WO2016052759A1 - 多能性幹細胞再樹立法 - Google Patents

Abstract

　本出願は、キメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する方法、及び当該方法により得られる細胞に関する。本発明の方法は、ヘテロな細胞集団から、キメラ形成能等を有する幹細胞をモノクローン化して高品質化する技術である。

Description

多能性幹細胞再樹立法

　本出願は、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞からキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する方法に関する。当該方法は、多能性幹細胞または複能性幹細胞から、キメラ形成能を保持する等の特性を有する細胞を選抜・再樹立することにより、幹細胞の高品質化を行う技術である。本出願はまた、当該方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞に関する。本出願はさらに、本発明の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞、または当該幹細胞を分化させて得られた体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を用いて薬効評価または病態解析を行う方法に関する。

　ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）／ＥＳ細胞（胚性幹細胞）から臓器原基または臓器幹細胞を作製・供給することが、ｉＰＳ細胞などを用いた再生医療の発展に必要である。たとえば、ヒトにｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞より再生したヒト臓器／臓器原基を移植するためには、その細胞をブタやヒツジ等の異種の環境で目的臓器形成に誘導するステップが有効と考えられる。しかしながら、臓器原基／臓器幹細胞をインビトロで作製することは困難であるので、異種間のキメラ胚を作製し、キメラ胚より臓器原基または臓器幹細胞を採取する必要がある。そのためには異種間にわたって生着性があり、かつキメラ形成能を維持した高品質の幹細胞を臓器形成の出発細胞とする必要がある。

　また、ｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞からクローン動物またはキメラ動物を作製することは、絶滅危惧種などの希少動物、ペットなどの愛玩哺乳動物、有用な商業動物の保存・再生・維持という観点から有用であると考えられる。この場合は、同種間または異種間で生着性があり、かつキメラ形成能を維持した高品質の幹細胞を出発細胞とする必要がある。

　マウスやラットのＥＳ細胞は、一般にナイーブ型の多能性幹細胞として樹立されており、胚盤胞補完法によるキメラ動物の作製について複数の報告例がある。一方、ウサギ、ブタ、サル、ヒトなど中動物のｉＰＳ／ＥＳ細胞はコロニーが扁平であるプライム型の特徴を有しており、これを異種または同種の胚盤胞に移植してもキメラを形成することができないか、形成できたとしてもごくわずかな寄与率である。

　このように、キメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する方法の重要性は、キメラ胚・キメラ動物の作製の成功率を高めるという観点から、よりいっそう増している。

　キメラ形成可能なｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞を得ることを目的としたこれまでの報告例の多くは、遺伝子導入等の手段でｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞を確立するものであった（非特許文献１）。また、環境因子の添加など培地の改良により、質の高いｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞を確立する例も報告されている（非特許文献２）。これらの報告例は、キメラ形成可能なｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞を作製する技術ではあるが、作製されたｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞がヘテロな細胞集団であり、キメラ形成能を持たない細胞が混在している可能性を十分否定できるだけの評価がなされていない。これらの技術は、ｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞のうちの「キメラ形成可能」な細胞の割合を高める技術であるといえる。

　現状では、「キメラ形成可能」という特性を維持した細胞はｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞樹立時に取得した全細胞のうちの一部に過ぎない。臓器形成等の出発細胞を得るためには、キメラ形成能の獲得性維持の観点から、樹立したｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞をさらに選択して再樹立を行い高品質化する必要がある。

　長尾ら（特許文献１）は、特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞、および該多能性細胞以外の他の多能性細胞を含む２種類以上の細胞を動物の宿主胚に注入することを含む、キメラ動物の作製方法を開示している。特許文献１は、生殖細胞を形成しえないマウス胚からＥＳ細胞を樹立し、該ＥＳ細胞を動物の生殖器官由来の細胞と共培養することにより、効率的に生殖器官由来の細胞からＥＳ細胞を樹立させることを見いだしたことを記載している。同文献はまた、当該生殖細胞を形成できないマウス胚から樹立したＥＳ細胞を他のマウスＥＳ細胞、例えば遺伝子を改変したＥＳ細胞と共培養することにより、他のマウスＥＳ細胞の増殖能が改善することができることを見いだしたことを記載している。

　しかしながら、同種・異種を問わず、キメラ形成可能なｉＰＳ／ＥＳ細胞の再樹立を可能にする方法については、現時点で報告例がない。

国際公開ＷＯ２００６／００９２７２号パンフレット

Ｈａｎｎａ，Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０７：９２２２−９２２７（２０１０） Ｇａｆｎｉ，Ｏ．，ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，５０４（７４７９）：２８２−２８６（２０１３） Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６：５１３（２０１４） Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐ．３：３４９２（２０１３）

　上述のように、臓器形成等の出発細胞を得るためには、キメラ形成能の獲得性維持の観点から、樹立したｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞をさらに選択して再樹立を行い高品質化する方法が依然として求められている。本発明は、キメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する方法を提供する。本発明はまた、再樹立されたキメラ形成能を有する幹細胞を提供する。

　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。ｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞から臓器原基または臓器幹細胞を作製するためには、異種間にわたって生着性があり、かつキメラ形成能を維持した高品質の幹細胞を臓器形成の出発細胞として供給する必要がある。この課題の解決のためには異種間のキメラ形成が可能な「よいｉＰＳ／ＥＳ細胞」を作製できるシステムの開発が必要である。この一つの方法として、本発明者らは「異種間における共培養・再樹立システム」を開発した。すなわち、「異種間における共培養・再樹立システム」として、ｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞を、（１）当該ｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞とは異なる種の高品質な多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、あるいはこれらの細胞を含む内部細胞塊）と共培養を行い、ＥＳ細胞で形成されるナイーブコロニー形成に寄与する細胞群かどうかを条件として選別する；および／または（２）当該ｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞とは異なる種の宿主胚（例えば桑実胚、胚盤胞、４倍体胚などのマウス初期胚）にマイクロインジェクション等で移植し共培養した際に、内部細胞塊（ＩＣＭ）の形成に寄与することが可能かどうかを条件として選別する；そして、上記（１）および／または（２）を必要に応じて繰り返すことにより、ｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞樹立株を、キメラ形成能を維持した幹細胞として再樹立する；方法を見いだした。上記の方法により再樹立したブタｉＰＳ細胞をマウス胚に移植したところ、１１．５日胚でキメラとして寄与するｉＰＳ細胞を複数株確立することに成功した。また、この方法について、既存の方法により作製した多能性幹細胞のヘテロな細胞群を、高品質な多能性幹細胞と共存する環境または宿主胚中の環境におくことにより、当該ヘテロな細胞群をキメラ形成能を有する細胞群として適応・訓化させ、そして当該キメラ形成能を有する細胞群を選別する方法として位置づけた。これらの研究成果により本発明は完成した。

　また、このような異種間における共培養・再樹立システムは、同種間のキメラ形成が可能なｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞を作製できるシステムとしても利用可能であるという技術思想に本発明者らは至った。

　すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
（１）異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する方法であって、以下の工程：
　（ｉ）第一の哺乳類の種由来の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と共培養する；
　（ｉｉ）工程（ｉ）の共培養物において、細胞集合体を形成し、かつ、当該第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞を含む細胞群を選別する；
　（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する；
　（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する；および
　（ｖ）当該内部細胞塊から当該第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞をクローニングすることにより、異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する；を含み、ここで当該第一の哺乳類の種と当該第二の哺乳類の種は異なる種であり、そして当該第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞は、齧歯類以外の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞であるか、齧歯類由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または複能性幹細胞である、前記方法。
（２）さらに、工程（ｖ）で再樹立した幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得て、工程（ｉｉｉ）~（ｖ）を繰り返すことを含む、（１）に記載の方法。
（３）多能性幹細胞が、以下：ＥＳ細胞および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）からなる群より選択され、そして、複能性幹細胞が以下：栄養芽幹細胞（ＴＳ細胞）、エピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、多能性生殖細胞（ｍＧＳ細胞）、クローン胚由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）、造血幹細胞、神経幹細胞、および、間葉系幹細胞、からなる群より選択される、（１）または（２）に記載の方法。
（４）第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞が、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、（１）ないし（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）高品質な多能性幹細胞が、ナイーブ型の多能性幹細胞である、（１）ないし（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）宿主胚が、初期胚、４倍体胚、雄性胚、単為発生胚、および胎盤に寄与するＥＳ細胞、からなる群より選択される、（１）ないし（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）工程（ｉｉｉ）が、工程（ｉｉ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の初期胚または４倍体胚にマイクロインジェクションまたはアグリゲーションして共培養することにより行う、（１）ないし（６）のいずれか１項に記載の方法。
（８）第一の哺乳類の種および第二の哺乳類の種がそれぞれ、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サル、ヒトからなる群より選択される、（１）ないし（７）のいずれか１項に記載の方法。
（９）異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する方法であって、以下の工程：
　（ｉ）第一の哺乳類の種由来の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得る；
　（ｉｉ）工程（ｉ）の細胞群を、第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する；
　（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する；および
　（ｉｖ）当該内部細胞塊から当該第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞をクローニングすることにより、異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する；
　を含み、ここで当該第一の哺乳類の種と当該第二の哺乳類の種は異なる種であり、そして当該第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞は、齧歯類以外の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞であるか、齧歯類由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または複能性幹細胞である、前記方法。
（１０）工程（ｉ）~（ｉｖ）を繰り返すことを含む、その際、２サイクル目以降の工程（ｉ）は、その直前のサイクルの工程（ｉｖ）で再樹立した幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得ることにより行う、（９）に記載の方法。
（１１）第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞はヒトＥＳ細胞ではなく、そして第二の哺乳類の種はヒトではない、（１）ないし（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）同種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する方法であって、以下の工程：
　（ｉ）哺乳類の種由来の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を、同種の哺乳類由来の高品質な多能性幹細胞と共培養する；
　（ｉｉ）工程（ｉ）の共培養物において、細胞集合体を形成し、かつ、前記多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞を含む細胞群を選別する；
　（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の細胞群を同種の哺乳類由来の宿主胚と共培養する；
　（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する；および
　（ｖ）当該内部細胞塊から前記多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞をクローニングすることにより、同種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する；を含む、ここで、当該哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞は、齧歯類以外の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞であるか、齧歯類由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または複能性幹細胞である、前記方法。
（１３）さらに、工程（ｖ）で再樹立した幹細胞を、同種の哺乳類由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得て、工程（ｉｉｉ）~（ｖ）を繰り返すことを含む、（１２）に記載の方法。
（１４）同種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する方法であって、以下の工程：
　（ｉ）哺乳類の種由来の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を、同種の哺乳類由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得る；
　（ｉｉ）工程（ｉ）の細胞群を、同種の哺乳類由来の宿主胚と共培養する；
　（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する；および
　（ｉｖ）当該内部細胞塊から前記多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞をクローニングすることにより、同種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する；
　を含む、ここで、当該哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞は、齧歯類以外の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞であるか、齧歯類由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または複能性幹細胞である、前記方法。
（１５）工程（ｉ）~（ｖ）を繰り返すことを含む、その際、２サイクル目以降の工程（ｉ）は、その直前のサイクルの工程（ｉｖ）で再樹立した幹細胞を、同種の哺乳類由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得ることにより行う、（１４）に記載の方法。
（１６）哺乳類の種はヒトではない、（１２）ないし（１５）のいずれか１項に記載の方法。
（１７）幹細胞であって、齧歯類以外の哺乳類の種由来の多能性幹細胞もしくは複能性幹細胞、または齧歯類由来のｉＰＳ細胞もしくは複能性幹細胞から再樹立したものであり、そして、以下：
　・キメラ形成可能；
　・細胞集合体を形成可能；および
　・内部細胞塊のニッチ環境に親和性が高い；
　からなる群より選択される特徴の１以上を有する、前記細胞。
（１８）（１）ないし（１６）に記載の方法により再樹立した、（１７）に記載の細胞。
（１９）細胞を用いた薬効評価または病態解析を行う方法であって、以下：
　（ｉ）細胞を得る工程：ここで当該細胞は、（Ａ）（１）ないし（１６）のいずれか１項に記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞であるか、（Ｂ）（１）ないし（１６）のいずれか１項に記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞を分化させることにより得た体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞であり、ここで当該体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞は、以下の（ａ）~（ｃ）のいずれかの方法により得られるものである：
　（ａ）（１）ないし（１６）のいずれか１項に記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞からキメラ胚またはキメラ胎児／胎仔を作製し、そして当該キメラ胚またはキメラ胎児／胎仔由来の体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る；
　（ｂ）（ａ）で得られたキメラ胚またはキメラ胎児／胎仔由来の体性幹細胞をインビトロで分化させて臓器前駆細胞または体性細胞を得る；
　（ｃ）（１）ないし（１６）のいずれか１項に記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞をインビトロで分化させることにより、体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る；
　（ｉｉ）工程（ｉ）で得た細胞を用いて薬効評価または病態解析を行う工程；
　を含む、前記方法。

　本発明の方法により、既存の方法により作製した多能性幹細胞等のヘテロな細胞群を、高品質な多能性幹細胞との共存環境または宿主胚中の環境におくことにより、当該ヘテロな細胞群をキメラ形成能を有する細胞群として適応・訓化させ、そして当該キメラ形成能を有する細胞群を選別することができる。既存の多能性幹細胞等の樹立方法が、「異種間でキメラ形成可能」な細胞の割合を高める技術であるとしたら、本発明は混在しているであろう「異種間でキメラ形成不能」な細胞を除き純化し、移植可能な株を完成させる技術である。本発明の方法は、再生医療においてｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞を用いた臓器移植等を行う際に、出発細胞として必要な高品質の細胞を提供するために有用である。

　また、本発明の方法により選抜したキメラ形成能を有する幹細胞からキメラ胎児／胎仔を作製し、当該キメラ胎児／胎仔から体性細胞・臓器前駆細胞を分取・樹立する、当該キメラ胎児／胎仔から体性幹細胞を分取・樹立する、または、当該体性幹細胞から分化させた臓器前駆細胞を含む体性細胞を作製する、等の方法にて、キメラ胎児／胎仔由来の体性細胞、臓器前駆細胞、体性幹細胞を得ることができる。あるいは、本発明の方法により選抜したキメラ形成能を有する幹細胞をインビトロで分化させることによっても、当該幹細胞由来の体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得ることができる。これらキメラ胎児／胎仔由来の細胞、またはキメラ形成能を有する幹細胞をインビトロで分化させた細胞は、薬効評価等や再生医療等に用いるために有用である。

図１は、本願のキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する方法の一態様を示す概略図である。 図２は、（ａ）選抜前のブタｉＰＳ細胞、及び（ｂ）再樹立後のブタｉＰＳ細胞の形態を示す写真である。スケールは１００μｍである。 図３は、再樹立後のブタｉＰＳ細胞の核型をＱ−バンド染色法により検討した結果である。選抜前および再樹立後でいずれも３８、ＸＸの正常核型であった。 図４は、再樹立したｉＰＳ細胞を用いてキメラ動物を作製したことを示す写真である。（ａ）は胎仔を示す写真であり、赤色蛍光タンパク質の存在から、胎仔においてブタｉＰＳ細胞由来の細胞が存在することを確認した。（ｂ）は、胎盤を示す写真であり、ブタｉＰＳ細胞由来の細胞が羊膜に存在することを確認した。 図５は、キメラ胚及び羊膜におけるブタｉＰＳ細胞の存在を確認するために、ブタ及びマウスのミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の検出を行った結果を示す写真である。 図６は、本願の方法で再樹立した同種間でキメラ形成可能なｉＰＳ細胞を用いて、キメラ法を用いた胚盤胞補完法によるキメラマウスを作製したことを示す図である。（ａ）はキメラマウスの作製手順を示す概略図である。（ｂ）はキメラマウス胎仔（胎齢１８．５）の精巣にｉＰＳ細胞由来の細胞が存在することを示す写真である（ｉＰＳ細胞は緑色蛍光タンパク質で標識されている）。 図７は、ブタｉＰＳ細胞の再樹立前および再樹立後の各細胞における遺伝子発現プロファイルの階層的クラスタリングの結果を示した図である。 図８は、山中４因子及びＮＡＮＯＧの内因性遺伝子の遺伝子発現レベルを示した図である。 図９は、山中４因子及びＮＡＮＯＧのブタに導入したヒト遺伝子（外因性遺伝子）の遺伝子発現レベルを示した図である。 図１０は、再樹立前後における外来性および内因性の山中４因子及びＮＡＮＯＧの遺伝子発現変化を（図８及び図９）の結果をまとめた図である。 図１１は、再樹立前後の各細胞における遺伝子発現プロファイルのピアソン相関解析の結果を示した図である。 図１２は、再樹立細胞において遺伝子の発現が再樹立前の細胞に比べてｌｏｇ_２値が２以上増加する遺伝子の種類及び発現が減少する遺伝子の種類をまとめた図である。 図１３は、ナイーブ型多能性（ｎａｉｖｅ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、コア型多能性（ｃｏｒｅ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、プライム型多能性（ｐｒｉｍｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、原始内胚葉（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ　ｅｎｄｏｄｅｒｍ）の各特性に関する遺伝子の発現についてブタｉＰＳ細胞の再樹立の前後で比較した図である。上段：各遺伝子のＦＰＫＭ値；下段：再樹立前後の遺伝子発現量の変化のｌｏｇ_２値。 図１４は、Ｔｂｘ３、Ｐｏｕ５Ｆ１（Ｏｃｔ４）及びＺｓｃａｎ４の各遺伝子の発現について、ブタｉＰＳ細胞の再樹立の前後で比較した図である。上段：各遺伝子のＦＰＫＭ値；下段：再樹立前後の遺伝子発現量の変化のｌｏｇ_２値。 図１５は、胚性細胞外マトリックスの構成成分の各遺伝子発現についてブタｉＰＳ細胞の再樹立の前後で比較した図である。

　以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

　本発明は異種間または同種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する方法、異種間または同種間でキメラ形成能を有する幹細胞、および、当該幹細胞または当該幹細胞を分化させて得られた細胞を用いた薬効評価または病態解析を行う方法に関する。
　＜定義＞

　本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。

　本明細書において、「幹細胞」とは、自己複製能と分化能を有する細胞である。ここで、自己複製能とは自分と同じ能力を持った細胞を複製する能力をいい、分化能とは異なる機能を持つ複数の細胞に分化する能力をいう。

　本明細書において、「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞」とは、幹細胞であって、個体を形成するすべての細胞種へ分化可能な能力を有する細胞である。多能性幹細胞には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が含まれる。

　本明細書において「複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞」とは、幹細胞であって、複数の細胞種へ分化し得る能力を有する細胞である。複能性幹細胞には、栄養芽幹細胞（ＴＳ細胞）、エピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、多能性生殖細胞（ｍＧＳ細胞）、クローン胚由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）、造血幹細胞、神経幹細胞、および、間葉系幹細胞、などが含まれる。

　本明細書において「多能性幹細胞等」と記載する場合、当該表現は多能性幹細胞および複能性幹細胞を含むものと理解される。

　キメラ胚／キメラ動物の作製は、多能性幹細胞等をホスト（別の個体）の受精卵や初期胚等に移植し、発生させることにより行われる。キメラ胚は、移植された多能性幹細胞等が、生じるホストの胚体の全部または一部となることにより作製される。キメラ動物は、移植された多能性幹細胞等が、生まれてくる個体の一部となることにより作製される。

　本明細書において、幹細胞が「キメラ形成能を有する」または「キメラ形成可能である」とは、幹細胞がホストの受精卵や初期胚等に移植された場合に、生じるホストの胚体の全部もしくは一部、または生まれてくる個体中の様々な臓器の一部となる能力を、当該幹細胞が有することを意味する。あるいは、本明細書において幹細胞が「キメラ形成能を有する」または「キメラ形成可能である」という用語は、幹細胞がホストの受精卵や初期胚等に移植された場合に、移植された多能性幹細胞等が内部細胞塊（ＩＣＭ）の一部を構成する能力、すなわちＩＣＭに寄与する能力を、当該幹細胞が有することを意味する用語としても用いられる。ここで、当該移植される幹細胞が由来する種とホストの種が異種である場合、特に「異種間でキメラ形成可能である」という。当該移植される幹細胞が由来する種とホストの種が同種である場合は、特に「同種間でキメラ形成可能である」という。

　本明細書において「異種」または「異なる種である」とは、動物種が異なることをいう。特に言及しなければ、「異種」または「異なる種である」とは、属レベル以上で動物種が異なることをいう。

　本明細書において「同種」とは、同じ動物種に属することを意味する。特に言及しなければ、「同種」の範囲には、種のレベルで同じ動物種に属するもののみならず、属のレベルで同じ動物種に属する「同属異種」も含まれる。

　本明細書において、多能性幹細胞等が「高品質」であるとは、当該多能性幹細胞等が「ナイーブ型」であることを意味する。多能性幹細胞等が「ナイーブ型」であるとは、多能性幹細胞等が、ドーム型のコロニーを形成する、キメラ形成能を有する、および、精子・卵子などの生殖細胞系列に分化可能である、からなる群より選択される１以上、好ましくは２以上、さらに好ましくは３つすべての性質を有することを意味する。

　本明細書において「宿主胚」とは、キメラ胚／キメラ動物を作製する際に、多能性幹細胞を移植する、ホストとなる動物の胚を意味する。
　＜異種間でキメラ形成可能な幹細胞を再樹立する方法＞

　本出願は、異種間でキメラ形成可能な幹細胞を再樹立する方法を提供する。

　第一の態様において、本出願は、異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する方法であって、以下の工程：
　（ｉ）第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と共培養する；
　（ｉｉ）工程（ｉ）の共培養物において、細胞集合体を形成し、かつ、当該第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞を含む細胞群を選別する；
　（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する；
　（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する；および
　（ｖ）当該内部細胞塊から当該第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞をクローニングすることにより、キメラ形成能を有する多能性幹細胞または複能性幹細胞を再樹立する；
を含み、ここで当該第一の哺乳類の種と当該第二の哺乳類の種は異なる種であり、そして当該第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞は、齧歯類以外の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞であるか、齧歯類由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または複能性幹細胞である、前記方法、を提供する。

　上記の方法は、さらに、工程（ｖ）で再樹立した幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得て、工程（ｉｉｉ）~（ｖ）を繰り返すことを含んでもよい。当該細胞群は、工程（ｖ）で再樹立した幹細胞と第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞を共存させる、または混合することができるあらゆる方法により行うことができる。

　上記の方法において、「多能性幹細胞」は、ＥＳ細胞および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）からなる群より選択される。そして「複能性幹細胞」は、栄養芽幹細胞（ＴＳ細胞）、エピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、多能性生殖細胞（ｍＧＳ細胞）、および、クローン胚由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）、造血幹細胞、神経幹細胞、および、間葉系幹細胞、からなる群より選択される。好ましい態様において、「多能性幹細胞または複能性幹細胞」は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。「高品質な多能性幹細胞」は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、あるいはこれらの細胞の内部細胞塊を含む。「高品質な多能性幹細胞」は、好ましくはＥＳ細胞である。

　上記の方法において、哺乳類の種は、哺乳類であれば特に限定されない。第一の哺乳類の種と第二の哺乳類の種は異なる種であり、以下に記載される群よりそれぞれ独立に選択してもよい。好ましい態様において、第一または第二の哺乳類の種は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サル、ヒトからなる群より選択され、さらに好ましくはマウス、ラット、ブタ、サル、ヒトからなる群より選択される。特に好ましくは、第一の哺乳類の種は、ブタ、サル、ヒトからなる群より選択される。

　上記の方法の工程（ｉ）では、第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と共培養する。当該工程において、共培養はインビトロで、第一の哺乳類の種由来のナイーブ型の多能性幹細胞または複能性幹細胞の培養に適した条件、または、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞の培養に適した条件、あるいはそれらの混合の条件で培養する。当業者はこれらの細胞の培養に適した培地の種類、および、培養温度や培養時間等の培養条件を適宜設定することができる。

　例えばブタｉＰＳ細胞とマウスＥＳ細胞の共培養の場合は、はじめはマウスＥＳ細胞培養条件で培養し、徐々にナイーブ型ブタｉＰＳ細胞培養条件に変えていくなど、至適な条件を実施する。その際の培養条件として、ガス濃度はＣＯ_２５％，Ａｉｒ９５％とし、培養温度は３７℃~３９℃とする条件が挙げられる。例えばクサビラオレンジにて蛍光標識したブタｉＰＳ細胞をマウスＥＳ細胞と混合して細胞塊を作製し、フィーダー細胞を敷いたディッシュに播種する。フィーダー細胞としてはＭＥＦ（マウス胎仔線維芽細胞）を用いる。蛍光タンパク質等の様々な選抜マーカーを用いた選択と、クローニングを行うために良好な形態の目視による選抜により、良好なモザイク状態のコロニーを採取する。これをさらに播種後、新しく形成されたコロニーから、蛍光等の選抜マーカーを有し、かつ状態の良いコロニーを選抜する。その際の培地条件は、例えば、初めはマウスＥＳ細胞培地条件で培養し徐々にナイーブ型ブタｉＰＳ細胞培養条件に変えていくなど、至適な条件を実施する。例えば、以下の培地組成が利用できる。

　ナイーブ型ブタｉＰＳ細胞の培地組成：８２％（ｖ／ｖ）Ｄ−ＭＥＭ、１５％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、０．１ｍＭ　２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１ｘＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１ｘ　ＧｌｕｔａＭＡＸ^ＴＭ−Ｉ（ＧＩＢＣＯ）、１ｘ　ｒｈＬＩＦ（Ｗａｋｏ）、１０μＭ　Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎを含む培養液

　マウスＥＳ細胞の培養組成：８０％（ｖ／ｖ）Ｄ−ＭＥＭ、２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸溶液、０．１ｍＭ　２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１ｘＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１０^３Ｕ／ｍＬｍＬＩＦを含む培養液

　上記方法の工程（ｉｉ）では、工程（ｉ）の共培養物において、細胞集合体を形成し、かつ、第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞を含む細胞群を選別する。この工程はすなわち、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞とともにコロニー形成（特にナイーブコロニー形成）する第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞を含む細胞群を選別する工程である。このように、幹細胞が、ＥＳ細胞とともにコロニー形成する場合、当該幹細胞について「コロニー形成に寄与する幹細胞」と表現することがある。第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞とともにコロニー形成（特にナイーブコロニー形成）する第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞等に由来する幹細胞を含む細胞群の選別は、第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞等を選別前に適切な選抜マーカーで標識しておき、当該選抜マーカーを含むコロニーを選別することにより行うことができる。あるいは、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞を適切な選抜マーカーで標識しておき、当該選抜マーカーを含まないコロニーを第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞等を含む細胞群として識別することもできる。適切な選抜マーカーの例として、クサビラオレンジ（ｈｕＫＯ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｃｌｏｖｅｒ、ＤｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ルシフェラーゼ、ＬａｃＺ、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ＤＴ−Ａ遺伝子、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子、等が挙げられる。識別は、蛍光、発光、染色等による識別、または、薬剤耐性遺伝子等による薬剤選択により行うことができる。

　上記の方法の工程（ｉｉｉ）では、工程（ｉｉ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する。工程（ｉｉ）の細胞群と第二の哺乳類の種由来の宿主胚との共培養により、キメラ胚が作製される。そして、工程（ｉｉｉ）の共培養では、内部細胞塊（ＩＣＭ）が得られる初期胚盤胞の段階までキメラ胚を培養する。好ましい態様において、当該工程の共培養は、工程（ｉｉ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の宿主胚にマイクロインジェクションまたはアグリゲーションして共培養することにより行う。マイクロインジェクションは、宿主胚に細胞（幹細胞など）を移植することによりキメラ胚を作製する方法である。アグリゲーションは、宿主胚として桑実胚期までの初期胚を用い、これに幹細胞等を接触・集合させてキメラ胚を作製する方法である。より好ましくは、工程（ｉｉｉ）の共培養は、工程（ｉｉ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の宿主胚にマイクロインジェクションして共培養することにより行う。

　宿主胚は、特に限定されるものではないが、初期胚、４倍体胚（テトラプロイド胚）、雄性胚、単為発生胚、胎盤に寄与するＥＳ細胞から選択してもよい。好ましい態様において、宿主胚は初期胚または４倍体胚である。

　初期胚は、２細胞期胚から胚盤胞期胚までの胚を意味する。

　４倍体胚は、野生型の２細胞期の割球を電気的に融合させて作製した胚である。４倍体胚を用いて多能性幹細胞と共培養することによりキメラ胚を作製すると、４倍体細胞は胚体自体には寄与できないが、胎盤などの胚体該組織には寄与できるという性質があるため、得られる胚体または個体は前記の多能性幹細胞に１００％由来するものとなる。

　雄性胚はそれ自体では胎児／胎仔になりにくい胚であるが、多能性細胞との共培養によりキメラ胚を作製することで、胎児／胎仔を得ることができる。

　単為発生胚はそれ自体では胎性致死胚であるが、多能性細胞との共培養によりキメラ胚を作製することで個体を得ることができる場合がある。

　胎盤に寄与するＥＳ細胞とは、ＥＳ細胞の細胞集団に含まれる極微少な亜集団として存在する分化全能性を有する細胞である。一般的にＥＳ細胞は、胚盤胞期胚に由来し、機能的には内部細胞塊に相当し、胎盤等の胚体外組織を形成しないと考えられていた。しかし、ＥＳ細胞の極めて少ない分画に分化全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する２細胞期胚に相当する細胞群があることが報告された（Ｍａｃｆａｒｌａｎ，Ｔ．Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８７（７４０５）：５７−６３（２０１２））。この分化全能性を有する細胞群を特に、胎盤に寄与するＥＳ細胞と記載する。

　好ましくは、上記の方法の工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の初期胚または４倍体胚にマイクロインジェクションまたはアグリゲーションして共培養することにより行われる。さらに好ましくは、上記の方法の工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の初期胚または４倍体胚にマイクロインジェクションして共培養することにより行われる。

　上記の方法の工程（ｉｖ）では、工程（ｉｉｉ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する。内部細胞塊の分離は、当業者に公知の手法を用いて行うことができる。好ましくは、内部細胞塊の分離は、顕微鏡手術法または免疫手術法にて行う。胚の状態を観察しながら内部細胞塊を取り出すには顕微鏡手術法が優れている。一方、免疫手術（Ｓｏｌｔｅｒ，Ｄ．ａｎｄ　Ｋｎｏｗｌｅｓｓ，Ｂ．Ｂ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２（１２）：５０９９−５１０２（１９７５））は、顕微鏡手術法よりも機械的損傷が少なく、胚盤胞の内部細胞塊を単離するのに優れている。どちらを用いてもよい。

　上記の方法の工程（ｖ）では、工程（ｉｖ）で得た内部細胞塊から第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞をクローニングすることにより、異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する。内部細胞塊からの多能性幹細胞等のクローニングは当業者に公知の手法を用いて行うことができる。クローニングした細胞が、第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞であることは、当該第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞等を選抜前（すなわち、工程（ｉｉｉ）を行う前）に適切な選抜マーカーで標識しておくことで識別可能である。あるいは、工程（ｉｉｉ）を行う前に宿主胚を適切な選抜マーカーで標識しておき、当該選抜マーカーを含まない細胞を第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞として識別し、クローニングすることもできる。適切な選抜マーカーの例として、クサビラオレンジ（ｈｕＫＯ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｃｌｏｖｅｒ、ＤｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ルシフェラーゼ、ＬａｃＺ、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ＤＴ−Ａ遺伝子、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子、等が挙げられる。識別は、蛍光、発光、染色等による識別、または、薬剤耐性遺伝子等による薬剤選択により行うことができる。

　例えば、クサビラオレンジ（ｈｕＫＯ）で標識された多能性幹細胞等をクローニングする場合は、以下のようにして行うことができる。胚盤胞を顕微鏡下で胚盤胞ごと除去するか、顕微鏡手術でその部分を取り除く。あるいは顕微鏡手術または免疫手術で内部細胞塊だけを取り出し、４穴プレートのフィーダー細胞上にそれぞれ別々に移して培養する。播種後増殖してきた内部細胞塊から良好な形態をし、蛍光顕微鏡にて赤色蛍光を有することを確認したモザイク状態のものだけを、増殖能と形態を指標に目視で選別しピックアップする。また、栄養膜様細胞、上皮様細胞、内胚葉様細胞等の形態を示すコロニーおよび細胞は取り除く。トリプシン処理して細胞塊を分散し、いくつかの新たな細胞塊に分解後、新しく準備したフィーダー細胞上にそれぞれ別々に移して培養する。播種後、さらに新しく形成されたコロニーから、蛍光顕微鏡にて赤色蛍光を有することを確認して状態の良いコロニー選抜をする。次に分散させるときはさらに少数の細胞数の細胞塊にまで分散させ、何度か工程を繰り返し多能性細胞だけのコロニーとする。

　第二の態様において、本出願は、異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する方法であって、以下の工程：
　（ｉ）第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得る；
　（ｉｉ）工程（ｉ）の細胞群を、第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する；
　（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する；および
　（ｉｖ）当該内部細胞塊から当該第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞をクローニングすることにより、異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する；
を含み、ここで当該第一の哺乳類の種と当該第二の哺乳類の種は異なる種であり、そして当該第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞は、齧歯類以外の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞であるか、齧歯類由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または複能性幹細胞である、前記方法を提供する。

　第二の態様の方法は、工程（ｉ）~（ｉｖ）を繰り返して行ってもよい。その場合、２サイクル目以降の工程（ｉ）は、その直前のサイクルの工程（ｉｖ）で再樹立した幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得ることにより行う。

　第二の態様における「多能性幹細胞または複能性幹細胞」、「高品質な多能性幹細胞」、及び「哺乳類の種」は、第一の態様と同様に選択することができる。

　第二の態様の方法の工程（ｉ）では、第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得る。あるいは、第二の態様の工程（ｉ）~（ｉｖ）を繰り返す場合、２サイクル目以降の工程（ｉ）では、その直前のサイクルの工程（ｉｖ）で再樹立した幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得る。この工程は、第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞等または工程（ｉｖ）で再樹立した幹細胞と第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞とを共存させる、または混合することができるあらゆる方法により行うことができる。

　第二の態様の方法の工程（ｉｉ）~（ｉｖ）は、第一の態様の方法の工程（ｉｉｉ）~（ｖ）にそれぞれ対応する。各工程の詳細については、上記に説明したとおりである。

　特に好ましい態様において、本願の異種間でキメラ形成可能な幹細胞を再樹立する方法（第一及び第二の態様双方）における第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞はヒトＥＳ細胞ではなく、そして第二の哺乳類の種はヒトではない。
　＜同種間でキメラ形成可能な幹細胞を再樹立する方法＞

　本出願は、同種間でキメラ形成可能な幹細胞を再樹立する方法を提供する。

　第一の態様において、本出願は、同種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する方法であって、以下の工程：
　（ｉ）哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞を、同種の哺乳類由来の高品質な多能性幹細胞と共培養する；
　（ｉｉ）工程（ｉ）の共培養物において、細胞集合体を形成し、かつ、前記多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞を含む細胞群を選別する；
　（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の細胞群を同種の哺乳類由来の宿主胚と共培養する；
　（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する；および
　（ｖ）当該内部細胞塊から前記多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞をクローニングすることにより、同種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する；
　を含む、ここで、当該哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞は、齧歯類以外の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞であるか、齧歯類由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または複能性幹細胞である、前記方法を提供する。

　上記の方法は、さらに、工程（ｖ）で再樹立した幹細胞を、同種の哺乳類由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得て、工程（ｉｉｉ）~（ｖ）を繰り返すことを含んでもよい。当該細胞群は、工程（ｖ）で再樹立した幹細胞と第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞を共存させる、または混合することができるあらゆる方法により行うことができる。

　上記の方法において「多能性幹細胞」は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、からなる群より選択され、そして「複能性幹細胞」は、栄養芽幹細胞（ＴＳ細胞）、エピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、多能性生殖細胞（ｍＧＳ細胞）、および、クローン胚由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）、造血幹細胞、神経幹細胞、および、間葉系幹細胞、からなる群より選択される。好ましい態様において「多能性幹細胞または複能性幹細胞」は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。「高品質な多能性幹細胞」は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、あるいはこれらの細胞の内部細胞塊を含む。「高品質な多能性幹細胞」は、好ましくはＥＳ細胞である。

　上記の方法において、哺乳類の種は、哺乳類であれば特に限定されない。好ましい態様において、哺乳類の種は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サル、ヒトからなる群より選択され、より好ましくはマウス、ラット、ブタ、サル、ヒトからなる群より選択される。さらに好ましくは、哺乳類の種はヒトではない。したがって、哺乳類の種は、上述の哺乳類の種の群よりヒトを除いた群より選択することもできる。

　上記の方法の工程（ｉ）では、哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞を、同種の哺乳類由来の高品質な多能性幹細胞と共培養する。当該工程において、共培養はインビトロで、高品質な多能性幹細胞の培養に適した条件、ナイーブ型の多能性幹細胞の培養に適した条件、またはそれらを組み合わせた条件で培養する。当業者は、培養に適した培地の種類、および、培養温度や培養時間等の培養条件を適宜設定することができる。

　好ましい培養条件として、ガス濃度はＣＯ_２５％、Ａｉｒ９５％とし、培養温度は３７℃~３９℃とする条件が挙げられる。例えば、選抜マーカーで標識したｉＰＳ細胞を同種の高品質な多能性幹細胞と混合して細胞塊を作製し、フィーダー細胞を敷いたディッシュに播種する。フィーダー細胞としてはＭＥＦ（マウス胎仔線維芽細胞）を用いることができる。蛍光タンパク質等の様々な選抜マーカーを用いた選択と、クローニングを行うために良好な形態の目視による選抜により、良好なモザイク状態のコロニーを採取する。これをさらに播種後、新しく形成されたコロニーから、蛍光等の選抜マーカーを有し、かつ状態の良いコロニーを選抜する。その際の培地条件は、例えば、初めは高品質な多能性幹細胞培地条件で培養し徐々にナイーブ型の多能性幹細胞の培養条件に変えていくなど、至適な条件を実施する。例えば、上記「異種間でキメラ形成可能な多能性幹細胞または複能性幹細胞を再樹立する方法」の第一の態様の方法の工程（ｉ）に関する記載において示した「ナイーブ型ブタｉＰＳ細胞の培地組成」、「マウスＥＳ細胞の培地組成」等を利用してもよい。

　上記方法の工程（ｉｉ）では、工程（ｉ）の共培養において、細胞集合体を形成し、かつ、前記多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞を含む細胞群を選抜する。工程（ｉｉ）は、上記「異種間でキメラ形成能を有する多能性幹細胞または複能性幹細胞を再樹立する方法」の項目の第一の態様の方法の工程（ｉｉ）の説明に従って、同様に行うことができる。

　上記の方法の工程（ｉｉｉ）では、工程（ｉｉ）の細胞群を同種の哺乳類由来の宿主胚と共培養する。工程（ｉｉ）の細胞群と同種の哺乳類由来の宿主胚との共培養により、同種キメラ胚が作製される。そして、工程（ｉｉｉ）の共培養では、内部細胞塊（ＩＣＭ）が得られる初期胚盤胞の段階まで同種キメラ胚を培養する。好ましい態様において、当該行程の共培養は、工程（ｉｉ）の細胞分を同種の哺乳類由来の宿主胚にマイクロインジェクションまたはアグリゲーションして共培養することにより行う。

　上記の方法において、宿主胚は、上記「異種間でキメラ形成能を有する多能性幹細胞または複能性幹細胞を再樹立する方法」の項目における説明に従って、同様に選択することができる。

　好ましくは、上記の方法の工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）の細胞群を同種の哺乳類由来の初期胚または４倍体胚にマイクロインジェクションまたはアグリゲーションして共培養することにより行われる。さらに好ましくは、上記の方法の工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）の細胞群を同種の哺乳類由来の初期胚または４倍体胚にマイクロインジェクションして共培養することにより行われる。

　上記の方法の工程（ｉｖ）では、工程（ｉｉｉ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する。また、工程（ｖ）では、当該内部細胞塊から前記多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞をクローニングすることにより、同種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する。上記の方法の工程（ｉｖ）および工程（ｖ）は、上記「異種間でキメラ形成能を有する多能性幹細胞または複能性幹細胞を再樹立する方法」の項目における第一の態様の方法の工程（ｉｖ）および工程（ｖ）の説明に従って、同様に行うことができる。

　第二の態様において、本出願は、同種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する方法であって、以下の工程：
　（ｉ）哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞を、同種の哺乳類由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得る；
　（ｉｉ）工程（ｉ）の細胞群を、同種の哺乳類由来の宿主胚と共培養する；
　（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する；および
　（ｉｖ）当該内部細胞塊から前記多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞をクローニングすることにより、同種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する；
を含む、ここで、当該哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞は、齧歯類以外の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞であるか、齧歯類由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または複能性幹細胞である、前記方法を提供する。

　第二の態様の方法は、工程（ｉ）~（ｉｖ）を繰り返して行ってもよい。その場合、２サイクル目以降の工程（ｉ）は、その直前のサイクルの工程（ｉｖ）で再樹立した幹細胞を、同種の哺乳類由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得ることにより行う。

　第二の態様における「多能性幹細胞または複能性細胞」、「高品質な多能性幹細胞」、及び「哺乳類の種」は、第一の態様と同様に選択することができる。

　第二の態様の方法の工程（ｉ）では、哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞を、同種の哺乳類由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得る。あるいは、第二の態様の工程（ｉ）~（ｉｖ）を繰り返す場合、２サイクル目以降の工程（ｉ）では、その直前のサイクルの工程（ｉｖ）で再樹立した幹細胞を、同種の哺乳類由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得る。この工程は、哺乳類の種由来の多能性幹細胞等と、同種の哺乳類由来の高品質な多能性幹細胞を共存させる、または混合することができるあらゆる方法により行うことができる。

　第二の態様の方法の工程（ｉｉ）~（ｉｖ）は、第一の態様の方法の工程（ｉｉｉ）~（ｖ）にそれぞれ対応する。各工程の詳細については、上記に説明したとおりである。
　＜キメラ形成可能な多能性幹細胞または複能性幹細胞＞

　本出願は、上記の再樹立方法によって得られるキメラ形成可能な幹細胞を提供する。

　本発明の幹細胞は、齧歯類以外の哺乳類の種由来の多能性幹細胞もしくは複能性幹細胞、または齧歯類由来のｉＰＳ細胞もしくは複能性幹細胞から再樹立されたものであり、そして、以下：
　・キメラ形成可能；
　・細胞集合体を形成可能；および
　・内部細胞塊のニッチ環境に親和性が高い；
からなる群より選択される特徴の１以上を有する。

　本発明のキメラ形成能を有する幹細胞の再樹立法は、多能性幹細胞等がＥＳ細胞とともにコロニーを形成するか否か（すなわち、コロニー形成に寄与するか否か）に基づいて、および／または、多能性幹細胞等が内部細胞塊の一部を構成するか否か（すなわち、ＩＣＭに寄与するか否か）に基づいて、多能性幹細胞等を選別するものである。このことから、本発明の方法によって再樹立した幹細胞は、上記の特徴を有するものである。本発明の方法により再樹立したキメラ形成可能な幹細胞は、再樹立前の多能性幹細胞等に混在していたキメラ形成不能な細胞を除いて純化し、移植可能な株として再樹立された細胞である。

　実施例６−９に示されるように、本発明の方法によって再樹立された幹細胞は、再樹立前の細胞と比較して、よりナイーブ型多能性（ｎａｉｖｅ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、コア型多能性（ｃｏｒｅ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）遺伝子群の発現が高いという特性を有する、即ち、より未分化の状態を維持している。これは、キメラ形成能を有する幹細胞として優れた性質を有することを意味する。

　本発明の方法により再樹立されたキメラ形成能を有する幹細胞は、特に限定されないが、以下の用途に利用され得る。

　本発明のキメラ形成能を有する幹細胞を利用して、胚盤胞補完法によりキメラ動物を作製することで、当該幹細胞に由来する臓器／臓器原基を形成することができる。このような臓器／臓器原基は再生医療において有用である。

　また、本発明のキメラ形成能を有する幹細胞を用いて胚盤胞補完法によりキメラ胚またはキメラ胎児／胎仔を作製し、当該キメラ胚またはキメラ胎児／胎仔由来の体性幹細胞、臓器前駆細胞および体性細胞を得ることができる。また、当該キメラ胚またはキメラ胎児／胎仔由来の体性幹細胞をインビトロで分化させて臓器前駆細胞および体性細胞を得ることもできる。あるいは、本発明のキメラ形成能を有する幹細胞をインビトロで分化させることにより、体性幹細胞、臓器前駆細胞および体性細胞を得ることもできる。これらの体性幹細胞、臓器前駆細胞および体性細胞は、薬効評価や病態解析に用いるために有用である。本発明のキメラ形成能を有する幹細胞は、キメラ形成能を維持した高品質な幹細胞であるので、当該細胞を出発細胞として効率よくキメラ胚／キメラ動物の作製を行ったり分化させたりすることができる。

　あるいは、本発明のキメラ形成能を有する幹細胞を利用して、テトラプロイドレスキュー法により、当該幹細胞が伝播された動物を作製することもできる。テトラプロイドレスキュー法は、４倍体の受精卵にｉＰＳ／ＥＳ細胞等を注入することにより、４倍体細胞は胎盤へと発生し、ｉＰＳ／ＥＳ細胞等のみが個体へと発生することを利用した方法である（Ｎａｇｙ，Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１０，８１５−８２１（１９９０））。このような動物の作製法は、絶滅危惧種などの希少動物、ペットなどの愛玩哺乳動物、有用な商業動物の保存、再生、および／または維持に有効である。この場合、利用する本発明のキメラ形成能を有する多能性幹細胞等は、同種間でキメラ形成能を有する多能性幹細胞等であることが望ましい。
　＜細胞を用いた薬効評価または病態解析を行う方法＞

　本出願は、上記の再樹立方法によって得られるキメラ形成可能な幹細胞、または当該キメラ形成可能な幹細胞を分化させて得た体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞、を用いて薬効評価または病態解析を行う方法を提供する。すなわち、本出願は、細胞を用いた薬効評価または病態解析を行う方法であって、以下：
　（ｉ）細胞を得る工程：ここで当該細胞は、（Ａ）本発明の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞であるか、（Ｂ）本発明の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞を分化させることにより得た体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞であり、ここで当該体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞は、以下の（ａ）~（ｃ）のいずれかの方法により得られるものである：
　（ａ）本発明の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞からキメラ胚またはキメラ胎児／胎仔を作製し、そして当該キメラ胚またはキメラ胎児／胎仔由来の体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る；
　（ｂ）（ａ）で得られたキメラ胚またはキメラ胎児／胎仔由来の体性幹細胞をインビトロで分化させて臓器前駆細胞または体性細胞を得る；
　（ｃ）本発明の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞をインビトロで分化させることにより、体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る；
　（ｉｉ）工程（ｉ）で得た細胞を用いて薬効評価または病態解析を行う工程；
を含む前記方法、を提供する。

　上記の方法の工程（ｉ）において、（Ａ）の「キメラ形成能を有する幹細胞」は、上記「異種間でキメラ形成可能な幹細胞を再樹立する方法」および「同種間でキメラ形成可能な幹細胞を再樹立する方法」において説明した方法によって、多能性幹細胞または複能性幹細胞から再樹立して得ることができる。

　上記の方法の工程（ｉ）において、（Ｂ）の「キメラ形成能を有する幹細胞を分化させることにより得た体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞」は、まず、「キメラ形成能を有する幹細胞」を（Ａ）と同様にして得た後、以下の（ａ）~（ｃ）のいずれかの方法を行うことにより得ることができる。
　（ａ）の方法は、キメラ形成能を有する幹細胞からキメラ胚またはキメラ胎児／胎仔を作製し、そして当該キメラ胎児／胎仔由来の体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る、というものである。キメラ胚またはキメラ胎児／胎仔の作製方法は、上記「定義」の項目においてキメラ胚／キメラ動物の作製について記載した方法により行うことができる。キメラ胚またはキメラ胎児／胎仔から体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得るためには当該細胞を分取・樹立することにより行う。キメラ胚またはキメラ胎児／胎仔からの体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞の分取・樹立は、当業者が通常用いる方法により適宜行うことができる。
　（ｂ）の方法は、（ａ）で得られたキメラ胚またはキメラ胎児／胎仔由来の体性幹細胞をインビトロで分化させて臓器前駆細胞または体性細胞を得る、というものである。体性幹細胞をインビトロで分化させて臓器前駆細胞または体性幹細胞を得る方法は、当業者が通常用いる方法により適宜行うことができる。
　（ｃ）の方法は、キメラ形成能を有する幹細胞をインビトロで分化させることにより、体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る、というものである。キメラ形成能を有する幹細胞をインビトロで分化させて、体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る方法は、当業者が多能性幹細胞をインビトロで分化させるために通常用いる方法により適宜行うことができる。

　上記の方法の工程（ｉ）において得られる「体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞」は、例えば、心臓、神経、腎臓、肝臓、膵臓、骨格筋、血球系細胞、等に関連する細胞であるが、特に限定されない。

　上記の方法の工程（ｉｉ）において、工程（ｉ）で得た細胞を用いて薬効評価または病態解析を行う。薬効評価または病態解析は、細胞を用いた検査方法であれば当業者が通常用いる方法により、適宜行うことができる。

　以下に本発明の具体例を示す。これらの具体例は、本発明を理解するための説明を提供することを目的とするものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
　＜実施例１：異種間でキメラ形成可能なｉＰＳ細胞の再樹立＞

　赤色蛍光タンパク質（クサビラオレンジ、ｈｕＫＯ）が導入されたブタｉＰＳ細胞をマウスＥＳ細胞とともに共培養を行い、増殖能や形態の良いコロニーを選別した。このブタｉＰＳ細胞をマウス４倍体胚盤胞（Ｆ１×Ｂ６）４５個にマイクロインジェクションした後、マウス初期胚培養条件（ｍｗｍ培養液、５％ＣＯ_２、３７℃）で１日共培養した。異常形状をしているもの、ＩＣＭ以外にあるナイーブ型ブタｉＰＳ細胞がある胚盤胞を顕微鏡下で除去し、良好な胚だけを４穴プレートのフィーダー細胞上にそれぞれ別々に移して培養した。播種後増殖してきたＩＣＭから良好な形態をし、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ　Ｏｂｓｅｒｖｅｒ　Ｄ１　ｓｙｓｔｅｍ，Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）にて赤色蛍光を有することを確認したモザイク状態のものだけを、増殖能や形態を指標に目視で選別しピックアップした。０．０２５％トリプシン／０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ処理し、細胞塊を分散した後、新しく準備した４穴プレートのフィーダー細胞上にそれぞれ別々に移して培養した。播種後、さらに新しく形成されたコロニーから、蛍光顕微鏡にて赤色蛍光を有することを確認して状態の良いコロニーを選抜し（４ライン）、これを再樹立後のコロニーとした（図２）。
　＜実施例２：再樹立したｉＰＳ細胞の核型の検討＞

　再樹立前のブタｉＰＳ細胞と、再樹立後のｉＰＳ細胞の核型をＱ−バンド染色法により検討したところ、いずれも３８、ＸＸの正常核型であった。以上から、再樹立の操作により、細胞融合や染色体の脱落などによる核型の変化は認められなかった。このことより再樹立の操作は、ヘテロなｉＰＳ細胞集団からのクローン化によるものであることが示された（図３）。
　＜実施例３：再樹立したｉＰＳ細胞を用いたキメラ動物作製＞

　再樹立したブタｉＰＳ細胞のキメラ形成能を、マウス胚盤胞に移入して検討した。移植は胚盤胞期胚（Ｆ１×Ｂ６など）に対して、再樹立後のブタｉＰＳ細胞を約１０個ずつピエゾマイクロマニピュレーターで注入した。注入を行った胚盤胞期胚を、膣栓を確認後２．５または３．５日目のレシピエントＩＣＲマウス８匹の子宮に移植し、妊娠８．５、９．５、１０．５日目にレシピエントＩＣＲマウスを頸椎脱臼で安楽死後、子宮を取り出し脱落膜ごと胎仔胎盤を採集した。Ｅ９．５、Ｅ１０．５、Ｅ１１．５の異種間キメラマウスおよび羊膜を複数採取することができた。キメラ形成したブタｉＰＳ細胞由来の細胞は蛍光実体顕微鏡（Ｍ１６５　ＦＣ、Ｌｅｉｃａ）にて赤色蛍光を確認した（図４）。その結果、胎仔においてブタｉＰＳ細胞由来の細胞が存在することが確認され、再樹立したｉＰＳ細胞を用いてキメラ動物の作製が可能であることが示された。また、ブタｉＰＳ細胞由来の細胞は羊膜（胎仔由来の組織）に存在することも示された。ネガティブコントロール（正常マウス胎盤）では、赤色蛍光は確認されなかった。
　＜実施例４：再樹立したｉＰＳ細胞を用いたキメラ動物作製＞

　キメラ胚におけるブタｉＰＳ細胞の存在を確認するために、Ｅ９．５、Ｅ１０．５の胎仔および羊膜から、ＰＣＲにてブタのミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の検出を試みた。

　具体的には、蛍光実体顕微鏡にて観察したＥ９．５、Ｅ１０．５のキメラ胎仔および羊膜をプロテアーゼ処理後、各々のＤＮＡを抽出した。これらのＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法にてブタｍｔＤＮＡおよびマウスｍｔＤＮＡを検出した。ブタｍｔＤＮＡの検出には、５’−ＣＡＴ　ＴＧＧ　ＡＧＴ　ＡＧＴ　ＣＣＴ　ＡＣＴ　ＡＴＴ　ＴＡＣ　ＣＧＴ　Ｔ−３’（配列番号１）および５’−ＧＧＡ　ＴＴＡ　ＧＴＡ　ＧＧＡ　ＴＴＡ　ＧＴＡ　ＴＴＡ　ＴＡＡ　ＡＴＡ　ＡＧＧ　ＣＴＣ−３’（配列番号２）のプライマーセットおよびｒＴａｑを用いて、９４℃１５秒、６２℃２０秒、７２℃４０秒を４０サイクル実施した。またマウスｍｔＤＮＡの検出には、５’−ＡＴＣ　ＡＴＴ　ＣＡＴ　ＡＧＣ　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＧＡ−３’（配列番号３）および５’−ＡＡＧ　ＧＡＴ　ＧＡＡ　ＴＡＴ　ＧＧＡ　ＴＴＴ　ＧＣ−３’（配列番号４）のプライマーセットおよびｒＴａｑを用いて、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を３５サイクル実施した。ＰＣＲの特異性は高く、ｐｉｇ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓとＢ６マウスｔａｉｌ　ＤＮＡコントロールで示すように、それぞれブタまたはマウスｍｔＤＮＡでのみ検出した。なお、ブタｉＰＳ細胞は、マウスフィーダー細胞上で培養しているため、両方のプライマーで検出された（図５）。

　胎仔（ｅｍｂｒｙｏ）では６／１０、羊膜（ｙｏｌｋ　ｓａｃ）では５／１０の率でブタのｍｔＤＮＡを検出した（図５）。すなわち、異種間キメラ胚は高頻度で形成されたことから、再樹立した多能性幹細胞のキメラ形成能は非常に高いことが示された。また、本細胞は羊膜への分化能も示され、高度の多能性を獲得していることを示した。
　＜実施例５：同種間でキメラ形成可能なｉＰＳ細胞の再樹立＞

　マウスｉＰＳ細胞から再樹立にて、良好なコロニーを単離した。これを雄性不妊マウスの胚盤胞を用いてキメラマウスを作製し、補完法にて精巣・精子を作製した。

　具体的には、キメラ形成能をほとんど持たないＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（ＥＧＰＦ）オス由来のｉＰＳ細胞を実施例１の方法で再樹立し、再樹立ｉＰＳ細胞を得た。次にＣ５７ＢＬ／６Ｊ　３週齢雌マウスをホルモン処理して過剰排卵を誘起した後に同胞異種マウスＳＰＲ２（Ｍｕｓ　Ｓｐｒｅｔｕｓ）雄マウスと交配することで多くの受精胚（異種間交雑胚）を得た。再樹立ｉＰＳ細胞を約１０個ずつピエゾマイクロマニピュレーターで異種間交雑胚盤胞に注入した。注入を行った３０個の胚盤胞期胚を、膣栓を確認後２．５日目のレシピエントＩＣＲマウス１匹の子宮に移植し、出産前夜（妊娠１８．５日目の夜）に帝王切開により３匹の雄胎仔を取り出した。いずれも精巣にｉＰＳ細胞由来の細胞が存在することを、蛍光顕微鏡を用いて緑色蛍光を検出することによって確認した（図６）。
　＜実施例６：再樹立前及び後の細胞における遺伝子発現プロファイルの階層的クラスタリング＞

　再樹立前のブタｉＰＳ細胞（ｉＰＳ　ｃｅｌｌ）の培養用デッシュ３枚、再樹立後のブタｉＰＳ細胞（Ｒｅ−ｉＰＳ　ｃｅｌｌ）の培養用デッシュ３枚から、各々ＲＮＡ抽出を行った。

　各細胞より抽出したＲＮＡについて、イルミナ社ＨｉＳｅｑ　２０００を用いてＲＮＡ−Ｓｅｑを行い、ブタのトランスクリプトームのパイプラインでマッピングした結果、１７，０９２の遺伝子数を同定した。サンプル間比較の組合せで検定された遺伝子の発現量をＦＰＫＭ（Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　Ｐｅｒ　Ｋｉｌｏｂａｓｅ　ｏｆ　ｅｘｏｎ　ｐｅｒ　Ｍｉｌｌｉｏｎ　ｍａｐｐｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）値で示し、群平均法にてクラスタリングを行い、キャンベラ（ｃａｎｂｅｒｒａ）アルゴリズムにて距離を測定した。

　ブタｉＰＳ細胞の再樹立前および再樹立後の各細胞における遺伝子発現プロファイルの階層的クラスタリングの結果を、図７に示す。再樹立前の細胞と再樹立後の細胞で、各々の遺伝子発現プロファイルは大きく２つの群にグループ化された。即ち、再樹立後の細胞の遺伝子発現プロファイルは、再樹立前のものとは異なり、特定の遺伝子発現パターンを示すことが明らかになった。
　＜実施例７：再樹立ｉＰＳ細胞中の山中４因子の発現＞
　（１）内因性遺伝子の発現レベル
　実施例６で得られた再樹立前のｉＰＳ細胞（ｐｉＰＳ３、ｐｉＰＳ８、ｐｉＰＳ９）、及び、再樹立後のｉＰＳ細胞（ｐｉＰＳ１、ｐｉＰＳ５、ｐｉＰＳ６）について、山中４因子に相当するブタの内在性遺伝子（ＰＡＵ５Ｆ１（Ｏｃｔ４）、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＭＹＣ）および多能性維持に重要なＮＡＮＯＧ遺伝子の、再樹立前後による遺伝子発現量の変化を、ＦＰＫＭ値の変化に基づいて検討した。結果を図８に示す。多能性維持に必要なＮＡＮＯＧ、ＰＡＵ５Ｆ１（Ｏｃｔ４）、ＫＬＦ４の遺伝子発現量は有意に上昇した（ＦＰＫＭ値のｌｏｇ_２値、１．３以上）。一方、ＳＯＸ２の発現量は変わらず、ＭＹＣの発現量については有意差はないが減少傾向にあった。以上から、再樹立後のブタｉＰＳ細胞は、多能性維持に重要な内因性遺伝子の発現上昇が認められた。

　（２）外因性遺伝子の発現レベル
　本実施例で使用されたブタｉＰＳ細胞は、元来ブタ繊維芽細胞にヒト山中４因子の遺伝子を導入して作製されている。一般にナイーブ型のマウスｉＰＳ細胞などでは、ｉＰＳ細胞作製時に外来性に導入された山中４因子の遺伝子発現は抑制される傾向にある。本実施例７（２）では、ｉＰＳ細胞作製時に外来性に導入したヒト山中４因子の遺伝子発現が、再樹立の前後で変化があるかを検討した。

　実施例６のＲＮＡ−Ｓｅｑの結果を、ヒトのトランスクリプトームのパイプラインでヒト遺伝子にマッピングを行い、ヒト遺伝子由来の転写物を同定したところ、ヒト遺伝子へのマッッピング率は３~４％であり、ヒト遺伝子への比率は妥当であった。そして、再樹立前後のヒト山中４因子遺伝子（ｈＰＡＵ５Ｆ１（ｈＯｃｔ４）、ｈＫＬＦ４、ｈＳＯＸ２、ｈＭＹＣ）の発現を検討すると、いずれも有意に減少していることが明らかになった。陰性コントロールとして、山中４因子ではないヒトＮＡＮＯＧ遺伝子（ｈＮＡＮＯＧ）を検討したが、再樹立の前後とも、その発現はほとんど検出できなかった（ネガティブコントロール）。以上から、ブタｉＰＳ細胞を樹立した際に導入したヒト山中４因子の発現は、再樹立後に有意に減少していた。

　図１０に、上記（１）（図８）及び（２）（図９）における遺伝子発現変化の傾向をまとめた。再樹立後の細胞では、外来性の山中４因子の遺伝子発現が抑制されたこと、また内因性の多能性維持に重要な、ＮＡＮＯＧ、Ｏｃｔ４（ＰＡＵ５Ｆ１）、ＫＬＦ４の遺伝子発現が増加していることが明らかになった。再樹立後の細胞は、以上のようなナイーブ型の傾向を有した。
　＜実施例８：再樹立細胞のピアソンの相関分析＞

　実施例６で、再樹立前のｉＰＳ細胞（ｐｉＰＳ３、ｐｉＰＳ８、ｐｉＰＳ９）、及び、再樹立後のｉＰＳ細胞（ｐｉＰＳ１、ｐｉＰＳ５、ｐｉＰＳ６）について、ＲＮＡ−Ｓｅｑを行い、ブタのトランスクリプトームのパイプラインでマッピングを行った。各々の遺伝子発現プロファイルについてピアソンの相関係数を産出し、それぞれの発現プロファイルの近似性を検討した。

　結果を図１１に示す。再樹立後の細胞群（Ｒｅ−ｉＰＳ　ｃｅｌｌ）では、各細胞（ディッシュ）間においてプロファイルのバラツキはなかった。一方、再樹立前の細胞（ｉＰＳ　ｃｅｌｌ）では、各細胞（ディッシュ）毎に遺伝子発現プロファイルのバラツキが大きく認められた。以上から、再樹立前のｉＰＳ細胞においては、多様な細胞が混在し、培養のディッシュ毎に大きなバラツキが生じることが認められたが、再樹立した細胞では、培養してもバラツキが認められず均一な性質を有することが認められる。再樹立の技術によって均一な性質のクローンのみ選別され、その後培養しても性質が大きく変化しないことが明らかになった。
　＜実施例９：ＤＡＶＩＤを用いた遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析＞

　実施例６で得られたＲＮＡ−Ｓｅｑの結果から、再樹立後のｉＰＳ細胞（ｐｉＰＳ１、ｐｉＰＳ５、ｐｉＰＳ６）において再樹立前の細胞（ｐｉＰＳ３、ｐｉＰＳ８、ｐｉＰＳ９）に比べて発現量で、ｌｏｇ_２値が２以上変化した遺伝子群を抽出し、Ｄａｔａｂａｓｅ　ｆｏｒ　Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＤＡＶＩＤ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ　ａｎｄ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＮＩＡＩＤ），ＮＩＨ提供）を用いて、遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を行った。

　図１２は、ＧＯ分析の結果、再樹立細胞において遺伝子の発現が再樹立前の細胞に比べてｌｏｇ_２値が２以上増加する遺伝子の種類及び発現が減少する遺伝子の種類をまとめた図である。再樹立細胞において、糖タンパク質、細胞接着分子、胚形態形成、細胞外マトリックスなどに関与する遺伝子の発現が増加している。

　Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６：５１３（２０１４）では、マウス胚２細胞期から移植後胚盤胞に分化・成長するまでのステージをＥ１．５−Ｅ５．５までの各ステージに分け、各ステージにおける遺伝子発現量を調べている。その結果、各遺伝子発現の特性をナイーブ型多能性（ｎａｉｖｅ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、コア型多能性（ｃｏｒｅ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、プライム型多能性（ｐｒｉｍｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、原始内胚葉（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ　ｅｎｄｏｄｅｒｍ）の４種類にグループ分けしている。

　図１３は、ナイーブ型多能性（ｎａｉｖｅ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、コア型多能性（ｃｏｒｅ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、プライム型多能性（ｐｒｉｍｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、原始内胚葉（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ　ｅｎｄｏｄｅｒｍ）の各特性に関する遺伝子の発現についてブタｉＰＳ細胞の再樹立の前後で比較した図である。上段は各遺伝子のＦＰＫＭ値、そして下段は、再樹立前後の遺伝子発現量の変化をｌｏｇ_２値で示したものである。再樹立により、Ｔｂｘ３、ＥＳＲＲＢ、ＤＰＰＡ３、ＫＬＦ４等のナイーブ型多能性（ｎａｉｖｅ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）の特性に関する遺伝子、ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＳＡＬＬ４、ＧＤＦ３等のコア型多能性（ｃｏｒｅ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）の特性に関する遺伝子の発現量が増加した。一方、プライム型多能性（ｐｒｉｍｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）の特性に関するＬＥＦ１の発現量は減少した。再樹立によりｉＰＳ細胞がよりナイーブな状態になったことが理解される。

　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐ．３：３４９２（２０１３）では、Ｔｂｘ３、Ｚｓｃａｎ４がマウス胚２細胞期の制御（未分化状態の制御）に関与していることを記載している。図１４は、Ｔｂｘ３、Ｐｏｕ５Ｆ１（Ｏｃｔ４）及びＺｓｃａｎ４の各遺伝子の発現がブタｉＰＳ細胞において再樹立により増加していることを示している。Ｚｓｃａｎ４は、テロメラーゼ非依存的なテロメアの維持、ゲノムの安定性に関与している遺伝子として知られており、細胞の未分化状態のマーカーとして使用され得る。再樹立ｉＰＳ細胞では、Ｚｓｃａｎ４が増加し２細胞状態（未分化状態）が維持されることが明らかになった。

　Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６：５１３（２０１４）では、マウス胚盤胞の胚性細胞外マトリックスの構成成分の詳細を図示している。胚性細胞外マトリックスの構成成分は、インテグリン、ラミニン、ＩＣＡＭ、コラーゲン等を含み、特に、フィブロネクチンのＦｎ１、ラミニンのラミニンａ５、ラミニンｂ１、ラミニンｃ１の各鎖が４０％以上を占める。

　図１５は、胚性細胞外マトリックスの構成成分の各遺伝子発現についてブタｉＰＳ細胞の再樹立の前後で比較した図である。上段は各遺伝子のＦＰＫＭ値、そして下段は、再樹立前後の遺伝子発現量の変化をｌｏｇ_２値で示したものである。再樹立により、複数種のインテグリン、ラミニン、ＩＣＡＭ、コラーゲン等の多くの細胞外マトリックスの遺伝子が増加した。

　本発明の方法により、既存の方法により作製した多能性幹細胞等のヘテロな細胞群から、キメラ形成能を有する細胞群を訓化・選別することができる。すなわち、本発明の方法は、ヘテロな細胞集団をモノクローン化して高品質化する技術であり、再生医療におけるｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞等を用いた臓器形成の出発細胞を得るために有用な技術である。本発明の方法は多能性幹細胞等を確立する既存の方法と競合するものではない。本発明の方法を、既存の方法の実施後に行うことで多能性幹細胞等をさらに高品質化し、臓器形成等の成功率を高めることに貢献するものである。また、本発明の方法により再樹立した細胞、本発明の方法により再樹立した細胞から作製したキメラ胚／胎仔から得た体性細胞、体性幹細胞、および臓器前駆細胞、ならびに、本発明の方法により再樹立した細胞をインビトロで分化させて得た体性幹細胞、臓器前駆細胞、および体性細胞は、病態解析や薬効評価等に有用である。

　あるいは、キメラ形成能を有する多能性幹細胞等を提供することは、絶滅危惧種などの希少動物、ペットなどの愛玩哺乳動物、有用な商業動物の保存、再生、および／または維持にも有用である。

Claims (19)

1. 　異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する方法であって、以下の工程：
   　（ｉ）第一の哺乳類の種由来の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と共培養する；
   　（ｉｉ）工程（ｉ）の共培養物において、細胞集合体を形成し、かつ、当該第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞を含む細胞群を選別する；
   　（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する；
   　（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する；および
   　（ｖ）当該内部細胞塊から当該第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞をクローニングすることにより、異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する；
   を含み、ここで当該第一の哺乳類の種と当該第二の哺乳類の種は異なる種であり、そして当該第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞は、齧歯類以外の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞であるか、齧歯類由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または複能性幹細胞である、前記方法。
2. 　さらに、工程（ｖ）で再樹立した幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得て、工程（ｉｉｉ）~（ｖ）を繰り返すことを含む、請求項１に記載の方法。
3. 　多能性幹細胞が、以下：ＥＳ細胞および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）からなる群より選択され、そして、複能性幹細胞が以下：栄養芽幹細胞（ＴＳ細胞）、エピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、多能性生殖細胞（ｍＧＳ細胞）、クローン胚由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）、造血幹細胞、神経幹細胞、および、間葉系幹細胞、からなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
4. 　第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞が、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
5. 　高品質な多能性幹細胞が、ナイーブ型の多能性幹細胞である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
6. 　宿主胚が、初期胚、４倍体胚、雄性胚、単為発生胚、および胎盤に寄与するＥＳ細胞、からなる群より選択される、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
7. 　工程（ｉｉｉ）が、工程（ｉｉ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の初期胚または４倍体胚にマイクロインジェクションまたはアグリゲーションして共培養することにより行う、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
8. 　第一の哺乳類の種および第二の哺乳類の種がそれぞれ、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サル、ヒトからなる群より選択される、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
9. 　異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する方法であって、以下の工程：
   　（ｉ）第一の哺乳類の種由来の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得る；
   　（ｉｉ）工程（ｉ）の細胞群を、第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する；
   　（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する；および
   　（ｉｖ）当該内部細胞塊から当該第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞をクローニングすることにより、異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する；
   を含み、ここで当該第一の哺乳類の種と当該第二の哺乳類の種は異なる種であり、そして当該第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞は、齧歯類以外の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞であるか、齧歯類由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または複能性幹細胞である、前記方法。
10. 　工程（ｉ）~（ｉｖ）を繰り返すことを含む、その際、２サイクル目以降の工程（ｉ）は、その直前のサイクルの工程（ｉｖ）で再樹立した幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得ることにより行う、請求項９に記載の方法。
11. 　第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞はヒトＥＳ細胞ではなく、そして第二の哺乳類の種はヒトではない、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 　同種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する方法であって、以下の工程：
    　（ｉ）哺乳類の種由来の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を、同種の哺乳類由来の高品質な多能性幹細胞と共培養する；
    　（ｉｉ）工程（ｉ）の共培養物において、細胞集合体を形成し、かつ、前記多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞を含む細胞群を選別する；
    　（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の細胞群を同種の哺乳類由来の宿主胚と共培養する；
    　（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する；および
    　（ｖ）当該内部細胞塊から前記多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞をクローニングすることにより、同種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する；を含む、ここで、当該哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞は、齧歯類以外の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞であるか、齧歯類由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または複能性幹細胞である、前記方法。
13. 　さらに、工程（ｖ）で再樹立した幹細胞を、同種の哺乳類由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得て、工程（ｉｉｉ）~（ｖ）を繰り返すことを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 　同種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する方法であって、以下の工程：
    　（ｉ）哺乳類の種由来の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を、同種の哺乳類由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得る；
    　（ｉｉ）工程（ｉ）の細胞群を、同種の哺乳類由来の宿主胚と共培養する；
    　（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する；および
    　（ｉｖ）当該内部細胞塊から前記多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞をクローニングすることにより、同種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する；
    を含む、ここで、当該哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞は、齧歯類以外の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞であるか、齧歯類由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または複能性幹細胞である、前記方法。
15. 　工程（ｉ）~（ｖ）を繰り返すことを含む、その際、２サイクル目以降の工程（ｉ）は、その直前のサイクルの工程（ｉｖ）で再樹立した幹細胞を、同種の哺乳類由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得ることにより行う、請求項１４に記載の方法。
16. 　哺乳類の種はヒトではない、請求項１２ないし１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 　幹細胞であって、齧歯類以外の哺乳類の種由来の多能性幹細胞もしくは複能性幹細胞、または齧歯類由来のｉＰＳ細胞もしくは複能性幹細胞から再樹立したものであり、そして、以下：
    　・キメラ形成可能；
    　・細胞集合体を形成可能；および
    　・内部細胞塊のニッチ環境に親和性が高い；からなる群より選択される特徴の１以上を有する、前記細胞。
18. 　請求項１ないし１６に記載の方法により再樹立した、請求項１７に記載の細胞。
19. 　細胞を用いた薬効評価または病態解析を行う方法であって、以下：
    　（ｉ）細胞を得る工程：ここで当該細胞は、（Ａ）請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞であるか、（Ｂ）請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞を分化させることにより得た体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞であり、ここで当該体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞は、以下の（ａ）~（ｃ）のいずれかの方法により得られるものである：
    　（ａ）請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞からキメラ胚またはキメラ胎児／胎仔を作製し、そして当該キメラ胚またはキメラ胎児／胎仔由来の体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る；
    　（ｂ）（ａ）で得られたキメラ胚またはキメラ胎児／胎仔由来の体性幹細胞をインビトロで分化させて臓器前駆細胞または体性細胞を得る；
    　（ｃ）請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞をインビトロで分化させることにより、体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る；
    　（ｉｉ）工程（ｉ）で得た細胞を用いて薬効評価または病態解析を行う工程；
    を含む、前記方法。

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