JP2000508919A

JP2000508919A - 多能性ウサギ胚幹（ｅｓ）細胞系およびそのキメラウサギの発生における使用

Info

Publication number: JP2000508919A
Application number: JP9538604A
Authority: JP
Inventors: モリーディス，ランドール; スホーンヤンス，ルーク
Original assignee: KU Leuven Research and Development
Current assignee: KU Leuven Research and Development
Priority date: 1996-04-29
Filing date: 1997-04-29
Publication date: 2000-07-18
Also published as: CA2252524A1; EP0907722A1; AU2892997A; WO1997041209A1; CN1217746A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系に関し、これは、少なくとも７０％、好ましくは８０−９０％の未分化細胞を含み、交配５.５日後の胞胚の内部細胞塊の単離、およびそのウサギＥＳ培地における支持細胞上での培養により得られる。本発明はさらに、この細胞系の誘導および保持のさらなる最適化、およびその利用、とりわけキメラウサギの発生における使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】多能性ウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系およびそのキメラウサギの発生における使用本発明は、新規のウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系およびそのキメラウサギの発生における使用に関する。遺伝子標的（胚幹（ＥＳ）細胞における相同的組換えによる）技法によって、希望するように、そして限定的にゲノムを操作することができる（Capecchi，19 89;Robertoson，1987;Bradley，1987）。概要を述べると、標的とすべき遺伝子は、プラスミド移転ベクターに組み込まれ、これらの配列のいくつかの、選択可能マーカーをコードする外来ＤＮＡでの置換（不活性化）により、または変異遺伝子配列（標的変異生成）により改変される。これらの不活性化または変異の遺伝子は、ＥＳ細胞（夫々完全な動物に成長する潜在能力を有す）に導入される。次いで、天然遺伝子が不活性化ハイブリドで置換されているＥＳ細胞のクローンをインビトロで選択し、これらの選択クローンを再移植した正常胚に導入する。この方法は不活性化遺伝子の生殖系列伝達のために選択されるキメラ動物をつくる。育種および選択を通じて、標的（ノックアウト）遺伝子を欠く形質転換動物がつくられる。完全なＥＳ細胞誘導マウスが最近開発された技術でつくられて、四倍体胚を有する野生型または変異のＥＳ細胞が集められる（Nagy et al.，1993）。また、ＥＳ細胞は非相同的組換えによる遺伝物質の導入に用いられ、生きている動物の遺伝変化の研究に供せられる。遺伝子機能の変化のために形質転換技法およびＥＳ細胞技法の使用は、主なヒトの病気の動物モデルを提供する（参照Wilson，1996;Rubin and Barsh，1996）。しかし現在のところ、この技術はマウスにおいてのみ成功している。マウスは、多くの利用に役立つものであるが、その可能な使用を大きく制限するものがある（例えば、大きさおよびヒト疾患の表現型をつくり得ないこと）。従って、表現型結果または機能損失変異を試験するための大動物モデルは、非常に価値がある。推定の多能性ＥＳ細胞が多くの他種の動物で単離されており、それには、ハムスター（Doetshman et al.，1988）、豚（Evans et al.，1990;Piedrahita et a l.，1990;Notarianni et al.，1990;Talbot et al.，1993）、羊（Notarianni e t al.，1990）、牛（Evans et al.;Saito et al.，1992）、ミンク（Sukoyan et al.，1993）、兎（Graves and Moreadith，1993）、ラット（Iannaccione et a l.，1994）、ヒト（Bongso et al.，1994）および霊長類（Thomson et al.，199 5）がある。しかし、マウスとラットにおいてのみ、ＥＳ細胞は胞胚中に再導入してキメラをもたらす培養が確立しており、ウサギや他の動物での試みは現在まですべて成功していない。ウサギの胞胚から新たに誘導された内部細胞塊（ＩＣＭ）の細胞は、受容体の胞胚に注入された後にキメラウサギの発生を可能とすることが示されており（Ga rdner and Munro，1974;Moustafa,1974;Babinet and Bordenave，1980）、一方、Yang et alは、新たに単離したＩＣＭおよびインビトロ培養に３日間保持したＩＣＭの両方の細胞からのキメラウサギの生成を報告している。しかし、ＥＳ細胞における相同的組換えによる遺伝子標的を可能にするためには、長期問培地中に保持することができ、キメラ動物をつくるための発揮された能力を有する細胞系が標的遺伝変化のある子孫をつくるために必要である。本発明以前には、マウスおよびラット以外にかかる細胞系は単離されていなかった。推定の多能性ウサギＥＳ細胞の誘導は、前にGravesおよびMoreadith（1993）により報告された。２種の主な細胞型が体外移植胚の一連の継代後に明らかになった。ひとつの型は栄養外胚葉の初代産物に等しい形態を持ち、胚の着床を司ぞる細胞であった。第二の型は典型的に上皮の様相を示し、ウサギＥＳ細胞を表すと推定された（表１）。これらの推定ＥＳ細胞は、外胚葉、中胚葉および内胚葉を現す多様な細胞型からなる胚子様体をつくることができたが、ニュージランド白色（ＮＺＷ）種からの胞胚への上皮様細胞の導入後（Graves and Moreadith， 1993;Graves and Moreadith，未公表結果（表１））および脱核したニュジーランド白色種の受精卵への核移植後（Du et al.，1995）にキメラウサギを作ることはできなかった。これは、これらのＥＳ細胞でキメラをつくれないのは種間障壁によるものであろうことを示唆している。しかしながら、表１のデータによると、単一の内部細胞塊から、４つの試験した上皮系のいずれからもキメラ動物は誘導されない。表１：推定ＥＳ細胞系のウサギ胚注入の結果（未公表、Graves and Moreadith）細胞系胚の段階＃注入＃出生（％）キメラ（％）ＧＭ３胞胚４６２９（６３）０（０）ＧＭ４胞胚２４２（８）０（０）ＧＭ８桑実胚８４６（７）０（０）ＧＭ４桑実胚１４５（３５）０（０）合計１６８４２（２５）０（０） NiemannおよびStrelchenko（1994）も多能性ウサギ（カリフォルニア種）ＥＳ細胞の分離および保持を試みたが、宿主胞胚（Chinchi1lla，Black Rex）の内部細胞塊を有する推定ＥＳ細胞（計１２継代で保持された）の集合を観察したけれども、キメラ子孫の発生を記載していない。これらの推定ＥＳ細胞は交配４日後に採取したウサギ胚から誘導された。このように現在まで、受容体の胞胚に注入してキメラ動物をつくる発揮能力の、安定な多能性ウサギＥＳ細胞系を作ろうとする試みはすべて失敗している。従って、受容体の胞胚に注入してキメラ動物をつくる発揮能力のウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系の改良された誘導および保持を得ること、次いで野生型または遺伝的に変化した子孫の産生を可能にすること（相同的または非相同的のいずれかの組換えを経て、例えば遺伝子または核移転を用いて）が本発明の目的である。少なくとも７０％、好ましくは８０−９０％の未分化細胞を含有するウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系が、交配５.５日後の胞胚の内部細胞塊を単離し、次いでそれらをウサギＥＳ培地において支持細胞上で培養することにより、得られることが分かった。本発明のウサギＥＳ培地は、高グルコースDulbecco's Modified Eagle Medium 、４mMのＬ−グルタミン、０.１mMの２−メルカプトエタノール、１４８単位／m lのペニシリンＧナトリウム、１４８μｇ／mlの硫酸ストレプトマイシン、４μ ｇ／ mlのウシインスリン、１０³単位／mlのネズミ白血病阻害因子、２０％のウシ胎児血清、１.５％のＭＥＭ非必須アミノ酸溶液を含む。支持細胞は、好ましくは１２.５日令のマウス胚から誘導されたマウス胚線維芽細胞であり、１０cmのペトリ皿につき３−４×１０⁶細胞の密度で用いられる。好ましくは、改良トリプシン処理法も用いられ、これは、リン酸塩緩衝溶液中に０.１％のコラゲナーゼ、１％のチキン血清および０.０３％のトリプシン−ＥＤＴＡを含有するトリプシン処理培地の使用からなる。マウス胚線維芽細胞および栄養外胚葉細胞がこの培地で緩やかに離れるので、ＥＳ細胞の選択的継代が可能となった。本発明の細胞は、次の性質でもって認識される。１０以上の継代後の三次元的コロニー形成、アルカリホスファターゼについてポジティブ着色およびサイトケラチン１８とヴィメンチンについてネガティブ着色。本発明は、キメラウサギ発生のためのＥＳ細胞系の使用に関し、例えば受容体胞胚への胞胚の注入、胚の集合または核の移転に続いてなされる。本発明のＥＳ細胞系は、相同的または非相同的組換えによる遺伝子変化のために、または生殖系列移送を経る遺伝子変化のあるウサギの発生のためにも使用される。本発明の細胞系の使用または分化は、（新規）遺伝子の研究または単離をもたらし得る。本発明は、多能性ＥＳ細胞の改良誘導、いくつかの継代での培地における保持、およびキメラ動物の発生のための使用を導く。受容体の胞胚に注入してキメラ動物をつくる発揮能力のあるウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系の改良誘導および保持は、これらの多能性ＥＳ細胞における相同的または非相同的組換えに続き、標的変異の生殖系列移転ができる子孫の発生を可能にする。さらに、ウサギＥＳ細胞は、その多能性によって、新規遺伝子の研究または単離を可能にする特定の細胞型へ分化し得るようになる。本発明は次の実施例で説明されるが、これは本発明の範囲を限定する意図ではない。本発明に基づき、いくつもの変更および改良がなし得ることは、当業者に明らかであろう。実施例１細胞培養条件 Graves and Moreadith（1993）に記載されているように、ＥＳ細胞系ＧＭ３から出発し、Dutch Beltedウサギ胚から誘導して（図１）、Graves and Moreadith （1993）の方法に比較して未分化ＥＳ細胞の率を安定化するよう細胞培養条件を整えた。ニュージランド白色種の胞胚腔にES細胞を注入して、キメラの発生が初めて可能となった。これは実施例２に示す。細胞培地、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）支持層の密度、ＭＥＦの誘導に用いるマウス胚の年齢および継代のための細胞の離脱に用いるトリプシン処理培地に変更を加えた。 Graves and Moreadith（1993）で用いられた培地は、高グルコースDulbecco's Modified Eagle Medium、４mMのＬ-グルタミン、０.１mMの２-メルカプトエタノール、１４８U/mlのペニシリンＧナトリウムおよび１４８μｇ/mlの硫酸ストレプトマイシンからなる。本発明では、次の添加物を変更または追加した。４μｇ/mlのウシインスリン、１０³単位/mlのネズミ白血球阻害因子、２０％ウシ胎児血清および１.５％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液。ウサギＥＳ細胞（１０cmペトリ皿当たり１.５−３×１０⁶細胞）をマイトマイシンで有糸分裂的に停止したマウス胚線維芽細胞に合流的に生育し、ＥＳ細胞を新たにつくった支持細胞（１０cm皿当たり３-４×１０⁶細胞）上で４-６日毎に継代した。ＥＳ細胞に上記の改良培地を毎日供給した。培養皿を５％ＣＯ₂空気の湿気中に保持した。マウス胚線維芽細胞を１２.５令のマウス胚から誘導し、継代１で使用した。１２.５令の胚の使用と共に高い密度のマウス胚線維芽細胞（１０cmペトリ皿当たり２−３×１０⁶に対し３−４×１０⁶）は、ＥＳ細胞の分化を顕著に低下した。未分化細胞のみがキメラ子孫をつくるのに不可欠である、受容者胚の内部細胞塊中に合体する能力を保持しているので、この分化の低下は重要であることが分かった。さらに、改良された選択的トリプシン処理法を用いて、栄養外胚葉細胞（ＥＳ細胞分化を誘発できる）を培地から取得できた。トリプシン処理培地は、リン酸塩緩衝液中に０.１％のコラゲナーゼ、１％のチキン血清および０.０３％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Gibco Cat．no．25200）を含有する。この選択的トリプシン処理培地は、マウス胚線維芽細胞および栄養外胚葉細胞がＥＳ細胞よりもゆっくりと離れるので、ＥＳ細胞の選択的継代を可能にした。実施例２キメラの発生 Graves and Moreadith（1993）によるDutch Belted胚から誘導したが、実施例１の培養条件に保持したＧＭ３細胞を下記のキメラ子孫を発生するために用いた。推定ＥＳ細胞の上皮様コロニーの胞胚注入は、ウサギ胚への注入後にキメラウサギを発生することは以前になかった（表１）。さらなる下記の実験において、アルカリホスファターゼ・ポジティブの未分化ＥＳ細胞の比率を安定化する改良培養条件に、継代１２からのＧＭ３細胞を保持した。性的成熟ニュージランド白色種の雌に豚小胞刺激ホルモンの６回連続的皮下注入（ＦＳＨ‐０.４，０.４，０.５，０.５，０.５，０.５mg）を１２時間ごとに行い、ＦＳＨの最終投与１０時間後に７５IUのヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を静脈注射し、この雌を同種の雄と交配した。３％のウシ血清アルブミン（Chon fraction V）および５％の抗生物質／抗真菌溶液（Gibco，Grand Island，NY）を補充したDulbecco'sリン酸塩緩衝液で子宮腔を洗うことにより交配９０時間後の子宮角から胞胚を採取した。なお、緩衝液は５％ＣＯ₂空気の湿気中３９℃で予め等張にしておいた。上皮様アルカリホスファターゼ・ネガティブかつ３次元成長アルカリホスファターゼ・ポジティブのＥＳ細胞をニュージランド白色種の胞胚腔に注入すると、キメラが発生した（表２）。計２８７のニュージランド白色種の胞胚がＧＭ３細胞系からの２０−３００細胞と共に注入された。ＧＭ３との胞胚の注入は微分干渉光を有するZeiss倒立顕微鏡で２５０×の倍率で行われた。顕微手術はマウスに日常的になされるように、Narashige顕微手術器で行われた。ＧＭ３細胞と共に注入された５−１０の胚は、小さい切り込みと鋭いガラスのピペットを利用して受容体ニュージランド白色種の雌の各子宮角の隣接部分に再移植された。この受容体雌は、供給体へのｈＣＧ注入１４時間後に、予め７５IU のｈＣＧが投与されていた。再移植はケタミン／キシラジン混合物による全身麻酔下に行われた。括弧内の％は注入胞胚に対するものである結果として全出生率は２３％であった。用いたＥＳ細胞系が有色Dutch Belted 株から誘導されたので、非有色ニュージランド白色種株からの胞胚へのＧＭ３細胞の注入はキメラにおいて明白な毛皮色形成を起こすであろう。毛皮の色からすると、３匹のキメラがDutch Belted系統に典型的な１以上の黒色帯を有していた。キメラ化の比率はDutch Belted有色毛皮の寄与を基にすると、１０％から５０％以上であった。これらのキメラのうち、１匹は雄（図２a）、１匹は雌（図２b ）および他の１匹はおそらく半陰陽であった。これらの結果は、培養中に保持され、何度も（１５−２２回）継代したＥＳ細胞系の胞胚注入がキメラウサギを発生し得るとの原則についての第一の証明をなす。キメラ化を振り返えると、３次元成長のアルカリホスファターゼ・ポジティブに帰されるようである。詳細を下記する。実際のところ、胞胚腔へのＥＳ細胞の注入後のキメラ生成頻度は低く、生きて生まれた動物の４％に過ぎなかった。これは次のようないくつかの要因によると思われる。１）ＥＳ細胞が導入された成熟胞胚における顕著な空間のために、発育胚へのＥＳ細胞の組み込みが少ないこと、２）Dutch Belted細胞系のニュージランド白色種の胞胚との生来の不適合性、３）細胞系の多能性の欠如。生育内部細胞塊に直接的にＥＳ細胞を導入することによって、ＥＳ細胞の生育内部細胞塊への運送頻度（続く胚中への組み込みに不可欠）を増加しようとする試みによっては、高頻度のキメラ形成をもたらさなかった。ＥＳ細胞注入についての受容体としてのDutch White胞胚（自然的点変異によりDutch Belted株から由来する）の使用は、キメラを発生せず、従って株障壁の関与を除去する。追加の実験によると、Graves and Moreadith（1993）に記載の培地に保持されたＥＳ細胞でのキメラ形成のないこと、および初期継代ＧＭ３細胞から出発した実施例１のようなＥＳ細胞での低効率は、主に残存多能性ＥＳ細胞についての前者における不存在および後者における低率によるようであった。このことはアルカリホスファターゼについての着色で表された。アルカリホスファターゼは未分化細胞中に存在するが、分化に際し急速になくなる（Benham et al.）。元の細胞系におけるアルカリホスファターゼ・ポジティブ細胞の出現は継代１０（図１）後１％以下であり、しかし、この頻度は本明細書記載の改良培養条件で保持され得る。推定ＥＳ細胞を表すと元は考えられていた（Graves and Moreath，1993 ）扁平上皮様細胞型（図１）はほとんどアルカリホスファターゼ・ネガティブであり、受容体胞胚の内部細胞塊に組み込むことができず、キメラ子孫を発生することができない。したがって、新しいＥＳ細胞系は実施例３に記載のように誘導された。実施例３ＥＳ細胞の改良誘導ＥＳ細胞の誘導についての改良法を開発し、改良細胞培養条件と併用して８から１０の継代後に８０％以上の未分化アルカリホスファターゼ・ポジティブ細胞からなる５ウサギＥＳ細胞系の発生が下記するように見られた。過剰排卵Dutch Beltedの雌をDutch Beltedの雄と交配せしめた。交配５.５日後（交配後４または５日の代わり）に子宮角から胞胚を取り、３％のウシ血清アルブミン（Cohn fraction V）および５％（v/v）の抗生物質/抗真菌物質溶液を補充したDulbecco'リン酸塩緩衝液で洗った。胞胚を次の処置まで５％ＣＯ₂培養器中３９℃でウサギＥＳ培地に保持した。酸性リン酸塩緩衝液（ｐＨ＝２.５）および０.５％のプロナーゼリン酸塩緩衝液を用いて、胞胚のムチン・コートおよび透明帯を除去した。内部細胞塊をまわりの栄養外胚葉細胞から２本の針を手動して取り出し、９６ウエルの培養皿に入れた（１０cm皿当たり３−４×１０細胞に等しい密度で１２.５日令の継代１マウス胚線維芽細胞を植えた）。植えた内部細胞塊に上記の改良ウサギＥＳ細胞培地を毎日与えた。この培地にはネズミ白血病阻害因子の代わりにヒトまたはウサギ白血病阻害因子が入れられていた。２日後、発生した栄養外胚葉を傾斜ガラスピペットで下の支持細胞層から緩やかに取り、それをガラスピペットに吹き込むことにより、発生した内部細胞塊を残存の栄養外胚葉細胞から容易に剥がし得た。次いで、３次元成長を特徴とするＥＳ様コロニーのみを培養皿上に継代した。４から５日後に９６ウエルを上記のトリプシン処理液で選択的に処置し、ＥＳ細胞の選択的継代を可能にした。栄養外胚葉細胞やマウス胚線維芽細胞は継代しない。改良ウサギＥＳ細胞に典型的な３次元成長は前に見られたことはなく、明らかにかかる細胞系の新しい特徴であった。改良培養条件および５.５日令の胚の使用によってのみ、３次元未分化ＥＳ細胞コロニーを培地中に高頻度で保持できた。ＥＳ細胞を非常に緩やかに大きい培養皿上に４から５日の間隔で継代し、分化および多能性損失を防ぐための他の不可欠条件である非常に高い密度でＥＳ細胞を保持した。次の培養皿上の支持細胞の密度を１０cm皿当り３から４×１０に等しい密度に維持した。この処置により得たウサギＥＳ細胞は、以前に報告されたいかなるウサギＥＳ変種よりも多能性のネズミＥＳ細胞系に類似していた。主な特性は、３次元におけるコロニー成長、高い光屈折性および核/細胞質の小さい比である。最も重要な特徴は、１０継代後、アルカリホスファターゼについてポジティブ着色（図３ｂ）および分化の既知マーカーであるヒトサイトケラチン１８およびマウスヴィメンチン（Viebahn et al.，1988;Piedrahita et al.，1990）についてネガティブ着色により表されるように、８０から９０％のES細胞が未分化で残っていることである。これらの特性は、アルカリホスファターゼ・ポジティブ着色から判定すると、未分化が１％以下であった以前の推定ＥＳ細胞系の性質と非常に異なっている。頻繁に継代したウサギＥＳ細胞における未分化細胞比率のこの非常な増加（１％から８０−９０％へ）は、ＥＳ細胞の胞胚への注入によるキメラウサギ発生の効率を顕著に高め、標的の遺伝的変化を有するキメラウサギの発生を可能にする。参考文献 Babinet C，Bordenave GR(1980)：免疫外科的につくられた内部細胞塊の移植によるキメラウサギ J Embryol Exp Morphoi 60:429-440 Benham FJ，Andrews FW，Knowles BB，Bronson DL，Harris H(1981):ヒト精巣奇形癌細胞系における分化の可能マーカーとしてのアルカリホスファターゼ・アイソザイム Dev．Bio 88:279-287 Bongso A，Fong C-Y，Ng S-C，Ratman S(1994)：ヒト胞胚からの内部細胞塊の単離および培養 Hum Reprod 9:2110-2117 Bradley A(1987)：キメラマウスの産生と解析 Teratocarcinomas and Embryoni c Stem Cells：A Practical Approach(Ed．Robertson EJ)，IRI Press Ltd.，Ox ford，1987，pp．113-151 Capecchi MR(1989)：相同的組換えによるゲノムの改変 Science 244:1288−129 2 Doetschman T，Williams P，Maeda N(1988)：ハムスター胞胚誘導胚幹(ES)細胞の樹立 Dev Biol 127:224-227 Du F，Giles JR，Foote RH，Graves KG，Yang X，Moreadith RW(1995):推定ウサギ胚幹細胞の核移転が正常な胞胚生育を導く J Reprod Fert 104:219-223 Evans MJ，Notarianni E，Laurie S，Moor 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RH（1988）：簡単な手法による桑実胚からのキメラウサギの産生 Gamete Res 21: 345-351 図面の説明図１：ウサギＥＳ細胞（ＧＭ３系）、Graves and Moreadithから誘導Ａ）扁平上皮様表現型を現す推定ＥＳ細胞の位相差顕微鏡写真。Ｂ）非常に低率（＜１％）のアルカリホスファターゼ・ポジティブ細胞（赤）を示す推定ＥＳ細胞のアルカリホスファターゼ着色。図２：Ａ）ひとつの黒色帯を有する雄キメラ。Ｂ）いくつかの黒色帯を有する雌キメラ。この帯はＧＭ３ＥＳ細胞系が誘導されたDutch Belted系列に典型的である。図３：Ａ）上記の改良された細胞培養およびＥＳ誘導条件を用いて、新たに誘導された細胞系の位相差顕微鏡写真。Ｂ）上記の改良された細胞培養およびＥＳ誘導条件を用いて、誘導されたウサギＥＳ細胞系のアルカリホスファターゼ着色。この新しいＥＳ細胞系は、３次元成長、高屈折性および８０から９０％のアルカリホスファターゼ・ポジティブ着色を特徴とする。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年６月５日（１９９８．６．５）【補正内容】請求の範囲１．少なくとも７０％、好ましくは８０−９０％の未分化細胞を含有しており、そして受容体の胞胚中に注入した後にキメラウサギを発生する能力を有し、およびこの細胞系が交配５.５日後の胞胚の内部細胞塊を単離し、次いでそれらをウサギＥＳ培地において支持細胞上で培養して得られるものである、ウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系。２．ウサギＥＳ培地が、高グルコースDulbecco's Modified Eagle Medium、４mM のＬ−グルタミン、０.１mMの２−メルカプトエタノール、１４８単位／mlのペニシリンＧナトリウム、１４８μｇ／mlの硫酸ストレプトマイシン、４μｇ／ml のウシインスリン、１０³単位／mlのネズミ白血病阻害因子、２０％のウシ胎児血清、１.５％のＭＥＭ非必須アミノ酸溶液を含む、請求項１のウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系。３．支持細胞が、１２.５日令のマウス胚から誘導されたマウス胚支持細胞であり、１０cmのペトリ皿につき３−４×１０⁶細胞の密度である、請求項１または２のウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系。４．ＥＳ細胞が種々の継代を経て培養され、そしてＥＳ細胞が各継代の前にリン酸塩緩衝溶液中に０.１％のコラゲナーゼ、１％のチキン血清および０.０３％のトリプシン−ＥＤＴＡを含有する選択的トリプシン処理培地でトリプシン処理される、請求項１、２または３のウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系。５．１０以上の継代後の三次元的コロニー形成、アルカリホスファターゼについてポジティブ着色、およびサイトケラチン１８およびヴィメンチンについてネガティブ着色を特徴とする、請求項１−４のいずれかのウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系。６．キメラウサギの発生における使用のための、請求項１−５のいずれかのウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系。７．相同的または非相同的組換えによる遺伝子変化のための、請求項１−５のいずれかのウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系。８．生殖系列移転を経る遺伝子変化を有するウサギの発生のための、請求項１− ５のいずれかのウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系。９．（新規）遺伝子の研究または単離のための、請求項１−５のいずれかのウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系。１０．キメラウサギの発生のための、請求項１−５によるＥＳ細胞の使用。１１．受容体胞胚への胞胚注入、胚の集合または核の移転に続くキメラウサギの発生のための、請求項１０の使用。１２．相同的または非相同的組換えによる遺伝子変化のための、請求項１−５によるＥＳ細胞の使用。１３．生殖系列移転を経る遺伝子変化を有するウサギの発生のための、請求項１ −５によるＥＳ細胞の使用。１４．（新規）遺伝子の研究または単離のための、請求項１−５によるＥＳ細胞の使用または分化。１５．高グルコースDulbecco's Modified Eagle Medium、４mMのＬ−グルタミン、０.１mMの２−メルカプトエタノール、１４８単位／mlのペニシリンＧナトリウム、１４８μｇ／mlの硫酸ストレプトマイシン、４μｇ／mlのウシインスリン、１０³単位／mlのネズミ白血病阻害因子、２０％のウシ胎児血清、１.５％のＭＥＭ非必須アミノ酸溶液を含む、ウサギＥＳ培地。１６．リン酸塩緩衝液中に０.１％のコラゲナーゼ、１％のチキン血清および０. ０３％のトリプシン−ＥＤＴＡを含有する選択的トリプシン処理培地。１７．少なくとも７０％、好ましくは８０−９０％の未分化細胞を含有しており、そして受容体の胞胚中に注入した後にキメラウサギを発生する能力を有するウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系を産生する方法であって、交配５.５日後の胞胚の内部細胞塊を単離し、次いでそれらをウサギＥＳ培地において支持細胞上で培養して得られる工程を含む、方法。１８．ウサギＥＳ培地が、高グルコースDulbecco'ｓ Modified Eagle Medium、4 mMのＬ−グルタミン、０.１mMの２−メルカプトエタノール、１４８単位／mlのペニシリンＧナトリウム、１４８μｇ／mlの硫酸ストレプトマイシン、４μｇ／ mlのウシインスリン、１０³単位／mlのネズミ白血病阻害因子、２０％のウシ胎児血清、１.５％のＭＥＭ非必須アミノ酸溶液を含む、請求項１７の方法。１９．支持細胞が、１２.５日令のマウス胚から誘導されたマウス胚支持細胞であり、１０cmのペトリ皿につき３−４×１０⁶細胞の密度である、請求項１７または１８の方法。２０．ＥＳ細胞が種々の継代を経て培養され、そしてＥＳ細胞が各継代の前にリン酸塩緩衝溶液中に０.１％のコラゲナーゼ、１％のチキン血清および０.０３％のトリプシン−ＥＤＴＡを含有する選択的トリプシン処理培地でトリプシン処理される、請求項１７、１８または１９の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号９７２００１６８．９ (32)優先日平成９年１月22日(1997．1．22) (33)優先権主張国ヨーロッパ特許庁（ＥＰ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも７０％、好ましくは８０−９０％の未分化細胞を含有しており、および交配５.５日後の胞胚の内部細胞塊を単離し、次いでそれらをウサギＥＳ培地において支持細胞上で培養して得られる、ウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系。２．ウサギＥＳ培地が、高グルコースDulbecco's Modified Eagle Medium、４mM のＬ−グルタミン、０.１mMの２−メルカプトエタノール、１４８単位／mlのペニシリンＧナトリウム、１４８μｇ／mlの硫酸ストレプトマイシン、４μｇ／ml のウシインスリン、１０³単位／mlのネズミ白血病阻害因子、２０％のウシ胎児血清、１.５％のＭＥＭ非必須アミノ酸溶液を含む、請求項１のウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系。３．支持細胞が、１２.５日令のマウス胚から誘導されたマウス胚支持細胞であり、１０cmのペトリ皿につき３−４×１０⁶細胞の密度である、請求項１または２のウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系。４．ＥＳ細胞が種々の継代を経て培養され、そしてＥＳ細胞が各継代の前にリン酸塩緩衝溶液中に０.１％のコラゲナーゼ、１％のチキン血清および０.０３％のトリプシン−ＥＤＴＡを含有する選択的トリプシン処理培地でトリプシン処理される、請求項１、２または３のウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系。５．１０以上の継代後の三次元的コロニー形成、アルカリホスファターゼについてポジティブ着色、およびサイトケラチン１８およびヴィメンチンについてネガティブ着色を特徴とする、請求項１−４のいずれかのウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系。６．キメラウサギの発生における使用のための、請求項１−５のいずれかのウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系。７．相同的または非相同的組換えによる遺伝子変化のための、請求項１−５のいずれかのウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系。８．生殖系列移転を経る遺伝子変化を有するウサギの発生のための、請求項１− ５のいずれかのウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系。９．（新規）遺伝子の研究または単離のための、請求項１−５のいずれかのウサギ胚幹（ＥＳ）細胞系。１０．キメラウサギの発生のための、請求項１−５によるＥＳ細胞の使用。１１．受容体胞胚への胞胚注入、胚の集合または核の移転に続くキメラウサギの発生のための、請求項１０の使用。１２．相同的または非相同的組換えによる遺伝子変化のための、請求項１−５によるＥＳ細胞の使用。１３．生殖系列移転を経る遺伝子変化を有するウサギの発生のための、請求項１ −５によるＥＳ細胞の使用。１４．（新規）遺伝子の研究または単離のための、請求項１−５によるＥＳ細胞の使用または分化。１５．高グルコースDulbecco's Modified Eagle Medium、４mMのＬ−グルタミン、０.１mMの２−メルカプトエタノール、１４８単位／mlのペニシリンＧナトリウム、１４８μｇ／mlの硫酸ストレプトマイシン、４μｇ／mlのウシインスリン、１０³単位／mlのネズミ白血病阻害因子、２０％のウシ胎児血清、１.５％のＭＥＭ非必須アミノ酸溶液を含む、ウサギＥＳ培地。１６．リン酸塩緩衝液中に０.１％のコラゲナーゼ、１％のチキン血清および０. ０３％のトリプシン−ＥＤＴＡを含有する選択的トリプシン処理培地。