JP6333830B2 - 多能性幹細胞の心筋分化を促進する化合物 - Google Patents
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Description
1.式(II)
R16およびR17は、それぞれ独立してメトキシ基、エトキシ基、およびプロポキシ基から選択される]
を有する化合物またはその塩。
2.R16がメトキシ基である、前記1記載の化合物またはその塩。
3.R17がメトキシ基またはプロポキシ基である、前記2記載の化合物またはその塩。
4.mが1〜3である、前記1〜3のいずれかに記載の化合物またはその塩。
5.以下のいずれかの式を有する化合物またはその塩。
7.
8.前記化合物の最終濃度が0.4〜2μMとなるよう多能性幹細胞の心筋分化培地に添加される、前記6または7に記載の多能性幹細胞の心筋分化促進剤。
9.前記1〜5のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進用キット。
10.前記1〜5のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する方法。
11.
12.前記培地が前記化合物を0.4〜2μMで含む、前記10または11に記載の方法。
13.前記1〜5のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法。
14.
15.前記培地が前記化合物を0.4〜2μMで含む、前記13または14に記載の方法。
式(I):
R1−R5は、各々独立して、水素原子;ハロゲン原子;水酸基;炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基;非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基;又は基−NR12R13(R12及びR13は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖または分岐アルキル基である)である、ここでR1−R5のうち隣接する2つが一緒になって−O−CH2−O−または−O−(CH2)2−O−を形成していてもよい、
R6−R9は、各々独立して、水素原子;ハロゲン原子;水酸基;炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基;基−C(O)Aで置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基(Aは、非置換又は炭素数1〜5の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和5または6員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される1または2個の原子を含んでいてもよい);非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基;又は基−NR12R13(R12及びR13は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖または分岐アルキル基である)である、ここでR6−R9のうち隣接する2つが一緒になって−O−CH2−O−または−O−(CH2)2−O−を形成していてもよい、
R10−R11は、各々独立して、水素原子;又は炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基である、
Xは、−CR14(R14は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基である);酸素原子;硫黄原子;セレン原子;又は基−NR15(R15は、水素原子、炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数1〜5の直鎖又は分岐アシル基である)である、および
nは、0から6の整数である]。
式(I)のR7基に相当するKY02111のCl基を他のハロゲン基等に置換した化合物を合成し、既報のとおり(Cell Reports, Volume 2, Issue 5, 1448-1460, 25 October 2012、国際出願公開第2012/026491号公報;参照により本明細書の一部をなす)、サルES細胞において濃度依存的に心筋分化効果を確認した。具体的には、心筋分化マーカーであるα−MHC遺伝子のプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するベクターをサルES細胞(カニクイザルCMK6.4株)に導入し、6ウェルプレート(旭硝子/ 5816-006 :Ezview カルチャープレート)に4.0×105細胞/ウェルにて播種し、IMDM培地を基本とした心筋分化培地(IMDM培地(Sigma)200ml、ウシ胎児血清(GIBCO)50ml、MEM 非必須アミノ酸溶液(Sigma)2.5ml、ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO)2.5ml、200mM L−グルタミン 2.5ml、2−メルカプトエタノール 2μl)にて培養して、分化誘導開始後4〜8日に化合物を添加した。10日目にGFP蛍光量をMetamorph イメージングシステムで解析した。
上記1の解析の結果、R7基にH<F<CH3<Cl<Br<Iの順に心筋分化効果が高くなるという構造活性相関が導かれた(図2)。特に、ヨウ素置換体であるSO2031(以下、KY02−Iとも記載する)は、R7基がCl基であるKY02111と比較して、0.1μM、1μM、10μM、30μMにおいて、それぞれ約16倍、6.3倍、2.1倍、1.5倍の心筋分化効果が得られた。また、SO2031(KY02−I)は、R7基がBr基であるSO087と比較しても、0.1μM、1μM、10μM、30μMにおいて、それぞれ約5.2倍、2倍、1.6倍、1.1倍の心筋分化効果が得られた。これらの結果から、特に低濃度ではヨウ素置換体の化合物が最も高い効果を持つことが明らかとなった。
KY02−Iの炭素鎖の炭素数(n)を変えたものを合成し、心筋分化効果を確認した(図3)。その結果、炭素鎖n=0のSO3030(KY00−I)についてはほとんど活性を示さなかったが、炭素鎖n=1のSO3031(KY01−I)、n=2のSO2031(KY02−I)、n=3のSO3042(KY03−I)に関しては、KY02111よりも高い心筋分化促進効果が見られた。また、0.1μMの低濃度においては、炭素鎖n=1のSO3031(KY01−I)よりも、炭素鎖n=2とn=3のSO2031(KY02−I)とSO3042(KY03−I)の方が高い効果(それぞれ2.7倍、2.8倍)を持つことが分かった。さらに、10μMと30μMの高濃度においては、SO2031(KY02−I)よりSO3042(KY03−I)の方が僅かに高い分化効果(約1.3倍)を持つ傾向が見られた。
炭素鎖n=2のSO2031(KY02−I)と炭素鎖n=3のSO3042(KY03−I)の心筋分化促進効果を、図3に示す結果とは別に、再度濃度依存的に確認した(図4)。その結果、0.1μM、0.4μM、2μMにおいては2つの化合物の分化促進効果に差がなかったが、比較的高濃度の10μMではS3042の方が僅かに効果が高かった(約1.1倍)。図3の結果と合わせると、高濃度ではn=3のSO3042(KY03−I)の方が僅かに効果が高いと考えられた。
式(I)の一般式のR2基およびR3基(KY02111のジメトキシ基)を置換した化合物を合成し、心筋分化効果を確認した(図5)。その結果、ジメトキシ基構造を失った化合物は、R2のメトキシ基をプロポキシ基に置換したSO2077を除き、いずれも分化促進効果が低くなった。SO2077は、ジメトキシ基を有するSO2031(KY02−I)と同等の活性が見られた。
ヒトES細胞(KhES−3株)およびiPS細胞(IMR90−1株)を用いて、SO2031(KY02−I)の心筋分化促進効果を確認した(図6)。心筋分化誘導は、既報の方法に従って行った(Cell Reports, Volume 2, Issue 5, 1448-1460, 25 October 2012、参照により本明細書の一部をなす)。具体的には、培地成分は、IMDM (Sigma)(1% MEM 非必須アミノ酸溶液 (Sigma)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン (Gibco)、2 mM L-グルタミン (Sigma)、0.5 mM L-カルニチン (Sigma)、0.001% 2-メルカプトエタノール (Gibco)、および0.4% ヒト血清アルブミン (Sigma)含有)を用いた。培養プレートは超低接着培養ディッシュ (Corning)を用いて、浮遊培養系にて心筋分化を行った。最初の2日間はWnt活性剤であるCHIR99021を3μM添加し、培養後3日目から8日目までSO2031(KY02−I)を2μM添加した。心筋分化効率は、心筋特異的マーカー分子である心筋トロポニンT(cTnT)の抗体を用いてフローサイトメトリーにより心筋細胞の割合を計算することで求めた。その結果、ヒトiPS細胞(IMR90−1株)においては、SO2031(KY02−I)添加により心筋細胞の割合が3.7%から56.8%まで増加し、ヒトES細胞(KhES−3株)においては、SO2031(KY02−I)添加により心筋細胞の割合が17.9%から77.9%まで増加した。このことから、サルES細胞だけではなくヒトES/iPS細胞においても、ヨウ素置換体であるSO2031(KY02−I)が比較的低濃度で、かつサイトカインや成長因子の刺激なしでも心筋分化を効率的に促進することが分かった。
SO2031(KY02−I)を20%血清含有培地(IMDM培地(Sigma)200ml、ウシ胎児血清(GIBCO)50ml、MEM 非必須アミノ酸溶液(Sigma)2.5ml、ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO)2.5ml、200mM L−グルタミン 2.5ml、2−メルカプトエタノール 2μl)に20μMで、または血清不含培地(IMDM培地(Sigma)200ml、MEM非必須アミノ酸溶液(Sigma)2.5ml、ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO)2.5ml、200mM L−グルタミン 2.5ml、2−メルカプトエタノール 2μl)に3μMまたは20μMで溶解させ、24時間後に観察した(図7)。いずれの培地でも大きな結晶の析出は観察されず(図7A〜C)、また、血清不含培地でも、十分な心筋分化促進効果が得られる3μMでは、結晶の析出はほとんど観察されなかった(図7C)。結晶が析出しないことにより、培地中の濃度が析出により下がることがなく安定に維持される。また、析出した結晶が細胞に傷害を与える可能性がなく、さらに細胞内に残存した結晶が移植適用時に持ち越されてホストに毒性を与えたりする危険性がない。
SO3031(KY01−I)
1H NMR (DMSO-d6): δ 12.61 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.73-7.69 (m ,1H), 7.54 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.97-6.84 (m, 3H), 3.75-3.72 (m, 8H).
MS (ESI) Found; 455 [M+H]+
1H NMR (DMSO-d6): δ 12.42 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.72-7.69 (m, 1H), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.85-6.83 (m, 2H), 6.75-6.72 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 2.90-2.76 (m, 4H).
MS (ESI) Found; 469 [M+H]+
1H NMR (DMSO-d6): δ 12.37 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.72-7.69 (m, 1H), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.86-6.79 (m, 2H), 6.70 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 2.58-2.48 (m, 4H), 1.96-1.86 (m, 2H).
MS (ESI) Found; 483 [M+H]+
1H NMR (DMSO-d6): δ 12.42 (s, 1H), 8.38-8.37 (m, 1H), 7.72-7.69 (m, 1H), 7.54-7.51 (m, 1H), 6.85-6.82 (m, 2H), 6.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.86-3.82 (m, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.87-2.78 (m, 4H), 1.72-1.65 (m, 2H), 094 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
MS (ESI) Found; 497 [M+H]+
Claims (15)
- R16がメトキシ基である、請求項1記載の化合物またはその塩。
- R17がメトキシ基またはプロポキシ基である、請求項2記載の化合物またはその塩。
- mが1〜3である、請求項1〜3のいずれかに記載の化合物またはその塩。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進剤。
- 前記化合物の最終濃度が0.4〜2μMとなるよう多能性幹細胞の心筋分化培地に添加される、請求項6または7に記載の多能性幹細胞の心筋分化促進剤。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む、多能性幹細胞の心筋分化促進用キット。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する方法。
- 前記培地が前記化合物を0.4〜2μMで含む、請求項10または11に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法。
- 前記培地が前記化合物を0.4〜2μMで含む、請求項13または14に記載の方法。
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