WO2012026491A1 - 多能性幹細胞の心筋分化促進剤 - Google Patents

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linear
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憲夫 中辻
志成 上杉
山田　耕平
南　一成
智美 尾辻
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国立大学法人京都大学
特定非営利活動法人幹細胞創薬研究所
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Definitions

  • the present invention relates to an agent for promoting differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes, a method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes, and a method for producing cardiomyocytes from pluripotent stem cells.
  • the method for inducing differentiation of pluripotent stem cells is the key to the realization of regenerative medicine and the establishment of in vitro drug efficacy evaluation tests or drug safety tests.
  • heart disease is currently the second leading cause of death among Japanese people, and is important for regenerative medicine and evaluation of heart disease efficacy.
  • cardiomyocytes since there are many drugs that cause serious side effects such as heart failure and arrhythmia on the heart, there is a need for a uniform supply of cardiomyocytes that can be used in cardiotoxicity tests.
  • END2 cells which are mouse-derived support cells, and human ES cells has been reported (Non-patent Document 1).
  • a method for obtaining uniform cardiomyocytes with high efficiency and low cost is required in the fields of regenerative medicine and drug discovery.
  • the present inventors examined the effect of promoting differentiation of monkey ES cells into cardiomyocytes for 9600 types of library compounds, and found that the low molecular compound N11474 has an effect of promoting myocardial differentiation. Furthermore, it has been found that the analog KY02111 obtained by the synthetic development of N11474 and its peripheral compounds have an effect of promoting myocardial differentiation, and the present invention has been completed.
  • R 1 to R 5 each independently represent a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a straight or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; a straight chain having 1 to 5 carbon atoms that is unsubstituted or substituted with a halogen atom.
  • a branched alkyl group a group —NR 12 R 13 (wherein R 12 and R 13 each independently represents a straight or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms substituted with a hydrogen atom, an oxygen atom, an unsubstituted group or a halogen atom) Wherein two adjacent R 1 —R 5 together form —O—CH 2 —O— or —O— (CH 2 ) 2 —O—.
  • R 6 to R 9 each independently represent a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; and a 1 to 5 carbon atom substituted with a group —C (O) A.
  • a straight-chain or branched alkoxy group (A is a saturated or unsaturated 5- or 6-membered ring which is unsubstituted or substituted with a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and the ring is a nitrogen atom, an oxygen atom, And 1 or 2 atoms independently selected from a sulfur atom); a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom; a group —NR 12 R 13 (R 12 and R 13 are each independently hydrogen atom, an oxygen atom, an unsubstituted or halogen atom substituted is a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms) is, wherein R 6 -O-C are two adjacent together among -R 9 2 -O- or -O- (CH 2) may form a 2 -O-, R 10 to R 11 are each independently
  • the present invention provides a method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes, comprising culturing the pluripotent stem cells in a medium containing the myocardial differentiation promoter.
  • the present invention provides a method for producing cardiomyocytes from pluripotent stem cells, comprising culturing the pluripotent stem cells in a medium containing the myocardial differentiation promoter.
  • the invention provides: Formula (I): [Where: R 1 , R 4 and R 5 are each independently a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 to 5 carbon atoms.
  • a group —NR 12 R 13 (wherein R 12 and R 13 are each independently a straight chain having 1 to 5 carbon atoms substituted by a hydrogen atom, an oxygen atom, an unsubstituted or halogen atom) Or a branched alkyl group).
  • R 2 and R 3 are straight or branched alkoxy groups having 1 to 5 carbon atoms, or R 2 and R 3 together represent —O—CH 2 —O— or —O— (CH 2 ).
  • R 6 to R 9 each independently represent a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; and a 1 to 5 carbon atom substituted with a group —C (O) A.
  • a straight-chain or branched alkoxy group (A is a saturated or unsaturated 5- or 6-membered ring which is unsubstituted or substituted with a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and the ring is a nitrogen atom, an oxygen atom, And 1 or 2 atoms independently selected from a sulfur atom); a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom; a group —NR 12 R 13 (R 12 and R 13 are each independently hydrogen atom, an oxygen atom, an unsubstituted or halogen atom substituted is a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms) is, wherein R Two adjacent groups of 6- R 9 together form —O—CH 2 -O- or -O- (CH 2 ) 2 -O- may be formed, R 10 to R 11 are each independently
  • pluripotent stem cells can be induced to differentiate into cardiomyocytes without using feeder cells, and pure cardiomyocytes can be obtained.
  • cardiomyocytes can be produced by inducing differentiation into cardiomyocytes with higher efficiency and lower cost than known methods.
  • the present invention relates to mass production of homogeneous and mature human cardiomyocytes used for high-throughput screening for QT prolongation tests important as drug safety tests, or for evaluation of drug efficacy against heart diseases, and transplanted cardiomyocytes for heart diseases etc.
  • myocardial differentiation promoting agent of the present invention is particularly useful in the production of Further, there is no molecular structure homology between the myocardial differentiation promoting agent of the present invention and the previously reported myocardial differentiation promoting factor, and the myocardial differentiation promoting agent of the present invention is a completely new type of myocardial differentiation promoting factor. Therefore, it is expected that the differentiation efficiency can be further enhanced by the combined use with other myocardial differentiation promoting factors.
  • a screening screening method for a myocardial differentiation promoting substance Screening system and detection of N11474. Structure-activity relationship between KY02111 and its peripheral compounds. Comparison of myocardial differentiation promoting effects of cytokines, G-CSF, nitrobin, N11474, KY02111, and KY01042. Synergistic effect of nitrobin and N11474 in promoting myocardial differentiation. Synergistic effect of nitrobin and KY02111 in promoting myocardial differentiation. N11474 myocardial differentiation promoting effect on human ES cells (increase in GFP expression). Compound (1) having an effect of promoting myocardial differentiation. Myocardial differentiation promoting effect of each compound. Effect of KY02111 on gene expression.
  • R 1 to R 5 each independently represent a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a straight or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; a straight chain having 1 to 5 carbon atoms that is unsubstituted or substituted with a halogen atom.
  • R 12 and R 13 are each independently a straight chain of 1 to 5 carbon atoms substituted with a hydrogen atom, an oxygen atom, or an unsubstituted or halogen atom, or Where two adjacent R 1 —R 5 together form —O—CH 2 —O— or —O— (CH 2 ) 2 —O—.
  • R 6 to R 9 each independently represent a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; and a 1 to 5 carbon atom substituted with a group —C (O) A.
  • a straight-chain or branched alkoxy group (A is a saturated or unsaturated 5- or 6-membered ring which is unsubstituted or substituted with a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and the ring is a nitrogen atom, an oxygen atom, And 1 or 2 atoms independently selected from a sulfur atom); a straight-chain or branched alkyl group of 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom; or a group —NR 12 R 13 (R 12 and R 13 each independently represents a hydrogen atom, an oxygen atom, or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom), Although in two adjacent of R 6 -R 9 together O-CH 2 -O- or -O- (CH 2) may form a 2 -O-, R 10 to R 11 are each independently
  • linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms examples include methoxy group, ethoxy group, propoxy group, isopropoxy group, butoxy group, isobutoxy group, sec-butoxy group, tert-butoxy group, and pentyloxy group. Can be mentioned.
  • Examples of the linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group, and a pentyl group. .
  • linear or branched acyl group having 1 to 5 carbon atoms examples include formyl group, acetyl group, propionyl group, butyryl group, isobutyryl group, valeryl group, and isovaleryl group.
  • each of R 1 to R 5 independently represents a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; or an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 carbon atom.
  • R 1 to R 5 independently represents a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; or an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 carbon atom.
  • R 2 and R 3 are preferably straight-chain or branched alkoxy groups having 1 to 5 carbon atoms, or together, —O—CH 2 —O— or —O— (CH 2 ) 2 —. O- is formed. More preferably, R 2 and R 3 are a methoxy group, an ethoxy group, or a propoxy group, and most preferably a methoxy group or an ethoxy group.
  • R 1 , R 4 and R 5 are preferably hydrogen atoms.
  • R 6 to R 9 each independently represent a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 to 5 carbon atoms; Or a group —NR 12 R 13 (wherein R 12 and R 13 each independently represents a hydrogen atom, an oxygen atom, or an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 to 5 carbon atoms) Where two adjacent R 6 —R 9 together are —O—CH 2 —O— or —O— (CH 2 ) 2 —O - May be formed.
  • R 6 and R 9 are preferably each independently a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; or an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 to 5 carbon atoms.
  • 5 is a linear or branched alkyl group, and more preferably a hydrogen atom.
  • R 7 represents a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; a linear or branched group having 1 to 5 carbon atoms substituted with a group —C (O) A.
  • An alkoxy group (A is a saturated or unsaturated 5- or 6-membered ring which is unsubstituted or substituted by a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and the ring is formed from a nitrogen atom, an oxygen atom, and a sulfur atom; 1 or 2 atoms independently selected); a linear or branched alkyl group of 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom; or a group —NR 12 R 13 (R 12 and R 13 are each independently a hydrogen atom, an oxygen atom, or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom, and R 8 is Hydrogen atom; halogen atom; hydroxyl group; carbon number 1 5 straight or branched alkoxy group; or unsubstituted or a straight-chain or branched alkyl group of
  • R 7 is a linear alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms substituted with a group —C (O) A, and the group —C (O) A is bonded to the terminal carbon atom of the alkoxy group. is doing.
  • A contains at least one nitrogen atom, and such A includes pyrrolidinyl, imidazolidinyl, pyrazolidinyl, pyrrolyl, imidazolyl, which is unsubstituted or substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
  • Pyrazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, piperidinyl, piperazinyl, morpholinyl, pyridyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, and pyridazinyl groups are examples of the group.
  • A is a piperidinyl group, piperazinyl group, or morpholinyl group that is unsubstituted or substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
  • A is a piperidin-1-yl group, piperazin-1-yl group, or morpholin-4-yl group which is unsubstituted or substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms. is there.
  • R 10 and R 11 are preferably a hydrogen atom.
  • X is an oxygen atom; a sulfur atom; a group —NR 15 (wherein R 15 is a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a linear or branched acyl group having 1 to 5 carbon atoms). Is). X is preferably a sulfur atom.
  • n is an integer from 0 to 4. In another preferred embodiment, n is an integer from 1 to 6, an integer from 1 to 4, or 2 or 3.
  • the myocardial differentiation promoter of the present invention comprises a compound selected from the following or a salt thereof: KY010104 T61164 KY02111 KY02114 KY01045 KY01040 KY02109 KY010104 KY01043 KY01046 PB2852 N11474 PB2572 PB2570 KY02104 SO087 SO102 SO096 SO094
  • the compounds of the present invention can be prepared by known methods (J. Med. Chem., 1965, 8 (5), pp 734-735) (included herein by reference) or according to the methods described in the Examples. Can be synthesized.
  • the term “pluripotent stem cell” means pluripotency capable of differentiating into all cells constituting an adult and self-replication capable of maintaining the pluripotency even after cell division. It means a cell having the ability.
  • the “pluripotent stem cell” includes embryonic stem cells (ES cells), embryonic germ cells (EG cells), and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • the species of “pluripotent stem cells” is not particularly limited, but is preferably a mammal, more preferably a rodent or a primate.
  • the present invention is particularly suitable for monkey or human pluripotent stem cells.
  • ES cells are pluripotent stem cells derived from early embryos, and can be established from the inner cell mass of blastocysts or epiblasts of early embryos after implantation.
  • ES cells include humans (Thomson J. A. et al., Science 282: 1145-1147 (1998), Biochem Biophys Res Commun. 345 (3), 926-32 (2006); primates such as rhesus monkeys and marmosets (Thomson J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848 (1995); Thomson J. A. et al., Biol. Reprod.
  • EG cells are pluripotent stem cells derived from primordial germ cells.
  • human EG cells (Shamblott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 7844-7848 (1995)) (this book by reference) Included in the specification).
  • iPS cell means a pluripotent stem cell derived from a cell other than a pluripotent stem cell such as a somatic cell or a tissue stem cell.
  • Methods for producing iPS cells include, for example, WO2007 / 069666, WO2009 / 006930, WO2009 / 006997, WO2009 / 007852, WO2008 / 118820, Cell Stem Cell 3 (5): 568-574 (2008), Cell Stem Cell 4 (5 ): 381-384 (2009), Nature 454: 646-650 (2008), Cell 136 (3): 411-419 (2009), Nature Biotechnology 26: 1269-1275 (2008), Cell Stem Cell 3: 475- 479 (2008), Nature Cell Biology 11: 197-203 (2009), Cell 133 (2): 250-264 (2008), Cell 131 (5): 861-72 (2007), Science 318 (5858): 1917 -20 (2007), which are hereby incorporated by reference.
  • cells produced by any method are included in the “i
  • the myocardial differentiation promoter of the present invention is added to the myocardial differentiation medium of pluripotent stem cells so that the final concentration of the active ingredient is, for example, 0.5 to 20 ⁇ M.
  • the myocardial differentiation medium is not particularly limited as long as it is a composition generally used for myocardial differentiation of pluripotent stem cells.
  • myocardial differentiation medium based on IMDM medium (the following are used in the examples) ), DMEM-based myocardial differentiation medium (DMEM / F12 medium (Sigma) 200 ml, fetal bovine serum (GIBCO) 50 ml, MEM non-essential amino acid solution (Sigma) 2.5 ml, penicillin-streptomycin (GIBCO) 2.5 ml, 200 mM L-glutamine 2.5 ml, 2-mercaptoethanol) or StemPro-34SFM (GIBCO) + BMP4 (10 ng / ml) is exemplified.
  • DMEM-based myocardial differentiation medium DMEM / F12 medium (Sigma) 200 ml, fetal bovine serum (GIBCO) 50 ml, MEM non-essential amino acid solution (Sigma) 2.5 ml, penicillin-streptomycin (GIBCO) 2.5 ml, 200 mM L-glutamine 2.5 ml, 2-
  • the timing of addition of the differentiation promoting agent of the present invention can be appropriately changed depending on the type of pluripotent stem cells used and the composition of the myocardial differentiation medium.
  • monkey or human ES cells are based on the IMDM medium described in the examples.
  • When culturing in the myocardial differentiation medium it may be added 6 to 14 days after the start of culture in the myocardial differentiation medium.
  • the myocardial differentiation promoting agent of the present invention may be used together with another myocardial differentiation promoting factor such as nitrobin, cytokine (combination of bFGF, BMP4, VEGF, DKK1 and activin A), Wnt signal inhibitor and the like.
  • the “myocardial differentiation promoting factor” in the present invention includes all substances having an effect of promoting myocardial differentiation. Therefore, the myocardial differentiation promoting agent of the present invention is also one of the “myocardial differentiation promoting factors”.
  • the “Wnt signal inhibitor” in the present invention means a substance that inhibits the Wnt signal pathway, and examples thereof include known compounds such as IWP2, XAV939, and IWR1, and proteins such as G-CSF, IGFBP4, and Dkk1.
  • the myocardial differentiation promoter of the present invention is also a useful “Wnt signal inhibitor” in the present invention. That is, the mode of using the myocardial differentiation promoter of the present invention and the Wnt signal inhibitor in combination includes a mode of using a plurality of types of myocardial differentiation promoter of the present invention.
  • another myocardial differentiation promoting factor used in combination has a different mechanism of action from the myocardial differentiation promoting agent of the present invention, and examples thereof include IWP2 and XAV939.
  • the timing of addition of another myocardial differentiation promoting factor can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the myocardial differentiation promoting factor used.
  • the present invention also provides a myocardial differentiation promoting kit comprising the myocardial differentiation promoting agent of the present invention.
  • the kit of the present invention may contain another myocardial differentiation promoting factor in addition to the myocardial differentiation promoting agent of the present invention.
  • the myocardial differentiation promoting agent of the present invention and another myocardial differentiation promoting factor may be stored in separate containers or in the same container.
  • the present invention also provides a method for inducing differentiation of cardiomyocytes and a method for producing cardiomyocytes.
  • the method of the present invention is characterized by culturing pluripotent stem cells in a medium containing the myocardial differentiation promoter of the present invention.
  • the method of the present invention comprises culturing pluripotent stem cells in a myocardial differentiation medium, and applying the myocardial differentiation promoter of the present invention as the final active ingredient on the 6th to 14th day after the start of culture in the myocardial differentiation medium. It is carried out by adding to a concentration of 0.5 to 20 ⁇ M and confirming the differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes on the 18th day of culture. Differentiation into cardiomyocytes can be confirmed by, for example, the number of beating cardiomyocytes and the expression level of ⁇ -MHC gene which is a myocardial differentiation marker.
  • myocardial differentiation promoting agent of the present invention in addition to the myocardial differentiation promoting agent of the present invention, another myocardial differentiation promoting factor may be added to the medium.
  • the cardiomyocytes obtained by the method of the present invention can be used for in vitro drug safety tests or as transplanted cardiomyocytes for heart diseases and the like.
  • R 1 , R 4 and R 5 are each independently a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 to 5 carbon atoms. Or a group —NR 12 R 13 (wherein R 12 and R 13 each independently represents a hydrogen atom, an oxygen atom, or an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 to 5 carbon atoms) A straight-chain or branched alkyl group).
  • R 2 and R 3 are straight or branched alkoxy groups having 1 to 5 carbon atoms, or R 2 and R 3 together represent —O—CH 2 —O— or —O— (CH 2 ).
  • R 6 to R 9 each independently represent a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; and a 1 to 5 carbon atom substituted with a group —C (O) A.
  • a straight-chain or branched alkoxy group (A is a saturated or unsaturated 5- or 6-membered ring which is unsubstituted or substituted with a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and the ring is a nitrogen atom, an oxygen atom, And 1 or 2 atoms independently selected from a sulfur atom); a straight-chain or branched alkyl group of 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom; or a group —NR 12 R 13 (R 12 and R 13 are each independently a hydrogen atom, an oxygen atom, or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom), in two adjacent of R 6 -R 9 is together - -CH 2 -O- or -O- (CH 2) may form a 2 -O-, R 10 to R 11 are each
  • R 1 , R 4 and R 5 are each independently a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; or unsubstituted or substituted with a halogen atom A straight-chain or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, preferably a hydrogen atom.
  • R 2 and R 3 are a methoxy group, an ethoxy group, or a propoxy group.
  • R 6 and R 9 are each independently a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; or an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 carbon atom.
  • R 7 represents a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; a linear or branched group having 1 to 5 carbon atoms substituted with a group —C (O) A.
  • An alkoxy group (A is a saturated or unsaturated 5- or 6-membered ring which is unsubstituted or substituted by a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and the ring is formed from a nitrogen atom, an oxygen atom, and a sulfur atom; 1 or 2 atoms independently selected); a linear or branched alkyl group of 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom; or a group —NR 12 R 13 (R 12 and R 13 are each independently a hydrogen atom, an oxygen atom, or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom, and R 8 is Hydrogen atom; halogen atom; hydroxyl group; carbon number 1 5 straight or branched alkoxy group; or unsubstituted or a straight-chain or branched alkyl group of
  • R 7 is a linear alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms substituted with a group —C (O) A, and the group —C (O) A is bonded to the terminal carbon atom of the alkoxy group. is doing.
  • A contains at least one nitrogen atom, and such A includes pyrrolidinyl, imidazolidinyl, pyrazolidinyl, pyrrolyl, imidazolyl, which is unsubstituted or substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
  • Pyrazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, piperidinyl, piperazinyl, morpholinyl, pyridyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, and pyridazinyl groups are examples of the group.
  • A is a piperidinyl group, piperazinyl group, or morpholinyl group that is unsubstituted or substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
  • A is a piperidin-1-yl group, piperazin-1-yl group, or morpholin-4-yl group which is unsubstituted or substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms. is there.
  • R 10 and R 11 are hydrogen atoms.
  • X is a sulfur atom.
  • n is an integer from 0 to 4. In another preferred embodiment, n is an integer from 1 to 6, an integer from 1 to 4, or 2 or 3.
  • the compounds of the invention are KY02114 SO087 SO102 SO096 SO094 It is.
  • GFP green fluorescent protein
  • monkey ES cells were seeded in a 6-well plate, and N11474, KY02111, KY01042 (final concentration of 10 ⁇ M each), G-CSF (final concentration of 5 ng / ml) were cultured on days 4 to 10 Nitrobin (final concentration 5 ⁇ M) was cultured on days 8 to 14, and cytokines (bFGF, BMP4, VEGF, DKK1, activin A) were cultured on days 1 to 14 (final concentrations of 5 ng / ml, 10 ng / ml, 10 ng / ml each). ml, 150 ng / ml, 3 ng / ml), and GFP expression was observed on the 14th day of culture.
  • cytokines bFGF, BMP4, VEGF, DKK1, activin A
  • nitrobin and KY02111 the synergistic effect on the myocardial differentiation promoting effect was examined.
  • KY02111 (5 ⁇ M) was administered on the 4th to 8th day of culture, nitrobin (1 ⁇ M) on the 8th to 12th day of culture, and GFP expression was observed on the 14th day of culture.
  • the increase in the expression level of GFP was about 3 times and about 30 times in the case of nitrobin or KY02111 administered alone compared to the control (DMSO), respectively, but the combination of nitrobin and KY02111 was about It was 50 times (FIG. 5-2, lower left graph).
  • the ratio of the number of GFP colonies was 22% and 73% when nitrobin or KY02111 was administered alone, respectively, but almost all (100%) colonies were positive for GFP fluorescence by the combined use of nitrobin and KY02111.
  • Fig. 5-2 lower right graph
  • the proportion of beating colonies was about 16% and 30% in the case of nitrobin or KY02111 alone, respectively, but 58% by the combined use of nitrobin and KY02111 (FIG. 5-2). , Bottom right graph).
  • KY02111 (5 ⁇ M) was administered for 3 days from 6 to 9 days after myocardial differentiation culture, and beating myocardial colonies were analyzed on the 9th day.
  • CMK6.4 monkey ES cells
  • Monkey ES cells were seeded in a 6-well plate, and KY02111, N11474 (final concentration of 10 ⁇ M each), IWP2 (final concentration of 10 ⁇ M), XAV939 (final concentration of 10 ⁇ M), IWR1 (final concentration of 10 ⁇ M), G-CSF (final concentration 5 ng / ml), IGFBP4 (final concentration 1 ⁇ g / ml), Dkk1 (final concentration 150 ng / ml), combination of cytokines (bFGF, BMP4, VEGF, DKK1, activin A on days 1-14 ) (Final concentrations of 5 ng / ml, 10 ng / ml, 10 ng / ml, 150 ng / ml, 3 ng / ml) were administered, and GFP expression was observed on the 14th day of culture.
  • the known Wnt signal inhibitor also showed a myocardial differentiation promoting effect, but KY02111 had the strongest myocardial
  • BIO Effect of Wnt signal activator on myocardial differentiation promoting effect
  • BIO As a Wnt signal activator on the myocardial differentiation promoting effect of KY02111, XAV939, and IWP2 was examined. Similar to (8) above, monkey ES cells were administered BIO (final concentration 5 ⁇ M) together with KY02111, XAV939, or IWP2 on the 4th to 10th day of culture, and GFP expression was observed on the 14th day of culture. As a result, BIO suppressed the myocardial differentiation effect of XAV939 and IWP2, but not the effect of KY02111 (FIG. 11).
  • KY02111 Reaction was performed in the same manner as described above using 3- (3,4-dimethoxyphenyl) propanoyl chloride (100 mg, 0.42 mmol) and 2-amino-6-chlorobenzothiazole (78 mg, 0.42 mmol) as substrates. 113 mg of 2- (3- (3,4-dimethoxyphenyl) propanamide) -6-chlorobenzothiazole was obtained in a yield of 72%.
  • KY02109 2- (3,4-Dimethoxyphenyl) acetyl chloride (100 mg, 0.51 mmol) and 2-amino-6-chlorobenzothiazole (94 mg, 0.51 mmol) were used as substrates and reacted in the same manner as above.
  • 153 mg of-(2- (3,4-dimethoxyphenyl) acetamido) -6-chlorobenzothiazole was obtained in a yield of 83%.
  • KY010104 Reaction was performed in the same manner as described above using 3- (3,4-dimethoxyphenyl) propanoyl chloride (100 mg, 0.5 mmol) and 2-amino-6-nitrobenzothiazole (105 mg, 0.57 mmol) as substrates. 138 mg of 2- (3- (3,4-dimethoxyphenyl) propanamide) -6-nitrobenzothiazole was obtained in a yield of 71%.
  • KY01046 Reaction was performed in the same manner as described above using 5- (3,4-dimethoxyphenyl) pentanoyl chloride (30 mg, 0.13 mmol) and 2-amino-6-nitrobenzothiazole (25 mg, 0.13 mmol) as substrates.
  • 2- (5- (3,4-dimethoxyphenyl) pentanamide) -6-nitrobenzothiazole 38 mg, yield 70% was obtained.
  • KY02104 2- (3,4-Dimethoxyphenyl) acetyl chloride (100 mg, 0.51 mmol) and 2-amino-6-fluorobenzothiazole (86 mg, 0.51 mmol) were used as substrates and reacted in the same manner as above. 157 mg of-(2- (3,4-dimethoxyphenyl) acetamido) -6-fluorobenzothiazole was obtained in a yield of 89%.
  • reaction solution was diluted with ethyl acetate and washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, distilled water, and saturated aqueous sodium chloride solution. After drying with sodium sulfate, the solvent was distilled off. Ethanol was added to the residue and refluxed, and recrystallization was performed to obtain 320 mg (yield 35%) of 2- (3- (3,4-dimethoxyphenyl) propanamide) -6-bromobenzothiazole.
  • reaction solution was diluted with ethyl acetate and washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, distilled water, and saturated aqueous sodium chloride solution. After drying with sodium sulfate, the solvent was distilled off. Ethanol was added to the residue and the mixture was refluxed and recrystallized to obtain 447 mg of ethyl 4-((2- (3- (3,4-dimethoxyphenyl) propanamido) benzothiazol-6-yl) oxy) butanoate, yield Obtained at 76%.
  • reaction solution was diluted with ethyl acetate and washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, distilled water, and saturated aqueous sodium chloride solution. After drying with sodium sulfate, the solvent was distilled off. Ethanol was added to the residue and the mixture was refluxed and recrystallized to give 3- (3,4-dimethoxyphenyl) -N- (6- (4-morpholino-4-oxobutoxy) benzothiazol-2-yl) propanamide. Obtained in 50 mg, 43% yield.

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Abstract

　本発明は、下記式（Ｉ）の化合物またはその塩を含む、多能性幹細胞の心筋細胞への分化促進剤、および多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導方法ならびに心筋細胞の製造方法に関する。

Description

多能性幹細胞の心筋分化促進剤
　本発明は、多能性幹細胞の心筋細胞への分化促進剤、多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する方法、および多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法に関する。
　多能性幹細胞の分化誘導方法は、再生医療の実現やインビトロでの薬効評価試験、あるいは薬剤安全性試験の確立の鍵を握るものである。特に、心疾患は現在日本人の死亡原因の第二位であり、再生医療や心疾患薬効評価については重要である。また心臓に対して心不全や不整脈など重篤な副作用を引き起こす薬物が多いことから、心毒性試験に用いることのできる均一な心筋細胞の供給が求められている。これまで、ヒトＥＳ細胞を心筋細胞へ分化させる手法として、マウス由来の支持細胞であるＥＮＤ２細胞とヒトＥＳ細胞を共培養する方法が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、その分化効率は十分ではなく、またマウス由来のＥＮＤ２細胞がヒト心筋細胞に混入しやすいため、純粋なヒト心筋細胞が得られにくいという問題がある。また、他の手法として、ＥＳ細胞から胚様体を形成し、そこに数種類のサイトカイン（維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、骨形態形成タンパク４（ＢＭＰ４）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、Dickkopf-1 （ＤＫＫ１）、アクチビンＡ）を添加し、心筋細胞への分化を誘導する方法も報告されている（非特許文献２、３）。しかしながら、この方法は大量のサイトカインを必要とするためコストがかかる上、その分化効率も十分ではない。
Mummery, C., et al., Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107(21),  2733-40 (2003). Yang, L., et al., Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453(7194),  524-8 (2008). Leschik, J., et al., Cardiac commitment of primate embryonic stem cells. Nat Protoc. 3(9),  1381-7 (2008).
　以上の文献は引用により本明細書に含まれる。
　高効率かつ低コストにて均一な心筋細胞を得る方法が、再生医療や創薬の分野において必要とされている。
　本発明者らは、９６００種類のライブラリー化合物について、サルＥＳ細胞から心筋細胞への分化促進効果を検討し、低分子化合物Ｎ１１４７４が心筋分化促進効果を有することを見出した。さらに、Ｎ１１４７４の合成展開によって得られた類縁体ＫＹ０２１１１およびその周辺化合物に心筋分化促進効果が認められることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、
　式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 ［式中、
　Ｒ１－Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１－Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
　Ｒ６－Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６－Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
　Ｒ１０－Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、
　Ｘは、－ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基、非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；基－ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基、炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
　ｎは、０から６の整数である］
の化合物またはその塩を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進剤を提供する。
　別の態様において、本発明は、前記心筋分化促進剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する方法を提供する。
　別の態様において、本発明は、前記心筋分化促進剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法を提供する。
　別の態様において、本発明は、
　式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 ［式中、
　Ｒ１、Ｒ４及びＲ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）である、
　Ｒ２及びＲ３は、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基である、又はＲ２及びＲ３は、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成している、
　Ｒ６－Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）である、ここでＲ６－Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－又は－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
　Ｒ１０－Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、
　Ｘは、酸素原子；硫黄原子；基－ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基、炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
　ｎは、０から６の整数である、但し、ｎが１又は２のとき、Ｒ７はＣｌ及びメトキシ基ではなく、Ｒ２はメトキシ基ではない］
　を有する化合物またはその塩を提供する。
　本発明により、支持細胞を使用することなく、多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導し、純粋な心筋細胞を得ることが可能となった。また、本発明により、既知の方法と比較して高効率かつ低コストに心筋細胞への分化を誘導し、心筋細胞を製造することが可能となった。本発明は、薬剤安全性試験として重要なＱＴ延長試験をハイスループットスクリーニングで行うため、あるいは心疾患に対する薬効評価に用いる均一かつ成熟したヒト心筋細胞の大量生産や、心臓疾患などに対する移植用心筋細胞の生産に特に有用である。また、本発明の心筋分化促進剤とこれまで報告されていた心筋分化促進因子との間には分子構造の相同性がなく、本発明の心筋分化促進剤は全く新たなタイプの心筋分化促進因子と考えられるため、他の心筋分化促進因子との併用によりさらに分化効率を高めることができると期待される。
心筋分化促進物質の探索スクリーニング方法。 スクリーニングシステムとＮ１１４７４の検出。 ＫＹ０２１１１とその周辺化合物の構造活性相関。 サイトカイン、Ｇ－ＣＳＦ、ニトロビン、Ｎ１１４７４、ＫＹ０２１１１、およびＫＹ０１０４２の心筋分化促進効果の比較。 心筋分化促進におけるニトロビンとＮ１１４７４の相乗効果。 心筋分化促進におけるニトロビンとＫＹ０２１１１の相乗効果。 Ｎ１１４７４のヒトＥＳ細胞に対する心筋分化促進効果（ＧＦＰ発現量の増加）。 心筋分化促進効果を有する化合物（１）。 各化合物の心筋分化促進効果。 遺伝子発現に対するＫＹ０２１１１の効果。 遺伝子発現に対するＷｎｔシグナル阻害剤とＷｎｔシグナル活性化剤の効果（１）。 遺伝子発現に対するＷｎｔシグナル阻害剤とＷｎｔシグナル活性化剤の効果（２）。 ＫＹ０２１１１、Ｎ１１４７４、既知のＷｎｔシグナル阻害剤（ＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ１）、および心筋分化促進効果が知られるタンパク質（Ｇ－ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ４、Ｄｋｋ１、サイトカイン）の心筋分化促進効果の比較。 ＫＹ０２１１１、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＰ２の心筋分化促進効果に対するＷｎｔシグナル活性化剤の効果（サルＥＳ細胞由来心筋細胞）。 ＫＹ０２１１１、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＰ２の心筋分化促進効果に対するＷｎｔシグナル活性化剤の効果（ヒトｉＰＳ細胞）。 心筋分化促進におけるＫＹ０２１１１とＸＡＶ９３９またはＩＷＰ２との相乗効果。 心筋分化促進効果を有する化合物（２）および各化合物の心筋分化促進効果。
　本発明は、
　式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 ［式中、
　Ｒ１－Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１－Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
　Ｒ６－Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６－Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
　Ｒ１０－Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、
　Ｘは、－ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基、非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；又は基－ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
　ｎは、０から６の整数である］。
の化合物またはその塩を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進剤を提供する。
　炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ－ブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ペンチルオキシ基が挙げられる。
　炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基が挙げられる。
　炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基としては、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基が挙げられる。
　ハロゲン原子としては、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＦが挙げられる。
　好ましい態様において、Ｒ１－Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基であり、ここでＲ１－Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい。
　Ｒ２及びＲ３は、好ましくは、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基であるか、又は、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成している。さらに好ましくは、Ｒ２及びＲ３は、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、最も好ましくはメトキシ基又はエトキシ基である。
　Ｒ１、Ｒ４及びＲ５は、好ましくは、水素原子である。
　ある態様において、Ｒ６－Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐のアルキル基である）であり、ここでＲ６－Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい。
　Ｒ６及びＲ９は、好ましくは、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基であり、より好ましくは、水素原子である。
　好ましい態様において、Ｒ７は、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）であって、Ｒ８は、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基であるか、又は、Ｒ７及びＲ８は、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成している。
　ある態様において、Ｒ７は、基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖アルコキシ基であり、基－Ｃ（Ｏ）Ａは前記アルコキシ基の末端の炭素原子に結合している。
　好ましい態様において、Ａは窒素原子を少なくとも１つ含み、そのようなＡとしては、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、及びピリダジニル基が例示される。より好ましい態様において、Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジニル基、ピペラジニル基、又はモルホリニル基である。さらに好ましい態様において、Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジン－１－イル基、ピペラジン－１－イル基、又はモルホリン－４－イル基である。
　Ｒ１０及びＲ１１は、好ましくは、水素原子である。
　好ましい態様において、Ｘは、酸素原子；硫黄原子；基－ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基、炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基である）である。Ｘは、好ましくは、硫黄原子である。
　好ましい態様において、ｎは、０から４の整数である。別の好ましい態様において、ｎは、１から６の整数、１から４の整数、又は２若しくは３である。
　好ましい態様において、本発明の心筋分化促進剤は、以下から選択される化合物またはその塩を含む：
　ＫＹ０１０４１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 　Ｔ６１１６４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 　ＫＹ０２１１１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 　ＫＹ０２１１４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 　ＫＹ０１０４５
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 　ＫＹ０１０４０
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 　ＫＹ０２１０９
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 　ＫＹ０１０４２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 　ＫＹ０１０４３
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 　ＫＹ０１０４６
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 　ＰＢ２８５２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 　Ｎ１１４７４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 　ＰＢ２５７２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 　ＰＢ２５７０
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
 　ＫＹ０２１０４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
 　ＳＯ０８７
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
 　ＳＯ１０２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 　ＳＯ０９６
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 　ＳＯ０９４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
　本発明の化合物は、例えば、J. Med. Chem., 1965, 8 (5), pp 734-735（引用により本明細書に含まれる）に記載されている（Ｎ１１４７４、Ｔ６１１６４)。また、UkrOrgSynthesis社（ＰＢ２８５２、ＰＢ２５７２、ＰＢ２５７０）やENAMINE社（Ｔ６１１６４）などから入手可能である。
　本発明の化合物は、公知の方法（J. Med. Chem., 1965, 8 (5), pp 734-735）（引用により本明細書に含まれる）により、あるいは実施例に記載の方法に準じて、合成することができる。
　本発明において「多能性幹細胞」とは、成体を構成する全ての細胞に分化することができる多分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）と、細胞分裂を経てもその多分化能を維持することができる自己複製能を有する細胞を意味する。「多能性幹細胞」には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が含まれる。「多能性幹細胞」の生物種は特に限定はされないが、好ましくは哺乳類であり、より好ましくは齧歯類または霊長類である。本発明は、サルまたはヒト多能性幹細胞に特に好適である。
　ＥＳ細胞は、初期胚に由来する多能性幹細胞であり、胚盤胞の内部細胞塊または着床後の初期胚のエピブラストから樹立することができる。ＥＳ細胞としては、ヒト（Thomson J. A. et al., Science 282: 1145-1147 (1998) 、Biochem Biophys Res Commun. 345(3),  926-32 (2006)；アカゲザルおよびマーモセット等の霊長類（Thomson J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848 (1995）；Thomson J. A. et al., Biol. Reprod. 55: 254-259 (1996)）；ウサギ（特表２０００－５０８９１９号）；ハムスター（Doetshman T. et al., Dev. Biol. 127: 224-227 (1988)）、ブタ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125128 (1990); Piedrahita J.A. et al., Theriogenology 34: 879-891 (1990); Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. 40: 51-56 (1990); Talbot N. C. et al., Cell. Dev. Biol. 29A: 546-554 (1993)）、ヒツジ（Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. Suppl. 43: 255-260 (1991)）、ウシ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125-128 (1990); Saito S. et al., Roux. Arch. Dev. Biol. 201: 134-141 (1992)）、ミンク（Sukoyan M. A. et al., Mol. Reorod. Dev. 33: 418-431 (1993)） などのＥＳ細胞が挙げられる（これら文献は引用により本明細書に含まれる）。
　ＥＧ細胞は、始原生殖細胞に由来する多能性幹細胞であり、例えば、ヒトＥＧ細胞（Shamblott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 7844-7848 (1995)) （引用により本明細書に含まれる）が挙げられる。
　本発明において「ｉＰＳ細胞」とは、体細胞や組織幹細胞などの多能性幹細胞以外の細胞から誘導された多能性幹細胞を意味する。ｉＰＳ細胞の作製方法は、例えば、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００８／１１８８２０、Cell Stem Cell 3(5): 568-574 (2008) 、Cell Stem Cell 4(5): 381-384 (2009)、Nature 454: 646-650 (2008) 、Cell 136(3) :411-419 (2009) 、Nature Biotechnology 26: 1269-1275 (2008) 、Cell Stem Cell 3: 475-479 (2008) 、Nature Cell Biology 11: 197-203 (2009) 、Cell 133(2): 250-264 (2008)、Cell 131(5): 861-72 (2007)、Science 318 (5858): 1917-20 (2007)（これら文献は引用により本明細書に含まれる）に記載される。しかしながら、人工的に誘導された多能性幹細胞であれば、いかなる方法で作製された細胞も本発明の「ｉＰＳ細胞」に含まれる。
　本発明の心筋分化促進剤は、多能性幹細胞の心筋分化培地に、活性成分の最終濃度が例えば０.５～２０μＭとなるよう添加される。心筋分化培地は、一般的に多能性幹細胞の心筋分化に使用される組成であればよく、特に限定はされないが、例えばＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地(実施例で使用している下記の組成のもの)、ＤＭＥＭを基本とした心筋分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Sigma）２００ｍｌ、ウシ胎児血清（GIBCO）５０ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution （Sigma）２．５ｍｌ、ペニシリン－ストレプトマイシン（GIBCO）２．５ｍｌ、２００ｍＭ　Ｌ－グルタミン　２．５ｍｌ、２－メルカプトエタノール）、またはStemPro-34SFM（GIBCO）＋ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）のような培地が例示される。本発明の分化促進剤を使用する場合、ＥＮＤ２細胞のような支持細胞を使用する必要がない。本発明の分化促進剤の添加の時期は、使用する多能性幹細胞の種類や心筋分化培地の組成により適宜変更されうるが、例えばサルまたはヒトＥＳ細胞を実施例に記載のＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地で培養する場合、心筋分化培地での培養開始後６～１４日目に添加すればよい。
　本発明の心筋分化促進剤は、ニトロビン、サイトカイン（bＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１およびアクチビンＡの組み合わせ）、Ｗｎｔシグナル阻害剤などの別の心筋分化促進因子と共に使用してもよい。本発明における「心筋分化促進因子」には、心筋分化促進効果を有するあらゆる物質が含まれ、それゆえ本発明の心筋分化促進剤もまた「心筋分化促進因子」の一つである。本発明における「Ｗｎｔシグナル阻害剤」とは、Ｗｎｔシグナル経路を阻害する物質を意味し、例えばＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ１などの既知の化合物、およびＧ－ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ４、Ｄｋｋ１などのタンパク質が挙げられる。本発明の心筋分化促進剤もまた、本発明における有用な「Ｗｎｔシグナル阻害剤」である。すなわち、本発明の心筋分化促進剤とＷｎｔシグナル阻害剤とを併用する態様には、複数種類の本発明の心筋分化促進剤を使用する態様が含まれる。好ましくは、併用する別の心筋分化促進因子は、本発明の心筋分化促進剤と作用機序の異なるものであり、例えばＩＷＰ２やＸＡＶ９３９が挙げられる。別の心筋分化促進因子の添加の時期は、使用する心筋分化促進因子に応じて当業者が適宜決定可能である。
　本発明はまた、本発明の心筋分化促進剤を含む心筋分化促進用キットを提供する。本発明のキットは、本発明の心筋分化促進剤に加えて別の心筋分化促進因子を含んでもよい。本発明の心筋分化促進剤と別の心筋分化促進因子とは、別々の容器に保存されていても、同一の容器に保存されていてもよい。
　本発明はまた、心筋細胞の分化誘導方法および心筋細胞の製造方法を提供する。本発明の方法は、本発明の心筋分化促進剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを特徴とする。ある態様において、本発明の方法は、多能性幹細胞を心筋分化培地中で培養すること、心筋分化培地での培養開始後６～１４日目に本発明の心筋分化促進剤を活性成分の最終濃度が０.５～２０μＭとなるよう添加すること、および培養１８日目に多能性幹細胞の心筋細胞への分化を確認することにより実施される。心筋細胞への分化は、例えば、拍動心筋細胞の数、心筋分化マーカーであるα－ＭＨＣ遺伝子の発現量により確認することができる。
　本発明の方法では、本発明の心筋分化促進剤に加えて、さらに別の心筋分化促進因子を培地に添加してもよい。
　本発明の方法により得られた心筋細胞は、インビトロにおける薬剤安全性試験に、あるいは心臓疾患などに対する移植用心筋細胞として、使用することができる。
　本発明はまた、
　式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 ［式中、
　Ｒ１、Ｒ４及びＲ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）である、
　Ｒ２及びＲ３は、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基である、又はＲ２及びＲ３は、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成している、
　Ｒ６－Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）である、ここでＲ６－Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－又は－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
　Ｒ１０－Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、
　Ｘは、酸素原子；硫黄原子；又は基－ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
　ｎは、０から６の整数である、但し、ｎが１又は２のとき、Ｒ７はＣｌ及びメトキシ基ではなく、Ｒ２はメトキシ基ではない］
　を有する化合物またはその塩を提供する。
　好ましい態様において、Ｒ１、Ｒ４及びＲ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基であり、好ましくは、水素原子である。
　好ましい態様において、Ｒ２及びＲ３は、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である。
　好ましい態様において、Ｒ６及びＲ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基であり、好ましくは、水素原子である。
　好ましい態様において、Ｒ７は、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）であって、Ｒ８は、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基であるか、又は、Ｒ７及びＲ８は、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成している。
　ある態様において、Ｒ７は、基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖アルコキシ基であり、基－Ｃ（Ｏ）Ａは前記アルコキシ基の末端の炭素原子に結合している。
　好ましい態様において、Ａは窒素原子を少なくとも１つ含み、そのようなＡとしては、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、及びピリダジニル基が例示される。より好ましい態様において、Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジニル基、ピペラジニル基、又はモルホリニル基である。さらに好ましい態様において、Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジン－１－イル基、ピペラジン－１－イル基、又はモルホリン－４－イル基である。
　好ましい態様において、Ｒ１０及びＲ１１は、水素原子である、
　好ましい態様において、Ｘは、硫黄原子である。
　好ましい態様において、ｎは、０から４の整数である。別の好ましい態様において、ｎは、１から６の整数、１から４の整数、又は２若しくは３である。
　好ましい態様において、本発明の化合物は、
　ＫＹ０２１１４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 　ＳＯ０８７
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 　ＳＯ１０２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 　ＳＯ０９６
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 　ＳＯ０９４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 　である。
　本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。
（１）ライブラリー化合物のスクリーニング
　図１に示すように、サルＥＳ細胞の心筋分化を促進する物質の探索スクリーニングを実施した。サルＥＳ細胞株（カニクイザルＣＭＫ６．４株）に、心筋分化マーカーであるα－ＭＨＣ遺伝子のプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するベクターを導入し、９６ウェルプレート（Greiner/655090：96穴FIAブラックプレート）上に５．０×１０３細胞/ウェルにて播種し、ＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地（ＩＭＤＭ培地（Sigma l3390）２００ｍｌ、ウシ胎児血清（GIBCO 10099-141）５０ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution （Sigma M7145）２．５ｍｌ、ペニシリン－ストレプトマイシン（GIBCO 15140）２．５ｍｌ、２００ｍＭ　Ｌ－グルタミン　２．５ｍｌ、２－メルカプトエタノール（Sigma M7522）　２μｌ、５Ｎ　ＮａＯＨ　２５５μｌを混合したもの）で１４日間培養した。培養後６～１４日に、９６００種類のライブラリー化合物を、１ウェルあたり１化合物（約１～５μＭ）投与した。培養後１４日に、ＨＣＳ（high contents screening）システム（モレキュラーデバイス/MetaMorph イメージングシステム）を用いてＧＦＰ発現量を測定した。その結果、低分子化合物Ｎ１１４７４を投与したウェルのＧＦＰ発現量が高い値を示し、Ｎ１１４７４が心筋分化促進効果を有することが明らかとなった（図２）。
（２）ＫＹ０２１１１およびその周辺化合物の構造活性相関
　心筋分化促進効果を有することが示されたＮ１１４７４の類縁体ＫＹ０２１１１およびその周辺化合物を合成し、これらの心筋分化促進効果を検討した。サルＥＳ細胞を６ウェルプレート（旭硝子/ 5816-006 ：Ezview カルチャープレート）に４．０×１０５細胞/ウェルにて播種し、培養４～１０日目に最終濃度が１０μＭとなるように各化合物を投与し、培養１４日目にＧＦＰ発現を観察した。その結果、化合物の分子構造に対応して、ＧＦＰ発現量の顕著な増加が見られた（図３）。また、心筋分化促進効果は、ジメトキシフェニル基に結合する炭素鎖の長さと相関することが示唆された（図３）。
（３）ニトロビンおよびサイトカインとの比較
　心筋分化促進因子として報告されているサイトカイン（bＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、アクチビンＡ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、および本発明者らが心筋分化促進効果を有することを見出したニトロビンと、本発明の化合物の心筋分化促進効果をＧＦＰ発現量の増加で比較した。上記（２）と同様にして、６ウェルプレートにサルＥＳ細胞を播種し、培養４～１０日目に、Ｎ１１４７４、ＫＹ０２１１１、ＫＹ０１０４２（最終濃度各１０μＭ）、Ｇ－ＣＳＦ（最終濃度５ｎｇ／ｍｌ）、培養８～１４日目にニトロビン（最終濃度５μＭ）を、培養１～１４日目にサイトカイン（bＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、アクチビンＡ）（最終濃度各５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ）を投与し、培養１４日目にＧＦＰ発現を観察した。その結果、Ｎ１１４７４、ＫＹ０２１１１、およびＫＹ０１０４２は、サイトカイン（約３００％）やＧ－ＣＳＦ（約２５０％）、ニトロビン（約４００％）よりもはるかに高いＧＦＰ発現量の増加（Ｎ１１４７４＝１０００％、ＫＹ０２１１１＝７４００％、ＫＹ０１０４２＝７０００％）を示した（図４）。
（４）ニトロビンとの相乗効果
　ニトロビンとＮ１１４７４について、心筋分化促進効果における相乗効果を調べた。Ｎ１１４７４（１０μＭ）を培養４～１０日目に、ニトロビン（３μＭ）を培養８～１４日目に投与し、培養１４日目にＧＦＰ発現を観察した。その結果、ＧＦＰ発現量の増加は、ニトロビンまたはＮ１１４７４の単独投与の場合約３～４倍であったのに対して、ニトロビンとＮ１１４７４を併用することで約９倍となった（図５－１、左グラフ）。また、ＧＦＰコロニー数の割合は、ニトロビンまたはＮ１１４７４の単独投与の場合約３～４割の増加であったのに対して、ニトロビンとＮ１１４７４の併用により約８割の増加となった（図５－１、右グラフ）。
　同様に、ニトロビンとＫＹ０２１１１について、心筋分化促進効果における相乗効果を調べた。ＫＹ０２１１１（５μＭ）を培養４～８日目に、ニトロビン（１μＭ）を培養８～１２日目に投与し、培養１４日目にＧＦＰ発現を観察した。その結果、ＧＦＰ発現量の増加は、コントロール（ＤＭＳＯ）に比べニトロビンまたはＫＹ０２１１１の単独投与の場合、それぞれ約３倍、約３０倍であったのに対して、ニトロビンとＫＹ０２１１１を併用することで約５０倍となった（図５－２、左下グラフ）。また、ＧＦＰコロニー数の割合は、ニトロビンまたはＫＹ０２１１１の単独投与の場合、それぞれ２２％、７３％であったのに対して、ニトロビンとＫＹ０２１１１の併用によりほぼすべて（１００％）のコロニーがＧＦＰ蛍光陽性となった（図５－２、右下グラフ）。さらに、拍動コロニーの割合についても、ニトロビンまたはＫＹ０２１１１の単独投与の場合、それぞれ約１６％、３０％であったのに対して、ニトロビンとＫＹ０２１１１の併用により５８％となった（図５－２、右下グラフ）。
（５）サル、ヒト、マウスＥＳ細胞およびヒトｉＰＳ細胞における心筋分化促進効果
　Ｎ１１４７４およびＫＹ０２１１１について、各種ＥＳ／ｉＰＳ細胞での心筋分化促進効果を、ＧＦＰ発現量と拍動コロニー数を指標に確認した。ヒトＥＳ細胞株（Ｋｈ－１株）（Suemori, H., et al., Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochem Biophys Res Commun. 345(3), 926-32 (2006)）（引用により本明細書に含まれる）を６ウェルプレート（旭硝子／　５８１６－００６　：Ｅｚｖｉｅｗ　カルチャープレート）に１．２×１０６細胞／ウェルにて播種し、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）を培養後０～４日目まで投与し、Ｎ１１４７４（１０μＭ）またはＫＹ０２１１１（５μＭ）を培養後４～１４日目まで投与し、２２日間培養した。ヒトｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１、ＩＭＲ９０－１、ＩＭＲ９０－４、ＲＣＨＩＰＣ０００３）（Takahashi, K., et al., Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131(5), 861-72 (2007); Yu, J., et al., Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318(5858), 1917-20 (2007).）（これら文献は引用により本明細書に含まれる）については、ヒトＥＳ細胞と同じ方法で心筋分化培養を行った。マウスＥＳ細胞（Ｒ１）からの心筋分化方法は、文献（ Transient inhibition of BMP signaling by Noggin induces cardiomyocyte differentiation of mouse embryonic stem cells.Yuasa S, Itabashi Y, Koshimizu U, Tanaka T, Sugimura K, Kinoshita M, Hattori F, Fukami S, Shimazaki T, Ogawa S, Okano H, Fukuda K.Nat Biotechnol. 2005 May;23(5):607-11. Epub 2005 May 1. Erratum in: Nat Biotechnol. 2005 Jul;23(7):897. ）（引用により本明細書に含まれる）に従って行った。心筋分化培養後６～９日目までの３日間、ＫＹ０２１１１（５μＭ）を投与し、９日目に拍動心筋コロニーを解析した。サルＥＳ細胞（ＣＭＫ６．４）については、上記（２）と同様にして心筋分化培養を行った。
　その結果、培養１４日以降、ＧＦＰ発現量の顕著な増加が観察された（図６）。また、拍動コロニー数についても、サルＥＳ細胞（ＣＭＫ６．４）、マウスＥＳ細胞（Ｒ１）、ヒトＥＳ細胞（Ｋｈ－１）、およびヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１、ＩＭＲ９０－１、ＩＭＲ９０－４、ＲＣＨＩＰＣ０００３）において、Ｎ１１４７４、ＫＹ０２１１１の投与により最大約６０倍もの顕著な増加が観察された（表１）。以上のとおり、これら化合物はヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞においても強い心筋分化促進効果を有することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000055
（６）その他の活性化合物（１）
　上記（２）と同様にして、さらに幾つかの周辺化合物が心筋分化促進効果を有することを見出した（図７）。
　（７）作用機序の検討
　本発明の化合物の作用機序を調べるため、ヒトｉＰＳ細胞を上記（１）記載の心筋分化培地へ播種し、培養３日目にＤＭＳＯまたはＫＹ０２１１１（１０μＭ）を添加し、添加後１２時間および２４時間の遺伝子発現をＤＮＡアレイにより調べた。その結果、以下の遺伝子の発現がＫＹ０２１１１の添加により低下することがわかった：（１２時間後最も発現が低下した遺伝子から順に）ＨＯＸＡ１、ＭＳＧＮ１、ＮＫＤ１、Ｔ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＤＫＫ１、ＤＫＫ４、ＣＤＸ２、ＭＳＸ１、ＮＯＤＡＬ、ＦＧＦ４、ＰＡＰＰＡ、ＰＲＲＸ１、ＬＲＡＴ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＡＸＩＮ２、ＬＧＬ１、ＳＰ５、ＭＩＸＬ１、ＡＰＣＤＤ１、ＤＳＥＬ。ＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子認識配列を用いたプロモーター解析を行ったところ、これら遺伝子にはＷｎｔシグナル経路の下流で機能する遺伝子が多く含まれていることがわかった。これら遺伝子の一部（ＭＳＧＮ１、ＨＯＸＡ１、Ｔ、Ｄｋｋ１、ＦＧＦ４）について、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により発現を確認したところ、いずれの遺伝子についてもＤＮＡアレイと同様の結果が得られた（図８）。
　次に、ＫＹ０２１１１の添加により発現が低下することが明らかとなった遺伝子群の発現に対する、ＫＹ０２１１１、既知のＷｎｔシグナル阻害剤であるＸＡＶ９３９およびＩＷＰ－２、ならびにＷｎｔシグナル活性化剤であるＢＩＯの効果を、定量的ＰＣＲにより調べた。検討した遺伝子は以下のとおりである：ＭＳＧＮ１、ＨＯＸＡ１；Ｔ、ＭＩＸＬ１；Ｄｋｋ１、ＡＸＩＮ２；ＮＯＤＡＬ、ＦＧＦ４（すべてＷｎｔシグナル標的遺伝子として報告されている）。その結果、これら遺伝子の発現は、ＫＹ０２１１１、ＸＡＶ９３９およびＩＷＰ－２のいずれの化合物によっても低下し、反対にＷｎｔシグナル活性化剤であるＢＩＯによって増加した（図９）。
　以上の結果は、ＤＮＡアレイにおいてＫＹ０２１１１の添加により発現低下が観察された遺伝子群がＷｎｔシグナル経路の下流の遺伝子であること、および、ＫＹ０２１１１がＷｎｔシグナル阻害剤であることを示唆している。
　（８）心筋分化促進効果の比較
　上記（２）と同様にして、ＫＹ０２１１１およびＮ１１４７４と、既知のＷｎｔシグナル阻害剤（ＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ１）および心筋分化促進効果が知られるタンパク質（Ｇ－ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ４、Ｄｋｋ１、サイトカイン（bＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、アクチビンＡの組み合わせ））との心筋分化促進効果を比較した。６ウェルプレートにサルＥＳ細胞を播種し、培養４～１０日目に、ＫＹ０２１１１、Ｎ１１４７４（最終濃度各１０μＭ）、ＩＷＰ２（最終濃度１０μＭ）、ＸＡＶ９３９（最終濃度１０μＭ）、ＩＷＲ１（最終濃度１０μＭ）、Ｇ－ＣＳＦ（最終濃度５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＧＦＢＰ４（最終濃度１μｇ／ｍｌ）、Ｄｋｋ１（最終濃度１５０ｎｇ／ｍｌ）、培養１～１４日目にサイトカイン（bＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、アクチビンＡの組み合わせ）（最終濃度各５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ）を投与し、培養１４日目にＧＦＰ発現を観察した。その結果、既知のＷｎｔシグナル阻害剤も心筋分化促進効果を示したが、ＫＹ０２１１１の心筋分化効果が最も強かった（図１０）。
　（９）心筋分化促進効果に対するＷｎｔシグナル活性化剤の効果
　ＫＹ０２１１１、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＰ２の心筋分化促進効果に対するＷｎｔシグナル活性化剤であるＢＩＯの効果を検討した。上記（８）と同様にして、サルＥＳ細胞に、培養４～１０日目にＫＹ０２１１１、ＸＡＶ９３９、またはＩＷＰ２とともにＢＩＯ（最終濃度５μＭ）を投与し、培養１４日目にＧＦＰ発現を観察した。その結果、ＢＩＯはＸＡＶ９３９およびＩＷＰ２の心筋分化効果を抑制したが、ＫＹ０２１１１の効果は抑制しなかった（図１１）。同様の結果が、上記（５）記載のようにヒトｉＰＳ細胞（ＩＭＲ９０－１）を用いて拍動コロニー数を調べた場合にも得られた（図１１）。これらの結果は、ＫＹ０２１１１の心筋分化効果の作用機序が既知のＷｎｔシグナル阻害剤とは異なることを示唆する。
　（１０）既知のＷｎｔシグナル阻害剤との相乗効果
　心筋分化促進における、ＫＹ０２１１１と既知のＷｎｔシグナル阻害剤であるＸＡＶ９３９またはＩＷＰ２との相乗効果について検討した。上記（８）と同様にして、サルＥＳ細胞に培養４～１０日目にＫＹ０２１１１、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＰ２を投与し、培養１４日目にＧＦＰ発現を観察した。その結果、ＫＹ０２１１１とＸＡＶ９３９とに相乗効果が観察された（図１２）。また、上記（８）記載のようにヒトｉＰＳ細胞（ＩＭＲ９０－１）を用いて拍動コロニー数を調べたところ、ＫＹ０２１１１とＸＡＶ９３９、ＫＹ０２１１１とＩＷＰ２との間に相乗効果が観察された（図１２－２）。以上の結果は、ＫＹ０２１１１の作用機序が既知のＷｎｔシグナル阻害剤とは異なることを支持し、両者を併用するとさらに強い心筋分化促進効果が得られることを示す。
（１１）その他の活性化合物（２）
　上記（２）と同様にして、さらに幾つかの心筋分化促進効果を有する化合物を見出した（図１３）。
（１２）本発明の化合物の製造例
　ＫＹ０１０４１
　３，４－ジメトキシベンゾイルイルクロリド（１００ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（８３，０μｌ．６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５００μｌ）に溶かし、２－アミノ－６－クロロベンゾチアゾール（１０５ｍｇ，０．５７ｍｍｏｌ）を加え一時間、室温にて撹拌した。反応終了後、塩化メチレンに希釈し、飽和食塩水にて洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥した後に溶媒を留去した。残渣にエタノールを加え、７０度に加熱し、溶解させた後に室温に戻すことで再結晶を行い、２－（３，４－ジメトキシベンズアミド）－６－クロロベンゾチアゾールを１３０ｍｇ、収率６８％で得た。

1H NMR (CDCl3): δ10.15(s, 1H), 7.83 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 7.63-7.45 (m, 3H), 7.36 (dd, J= 1.8, 8.7 Hz, 1H), 6.91 (d, J= 8.2 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.94 (s, 3H)
MS(ESI) Found: 349 [M+H]+
　ＫＹ０２１１１
　３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロパノイルクロリド（１００ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）と２－アミノ－６－クロロベンゾチアゾール（７８ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２－（３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロパンアミド）－６－クロロベンゾチアゾールを１１３ｍｇ、収率７２％で得た。

1H NMR (CDCl3): δ9.41(s, 1H), 7.79 (d, J= 2.9 Hz, 1H), 7.62 (d, J= 11.7 Hz, 1H), 7.37 (dd, J= 2.6, 11.4 Hz, 1H), 6.80-6.67 (m, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.03 (t, J= 9.9 Hz, 2H), 2.77 (t, J= 9.9 Hz, 2H)
MS(ESI) Found: 399 [M+H]+
　ＫＹ０２１１４
　４－（３，４－ジメトキシフェニル）ブタノイルクロリド（１００ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ）と２－アミノ－６－クロロベンゾチアゾール（７６ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２－（４－（３，４－ジメトキシフェニル）ブタンアミド）－６－クロロベンゾチアゾールを１２１ｍｇ、収率７５％で得た。

1H NMR (CDCl3): δ9.15(s, 1H), 7.79 (d, J= 2.9 Hz, 1H), 7.64 (d, J= 11.3 Hz, 1H), 7.39 (dd, J= 2.6, 11.4 Hz, 1H), 6.80-6.68 (m, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 2.67 (t, J= 9.9 Hz, 2H), 2.48 (t, J= 9.9 Hz, 2H), 2.09 (m, 2H)
MS(ESI) Found: 413 [M+H]+
　ＫＹ０１０４５
　５－（３，４－ジメトキシフェニル）ペンタノイルクロリド（３０ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）と２－アミノ－６－クロロベンゾチアゾール（２３ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２－（５－（３，４－ジメトキシフェニル）ペンタンアミド）－６－クロロベンゾチアゾールを３９ｍｇ、収率７５％で得た。

1H NMR (CDCl3): δ8.91 (s, 1H), 7.79 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 7.66 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 7.49 (dd, J= 2.3, 8.7 Hz, 1H), 6.79 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 6.71 (d, J= 7.8 Hz, 1H) 6.70 (s, 1H), 3.87(s, 3H), 3.86 (s, 3H), 2.62 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.52 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 1.80 (m, 2H), 1.72 (m, 2H)
MS(ESI) Found: 405 [M+H]+
　ＫＹ０１０４０
　３，４－ジメトキシベンゾイルイルクロリド（１００ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）と２－アミノ－６－ニトロベンゾチアゾール（１０５ｍｇ，０．５７ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２－（３，４－ジメトキシベンズアミド）－６－ニトロベンゾチアゾールを１００ｍｇ、収率５６％で得た。

1H NMR (CDCl3): δ10.15(s, 1H), 8.80 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 8.31 (dd, J= 2.3, 9.2 Hz, 1H), 7.73 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 7.63-7.47 (m, 2H), 6.95 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.97 (s, 3H)
MS(ESI) Found: 360 [M+H]+
　ＫＹ０２１０９
　２－（３，４－ジメトキシフェニル）アセチルクロリド（１００ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）と２－アミノ－６－クロロベンゾチアゾール（９４ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２－（２－（３，４－ジメトキシフェニル）アセトアミド）－６－クロロベンゾチアゾールを１５３ｍｇ、収率８３％で得た。

1H NMR (CDCl3): δ8.91(s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.31 (dd, J= 12.1 Hz, 1H), 7.77 (d, J= 11.7 Hz, 1H), 7.00-6.70 (m, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.86 (s, 2H)
MS(ESI) Found: 396 [M+H]+
　ＫＹ０１０４２
　３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロパノイルクロリド（１００ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）と２－アミノ－６－ニトロベンゾチアゾール（１０５ｍｇ，０．５７ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２－（３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロパンアミド）－６－ニトロベンゾチアゾールを１３８ｍｇ、収率７１％で得た。

1H NMR (CDCl3): δ9.29(s, 1H), 8.75 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 8.31 (dd, J= 2.3, 9.2 Hz, 1H), 7.77 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 6.80 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.75 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.74 (s, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.06 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.83 (t, J= 7.3 Hz, 2H)
MS(ESI) Found: 388 [M+H]+
　ＫＹ０１０４３
　４－（３，４－ジメトキシフェニル）ブタノイルクロリド（５５ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）と２－アミノ－６－ニトロベンゾチアゾール（５０ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２－（４－（３，４－ジメトキシフェニル）ブタンアミド）－６－ニトロベンゾチアゾールを６５ｍｇ、収率６６％で得た。

1H NMR (CDCl3): δ8.75 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 8.29 (dd, J= 2.3, 8.7 Hz, 1H), 7.70 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.75 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.67 (s, 1H), 6.66 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 2.66 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.54 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.11 (m, 2H)
MS(ESI) Found: 402 [M+H]+
　ＫＹ０１０４６
　５－（３，４－ジメトキシフェニル）ペンタノイルクロリド（３０ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）と２－アミノ－６－ニトロベンゾチアゾール（２５ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２－（５－（３，４－ジメトキシフェニル）ペンタンアミド）－６－ニトロベンゾチアゾールを３８ｍｇ、収率７０％で得た。

1H NMR (CDCl3): δ8.94 (s, 1H), 8.75 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 8.32 (dd, J= 2.3, 9.2 Hz, 1H), 7.81 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 6.80 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 6.72 (d, J= 7.8 Hz, 1H) 6.71 (s, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 2.63 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.56 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 1.82 (m, 2H), 1.73 (m, 2H)
MS(ESI) Found: 416 [M+H]+
　ＫＹ０２１０４
　２－（３，４－ジメトキシフェニル）アセチルクロリド（１００ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）と２－アミノ－６－フルオロベンゾチアゾール（８６ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２－（２－（３，４－ジメトキシフェニル）アセトアミド）－６－フルオロベンゾチアゾールを１５７ｍｇ、収率８９％で得た。

1H NMR (CDCl3): δ9.14(s, 1H), 7.64 (dd, J= 6.2, 12.1 Hz, 1H), 7.50 (dd, J= 3.6, 11.0 Hz, 1H), 7.14 (ddt, J= 3.7, 12.1 Hz, 1H), 6.90-6.78 (m, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.80 (s, 2H)
MS(ESI) Found: 369 [M+H]+
　ＳＯ０８７
　２－アミノ－６－ブロモベンゾチアゾール（５００ｍｇ，２．１８ｍｍｏｌ）、３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロピオン酸（５０５ｍｇ，２．４０ｍｍｏｌ）、Ｏ－（６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（１．０９ｇ，２．６３ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（４１９μｌ，２．４１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）溶液を室温にて終夜攪拌した。反応終了後、反応溶液を酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、蒸留水、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後に溶媒を留去した。残渣にエタノールを加えて還流し、再結晶を行い、２－（３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロパンアミド）－６－ブロモベンゾチアゾールを３２０ｍｇ、収率３５％で得た。

1H NMR (DMSO-d6): δ12.45 (s, 1H), 8.25 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.56 (dd, J = 1.8, 8.4 Hz, 1H), 6.87-6.83 (m, 2H), 6.77-6.73 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 2.88 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 7.0 Hz, 2H)
　ＳＯ１０２
　２－アミノ－６－クロロベンゾチアゾール（５５ｍｇ，０．２９８ｍｍｏｌ）および３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロピオン酸（８０ｍｇ，０．３５７ｍｍｏｌ）を基質に用いてＳＯ０８７と同様に反応を行い，Ｎ－（６－クロロベンゾチアゾール－２－イル）－３－（４－エトキシ－３－メトキシフェニル）プロパンアミドを４０ｍｇ、収率３４％で得た。

1H NMR (DMSO-d6): δ12.44 (s, 1H), 8.11 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.44 (dd, J = 2.2, 8.8 Hz, 1H), 6.90-6.82 (m, 2H), 6.72 (dd, J = 1.8, 7.0 Hz), 3.94 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.91-2.85 (m, 2H), 2.82-2.75 (m, 2H), 1.28 (t, J = 7.0 Hz, 3H)
　ＳＯ０９４
　２－アミノ－６－ヒドロキシベンゾチアゾール（４００ｍｇ，２．４１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（７ｍｌ）溶液をアルゴン雰囲気下、氷冷攪拌中、水素化ナトリウム（６０％）（１０６ｍｇ，２．６５ｍｍｏｌ）を加えて３０分攪拌後、４－ブロモ酪酸エチル（５２１μｌ，３．６２ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。反応終了後、反応溶液を酢酸エチルにて希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後に溶媒を留去し、エチル　４－（（２－アミノベンゾチアゾール－６－イル）オキシ）ブタノエートを３７２ｍｇ、収率５５％で得た。
　エチル　４－（（２－アミノベンゾチアゾール－６－イル）オキシ）ブタノエート（３７２ｍｇ，１．３３ｍｍｏｌ）、３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロピオン酸（３３５ｍｇ，１．５９ｍｍｏｌ）、Ｏ－（６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（６５９ｍｇ，１．５９ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（２７８μｌ，１．５９ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）溶液を室温にて終夜攪拌した。反応終了後、反応溶液を酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、蒸留水、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後に溶媒を留去した。残渣にエタノールを加えて還流し、再結晶を行い、エチル　４－（（２－（３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロパンアミド）ベンゾチアゾール－６－イル）オキシ）ブタノエートを４４７ｍｇ、収率７６％で得た。
　エチル　４－（（２－（３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロパンアミド）ベンゾチアゾール－６－イル）オキシ）ブタノエート（４４７ｍｇ，０．９４６ｍｍｏｌ）の１，４－ジオキサン溶液に、５Ｎ　ＮａＯＨ水溶液（３７８μｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。反応終了後、反応溶液を濃縮し、氷冷下、６Ｎ　塩酸にて中和した。析出物を吸引ろ取し、水洗し，４－（（２－（３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロパンアミド）ベンゾチアゾール－６－イル）オキシ）ブタン酸を２７１ｍｇ，収率６４％で得た。
　４－（（２－（３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロパンアミド）ベンゾチアゾール－６－イル）オキシ）ブタン酸（１００ｍｇ，０．２２５ｍｍｏｌ）およびモルホリン（２２μｌ，０．２４８ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）溶液に、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（３８ｍｇ，０．２４８ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（５２ｍｇ，０．２７０ｍｍｏｌ）を加えて室温にて２日間攪拌した。反応終了後、反応溶液を酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、蒸留水、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後に溶媒を留去した。残渣にエタノールを加えて還流し、再結晶を行い、３－（３，４－ジメトキシフェニル）－Ｎ－（６－（４－モルホリノ－４－オキソブトキシ）ベンゾチアゾール－２－イル）プロパンアミドを５０ｍｇ、収率４３％で得た。

1H NMR (DMSO-d6): δ12.20 (s, 1H), 7.60 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.01 (dd, J = 2.6, 8.8 Hz, 1H), 6.86-6.83 (m, 2H), 6.75 (dd, J = 1.8, 8.1 Hz), 4.03 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.71 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 3.56-3.53 (m, 4H), 3.46-3.42 (m, 4H), 2.87 (t, J = 7.0 Hz), 2H), 2.75 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.51-2.46 (m, 2H), 1.96 (t, J = 7.0 Hz, 2H)
　ＳＯ０９６
　４－（（２－（３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロパンアミド）ベンゾチアゾール－６－イル）オキシ）ブタン酸（８０ｍｇ，０．１８０ｍｍｏｌ）および１－メチルピペラジン（２１．８μｌ，０．１９８ｍｍｏｌ）を基質に用いてＳＯ０９４と同様に反応を行い、３－（３，４－ジメトキシフェニル）－Ｎ－（６－（４－（４－メチルピペラジン－１－イル）－４－オキソブトキシ）ベンゾチアゾール－２－イル）プロパンアミドを３９ｍｇ、収率４１％で得た。

1H NMR (DMSO-d6): δ12.20 (br s, 1H), 7.54 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 2.6Hz, 1H), 6.96 (dd, J = 2.6, 8.8 Hz, 1H), 6.86-6.82 (m, 2H), 6.73 (dd, J = 1.8, 8.1 Hz, 1H), 4.01 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.71 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 3.45-3.41 (m, 4H), 2.86 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.50-2.45 (m, 2H), 2.29-2.20 (m, 4H), 2.15 (s, 3H), 1,94 (t, J = 7.0 Hz, 2H)

Claims (26)

  1. 　式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、
    　Ｒ１－Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１－Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
    　Ｒ６－Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６－Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
    　Ｒ１０－Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、
    　Ｘは、－ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；又は基－ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
    　ｎは、０から６の整数である］
    の化合物またはその塩を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進剤。
  2. 　Ｒ６－Ｒ９が、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６－Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
    　請求項１の心筋分化促進剤。
  3. 　Ｒ１－Ｒ５が、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、ここでＲ１－Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、および
    　Ｘが、酸素原子；硫黄原子；基－ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基である）である、
    　請求項２の心筋分化促進剤。
  4. 　Ｒ２及びＲ３が、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基である、又はＲ２及びＲ３が、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成している、
    　Ｒ６及びＲ９が、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、および
    　Ｒ７が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）である、
    　Ｒ８が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、
    　又は、Ｒ７及びＲ８が、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成している、
    　請求項３の心筋分化促進剤。
  5. 　Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ９が水素原子である、
    　Ｒ２及びＲ３が、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である、および
    　Ｒ１０及びＲ１１が、水素原子である、
    　請求項４の心筋分化促進剤。
  6. 　Ｘが、硫黄原子である、および
    　ｎが、０から４の整数である、
    　請求項５の心筋分化促進剤。
  7. 　Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、及びＲ９が、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、
    　Ｒ２及びＲ３が、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基である、又はＲ２及びＲ３が、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成している、
    　Ｒ７が、基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）である、および
    　Ｘが、酸素原子；硫黄原子；基－ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基である）である、
    　請求項１の心筋分化促進剤。
  8. 　Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、及びＲ９が、水素原子である、
    　Ｒ２及びＲ３が、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である、
    　Ｒ１０及びＲ１１が、水素原子である、
    　Ｘが、硫黄原子である、
    　Ａが、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジニル基、ピペラジニル基、又はモルホリニル基である、および
    　ｎが、０から４の整数である、
    　請求項７の心筋分化促進剤。
  9. 　化合物が以下から選択される、請求項１の心筋分化促進剤。
    　ＳＯ０８７
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　ＫＹ０１０４１
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　Ｔ６１１６４
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     　ＫＹ０２１１１
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     　ＫＹ０２１１４
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     　ＫＹ０１０４５
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     　ＫＹ０１０４０
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     　ＫＹ０２１０９
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     　ＫＹ０１０４２
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     　ＫＹ０１０４３
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     　ＫＹ０１０４６
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     　ＰＢ２８５２
    　Ｎ１１４７４
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     　ＰＢ２５７２
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     　ＰＢ２５７０
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     　ＫＹ０２１０４
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     　ＳＯ１０２
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     　ＳＯ０９６
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
     　ＳＯ０９４
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
  10. 　多能性幹細胞が哺乳類である、請求項１～９のいずれかの心筋分化促進剤。
  11. 　多能性幹細胞が霊長類である、請求項１０の心筋分化促進剤。
  12. 　別の心筋分化促進因子と併用される、請求項１～１１のいずれかの心筋分化促進剤。
  13. 　別の心筋分化促進因子が、ニトロビン；bＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、およびアクチビンＡの組み合わせ；またはＷｎｔシグナル阻害剤である、請求項１２の心筋分化促進剤。
  14. 　請求項１～１１のいずれかの心筋分化促進剤を含む、心筋分化促進用キット。
  15. 　さらに別の心筋分化促進因子を含む、請求項１４のキット。
  16. 　請求項１～１３のいずれかの心筋分化促進剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する方法。
  17. 　請求項１～１３のいずれかの心筋分化促進剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法。
  18. 　請求項１７の方法で製造された心筋細胞。
  19. 　式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
     ［式中、
    　Ｒ１、Ｒ４及びＲ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）である、
    　Ｒ２及びＲ３は、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基である、又はＲ２及びＲ３は、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成している、
    　Ｒ６－Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）である、ここでＲ６－Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－又は－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
    　Ｒ１０－Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、
    　Ｘは、酸素原子；硫黄原子；又は基－ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
    　ｎは、０から６の整数である、但し、ｎが１又は２のとき、Ｒ７はＣｌ及びメトキシ基ではなく、Ｒ２はメトキシ基ではない］
    　を有する化合物またはその塩。
  20. 　Ｒ６－Ｒ９が、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）である、ここでＲ６－Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－又は－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
    　ｎが、３から６の整数である、
    　請求項１９の化合物またはその塩。
  21. 　Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ９が、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、および
    　Ｒ７が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）である、
    　Ｒ８が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、
    　又は、Ｒ７及びＲ８が、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成している、
    　請求項２０の化合物またはその塩。
  22. 　Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ９が水素原子である、
    　Ｒ２及びＲ３が、メトキシ基、エトキシ基、またはプロポキシ基である、および
    　Ｒ１０及びＲ１１が、水素原子である、
    　請求項２１の化合物またはその塩。
  23. 　Ｘが、硫黄原子である、および
    　ｎが、３である、
    　請求項２２の化合物またはその塩。
  24. 　Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、及びＲ９が、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、
    　Ｒ７が、基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）である、
    　請求項１９の化合物またはその塩。
  25. 　Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、及びＲ９が、水素原子である、
    　Ｒ２及びＲ３が、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基である、
    　Ｒ１０及びＲ１１が、水素原子である、
    　Ｘが、硫黄原子である、
    　Ａが、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジニル基、ピペラジニル基、又はモルホリニル基である、および
    　ｎが、０から４の整数である、
    　請求項２４の化合物またはその塩。
  26. 　以下：
    　ＳＯ０８７
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
     　ＫＹ０２１１４
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
     　ＳＯ１０２
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
     　ＳＯ０９６
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
     　ＳＯ０９４
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
     　の式を有する、請求項１９の化合物またはその塩。
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