマウス 2匹の子宮に移植し、 出産前夜（妊娠 18. 5日目の夜）に帝王切開により 7匹の雄と 1匹の雌、合計 8匹の キメラマウス胎仔を取り出した。 図 1に、 キメラマウス作製の概要を示す。 図 1 中、 左上の細胞は、 生殖細胞欠損 （Wv) 、 免疫不全 （nude, sc id) 、 リンパ球欠 損（RAG- 1, RAG- 2)等の目的とする細胞 '組織 '器官、 タンパクなどに関わる遺伝 子を変異または欠損した ES細胞であり、右上の細胞はヒトなどの神経幹細胞、造 血幹細胞、その他の分化細胞および生殖細胞欠損 OVv)、免疫不全（nude, sc id)、 リンパ球欠損（RAG- 1， RAG- 2)等の目的とする細胞 '組織 '器官、 タンパクなどに 関わる遺伝子を変異または欠損した ES細胞である。得られたキメラ個体から最終 的に目的とする細胞 ·組織 '器官、 タンパク等を取り出すことができる。 また、 図 2にキメラマウスの写真を示す。蛍光顕微鏡（GFP)にて観察した結果、得られた キメラ胎仔全てに目的の ES細胞（129， B6-YGFP)が寄与していることを確認した。 図 2 a およに図 2 b に示すように、 W V /W V ES 細胞のレスキューなしに
129. B6-Yl ink-GFP ES + テトラプロィド胚でキメラマウスを作製した場合、 胎仔 形成は見られず、 胎盤や着床痕のみであった。 図 2 cは、 129. B6-Yl ink- GFP ES +
WV/WVES #7 + テトラプロィド胚を移植した妊娠 18. 5日目のレシピエントマウ スを示す図である。 図 2 d は、 帝王切開直後の 129. B6- Yl ink- GFP ES + Wv/Wv
ES #7 + テトラプロィドキメラマウスを示す図である。 さらに、 図 2 e に示すよ うに、 生まれた個体のうち 2匹はがん球の欠失や腹水など異常な形態を示したが
(図 2 e の矢印） 、 他の産仔に以上は見られなかった。 図 3にキメラマウス
(129. B6-Yl ink-GFP ES + WV/WVES + テトラプロィドキメラマウス、 生後 8日 目） の蛍光顕微鏡による観察の結果を示す。 蘇生処置を行い活発に動くことを確 認した後、 里親につけて保育した。
〔実施例 7〕 テトラプロィドレスキュー法によるキメラマウスの作製（2) 実施例 4で得られた 4倍体胚盤胞期胚に対して、 先述の BS- neo ES細胞（雄）お よび BDF3 WV/WVES細胞（雄）をそれぞれ約 10個ずつピエゾマイクロマニピユレ 一夕一で注入した。 注入を行った 29個の 4倍体胚盤胞期胚を、 膣栓を確認後 2. 5 日目のレシピエント ICRマウス 2匹の子宮に移植し、 出産前夜（妊娠 18. 5日目の 夜）に帝王切開あるいは自然分娩により 3匹の雄胎仔を取り出した。蘇生処置を行 い活発に動くことを確認した後、 里親につけて保育した。 毛色により、 得られた キメラ胎仔の 1匹に目的の ES細胞 (BS- neo ES細胞）が寄与していることを確認し た。図 4に得られたキメラマウス （BS- neo ES (黒色） + WV/WVES (白色） + テ トラプロイドキメラマウス、 生後 8日目） の写真を示す。 図 4中、 毛色が黒い個 体には BS- neo ES細胞が寄与しており、 白い個体は WV/WVES細胞のみから個体 が形成されている。
図 5に一連のキメラマウス作製の結果を示す。
〔実施例 8〕 テトラプロィドレスキュー法によるキメラマウスの作製（3) 実施例 4で得られた 4倍体胚盤胞期胚に対して、 実施例 1および 2と同様の手 技で樹立した雌の B6- GFP ES細胞 （Ichida et al. , 2000) もしくは常法 （Barton et al. , 1987) により作製した B6- GFP単為発生胚由来. ES細胞 (B6-GFP PGES) を BDF3 Wv/Wv ES細胞（雌） とともにそれぞれ約 10個ずつピエゾマイクロマニピ ュレーターで注入した。注入を行つた B6-GFP ES細胞キメラ胚 24個および B6- GFP PGESキメラ胚 26個を膣栓を確認後 2. 5 日目のレシピエント ICRマウス 2匹の子 宮に移植し、 自然分娩により B6-GFP ES細胞キメラ胚由来個体 1匹と B6- GFP PGES キメラ胚由来個体 2匹を得た。 蛍光顕微鏡 （GFP) にて観察した結果、 B6-GFP ES 細胞キメラ胚由来個体 1匹と B6-GFP PGESキメラ胚由来個体 1匹に目的の GFP - ES 細胞が寄与していることを確認した。図 6にこのキメラマウス作製の詳細を示す。 〔実施例 9〕 4倍体胚との共培養
核移植胚ゃ雄性胚からの ES細胞（ES様細胞を含む）樹立率はあまり高くない。 また樹立できた ES細胞コロニーも良好な形態を維持しない場合が多い。これらの 問題を解決するため、 4倍体胚との共培養を行なった。
はじめに核移植胚と 4倍体胚との共培養による ES細胞の樹立について述べる。 操作は通常の電気融合法で行なった。 B6- mt薦 Sの雌マウスと DBA雄マウスとの交 配により得られた F1雌マウス（8週令）を過排卵処理して得た未受精卵を除核後、 BlOmdx雄マウスの尾部由来繊維芽細胞と融合した。ストロンチュウムによる活性 化の後、 M16 で 8細胞期まで培養した。 8細胞期の割球を 2個コンパクッション 前の 4倍体 4細胞期胚（実施例 4 )にマイクロマニュピレーターを用いて導入した。 8細胞期核移植胚 4個から 16個のキメラ胚を作製して M16で培養した。すべての 胚は胚盤胞期まで発育し、 内部細胞塊（ICM)の発達が見られた。そのうち無作為に 6個選び ES細胞の樹立に用いた。 6個の胚から最終的に 3ラインの ES細胞株が 樹立できた。
これとは別に樹立した雄性胚由来 ES 細胞はコロニーの扁平で増殖能も低いも のであった。雄性胚の作製は F l雌を過排卵処理して 129雄マウスと交配させ得ら れた前核期胚の雌性前核と、 Π雌を過排卵処理して B6雄マウスと交配させ得ら れた前核期胚の雄性前核を置換して作製したものである。 実施例 4で得られた 4 倍体胚盤胞期胚に対して、 この雄性胚由来 ES細胞を約 10個ずつピエゾマイクロ マニピュレーターで注入した。 約 1日培養後、 実施例 1の樹立法を用いて培養し た。 通常 ICM塊が増殖するのは 5日前後であるが、 ES細胞由来の ICM塊は増殖す るのは 3日前後である。この操作を数回繰り返して出来た ES細胞コロニーは良好 な形態をして増殖能の高いものであった。
〔実施例 1 0〕 4倍体胚および Wv/Wv ES細胞との共培養
KKマウスの受精胚を 8細胞期で子宮より回収した。 8細胞期の割球を 2個コン パクッション前の 4倍体 4細胞期胚 （実施例 4 ) にマイクロマニュピレーターを 用いて導入した。 8細胞期核移植胚 5個から 19個のキメラ胚を作製して M16で培 養した。すべての胚は胚盤胞期まで発育し、 内部細胞塊（I CM)の発達が見られたが ES細胞の樹立はできなかった。 次に同様の方法で 12個のキメラ胚を作製し培養 1. 5日後、胚盤胞期胚になったキメラ胚にマイトマイシン処理した Wv/Wv ES細 胞約 5個をピエゾマイクロマ二ュピレ一ターで導入した。 実施例 1と同様に ES 細胞を樹立したところ、 6ラインの ES細胞が樹立できた。
〔実施例 1 1〕 雄核発生胚由来 ES細胞の精細管への移植
雄核発生胚由来 ES細胞を精細管に移植して動向を探ることを目的とし、以下の 実験を行った。 材料としては B6 ' BALB F2 nu/nuWv/Wvと雄核発生胚由来 ES細胞
(ライン名 1- 1、 マーカーとして GFPと neoを保有、 継代数 8および再樹立） を 用いた。 方法は以下に述べるとおりである。 まず、 C57BL/6JWV/+の雌と BALB/cA nu/+の雄を交配させて、 WV+かつ nu/+である F lマウスを生産した（B6 . BALBF 1 、
Wv/+、 ηυ/+) このマウスを交配させることにより、 Wv/Wvかつ nu/iiuである
F2マウスを生産した （B6. BALBF2 、 Wv/Wv、 nu/nu)。 このマウスが 8週齢にな つたときに精細管に再樹立した雄核発生胚由来 ES 細胞を移植した。 再樹立は 4 倍体胚の胚盤期胚内に雄核発生胚由来 ES 細胞を約 10個注入し、 ES細胞を榭立す るときと同様の方法で行なった。
以下に詳しく述べる。 まず、 細胞の調製である。 あらかじめマイトマイシン処 理しておいた MEF上で 2日間培養し、 コンフルェントな状態になった雄核発生胚 由来 ES 1-1P8 を用いた。 この細胞を PBS ( - ) で洗浄後、 ト リプシン /EDTA (0. 25%/0. 04%)溶液を用いて細胞培養用ディッシュからはがし、 10%FBS添加 DMEM培地を等量加えることで反応を停止させた。 ピベッティングにより細胞を解 離した後、 40 HI 四方の格子のナイロンメッシュでろ過した。 この細胞懸濁液を 遠心分離機によりペレツト状にした。十分量の ES培地によりこのペレツトを再懸 濁し、 血球計算版により細胞数を測定した。 再び遠心分離機によりこれをペレツ ト状にし、 注入用培地 （ES培地 85 l + 20mg/ml DNase 5 ^ 1 +トリパンブルー 10 ^ 1) に懸濁し、 4. 3 X 107 cel ls/mlの細胞懸濁液を 100 1用意した。
次に移植について述べる。 B6 'BALBF2、 Wv/Wv、 nu/nuマウスに麻酔液 （ネン ブタール： 100%エタノール： PBS= 1 : 1 : 11) を 0. 3ml注射し、 麻酔をかけた。下腹部 を 70%エタノールで消毒し、 正中部を切開した。 精巣の周囲の脂肪をピンセット でつまんで精巣を引き出し、 実体顕微鏡下で輸精管を露出させた。 ゴム球を用い て、 先端を引き伸ばしておいたガラス管に細胞懸濁液を充填した。 移植用のマウ スピースにガラス管をセットした。 輸精管を保持しながら、 そこにガラス管を突 き刺し、精巣網内に針を進入させ、呼気により細胞懸濁液を精細管内に注入した。 十分に充填されたことを確認してガラス管を引き抜いた。 精巣を腹腔内に戻し、 反対側の精巣についても同様に移植を行った。 縫合糸にて腹膜と筋層を縫い合わ せ、 皮膚を金属製のクリップでとめた。
この操作により、今回は左の精巣には大量に細胞懸濁液を注入することができ、 右の精巣にも十分量細胞懸濁液を注入することができた。
B6 -BALBF2, Wv/Wv、 nu/nu の精巣は Wv/Wvマウス特有の極少の精巣であつ た。 精巣は、 移植翌日には元の位置に戻り、 一力月後には正常なマウスとほぼ同 じ大きさにまで成長した。 また、 図 8に示すように形成途中の精子が見られた。 よって、 雄核発生胚由来 ES細胞は精子幹細胞の性質を持っているといえる。
〔実施例 1 2〕 雄核発生胚由来 ES細胞のメチル化パターンの解析
実験に使用した雄核発生胚由来 ES細胞 (Androgenet ic ES : AgES) および比較 対照区としてノ一マルの B6由来 ES細胞 3ラインを用いてゲノムのィンプリンテ ィングの状態を確認した。 ィンプリンティングの状態はィンプリント遺伝子上流 にある動 (Differentially Methylated Regions) の CpGサイトのメチル化状 態を測ることにより調べることができる。 まず、 それぞれのサンプルより ]) NAを 抽出し、 CpGenome DNA Modification kit (Intergen)を用いてバイサルフアイト 処理を行った。 次に combined bisulfite restriction analysis (COBRA)を行う ために、母方特異的にメチル化されるィンプリント遺伝子 Pegl/Mest、 Snrpnおよ び Igf2r特異的プライマ一を用いて、 PCRによりサンプルの DNAを増幅した。 使 用したプライマーは以下の通りである。
Pegl/Mest (Promoter & exon 1， Genbank acc. no. AF017994) ,
5 ' -GGTTGGGTTTGGATATTGTAAAGT-3 ' (配列番号 3 )
および 5 ' -TTCCCTATAAATATCTTCCCATATTC-3 ' (配列番号 4 )
Snrpn (DMR1, Genbank acc. no. AF081460),
5' -TTTGGTAGTTGTTTTTTGGTAGGATAT-3 ' (配列番号 5 )
および 5 ' -ACTAAAATCCACAAACCCAACTAAC-3 ' (配列番号 6 )
Igf2r (DMR2, Genbank acc. no. L06446) ,
5' -GAAGTTGTGATTTTGGTTATGTTAAG-3 ' (配列番号 7 )
および 5 ' -ACAATTTACACCCTCAAAATACCTC-3 ' (配列番号 8 )
Pegl/Mestおよび Igi2rの増幅産物については Taq Iにて 65°Cで 4時間、 Snrpn については Hha Iにて 37°Cで 4時間制限酵素処理を行った。 以上のサンプルを 2.5 ァガロースで泳動し、 ェチジゥムブ口マイド染色により DNA断片長を確認し た。
COBRAでは、 もし脆がメチル化されていれば、 Pegl/Mestでは 137b の増幅産 物が 90bpと 47b に、 Snrpnでは 248b が 135bpと 113bpに、 Igf2rでは 193bp が 141to といくつかの断片に切れると考えられる。 比較対照区のノーマルの ES 細胞ではおよそ 50%の]) NAがメチル化されており、 正常な受精卵や体細胞と同 じパターンを示した。一方、雄核発生胚由来 ES細胞ではいずれのインプリント遺 伝子もメチル化されておらず、 精子と同じメチル化パターンを示した。 産業上の利用可能性
本発明の C- kit変異動物 （W遺伝子変異動物） 由来である、 生殖細胞を形成で きない多能性細胞は、 従来樹立し得なかった多能性細胞であり、 該多能性細胞を 動物の胚盤胞細胞等の生殖器官由来の細胞と培養することにより増殖能の高 ES 細胞等の多能性細胞を樹立することができる。 また、 樹立された多能性細胞と本 発明の生殖細胞を形成できない多能性細胞を共培養することにより、 樹立された 全能生細胞の増殖能を高く保つことができ、 継代を繰り返した多能性細胞のキメ ラ動物の作製等への利用を可能にする。 さらに、 本発明の生殖細胞を形成できな い多能性細胞を ES 細胞等の他の多能性細胞と共に動物の初期胚に注入し発生さ せることにより、 該他の多能性細胞が生殖系列へ伝播されたキメラ動物を効率的 に作製することができ、 また出生するキメラ動物の性比をコントロールすること も可能である。
さらに、 本発明の特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能 を喪失した多能性細胞および他の多能性細胞を含む 2種類以上の細胞を動物の宿 主胚に注入することを含む、 キメラ動物の作製方法において、 特定の遺伝子が変 異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞および他の多能 性細胞を含む 2種類以上の細胞を適切に選択することにより、 キメラ動物に異種 動物のタンパク質を産生させたり、 あるいはキメラ動物に異種動物の臓器特異的 幹細胞や臓器を産生させることが可能になる。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 配列表フリーテキスト
配列番号：！〜 8 プライマー

Claims

請求の範囲
1 . 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した 多能性細胞および該多能性細胞以外の他の多能性細胞を含む 2種類以上の細胞を 動物の宿主胚に注入することを含む、 キメラ動物の作製方法。
2 . 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した 多能性細胞および該多能性細胞以外の他の多能性細胞を含む 2種類以上の細胞を 共培養した後に動物の宿主胚に同時に注入することを含む、 キメラ動物の作製方 法。
3 . 共培養が動物の初期胚中で行われる請求項 2記載のキメラ動物の作製方 法。
4 . 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した 多能性細胞以外の他の細胞由来の遺伝子が機能するキメラ動物である、 請求項 1 から 3のいずれか 1項に記載のキメラ動物の作製方法。
5 . 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した 多能性細胞以外の他の細胞由来の前記変異または欠損した遺伝子に対応する遺伝 子が機能するキメラ動物である、 請求項 1から 3のいずれか 1項に記載のキメラ 動物の作製方法。
6 . 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した 多能性細胞以外の他の多能性細胞が遺伝子改変を受けた細胞である請求項 1から 5のいずれか 1項に記載のキメラ動物の作製方法。
7 . 遺伝子改変が外来遺伝子の導入または内在遺伝子のノックァゥトである、 請求項 6記載のキメラ動物の作製方法。
8 . 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した 多能性細胞および/または他の多能性細胞が適合型ミトコンドリア DNAが導入ま たは置換された多能性細胞である、 請求項 1から 7のいずれか 1項に記載のキメ ラ動物の作製方法。
9 . 動物の宿主胚が適合型ミトコンドリア DNAを導入した宿主胚である、 請 求項 1から 8のいずれか 1項に記載のキメラ動物の作製方法。
1 0 . 動物の宿主胚が胚盤胞である、 請求項 1から 9のいずれか 1項に記載 のキメラ動物の作製方法。
1 1 . 動物の宿主胚がテトラプロイドである、 請求項 1 0記載のキメラ動物 の作製方法。
1 2 . 多能性細胞が ES細胞、 EG細胞および GS細胞からなる群から選択され る細胞である請求項 1から 1 1のいずれか 1項に記載のキメラ動物の作製方法。
1 3 . 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失し た多能性細胞以外の他の細胞が、 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が 関与する機能を喪失した多能性細胞に対して動物分類学上同種である請求項 1か ら 1 2のいずれか 1項に記載のキメラ動物の作製方法。
1 4 . 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失し た多能性細胞以外の他の細胞が、 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が 関与する機能を喪失した多能性細胞に対して動物分類学上異種である請求項 1か ら 1 2のいずれか 1項に記載のキメラ動物の作製方法。
1 5 . 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失し た多能性細胞がマウス、 ラット、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ヒッジ、 ャギおよびサルか らなる群から選択される動物由来である請求項 1から 1 4のいずれか 1項に記載 のキメラ動物の作製方法。
1 6 . 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失し た多能性細胞以外の他の細胞がマウス、 ラット、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ヒッジ、 ャ ギ、 サルおよびヒトからなる群から選択される動物由来である請求項 1から 1 5 のいずれか 1項に記載のキメラ動物の作製方法。
1 7 . 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失し た多能性細胞において、 変異または欠損した遺伝子が
(a) 生殖細胞形成に関与する遺伝子、
(b) 免疫系に関与する遺伝子、 ならびに
(c) 特定の組織もしくは器官の形成に関与する遺伝子または特定のタンパク質を コードする遺伝子
からなる群から選択される 1以上の遺伝子である請求項 1から 1 6のいずれか 1 項に記載のキメラ動物の作製方法。
1 8 . 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失し た多能性細胞が、 異種間交雑により得られた生殖細胞を形成し得ない多能性細胞 である請求項 1から 1 6のいずれか 1項に記載のキメラ動物の作製方法。
1 9 . 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失し た多能性細胞が、 生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損し、 生殖細胞 を形成し得ない多能性細胞であり、 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子 が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞が生殖系列に伝播さ れる請求項 1 7記載のキメラ動物の作製法。
2 0 . 生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損し、 生殖細胞を形成 し得ない多能性細胞が C- ki t変異動物由来の生殖細胞を形成できない多能性細胞 である請求項 1 9記載のキメラ動物の作製方法。
2 1 . C- ki t変異動物が Wv/Wvマウスである請求項 2 0記載のキメラ動物の 作製方法。
2 2 . 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失し た多能性細胞以外の他の多能性細胞が遺伝子改変を受けた細胞であり、 該遺伝子 改変を受けた多能性細胞が生殖系列に伝播される請求項 1 9から 2 1のいずれか 1項に記載のキメラ動物の作製方法。
2 3 . 遺伝子改変が外来遺伝子の導入または内在遺伝子のノックアウトであ る、 請求項 2 2記載のキメラ動物の作製方法。
2 4 . 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失し た多能性細胞が、 免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、 免疫機能に障害 を有する多能性細胞である請求項 1 7記載のキメラ動物の作製方法。
2 5 . 免疫系に関与する遺伝子が変異又は欠損し、 免疫機能に障害を有する 多能性細胞が、 抗体をコードする遺伝子が変異又は欠損し、 抗体産生能を喪失し た多能性細胞である請求項 2 4記載のキメラ動物の作製方法。
2 6 . 免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、 免疫機能に障害を有す る多能性細胞が免疫不全動物由来の多能性細胞である請求項 2 4に記載のキメラ 動物の作製方法。
2 7 . 免疫不全動物が nu/miマウスまたは sc idマウスである請求項 2 6記載 のキメラ動物の作製方法。
2 8 . 免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、 免疫機能に障害を有す る多能性細胞がリンパ球欠損動物由来の多能性細胞である請求項 2 4記載のキメ ラ動物の作製方法。
2 9 . リンパ球欠損動物が RAG- 1遺伝子およびノまたは RAG- 2遺伝子が変異 または欠損した動物である請求項 2 8記載のキメラ動物の作製方法。
3 0 . 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失し た多能性細胞が特定の組織もしくは器官の形成に関与する遺伝子または特定の夕 ンパク質をコードする遺伝子が変異または欠損した多能性細胞である請求項 1 7 記載のキメラ動物の作製方法。
3 1 . 製造されたキメラ動物において、 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞の前記変異 または欠損した遺伝子に対応する遺伝子により、 該遺伝子が関与する特定の組織 もしくは器官または夕ンパク質が産生される請求項 3 0記載のキメラ動物の作製 方法。
3 2 . 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失し た多能性細胞が免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損しており、 さらに生殖 細胞形成に関与する遺伝子、 あるいは特定の組織もしくは器官の形成に関与する 遺伝子または特定のタンパク質をコードする遺伝子が変異または欠損している多 能性細胞である請求項 1 7記載のキメラ動物の作製方法。
3 3 . 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失し た多能性細胞以外の他の多能性細胞が、
(a) 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した多能 性細胞以外の他の多能性細胞と該特定の遺伝子が変異または欠損した多能性細胞 に対して動物分類学上同種もしくは異種である細胞との融合細胞、 または
(b) 該特定の遺伝子が変異または欠損した多能性細胞に対して動物分類学上同種 または異種である細胞由来の多能性細胞
である請求項 1から 3 2のいずれか 1項に記載のキメラ動物の作製方法。
3 4 . 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失し た多能性細胞以外の他の多能性細胞に対して動物分類学上同種もしくは異種であ る細胞が組織幹細胞または分化細胞である請求項 3 3記載のキメラ動物の作製方 法。
3 5 . 生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損し、 生殖細胞を形成 し得ない多能性細胞ならびに
(a) 生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損し、 生殖細胞を形成し得な い前記多能性細胞と該生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損した多能 性細胞に対して動物分類学上同種または異種である細胞との融合細胞、 もしくは
(b) 該生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損した多能性細胞に対して 動物分類学上同種または異種である細胞由来の多能性細胞様細胞
を動物の宿主胚に注入することを含む、 前記同種または異種である細胞が生殖系 列に伝播し得る請求項 3 3または 3 4に記載のキメラ動物の作製方法。
3 6 . 免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、 免疫機能に障害を有す る多能性細胞ならびに
(a) 免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、 免疫機能に障害を有する前記 多能性細胞と該多能性細胞に対して動物分類学上異種である細胞との融合細胞、 もしくは
(b) 該多能性細胞に対して異種である細胞由来の多能性細胞様細胞
を動物の宿主胚に注入することを含む、 前記免疫系に関与する遺伝子が変異また は欠損し、 免疫機能に障害を有する多能性細胞および前記異種である細胞がキメ ラ個体の形成に寄与している請求項 3 3または 3 4に記載のキメラ動物の作製方 法。
3 7 . 請求項 1から 3 6のいずれか 1項に記載の方法で製造されたキメラ動 物。
3 8 . 請求項 1 7から 2 3のいずれか 1項に記載の方法で製造されたキメラ 動物より、 特定の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失し た多能性細胞以外の他の多能性細胞由来の生殖細胞を回収することを含む、 特定 の遺伝子が変異または欠損し、 該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以 外の他の多能性細胞由来の生殖細胞を製造する方法。
3 9 . 請求項 1 7から 2 3のいずれか 1項に記載の方法で製造されたキメラ 動物を交配し遺伝子が改変された動物を子孫として得る遺伝子改変動物の製造方 法。
4 0 . 請求項 3 9記載の方法で製造された遺伝子改変動物。
4 1 . 請求項 1 7および 2 4から 2 9のいずれか 1項に記載の方法で製造さ れたキメラ動物またはその子孫であって、 免疫系に関与する遺伝子が変異または 欠損し、 免疫機能に障害を有する多能性細胞以外の他の多能性細胞由来の抗体を コードする遺伝子を有するキメラ動物またはその子孫に抗原を投与することを含 む抗体の製造方法。
4 2 . 請求項 1 7、 3 0および 3 1のいずれか 1項に記載の製造方法により 製造されたキメラ動物またはその子孫に、 特定の組織もしくは器官を形成させま たは特定のタンパク質を産生させることを含む、 特定の組織もしくは器官または 特定のタンパク質を製造する方法。
4 3 . C- ki t変異動物由来である、 生殖細胞を形成できない多能性細胞。
4 4 . C-ki t変異動物が Wv/Wvマウスである請求項 4 3記載の多能性細胞。
4 5 . 免疫不全動物由来である、 免疫に関与する遺伝子が変異または欠損し た多能性細胞。
4 6 . 動物が nu/nuマウスまたは sc idマウスである請求項 4 5記載の多能性 細胞。
4 7 . リンパ球欠損動物由来である、 免疫に関与する遺伝子が変異または欠 損した多能性細胞。
4 8 . リンパ球欠損動物が、 RAG- 1遺伝子および または RAG- 2遺伝子が変 異または欠損した動物である請求項 4 7記載の多能性細胞。
4 9 . ES細胞、 EG細胞および GS細胞からなる群から選択される細胞である、 請求項 4 3から 4 8のいずれか 1項に記載の多能性細胞。
5 0 . ミトコンドリア DNAとして適合型ミトコンドリア DNAが導入されてい る請求項 4 3から 4 9のいずれか 1項に記載の多能性細胞。
5 1 . 適合型ミトコンドリア DNAが、野生型マウス Mus muscu lus musculus 夕 イブである、 請求項 5 0記載の多能性細胞。
5 2 . 性染色体型が雄 XY型である、請求項 4 3から 5 1のいずれか 1項に記 載の多能性細胞。
5 3 . 性染色体型が雌 XX型である、請求項 4 3から 5 1のいずれか 1項に記 載の多能性細胞。
5 4 . 請求項 4 3から 5 3のいずれか 1項に記載の多能性細胞と動物の初期 胚もしくは生殖細胞由来の細胞を混合培養して、 生殖器官由来の細胞から多能性 細胞を樹立する方法。
5 5 . 動物の初期胚が雄核発生胚または雌核発生胚である請求項 5 4記載の 方法。
5 6 . 混合培養が動物の初期胚中での共培養である請求項 5 4または 5 5に 記載の初期胚もしくは生殖細胞由来の細胞から多能性細胞を樹立する方法。
5 7 . 初期胚もしくは生殖細胞由来の細胞が、 胚盤胞の内部細胞塊由来の細 胞であり、 多能性細胞が、 ES細胞である請求項 5 4から 5 6のいずれか 1項に記 載の多能性細胞を樹立する方法。
5 8 . 初期胚もしくは生殖細胞由来の細胞が、 始原生殖細胞であり、 多能性 細胞が、 EG細胞である請求項 5 4から 5 6のいずれか 1項に記載の多能性細胞を 樹立する方法。
5 9 . 初期胚もしくは生殖細胞由来の細胞が、 生殖細胞であり、 多能性細胞 が、 GS細胞である請求項 5 4から 5 6のいずれか 1項に記載の多能性細胞を樹立 する方法。
6 0 . 請求項 4 3から 5 3のいずれか 1項に記載の多能性細胞と他の多能性 細胞を共培養することを含む、 該他の多能性細胞の増殖能を向上させる方法。
6 1 . 共培養が動物の初期胚中で行われる請求項 6 0記載の他の多能性細胞 の増殖能を向上させる方法。
6 2 . 他の多能性細胞が、 ES細胞、 EG細胞および GS細胞からなる群から選 択される細胞である請求項 6 0または 6 1に記載の多能性細胞の増殖能を向上さ せる方法。
6 3 . 他の多能性細胞が遺伝子が改変されている多能性細胞である、 請求項 6 0から 6 2のいずれか 1項に記載の多能性細胞の増殖能を向上させる方法。 ，
6 4 . 請求項 4 3から 5 3のいずれか 1項に記載の多能性細胞を他の多能性 細胞と共に動物の宿主胚に注入することを含む、 生殖細胞が他の多能性細胞に由 来する生殖系列キメラ動物の作製方法。
6 5 . 請求項 4 3から 5 3のいずれか 1項に記載の多能性細胞およびノまた は他の多能性細胞が適合型ミトコンドリア DNAが導入または置換された多能性細 胞である、 請求項 6 3記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
6 6 . 動物の宿主胚が適合型ミトコンドリア DNAを導入または置換した宿主 胚である、 請求項 6 4または 6 5に記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
6 7 . 動物の宿主胚が胚盤胞である、 請求項 6 4から 6 6のいずれか 1項に 記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
6 8 . 動物の宿主胚がテトラプロイドである、 請求項 6 7記載の生殖系列キ メラ動物の作製方法。
6 9 . 他の多能性細胞が、 ES細胞、 EG細胞および GS細胞からなる群から選 択される細胞である請求項 6 4から 6 8のいずれか 1項に記載の生殖系列キメラ 動物の作製方法。
7 0 . 動物がマウスである、 請求項 6 4から 6 9のいずれか 1項に記載の生 殖系列キメラ動物の作製方法。
7 1 . 他の多能性細胞が遺伝子が改変されている多能性細胞である、 請求項 6 4から 7 0のいずれか 1項に記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
7 2 . 請求項 4 3から 5 3のいずれか 1項に記載の多能性細胞と他の多能性 細胞を共培養し、 共培養した細胞を共に動物の宿主胚に注入することを含む、 生 殖細胞が他の多能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物の作製方法。
7 3 . 共培養が動物の初期胚中で行われる請求項 7 2記載の生殖系列キメラ 動物の作製方法。
7 4 . 請求項 4 3から 5 3のいずれか 1項に記載の多能性細胞および他の多 能性細胞が適合型ミトコンドリア DNAが導入された多能性細胞である、 請求項 7
1または 7 2に記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
7 5 . 動物の宿主胚が適合型ミトコンドリア DNAを導入した宿主胚である、 請求項 7 2から 7 4のいずれか 1項に記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
7 6 . 動物の宿主胚が胚盤胞である、 請求項 7 2から 7 5のいずれか 1項に 記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
7 7 . 動物の宿主胚がテトラプロィドである、 請求項 7 6記載の生殖系列キ メラ動物の作製方法。
7 8 . 他の多能性細胞が、 ES細胞、 EG細胞および GS細胞からなる群から選 択される細胞である請求項 7 2から 7 7のいずれか 1項に記載の生殖系列キメラ 動物の作製方法。
7 9 . 動物がマウスである、 請求項 7 2から 7 8のいずれか 1項に記載の生 殖系列キメラ動物の作製方法。
8 0 . 他の多能性細胞が遺伝子が改変されている多能性細胞である、 請求項 7 2から 7 9のいずれか 1項に記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
8 1 . 請求項 6 4から 8 0のいずれか 1項に記載の方法により作製されたキ メラ動物。
8 2 . 請求項 5 5記載の方法により樹立した雄核発生胚または雌核発生胚由 来の多能性細胞を動物の生殖器官に移植することにより生殖細胞を作製する方法。
8 3 . 雄核発生胚由来の ES細胞を、動物の輸精管に移植することにより精子 を作製する請求項 8 2記載の方法。
PCT/JP2005/013685 2004-07-20 2005-07-20 Es細胞を用いたキメラ作製 WO2006009297A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006527813A JPWO2006009297A1 (ja) 2004-07-20 2005-07-20 Ｅｓ細胞を用いたキメラ作製
US11/632,896 US20070250943A1 (en) 2004-07-20 2005-07-20 Construction of Chimera Using En Cells
EP05767072A EP1779724A4 (en) 2004-07-20 2005-07-20 GENERATION OF A CHIMERIC BY ES CELLS

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-211887 2004-07-20
JP2004211887 2004-07-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006009297A1 true WO2006009297A1 (ja) 2006-01-26

Family

ID=35785395

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/013685 WO2006009297A1 (ja) 2004-07-20 2005-07-20 Es細胞を用いたキメラ作製

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20070250943A1 (ja)
EP (1) EP1779724A4 (ja)
JP (1) JPWO2006009297A1 (ja)
WO (1) WO2006009297A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012029784A1 (ja) * 2010-08-31 2012-03-08 国立大学法人熊本大学 マウス系統を樹立する方法
WO2014119627A1 (ja) * 2013-01-29 2014-08-07 国立大学法人 東京大学 キメラ動物の作製方法
WO2016052759A1 (ja) * 2014-10-02 2016-04-07 学校法人自治医科大学 多能性幹細胞再樹立法
WO2016163386A1 (ja) * 2015-04-08 2016-10-13 全国農業協同組合連合会 異個体由来の配偶子を生産する非ヒト大型哺乳動物又は魚類の作出方法
WO2017175876A1 (ja) * 2016-04-05 2017-10-12 学校法人自治医科大学 幹細胞を再樹立する方法
JPWO2019073960A1 (ja) * 2017-10-10 2020-11-19 国立大学法人 東京大学 分化ポテンシャルを改変した多能性幹細胞の動物の作製への応用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001299141A (ja) * 2000-04-27 2001-10-30 Sumitomo Electric Ind Ltd ノックイン非ヒト哺乳動物
WO2003072777A1 (fr) * 2002-02-27 2003-09-04 Yasumitsu Nagao Animal dont l'embryon est modifie et procede de construction de cet animal
WO2003089580A2 (en) * 2002-04-16 2003-10-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cancer models
JP2004503215A (ja) * 2000-05-12 2004-02-05 アドヴァンスト　リサーチ　アンド　テクノロジー　インスティチュート、インコーポレイティッド 造血細胞集団において静止細胞を濃縮するための方法
JP2004166696A (ja) * 2002-10-31 2004-06-17 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd Ｇａｔａ−３遺伝子導入アトピー性皮膚炎モデル動物

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2477112A1 (en) * 2002-02-27 2003-09-04 Yasumitsu Nagao A method for producing germline chimeric animal

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001299141A (ja) * 2000-04-27 2001-10-30 Sumitomo Electric Ind Ltd ノックイン非ヒト哺乳動物
JP2004503215A (ja) * 2000-05-12 2004-02-05 アドヴァンスト　リサーチ　アンド　テクノロジー　インスティチュート、インコーポレイティッド 造血細胞集団において静止細胞を濃縮するための方法
WO2003072777A1 (fr) * 2002-02-27 2003-09-04 Yasumitsu Nagao Animal dont l'embryon est modifie et procede de construction de cet animal
WO2003089580A2 (en) * 2002-04-16 2003-10-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cancer models
JP2004166696A (ja) * 2002-10-31 2004-06-17 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd Ｇａｔａ−３遺伝子導入アトピー性皮膚炎モデル動物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1779724A4 *

Cited By (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5935692B2 (ja) * 2010-08-31 2016-06-15 国立大学法人 熊本大学 マウス系統を樹立する方法
JPWO2012029784A1 (ja) * 2010-08-31 2013-10-28 国立大学法人 熊本大学 マウス系統を樹立する方法
WO2012029784A1 (ja) * 2010-08-31 2012-03-08 国立大学法人熊本大学 マウス系統を樹立する方法
US9167805B2 (en) 2010-08-31 2015-10-27 National University Corporation Kumamoto University Method of establishing mouse strain
JP6279141B1 (ja) * 2013-01-29 2018-02-14 国立大学法人 東京大学 キメラ動物の作製方法
JP2018082716A (ja) * 2013-01-29 2018-05-31 国立大学法人 東京大学 キメラ動物の作製方法
US11844336B2 (en) 2013-01-29 2023-12-19 The University Of Tokyo Method for producing chimeric animal
JPWO2014119627A1 (ja) * 2013-01-29 2017-01-26 国立大学法人 東京大学 キメラ動物の作製方法
WO2014119627A1 (ja) * 2013-01-29 2014-08-07 国立大学法人 東京大学 キメラ動物の作製方法
US10645912B2 (en) 2013-01-29 2020-05-12 The University Of Tokyo Method for producing chimeric animal
JP2018046833A (ja) * 2013-01-29 2018-03-29 国立大学法人 東京大学 キメラ動物の作製方法
US11441125B2 (en) 2014-10-02 2022-09-13 Jichi Medical University Method for reestablishment of pluripotent stem cells
WO2016052759A1 (ja) * 2014-10-02 2016-04-07 学校法人自治医科大学 多能性幹細胞再樹立法
KR20170133380A (ko) * 2015-04-08 2017-12-05 내셔날 페더레이션 오브 애그리컬쳐 코오퍼레이티브 어소우시에이션스 이개체 유래의 배우자를 생산하는 비인간 대형 포유 동물 또는 어류의 작출 방법
CN107734965A (zh) * 2015-04-08 2018-02-23 全国农业协同组合连合会 生产来自不同个体的配子的非人大型哺乳动物或鱼类的制作方法
WO2016163386A1 (ja) * 2015-04-08 2016-10-13 全国農業協同組合連合会 異個体由来の配偶子を生産する非ヒト大型哺乳動物又は魚類の作出方法
KR102636332B1 (ko) * 2015-04-08 2024-02-14 내셔날 페더레이션 오브 애그리컬쳐 코오퍼레이티브 어소우시에이션스 이개체 유래의 배우자를 생산하는 비인간 대형 포유 동물 또는 어류의 작출 방법
JPWO2017175876A1 (ja) * 2016-04-05 2019-03-14 学校法人自治医科大学 幹細胞を再樹立する方法
WO2017175876A1 (ja) * 2016-04-05 2017-10-12 学校法人自治医科大学 幹細胞を再樹立する方法
JPWO2019073960A1 (ja) * 2017-10-10 2020-11-19 国立大学法人 東京大学 分化ポテンシャルを改変した多能性幹細胞の動物の作製への応用
JP7071749B2 (ja) 2017-10-10 2022-05-19 国立大学法人 東京大学 分化ポテンシャルを改変した多能性幹細胞の動物の作製への応用

Also Published As

Publication number Publication date
EP1779724A1 (en) 2007-05-02
JPWO2006009297A1 (ja) 2008-05-01
EP1779724A4 (en) 2008-03-19
US20070250943A1 (en) 2007-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5523226A (en) Transgenic swine compositions and methods
Prelle et al. Pluripotent stem cells–model of embryonic development, tool for gene targeting, and basis of cell therapy
Fang et al. Rabbit embryonic stem cell lines derived from fertilized, parthenogenetic or somatic cell nuclear transfer embryos
JP5588405B2 (ja) ラット胚性幹細胞
JP2019030310A (ja) ｉＰＳ細胞とＢＬＡＳＴＯＣＹＳＴ ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴＡＴＩＯＮを利用した臓器再生法
JP2000516463A (ja) 特定の遺伝的特性を有する哺乳動物を作製する方法
JPWO2011068103A1 (ja) ラット胚性幹細胞を用いたキメララットの作製法
WO2005100548A1 (ja) 精巣細胞由来多能性幹細胞の製造方法
WO2013143467A1 (zh) 孤雄单倍体干细胞系及其制法和应用
WO2006009297A1 (ja) Es細胞を用いたキメラ作製
Park et al. Assisted reproductive techniques and genetic manipulation in the common marmoset
Klimczewska et al. The regulative nature of mammalian embryos
JP4226598B2 (ja) 精子幹細胞の生体外における増殖方法、その方法を利用して増殖された精子幹細胞、および精子幹細胞の生体外増殖に用いられる培地添加剤キット
US8119785B2 (en) Nucleic acid sequences and homologous recombination vectors for distruption of a Fel D I gene
JP4275137B2 (ja) 核移植卵、単為発生胚および単為発生哺乳動物の作出方法
US10626417B2 (en) Method of genetically altering and producing allergy free cats
Ohta et al. Male germline and embryonic stem cell lines from NOD mice: efficient derivation of GS cells from a nonpermissive strain for ES cell derivation
WO2021174742A1 (zh) 一种动物的制备方法
Sasaki Creating genetically modified marmosets
Zhu et al. Increasing the number of transferred embryos results in delivery of viable transgenically cloned Guangxi Bama mini-pigs
US20070204357A1 (en) Process for producing normal parenchymal cells, tissues or organs by bioincubator
JP5078074B2 (ja) 核移植卵、単為発生胚および単為発生非ヒト哺乳動物の作出方法
JP2009159878A (ja) 非ヒトｅｓ動物の新規作成方法
Moore Characterization of porcine inner cell mass (pICM) and primordial germ cells (pPGC) for the development of transgenic embryonic cell lines
Hall et al. Nuclear transfer and its applications in regenerative medicine

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006527813

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11632896

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005767072

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005767072

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 11632896

Country of ref document: US