JPWO2006009297A1 - Ｅｓ細胞を用いたキメラ作製 - Google Patents

Abstract

同種または異種動物のタンパク質や組織を産生し、または所望の多能性細胞が生殖系列に伝播したキメラ動物ならびに特定の遺伝子を欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞の提供。特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞および該多能性細胞以外の他の多能性細胞を含む２種類以上の細胞を動物の宿主胚に注入することを含む、キメラ動物の作製方法および該方法により製造されたキメラ動物。

Description

本発明は、生殖細胞形成に関与する遺伝子、免疫系に関与する遺伝子等の特定の遺伝子が変異または欠損した多能性細胞を用いてキメラ動物を作成する方法に関する。

従来より、ノックアウトマウス等のジーンターゲッティングされた遺伝子が改変されたマウスの作製のためにＥＳ細胞を用いてキメラマウスを形成し、キメラマウスを交配していた。
これらの遺伝子改変マウスの作製のためには、優良なＥＳ細胞を樹立し、ＥＳ細胞において効率よく遺伝子改変を行い、遺伝子改変されたＥＳ細胞がキメラマウスを形成し、得られたキメラマウスにおいて、ＥＳ細胞で行った遺伝子改変が生殖系列に伝播され次世代に伝達される必要がある。
ＥＳ細胞の樹立はマウスの系統に大きく依存し、樹立の確立が低く、また樹立できたＥＳ細胞は継代を重ねるに従い生殖系列への伝播能を失うため、莫大な労力をつぎ込んで樹立したＥＳ細胞も、できる限り、継代を重ねずに使用する必要があった。特に近交系のマウスを用いる場合は、その傾向が大きかった。
ＥＳ細胞の遺伝子改変が生殖系列に伝播されることについては、問題が多かった。特にキメラマウスを作製できても、生殖系列への伝播がないことは多かった。実際には、生殖系列への伝播実績があり、継代を重ねていないＥＳ細胞を入手して使用していた。
ＥＳ細胞からキメラマウスを選択的に作製する方法としてテトラプロイドレスキュー法があった（Ｎａｇｙ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１０，８１５−８２１（１９９０））。該方法においては、ＥＳ細胞を４倍体の受精卵に注入し、４倍体細胞は胎盤へと発生し、ＥＳ細胞のみが個体へと発生するので、ＥＳ細胞の遺伝子改変が生殖系列に伝播し得る。
しかしながら、該方法においては、得られたキメラマウスは呼吸障害や奇形などの障害を発症して長くは生存できず（Ｅｇｇａｎ Ｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９８，６２０９−６２１４（２００１））生殖系列キメラの有効な作製方法とはなり得なかった。
本発明者は、これらの問題点を解決し、生殖キメラを有効に作製する方法を開発した。一つは、生殖細胞を形成することができない初期胚をｃ−ｋｉｔ変異マウスの、Ｗ^ｖ／＋マウスとＷ／＋マウスとの正逆の交配により得られる受精胚（Ｗ^ｖ／Ｗ又はＷ／Ｗ^ｖ）であって、雌雄両性で生殖細胞を形成することができない（不稔／不妊）マウスの初期胚にＥＳ細胞を注入し、ＥＳ細胞に由来する生殖細胞のみを有するキメラマウスを作製する方法（特許文献１参照）であった。
また、本発明者らは、ＥＳ細胞またはＥＳ細胞を注入する初期胚の細胞のミトコンドリアＤＮＡを野生型のミトコンドリアＤＮＡに置換することにより、ミトコンドリアＤＮＡと核ＤＮＡを適合させることにより、上記のテトラプロイドレスキュー法においても、呼吸障害や奇形等の障害を発症しない、キメラマウスの作製方法を開発した（特許文献２参照）。
しかしながら、これらの方法によっても、用いるＥＳ細胞は、継代を重ねずに増殖能力および未分化状態および分化能を保っている必要があり、ＥＳ細胞の調製という面で効率的ではなかった。また、出生するキメラマウスの性比のコントロールは不可能であった。
ＷＯ ０３／０７１８６９号国際公開パンフレット ＷＯ ０３／０７２７７７号国際公開パンフレット

本発明は、特定の遺伝子が変異しまたは欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞および該機能を有する他の多能性細胞を含む２種類以上の細胞を用いた新規なキメラ動物を作製する方法および該方法により作製された、同種または異種動物のタンパク質や組織を産生し、または所望の多能性細胞が生殖系列に伝播したキメラ動物の提供を目的とする。さらに、本発明は特定の遺伝子を欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞の提供、ならびに該多能性細胞を用いて他の多能性細胞を樹立する方法の提供を目的とする。
上述のように、ＥＳ細胞のミトコンドリアを改変し、あるいはＷ^ｖ／Ｗマウス（Ｗ／Ｗ^ｖマウス）等の生殖細胞を形成できないマウス由来の胚とＥＳ細胞を用いることにより生殖系列キメラマウスを効率的に作製する方法が確立されていた。
しかし、Ｗ^ｖ／Ｗマウス（Ｗ／Ｗ^ｖマウス）等の生殖細胞を形成できないマウス由来の受精胚を調製することは非常に手間がかかる作業であり困難であった。
また、キメラマウスを作製する場合に用いるＥＳ細胞は高い増殖能を有していることが望ましいが、現実的には、高い増殖能を有するＥＳ細胞を樹立することは容易ではなく、また樹立したＥＳ細胞も継代を重ねると増殖能が低下し、キメラマウスを効率的に作製できなくなるという問題があった。また、従来得られていたＥＳ細胞は性染色体が雄ＸＹであるため、ＥＳ細胞の寄与が大きいとキメラマウスはほとんどが雄となり、従来の方法では、出生するキメラマウスの性比をコントロールすることはできなかった。
近交系マウスのＥＳ細胞は継代を重ねると増殖能が低下するが、Ｆ１交雑系マウスの細胞と共培養することにより増殖能が低下しないことが知られていた（Ａｘｅｌｒｏｄ．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １０１，２２５−２２８，１９８４）。
本発明者らは、鋭意検討の結果、生殖細胞を形成しえないマウス胚からＥＳ細胞を樹立し、該ＥＳ細胞を動物の生殖器官由来の細胞と共培養することにより、効率的に生殖器官由来の細胞からＥＳ細胞を樹立させることを見出した。このように、生殖細胞を形成しえないマウス胚からＥＳ細胞を樹立して宿主胚に所望のＥＳ細胞と同時に注入することにより、前述の生殖細胞を形成できないマウス由来の受精胚を調製することの困難性を解消し得る。さらに、前記の生殖細胞を形成しえないマウスから樹立したＥＳ細胞を、他のＥＳ細胞、例えば遺伝子を改変したＥＳ細胞と共培養することにより、他のＥＳ細胞の増殖能が改善することができることを見出した。さらに、前記の生殖細胞を形成しえないマウス胚から樹立したＥＳ細胞を他のＥＳ細胞、例えば遺伝子を改変したＥＳ細胞と共に動物の初期胚に注入し発生させることにより、他のＥＳ細胞が生殖系列へ伝播されたキメラ動物を作製できることを見出した。このように、生殖細胞の形成に関与する遺伝子に変異を有し生殖細胞を形成しえないマウス胚由来のＥＳ細胞と生殖細胞を形成し得るＥＳ細胞を動物の初期胚に注入し発生させることにより、生殖細胞を形成し得るＥＳ細胞が生殖系列に伝播するので、キメラ個体の子孫は、該生殖細胞を形成し得るＥＳ細胞由来となる。
さらに、本発明者らは、免疫不全マウスやリンパ球欠損マウス等の胚に由来するＥＳ細胞などの特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子に関連する機能に障害を有する動物由来の多能性細胞および他の多能性細胞を動物の初期胚に注入し発生させることにより、キメラ個体において、特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の細胞が機能することを見出し本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞および該多能性細胞以外の他の多能性細胞を含む２種類以上の細胞を動物の宿主胚に注入することを含む、キメラ動物の作製方法。
［２］ 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞および該多能性細胞以外の他の多能性細胞を含む２種類以上の細胞を共培養した後に動物の宿主胚に同時に注入することを含む、キメラ動物の作製方法。
［３］ 共培養が動物の初期胚中で行われる［２］のキメラ動物の作製方法。
［４］ 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の細胞由来の遺伝子が機能するキメラ動物である、［１］から［３］のいずれかのキメラ動物の作製方法。
［５］ 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の細胞由来の前記変異または欠損した遺伝子に対応する遺伝子が機能するキメラ動物である、［１］から［３］のいずれかのキメラ動物の作製方法。
［６］ 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞が遺伝子改変を受けた細胞である［１］から［５］のいずれかのキメラ動物の作製方法。
［７］ 遺伝子改変が外来遺伝子の導入または内在遺伝子のノックアウトである、［６］のキメラ動物の作製方法。
［８］ 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞および／または他の多能性細胞が適合型ミトコンドリアＤＮＡが導入または置換された多能性細胞である、［１］から［７］のいずれかのキメラ動物の作製方法。
［９］ 動物の宿主胚が適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した宿主胚である、［１］から［８］のいずれかのキメラ動物の作製方法。
［１０］ 動物の宿主胚が胚盤胞である、［１］から［９］のいずれかのキメラ動物の作製方法。
［１１］ 動物の宿主胚がテトラプロイドである、［１０］のキメラ動物の作製方法。
［１２］ 多能性細胞がＥＳ細胞、ＥＧ細胞およびＧＳ細胞からなる群から選択される細胞である［１］から［１１］のいずれかのキメラ動物の作製方法。
［１３］ 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の細胞が、特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞に対して動物分類学上同種である［１］から［１２］のいずれかのキメラ動物の作製方法。
［１４］ 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の細胞が、特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞に対して動物分類学上異種である［１］から［１２］のいずれかのキメラ動物の作製方法。
［１５］ 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞がマウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギおよびサルからなる群から選択される動物由来である［１］から［１４］のいずれかのキメラ動物の作製方法。
［１６］ 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の細胞がマウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サルおよびヒトからなる群から選択される動物由来である［１］から［１５］のいずれかのキメラ動物の作製方法。
［１７］ 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞において、変異または欠損した遺伝子が
（ａ）生殖細胞形成に関与する遺伝子、
（ｂ）免疫系に関与する遺伝子、ならびに
（ｃ）特定の組織もしくは器官の形成に関与する遺伝子または特定のタンパク質をコードする遺伝子
からなる群から選択される１以上の遺伝子である［１］から［１６］のいずれかのキメラ動物の作製方法。
［１８］ 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞が、異種間交雑により得られた生殖細胞を形成し得ない多能性細胞である［１］から［１６］のいずれかのキメラ動物の作製方法。
［１９］ 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞が、生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損し、生殖細胞を形成し得ない多能性細胞であり、特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞が生殖系列に伝播される［１７］のキメラ動物の作製方法。
［２０］ 生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損し、生殖細胞を形成し得ない多能性細胞がＣ−ｋｉｔ変異動物由来の生殖細胞を形成できない多能性細胞である［１９］のキメラ動物の作製方法。
［２１］ Ｃ−ｋｉｔ変異動物がＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウスである［２０］のキメラ動物の作製方法。
［２２］ 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞が遺伝子改変を受けた細胞であり、該遺伝子改変を受けた多能性細胞が生殖系列に伝播される［１９］から［２１］のいずれかのキメラ動物の作製方法。
［２３］ 遺伝子改変が外来遺伝子の導入または内在遺伝子のノックアウトである、［２２］のキメラ動物の作製方法。
［２４］ 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞が、免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞である［１７］のキメラ動物の作製方法。
［２５］ 免疫系に関与する遺伝子が変異又は欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞が、抗体をコードする遺伝子が変異又は欠損し、抗体産生能を喪失した多能性細胞である［２４］のキメラ動物の作製方法。
［２６］ 免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞が免疫不全動物由来の多能性細胞である［２４］のキメラ動物の作製方法。
［２７］ 免疫不全動物がｎｕ／ｎｕマウスまたはｓｃｉｄマウスである［２６］のキメラ動物の作製方法。
［２８］ 免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞がリンパ球欠損動物由来の多能性細胞である［２４］のキメラ動物の作製方法。
［２９］ リンパ球欠損動物がＲＡＧ−１遺伝子および／またはＲＡＧ−２遺伝子が変異または欠損した動物である［２８］のキメラ動物の作製方法。
［３０］ 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞が特定の組織もしくは器官の形成に関与する遺伝子または特定のタンパク質をコードする遺伝子が変異または欠損した多能性細胞である［１７］のキメラ動物の作製方法。
［３１］ 製造されたキメラ動物において、特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞の前記変異または欠損した遺伝子に対応する遺伝子により、該遺伝子が関与する特定の組織もしくは器官またはタンパク質が産生される［３０］のキメラ動物の作製方法。
［３２］ 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞が免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損しており、さらに生殖細胞形成に関与する遺伝子、あるいは特定の組織もしくは器官の形成に関与する遺伝子または特定のタンパク質をコードする遺伝子が変異または欠損している多能性細胞である［１７］のキメラ動物の作製方法。
［３３］ 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞が、
（ａ）特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞と該特定の遺伝子が変異または欠損した多能性細胞に対して動物分類学上同種もしくは異種である細胞との融合細胞、または
（ｂ）該特定の遺伝子が変異または欠損した多能性細胞に対して動物分類学上同種または異種である細胞由来の多能性細胞
である［１］から［３２］のいずれかのキメラ動物の作製方法。
［３４］ 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞に対して動物分類学上同種もしくは異種である細胞が組織幹細胞または分化細胞である［３３］のキメラ動物の作製方法。
［３５］ 生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損し、生殖細胞を形成し得ない多能性細胞ならびに
（ａ）生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損し、生殖細胞を形成し得ない前記多能性細胞と該生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損した多能性細胞に対して動物分類学上同種または異種である細胞との融合細胞、もしくは
（ｂ）該生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損した多能性細胞に対して動物分類学上同種または異種である細胞由来の多能性細胞様細胞
を動物の宿主胚に注入することを含む、前記同種または異種である細胞が生殖系列に伝播し得る［３３］または［３４］のキメラ動物の作製方法。
［３６］ 免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞ならびに
（ａ）免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する前記多能性細胞と該多能性細胞に対して動物分類学上異種である細胞との融合細胞、もしくは
（ｂ）該多能性細胞に対して異種である細胞由来の多能性細胞様細胞
を動物の宿主胚に注入することを含む、前記免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞および前記異種である細胞がキメラ個体の形成に寄与している［３３］または［３４］のキメラ動物の作製方法。
［３７］ ［１］から［３６］のいずれかの方法で製造されたキメラ動物。
［３８］ ［１７］から［２３］のいずれかの方法で製造されたキメラ動物より、特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞由来の生殖細胞を回収することを含む、特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞由来の生殖細胞を製造する方法。
［３９］ ［１７］から［２３］のいずれかの方法で製造されたキメラ動物を交配し遺伝子が改変された動物を子孫として得る遺伝子改変動物の製造方法。
［４０］ ［３９］の方法で製造された遺伝子改変動物。
［４１］ ［１７］および［２４］から［２９］のいずれかの方法で製造されたキメラ動物またはその子孫であって、免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞以外の他の多能性細胞由来の抗体をコードする遺伝子を有するキメラ動物またはその子孫に抗原を投与することを含む抗体の製造方法。
［４２］ ［１７］、［３０］および［３１］のいずれかの製造方法により製造されたキメラ動物またはその子孫に、特定の組織もしくは器官を形成させまたは特定のタンパク質を産生させることを含む、特定の組織もしくは器官または特定のタンパク質を製造する方法。
［４３］ Ｃ−ｋｉｔ変異動物由来である、生殖細胞を形成できない多能性細胞。
［４４］ Ｃ−ｋｉｔ変異動物がＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウスである［４３］の多能性細胞。
［４５］ 免疫不全動物由来である、免疫に関与する遺伝子が変異または欠損した多能性細胞。
［４６］ 動物がｎｕ／ｎｕマウスまたはｓｃｉｄマウスである［４５］の多能性細胞。
［４７］ リンパ球欠損動物由来である、免疫に関与する遺伝子が変異または欠損した多能性細胞。
［４８］ リンパ球欠損動物が、ＲＡＧ−１遺伝子および／またはＲＡＧ−２遺伝子が変異または欠損した動物である［４７］の多能性細胞。
［４９］ ＥＳ細胞、ＥＧ細胞およびＧＳ細胞からなる群から選択される細胞である、［４３］から［４８］のいずれかの多能性細胞。
［５０］ ミトコンドリアＤＮＡとして適合型ミトコンドリアＤＮＡが導入されている［４３］から［４９］のいずれかの多能性細胞。
［５１］ 適合型ミトコンドリアＤＮＡが、野生型マウスＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプである、［５０］の多能性細胞。
［５２］ 性染色体型が雄ＸＹ型である、［４３］から［５１］のいずれかの多能性細胞。
［５３］ 性染色体型が雌ＸＸ型である、［４３］から［５１］のいずれかの多能性細胞。
［５４］ ［４３］から［５３］のいずれかの多能性細胞と動物の生殖器官由来の細胞を混合培養して、初期胚もしくは生殖細胞由来の細胞から多能性細胞を樹立する方法。
［５５］ 動物の初期胚が雄核発生胚または雌核発生胚である［５４］の方法。
［５６］ 混合培養が動物の初期胚中での共培養である［５４］または［５５］の初期胚もしくは生殖細胞由来の細胞から多能性細胞を樹立する方法。
［５７］ 初期胚もしくは生殖細胞由来の細胞が、胚盤胞の内部細胞塊由来の細胞であり、多能性細胞が、ＥＳ細胞である［５４］から［５６］のいずれかの多能性細胞を樹立する方法。
［５８］ 初期胚もしくは生殖細胞由来の細胞が、始原生殖細胞であり、多能性細胞が、ＥＧ細胞である［５４］から［５６］のいずれかの多能性細胞を樹立する方法。
［５９］ 初期胚もしくは生殖細胞由来の細胞が、生殖細胞であり、多能性細胞が、ＧＳ細胞である［５４］から［５６］のいずれかの多能性細胞を樹立する方法。
［６０］ ［４３］から［５３］のいずれかの多能性細胞と他の多能性細胞を共培養することを含む、該他の多能性細胞の増殖能を向上させる方法。
［６１］ 共培養が動物の初期胚中で行われる［６０］の他の多能性細胞の増殖能を向上させる方法。
［６２］ 他の多能性細胞が、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞およびＧＳ細胞からなる群から選択される細胞である［６０］または［６１］の多能性細胞の増殖能を向上させる方法。
［６３］ 他の多能性細胞が遺伝子が改変されている多能性細胞である、［６０］から［６２］のいずれかの多能性細胞の増殖能を向上させる方法。
［６４］ ［４３］から［５３］のいずれかの多能性細胞を他の多能性細胞と共に動物の宿主胚に注入することを含む、生殖細胞が他の多能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物の作製方法。
［６５］ ［４３］から［５３］のいずれかの多能性細胞および／または他の多能性細胞が適合型ミトコンドリアＤＮＡが導入または置換された多能性細胞である、［６４］の生殖系列キメラ動物の作製方法。
［６６］ 動物の宿主胚が適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入または置換した宿主胚である、［６４］または［６５］の生殖系列キメラ動物の作製方法。
［６７］ 動物の宿主胚が胚盤胞である、［６４］から［６６］のいずれかの生殖系列キメラ動物の作製方法。
［６８］ 動物の宿主胚がテトラプロイドである、［６７］の生殖系列キメラ動物の作製方法。
［６９］ 他の多能性細胞が、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞およびＧＳ細胞からなる群から選択される細胞である［６４］から［６８］のいずれかの生殖系列キメラ動物の作製方法。
［７０］ 動物がマウスである、［６４］から［６９］のいずれかの生殖系列キメラ動物の作製方法。
［７１］ 他の多能性細胞が遺伝子が改変されている多能性細胞である、［６４］から［７０］のいずれかの生殖系列キメラ動物の作製方法。
［７２］ ［４３］から［５３］のいずれかの多能性細胞と他の多能性細胞を共培養し、共培養した細胞を共に動物の宿主胚に注入することを含む、生殖細胞が他の多能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物の作製方法。
［７３］ 共培養が動物の初期胚中で行われる［７２］の生殖系列キメラ動物の作製方法。
［７４］ ［４３］から［５３］のいずれかの多能性細胞および他の多能性細胞が適合型ミトコンドリアＤＮＡが導入された多能性細胞である、［７２］または［７３］の生殖系列キメラ動物の作製方法。
［７５］ 動物の宿主胚が適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した宿主胚である、［７２］から［７４］の生殖系列キメラ動物の作製方法。
［７６］ 動物の宿主胚が胚盤胞である、［７２］から［７５］のいずれかの生殖系列キメラ動物の作製方法。
［７７］ 動物の宿主胚がテトラプロイドである、［７６］の生殖系列キメラ動物の作製方法。
［７８］ 他の多能性細胞が、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞およびＧＳ細胞からなる群から選択される細胞である［７２］から［７７］のいずれかの生殖系列キメラ動物の作製方法。
［７９］ 動物がマウスである、［７２］から［７８］のいずれかの生殖系列キメラ動物の作製方法。
［８０］ 他の多能性細胞が遺伝子が改変されている多能性細胞である、［７２］から［７９］のいずれかの生殖系列キメラ動物の作製方法。
［８１］ ［６４］から［８０］のいずれかの方法により作製されたキメラ動物。
［８２］ ［５５］の方法により樹立した雄核発生胚または雌核発生胚由来の多能性細胞を動物の生殖器官に移植することにより生殖細胞を作製する方法。
［８３］ 雄核発生胚由来のＥＳ細胞を、動物の輸精管に移植することにより精子を作製する［８２］の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−２１１８８７号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

図１は、本発明の方法で１２９．Ｂ６−ＹＧＦＰ ＥＳ細胞およびＷ^ｖ／Ｗ^ｖＥＳ細胞を用いてキメラマウスを作製した場合の、移植数、新生仔数等を示す図である。
図２は、１２９．Ｂ６−ＹＧＦＰ ＥＳ細胞およびＷ^ｖ／Ｗ^ｖＥＳ細胞を用いて本発明の方法で作製したキメラマウスの写真である。
図３は、１２９．Ｂ６−ＹＧＦＰ ＥＳ細胞およびＷ^ｖ／Ｗ^ｖＥＳ細胞を用いて本発明の方法で作製したキメラマウスの蛍光を示す写真である。
図４は、ＢＳ−ｎｅｏ ＥＳ細胞およびＷ^ｖ／Ｗ^ｖＥＳ細胞を用いて本発明の方法で作製したキメラマウスの写真である。
図５は、本発明の方法によるキメラ作製の概要を示す図である（実施例７）。
図６は、本発明の方法によるキメラ作製の概要を示す図である（実施例８）。
図７は、本発明の方法の概要を示す図である。
図８は、雄核発生胚由来ＥＳ細胞からの精子の形成を示す写真である。

本発明の特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞および該多能性細胞以外の他の多能性細胞を含む２種類以上の細胞を用いてキメラ動物を作製する方法において、変異または欠損した遺伝子は限定されず、遺伝子の変異または欠損により特定の機能が失われる遺伝子ならばいずれの遺伝子も含まれる。ここで、「特定の遺伝子が変異しまたは欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した」とは、遺伝子の塩基配列の一部または全部において、欠失、置換等が生じ、あるいは遺伝子に塩基の付加等が生じ、遺伝子の機能が失われあるいは低下することをいう。多能性細胞自体が該機能を喪失している場合も、多能性細胞由来のキメラ個体やその子孫個体が該機能を喪失している場合も含む。「遺伝子の機能」とは、該遺伝子が発現し体内で特定の物質が産生され、または器官、組織等が形成されること、該遺伝子が発現し、体内で特定の物質が産生され該物質により体内で特定の反応が生じること等、遺伝子が関与するあらゆる機能を包含する。本発明の「特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞」は、「目的とする細胞・組織・器官、タンパクなどに関わる遺伝子を欠損した多能性細胞」であり、ここで目的とする細胞・組織・器官、タンパクとは、キメラ動物に産生させようと意図する臓器、タンパクをいう。
本発明の多能性細胞とは、あらゆる細胞に分化し得る細胞をいう。多能性細胞には、生殖細胞に分化し得る全能性細胞や動物の組織に分化し得る組織性幹細胞がある。全能性細胞には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、ＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ、胚性生殖細胞）、ＧＳ細胞等が含まれる。ここで、内部細胞塊由来細胞をＥＳ細胞、始原生殖細胞由来細胞をＥＧ細胞、生殖細胞由来細胞をＧＳ細胞という。また、全能性細胞と性質が似ており、多能性を有していて生殖細胞に分化し得る細胞を、全能性細胞様細胞という場合があり、例えばＥＳ細胞様細胞（ＥＳ様細胞）、ＥＧ細胞様細胞（ＥＧ様細胞）、ＧＳ細胞様細胞（ＧＳ様細胞）等があるが、本発明において多能性細胞という場合、これらの多能性細胞様細胞と呼ばれる細胞も含まれる。例えば、ＥＳ細胞様細胞は、動物の組織性幹細胞や分化した体細胞を形質転換したり、あるいはＥＳ細胞と動物の組織性幹細胞や分化した体細胞を融合することにより得られる。
本発明の方法により得られたキメラ個体は、少なくとも特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞由来の分化細胞等の細胞および前記他の多能性細胞由来の分化細胞等の細胞から形成される。キメラ動物の作製にこれらの２種類の細胞以外の細胞を用いた場合は、キメラ個体は該２種類の細胞以外の細胞からも構成される。「２種類の細胞以外の細胞」は限定されないが、例えば、動物の組織幹細胞や動物の分化した体細胞等が挙げられる。
該キメラ個体においては、特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞由来細胞以外の細胞、該細胞の有する染色体、該細胞の有する遺伝子が機能している。特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞には、特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞に対して動物分類学上異なる動物種由来細胞の多能性細胞も動物分類学上同一の動物種由来の多能性細胞も含まれる。ここで、「特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞由来細胞以外の細胞、該細胞の有する染色体、該細胞の有する遺伝子が機能している」とは、例えば、多能性細胞由来細胞以外の細胞が特定の物質を産生したり、該細胞が特定の器官や組織を形成したりすることをいい、「該細胞の有する遺伝子が機能している」の「遺伝子」は、「特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞」において変異または欠損した特定の遺伝子と同じ遺伝子であっても、異なる遺伝子であってもよい。好ましくは、特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞由来細胞以外の細胞の有する前記変異または欠損した遺伝子に対応する遺伝子が機能している。ここで、「前記変異または欠損した遺伝子に対応する遺伝子」とは、前記変異または欠損した遺伝子と同一の遺伝子または塩基配列の相同性の高い遺伝子であって、前記変異もしくは欠損した遺伝子が関与する機能と同一もしくは類似の機能を有している遺伝子をいう。
特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞として、例えば、生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損した多能性細胞、免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損した多能性細胞、特定の組織もしくは器官の形成に関与する遺伝子または特定のタンパク質をコードする遺伝子などのその他の遺伝子が変異または欠損した多能性細胞等が挙げられる。すなわち、特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞において、変異または欠損した遺伝子が（ａ）生殖細胞形成に関与する遺伝子、（ｂ）免疫系に関与する遺伝子、ならびに（ｃ）特定の組織もしくは器官の形成に関与する遺伝子または特定のタンパク質をコードする遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子である多能性細胞を用いることができる。
この場合、特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞は、該遺伝子が変異および欠損していない多能性細胞であり、例えば、生殖細胞形成能を有している多能性細胞、免疫機能に関して障害を有していない多能性細胞、あるいは特定の組織もしくは器官の形成に関与する遺伝子または特定のタンパク質をコードする遺伝子が変異も欠損もしていない多能性細胞である。
該他の多能性細胞において、所望の遺伝子が改変されていてもよい。この場合、特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞として、生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損した多能性細胞を用いた場合、得られるキメラ動物において形成される生殖細胞は所望の遺伝子が改変された細胞由来であるので、該キメラ動物から得られる子孫個体は、所望の遺伝子が改変されたトランスジェニック動物である。所望の遺伝子の改変は、多能性細胞が元々有していない外来遺伝子の導入でもよく、また多能性細胞が元々有している内在性遺伝子のノックアウトであってもよい。外来遺伝子としては、例えば動物分類学上の他種動物由来の遺伝子等が挙げられる。所望の遺伝子の改変は公知の方法で行うことができる。
さらに、特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞は、特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞と他の細胞との融合細胞であってもよく、また動物の組織性幹細胞（臓器特異性幹細胞、体性幹細胞）や分化した体細胞を公知の手段で形質転換した多能性細胞様細胞であってもよい。組織性幹細胞とは、成熟した動物の組織に存在し該組織または他の組織細胞へと分化し、該組織を形成し得る細胞をいう。例えば、脳幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、腎幹細胞、心臓幹細胞、血管幹細胞、造血幹細胞、骨髄幹細胞、神経幹細胞、網膜幹細胞、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞、間葉系幹細胞等がある。これらの幹細胞は、それぞれ特異的な表面抗原を有し、該抗原に特異的な抗体を用いて単離したり、あるいは蛍光標識した前記抗体を用いてセルソーター等を利用して単離することができる。また、幹細胞が色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を排出することを利用してＳＰ（Ｓｉｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）細胞として単離することもできる。幹細胞を単離する方法は当業者には周知である。これらの組織幹細胞の単離や分化能については、実験医学，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．４，２０００，ｐ．４２０−４６０、実験医学，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．３，２００１，３２６−３６９、実験医学，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１５，２００１、実験医学，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．８，２００３等に記載されており、これらの文献の記載に従って、幹細胞を単離し、あるいは所望の幹細胞を選択することができる。多能性細胞であるＥＳ細胞と分化細胞の融合細胞を宿主胚に注入し発生させた場合に、該融合細胞が個体に寄与し、機能し得ることは確認されている（Ｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｄｙｎ．２２７，５０４−５１０，２００３）。
これらの幹細胞や分化した体細胞を他のＥＳ細胞等の多能性細胞と共培養したりすることにより、形質転換（分化転換）した多能性細胞を得ることが出来る（Ａｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３０，３５０−３５６，２００４）（Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１６，５４５−５４８，２００２）（Ｔｅｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３０，５４２−５４５，２００２）。
生殖細胞由来の細胞をＥＳ細胞等の多能性細胞と共培養することにより、生殖器官由来の細胞からの多能性細胞を樹立することができる。例えば、雄核発生胚（ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏ）や雌核発生胚（ｇｙｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏ）を多能性細胞と共培養することで、雄核発生胚由来のＥＳ細胞等の多能性細胞や雌核発生胚由来のＥＳ細胞等の多能性細胞を樹立することができる。共培養は、培養用ディッシュ等の培養用容器中で行なえばよい。この際、培養容器に適当なフィーダー細胞を播いておいてもよい。雄核発生胚は、受精卵からの雌性前核を除去し、別の受精卵から採取した雄性前核を移植することにより作製することができ、雌核発生胚は、受精卵からの雄性前核を除去し、別の受精卵から採取した雌性前核を移植することにより作製することができる。すなわち、本発明は、雄核発生胚または雌核発生胚をＥＳ細胞等の多能性細胞と共培養し、雄核発生胚または雌核発生胚由来のＥＳ細胞を樹立する方法をも包含する。
共培養する他の多能性細胞としては、キメラ動物の作製の際に動物の宿主胚に注入する特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞を用いればよい。
細胞の融合は、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法等の公知の方法で行うことができる。形質転換により２倍体である多能性様細胞が得られ、融合により４倍体である多能性様細胞が得られる。この際、一方の細胞をコルヒチン等のコルセミドで処理することで微小核体としてもよいし、マイトマイシンＣや放射線で処理して不均等融合させてもよい。一方のミトコンドリアＤＮＡを公知の方法で除去後、融合に用いることも出来る。
なお、特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞として、前記特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞との融合細胞を用いる場合および組織幹細胞や体細胞を特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞と共培養し多能性細胞様細胞に形質転換して用いる場合、調製した融合細胞または多能性様細胞中に特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞が含まれている。この場合であっても、キメラ動物作製の際、該多能性細胞を同時に宿主胚に注入すればよい。それ以外に、特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞として、特定の遺伝子が関与する機能を持つ（異種細胞、染色体などが導入された融合細胞など）と未受精卵または脱核受精卵を融合・活性化・培養を行った結果得られる胚盤胞期胚由来多能性細胞、例えばＥＳ様細胞を宿主胚に注入することも可能であろう。このように、融合細胞または多能性細胞様細胞を調製する際に用いた特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞をそのまま同時に宿主胚に注入する場合も、「特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞および該多能性細胞以外の他の多能性細胞を含む２種類以上の細胞を動物の宿主胚に注入」するに該当する。
用いる組織幹細胞や体細胞は、特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した前記多能性細胞に対して動物分類学上の同種でも異種であってもよい。
前記特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞が生殖細胞形成に関与する遺伝子である場合、例えば、特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞由来細胞以外の細胞から生殖細胞が形成され得る。また、前記特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞が免疫系に関与する遺伝子である場合、例えば、特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞由来細胞以外の細胞が抗体を産生する等免疫担当細胞として機能する。あるいは、特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞由来細胞以外の細胞は、キメラ個体形成の際に、免疫系が関与する遺伝子が変異または欠損した細胞の免疫機構により攻撃・排除されることがないので、キメラ個体において、特定の遺伝子が変異または欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞由来細胞以外の細胞が特定の物質を産生し、あるいは特定の器官や組織を形成する。
生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損しており生殖細胞を形成できない多能性細胞としては、例えば、Ｃ−ｋｉｔ変異動物（Ｗ遺伝子変異動物）由来の細胞がある。Ｃ−ｋｉｔは、Ｗ遺伝子座にマップされる、レセプター型チロシンキナーゼのひとつであり、不妊等に関与する。Ｃ−ｋｉｔ変異動物として、例えばＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウスが挙げられる。Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖマウスは、雌雄両性で生殖細胞を形成することができない（不稔／不妊）マウスである。Ｃ−ｋｉｔ変異動物の一つであるＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウスは、例えば、後述の実施例１に記載の方法により得ることができる。他のＣ−ｋｉｔ変異動物もＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウスの作製法に従って、作製することができる。また、この場合、該多能性細胞は、生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損しており、生殖細胞形成という機能を欠損している。この多能性細胞と該多能性細胞に対して同種または異種であり、生殖細胞を形成し得る他の多能性細胞を混合して動物の初期胚に注入することにより、生殖細胞を形成し得る多能性細胞が生殖系列に伝播し得るキメラ動物を得ることができる。
生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損し、生殖細胞を形成し得ない多能性細胞に対して同種または異種である細胞がマウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サルおよびヒトからなる群から選択される。
該生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損しており生殖細胞を形成できない多能性細胞と一緒に宿主胚に注入する他の多能性細胞として、例えば遺伝子改変を受けた細胞が挙げられ、遺伝子改変として外来遺伝子の導入または内在遺伝子のノックアウトが挙げられる。これらの細胞を動物の宿主胚に注入することにより、前記の遺伝子改変を受けた細胞が生殖系列に伝播し得るキメラ動物を作製することができる。このようにして得られたキメラ動物においては、遺伝子改変を受けた細胞から生殖細胞が形成され、またキメラ動物の子孫を得ることにより遺伝子改変を受けた動物がトランスジェニック動物として産生される。また、一緒に宿主胚に注入する他の多能性細胞は、該生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損しており生殖細胞を形成できない多能性細胞に対して動物分類学上の異種であってもよく、この場合得られたキメラ動物は異種動物の生殖細胞を形成する。該異種動物の生殖細胞は、異種動物の染色体を有するため、得られた動物より異種動物の染色体を有する器官や組織の幹細胞や器官や臓器自体が得られ、また得られた動物が有する異種動物の染色体を有する体細胞より、異種動物のタンパク質等の物質を得ることができる。
免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞として、例えば、ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕマウス）やｓｃｉｄマウス等の免疫不全動物由来の多能性細胞が挙げられる。ここで、「免疫機能に障害を有する」とは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞等の免疫担当細胞を形成できないこと、あるいは抗体を産生し得ず、異種由来細胞、異種由来組織、異種由来物質等を排除する機能が喪失または低下していることをいう。
ヌードマウスとは、先天的に胸腺を欠失したマウスであり、第１１染色体の劣性遺伝子であるｎｕ遺伝子がホモ型であるマウスである。すなわち、ヌードマウス由来の多能性細胞は、ｎｕ遺伝子に関してホモ型である多能性細胞である。ｓｃｉｄマウスとは、ヒトの重症複合免疫不全勝（ＳＣＩＤ）と同様の病態を呈するマウスをいい、劣性遺伝子であるｓｃｉｄ遺伝子がホモ型であるマウスであるｓｃｉｄマウスには、ＮＯＤ／ｓｃｉｄなどがある。すなわち、ｓｃｉｄマウス由来の多能性細胞は、ｓｃｉｄ遺伝子に関してホモ型である多能性細胞である。ヌードマウス、ｓｃｉｄマウス等の免疫不全マウス、ＲＡＧ−１遺伝子および／またはＲＡＧ−２遺伝子を欠失したリンパ球欠損マウス（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，４５２８−４５３２，１９９３）は市販のものを入手するかまたは文献の記載に従って入手することができる。
このような免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞と免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞に対して動物分類学上の異種である他の多能性細胞を動物の宿主胚に注入することにより、前記免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞および前記異種である細胞がキメラ個体の形成に寄与しているキメラ動物を製造することができる。免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞がマウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル等の動物由来の多能性細胞を用いることができる。例えば、免疫不全マウス由来の多能性細胞と、ヒトの抗体をコードする遺伝子を含む多能性細胞を用いてキメラマウスを作製した場合、該キメラマウスはヒト抗体遺伝子を含んでいる。該キメラマウスに抗原を投与することによりキメラマウスにヒト抗体を産生させることができる。さらに、免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞として、Ｔ細胞およびＢ細胞等のリンパ球の形成能を喪失した多能性細胞が挙げられ、例えば、遺伝子再構成に関与したＲＡＧ−１遺伝子やＲＡＧ−２遺伝子を欠失した動物由来の多能性細胞が挙げられる。このような多能性細胞も免疫機能が欠損しており、上記の免疫不全動物由来のＥＳ細胞を用いる場合と同様に、他種動物由来のＥＳ細胞と混合しキメラ動物を作製することができる。
さらに、特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞として、特定の組織もしくは器官の形成に関与する遺伝子または特定のタンパク質をコードする遺伝子が変異または欠損して、該組織もしくは器官の形成能または該タンパク質の産生能を喪失した多能性細胞が挙げられる。特定の組織もしくは器官の形成に関与する遺伝子は限定されず、特定の臓器の形成に関与する遺伝子等が挙げられる。特定のタンパク質をコードする遺伝子も限定されず、例えばサイトカインなどの生理活性物質、免疫グロブリン等をコードする遺伝子が挙げられる。このような特定の組織もしくは器官の形成に関与する遺伝子または特定のタンパク質をコードする遺伝子が変異または欠損して、該組織もしくは器官の形成能または該タンパク質の産生能を喪失した多能性細胞を該遺伝子が変異および欠損していない他の多能性細胞とともに用いてキメラ動物を製造することにより、得られたキメラ動物において、他の多能性細胞由来の組織もしくは器官が形成され、またはタンパク質が産生される。他の多能性細胞が特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞に対して動物分類学上の異種である場合、キメラ動物において異種組織または器官が形成され、または異種タンパク質が産生される。特定の遺伝子が変異または欠損は、公知の遺伝子操作技術により行うことができる。
また、複数の遺伝子が変異または欠損し、複数の機能を喪失した多能性細胞を用いることもできる。すなわち、変異または欠損した遺伝子が（ａ）生殖細胞形成に関与する遺伝子、（ｂ）免疫系に関与する遺伝子、ならびに（ｃ）特定の組織もしくは器官の形成に関与する遺伝子または特定のタンパク質をコードする遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子である多能性細胞を用いることができる。例えば、Ｗ^ｖ遺伝子とｎｕ遺伝子の両方に関してホモであるマウス、すなわち生殖細胞を形成することができず、なおかつ免疫不全であるマウス由来の多能性細胞を用いることができる。
さらに、複数の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞として、異種間交雑により得られた生殖細胞を形成し得ない多能性細胞を用いることもできる。生殖細胞を形成し得ない多能性細胞は、生殖細胞を形成し得ない初期胚から得ることができ、生殖細胞を形成し得ない初期胚、例えば受精胚は遺伝的要因により起こる生殖細胞の形成不全を利用することで作製する。すなわち、異種交雑種第１代は不稔を示し生殖細胞を欠失することが知られており、この遺伝的要因を利用して作製する。例えば、マウスを用いる場合、実験用マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）とその同胞異種関係にあるマウスを自然交配して異種交雑受精胚を得る。このとき繁殖能力に優れた実験用マウスの雌から卵子を得る方が望ましい。すなわち、実験用マウスの雌とその同胞異種関係にある雄を自然交配して異種交雑受精胚を得ることが望ましい。特に、３週齢から４週齢の若齢期実験用雌マウスをホルモン処理して過剰排卵を誘起した後に交配することで多くの受精胚を得ることができる。更に、過剰排卵を誘起した若齢期の実験用雌マウスから採取した卵子と異種マウスの精子を体外受精して得た異種交雑種胚を効率よく大量に得ることができる。実験用マウスはＣ５７ＢＬ／６などが使用できる。
一方、交配相手である異種マウスはＭｕｓ ｓｐｒｅｔｕｓやＭｕｓ ｃａｒｏｌｉ、Ｍｕｓ ｐａｈａｒｉ等が使用できるが、体外受精に関する情報が比較的集積されているＭｕｓ ｓｐｒｅｔｕｓが好ましく、異種交雑種胚を安定して得ることができるＣ５７ＢＬ／６雌性マウスとＭｕｓ ｓｐｒｅｔｕｓ雄性マウスの組み合わせが好ましい。上記ではマウスについて例示したが、本発明の多能性細胞はマウスに限定されずあらゆる動物の多能性細胞を含む。他の動物においてもマウスと同様に操作することにより、異種間交雑により得られた生殖細胞を形成し得ない多能性細胞を得ることができる。なお、異種間交雑により得られた生殖細胞を形成し得ない多能性細胞はＷＯ ０３／０７１８６９号国際公開パンフレットの記載に従っても得ることができる。
上記のように２種類以上の細胞を動物の胚盤胞等の初期胚である宿主胚に注入し、該初期胚を仮親の子宮に移植することにより、キメラ動物を形成することができる。また、この際、テトラプロイドレスキュー法により所望の多能性細胞の遺伝子が生殖細胞に伝播されたキメラ動物を作製することもできる。テトラプロイドレスキュー法は、４倍体の受精卵にＥＳ細胞等の多能性細胞を注入することにより、４倍体細胞は胎盤へと発生し、ＥＳ細胞等の多能性細胞のみが個体へと発生することを利用した多能性細胞が生殖系列に伝播したキメラ動物を作製する方法である（Ｎａｇｙ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１０，８１５−８２１（１９９０））。テトラプロイドレスキュー法でキメラ動物を作製する場合は、出生してきた動物の呼吸障害による死亡を防止するために、４倍体受精卵またはＥＳ細胞のミトコンドリアＤＮＡを核ＤＮＡと適合させておくのが望ましい。テトラプロイドレスキュー法を行う際のミトコンドリアＤＮＡを核ＤＮＡと適合させる方法については後述する。
図７に本発明の方法によるキメラ動物作製法の概要を示す。
このように、特定の遺伝子が変異しまたは欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞および該機能を有する他の多能性細胞を含む２種類以上の細胞を用いてキメラ動物を作製することには、以下に述べる利用法がある。
（１） 遺伝子改変動物由来の生殖細胞の生産
（２） 遺伝子改変動物の生産
（３） 異種動物由来の幹細胞の生産
（４） 異種動物由来の細胞、組織または器官の生産
（５） 異種動物由来の生殖細胞の生産
（６） 異種動物の生産
（７） 異種動物由来細胞を含むキメラ組織または器官の生産
（８） 異種体細胞による目的物質の生産
さらに、これとは別に再生医療の視点からレシピエント（ここでは免疫不全マウス）に臓器幹細胞や生殖幹細胞を移植した場合、生着はするが増殖しないことや目的の細胞に分化しないことが多々ある。これは異種細胞を取り巻く細胞環境が本来の環境と細胞、分子レベルであまりにも異なるためと考えられる。一方、本発明の方法において生産されるキメラの臓器は、異種細胞、マウス細胞、様々なハイブリッド細胞が混在していると考えられる。この状況は異種幹細胞や目的の染色体や遺伝子を持つハイブリット細胞が増殖、機能するためには有利であると考えられる。また更に、このようなキメラ個体に異種臓器幹細胞を移植する場合にも有利と考えられる。将来的に異種幹細胞の増殖、分化に必要な物質（遺伝子）が明らかになった場合にもマウスＥＳ細胞を用いているため遺伝子改変を容易に行なうことが可能である。
また臓器移植に用いる目的で、急性拒絶反応の抗原性に関与する酵素を欠損したノックアウトクローンブタが作成されている。これらのブタから更に免疫不全ブタを作成し、本発明の方法で、ヒト細胞とブタ細胞の融合細胞を作製し、キメラ動物を作成すればよりヒト臓器に近いものが出来る。
本発明は、上記の方法で得られたキメラ動物およびその子孫をも包含する。
さらに、本発明は、特定の遺伝子が変異しまたは欠損し該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞それ自体も包含する。該多能性細胞に含まれる細胞は上記のとおりである。
以下、本発明の多能性細胞の作製法および利用法をＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞を例に詳細に説明するが、多能性細胞の由来はＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウスに限られず、ｎｕ／ｎｕマウスやｓｃｉｄマウス等の免疫不全マウス、リンパ球欠損マウス、他のマウス、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル等の他の動物も含まれる。また、多能性細胞もＥＳ細胞には限定されず、ＥＧ細胞やＧＳ細胞も含まれる。
ＥＳ細胞は哺乳類の発生過程において胚盤胞の内部細胞塊をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することにより樹立することができる（Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：１５４−１５６，１９８１；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：１１４５−１１４７，１９９８）。
胚でＥＳ細胞からキメラマウスが形成されるためには、樹立したＥＳ細胞が高い増殖能を有している必要がある。増殖能はｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増殖能および胚中での増殖能の両方を含む。
すなわち、ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊の細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することにより、樹立することができるが、この際に他のＥＳ細胞や４倍体胚と共培養することにより、未分化状態、分化能および増殖能が大きいＥＳ細胞を樹立することが出来る。また樹立率も向上する。ここで用いるＥＳ細胞は目的とするＥＳ細胞と識別、分離が可能であればよいが、生殖系列キメラ作製を目的とするＥＳ細胞の樹立の場合には生殖細胞を形成しないＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来ＥＳ細胞が望ましい。例えば、ＫＫマウスの場合Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞と共培養しない場合の樹立率が０％であるのに対して、共培養した場合は５０％に上昇する。共培養は、培養用ディッシュ等の培養用容器中で行なえばよい。この際、培養容器に適当なフィーダー細胞を播いておいてもよい。さらに、共培養は、内部細胞塊（ＩＣＭ）を構成する初期胚中で行ってもよい。この場合、共培養しようとする複数の細胞をマイクロマニュピレーター等を用いて初期胚中に注入し、培養すればよい。一定期間の共培養後、共培養した細胞を回収し、４倍体は胚（テトラプロイド）等のキメラ動物の作製のための初期胚中に注入すればよい。用いた初期胚は、繰り返し共培養に用いることができる。また、初期胚としてテトラプロイドを用いてもよい。上記の方法は核移植胚や雄性胚などＥＳ細胞を樹立する事が困難な再構築胚からもＥＳ細胞を効率的に樹立することが出来る。またＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来ＥＳ細胞や４倍体胚と共培養した再構築胚はそのままキメラ動物の作製に用いることも出来る。
また、後述のように、キメラ動物の作製のための初期胚に共培養しようとする複数のＥＳ細胞を注入し、そのままキメラ動物を作製してもよい。
本発明のＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞を用いた他のＥＳ細胞の樹立は、例えば後述の実施例５記載の方法で行えば良い。
本発明のＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞を他のＥＳ細胞、例えば、外来遺伝子の導入や特定の遺伝子のノックアウト等の所望の遺伝子改変を行ったＥＳ細胞と共培養し、同時に初期胚に入れることにより、所望のＥＳ細胞の培養中の増殖能が高められ、なおかつ胚に移植した後の該ＥＳ細胞の増殖も良好となり、該ＥＳ細胞の遺伝子が生殖系列に伝播されたキメラマウスを得ることができる。また、本発明のＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞と共培養した他のＥＳ細胞の形態も良好に保たれる。良好なＥＳ細胞のコロニーは輪郭が丸くはっきりしており、細胞が盛り上がって増殖している。これに対して悪いＥＳ細胞のコロニーは偏平で形が崩れている。
一方、Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞は、生殖細胞が形成されないため、該ＥＳ細胞が生殖系列に伝播されることはない。すなわち、本発明の方法でキメラ動物を得た場合、得られたキメラ動物の精子又は卵子はＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞ではない他のＥＳ細胞に由来し、次世代の産仔には必ず該ＥＳ細胞に由来した染色体が伝播する。この際、所望のＥＳ細胞はいずれのマウス系統由来のものも用いることができるが、Ｃ５７ＢＬ／６または１２９系統由来のＥＳ細胞が望ましく、特にＣ５７／ＢＬ６由来のＥＳ細胞が望ましい。また、このとき市販のＥＳ細胞を用いてもよい。
また、この際、Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞と共培養する代わりに、他のＥＳ細胞の樹立の際にＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞のコンディションメディウムを添加した培地を用いても、培養中の増殖能が高められ、なおかつ胚に移植した後の増殖能が高められたＥＳ細胞を樹立することができる。コンディションメディウムは、例えばＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２１，２０−２８，１９８７の記載に従って調製できる。
この時、所望のＥＳ細胞と共培養する、Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞の増殖能が一定の範囲にあることが望ましい。該ＥＳ細胞の増殖能が低いと共培養するＥＳ細胞の増殖能を改善することができず、一方該ＥＳ細胞の増殖能が高すぎると、ＥＳ細胞がすべて、Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞に置き換わってしまう。該ＥＳ細胞が未分化状態および分化能を維持して増殖能が高すぎる場合は、マイトマイシンＣ、放射線やローダミンなどで処理することで増殖能を調節することが出来る。
一般的にＥＳ細胞を用いてキメラマウスを作製する場合、ＥＳ細胞の継代数が多くなると、増殖能が低下し、生殖系列に伝播しにくくなる。このため、通常継代数が１０代以下のＥＳを用いる必要がある。一方、Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞と共培養して用いる場合は、Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞に増殖等がサポートされるため、長期継代を行ったＥＳ細胞、例えば１２代以上、あるいは２０代以上継代したＥＳ細胞も用いることができる。
本発明のＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞を、所望の他のＥＳ細胞とともに胚盤胞等の初期胚に注入し、該初期胚を仮親の子宮に移植することにより、効率的にキメラマウスを形成することができる。また、この際、テトラプロイドレスキュー法により所望のＥＳ細胞の遺伝子が生殖細胞に伝播されたキメラマウスを作製することもできる。テトラプロイドレスキュー法は、４倍体の受精卵にＥＳ細胞を注入することにより、４倍体細胞は胎盤へと発生し、ＥＳ細胞のみが個体へと発生することを利用したＥＳ細胞が生殖系列に伝播したキメラマウスを作製する方法である（Ｎａｇｙ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１０，８１５−８２１（１９９０））。テトラプロイドレスキュー法でキメラマウスを作製する場合は、出生してきたマウスの呼吸障害による死亡を防止するために、４倍体受精卵または、Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞と混合するＥＳ細胞のミトコンドリアＤＮＡを核ＤＮＡと適合させておくのが望ましい。但し、用いる細胞が交雑細胞、例えば２種類の近交系動物の交雑細胞を用いる場合は、出生マウスの呼吸障害という問題は生じないので、必ずしもミトコンドリアＤＮＡを核ＤＮＡと適合させる必要はない。例えば、本発明で用いているＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウスは交雑系マウスであるので、Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞は、必ずしもミトコンドリアＤＮＡを核ＤＮＡに適合させる必要はない。ミトコンドリアＤＮＡを核ＤＮＡと適合させるためには、４倍体受精卵または、Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞と混合するＥＳ細胞のミトコンドリアＤＮＡを野生型マウスのミトコンドリアＤＮＡと置換させればよく、具体的には以下のようにして行う（ＷＯ０３／０７１８６９号国際公開パンフレット）。
マウス胚由来のミトコンドリアＤＮＡ置換ＥＳ細胞は、公知の方法により得ることができる。例えば、近交系マウスのミトコンドリアＤＮＡの置換は、バッククロス交配法または核置換法などにより、所望のタイプのミトコンドリアＤＮＡに置換した近交系マウスを作製し、このマウスからＥＳ細胞を樹立すればよい。近交系マウスＣ５７ＢＬ／６のミトコンドリアＤＮＡをバッククロス交配法により野生型マウスＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓと１２回以上の交雑を繰り返すことにより、ミトコンドリアのＤＮＡが野生型マウスＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプに置換された近交系マウスＢ６−ｍｔＭｕｓが作製できる。このマウスからミトコンドリアＤＮＡを適合型マウスＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプのＤＮＡに置換したＥＳ細胞を樹立できる。
一方、前核置換法は、常法（ＭｏＧｒａｔｈ Ｊ＆Ｓｏｌｔｅｒ Ｄ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ，２２８，３５５−３６２（１９８３））に従い、近交系マウスｍｄｘの前核期受精卵の雌雄前核を野生型マウスＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプのミトコンドリアを有する除核した前核期受精卵に移植し、電気パルスによる核融合を行い培養した後にマウス卵管に移植して個体発生させることにより、ミトコンドリアＤＮＡをＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプに置換した近交系マウスｍｄｘ−ｍｔＭｕｓが作製できる。このマウスから同じくミトコンドリアＤＮＡを野生型に置換したＥＳ細胞を樹立することができる。
ＥＳ細胞の樹立にあたっては、この様にして作製した近交系マウス、例えばＢ６−ｍｔＭｕｓ又はｍｄｘ−ｍｔＭｕｓの胚盤胞を採取し、常法（Ｅｖａｎｓ ＭＪ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ ＭＫ，Ｎａｔｕｒｅ ２９２，１５４−１５６（１９８１））によりＥＳ細胞を樹立することができる。
また、Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞についてミトコンドリアＤＮＡを置換する場合は、Ｂ６−Ｗ^ｖ／＋の雄をＢ６−ｍｔＭｕｓの雌に交配させＢ６−Ｗ^ｖ／＋−ｍｔＭｕｓマウスを得る。Ｂ６−Ｗ^ｖ／＋−ｍｔＭｕｓの♀とＤＢＡマウスの雄を交配することでＢＤＦ１−Ｗ^ｖ／＋−ｍｔＭｕｓマウスが得られ、以後ＢＤＦ１−Ｗ^ｖ／＋−ｍｔＭＵＳマウス同士を交配させればよい。上述のように、本発明のＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞は、他のＥＳ細胞の樹立、遺伝子改変を行った所望のＥＳ細胞との共培養によるキメラマウスの作製に十分な増殖能を有したＥＳ細胞の調製、および所望のＥＳ細胞と同時に胚盤胞に注入することによるキメラマウスの作製に用いることができる。これらの工程におけるＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞の使用は、各々の工程のみにおける使用であってもよいし、２つ以上の工程における連続的な使用であってもよい。例えば、Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞を所望の遺伝子改変を行った他のＥＳ細胞と共培養して、そのままＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞と他のＥＳ細胞をキメラマウス作製のために、胚盤胞に注入してもよい。
ノックアウトマウス等の作出のためにＥＳ細胞の遺伝子を改変した場合、該ＥＳ細胞の増殖能は低くなる場合が多く、本発明のＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞はこのような遺伝子を改変したＥＳ細胞の増殖能等を改善することもできる。特に、複数の遺伝的改変を行ったＥＳ細胞に対しても好適に用いることができる。
さらに、本発明のＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞により樹立できる細胞、所望の遺伝子改変を行う細胞、同時に胚盤胞に注入する細胞は、ＥＳ細胞だけではなく、ＥＧ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ）またはＧＳ細胞を用いてもよい。ＥＧ細胞は哺乳類始原生殖細胞をＬＩＦ、ＦＧＦ２等のサイトカインと共に培養することにより得られる（Ｍａｔｕｓｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７０：８４１−８４７，１９９２）。ＧＳ細胞は幼年期の雄マウスの精巣から得ることができる（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４２８，１４５−１５０，２００４））
ＧＳ細胞の樹立は、例えば以下の方法で行う。
マウスＧＳ様細胞の樹立
１．ディッシュはゼラチンコートしておく。
２．酵素液１は５ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２にｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅを３ｍｇ／ｍｌ、ＤＮａｓｅ Ｉを２００μｇ／ｍｌ含む。
３．酵素液２は５ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２にｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅを３ｍｇ／ｍｌ、ＤＮａｓｅ Ｉを２００μｇ／ｍｌ、ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅを３ｍｇ／ｍｌ含む。
４．出生後１０日〜２週間のマウスの精巣を酵素液１の中で刻む。
５．３７℃で１５分間インキュベートする。
６．２３００ｒｐｍ、２０℃で１０分間遠心分離する。
７．上清をアスピレーターで吸い取り、そこにチューブＩＩ’の酵素溶液を加える。このとき、トリプシンを５００μｇ／ｍｌとなるように加える。
８．３７℃で３０分間インキュベートする。
９．血清入り培地で反応をとめた後、２３００ｒｐｍ、２０℃で１０分間遠心分離をする。
１０．上清をアスピレーターで吸い取り、そこにＤＭＥＭ／Ｆ１２（血清入り）を５ｍｌ入れる。
１１．８０μｍのナイロンメッシュで濾過する。
１２．ついで４０μｍのメッシュで濾過する。
１３．５〜２０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＥＳ培地で培養する。培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２は２日に１回交換、ＥＳ培地は毎日交換する。
本発明のＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス由来のＥＳ細胞を所望のＥＳ細胞とともに胚盤胞に注入し、キメラマウスを作製する場合、出生するマウスの性比をコントロールすることができる。一般的に、ＥＳ細胞を樹立する場合、性染色体が雄ＸＹの型の細胞ができることが多く、雌ＸＸの型の細胞はできにくい。一方、本発明のＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞は、性染色体が雌ＸＸの型の細胞も容易に得ることができ、Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞については、雄ＸＹ型の細胞も雌ＸＸ型の細胞も必要に応じて選択することができる。例えば、所望の雄ＸＹ型のＥＳ細胞と雄ＸＸ型のＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞を胚盤胞に注入した場合、出生する全てのキメラマウスは、雄である。また、所望の雄ＸＹ型のＥＳ細胞と雌ＸＸ型のＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞を胚盤胞に注入した場合、所望のＥＳ細胞の増殖能の強さに応じて雄または雌のキメラマウスが出生する。
キメラ動物作成法により得られる可能性のあるキメラ動物の性および得られる生殖細胞の種類および由来は以下の通りである。
胚 ＥＳ キメラ 生殖細胞
１．雄 雄 雄 精子（胚由来＋ＥＳ由来）
２．雄 雌 雄 精子（胚由来）
３．雄 雌 雌 卵（ＥＳ由来＋まれに胚由来）
４．雌 雄 雄 精子（ＥＳ由来）
５．雌 雄 雌 卵（胚由来＋稀にＥＳ由来）
６．雌 雌 雌 卵（胚由来＋ＥＳ由来）
従来法において、ＥＳ細胞は通常雄であるので上記のうち２、３、６は起こり難い。すなわち、従来法において、雌のキメラが生まれた場合、ＥＳ細胞由来の卵を得られるのは上記の５の場合のみであるが、稀にしか生じない。従って、ＥＳ細胞は生殖伝播しにくい。
本発明のＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞を用いる場合、上記５の場合の胚をＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞にすれば、雌のキメラが生まれた場合の卵は全てＥＳ由来である。従って、その仔が生まれれば１００％ＥＳ細胞が生殖伝播している。
本発明のＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞を他のＥＳ細胞との共培養および他のＥＳ細胞を胚盤胞に注入するときに同時に注入することにより、ほぼ１００％の確率でキメラマウスを得ることができる。
また、本発明のＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来のＥＳ細胞を用いてキメラマウスを作製する場合、所望のＥＳ細胞の遺伝子が生殖系列に伝播したキメラマウスが１００％できるので、万一出生してきたマウスが死亡した場合でも、該マウスの生殖巣を他のマウスに移植することにより、所望のキメラマウスを作製することができる。
さらに、本発明は、雄核発生胚または雌核発生胚由来のＥＳ細胞から生殖細胞を作製する方法を包含する。雄核発生胚または雌核発生胚由来のＥＳ細胞は、生殖細胞由来の細胞をＥＳ細胞等の多能性細胞と共培養することにより、生殖器官由来の細胞からの多能性細胞を樹立することができる。例えば、雄核発生胚（ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏ）や雌核発生胚（ｇｙｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏ）を多能性細胞と共培養することで、雄核発生胚由来のＥＳ細胞等の多能性細胞や雌核発生胚由来のＥＳ細胞等の多能性細胞を樹立することができる。このようにして得られた雄核発生胚または雌核発生胚由来のＥＳ細胞は、他の初期胚や生殖細胞由来の細胞と共培養することにより、多能性細胞を樹立することもできる。
雄核発生胚または雌核発生胚由来のＥＳ細胞から、生殖細胞を形成することもできる。生殖細胞を形成するには、雄核発生胚または雌核発生胚由来のＥＳ細胞を動物の生殖器官に移植すればよい。例えば、雄核発生胚由来のＥＳ細胞を精細管に移植することにより雄核発生胚由来のＥＳ細胞由来の精子を形成することができる。この際、移植する動物はＥＳ細胞の由来動物と同種の動物が望ましい。移植の際、好ましくはＥＳ細胞をマイトマイシン等で処理する。また、同様に雌核発生胚由来のＥＳ細胞を卵管に移植することにより、雌核発生胚由来のＥＳ細胞由来の卵子を得ることができる。最終的に得られた生殖細胞がＥＳ細胞由来かどうかは、ゲノムのインプリンティングの状態を確認すればよい。
すなわち、本発明は、雄核発生胚または雌核発生胚由来の多能性細胞を動物の生殖器官に移植することにより生殖細胞を作製する方法を包含する。
以下の実施例をもって本発明を詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。

Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖマウス胚由来ＥＳ細胞株（Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖＥＳ細胞株）の樹立
雌のＣ５７ＢＬ−Ｗ^ｖ／＋マウス（エスエルシー）を雄のＤＢＡ／２Ｊ（日本クレア）と自然交配させて、交雑第一世代を得た。毛色よりＷ^ｖ遺伝子をヘテロに持つ個体、すなわちＢＤＦ１−Ｗ^ｖ／＋を選択した。ＢＤＦ１−Ｗ^ｖ／＋マウス同士を自然交配させ、同様に交雑第二世代のヘテロ個体（ＢＤＦ２−Ｗ^ｖ／＋）を得た。ＢＤＰ２−Ｗ^ｖ／＋マウスの雌雄を自然交配させ、膣栓を確認した日から３日目の個体の子宮をＭ２培地で灌流し、３４個の胚盤胞期胚を回収し、得られた胚を常法（Ｅｖａｎｓ ＭＪ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ ＭＫ，Ｎａｔｕｒｅ２９２，１５４−１５６（１９８１））に従いＥＳ細胞を樹立した。即ち、ＥＳ培地（８０％（ｖ／ｖ）ＤＭＥＭ，２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ，１％（ｖ／ｖ）１００ｍＭ ピルビン酸溶液（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．１１３６０−０７０）、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．１１１４０−０２７），１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ−６２５０），１０^３Ｕ／ｍＬ ＬＩＦを分注した４穴プレートのフィーダー細胞上に先に得られた胚を１個ずつ移して３７℃，５％ＣＯ_２−５％Ｏ_２−９０％Ｎ_２の条件下で培養した。培養７日目に増殖したＩＣＭ細胞塊を選抜した。０．１２５％トリプシン／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ処理を行い、細胞を分散した後に新しく準備した４穴プレートのフィーダー細胞上に播種して培養した。２回目の継代ではウェル全体をトリプシン／ＥＤＴＡ処理し、新しい３．５ｃｍ培養皿に播種して良好に増殖する１７ラインを得た。ここまで到達できた細胞は、その後も安定して増殖することができたため細胞株として凍結保存した。
樹立したＥＳ細胞のゲノタイビングはＰＣＲ−ＲＦＬＰ法（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ９８，１０１７−１０２５（１９９７））により行った。Ｗ遺伝子を認識するプライマー ５’−ＡＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＣＴＡＡＴＧＴＣＧＧ−３’（配列番号１）および５’−ＣＴＣＧＡＧＡＣＴＡＣＣＴＣＣＣＡＣＣ−３’（配列番号２）にてＰＣＲを行い増幅して得られた１０４ｂｐの断片をＮｓｉ１制限酵素処理し、断片化されない野生型および８５ｂｐと１９ｂｐに断片化されるＷ^ｖタイプを検定した。その結果、５ラインがＷ^ｖ／Ｗ^ｖタイプであった。これらのラインについて性判別ＰＣＲ（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ７７，６３９−６５０，１９９４）を行ったところ、２ラインが雄株、３ラインが雌株であった。

１２９．Ｂ６−ＹＧＦＰ ＥＳ細胞の樹立
雌の１２９／ｓｖマウス（ＮＩＨ）を雄のＣ５７ＢＬ／６−ＥＧＦＰ＃６０（Ｙ−ｌｉｎｋ）（Ｉｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６，２７５，１５９９２−６００１（２０００））と自然交配させて、膣栓を確認した日から３日目の個体の子宮をＭ２培地で灌流し、１０個の胚盤胞期胚を回収し、得られた胚を常法（Ｅｖａｎｓ ＭＪ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ ＭＫ，Ｎａｔｕｒｅ ２９２，１５４−１５６（１９８１））に従いＥＳ細胞を樹立した。即ち、ＥＳ培地（８０％（ｖ／ｖ）ＤＭＥＭ，２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ，１％（ｖ／ｖ）１００ｍＭピルビン酸溶液（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．１１３６０−０７０），１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．１１１４０−０２７），１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ−６２５０），１０^３Ｕ／ｍＬ ＬＩＦを分注した４穴プレートのフィーダー細胞上に先に得られた胚を１個ずつ移して３７℃，５％ＣＯ_２−５％Ｏ_２−９０％Ｎ_２の条件下で培養した。培養７日目に増殖したＩＣＭ細胞塊を選抜した。０．１２５％トリプシン／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ処理を行い、細胞を分散した後に新しく準備し４穴プレートのフィーダー細胞上に播種して培養した。２回目の継代ではウェル全体をトリプシン／ＥＤＴＡ処理し、新しい３．５ｃｍ培養皿に播種して良好に増殖する５ラインを得た。ここまで到達できた細胞は、その後も安定して増殖することができたため細胞株として凍結保存した。
これらのラインについて性判別ＰＣＲ（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ７７，６３９−６５０，１９９４）を行ったところ、１ラインが雄株、４ラインが雌株であった。

ＢＳ−ｎｅｏ ＥＳ細胞の樹立
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのミトコンドリアＤＮＡをＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプに置換したマウスＢ６−ｍｔＭｕｓの雌（Ｎ１５）（Ｎａｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｇｅｎｅｔ Ｓｙｓｔ ７３，２１−２７（１９９８））を雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと自然交配させた。膣栓を確認した日から３日目の個体の子宮をＭ２培地で灌流し、２０個の胚盤胞期胚を回収し、得られた胚を常法（Ｅｖａｎｓ ＭＪ ａｎｄ Ｋｏｕｆｍａｎ ＭＫ，Ｎａｔｕｒｅ２９２，１５４−１５６（１９８１））に従いＥＳ細胞を樹立した。即ち、ＥＳ培地（８０％（ｖ／ｖ）ＤＭＥＭ，２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ，１％（ｖ／ｖ）１００ｍＭピルビン酸溶液（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．１１３６０−０７０），１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．１１１４０−０２７），１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ−６２５０），１０^３Ｕ／ｍＬ ＬＩＦを分注した４穴プレートのフィーダー細胞上に先に得られた胚を１個ずつ移して３７℃，５％ＣＯ_２−５％Ｏ_２−９０％Ｎ_２の条件下で培養した。培養５日目に増殖したＩＣＭ細胞塊を選抜した。０．１２５％トリプシン／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ処理を行い、細胞を分散した後に新しく準備した４穴プレートのフィーダー細胞上に播種して培養した。２回目の継代ではウェル全体をトリプシン／ＥＤＴＡ処理し、新しい３．５ｃｍ培養皿に播種して良好に増殖する２ラインを得た。ここまで到達できた細胞は、その後も安定して増殖することができたため細胞株として凍結保存した。
これらのラインについて性判別ＰＣＲ（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ７７，６３９−６５０，１９９４）を行ったところ、１ラインが雄株、１ラインが雌株であった。
樹立したＢ６−ｍｔＭｕｓ ＥＳ細胞株の雄のラインに常法により、ｎｅｏ遺伝子ベクターを遺伝子導入し、遺伝子ターゲッティングを行った。

４倍体胚盤胞期胚の調製
過剰排卵誘起処理を施したＩＣＲマウスを同系統の雄マウスと自然交配させ、膣栓を確認した個体から絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）投与後４４〜４６時間に卵管灌流法で後期２細胞期胚を採取した。得られた後期２細胞期胚を０．３Ｍマンニトール中で直流電気パルスにより融合処理（ＦＵＪＩＴＡ製ゴクウ：パルス条件は１８Ｖ，５０μｓｅｃ，９９９μｓｅ間隔で３回）を施し４倍体胚を調製した。４倍体を選別し、Ｍ１６培地にて３７℃、５％ＣＯ_２−Ａｉｒ中で２日間培養して、４倍体胚盤胞期胚を取得した。

Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖＥＳ細胞との共培養
ＢＳ−ｎｅｏ ＥＳ細胞については遺伝子導入後の薬剤選抜等により細胞がダメージを受けていたため、Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖＥＳ細胞との共培養を行った。すなわち１×１０^４個ＢＳ−ｎｅｏ ＥＳ細胞と１×１０^４個のＷ^ｖ／Ｗ^ｖＥＳ細胞を混合し、フィーダー細胞を敷いた６ｃｍディッシュに播種した。通常のＥＳ細胞の維持と同様の方法により、３日目に継代を行った。さらに３日培養後、クローニングを行うために良好な形態をしたコロニー２０個を０．１２５％トリプシン／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ処理し、細胞を分散した後、新しく準備した４穴プレートのフィーダー細胞上にそれぞれ別々に移して培養した。培養３日目に増殖したコロニーそれぞれ３〜５個を用いて前述のＰＣＲ−ＲＰＬＰ法（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ９８，１０１７−１０２５（１９９７））によりゲノタイピングを行った。２０ラインのうち７ラインがＢＳ−ｎｅｏ ＥＳ細胞株であった。この中で最もコロニーの形態および増殖が良好なラインを凍結保存しておき、キメラ作製に用いることにした。

テトラプロイドレスキュー法によるキメラマウスの作製（１）
実施例４で得られた４倍体胚盤胞期胚に対して、先述の１２９．Ｂ６−ＹＧＦＰ ＥＳ細胞（雄）およびＢＤＦ３ Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖＥＳ細胞（雌）をそれぞれ約１０個ずつピエゾマイクロマニピュレーターで注入した。注入を行った３９個の４倍体胚盤胞期胚（テトラプロイド）を、膣栓を確認後２．５日目のレシピエントＩＣＲマウス２匹の子宮に移植し、出産前夜（妊娠１８．５日目の夜）に帝王切開により７匹の雄と１匹の雌、合計８匹のキメラマウス胎仔を取り出した。図１に、キメラマウス作製の概要を示す。図１中、左上の細胞は、生殖細胞欠損（Ｗｖ）、免疫不全（ｎｕｄｅ，ｓｃｉｄ）、リンパ球欠損（ＲＡＧ−１，ＲＡＧ−２）等の目的とする細胞・組織・器官、タンパクなどに関わる遺伝子を変異または欠損したＥＳ細胞であり、右上の細胞はヒトなどの神経幹細胞、造血幹細胞、その他の分化細胞および生殖細胞欠損（Ｗｖ）、免疫不全（ｎｕｄｅ，ｓｃｉｄ）、リンパ球欠損（ＲＡＧ−１，ＲＡＧ−２）等の目的とする細胞・組織・器官、タンパクなどに関わる遺伝子を変異または欠損したＥＳ細胞である。得られたキメラ個体から最終的に目的とする細胞・組織・器官、タンパク等を取り出すことができる。また、図２にキメラマウスの写真を示す。蛍光顕微鏡（ＧＦＰ）にて観察した結果、得られたキメラ胎仔全てに目的のＥＳ細胞（１２９，Ｂ６−ＹＧＦＰ）が寄与していることを確認した。図２ａおよに図２ｂに示すように、Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖＥＳ細胞のレスキューなしに１２９．Ｂ６−Ｙｌｉｎｋ−ＧＦＰ ＥＳ＋テトラプロイド胚でキメラマウスを作製した場合、胎仔形成は見られず、胎盤や着床痕のみであった。図２Ｃは、１２９．Ｂ６−Ｙｌｉｎｋ−ＧＦＰ ＥＳ＋Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖＥＳ ＃７＋テトラプロイド胚を移植した妊娠１８．５日目のレシピエントマウスを示す図である。図２ｄは、帝王切開直後の１２９．Ｂ６−Ｙｌｉｎｋ−ＧＦＰ ＥＳ＋Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖＥＳ ＃７＋テトラプロイドキメラマウスを示す図である。さらに、図２ｅに示すように、生まれた個体のうち２匹はがん球の欠失や腹水など異常な形態を示したが（図２ｅの矢印）、他の産仔に以上は見られなかった。図３にキメラマウス（１２９．Ｂ６−Ｙｌｉｎｋ−ＧＦＰ ＥＳ＋Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖＥＳ＋テトラプロイドキメラマウス、生後８日目）の蛍光顕微鏡による観察の結果を示す。蘇生処置を行い活発に動くことを確認した後、里親につけて保育した。

テトラプロイドレスキュー法によるキメラマウスの作製（２）
実施例４で得られた４倍体胚盤胞期胚に対して、先述のＢＳ−ｎｅｏ ＥＳ細胞（雄）およびＢＤＦ３ Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖＥＳ細胞（雄）をそれぞれ約１０個ずつピエゾマイクロマニピュレーターで注入した。注入を行った２９個の４倍体胚盤胞期胚を、膣栓を確認後２．５日目のレシピエントＩＣＲマウス２匹の子宮に移植し、出産前夜（妊娠１８．５日目の夜）に帝王切開あるいは自然分娩により３匹の雄胎仔を取り出した。蘇生処置を行い活発に動くことを確認した後、里親につけて保育した。毛色により、得られたキメラ胎仔の１匹に目的のＥＳ細胞（ＢＳ−ｎｅｏ ＥＳ細胞）が寄与していることを確認した。図４に得られたキメラマウス（ＢＳ−ｎｅｏ ＥＳ（黒色）＋Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖＥＳ（白色）＋テトラプロイドキメラマウス、生後８日目）の写真を示す。図４中、毛色が黒い個体にはＢＳ−ｎｅｏ ＥＳ細胞が寄与しており、白い個体はＷ^ｖ／Ｗ^ｖＥＳ細胞のみから個体が形成されている。
図５に一連のキメラマウス作製の結果を示す。

テトラプロイドレスキュー法によるキメラマウスの作製（３）
実施例４で得られた４倍体胚盤胞期胚に対して、実施例１および２と同様の手技で樹立した雌のＢ６−ＧＦＰ ＥＳ細胞（Ｉｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２０００）もしくは常法（Ｂａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）により作製したＢ６−ＧＦＰ単為発生胚由来ＥＳ細胞（Ｂ６−ＧＦＰ ＰＧＥＳ）をＢＤＦ３ Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖＥＳ細胞（雌）とともにそれぞれ約１０個ずつピエゾマイクロマニピュレーターで注入した。注入を行ったＢ６−ＧＦＰ ＥＳ細胞キメラ胚２４個およびＢ６−ＧＦＰ ＰＧＥＳキメラ胚２６個を膣栓を確認後２．５日目のレシピエントＩＣＲマウス２匹の子宮に移植し、自然分娩によりＢ６−ＧＦＰ ＥＳ細胞キメラ胚由来個体１匹とＢ６−ＧＦＰ ＰＧＥＳキメラ胚由来個体２匹を得た。蛍光顕微鏡（ＧＦＰ）にて観察した結果、Ｂ６−ＧＦＰ ＥＳ細胞キメラ胚由来個体１匹とＢ６−ＧＦＰ ＰＧＥＳキメラ胚由来個体１匹に目的のＧＦＰ−ＥＳ細胞が寄与していることを確認した。図６にこのキメラマウス作製の詳細を示す。

４倍体胚との共培養
核移植胚や雄性胚からのＥＳ細胞（ＥＳ様細胞を含む）樹立率はあまり高くない。また樹立できたＥＳ細胞コロニーも良好な形態を維持しない場合が多い。これらの問題を解決するため、４倍体胚との共培養を行なった。
はじめに核移植胚と４倍体胚との共培養によるＥＳ細胞の樹立について述べる。操作は通常の電気融合法で行なった。Ｂ６−ｍｔＭＵＳの雌マウスとＤＢＡ雄マウスとの交配により得られたＦ１雌マウス（８週令）を過排卵処理して得た未受精卵を除核後、Ｂ１０ｍｄｘ雄マウスの尾部由来繊維芽細胞と融合した。ストロンチュウムによる活性化の後、Ｍ１６で８細胞期まで培養した。８細胞期の割球を２個コンパクッション前の４倍体４細胞期胚（実施例４）にマイクロマニュピレーターを用いて導入した。８細胞期核移植胚４個から１６個のキメラ胚を作製してＭ１６で培養した。すべての胚は胚盤胞期まで発育し、内部細胞塊（ＩＣＭ）の発達が見られた。そのうち無作為に６個選びＥＳ細胞の樹立に用いた。６個の胚から最終的に３ラインのＥＳ細胞株が樹立できた。
これとは別に樹立した雄性胚由来ＥＳ細胞はコロニーの扁平で増殖能も低いものであった。雄性胚の作製はＦ１雌を過排卵処理して１２９雄マウスと交配させ得られた前核期胚の雌性前核と、Ｆ１雌を過排卵処理してＢ６雄マウスと交配させ得られた前核期胚の雄性前核を置換して作製したものである。実施例４で得られた４倍体胚盤胞期胚に対して、この雄性胚由来ＥＳ細胞を約１０個ずつピエゾマイクロマニピュレーターで注入した。約１日培養後、実施例１の樹立法を用いて培養した。通常ＩＣＭ塊が増殖するのは５日前後であるが、ＥＳ細胞由来のＩＣＭ塊は増殖するのは３日前後である。この操作を数回繰り返して出来たＥＳ細胞コロニーは良好な形態をして増殖能の高いものであった。

４倍体胚およびＷ^ｖ／Ｗ^ｖＥＳ細胞との共培養
ＫＫマウスの受精胚を８細胞期で子宮より回収した。８細胞期の割球を２個コンパクッション前の４倍体４細胞期胚（実施例４）にマイクロマニュピレーターを用いて導入した。８細胞期核移植胚５個から１９個のキメラ胚を作製してＭ１６で培養した。すべての胚は胚盤胞期まで発育し、内部細胞塊（ＩＣＭ）の発達が見られたがＥＳ細胞の樹立はできなかった。次に同様の方法で１２個のキメラ胚を作製し培養１．５日後、胚盤胞期胚になったキメラ胚にマイトマイシン処理したＷ^ｖ／Ｗ^ｖＥＳ細胞約５個をピエゾマイクロマニュピレーターで導入した。実施例１と同様にＥＳ細胞を樹立したところ、６ラインのＥＳ細胞が樹立できた。

雄核発生胚由来ＥＳ細胞の精細管への移植
雄核発生胚由来ＥＳ細胞を精細管に移植して動向を探ることを目的とし、以下の実験を行った。材料としてはＢ６・ＢＡＬＢ Ｆ２ ｎｕ／ｎｕＷ^ｖ／Ｗ^ｖと雄核発生胚由来ＥＳ細胞（ライン名１−１、マーカーとしてＧＦＰとｎｅｏを保有、継代数８および再樹立）を用いた。方法は以下に述べるとおりである。まず、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＷ^ｖ／＋の雌とＢＡＬＢ／ｃＡｎｕ／＋の雄を交配させて、Ｗ^ｖ／＋かつｎｕ／＋であるＦ１マウスを生産した（Ｂ６・ＢＡＬＢＦ１、Ｗ^ｖ／＋、ｎｕ／＋）。このマウスを交配させることにより、Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖかつｎｕ／ｎｕであるＦ２マウスを生産した（Ｂ６・ＢＡＬＢＦ２、Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖ、ｎｕ／ｎｕ）。このマウスが８週齢になったときに精細管に再樹立した雄核発生胚由来ＥＳ細胞を移植した。再樹立は４倍体胚の胚盤期胚内に雄核発生胚由来ＥＳ細胞を約１０個注入し、ＥＳ細胞を樹立するときと同様の方法で行なった。
以下に詳しく述べる。まず、細胞の調製である。あらかじめマイトマイシン処理しておいたＭＥＦ上で２日間培養し、コンフルエントな状態になった雄核発生胚由来ＥＳ １−１Ｐ８を用いた。この細胞をＰＢＳ（−）で洗浄後、トリプシン／ＥＤＴＡ（０．２５％／０．０４％）溶液を用いて細胞培養用ディッシュからはがし、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を等量加えることで反応を停止させた。ピペッティングにより細胞を解離した後、４０μｍ四方の格子のナイロンメッシュでろ過した。この細胞懸濁液を遠心分離機によりペレット状にした。十分量のＥＳ培地によりこのペレットを再懸濁し、血球計算版により細胞数を測定した。再び遠心分離機によりこれをペレット状にし、注入用培地（ＥＳ培地８５μｌ＋２０ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ ５μｌ＋トリパンブルー１０μｌ）に懸濁し、４．３×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液を１００μｌ用意した。
次に移植について述べる。Ｂ６・ＢＡＬＢＦ２、Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖ、ｎｕ／ｎｕマウスに麻酔液（ネンブタール：１００％エタノール：ＰＢＳ＝１：１：１１）を０．３ｍｌ注射し、麻酔をかけた。下腹部を７０％エタノールで消毒し、正中部を切開した。精巣の周囲の脂肪をピンセットでつまんで精巣を引き出し、実体顕微鏡下で輸精管を露出させた。ゴム球を用いて、先端を引き伸ばしておいたガラス管に細胞懸濁液を充填した。移植用のマウスピースにガラス管をセットした。輸精管を保持しながら、そこにガラス管を突き刺し、精巣網内に針を進入させ、呼気により細胞懸濁液を精細管内に注入した。十分に充填されたことを確認してガラス管を引き抜いた。精巣を腹腔内に戻し、反対側の精巣についても同様に移植を行った。縫合糸にて腹膜と筋層を縫い合わせ、皮膚を金属製のクリップでとめた。
この操作により、今回は左の精巣には大量に細胞懸濁液を注入することができ、右の精巣にも十分量細胞懸濁液を注入することができた。
Ｂ６・ＢＡＬＢＦ２、Ｗ^ｖ／Ｗ^ｖ、ｎｕ／ｎｕの精巣はＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウス特有の極少の精巣であった。精巣は、移植翌日には元の位置に戻り、一ヵ月後には正常なマウスとほぼ同じ大きさにまで成長した。また、図８に示すように形成途中の精子が見られた。よって、雄核発生胚由来ＥＳ細胞は精子幹細胞の性質を持っているといえる。

雄核発生胚由来ＥＳ細胞のメチル化パターンの解析
実験に使用した雄核発生胚由来ＥＳ細胞（Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ ＥＳ：ＡｇＥＳ）および比較対照区としてノーマルのＢ６由来ＥＳ細胞３ラインを用いてゲノムのインプリンティングの状態を確認した。インプリンティングの状態はインプリント遺伝子上流にあるＤＭＲｓ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ）のＣｐＧサイトのメチル化状態を測ることにより調べることができる。まず、それぞれのサンプルよりＤＮＡを抽出し、ＣｐＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）を用いてバイサルファイト処理を打った。次にｃｏｍｂｉｎｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＯＢＲＡ）を行うために、母方特異的にメチル化されるインプリント遺伝子Ｐｅｇ１／Ｍｅｓｔ、ＳｎｒｐｎおよびＩｇｆ２ｒ特異的プライマーを用いて、ＰＣＲによりサンプルのＤＮＡを増幅した。使用したプライマーは以下の通りである。
Ｐｅｇ１／Ｍｅｓｔ（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ＆ ｅｘｏｎ １，Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃ．ｎｏ．ＡＦ０１７９９４），
５’−ＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＡＴＡＴＴＧＴＡＡＡＧＴ−３’（配列番号３）
および５’−ＴＴＣＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＣＴＴＣＣＣＡＴＡＴＴＣ−３’（配列番号４）
Ｓｎｒｐｎ（ＤＭＲ１，Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃ．ｎｏ．ＡＦ０８１４６０），
５’−ＴＴＴＧＧＴＡＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＧＧＴＡＧＧＡＴＡＴ−３’（配列番号５）
および５’−ＡＣＴＡＡＡＡＴＣＣＡＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＴＡＡＣ−３’（配列番号６）
Ｉｇｆ２ｒ（ＤＭＲ２，Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃ．ｎｏ．Ｌ０６４４６），
５’−ＧＡＡＧＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＴＡＴＧＴＴＡＡＧ−３’（配列番号７）
および５’−ＡＣＡＡＴＴＴＡＣＡＣＣＣＴＣＡＡＡＡＴＡＣＣＴＣ−３’（配列番号８）
Ｐｅｇ１／ＭｅｓｔおよびＩｇｆ２ｒの増幅産物についてはＴａｑ Ｉにて６５℃で４時間、ＳｎｒｐｎについてはＨｈａ Ｉにて３７℃で４時間制限酵素処理を行った。以上のサンプルを２．５％アガロースで泳動し、エチジウムブロマイド染色によりＤＮＡ断片長を確認した。
ＣＯＢＲＡでは、もしＤＮＡがメチル化されていれば、Ｐｅｇ１／Ｍｅｓｔでは１３７ｂｐの増幅産物が９０ｂｐと４７ｂｐに、Ｓｎｒｐｎでは２４８ｂｐが１３５ｂｐと１１３ｂｐに、Ｉｇｆ２ｒでは１９３ｂｐが１４１ｂｐといくつかの断片に切れると考えられる。比較対照区のノーマルのＥＳ細胞ではおよそ５０％のＤＮＡがメチル化されており、正常な受精卵や体細胞と同じパターンを示した。一方、雄核発生胚由来ＥＳ細胞ではいずれのインプリント遺伝子もメチル化されておらず、精子と同じメチル化パターンを示した。

本発明のＣ−ｋｉｔ変異動物（Ｗ遺伝子変異動物）由来である、生殖細胞を形成できない多能性細胞は、従来樹立し得なかった多能性細胞であり、該多能性細胞を動物の胚盤胞細胞等の生殖器官由来の細胞と培養することにより増殖能の高ＥＳ細胞等の多能性細胞を樹立することができる。また、樹立された多能性細胞と本発明の生殖細胞を形成できない多能性細胞を共培養することにより、樹立された全能生細胞の増殖能を高く保つことができ、継代を繰り返した多能性細胞のキメラ動物の作製等への利用を可能にする。さらに、本発明の生殖細胞を形成できない多能性細胞をＥＳ細胞等の他の多能性細胞と共に動物の初期胚に注入し発生させることにより、該他の多能性細胞が生殖系列へ伝播されたキメラ動物を効率的に作製することができ、また出生するキメラ動物の性比をコントロールすることも可能である。
さらに、本発明の特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞および他の多能性細胞を含む２種類以上の細胞を動物の宿主胚に注入することを含む、キメラ動物の作製方法において、特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞および他の多能性細胞を含む２種類以上の細胞を適切に選択することにより、キメラ動物に異種動物のタンパク質を産生させたり、あるいはキメラ動物に異種動物の臓器特異的幹細胞や臓器を産生させることが可能になる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

配列番号１〜８ プライマー

Claims (83)

1. 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞および該多能性細胞以外の他の多能性細胞を含む２種類以上の細胞を動物の宿主胚に注入することを含む、キメラ動物の作製方法。
2. 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞および該多能性細胞以外の他の多能性細胞を含む２種類以上の細胞を共培養した後に動物の宿主胚に同時に注入することを含む、キメラ動物の作製方法。
3. 共培養が動物の初期胚中で行われる請求項２記載のキメラ動物の作製方法。
4. 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の細胞由来の遺伝子が機能するキメラ動物である、請求項１から３のいずれか１項に記載のキメラ動物の作製方法。
5. 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の細胞由来の前記変異または欠損した遺伝子に対応する遺伝子が機能するキメラ動物である、請求項１から３のいずれか１項に記載のキメラ動物の作製方法。
6. 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞が遺伝子改変を受けた細胞である請求項１から５のいずれか１項に記載のキメラ動物の作製方法。
7. 遺伝子改変が外来遺伝子の導入または内在遺伝子のノックアウトである、請求項６記載のキメラ動物の作製方法。
8. 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞および／または他の多能性細胞が適合型ミトコンドリアＤＮＡが導入または置換された多能性細胞である、請求項１から７のいずれか１項に記載のキメラ動物の作製方法。
9. 動物の宿主胚が適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した宿主胚である、請求項１から８のいずれか１項に記載のキメラ動物の作製方法。
10. 動物の宿主胚が胚盤胞である、請求項１から９のいずれか１項に記載のキメラ動物の作製方法。
11. 動物の宿主胚がテトラプロイドである、請求項１０記載のキメラ動物の作製方法。
12. 多能性細胞がＥＳ細胞、ＥＧ細胞およびＧＳ細胞からなる群から選択される細胞である請求項１から１１のいずれか１項に記載のキメラ動物の作製方法。
13. 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の細胞が、特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞に対して動物分類学上同種である請求項１から１２のいずれか１項に記載のキメラ動物の作製方法。
14. 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の細胞が、特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞に対して動物分類学上異種である請求項１から１２のいずれか１項に記載のキメラ動物の作製方法。
15. 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞がマウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギおよびサルからなる群から選択される動物由来である請求項１から１４のいずれか１項に記載のキメラ動物の作製方法。
16. 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の細胞がマウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サルおよびヒトからなる群から選択される動物由来である請求項１から１５のいずれか１項に記載のキメラ動物の作製方法。
17. 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞において、変異または欠損した遺伝子が
    （ａ）生殖細胞形成に関与する遺伝子、
    （ｂ）免疫系に関与する遺伝子、ならびに
    （ｃ）特定の組織もしくは器官の形成に関与する遺伝子または特定のタンパク質をコードする遺伝子
    からなる群から選択される１以上の遺伝子である請求項１から１６のいずれか１項に記載のキメラ動物の作製方法。
18. 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞が、異種間交雑により得られた生殖細胞を形成し得ない多能性細胞である請求項１から１６のいずれか１項に記載のキメラ動物の作製方法。
19. 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞が、生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損し、生殖細胞を形成し得ない多能性細胞であり、特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞が生殖系列に伝播される請求項１７記載のキメラ動物の作製法。
20. 生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損し、生殖細胞を形成し得ない多能性細胞がＣ−ｋｉｔ変異動物由来の生殖細胞を形成できない多能性細胞である請求項１９記載のキメラ動物の作製方法。
21. Ｃ−ｋｉｔ変異動物がＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウスである請求項２０記載のキメラ動物の作製方法。
22. 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞が遺伝子改変を受けた細胞であり、該遺伝子改変を受けた多能性細胞が生殖系列に伝播される請求項１９から２１のいずれか１項に記載のキメラ動物の作製方法。
23. 遺伝子改変が外来遺伝子の導入または内在遺伝子のノックアウトである、請求項２２記載のキメラ動物の作製方法。
24. 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞が、免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞である請求項１７記載のキメラ動物の作製方法。
25. 免疫系に関与する遺伝子が変異又は欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞が、抗体をコードする遺伝子が変異又は欠損し、抗体産生能を喪失した多能性細胞である請求項２４記載のキメラ動物の作製方法。
26. 免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞が免疫不全動物由来の多能性細胞である請求項２４に記載のキメラ動物の作製方法。
27. 免疫不全動物がｎｕ／ｎｕマウスまたはｓｃｉｄマウスである請求項２６記載のキメラ動物の作製方法。
28. 免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞がリンパ球欠損動物由来の多能性細胞である請求項２４記載のキメラ動物の作製方法。
29. リンパ球欠損動物がＲＡＧ−１遺伝子および／またはＲＡＧ−２遺伝子が変異または欠損した動物である請求項２８記載のキメラ動物の作製方法。
30. 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞が特定の組織もしくは器官の形成に関与する遺伝子または特定のタンパク質をコードする遺伝子が変異または欠損した多能性細胞である請求項１７記載のキメラ動物の作製方法。
31. 製造されたキメラ動物において、特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞の前記変異または欠損した遺伝子に対応する遺伝子により、該遺伝子が関与する特定の組織もしくは器官またはタンパク質が産生される請求項３０記載のキメラ動物の作製方法。
32. 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞が免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損しており、さらに生殖細胞形成に関与する遺伝子、あるいは特定の組織もしくは器官の形成に関与する遺伝子または特定のタンパク質をコードする遺伝子が変異または欠損している多能性細胞である請求項１７記載のキメラ動物の作製方法。
33. 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞が、
    （ａ）特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞と該特定の遺伝子が変異または欠損した多能性細胞に対して動物分類学上同種もしくは異種である細胞との融合細胞、または
    （ｂ）該特定の遺伝子が変異または欠損した多能性細胞に対して動物分類学上同種または異種である細胞由来の多能性細胞
    である請求項１から３２のいずれか１項に記載のキメラ動物の作製方法。
34. 特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞に対して動物分類学上同種もしくは異種である細胞が組織幹細胞または分化細胞である請求項３３記載のキメラ動物の作製方法。
35. 生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損し、生殖細胞を形成し得ない多能性細胞ならびに
    （ａ）生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損し、生殖細胞を形成し得ない前記多能性細胞と該生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損した多能性細胞に対して動物分類学上同種または異種である細胞との融合細胞、もしくは
    （ｂ）該生殖細胞形成に関与する遺伝子が変異または欠損した多能性細胞に対して動物分類学上同種または異種である細胞由来の多能性細胞様細胞
    を動物の宿主胚に注入することを含む、前記同種または異種である細胞が生殖系列に伝播し得る請求項３３または３４に記載のキメラ動物の作製方法。
36. 免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞ならびに
    （ａ）免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する前記多能性細胞と該多能性細胞に対して動物分類学上異種である細胞との融合細胞、もしくは
    （ｂ）該多能性細胞に対して異種である細胞由来の多能性細胞様細胞
    を動物の宿主胚に注入することを含む、前記免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞および前記異種である細胞がキメラ個体の形成に寄与している請求項３３または３４に記載のキメラ動物の作製方法。
37. 請求項１から３６のいずれか１項に記載の方法で製造されたキメラ動物。
38. 請求項１７から２３のいずれか１項に記載の方法で製造されたキメラ動物より、特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞由来の生殖細胞を回収することを含む、特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞以外の他の多能性細胞由来の生殖細胞を製造する方法。
39. 請求項１７から２３のいずれか１項に記載の方法で製造されたキメラ動物を交配し遺伝子が改変された動物を子孫として得る遺伝子改変動物の製造方法。
40. 請求項３９記載の方法で製造された遺伝子改変動物。
41. 請求項１７および２４から２９のいずれか１項に記載の方法で製造されたキメラ動物またはその子孫であって、免疫系に関与する遺伝子が変異または欠損し、免疫機能に障害を有する多能性細胞以外の他の多能性細胞由来の抗体をコードする遺伝子を有するキメラ動物またはその子孫に抗原を投与することを含む抗体の製造方法。
42. 請求項１７、３０および３１のいずれか１項に記載の製造方法により製造されたキメラ動物またはその子孫に、特定の組織もしくは器官を形成させまたは特定のタンパク質を産生させることを含む、特定の組織もしくは器官または特定のタンパク質を製造する方法。
43. Ｃ−ｋｉｔ変異動物由来である、生殖細胞を形成できない多能性細胞。
44. Ｃ−ｋｉｔ変異動物がＷ^ｖ／Ｗ^ｖマウスである請求項４３記載の多能性細胞。
45. 免疫不全動物由来である、免疫に関与する遺伝子が変異または欠損した多能性細胞。
46. 動物がｎｕ／ｎｕマウスまたはｓｃｉｄマウスである請求項４５記載の多能性細胞。
47. リンパ球欠損動物由来である、免疫に関与する遺伝子が変異または欠損した多能性細胞。
48. リンパ球欠損動物が、ＲＡＧ−１遺伝子および／またはＲＡＧ−２遺伝子が変異または欠損した動物である請求項４７記載の多能性細胞。
49. ＥＳ細胞、ＥＧ細胞およびＧＳ細胞からなる群から選択される細胞である、請求項４３から４８のいずれか１項に記載の多能性細胞。
50. ミトコンドリアＤＮＡとして適合型ミトコンドリアＤＮＡが導入されている請求項４３から４９のいずれか１項に記載の多能性細胞。
51. 適合型ミトコンドリアＤＮＡが、野生型マウスＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプである、請求項５０記載の多能性細胞。
52. 性染色体型が雄ＸＹ型である、請求項４３から５１のいずれか１項に記載の多能性細胞。
53. 性染色体型が雌ＸＸ型である、請求項４３から５１のいずれか１項に記載の多能性細胞。
54. 請求項４３から５３のいずれか１項に記載の多能性細胞と動物の初期胚もしくは生殖細胞由来の細胞を混合培養して、生殖器官由来の細胞から多能性細胞を樹立する方法。
55. 動物の初期胚が雄核発生胚または雌核発生胚である請求項５４記載の方法。
56. 混合培養が動物の初期胚中での共培養である請求項５４または５５に記載の初期胚もしくは生殖細胞由来の細胞から多能性細胞を樹立する方法。
57. 初期胚もしくは生殖細胞由来の細胞が、胚盤胞の内部細胞塊由来の細胞であり、多能性細胞が、ＥＳ細胞である請求項５４から５６のいずれか１項に記載の多能性細胞を樹立する方法。
58. 初期胚もしくは生殖細胞由来の細胞が、始原生殖細胞であり、多能性細胞が、ＥＧ細胞である請求項５４から５６のいずれか１項に記載の多能性細胞を樹立する方法。
59. 初期胚もしくは生殖細胞由来の細胞が、生殖細胞であり、多能性細胞が、ＧＳ細胞である請求項５４から５６のいずれか１項に記載の多能性細胞を樹立する方法。
60. 請求項４３から５３のいずれか１項に記載の多能性細胞と他の多能性細胞を共培養することを含む、該他の多能性細胞の増殖能を向上させる方法。
61. 共培養が動物の初期胚中で行われる請求項６０記載の他の多能性細胞の増殖能を向上させる方法。
62. 他の多能性細胞が、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞およびＧＳ細胞からなる群から選択される細胞である請求項６０または６１に記載の多能性細胞の増殖能を向上させる方法。
63. 他の多能性細胞が遺伝子が改変されている多能性細胞である、請求項６０から６２のいずれか１項に記載の多能性細胞の増殖能を向上させる方法。
64. 請求項４３から５３のいずれか１項に記載の多能性細胞を他の多能性細胞と共に動物の宿主胚に注入することを含む、生殖細胞が他の多能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物の作製方法。
65. 請求項４３から５３のいずれか１項に記載の多能性細胞および／または他の多能性細胞が適合型ミトコンドリアＤＮＡが導入または置換された多能性細胞である、請求項６３記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
66. 動物の宿主胚が適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入または置換した宿主胚である、請求項６４または６５に記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
67. 動物の宿主胚が胚盤胞である、請求項６４から６６のいずれか１項に記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
68. 動物の宿主胚がテトラプロイドである、請求項６７記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
69. 他の多能性細胞が、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞およびＧＳ細胞からなる群から選択される細胞である請求項６４から６８のいずれか１項に記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
70. 動物がマウスである、請求項６４から６９のいずれか１項に記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
71. 他の多能性細胞が遺伝子が改変されている多能性細胞である、請求項６４から７０のいずれか１項に記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
72. 請求項４３から５３のいずれか１項に記載の多能性細胞と他の多能性細胞を共培養し、共培養した細胞を共に動物の宿主胚に注入することを含む、生殖細胞が他の多能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物の作製方法。
73. 共培養が動物の初期胚中で行われる請求項７２記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
74. 請求項４３から５３のいずれか１項に記載の多能性細胞および他の多能性細胞が適合型ミトコンドリアＤＮＡが導入された多能性細胞である、請求項７１または７２に記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
75. 動物の宿主胚が適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した宿主胚である、請求項７２から７４のいずれか１項に記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
76. 動物の宿主胚が胚盤胞である、請求項７２から７５のいずれか１項に記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
77. 動物の宿主胚がテトラプロイドである、請求項７６記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
78. 他の多能性細胞が、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞およびＧＳ細胞からなる群から選択される細胞である請求項７２から７７のいずれか１項に記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
79. 動物がマウスである、請求項７２から７８のいずれか１項に記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
80. 他の多能性細胞が遺伝子が改変されている多能性細胞である、請求項７２から７９のいずれか１項に記載の生殖系列キメラ動物の作製方法。
81. 請求項６４から８０のいずれか１項に記載の方法により作製されたキメラ動物。
82. 請求項５５記載の方法により樹立した雄核発生胚または雌核発生胚由来の多能性細胞を動物の生殖器官に移植することにより生殖細胞を作製する方法。
83. 雄核発生胚由来のＥＳ細胞を、動物の輸精管に移植することにより精子を作製する請求項８２記載の方法。

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