CN103209968B - 多能干细胞心肌细胞分化促进剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及：多能干细胞的心肌细胞分化促进剂，所述分化促进剂包含由下式(I)表示的化合物或其盐：

Description

多能干细胞心肌细胞分化促进剂
技术领域
本发明涉及用于促进多能干细胞分化成心肌细胞的组合物，和用于诱导多能干细胞分化成心肌细胞的方法，以及用于从多能干细胞制备心肌细胞的方法。
背景技术
诱导多能干细胞分化的技术对于再生医学的实现和体外药物筛选研究的建立或药物安全性评价是关键。尤其，对于用于心脏病的再生医学和药物评价很重要，原因在于目前在日本心脏病是第二位的死因。存在多种药物，其诱发严重的副作用，包括心脏停搏和心律不齐，导致不断增加的对提供同质心肌细胞(其可用于心脏毒性研究)的需要。到目前为止，已有报道，通过将人ES细胞和小鼠饲养细胞，END2细胞共培养来诱导人ES细胞分化为心肌细胞(非专利文献1)。然而，此方法的分化效率不令人满意并且它难以获得纯的人心肌细胞，因为所得的人心肌细胞通常被小鼠END2细胞污染。还有报道，通过由ES细胞制备胚胎体并向胚胎体中加入若干细胞因子(成纤维细胞生长因子(bFGF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、Dickkopf-1(DKK1)、活化素A)来诱导心肌细胞分化(非专利文献2和3)。然而，此方法需要大量的细胞因子并且成本太高，同时其分化效率不足。
引用列表
非专利文献 
非专利文献1：
Mummery，C.，等，Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes：role of coculture with visceral endoderm-like cells(人胚胎干细胞分化成心肌细胞：与内脏内胚层样细胞共培养的作用).Circulation(循 环).107(21)，2733-40(2003)。
非专利文献2：
Yang，L.，等，Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+embryonic-stem-cell-derived population(人心血管祖细胞发育自KDR+胚胎干细胞源的种群).Nature(自然).453(7194)，524-8(2008)。
非专利文献3：
Leschik，J.，等，Cardiac commitment of primate embryonic stem cells(灵长类动物胚胎干细胞的心脏定向).Nat Protoc.3(9)，1381-7(2008)。
上述文献通过引用结合于此。
发明内容
技术问题
在再生医学和药物发现领域需要以低成本高效率制备同质心肌细胞的方法。
解决问题的方案
本发明的发明人考察了9600种库化合物的促进猴ES细胞分化成心肌细胞的作用，并且发现低分子量化合物N11474具有促进心肌细胞分化的作用。此外，发现通过N11474及其类似化合物的合成开发获得的类似物KY02111具有促进心肌细胞分化的作用。因而，本发明已经得以实现。
本发明提供一种用于促进多能干细胞分化成心肌细胞的组合物，所述组合物包含由式(I)表示的化合物或其盐：
[式1]
其中，
R1至R5各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-NR12R13，其中R12和R13独立地是氢原子，氧原子，或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；其中R1至R5中的两个相邻基团可以结合在一起以形成-O-CH2-O-或-O-(CH2)2-O-，
R6至R9各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；被基团-C(O)A取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基，其中A是饱和或不饱和的5元或6元环，所述5元或6元环是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代并且所述环可以含有1个或2个独立地选自氮原子、氧原子和硫原子中的原子；未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是氢原子，氧原子，或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；其中R6至R9中的两个相邻基团可以结合在一起以形成-O-CH2-O-或-O-(CH2)2-O-，
R10至R11各自独立地是氢原子；或具有1至5个碳原子的直链或支链烷基，
X是-CR14，其中R14是氢原子，卤素原子，羟基，具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基，或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；氧原子；硫原子；硒原子；或基团-NR15，其中R15是氢原子，具有1至5个碳原子的直链或支链烷基，或具有1至5个碳原子的直链或支链酰基，并且
n是0至6的整数
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于诱导多能干细胞分化成心肌细胞的方法，所述方法包括在含有如上所述的用于促进多能干细胞分化成心肌细胞的的组合物的培养基中培养多能干细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于从多能干细胞制备心肌细胞的方法，所述方法包括在含有如上所述的用于促进多能干细胞分化成心肌细胞的的组合物的培养基中培养多能干细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供由式(I)表示的化合物或其盐：
[式2]
其中，
R1，R4和R5各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-NR12R13，其中R12和R13独立地是氢原子，氧原子，或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基，
R2和R3是具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基，或R2和R3结合在一起以形成-O-CH2-O-或-O-(CH2)2-O-，
R6至R9各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；被基团-C(O)A取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基，其中A是饱和或不饱和的5元或6元环，所述5元或6元环是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代并且所述环可以含有1个或2个独立地选自氮原子、氧原子和硫原子中的原子；未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是氢原子，氧原子，或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；其中R6至R9中的两个相邻基团可以结合在一起以形成-O-CH2-O-或-O-(CH2)2-O-，
R10至R11各自独立地是氢原子；或具有1至5个碳原子的直链或支链烷基，
X是氧原子；硫原子；或基团-NR15，其中R15是氢原子，具有1至5个碳原子的直链或支链烷基，或具有1至5个碳原子的直链或支链酰基，
n是0至6的整数，条件是当n是1或2时，R7不是Cl也不是甲氧基， R2不是甲氧基。
发明的有益效果
根据本发明，已经可以在不使用饲养细胞下诱导多能干细胞分化成心肌细胞并且获得纯的心肌细胞。此外，根据本发明，已经可以以相比于已知方法更高的效率、更低的成本诱导心肌细胞分化以制备心肌细胞。本发明尤其适用于评价QT延长，这对于以高通量形式评价药物安全性、大规模制备用于心脏病药物评价中的同质且成熟的人心肌细胞，以及生产用于移植以治疗心脏疾病等的心肌细胞是至关重要的。此外，本发明的组合物与迄今已报道的心肌细胞分化促进剂在分子结构上不相同，因此本发明的组合物被认为是完全新型的心肌细胞分化促进剂并且预期当联合不同的心肌细胞分化促进剂使用时甚至更大地增加分化效率。
附图说明
[图1]图1示出了对促进心肌细胞分化的试剂的筛选策略。
[图2]图2示出了N11474的筛选系统和检测。
[图3]图3示出了KY02111及其类似化合物的结构-活性关系。
[图4]图4示出了在细胞因子、G-CSF、双呋脒腙(nitrovin)、N11474、KY02111和KY01042之间的促进心肌细胞分化的作用的比较。
[图5-1]图5-1示出了在双呋脒腙和N11474之间的促进心肌细胞分化的协同效应。
[图5-2]图5-2示出了在双呋脒腙和KY02111之间的促进心肌细胞分化的协同效应。
[图6]图6示出了N11474在促进心肌细胞分化中对人ES细胞的作用(GFP表达水平增高)。
[图7-1]图7-1示出了有效促进心肌细胞分化的化合物(1)。
[图7-2]图7-2示出了各个化合物促进心肌细胞分化的作用。
[图8]图8示出了KY02111对基因表达的作用。
[图9-1]图9-1示出了Wnt信号传导抑制剂和Wnt信号传导激活剂对基因表达的作用(1)。
[图9-2]图9-2示出了Wnt信号传导抑制剂和Wnt信号传导激活剂对基因表达的作用(2)。
[图10]图10示出了在KY02111、N11474、已知的Wnt信号传导抑制剂(IWP2，XAV939，IWR1)和已知具有促进心肌细胞分化作用的蛋白质(G-CSF，IGFBP4，Dkk1和细胞因子)之间的促进心肌细胞分化的作用的比较。
[图11-1]图11示出了Wnt信号传导激活剂对KY02111、XAV939和IWP2(来源于猴ES细胞的心肌细胞)的促进心肌细胞分化作用的影响。
[图11-2]图11-2示出了Wnt信号传导激活剂对KY02111、XAV939和IWP2(人iPS细胞)的促进心肌细胞分化作用的影响。
[图12]图12示出了KY02111和XAV939或IWP2之间在促进心肌细胞分化中的协同效应。
[图13]图13示出了有效促进心肌细胞分化的化合物(2)以及各个化合物的促进心肌细胞分化的作用。
具体实施方式
本发明提供一种用于促进多能干细胞分化成心肌细胞的组合物，所述组合物含有由式(I)表示的化合物或其盐：
[式3]
其中，
R1至R5各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-NR12R13，其中R12和R13独立地是氢原子，氧原子，或未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链 烷基；其中R1至R5中的两个相邻基团可以结合在一起以形成-O-CH2-O-或-O-(CH2)2-O-，
R6至R9各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；被基团-C(O)A取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基，其中A是饱和或不饱和的5元或6元环，所述5元或6元环是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代并且所述环可以含有1个或2个独立地选自氮原子、氧原子和硫原子中的原子；未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是氢原子，氧原子，或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；其中R6至R9中的两个相邻基团可以结合在一起以形成-O-CH2-O-或-O-(CH2)2-O-，
R10至R11各自独立地是氢原子；或具有1至5个碳原子的直链或支链烷基，
X是-CR14，其中R14是氢原子，卤素原子，羟基，具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基，或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；氧原子；硫原子；硒原子；或基团-NR15，其中R15是氢原子，具有1至5个碳原子的直链或支链烷基，或具有1至5个碳原子的直链或支链酰基，并且
n是0至6的整数。
具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基的实例包括甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基和戊氧基。
具有1至5个碳原子的直链或支链烷基的实例包括甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基和戊基。
具有1至5个碳原子的直链或支链酰基的实例包括甲酰基，乙酰基，丙酰基，丁酰基，异丁酰基，戊酰基和异戊酰基。
卤素原子的实例包括Cl，Br，I或F。
在一个优选实施方案中，R1至R5各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；其中R1至R5中的两个相邻基团可以结合在一起以形成-O-CH2-O-或-O-(CH2)2-O-。
R2和R3优选是具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基或结合在一起以形成-O-CH2-O-或-O-(CH2)2-O-。进一步优选地，R2和R3是甲氧基，乙氧基或丙氧基，并且最优选甲氧基或乙氧基。
R1，R4和R5优选是氢原子。
在一个实施方案中，R6至R9各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是氢原子，氧原子，或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；其中R6至R9中的两个相邻基团可以结合在一起以形成-O-CH2-O-或-O-(CH2)2-O-，
R6和R9优选各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基，更优选氢原子。
在一个优选实施方案中，R7是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；被基团-C(O)A取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基，其中A是饱和或不饱和的5元或6元环，所述5元或6元环是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代并且所述环可以含有1个或2个独立地选自氮原子、氧原子和硫原子中的原子；未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是氢原子，氧原子，或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；R8是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或R7和R8结合在一起以形成-O-CH2-O-或-O-(CH2)2-O-。
在一个实施方案中，R7是被基团-C(O)A取代的具有1至5个碳原子的直链烷氧基，并且所述基团-C(O)A结合至该烷氧基的末端碳原子。
在一个优选实施方案中，A含有至少一个氮原子，并且这样的A的实例包括吡咯烷基，咪唑烷基，吡唑烷基，吡咯基，咪唑基，吡唑基，噻唑基，异噻唑基，唑基，异唑基，哌啶基，哌嗪基，吗啉基，吡啶基，嘧啶基，吡嗪基和哒嗪基，它们是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链 烷基取代。在一个更优选的实施方案中，A是哌啶基，哌嗪基或吗啉基，它们是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代。在一个进一步优选的实施方案中，A是哌啶-1-基，哌嗪-1-基或吗啉-4-基，它们是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代。
R10和R11优选是氢原子。
在一个优选实施方案中，X是氧原子；硫原子；或基团-NR15，其中R15是氢原子，具有1至5个碳原子的直链或支链烷基，具有1至5个碳原子的直链或支链酰基。X优选是硫原子。
在一个优选实施方案中，n是0至4的整数。在另一个优选的实施方案中，n是1至6的整数，1至4的整数，或者是2或3。
在一个优选实施方案中，本发明的组合物含有选自以下组中的化合物或其盐：
KY01041
[式4]
T61164
[式5]
KY02111
[式6]
KY02114
[式7]
KY01045
[式8]
KY01040
[式9]
KY02109
[式10]
KY01042
[式11]
KY01043
[式12]
KY01046
[式13]
PB2852
[式14]
N11474
[式15]
PB2572
[式16]
PB2570
[式17]
KY02104
[式18]
SO087
[式19]
SO102
[式20]
SO096
[式21]
SO094
[式22]
本发明的化合物例如描述于J.Med.Chem.，1965，8(5)，pp734-735(通过引用结合于此)(N11474，T61164)。而且，它们可获自UkrOrgSynthesis Ltd.(PB2852，PB2572，和PB2570)和ENAMINE(T61164)等。
本发明的化合物可以通过已知的方法(J.Med.Chem.，1965，8(5)，pp 734-735)(通过引用结合于此)或依照实施例中描述的方法合成。
当在本文中使用时，术语″多能干细胞″是指具有分化构成成人身体的任何类型细胞的能力(多能性)和作为在细胞分裂期间保持该多能性的能力的自我更新能力的细胞。″多能干细胞″包括胚胎干细胞(ES细胞)，胚胎生殖细胞(EG细胞)以及诱导的多能干细胞(iPS细胞)。″多能干细胞″可以是没有限制的任何物种的细胞，优选哺乳动物细胞，并且更优选啮齿类或灵长类动物细胞。本发明特别适用于猴或人多能干细胞。
ES细胞是源自早期胚胎的多能干细胞并且可以由早期胚胎中的胚泡或植入后外胚层的内细胞团建立。ES细胞的实例包括在以下文献中所述的那些：人(Thomson J.A.等，Science(科学)282：1145-1147(1998)，Biochem Biophys Res Commun.(生物化学生物物理学研究协会)345(3)，926-32(2006)；灵长类动物如恒河猴(rhesus macaque)和绒猴(marmoset)(Thomson J.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院刊)USA92：7844-7848(1995)；Thomson J.A.等，Biol.Reprod.(生殖生物学)55：254-259(1996))；兔(国际专利申请号2000-508919的国家公开)；仓鼠(Doetshman T.等，Dev.Biol.(发育生物学)127：224-227(1988))，猪(Evans M.J.等，Theriogenology(动物生殖学)33：125128(1990)；Piedrahita J.A.等，Theriogenology(动物生殖学)34：879-891(1990)；Notarianni E.等，J.Reprod.Fert.(生殖学杂志)40：51-56(1990)；Talbot N.C.等，Cell.Dev.Biol.(细胞发育生物学)29A：546-554(1993))，羊(Notarianni E.等，J.Reprod.Fert.Suppl.43：255-260(1991))，牛(Evans M.J.等，Theriogenology(动物生殖学)33：125-128(1990)；Saito S.等，Roux.Arch.Dev.Biol.201：134-141 (1992))，和貂(Sukoyan M.A.等，Mol.Reorod.Dev.(分子生殖发育)33：418-431(1993))(这些文献通过引用结合于此)。。
EG细胞是源自原始生殖细胞的多能干细胞，并且实例包括人EG细胞(Shamblott，等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(美国科学院院刊)95：13726-13731(1998))(该文献通过引用结合于此)。
术语"iPS细胞"当在本文中使用时指由除多能干细胞外的细胞诱导得到的多能干细胞，如体细胞和组织干细胞。制备iPS细胞的方法描述于以下文献中，例如：WO2007/069666，WO2009/006930，WO2009/006997，WO2009/007852，WO2008/118820，Cell Stem Cell(细胞-干细胞)3(5)：568-574(2008)，Cell Stem Cell(细胞-干细胞)4(5)：381-384(2009)，Nature(自然)454：646-650(2008)，Cell(细胞)136(3):411-419(2009)，Nature Biotechnology(自然-生物技术)26：1269-1275(2008)，Cell Stem Cell(细胞-干细胞)3：475-479(2008)，Nature Cell Biology(自然-细胞生物学)11：197-203(2009)，Cell(细胞)133(2)：250-264(2008),Cell(细胞)131(5):861-72(2007),Science(科学)318(5858):1917-20(2007)(这些文献通过引用结合于此)。然而，只要它们是人工诱导的多能干细胞，则通过任何方法制备的细胞都包括在本发明的"iPS细胞"中。
本发明的组合物可以以例如0.5至20μM的活性成分的浓度加入到用于多能干细胞的心肌细胞的分化培养基中。用于心肌细胞的分化培养基可以是用于多能干细胞的心肌细胞分化的任何常规培养基并且分化培养基的组成没有具体限制。分化培养基的实例包括用于心肌细胞的基于IMDM的分化培养基(具有以下描述和实施例中使用的组成)，用于心肌细胞的基于DMEM的分化培养基(200ml DMEM/F12培养基(Sigma)，其含有50ml胎牛血清(GIBCO),2.5ml MEM非必需氨基酸溶液(Sigma),2.5ml青霉素-链霉素(GIBCO),200mM L-谷氨酰胺和2.5ml2-巯基乙醇),以及StemPro-34SFM(GIBCO)+BMP4(10ng/ml)。当使用本发明的组合物时，不必需使用饲养细胞如END2细胞。可以根据多能干细胞的类型和要使用的用于心肌细胞的分化培养基的组成在适当时间添加本发明的组合物。当将猴或人ES细胞在实施例中使用的用于心肌细胞的基于IMDM的分化培养基中培养时，可以在培养的第6至14天期间将本发明的组合物添加到用于心肌细胞的分化培养基中。
本发明的组合物可以联合不同的心肌细胞分化促进剂如双呋脒腙，细胞因子(bFGF、BMP4、VEGF、DKK1和活化素A的组合)，或Wnt信号传导抑制剂使用。本发明中的″心肌细胞分化促进剂″包括有效促进心肌细胞分化的各种物质，因此在此含义上，本发明的组合物也是所述″心肌细胞分化促进剂″中的一种。本发明中的″Wnt信号传导抑制剂″是指抑制Wnt信号传导途径的物质并且实例包括已知的化合物如IWP2，XAV939和IWR1，以及蛋白质如G-CSF，IGFBP4和Dkk1。本发明的组合物也是有用的本发明中的″Wnt信号传导抑制剂″。更具体地，其中本发明的组合物和Wnt信号传导抑制剂组合使用的实施方案包括其中使用不同类型的本发明的组合物的实施方案。优选地，组合使用的不同的心肌细胞分化促进剂是具有与本发明的组合物不同作用机制的那些促进剂，并且这样的促进剂的实例包括IWP2和XAV939。所述不同的心肌细胞分化促进剂的施用时间表可以根据要使用的试剂由本领域技术人员适当确定。
本发明还提供一种用于促进心肌细胞分化的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的组合物。除了本发明的组合物之外，本发明的试剂盒还可以包含不同的心肌细胞分化促进剂。本发明的组合物和所述不同的心肌细胞分化促进剂可以保持在单独的容器或同一容器中。
本发明还提供一种用于诱导心肌细胞分化的方法和一种用于制备心肌细胞的方法。本发明的方法的特征在于，多能干细胞在含有本发明的组合物的培养基中培养。在一个实施方案中，本发明的方法包括在用于心肌细胞的分化培养基中培养多能干细胞，将本发明的组合物添加到该分化培养基中以使在培养的第6至14天期间活性成分的最终浓度为0.5至20μM以及在培养的第18天时确认所述多能干细胞分化成心肌细胞。分化成心肌细胞可以由心肌细胞搏动集落的数目或心肌细胞分化的标志物如α-MHC基因的表达水平来检测。
在本发明的方法中，除了本发明的组合物之外，还可以向培养基中添加不同的心肌细胞分化促进剂。
通过本发明方法制备的心肌细胞可以用于在体外评价药物安全性或用作作为治疗心脏病的移植物的心肌细胞。
本发明还提供一种具有式(I)的化合物或其盐：
[式23]
其中，
R1，R4和R5各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是氢原子，氧原子，或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基，
R2和R3具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基，或R2和R3结合在一起以形成-O-CH2-O-或-O-(CH2)2-O-，
R6至R9各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；被基团-C(O)A取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基，其中A是饱和或不饱和的5元或6元环，所述5元或6元环是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代并且所述环可以含有1个或2个独立地选自氮原子、氧原子和硫原子中的原子；未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是氢原子，氧原子，或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；其中R6至R9中的两个相邻基团可以结合在一起以形成-O-CH2-O-或-O-(CH2)2-O-，
R10至R11各自独立地是氢原子；或具有1至5个碳原子的直链或支链烷基，
X是氧原子；硫原子；或基团-NR15，其中R15是氢原子，具有1至5个碳原子的直链或支链烷基，或具有1至5个碳原子的直链或支链酰基，并且
n是0至6的整数，条件是当n是1或2时，R7不是Cl也不是甲氧基，R2不是甲氧基。
在一个优选实施方案中，R1，R4和R5各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基，优选氢原子。
在一个优选实施方案中，R2和R3是甲氧基，乙氧基或丙氧基。
在一个优选实施方案中，R6和R9各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基，优选氢原子。
在一个优选实施方案中，R7是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；被基团-C(O)A取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基，其中A是饱和或不饱和的5元或6元环，所述5元或6元环是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代并且所述环可以含有1个或2个独立地选自氮原子、氧原子和硫原子中的原子；未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是氢原子，氧原子，或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；R8是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或R7和R8结合在一起以形成-O-CH2-O-或-O-(CH2)2-O-。
在一个实施方案中，R7是被基团-C(O)A取代的具有1至5个碳原子的直链烷氧基，并且所述基团-C(O)A结合至该烷氧基的末端碳原子。
在一个优选实施方案中，A含有至少一个氮原子并且这样的A的实例包括吡咯烷基，咪唑烷基，吡唑烷基，吡咯基，咪唑基，吡唑基，噻唑基，异噻唑基，唑基，异唑基，哌啶基，哌嗪基，吗啉基，吡啶基，嘧啶基，吡嗪基和哒嗪基，它们是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代。在一个更优选的实施方案中，A是哌啶基，哌嗪基或吗啉基，它们是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代。在一个进一步优选的实施方案中，A是哌啶-1-基，哌嗪-1-基或吗啉-4-基，它们是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代。
在一个优选实施方案中，R10和R11是氢原子。
在一个优选实施方案中，X是硫原子。 
在一个优选实施方案中，n是0至4的整数。在另一个优选的实施方案中，n是1至6的整数，1至4的整数，或者2或3。
在一个优选实施方案中，本发明的化合物为：
KY02114
[式24]
SO087
[式25]
SO102
[式26]
SO096
[式27]
SO094
[式28]
本发明参考以下实施例进一步详细描述。
[实施例]
(1)库化合物的筛选
如在图1中所述，对促进猴ES细胞的心肌细胞分化的物质进行筛选。将在α-MHC基因(心肌细胞分化的标志物)启动子控制下表达绿色荧光蛋白(GFP)的载体引入到猴ES细胞系(CMK 6.4食蟹猴(cynomolgus)ES细胞)中并将该细胞以5.0x103细胞/孔接种于96孔培养板上(Greiner/655090：96孔FIA黑板)，并在用于心肌细胞的基于IMDM的分化培养基(200ml IMDM(Sigma 13390)，其包含50ml胎牛血清(GIBCO 10099-141)、2.5ml MEM非必须氨基酸溶液(Sigma M7145)、2.5ml青霉素-链霉素(GIBCO 15140)、2.5ml 200mM L-谷氨酰胺、2μl2-巯基乙醇(Sigma M7522)、255μl5N NaOH)中培养14天。在培养的第6至14天的期间内，将9,600种库化合物添加到单独的孔中(约1至5μM化合物/孔)。然后，在培养的第14天，通过使用HCS(高内涵筛选)系统(分子设备/MetaMorph成像系统)来测定GFP表达水平。结果，添加低分子量化合物N11474的孔指示高GFP表达水平，并且表明N11474在促进心肌细胞分化中是有效的(图2)。
(2)KY02111及其类似化合物的结构-活性关系
合成KY02111(其是显示有效促进心肌细胞分化的类似物)及其类似化合物，并考察其促进心肌细胞分化的作用。将猴ES细胞以4.0x105细胞/孔接种到6-孔培养板(Asahi Glass/5816-006：Ezview培养板)，向其中添加各种化合物以使其在培养的第4至10天期间的终浓度为10μM，并在 培养的第14天观察GFP表达。结果，发现依照化合物的分子结构，GFP表达水平显著增加(图3)。而且，表明促进心肌细胞分化的作用与结合于二甲氧基苯基的碳链长度相关联(图3)。
(3)双呋脒腙和细胞因子的比较
就基于GFP表达水平增加的促进心肌细胞分化的作用而言，将已知作为心肌细胞分化促进剂的细胞因子(bFGF，BMP4，VEGF，DKK1，活化素A)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)和本发明的发明人发现有效促进心肌细胞分化的双呋脒腙与本发明的化合物进行比较。以与上述(2)相同的方式，将猴ES细胞接种到6-孔板，在培养的第4至10天期间添加N11474，KY02111，KY01042(各自终浓度为10μM)和G-CSF(终浓度为5ng/ml)，在培养的第8至14天期间添加双呋脒腙(终浓度为5μM)，以及在培养的第1至14天期间添加细胞因子(bFGF，BMP4，VEGF，DKK1，活化素A)(终浓度分别为5ng/ml，10ng/ml，10ng/ml，150ng/ml和3ng/ml)，并且在培养的第14天观察GFP表达。结果，在GFP表达水平上，N11474，KY02111和KY01042表现出比细胞因子(约300％)、G-CSF(约250％)和双呋脒腙(约400％)远远更高的增加(N11474＝1000％，KY02111＝7400％和KY01042＝7000％)(图4)。
(4)与双呋脒腙的协同效应
考察双呋脒腙和N11474在促进心肌细胞分化的作用中的协同效应。在培养的第4至10天期间添加N11474(10μM)并在培养的第8至14天期间添加双呋脒腙(3μM)，并且在培养的第14天观察GFP表达。结果，GFP表达水平的增加为在双呋脒腙或N11474单独施用时的约3至4倍，而在双呋脒腙和N11474组合使用时所述水平增加约9倍(图5-1，左图)。而且，当双呋脒腙或N11474单独施用时，GFP集落数目的比例增加约30至40％，而在双呋脒腙和N11474组合使用时，该比例增加约80％(图5-1，右图)。
类似地，考察双呋脒腙和KY02111在促进心肌细胞分化的作用的协同效应。在培养的第4至8天期间添加KY02111(5μM)，在培养的第8 至12天期间添加双呋脒腙(1μM)，并在在培养的第14天观察GFP表达。结果，当双呋脒腙或KY02111单个施用时，GFP表达水平的增加分别比对照(DMSO)显著更大约3倍和约30倍，而当双呋脒腙和KY02111组合使用时，所述水平增加约50倍(图5-2，左图)。而且，当双呋脒腙或KY02111单个施用时，GFP集落数目的比率分别增加约22％和73％，而当双呋脒腙和KY02111组合使用时，所有集落基本上(100％)是GFP荧光阳性的(图5-2，右下图)。此外，当双呋脒腙或KY02111单个施用时，搏动集落的比例分别为约16％和30％，而当双呋脒腙和KY02111组合使用时，该比例为58％(图5-2，右下图)。
(5)促进猴、人和小鼠ES细胞分化成心肌细胞的作用
在GFP表达水平和搏动集落数目用作指示物的情况下，确认N11474和KY02111促进各种ES/iPS细胞分化成心肌细胞的作用。将人ES细胞系(Kh-1系)(Suemori，H.，等，Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage(通过酶促大体积通道有效建立人胚胎干细胞系和以稳定核型的长期培养).Biochem Biophys Res Commun.(生物化学生物物理学研究协会)345(3)，926-32(2006))(通过引用结合于此)以1.2x106细胞/孔接种到6-孔板(Asahi Glass/5816-006：Ezview培养板)并培养22天，其中在培养的第0至4天期间添加BMP4(10ng/ml)并且在培养的第4至14天期间添加N11474(10μM)或KY02111(5μM)。将人iPS细胞系(253G1，IMR90-1，IMR90-4和RCHIPC0003)(Takahashi，K.等，Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors(通过指定因子诱导来自成人成纤维细胞的多能干细胞).Cell(细胞).131(5)，861-72(2007)；Yu，J.等，Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells(来源于人体细胞的经诱导的多能干细胞).Science(科学).318(5858)，1917-20(2007))(这些文献通过引用结合于此)以与人ES细胞相同的方式培养以用于心肌细胞分化。来自小鼠ES细胞(R1)的心肌细胞依照在文献(Transient inhibition of BMP signaling by Noggin induces cardiomyocyte differentiation of mouse embryonic stem cells(通过Noggin的 BMP信号传导的暂时抑制诱导小鼠胚胎干细胞的心肌细胞分化).Yuasa S，Itabashi Y，Koshimizu U，Tanaka T，Sugimura K，Kinoshita M，Hattori F，Fukami S，Shimazaki T，Ogawa S，Okano H，Fukuda K.Nat Biotechnol.2005 May；23(5)：607-11.Epub 2005 May 1.Erratum in：Nat Biotechnol.2005 Jul；23(7)：897.)(通过引用结合于此)中描述的方法进行分化。在心肌细胞分化培养的第6至9天期间添加KY02111(5μM)达3天并在第9天分析心肌细胞的搏动集落。以与上述(2)相同的方式培养猴ES细胞(CMK6.4)用于心肌细胞分化。
结果，在培养的第14天和之后，观察到GFP表达水平的显著增加(图6)。而且，搏动集落数目显著增大，其中通过施用N11474和KY02111，增大的最大值在猴ES细胞(CMK6.4)，小鼠ES细胞(R1)，人ES细胞(Kh-1)和人iPS细胞(253G1，IMR90-1，IMR90-4和RCHIPC0003)中为约60倍(表1)。如上所述，证实了这些化合物对于人ES细胞和iPS细胞以及小鼠ES细胞在促进心肌细胞分化中是高度有效的。
[表1]
用于促进心肌细胞分化的化合物(N11474，KY02111)对各种ES/iPS细胞系的作用(相比于对照(DMSO)，搏动集落数目的增加率)
(6)其他活性化合物(1)
以与上述(2)相同的方式，还发现一些更多的类似化合物有效促进心肌细胞分化(图7)。
(7)关于作用机制的研究
为了考察本发明化合物的作用机制，将人iPS细胞接种到在上述(1)中描述的用于心肌细胞的分化培养基中，在培养的第3天添加DMSO或KY02111(10μM)，并在添加后12小时和24小时通过DNA阵列分析基因表达。结果，表明以下基因的表达通过添加KY02111而减少：(以其表达在12小时后减少最多的基因的顺序)HOXA1，MSGN1，NKD1，T，TNFRSF11B，DKK1，DKK4，CDX2，MSX1，NODAL，FGF4，PAPPA，PRRX1，LRAT，CYP1B1，SLC34A2，AXIN2，LGL1，SP5，MIXL1，APCDD1和DSEL。进行利用TCF/LEF转录因子识别序列的启动子分析，并且表明这些基因含有在Wnt信号传导途径下游起作用的许多基因。这些基因中的一部分(MSGN1，HOXA1，T，Dkk1和FGF4)的表达通过定量聚合酶链式反应(qPCR)确认并且所有这些基因具有与DNA阵列分析相同的结果(图8)。
接下来，通过定量聚合酶链式反应分析KY02111，XAV939和IWP-2，已知的Wnt信号传导抑制剂，以及BIO(一种Wnt信号传导激活剂)对发现通过添加KY02111具有减少的表达的一组基因的作用。所分析的基因为如下：MSGN1，HOXA1；T，MIXL1；Dkk1，AXIN2；NODAL和FGF4(都称为Wnt信号传导靶基因)。结果，这些基因的表达也被化合物KY02111，XAV939和IWP-2中的任一种减少，而被BIO(Wnt信号传导激活剂)增加(图9)。
上述结果表明，发现通过在DNA阵列中添加KY02111具有减少表达的该组基因是位于Wnt信号传导途径下游的基因以及KY02111是一种Wnt信号传导抑制剂。
(8)促进心肌细胞分化的作用的比较
以与上述(2)相同的方式，在KY02111和N11474，已知的Wnt信号传导抑制剂(IWP2，XAV939和IWR1)，已知有效促进心肌细胞分化的蛋白质(G-CSF，IGFBP4，Dkk1和细胞因子(bFGF，BMP4，VEGF，DKK1和活化素A的混合物))之间，比较促进心肌细胞分化的作用。将猴ES细胞接种到 6-孔板，在培养的第4至10天期间添加KY02111和N11474(各自终浓度为10μM)，IWP2(终浓度为10μM)，XAV939(终浓度为10μM)，IWR1(终浓度为10μM)，G-CSF(终浓度为5ng/ml)，IGFBP4(终浓度为1μg/ml)和Dkk1(终浓度为150ng/ml)以及在培养的第1至14天期间添加细胞因子(bFGF，BMP4，VEGF，DKK1和活化素A的混合物)(终浓度分别为5ng/ml，10ng/ml，10ng/ml，150ng/ml和3ng/ml)，并且在培养的第14天观察GFP表达。结果，已知的Wnt信号传导抑制剂也显示促进心肌细胞分化的作用，但KY02111具有最强的促进心肌细胞分化的作用(图10)。
(9)Wnt信号传导激活剂对促进心肌细胞分化作用的影响
分析BIO(一种Wnt信号传导激活剂)对KY02111，XAV939和IWP2的促进心肌细胞分化作用的影响。以与上述(8)相同的方式，在培养的第4至10天期间将BIO(终浓度为5μM)连同KY02111，XAV939或IWP2一起添加到猴ES细胞，并在培养的第14天观察GFP表达。结果，BIO抑制通过XAV939和IWP2的心肌细胞分化作用，但不抑制通过KY02111的作用(图11)。当如上述(5)所描述的，使用人iPS细胞(IMR90-1)来分析搏动集落的数目时，发现相同的结果(图11)。这些结果表明，KY02111具有与已知的Wnt信号传导抑制剂不同的心肌细胞分化作用的作用机制。
(10)与已知的Wnt信号传导抑制剂的协同效应
分析在促进心肌细胞分化中KY02111和已知的Wnt信号传导抑制剂XAV939或IWP2之间的协同效应。以与上述(8)相同的方式，在培养的第4至10天期间向猴ES细胞中添加KY02111，XAV939和IWP2，并在培养的第14天观察GFP表达。结果，在KY02111和XAV939之间观察到协同效应(图12)。而且，如上述(8)中描述的，使用人iPS细胞(IMR90-1)来分析搏动集落的数目，并且在KY02111和XAV939以及KY02111和IWP2之间观察到协同效应(图12-2)。上述结果表明，KY02111具有与已知的Wnt信号传导抑制剂不同的作用机制，并且当二者组合使用时实现甚至更强的促进心肌细胞分化的作用。
(11)其他活性化合物(2)
以与上述(2)相同的方式，还发现一些更多的化合物有效促进心肌细胞分化(图13)。
(12)本发明的化合物的制备例
KY01041
将3，4-二甲氧基苯甲酰氯(100mg，0.55mmol)和三乙胺(83.0μl，6mmol)溶解在二氯甲烷(500μl)中，向其中加入2-氨基-6-氯苯并噻唑(105mg，0.57mmol)，并将混合物在室温搅拌1小时。在反应完成后，反应溶液在二氯甲烷中稀释并用饱和盐水溶液洗涤。溶液用硫酸镁干燥并蒸发溶剂。向剩余物中加入乙醇，并加热至70℃，溶解并通过将温度冷却至室温进行重结晶，由此获得130mg的2-(3，4-二甲氧基苯甲酰胺)-6-氯苯并噻唑，收率为68％。
1H NMR(CDCl3)：δ10.15(s，1H)，7.83(d，J＝1.8Hz，1H)，7.63-7.45(m，3H)，7.36(dd，J＝1.8，8.7Hz，1H)，6.91(d，J＝8.2Hz，1H)，3.96(s，3H)，3.94(s，3H)
MS(ESI)实测值：349[M+H]+
KY02111
使用3-(3，4-二甲氧基苯基)丙酰氯(100mg，0.42mmol)和2-氨基-6-氯苯并噻唑(78mg，0.42mmol)作为底物，反应以与上述相同的方式进行，由此获得113mg的2-(3-(3，4-二甲氧基苯基)丙酰胺)-6-氯苯并噻唑，收率为72％。
1H NMR(CDCl3)：δ9.41(s，1H)，7.79(d，J＝2.9Hz，1H)，7.62(d，J＝11.7Hz，1H)，7.37(dd，J＝2.6，11.4Hz，1H)，6.80-6.67(m，3H)，3.85(s，3H)，3.82(s，3H)，3.03(t，J＝9.9Hz，2H)，2.77(t，J＝9.9Hz，2H)
MS(ESI)实测值：399[M+H]+
KY02114
使用4-(3，4-二甲氧基苯基)丁酰氯(100mg，0.41mmol)和2-氨基-6-氯苯并噻唑(76mg，0.41mmol)作为底物，反应以与上述相同的方式进行，由此获得121mg的2-(4-(3，4-二甲氧基苯基)丁酰胺)-6-氯苯并噻唑，收率为75％。
1H NMR(CDCl3)：δ9.15(s，1H)，7.79(d，J＝2.9Hz，1H)，7.64(d，J＝11.3Hz，1H)，7.39(dd，J＝2.6，11.4Hz，1H)，6.80-6.68(m，3H)，3.87(s，3H)，3.84(s，3H)，2.67(t，J＝9.9Hz，2H)，2.48(t，J＝9.9Hz，2H)，2.09(m，2H)
MS(ESI)实测值：413[M+H]+
KY01045
使用5-(3，4-二甲氧基苯基)戊酰氯(30mg，0.13mmol)和2-氨基-6-氯苯并噻唑(23mg，0.13mmol)作为底物，反应以与上述相同的方式进行，由此获得39mg的2-(5-(3，4-二甲氧基苯基)戊酰胺)-6-氯苯并噻唑，收率为75％。
1H NMR(CDCl3)：δ8.91(s，1H)，7.79(d，J＝8.7Hz，1H)，7.66(d，J＝8.7Hz，1H)，7.49(dd，J＝2.3，8.7Hz，1H)，6.79(d，J＝7.8Hz，1H)，6.71(d，J＝7.8Hz，1H)6.70(s，1H)，3.87(s，3H)，3.86(s，3H)，2.62(t，J＝7.4Hz，2H)，2.52(t，J＝7.3Hz，2H)，1.80(m，2H)，1.72(m，2H)
MS(ESI)实测值：405[M+H]+
KY01040
使用3，4-二甲氧基苯甲酰氯(100mg，0.5mmol)和2-氨基-6-硝基苯并噻唑(105mg，0.57mmol)作为底物，反应以与上述相同的方式进行，由此获得100mg的2-(3，4-二甲氧基苯甲酰胺)-6-硝基苯并噻唑，收率为56％。
1H NMR(CDCl3)：δ10.15(s，1H)，8.80(d，J＝2.3Hz，1H)，8.31(dd，J＝2.3，9.2Hz，1H)，7.73(d，J＝9.2Hz，1H)，7.63-7.47(m，2H)，6.95(d，J＝8.7Hz，1H)，3.98(s，3H)，3.97(s，3H)
MS(ESI)实测值：360[M+H]+
KY02109
使用2-(3，4-二甲氧基苯基)乙酰氯(100mg，0.51mmol)和2-氨基-6-氯苯并噻唑(94mg，0.51mmol)作为底物，反应以与上述相同的方式进行，由此获得153mg的2-(2-(3，4-二甲氧基苯基)乙酰胺)-6-氯苯并噻唑，收率为83％。
1H NMR(CDCl3)：δ8.91(s，1H)，8.75(s，1H)，8.31(dd，J＝12.1Hz，1H)，7.77(d，J＝11.7Hz，1H)，7.00-6.70(m，3H)，3.92(s，3H)，3.90(s，3H)，3.86(s，2H)
MS(ESI)实测值：396[M+H]+
KY01042
使用3-(3，4-二甲氧基苯基)丙酰氯(100mg，0.5mmol)和2-氨基-6-硝基苯并噻唑(105mg，0.57mmol)作为底物，反应以与上述相同的方式进行，由此获得138mg的2-(3-(3，4-二甲氧基苯基)丙酰胺)-6-硝基苯并噻唑，收率为71％。
1H NMR(CDCl3)：δ9.29(s，1H)，8.75(d，J＝1.8Hz，1H)，8.31(dd，J＝2.3，9.2Hz，1H)，7.77(d，J＝9.2Hz，1H)，6.80(d，J＝8.7Hz，1H)，6.75(d，J＝8.7Hz，1H)，6.74(s，1H)，3.85(s，3H)，3.84(s，3H)，3.06(t，J＝7.3Hz，2H)，2.83(t，J＝7.3Hz，2H)
MS(ESI)实测值：388[M+H]+
KY01043
使用4-(3，4-二甲氧基苯基)丁酰氯(55mg，0.25mmol)和2-氨基-6-硝基苯并噻唑(50mg，0.25mmol)作为底物，反应以与上述相同的方式进行，由此获得65mg的2-(4-(3，4-二甲氧基苯基)丁酰胺)-6-硝基苯并噻唑，收率为66％。
1H NMR(CDCl3)：δ8.75(d，J＝2.3Hz，1H)，8.29(dd，J＝2.3，8.7Hz，1H)，7.70(d，J＝8.7Hz，1H)，6.75(d，J＝8.7Hz，1H)，6.67(s，1H)，6.66(d，J＝8.7Hz，1H)，3.83(s，3H)，3.83(s，3H)，2.66(t，J＝7.4Hz，2H)，2.54(t，J＝7.3Hz，2H)，2.11(m，2H)
MS(ESI)实测值：402[M+H]+
KY01046
使用5-(3，4-二甲氧基苯基)戊酰氯(30mg，0.13mmol)和2-氨基-6-硝基苯并噻唑(25mg，0.13mmol)作为底物，反应以与上述相同的方式进行，由此获得38mg的2-(5-(3，4-二甲氧基苯基)戊酰胺)-6-硝基苯并噻唑，收率为70％。
1H NMR(CDCl3)：δ8.94(s，1H)，8.75(d，J＝2.3Hz，1H)，8.32(dd，J＝2.3，9.2Hz，1H)，7.81(d，J＝9.2Hz，1H)，6.80(d，J＝7.8Hz，1H)，6.72(d，J＝7.8Hz，1H)6.71(s，1H)，3.88(s，3H)，3.86(s，3H)，2.63(t，J＝7.4Hz，2H)，2.56(t，J＝7.3Hz，2H)，1.82(m，2H)，1.73(m，2H)
MS(ESI)实测值：416[M+H]+
KY02104
使用2-(3，4-二甲氧基苯基)乙酰氯(100mg，0.51mmol)和2-氨基-6-氟苯并噻唑(86mg，0.51mmol)作为底物，反应以与上述相同的方式进行，由此获得157mg的2-(2-(3，4-二甲氧基苯基)乙酰胺)-6-氟苯并噻唑，收率为89％。
1H NMR(CDCl3)：δ9.14(s，1H)，7.64(dd，J＝6.2，12.1Hz，1H)，7.50(dd，J＝3.6，11.0Hz，1H)，7.14(ddt，J＝3.7，12.1Hz，1H)，6.90-6.78(m，3H)，3.90(s，3H)，3.87(s，3H)，3.80(s，2H)
MS(ESI)实测值：369[M+H]+
SO087
将含有2-氨基-6-溴苯并噻唑(500mg，2.18mmol)、3-(3，4-二甲氧基苯基)丙酸(505mg，2.40mmol)、O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲 六氟磷酸酯(1.09g，2.63mmol)和N，N′-二异丙基乙胺(419μl，2.41mmol)的N，N′-二甲基甲酰胺(5ml)溶液在室温搅拌过夜。在反应完成后，反应溶液用乙酸乙酯稀释并用饱和碳酸氢钠水溶液、蒸馏水和饱和氯化钠水溶液洗涤。溶液用硫酸钠干燥然后蒸发溶剂。剩余物在乙醇中回流并重结晶，由此获得320mg的2-(3-(3，4-二甲氧基苯基)丙酰胺)-6-溴苯并噻唑，收率 为35％。
1H NMR(DMSO-d6)：δ12.45(s，1H)，8.25(d，J＝1.8Hz，1H)，7.66(d，J＝8.4Hz，1H)，7.56(dd，J＝1.8，8.4Hz，1H)，6.87-6.83(m，2H)，6.77-6.73(m，1H)，3.71(s，3H)，3.70(s，3H)，2.88(t，J＝7.0Hz，2H)，2.79(t，J＝7.0Hz，2H)
SO102
使用2-氨基-6-氯苯并噻唑(55mg，0.298mmol)和3-(3，4-二甲氧基苯基)丙酸(80mg，0.357mmol)作为底物，反应以与SO087相同的方式进行，由此获得40mg的N-(6-氯苯并噻唑-2-基)-3-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)丙酰胺，收率为34％。
1H NMR(DMSO-d6)：δ12.44(s，1H)，8.11(d，J＝2.2Hz，1H)，7.71(d，J＝8.8Hz，1H)，7.44(dd，J＝2.2，8.8Hz，1H)，6.90-6.82(m，2H)，6.72(dd，J＝1.8，7.0Hz)，3.94(q，J＝7.0Hz，2H)，3.72(s，3H)，2.91-2.85(m，2H)，2.82-2.75(m，2H)，1.28(t，J＝7.0Hz，3H)
SO094
在冰冷却下搅拌的同时将氢化钠(60％)(106mg，2.65mmol)在氩气氛下加入到含有2-氨基-6-羟基苯并噻唑(400mg，2.41mmol)的N，N′-二甲基甲酰胺(7ml)溶液中并搅拌30分钟，然后向其中加入丁酸4-溴乙酯(521μl，3.62mmol)并在室温搅拌过夜。在反应完成后，反应溶液用乙酸乙酯稀释并用饱和氯化铵水溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤。溶液用硫酸钠干燥然后蒸发溶剂，由此获得372mg的4-((2-氨基苯并噻唑-6-基)(氧基)丁酸乙酯，收率为55％。
将含有4-((2-氨基苯并噻唑-6-基)氧基)丁酸乙酯(372mg，1.33mmol)、3-(3，4-二甲氧基苯基)丙酸(335mg，1.59mmol)、O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(659mg，1.59mmol)和N，N′-二异丙基乙胺(278μl，1.59mmol)的N，N′-二甲基甲酰胺(5ml)溶液在室温搅拌过夜。在反应完成后，反应溶液用乙酸乙酯稀释并用饱和碳酸氢钠水溶液、蒸馏水和饱和氯化钠水溶液洗涤。溶液用硫酸钠干燥并蒸发溶剂。剩余物 在乙醇中回流并重结晶，由此获得447mg的4-((2-(3-(3，4-二甲氧基苯基)丙酰胺)苯并噻唑-6-基)氧基)丁酸乙酯，收率为76％。
将5N NaOH水溶液(378μl)加入到含有4-((2-(3-(3，4-二甲氧基苯基)丙酰胺)苯并噻唑-6-基)氧基)丁酸乙酯(447mg，0.946mmol)的1，4-二烷溶液中并在室温搅拌过夜。在反应完成后，反应溶液浓缩并在冰冷却下用6N盐酸中和。沉淀物通过真空过滤收集并用水洗涤，由此获得271mg的4-((2-(3-(3，4-二甲氧基苯基)丙酰胺)苯并噻唑-6-基)氧基)丁酸，收率为64％。
将1-羟基苯并三唑(38mg，0.248mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(52mg，0.270mmol)加入到含有4-((2-(3-(3，4-二甲氧基苯基)丙酰胺)苯并噻唑-6-基)氧基)丁酸(100mg，0.225mmol)和吗啉(22μl，0.248mmol)的N，N′-二甲基甲酰胺(1ml)溶液并在室温搅拌2天。在反应完成后，反应溶液用乙酸乙酯稀释并用饱和碳酸氢钠水溶液、蒸馏水和饱和氯化钠水溶液洗涤。溶液用硫酸钠干燥并蒸发溶剂。剩余物在乙醇中回流并重结晶，由此获得50mg的3-(3，4-二甲氧基苯基)-N-(6-(4-吗啉代-4-氧代丁氧基)苯并噻唑-2-基)丙酰胺，收率为43％。
1H NMR(DMSO-d6)：δ12.20(s，1H)，7.60(d，J＝8.8Hz，1H)，7.55(d，J＝2.6Hz，1H)，7.01(dd，J＝2.6，8.8Hz，1H)，6.86-6.83(m，2H)，6.75(dd，J＝1.8，8.1Hz)，4.03(t，J＝6.2Hz，2H)，3.71(s，3H)，3.70(s，3H)，3.56-3.53(m，4H)，3.46-3.42(m，4H)，2.87(t，J＝7.0Hz)，2H)，2.75(t，J＝7.0Hz，2H)，2.51-2.46(m，2H)，1.96(t，J＝7.0Hz，2H)
SO096
使用4-((2-(3-(3，4-二甲氧基苯基)丙酰胺)苯并噻唑-6-基)氧基)丁酸(80mg，0.180mmol)和1-甲基哌嗪(21.8μl，0.198mmol)作为底物，反应以与SO094相同的方式进行，由此获得39mg的3-(3，4-二甲氧基苯基)-N-(6-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-氧代丁氧基)苯并噻唑-2-基)丙酰胺，收率为41％。
1H NMR(DMSO-d6)：δ12.20(br s，1H)，7.54(d，J＝8.8Hz，1H)，7.48(d，J＝2.6Hz，1H)，6.96(dd，J＝2.6，8.8Hz，1H)，6.86-6.82(m，2H)，6.73(dd，J＝ 1.8，8.1Hz，1H)，4.01(t，J＝6.2Hz，2H)，3.71(s，3H)，3.69(s，3H)，3.45-3.41(m，4H)，2.86(t，J＝7.7Hz，2H)，2.70(t，J＝7.7Hz，2H)，2.50-2.45(m，2H)，2.29-2.20(m，4H)，2.15(s，3H)，1，94(t，J＝7.0Hz，2H)

Claims (26)

1.由式(I)表示的化合物或其盐在制备一种用于促进多能干细胞分化成心肌细胞的组合物中的应用，
其中，
R1、R4和R5各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；R2和R3是具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基,
R6和R9各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基,并且
1)R7是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或-NO2；
R8是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基,或者
R7和R8结合在一起以形成-O-CH2-O-或-O-(CH2)2-O-；或者
2)R8是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；并且
R7是被基团-C(O)A取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基,其中A是饱和或不饱和的5元或6元环，所述5元或6元环是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代并且所述环能够含有1个或2个独立地选自氮原子、氧原子和硫原子中的原子；
R10至R11各自独立地是氢原子；或具有1至5个碳原子的直链或支链烷基,
X是氧原子或硫原子；并且
n是0至4的整数。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，
R1,R4,R5,R6和R9是氢原子,
R2和R3是甲氧基,乙氧基或丙氧基,并且
R10和R11是氢原子。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，
X是硫原子,并且
n是0至4的整数。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，
R1,R4,R5,R6和R9是氢原子,
R2和R3是甲氧基,乙氧基或丙氧基,
R10和R11是氢原子,
R7是卤素原子，
R8是氢原子，
X是硫原子,并且
n是0至4的整数。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，
R2和R3是甲氧基。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，
n为2。
7.根据权利要求1所述的应用，其中，
R1,R4,R5,R6,R8和R9是氢原子,
R2和R3是甲氧基,乙氧基或丙氧基,
R10和R11是氢原子,
X是硫原子,
A是哌啶基、哌嗪基或吗啉基，其是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代,并且
n是0至4的整数。
8.根据权利要求1所述的应用，其中所述化合物选自下列各项:
9.根据权利要求1至8中任一项所述的应用，其中多能干细胞是哺乳动物细胞。
10.根据权利要求9所述的应用，其中多能干细胞是灵长类动物细胞。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的应用，所述组合物联合不同的心肌细胞分化促进剂使用。
12.根据权利要求11所述的应用，其中所述不同的心肌细胞分化促进剂是双呋脒腙；bFGF、BMP4、VEGF、DKK1和活化素A的组合；或Wnt信号传导抑制剂。
13.权利要求1至12中任一项所述的组合物在制备一种用于促进心肌细胞分化的试剂盒中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，所述试剂盒还包括不同的心肌细胞分化促进剂。
15.一种用于诱导多能干细胞分化成心肌细胞的方法，所述方法包括在含有权利要求1至12中任一项所述的组合物的培养基中培养多能干细胞。
16.一种用于从多能干细胞制备心肌细胞的方法，所述方法包括在含有权利要求1至12中任一项所述的组合物的培养基中培养多能干细胞。
17.一种具有式(I)的化合物或其盐:
其中，
R1,R4,R5,R6和R9是氢原子,
R2和R3是甲氧基,乙氧基或丙氧基,
R10和R11是氢原子，
X是氧原子或硫原子，
n是0至4的整数，并且
1)R7是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或-NO2；
R8是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基,或者
R7和R8结合在一起以形成-O-CH2-O-或-O-(CH2)2-O-；或者
2)R8是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；并且
R7是被基团-C(O)A取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基,其中A是饱和或不饱和的5元或6元环，所述5元或6元环是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代并且所述环能够含有1个或2个独立地选自氮原子、氧原子和硫原子中的原子；
前提条件是：
(i)当n为1或2时，R7既不是Cl也不是甲氧基并且R2不是甲氧基，并且
(ii)当R1,R4,R5,R6,R8,R9,R10和R11是氢原子，R2和R3是甲氧基，X是硫原子并且n是0时，则R7不是–H、-Cl或–NO2。
18.根据权利要求17所述的化合物或其盐，其中，
X是硫原子,并且
n是2或3。
19.根据权利要求17所述的化合物或其盐，其中，
R1,R4,R5,R6,R8和R9是氢原子,
R2和R3是甲氧基,乙氧基或丙氧基,
R10和R11是氢原子,
X是硫原子,
A是哌啶基,哌嗪基或吗啉基，其是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代,并且
n是0至4的整数。
20.化合物或其盐，所述化合物由以下化学式表示：
21.式(I)表示的化合物或其盐，
其中，
R1,R4,R5,R6和R9是氢原子,
R2和R3是甲氧基,乙氧基或丙氧基，
R10和R11是氢原子,
X是氧原子或硫原子；并且
n是0至4的整数，
1)R7是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或-NO2；
R8是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基,或者
R7和R8结合在一起以形成-O-CH2-O-或-O-(CH2)2-O-；或者
2)R8是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或是未取代的或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；并且
R7是被基团-C(O)A取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基,其中A是饱和或不饱和的5元或6元环，所述5元或6元环是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代并且所述环能够含有1个或2个独立地选自氮原子、氧原子和硫原子中的原子；
前提条件是：
(i)当R1、R4、R5、R6、R8、R9、R10和R11是氢原子，R2和R3是甲氧基，X是硫原子和n为1时，那么R7不是–OCH3,-Cl,–NO2,F或甲基，
(ii)当R1、R4、R5、R6、R8、R9、R10和R11是氢原子，R2和R3是甲氧基，X是硫原子和n为2时，那么R7不是-Cl或–NO2，并且
(iii)当R1,R4,R5,R6,R8,R9,R10和R11是氢原子，R2和R3是甲氧基，X是硫原子并且n是0时，则R7不是–H、-Cl或–NO2，并且
(iv)当R1、R4、R5、R6、R9、R10和R11是氢原子，R2和R3是甲氧基，X是硫原子，n为1，R8为甲氧基时，那么R7不是甲氧基，并且
(v)当R1、R4、R5、R6、R9、R10和R11是氢原子，R2和R3是甲氧基，X是硫原子，n为1时，那么R7和R8不结合在一起形成-O-(CH2)2-O-。
22.根据权利要求21所述的化合物，其中，
X是硫原子,并且
n是0至4的整数。
23.根据权利要求22所述的化合物，其中，
R1,R4,R5,R6和R9是氢原子,
R2和R3是甲氧基,乙氧基或丙氧基,
R10和R11是氢原子,
R7是卤素原子，
R8是氢原子，
X是硫原子,并且
n是0至4的整数。
24.根据权利要求23所述的化合物，其中，
R2和R3是甲氧基。
25.根据权利要求24所述的化合物，其中，
n为2。
26.根据权利要求21所述的化合物，其中，
R1,R4,R5,R6,R8和R9是氢原子,
R2和R3是甲氧基,乙氧基或丙氧基,
R10和R11是氢原子,
X是硫原子,
A是哌啶基、哌嗪基或吗啉基，其是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代,并且
n是0至4的整数。
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