KR101213691B1 - 전강 난포-유래 배아 줄기 세포 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 전강 난포-유래 배아 줄기 세포 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 다음 단계를 포함한다. (a) 포유동물의 난소로부터 전강 난포를 수득하는 단계; (b) 전강 난포를 인 비트로 배양시키는 단계; (c) 배양된 전강 난포에 존재하는 인 비트로 난포 세포를 성숙시키는 단계; (d) 성숙된 난모 세포를 활성화하여 단위생식 시키는 단계; (e) 활성화된 난모 세포를 배양하여 배반포를 형성시키는 단계; 및 (f) 전강 난포-유래 배아 줄기 세포를 생산하기 위하여 배반포의 내세포괴(inner cell mass: ICM) 세포를 배양하는 단계.
전강, 난포, 배반포, 배아, 줄기, 세포
Description
본 발명은 전강 난포-유래 배아 줄기 세포 생산 방법 및 전강 난포-유래 배아 줄기 세포에 관한 것이다.
난소에는 수 많은 전강(원시, 제1차 및 제2차) 난포가 존재하지만, 일반적으로 인생 동안 오직 1% 미만의 난포가 수정 부위로 성숙 난모 세포를 방출할 수 있는 성숙(Graafian) 난포로 발전한다[1]. 나머지 난포는 난소 조직에서 “발생적으로 휴면상태”로 남아있고 최종적으로 아폽토시스(apoptosis)를 통하여 퇴화된다. 동물 생명공학 분야에서는 생식력을 증가시키기 위하여 전강 난포를 최근 10년간 이용해 왔다. 결과적으로, In vitro-배양 제2차 난포로 부터 유래한 난포 난모세포는 IVF 및 배양에 따라 배반포로 발전하였으며, 이식 후 배아의 만기까지의 발달은 C57BL6 x CBA의 F1 마우스에서 이루어졌다[2, 3]. 한편, 배아 줄기(ES) 세포의 인 비트로 조작에 의한 착상 전 배아를 생산하는 놀라운 성과가 최근 발표되었다[4]. 그 결과, 새로운 의학 기술을 발전시키는데 있어서 추가적인 전강 난포 배양의 적용이 제시되었다.
그럼에도 불구하고, 전강 난포 배양에 있어 기초적인 정보는 아직까지 보고되지 않고 있으며 난포 조작에 대한 표준 프로토콜을 확립하지 못하고 있다. 게다가, 미성숙 난포 배양 기술의 가능성 여부는 다른 계통 및 종에 있어서 검증되어야 하며 표준 방법의 개발은 임상전 모델 연구와 새로운 생명공학기술의 임상 적용에 있어 매우 필수적이다.
발생 능력이 있는 난모 세포의 많은 양을 획득하기 위하여 미성숙 난포의 도입은 새로운 의학 생명공학기술을 발달시키는 것뿐 만아니라 가축의 생식적 효율을 향상시키기 위하여 고려되고 있다. Eppig와 그의 연구진들[2, 21]은 인 비트로 배양된 말기의 제2차 난포로 부터 유래한 난모 세포를 인 비트로 수정한 후 정상 출산을 하는데 최초로 성공하였다. 전강 난포의 배양 프로토콜을 최적화하는데 몇 차례 시도가 있었으며, 예를 들면, 최근 마이크로비드(microbead)와 3차원 배양 시스템을 테스트 하였다[5, 22, 23]. 게다가, 비-인간 영장류의 배아 줄기 세포는 인 비트로 성숙된 난모세포의 단위생식 활성화 후 유도되었으며, 또한 전강 난포에 대한 냉동 보존 시스템을 개발하기 위한 노력을 하고 있다. 그러나, 인 비트로 배양된 전강 난포 배아 줄기 세포를 만들기 위한 시도는 실패하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확 하게 설명된다.
상기와 같은 이유로, 본 발명자들은 상기 종래 기술에서 필요한 문제점을 해결하고자 노력하였다. 그 결과, 배아 줄기 세포의 선택적 자원으로서 전강 난포를 성공적으로 보호하는 새로운 방법을 개발하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 전강 난포-유래 배아 줄기 세포를 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 전강 난포-유래 배아 줄기 세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 전강 난포-유래 배아 줄기 세포 생산 방법을 제공한다. (a) 포유동물의 난소로부터 전강 난포를 수득하는 단계; (b) 전강 난포를 인 비트로 배양시키는 단계; (c) 배양된 전강 난포에 존재하는 인 비트로 난포 세포를 성숙시키는 단계; (d) 성숙된 난모 세포를 활성화하여 단위생식 시키는 단계; (e) 활성화된 난모 세포를 배양하여 배반포를 형성시키는 단계; 및 (f) 전강 난포-유래 배아 줄기 세포를 생산하기 위하여 배반포의 내세포괴(inner cell mass: ICM) 세포를 배양하는 단계.
전강 세포의 제조
본 발명의 가장 현저한 특징은 배아 줄기 세포를 생산하는 근원으로서 전강 난포를 이용하는 것이다. 현재 알려진 바로는, 전강 난포가 배아 줄기 세포주를 형성하기 위하여 성공적으로 사용되었다는 것은 아직까지 보고되지 않았다.
본 발명의 명세서 용어 “전강 난포”는 강(antrum)을 형성하지 않는 난포를 의미하며, 하나의 층 이상의 과립막 세포 및 유사 분열 중기 Ⅱ 단계 전에 정지된 미성숙 난모 세포를 포함한다. 상기 “전강 난포”는 원시, 제1차 및 제2차 난포(초기, 중기 및 말기 단계)를 포함하나, 이미 유체-충진 강(fluid-filled antrum)을 형성하는 제3기 및 성숙 난포(Graafian follicles)는 제외한다.
배아 줄기(ES) 세포와 관련하여 사용된 어구 “전강 난포-유래”는 ES 세포가 출발 물질인 전강 난포로부터 in vitro상에서 만들어진 것을 의미한다. 다시 말하면, 전강 난포는 in vitro상에서 배아 줄기 세포를 제공하기 위하여 성장, 성숙 및 활성화가 된다.
전강 난포는 종래 기술에서 잘 알려진 다양한 방법에 따라 난소로 부터 분리된다. 예를 들면, 전강 난포는 적합한 도구(예를 들면, 주사 바늘)를 이용하여 물리적으로 회수된다. 한편, 적합한 프로티나아제(예를 들면, 콜라게나아제 및 트립신) 및/또는 DNAase를 이용하는 효소적 회수 방법은 전강 난포를 분리하는데 이용될 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 프로티나아제는 콜라게나아제 타입 Ⅰ 및 DNAase Ⅰ이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 전강 난포의 분리는 물리적 방법에 의해 실시하며, 보다 바람직하게는 주사 바늘(needle), 가장 바람직하게는 10-40 게이지(gauge) 주사 바늘이다. 상기 전강 난포의 분리에 언급된 용어 “물리적 방법”은 난소로부터 물리적으로 전강 난포를 분리시키는 도구를 이용하여 전강 난포를 직접적으로 회수하는 방법이다. 물리적 분리 방법은 더 많은 수의 난포를 얻을 수 있다는 면에서 효소적 방법보다 유용하며 효소적 방법과 비교하여 전강 난포로부터 얻을 수 있는 난모 세포의 증가에 대한 가능성을 추가적으로 보여준다. 효소적 회수 방법은 전강 난포의 기저막 손상을 가져올 것으로 보이며, 결국 배아 줄기 세포 생산성의 효율을 감소시킨다.
분리된 모든 전강 난포는 제1차 난포, 초기 제2차난포 및 말기 제2차난포를 포함한다.
전강 난포는 포유동물로부터 얻을 수 있으며, 바람직하게는, 인간, 소, 양, 돼지, 말, 토끼, 염소, 마우스(mice), 햄스터 및 랫트(rats)이고, 보다 바람직하게는, 인간, 마우스 및 랫트이며 가장 바람직하게는 마우스로부터 얻을 수 있다.
전강 난포의
in vitro
배양
다음 분리된 전강 난포를 적합한 성장 단계에 도달시키기 위하여 배지에서 배양시킨다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계에 이용된 전강 난포는 초기 제2차 난포이다. 상기 초기 제2차 난포는 직경 100-250 ㎛의 크기와 과립막 세포의 다층과 난포속 난모세포로 구성된 구형 구조의 형태를 기초로 하여 선별된다.
상기 단계에서 이용하는 배지는 종래 기술에서 포유동물의 난포 또는 난모 세포 배양에 이용하는 인간 난포 자극 호르몬(hFSH) 및/또는 황체 형성 호르몬(LH)이 첨가된 보편적인 배지이다. 예를 들면, 상기 배지는 Eagle’s MEM [Eagle’s minimum essensial medium, Eagle, H. Science 130:142(1959)], α-MEM[Stanner, C.P. et al., NAT. New Biol. 230:52(1971)], Iscove's MEM[Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)], 199 medium [Morgan et al., Proc. Soc. Exp. BioMed., 73:1(1950)], CMRL 1066, RPMI 1640 [Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)], F12[Ham, Pro. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)], F10 [Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)], DMEM [Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., virology 8:396(1959)], DMEM 및 F12의 믹스츄어(mixture) [Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:225(1980)], Way-mouth's MB752/1[Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)], McCoy's 5A [McCoy, T. A., et al, Pro. soc. Exp. Bio. Med. 100:115(1959)], MCDB의 시리즈 [Ham, R.G et al., In Vitro 14:11(1978)], 및 이의 변형배지를 포함한다. 배지의 상세한 기술은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York에서 알 수 있으며, 상기 기술은 본 명세서에 참조로 포함된다.
바람직하게는, in vitro 전강 난포를 배양하기 위한 배지는 α-MEM-glutamax 배지, 보다 바람직하게는, 우태아 혈청(FBS), 인슐린, 트랜스퍼린, 셀레늄, 인간 난포 자극 호르몬(hFSH), 황체 형성 호르몬(LH) 및/또는 항체들(예를 들면, 페니실린 및 스트렙토마이신)이 첨가된 배지이다. 바람직하게는, 제1차 난포를 이 단계에서 이용하는 경우, α-MEM-glutamax 배지에 리보뉴클레오시드 및 디옥시리보뉴클레오시드를 첨가하지 않는다. 보다 바람직하게는, 제1차 난포를 이용하는 경우, 처음에 상기 기술된 첨가물을 첨가한 리보뉴클레오시드 및 디옥시리보뉴클레오시드-부재 α-MEM-glutamax 배지를 사용한 다음 상기 배양된 난포의 직경이 대략 100 ㎛에 이른 후에는 FBS, 인슐린, 트랜서퍼린, 셀레늄, hFSH 및/또는 항체들을 첨가한 리보뉴클레오시드/디옥시리보뉴클레오시드-첨가 α-MEM-glutamax 배지를 사용한다. 바람직하게는, 초기 제2차 난포를 본 단계에 이용하는 경우, FBS, 인슐린, 트랜스퍼린, 셀레늄, hFSH 및/또는 항체가 첨가된 리보뉴클레오시드/디옥시리보뉴클레오시드-첨가 α-MEM-glutamax 배지만을 사용한다.
바람직하게는, 인 비트로 전강 난포를 성장시키기 위한 배양은 단일 세포 배양 시스템에 따라서 실시한다. 보다 구체적으로, 상기 배양은 미네랄 오일로 덮힌 상기 본 명세서에 기술한 배지를 함유한 배양 드롭릿(droplet)에 난포를 단독적으로 평판하여 실시한다.
초기 제1차 난포(특히, 마우스 유래)를 이용하는 경우, 인 비트로에서 전강 난포의 성장 기간은 바람직하게는 6-13일, 보다 바람직하게는 8-10일, 가장 바람직하게는 약 9일이다.
일반적으로, 전강 난포의 in vitro-성장은 4단계, 즉 난포, 확산, 슈도강, 퇴화 단계로 분류된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 전강 난포는 슈도강 단계에 이를 때까지 배양된다. 슈도강 단계에서 전강 난포는 강-유사 과립막 세포-부재 부위(area)을 형성한다. 과립막 세포의 최대 증식은 과립막 세포질 사이 빈 공간의 생성에 따라 좌우되며, 난포의 기저막은 보이지 않는다. 소낭내 난모 세포와 인접한 과립막(난구) 세포는 자발적으로 세포덩어리로부터 분리(방출)된다.
난포에서 난모세포의
in vitro
성숙
성장 단계, 바람직하게는 슈도강 단계에 진입하는 전강 난포는 호르몬 및/또는 성장 인자들의 처리에 의해 in vitro 성숙된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 인간 융모성생식선자극호르몬(hCG)은 난포속 난모 세포의 성숙에 이용된다. 가장 바람직하게는, 난포속 난포 세포를 성숙시키기 위하여 인간 융모성생식선자극호르몬 및 상피 성장 인자(EGF)의 조합을 이용한다. 이용된 hCG의 총량은 바람직하게는 1.0-10 IU(International Unit)/㎖이고, 보다 바람직하게는 1.5-10 IU/㎖이며, 보다 더 바람직하게는 2.0-5 IU/㎖이고, 가장 바람직하게는 2.0-3.0 IU/㎖이다. 사용된 EGF의 총량은 1.0-20 ng/㎖이고, 바람직하게는 2.0-10 ng/㎖이며, 보다 바람직하게는 3.0-7.0이고, 가장 바람직하게는 약 5 ng/㎖이다.
난모 세포 성숙은 2-30시간 걸리며, 바람직하게는 5-25시간이고, 보다 바람직하게는 10-25시간이며, 가장 바람직하게는 16-18시간 걸린다.
성장 단계, 바람직하게는 슈도강 단계에 진입하는 전강 난포는 성숙 단계, 바람직하게는 유사 분열의 중기 Ⅱ로 발달하여 성숙된다. 유사 분열의 중기 Ⅱ는 세포의 DNA가 2개의 염색분체로 표현되는 각각의 염색체인 반수의 염색체로 구성되는 단계이다.
난모 세포 성숙(유사 분열 중기 Ⅱ)은 제1차 극체의 분출과 난모 세포를 함입한 난구 세포의 점액 분비기 및 증식 검출에 의해 결정된다.
단위 생식을 위한 성숙된 난모 세포의 활성화
성숙 단계에 따라서, 난모 세포는 단위생식을 위하여 활성화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 성숙 난모 세포를 둘러싼 난구 세포(cumulus cells)는 단위생식을 위한 처리 전에 제거된다. 바람직하게는, 난구 세포의 제거는 배지를 기계적 파이펫팅(pipetting)으로 실시한다. 보다 바람직하게는, 상기 배지는 NaCl, KCl, CaCl2, KH2PO4, MgSO4, NaHCO3, HEPES, 젖산 나트륨(sodium lactate), 피루브산 나트륨(sodium pyruvate), 포도당, 항체(페니실린 및 스트렙토마이신) 및/또는 소 혈청 알부민(BSA)뿐만 아니라 히알루론산 분해효소가 포함된 것이다. 가장 바람직하게는, 상기 배지는 M2배지이다.
단위 생식은 종래 기술에서 잘 알려진 기술 중에서 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들면, 단위 생식을 위한 난모 세포 활성화는 난포 세포내에 Ca2+ 이온 농도를 증가시키기 위해서 난모 세포를 에탄올, 초기천공법, 칼슘 이온 투과 담체, 이오노마이신 또는 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트에 노출시키고, 단백질 합성 또는 미세섬유 합성을 일시적으로 억제하는 처리를 병행하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 성숙 난모 세포의 단위생식에 SrCl2및/또는 시토칼라신 B(cytochalasin B)를 사용한다. 보다 바람직하게는, 상기 단위생식은 SrCl2및/또는 시토칼라신 B가 첨가된 KSOM [Potassium-enriched Simplex Optimized Medium, Lawitts, J. A. and Biggers, J. D., Method Emzymol., 225:153-164(1993)] 배지에서 실시한다. 가장 바람직하게는, 성숙 난모 세포는 SrCl2 및/또는 시토칼라신 B가 첨가된 Ca2+-부재 KSOM 배지 배양에 의해서 단위생식으로 활성화된다. 단위 생식에 있어 SrCl2의 함량은 5-25 mM이고, 바람직하게는 5-20 mM이며, 보다 바람직하게는 7-15 mM이고, 가장 바람직하게는 약 10 mM이다. 단위생식에 있어 시토칼라신 B의 함량은 2.5-15 ㎍/㎖이며, 바람직하게는 2.5-10 ㎍/㎖이고, 보다 바람직하게는 4-7 ㎍/㎖이며, 가장 바람직하게는 약 5 ㎍/㎖이다. 단위 생식 배양 시간은 1-20시간이고, 바람직하게는 2-15시간이며, 보다 바람직하게는 2-10시간이고, 가장 바람직하게는 3-5시간이다.
성숙 난모 세포의 단위 생식의 성공여부는 성숙된 난포 세포가 생식핵(pronucleus)을 할 수 있는 역량에 따라 결정된다.
활성화된 난모 세포의 배반포로의 발달
배반포 단계로 발전하기 위하여 단위생식으로 활성화된 난모 세포를 배양시킨다.
활성화된 난모 세포를 배반포로 발달하는데 이용하는 배지에는 여러 가지가 있다. 예를 들면, Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), 녹-아웃 DMEM(knock-out DMEM), 우태아 혈청이 포함된 DMEM, 혈청 대체물, Chatot, Ziomek 및 Bavister(CZB) 배지가 포함된 DMEM, 소아혈청(FCS)이 포함된 Ham's F-10, Tyrodes-albumin-latate-pyruvate(TALP), Dulbecco's phosphate buffered saline(PBS), Eagle's 및 Whitten's 배지들이 있다. 바람직하게는, 단위생식 난모세포를 배반포로 발달하는데 이용하는 상기 배지는 Chatot, Ziomek 및 Bavister(CZB) 배지이다. 상기 CZB 배지는 NaCl, NaCl, KCl, KH2PO4, MgSO4, CaCl2, NaHCO3, HEPES, 젖산 나트륨, 피루브산 나트륨, EDTA 및 BSA(bovine serum albumin)을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 CZB 배지는 HB(바람직하게, methemoglobin 타입) 및 β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 추가적으로 포함한다. 배지들의 상세한 설명은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York, WO 97/47734 및 WO 98/30679에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 다르면, 단위생식 난모 세포는 단일 세포 배양 시스템에 따라 배양한다[3]. 보다 구체적으로, 상기 기술된 미네랄 오일로 덮인 배지를 포함하는 배양 드롭릿에 난모세포를 단일로 놓고 실시한다.
단위생식 난모세포 배양 기간은 2-10일이고, 바람직하게는 2-8일이며, 보다 바람직하게는 4-6일이고, 가장 바람직하게는 약 5일이다.
단위생식 난모세포가 배반포 단계로의 발달은 내부 세포괴(inner cell mass), 영양막(trophoblast) 및 포배강(blastocoele)으로 구성된 배아의 전형적인 형태 관찰에 따라 좌우된다.
전강 난포-유래 줄기 배아 세포의 생산
배반포의 형성은 다음과 같으며, 전강 난포-유래 줄기 배아 세포의 생산을 위하여 상기 배반포를 배양한다.
바람직하게는, 배반포가 투명대(zona pellucida)로부터 분리된 후 배양한다. 적절한 시간동안 배양한 후, 상기 ICM(inner cell mass)-유래 세포 콜로니들을 기계적으로 또는 효소적으로 회수한 다음 전강 난포-유래 배아 줄기 세포주를 확립하기 위하여 계대배양 한다. 선택적으로, 전강 난포-유래 배아 줄기 세포를 생산하는 배양에 있어 단계(e)의 배반포로부터 분리된 ICM을 이용한다.
본 단계에서 이용하는 배지는 포유동물 ES 세포를 수득하기 위하여 LIF(Leukemia inhibition factor)가 첨가된 잘 알려진 전형적인 배지이다. 예를 들면, 상기 배지는 DMEM, 녹-아웃 DMEM, 우태아 혈청이 포함된 DMEM, 혈청 대체물이 포함된 DMEM, Chatot, Ziomek 및 Bavister(CZB) 배지가 포함된 DMEM, 소아혈청(FCS)이 포함된 Han’s F-10, Tyrodes-albumin-latate-pyruvate(TALP), Dulbecco's phosphate buffered saline(PBS), Eagle's 및 Whitten's 배지들을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 배지는 β-머캅토에탄올, 비필수 아미노산, L-글루타민, 항체들(바람직하게, 페니실린 및 스트렙토마이신) 및/또는 FBS 및 녹-아웃 혈청 대체물의 혼합물로 보충된 LIF를 포함하는 녹-아웃 Dulbecco's modified Eagle's medium(KDMEM) 배지이다. 배지들의 상세한 설명은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York, WO 97/47734 및 WO 98/30679에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 배반포 또는 ICM은 영양공급 세포층(feeder cell layer)에서 배양된다. 영양공급층은 다양한 동물, 예를 들면, 마우스 배아 섬유아세포, 인간 섬유아세포-유사 세포, 닭 섬유아세포, 자궁 상피 세포, 지지세포(STO) 및 SI-m220 공급 세포, 및 BRL 세포에서 유래된 섬유아세포 및 상피 세포를 포함한다. 바람직한 영양공급 세포는 인간 유래, 유용하게는 마우스 배아 섬유아세포이다. 바람직하게는, 영양공급세포는 유사 분열적으로 비활성화, 예를 들면, 부수적으로 ES 세포 성장을 억제하는 미토마이신 C(mitomysin C)와 같은 항-유사 분열 시약(anti-mitotic agent) 처리에 의해 비활성화된 세포이다.
배아 줄기 세포의 제조는 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase: AP), 항-SSEA-1, 항-SSEA-3 및 항-SSEA-4 항체, 항-인테그린(integrin) α6 항체, 및 항-인테그린 β1항체와 같은 항-단계-특이적 배아 항원(anti-stage-specific embryonic antigen: SSEA) 항체를 이용하는 마커 어세이(marker assay)에 의해 측정할 수 있다. 또한, LIF 및 테라토마(teratoma)가 없어도 배아체를 형성할 수 있는 배아 줄기 세포의 잠재력 분석을 통하여 최종적으로 본 발명에 의해 제조된 배아 줄기 세포를 동정할 수 있다. 반면, 생산된 배아 줄기 세포의 핵형(karyotype)은 전강 난포로부터 유래된 것으로 나타난다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전강 난포-유래 배아 줄기 세포를 제공하고, 상기 배아 줄기 세포는 상기 전강 난포에 있는 난모 세포와 동일한 핵형을 나타내며, 알카라인 포스파타아제(AP)로 염색할 수 있으며, 배아체 및 테라토마를 형성할 수 있다.
상기 전강 난포-유래 배아 줄기 세포는 모세포 예를 들면, 전강 난포에 있는 난모세포와 같은 동일한 핵형을 가진다. 게다가, 본 발명의 전강 난포-유래 배아 줄기 세포는 알카라인 포스파타아제(AP)로 염색이 가능하며, 배아체 및 테라토마를 형성할 수 있는 배아 줄기 세포와 공통된 특징을 나타낸다.
본 명세서에서 배아 줄기 세포에 언급되어 사용된 용어 “염색가능”은 세포가 양성으로 염색되거나 AP, 항-SSEA 항체, 항-인테그린 α6 항체 및 항-인테그린 β1항체와 같은 세포 표면 결합 리간드에 양성으로 염색되거나 반응한다는 것을 의미한다.
본 발명의 전강 난포-유래 배아 줄기 세포는 전능성(pluripotent)이다. 용어 “전능성”은 세포가 3가지의 주요 배엽들에서 유래된 어떠한 세포로도 발달할 수 있는 가능성을 가지는 것을 의미한다. SCID 마우스의 경우에, 성공적인 전강 난포-유래 ES 세포는 모든 3 배아 배엽으로부터 유래한 세포로 분화할 수 있다. 게다가, LIF가 없이 배양하는 경우, 본 발명의 전강 난포-유래 ES 세포는 3배엽에 대한 특이적인 마커, 즉 외배엽에 대한 신경 카드헤린(cadherin) 접착 분자 및 S-100, 중배엽에 대한 근육 액틴 및 데스민(desmin), 내배엽에 대한 α-페토프로틴(α-fetoprotein) 및 트로마-1(Troma-1)에 양성을 나타내는 배아체를 형성한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배아 줄기 세포는 초기 제2차 난포로부터 유래한다. 본 발명의 배아 줄기 세포는 포유동물의 초기 제2차 난포로 부터 유래하며, 바람직하게는 인간, 소, 양, 돼지, 말, 토끼, 염소, 마우스(maice), 햄스터 및 랫트(rats)로 부터 유래한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배아 줄기 세포는 마우스와 같은 설치류의 초기 제2차난포로 부터 유래한다. 예시적으로, 본 발명의 배아 줄기 세포는 기탁번호 KCLRF-BP-00133으로 기탁된 FpB6D2-snu-1이다.
ES 세포가 여러 종류의 세포로 분화할 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 그러므로, 본 발명의 전강 난포-유래 ES 세포는 다양한 타입의 세포를 제공하는 우수한 자료가 된다. 예를 들면, 상기 전강 난포-유래 ES 세포는 세포 분화를 위한 조건하에서 조혈 세포, 신경 세포, 베타 세포(beta cell), 근육 세포, 간세포, 연골 세포, 상피 세포, 요로 세포 및 유사 세포로 분화하도록 유도된다. ES 세포가 분화하기 위한 배지 조건 및 방법은 Palacios, et al., PNAS. USA, 92:7530-7537(1995), Pedersen, J. Reprod. Fertil. Dev., 6;543-552(1994), 및 Bain et al., Dev. Biol, 168:342-357(1995)에 개시되어 있다.
본 발명의 전강 난포-유래 ES 세포는 이식 치료를 통한 수 많은 치료에 적용이 가능하다. 본 발명의 전강 난포-유래 ES 세포는 당뇨병, 파킨스 병, 알츠하이머 병, 암, 척수 손상, 다발성 경화, 루게릭병, 근이영양증, 간 질환, 즉, 고콜레스테롤혈증, 심장 질환, 연골 이식, 창상, 족부 궤양, 위장병, 혈관질환, 신장 질환, 요로 질환, 노화 관련 질환 및 상태와 같은 수 많은 질병 또는 질환 치료에 응용할 수 있다.
본 발명은 ES 세포가 in vitro-배양 전강(바람직하게, 초기 제2차) 난포에서 성장한 난모 세포의 단위생식 활성화로 인하여 생성된다는 것을 명확하게 증명한다. 다시 말하면, 미성숙(전강) 난포는 ES 세포의 선택적 자료를 제공한다. ES 세포의 원료로서의 전강 난포의 유용성은 실시예에 기술한 것과 같은 난포 배양, 난모세포 활성화, 배아 배양 및 ES 세포 확립의 프로토콜을 사용하는 경우 계속 발전될 수 있다. 본 발명은 체세포 핵 치환을 사용하지 않고 동형 접합(homozygous) ES 세포를 확립한 최초의 발명이다. 본 발명의 방법은 발생 능력을 갖는 배란된 난모세포 및 생존 가능한 태아의 희생을 막을 수 있다.
도 1은 회수된 전강 난포의 분류를 나타낸다(x 600). (A) 제1차 난포는 단층의 과립막 세포 및 기저막으로 구성되며, 반면(B) 초기 및(C) 말기 제2차 난포는 과립막 세포의 다중 층을 가진다. 초기 및 말기 제2차 난포의 분류는 사이즈에 의해 결정된다. 스케일 바(Scale bar)는 50 ㎛를 의미한다.
도 2는 회수된 전강 난포의 형태를 나타낸다(x 120). 전강 난포는(A) 단독 으로 또는(B) 그룹을 형성하였다. 그룹으로 형성된 난포는 서로 분리하기가 어려우며 마이크로드롭릿(microdroplet)을 이용하는 단일 전강 배양에 있어서 적당하지 않다. 스케일 바는 250 ㎛를 의미한다.
도 3은 다른 방법에 의하여 마우스(C57BL6/DBA2) 난소로부터 회수한 전강 난포와 난포속 난모 세포의 형태학적 차이를 나타낸다. 주사 바늘을 이용하는 물리적 방법 또는 콜라게나아제 및 DNAase를 이용하는 효소적 방법을 사용하였다. (A) 물리적 방법에 의하여 회수한 난포(배양 0일): 기저막은 손상되지 않았으며 몇 개의 난포막(theca) 세포는 여전히 막에 붙어 있다(x 600). (B) 효소적 방법에 의하여 회수한 난포(배양 0일): 기저막은 보이지 않으며 난포막 세포는 막에 완전히 붙어 있다(x 600). 스케일 바는 50 ㎛를 의미한다.
도 4는 인 비트로 배양된 마우스(C57BL6/DBA2) 난소로 부터 회수한 전강 난포의 발달을 나타낸다. 물리적 방법으로 회수한 제1차 난포는 우태아 혈청, 인슐린, 트랜스퍼린, 셀레니움, FSH 및 항체를 첨가한 α-MEM-glutamax 배지에서 배양하였다(x 600). (A) 난포 단계: 구형 및 뚜렷한 기저막이 있는 전강 난포를 나타낸다(x 600). (B) 확산 단계: 난모 세포를 함입한 과립막 세포들은 증식 및 성장하였다(x 600). (C) 슈도강(pseudoantral) 단계: 난포는 과립막 세포의 증식에 의하여 강-유사(antrum-like) 투명 구조를 형성한다(x 300). (D) 퇴화 단계: 과립막(granulose) 세포들은 난모 세포가 과립막 세포 덩어리로부터 자발적으로 떨어진 후 퇴화되었다(x 300). A 및 B에서의 스케일 바는 50 ㎛이고 C 및 D에서의 스케일 바는 100㎛이다.
도 5A-5F는 다른 방법에 의하여 회수된 전강 난포의 in vitro-성장을 나타낸다. 제1차, 초기 제2차 및 말기 제2차 난포는 우태아 혈청, 인슐린, 트랜스퍼린, 셀레니움, FSH 및 항체가 포함된 α-MEM-glutamax 배지에서 배양하였으며, 난포(검정색 바), 확산(백색), 슈도강(사선무늬) 및 퇴화(마름모무늬) 단계에서의 in vitro-성장을 역상 현미경으로 매일 관찰하였다. 수치는 평균백분율±SD로 표시하였다. 제1차 난포의 성장(A 및 B): 물리적 방법에 의해 회수된 난포는 배양 11일 및 12일째 되는 슈도강 단계에서 더욱 발달한 반면, 효소적 방법에 의해 회수된 모든 난포들은 배양 4일째인 확산 단계에서 발달을 멈추었다. 초기 제2차 난포의 성장(C 및 D): 슈도강 단계의 발생은 물리적 및 효소적 방법에 있어 각각 배양 10일(74%) 및 9일(70%)째 되는 날 최고점에 이르렀다. 말기 제2차 난포의 성장(E 및 F): 슈도강 형성의 최고점은 물리적 및 효소적 방법에 있어 각각 배양 7일(73%) 및 6일(80%)째 되는 날 최고점에 이르렀다. 난포 발달의 동일한 단계에 있어서 다른 문자들은 관찰 시기에서 유의적인(P<0.05) 차이를 나타낸 것이다.
도 6A-6E는 다른 방법으로 회수한 제1차 , 초기 제2차 및 말기 제2차 난포의 슈도강 단계로 부터 유래한 난모 세포의 성숙을 나타낸다. 성숙 상태를 매일 관찰하였으며 hCG 및 상피 성장 인자(epidermal growth factor)를 난모 세포 성숙을 위한 배양 16시간 전에 배양 배지에 첨가하였다. 수치는 평균백분율±SD로 나타내었으며 배포(germinal vesicle: GV), 배포 붕괴(germinal vesicle breakdown: GVBD) 및 중기 Ⅱ(metaphase Ⅱ: MⅡ) 단계로 발달하는 난모 세포의 백분율을 각각의 관찰 매시기마다 체크하였다. (A) 제1차 난포에서 성장한 성숙 난모 세포는 물 리적 방법에 의해 회수하였다. MⅡ 단계의 난모 세포는 배양 10일과 13일 사이에서 검출되었다(13에서 27%). 초기 제2차 난포에서 성장한 성숙 난모 세포는(B) 물리적 및(C) 효소적 방법에 의해 회수하였다. M Ⅱ단계의 난모 세포의 현저한 증가는 물리적 방법에 있어 배양 9일째(47%)에 검출되었으며 효소적 방법에 있어서는 배양 7일째(54%)에 검출되었다. 말기 제2차 난포에서 성장한 성숙 난모 세포는(D) 물리적 방법 및(E) 효소적 방법에 의해 회수하였다. M Ⅱ단계의 난모 세포의 현저한 증가는 물리적 및 효소적 방법에서 각각 배양 5일째부터 7일째까지(28% 및 78%)에서 검출되었다. 난포 발달의 동일한 카테고리에서 다른 문자는 관찰 시기에서 유의적 차이를 나타낸 것이다.
도 7은 효소를 처리하여 분리한 전강 난포로부터 유래된 난모 세포의 형태학적 차이를 나타낸 것이다. (A) 물리적 방법에 의해 회수된 난포에서 성장한 난모 세포(배양 11일째): 제1차 극체(polar body)를 볼 수 있으며 두꺼운 투명대(zona pellucida) 및 좁은 난황 주위 공간(perivitelline space)이 관찰된다(x 600). (B) 효소적 방법에 의해 회수된 난포에서 성장한 난모 세포: 제1차 극체(polar body)를 볼 수 있으나 얇은 투명대(zona pellucida) 및 넓은 난황 주위 공간(perivitelline space)이 검출된다(x 600). (C) in vivo 배란된 난모 세포. 스케일 바는 50 ㎛를 의미한다.
도 8은 in vitro상에서 배양하는 동안 F1(C57BL6 x DBA2) 마우스의 난소에서 회수한 전강 난포의 발단을 나타낸 것이다. 물리적으로 회수한 제2난포는 우태아 혈청, 인슐린, 트랜스퍼린, 셀레니움, FSH 및 항체가 포함된 α-MEM-glutamax 배지 에서 배양하였다. (A) 난포 단계: 배양하는 동안 구형 형태를 유지하고 있는 난포 및 뚜렷한 기저막을 볼 수 있다(x 600). (B) 확산 단계: 난포세포를 함입한 과립막 세포들은 분열 및 성장하였다(x 600). (C) 슈도강(pseudoantral) 단계: 난포는 과립막(granulose) 세포들의 분열 및 분화로 인하여 강-유사(antrum-like) 투명 구조를 형성한다(x 300). (D) 퇴화 단계: 과립막(granulose) 세포들은 난모 세포가 과립막 세포 덩어리로 부터 자발적으로 떨어진 후 퇴화되었다(x 300) A 및 B에서의 스케일 바는 50 ㎛를 의미하고 C 및 D에서의 스케일 바는 100㎛를 의미한다.
도 9는 우태아 혈청과 녹-아웃 혈청 대체물질(knock-out serum replacement)을 3:1로 혼합한 혼합물을 보충한 변형된 녹-아웃 DMEM 에서 단위생식 활성화 및 내세포괴(inner cell mass: ICM) 세포 콜로니의 연속된 계대 배양에 의해 생성된(A) 난포-유래, 동형접합 배아 줄기(Embryonic stem: ES) 세포의 특징을 보여준다. 난포-유래 마우스 ES 세포들는 7개 줄기 세포-특이적 마커, 즉(F) 알카라인 포스페이트(alkaline phosphate: AP),(B) 항-단계 특이적 배아 항원(SSEA-1),(C) 항-SSEA-3,(D) 항-SSEA-4,(E) Oct-4,(G) 항-인테그린(integrin) α6 및 항-인테그린 β1를 사용하여 특성화 된다. 확립된 ES 세포는 항-SSEA-3와 항-SSEA-3 항체를 제외한 모든 특이적 마커에 양성으로 염색되었으며, 이러한 양상은 다른 유래의 마우스 ES 세포와 동일하다. 스케일 바는 50 ㎛를 의미한다.
도 10은 소 태아 혈청과 녹-아웃 혈청 대체물질을 3:1로 혼합한 혼합물을 보충한 변형 녹-아웃 DMEM에서 단위생식의 활성화 및 내세포괴 세포 콜로니의 연속된 계대 배양에 의해 생성된(A) 난포-유래, 동형접합 배아 줄기(Embryonic stem: ES) 세포의 in vitro 분화를 나타낸 것이다. 배아체로의 자발적인 분화를 위하여 난포-유래 ES 세로의 콜로니를 백혈구 억제 요소(leukemia inhibitory factor: LIF)-부재 배지에서 배양하였으며 배아체의 면역세포화학 검사는 3배엽에 특이적 마커 즉,(A) 신경 캐드헤린 접착 분자(외배엽에 대한 NCAM(Neural cadherin adhesion molecule)),(B) 근육 액틴(muscle actin; 중배엽),(C) α-케토 단백질(α-keto protein; 내배엽),(D) S-100(외배엽),(E) 데스민(Desmin; 중배엽) 및(F) 트로마-1(Troma; 내배엽)을 이용하여 실시하였다. 배아체를 구성하는 세포들은 테스트된 마커들 중에서 하나의 마커에 양성으로 염색되었다. 스케일 바는 50 ㎛를 의미한다.
도 11은 전강 난포-유래 동형접합 배아 줄기 세포의 신경 분화를 나타낸다. (A, E) 변형된 N2B27 배지에서 분화된 난포-유래, 자가 조직의 ES 세포들의 상 대조 이미지. 피브로넥틴(fibronectin)에 재평판 배양 후 7-10일째 생성된(B) Tuj1-양성 및(C) 네스틴-양성 뉴런. (D)(B) Tuj1-양성 및(C) 네스틴-양성 뉴런의 통합된 이미지. 피브로넥틴(fibronectin)에 재평판 배양 후 11-14일째 생성된 각각의(F) GFAP-양성 성상 세포 및(G) O4-양성 희소돌기아교세포(oligodendrocyte). (H) GFAP-양성 성상 세포 및 O4-양성 희소돌기아교세포의 통합된 이미지. 스케일 바는 40 ㎛를 의미한다.
도 12는 NOD-SCID 마우스에 이식한 후 우태아 혈청과 녹-아웃 혈청 대체물질을 3:1로 혼합시킨 혼합물을 보충한 변형 녹-아웃 DMEM에서 단위생식의 활성화 및 내세포괴 세포 콜로니의 연속된 계대 배양에 의해 생성된(A) 난포-유래, 동형접합 배아 줄기(Embryonic stem: ES) 세포의 테라토마 의 형성을 나타낸 것이다. 테라토마의 형태는 헤마톡실린 파라핀으로 고정하고 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)을 염색하여 조사하였다. 테라토마에는 내배엽 세포의(A) 선상 위-유사 구조,(B) 외분비계 췌장 조직 및(C) 섬모화 된 호흡계 상피(화살 머리), 외배엽 세포의(D) 케라틴(keratin)으로 층을 이루는 편평 상피 및(E) 신경상피 로제트(rosette),(F) 망막 상피 및(G) 피지선, 중배엽 세포의(H) 지방세포(adipocytes, 화살 머리) 및 골격근 다발(화살)을 포함한다. 스케일 바는 200 ㎛를 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
재료 및 방법
I. 전강 난포 조작에 대한 기조적 시스템의 확립
실험 동물
서울대학교 발생학 및 생식세포 생물공학 실험실에서 키운 암컷 F1 혼성(C57BL6/DBA2) 마우스를 조절된 빛(14L:10D), 온도(20-22℃) 및 습도(40-60%) 조 건하에서 사육하였으며, 2주차 성-미성숙(사춘기) 암컷 마우스를 최종적으로 본 발명에 이용하였다. 동물 관리, 번식 및 수술에 대한 모든 과정은 서울대학교 표준 수술 프로토콜에 따라 실시하였다. 서울대학교 동물 과학 및 기술부 임상시험심사위원회는 2004년 10월에 본 실험의 동물 보호 및 사용을 포함하는 연구 신청 및 관련된 실험 과정에 대하여 승인하였다. 또한 실험 표본의 관리와 실험 설비 및 장비의 품질관리를 수행하였다.
전강 난포의 분리
암컷 마우스는 경구 탈구에 의해서 희생되었으며 난소는 무균적으로 제거 하였다. 난포의 기계적인 분리를 위하여, 난소를 37℃에서 10% (v/v) 열-불활성화 된 우태아 혈청(FBS) 및 1% (v/v) 동결건조된 페니실린-스트렙토마이신 혼합액을 첨가한 2 ㎖ L-15 Leibovitz-glutamax 배지(Sigma-Aldrich, St, ouis, MO)에 두었다. 본 발명에는 2가지 타입의 회수 방법을 사용하였다. 전강 난포는 30-게이지 주사 바늘을 이용하여 기계적으로 회수하였다. 이 회수 방법의 실시하는 경우에, 모아진 난소를 0.1% (v/w) 콜라게나아제 타입 Ⅰ(198 units/mg; Sigma-Aldrich Corp.), 0.02% (v/w) DNase Ⅰ(11.2 units/mg; Sigma-Aldrich Corp.) 및 0.03% (v/v) 우태아 혈청(FBS)이 첨가된 리보뉴클레오시드 및 디옥시리보뉴클레오시드-함유 α-MEM-glutamax 배지에 37℃에서 1시간 두었다. 단백질가수분해 절단을 촉진시키기 위하여, 난소를 30분마다 부드럽게 파이펫팅을 하여 적정하였다.
전강 난포의 배양
기계적 또는 효소적으로 분리한 전강 난포를 L-15 배지의 10 ㎕ 드롭릿(droplet)으로 3번 세척하였고 40 x 배율에서 역광 현미경(TE-2000 Nikon, 일본)의 접안렌즈 마이크로미터로 직경을 측정하여 3가지 카테고리로 분류하였다. 선택 기준은 직경 75-99 ㎛의 제1차 난포, 100-125 ㎛의 초기 제2차 난포 및 126-180 ㎛의 말기 제2차 난포로 정하였다. 난포의 크기뿐만 아니라, 전강 난포의 전형적인 형태도 분류하는데 이용하였다(도1). 제1차 난포는 과립막 세포의 단일 밀집층 및 난포속 난모 세포를 구성하는 둥근 구조를 나타내었다. 또한, 초기 및 말기 제2차 난포는 과립막세포의 복합층 및 난포속 난모 세포로 구성하는 둥근 구조를 나타내었다. 분류된 모든 난포는 37℃, 5% CO2에서 배양하였다.
제1차 및 제2차 난포의 인 비트로 배양
60 x 15 mm 팔콘 플라스틱 디쉬(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에서 세척-미네랄 오일(Sigma-Aldrich Corp.)로 덮힌 10 ㎕ 배양 드롭릿(droplet)에 제1차 난포를 단일로 놓았다.
제1차 난포 배양에 이용된 배지는 리보뉴클레오시드 및 디옥시리보뉴클레오시드-부재 α-MEM-glutamax 배지이고, 1% (v/v) 열-불활성화된 우태아 혈청(FBS), 5 ㎍/㎖ 인슐린, 5 ㎍/㎖ 트랜스퍼린, 5 ng/㎖ 셀레늄, 100 mIU/㎖ 재조합 인간 FSH(Organon, Oss, 네덜란드), 10 mIU/㎖ LH(cat. no. L-5259, Sigma-Aldrich Corp) 및 1% (v/v) 페니실린 및 스트렙토마이신을 배지에 첨가하였다. 배양 1일째, 추가적으로 신선한 배지 10 ㎕을 각 드롭릿(droplet)에 더하여 주었고 배양 3일째부터 매일 배지의 반을 바꾸어 주었다. 배양된 난포는 기계적 파이펫팅에 의해 배양 접시의 바닥과 잘 떨어졌다. 난포의 직경이 100 ㎛에 이르는 경우(대략 배양 5일째), FBS, 인슐린, 트랜스퍼린, 셀레니움, FSH 및 항체가 첨가된 리보뉴클레오시드 및 디옥시리보뉴클레오시드-함유 α-MEM-glutamax 배지의 10 ㎕ 드롭릿에 놓았다. 그 다음날, 신선한 배지 10 ㎕을 각 드롭릿에 더해준 다음 3일후 배지의 반을 매일 바꾸어 주었다[5].
또한, 제2차난포를 각각 배양하였고 배양 프로토콜은 리보뉴클레오시드 및 디옥시리보뉴클레오시드-함유 α-MEM-glutamax 배지를 사용하는 것을 제외하고는 제1차 난포의 것과 동일하게 하였다. 전강 난포의 형태학적 변화는 배양 과정에서 매일 모니터링하였다.
난포속 난모 세포의 성숙의 판단
전강 난포에서 난포속 난포 세포의 성숙을 유도하기 위해서, 2.5 IU/㎖ hCG(PregnylTM; Organon) 및 5 ng/㎖ 상피 성장 인자(cat. no E-4127, Sigma-Alirich Corp)를 난모 세포 성숙 배양 16-18시간 전에 배양 배지에 더해 주었다. 감수 분열의 과정은 Lacmoid 염색 반응을 통하여 난모 세포를 모니터링 하였고 제1차 극체를 포함하지 않는 난모 세포에서 난핵(germinal vesicle: GV) 및 난핵 붕 괴(GVBD)는 위상차 현미경으로 조사하였다. 난모 세포 성숙(유사분열 중기 Ⅱ로의 발달)은 제1차 극체의 방출과 난모 세포를 함입한 난구 세포의 점액 분비기 및 증식 검출로 판단하였다. 제1차 극체의 방출을 모니터링하기 위하여, 배양된 난포로부터 회수한 난모세포를 200 IU/㎖ 히알루로니다아제(hyaluronidase)를 첨가한 M2 배지에서 파이펫팅 처리하여 난구 세포와 분리시켰다. 간접적으로 세포질 성숙을 동정할 수 있는 성숙된 난모 세포의 생식핵 형성 능력은 10 mM SrCl2 및 5 ㎍/㎖ 시토칼라신 B(cytochalasin B)를 첨가한 Ca2+-부재 KSOM 배지를 이용하여 단위생식적 활성화 후 모니터링 하였다. 활성화된 난모 세포 형성은 형광 기구가 장착된 역광 현미경에서 Hoechest 염색을 통하여 평가하였다. 반면, 배양된 전강 난포로부터 유래한 유사분열 중기 Ⅱ단계 난포세포의 크기(직경) 및 투명대(zona) 두께는 접안마이크로미터가 장착된 역광 현미경을 통하여 모니터링 하였다.
통계학적 분석
통계학적 분석 시스템(SAS) 프로그램에서 일반화된 선형 모델(PROC-GLM)을 사용하였고 P 값이 0.05보다 작을 경우에 유의한 차이로 판단을 하였다.
Ⅱ. 전강 난포로부터 유래한 동형접합 배아 줄기 세포
실험 동물
2개의 F1 혼성 스트레인(hybrid strain)을 C57BL6 암컷 마우스와 DBA2 또는 CBA/Ca 수컷 마우스의 교접에 의해여 생산하였다. 확립된 콜로니를 서울대학교 발생학 및 생식세포 생물공학 실험실에서 조절된 빛(14L:10D), 온도(20-22℃) 및 습도(40-60%) 조건으로 보존하였다. 2주차 미성숙 암컷 마우스를 최종적으로 본 발명에 이용하였다. 동물 관리, 번식 및 수술에 대한 모든 과정은 서울대학교 표준 프로토콜을 따라 실시하였다. 또한 실험 표본 관리와 실험 설비 및 장비의 품질관리를 수행하였다.
초기 제2차 난포의 분리
암컷 마우스를 경구 탈골하여 안락사 시켰다. 난소는 무균 상태로 제거하였고 37℃에서 10% (v/v) 열-불활성화 된 우태아 혈청(FBS; Hyclone Laboratories, Logan, UT) 및 1% (v/v) 동결 건조된 페니실린-스트렙토마이신 용액(Gibco Invitrogen, 미국)을 첨가한 2 ㎖ L-15 Leibovitz-glutamax 배지(Gibco Invitrogen, Grand Island, NY)에 두었다. 그 다음, 전강 난포를 30-게이지 주사 바늘을 이용하여 기계적으로 회수하였다. 분리된 전강 난포 사이에서, 직경 100-125 ㎛ 크기의 과립막세포의 복합층 및 난포내 난모 세포인 초기 제2차 난포를 역광 현미경(TE-2000; Nikon, Tokyo, 일본)의 접안렌즈 마이크로미터로 측정하여 분리하였다(40 배율). 난포를 L-15 배지의 10 ㎕ 드롭릿(droplet)에 3번 세척하고 37℃, CO2에서 배양시켰다.
제2차 난포의 in vitro 성장
회수된 난포를 60 x 15 mm 팔콘 플라스틱 페리 디쉬(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에서 세척-미네랄 오일(Sigma-Aldrich Corp.)로 덮힌 10 ㎕ 배양 드롭릿에 단일로 놓았다. 초기 제2차 난포를 5% (v/v) FBS, 5 ㎍/㎖ 인슐린, 5 ㎍/㎖ 트랜스퍼린, 5 ng/㎖ 셀레니움, 100 mIU/㎖ 재조합 인간 FSH(Organon, Oss, 네덜란드)가 첨가된 리보뉴클레오시드 및 디옥시리보뉴클레오시드-함유 α-MEM-glutamax(Gibco Invitrogen, 미국) 배지에서 배양하였다. 본 실험의 모든 배지 기질은 Sigma-Aldrich(St Louis, MO) 사에서 구입하였다(다른 특별한 언급을 하지 않는다면). 배양 1일째, 각 드롭릿(droplet)에 10 ㎕의 신선한 배지를 추가적으로 더하여 주고, 배양 3일째부터 마지막 날까지 배양액의 반을 매일 교체하였다(Lenie et al., 2004). in vitro 배양에 있어서 초기 제2차 난포에서 발생하는 형태학적 변화는 도 8에 나타내었다.
성숙 난모 세포의 수집과 단위생식의 활성화
직경 100-125 ㎛의 초기 제2차 난포를 8-13일간 배양하였으며, 실험 디자인에 따라, 난모 세포 성숙은 배양 종료 16시간 전에 인간 2.5 IU 인간 융모성생식성자극호르몬(hCG)(pregnyl; Organon, Oss, 네덜란드)/㎖ 및 5 ng 상피 성장 인자/㎖에 노출에 의하여 유발되었다. 유사 분열 중기 Ⅱ 단계로 발달하는 난모 세포 성숙은 제1차 극체의 방출과 난모 세포를 함입한 난구 세포의 점액 분비기 및 증식 검출로 판단하였다. 200 IU 히알루로니다아제(hyaluronidase)/㎖가 첨가된 94.66 mM NaCl, 4.78 mM KCl, 1.71 mM CaCl22H2O, 1.19 mM KH2PO4, 1.19 mM MgSO47H2O, 4.15 mM NaHCO3, 20.85 mM HEPES, 23.28 mM 젖산 나트륨, 0.33 mM 피루브산 나트륨, 5.56 mM 포도당, 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신, 및 4 ㎎ 소 혈청 알부민(BAS)/㎖으로 구성된 M2 배지에서 기계적으로 파이펫팅하여 난포 세포를 난구 세포와 분리시켰다. 성숙 난모 세포를 10 mM SrCl2및 5 ㎍/㎖ 시토카라신 B를 첨가한 Ca2+-부재 KSOM 배지에서 4시간 배양하여 단위생식으로 활성화 시켰다.
활성화된 난모 세포의 배양
변형된 Chatot, Ziomek 및 Bavister(CZB) 배지를 단위생식으로 활성화된 난모 세포 배양에 이용하였다. CZB는 81.6 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO47H2O, 1.7 mM CaCl22H2O, 25.1 mM NaHCO3, 31.3 mM 젖산 나트륨, 0.3 mM 피루브산 나트륨, 1 mM 글루타민, 0.1 mM EDTA, 및 5 ㎎ BSA/㎖으로 구성하였다. 최종적으로, 0.001 ㎎ Hb(methemoglobin type)/㎖ 및 5.5 ㎛ β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol; Gibco Invitrogen, 미국)을 CZB 배지에 첨가하였다. 활성화된 난모 세포는 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 세척-미네랄 오일로 덮여진 배지의 5-㎕ 드롭릿(droplet)에서 약 5일 동안 배양하였다(Lee et al.,2004). 활성화된 난모 세포의 배반포로의 발달은 hCG 삽입 후 약 140시간 스테레오마이크로스코프(stereomicroscope; SMZ-3, Nikon, 일본) 또는 역광 현미경(Eclipse TE-3000; Nikon, 일본)으로 모니티링 하였다.
ES 세포의 확립
모아진 배반포의 투명대를 Acid Tyrode 용액을 이용하여 제거한 후, 투명대가 없는(zona-free) 배반포를 젤라틴-코팅 4-웰 멀티-디쉬에서 3시간동안 10 ㎍ 미토마이신 C(mitomycin C; Chemicon, Temecula, CA, 미국)/㎖를 처리한 마우스 배아 섬유아세포의 피더층(feeder layer)에 배양하였다. 0.1 mM β-머캅토에탄올, 1% (v/v) 비필수 아미노산(Gibco Invitrogen, 미국), 2 mM L-글루타민, 1% (v/v) 페니실린 및 스트렙토마이신의 동결건조된 믹스츄어, 및 2,000 unite 마우스 LIF(Chemicon, 미국)/㎖, FBS와 녹-아웃 혈청 대체물의 3:1 혼합물로 보충한 녹-아웃 Dulbecco's 최소 필수 배지(KDMEM; Gibco Invitrogen, 미국)를 최초 배반포 배양에 이용하였다. 배양 4일째 되는 날에, 내세포괴(inner cell mass; ICM) 세포-유래 세포 콜로니를 모세관 파이펫으로 제거하고 추가적인 증식을 위하여 MEF 피더(feeder)에 재평판 하였다. 증식된 콜로니를 습한 37℃, 5% CO2 조건하에서 MEF 피더가 존재 또는 부존재한 0.04 % (v/w) 트립신-EDTA(Gibco Invitrogen, 미국)으로 분리시키고 35-mm 조직 배양 접시에 계대배양 하였다. 배양된 ES 세포가 70-80% 컨플루언시(confluency)가 되었을 때, 계대를 4일 간격으로 하였다. 배지는 계대배양동안 매일 교체하였다.
염색체 분석
확립된 ES 세포의 염색체는 20 계대에서 분석되었다. ES 세포는 37℃, 5% CO2에서 3시간 동안 0.1 ㎍ 콜세미드(colcemid)/㎖를 보충한 배지에서 배양하였다. 처리된 세포는 트립신을 처리하여 부유시켰고, 37℃에서 0.075 M KCl에서 15분간 재부유시켰으며, 저장 용액(hypotonic solution)에 놓은 후, 3:1(v/v) 메탄올과 아세트산 혼합물에 고정하였다. 염색체를 열-처리된 슬라이드에 펼친 후 김자액(Giemsa solution)으로 염색하였다.
표지 분석(Marker assay)
20번째 계대에서 모은 ES 세포 콜로니를 Ca2+ 및 Mg2+가 포함된 PBS(Gibco Invitrogen, 미국)로 세척하였고, 10분 동안 실온에서 4% (v/v) 포름알데히드로 고정하였으며, PBS로 2번 세척한 후 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase: AP)로 염색하였다. 반응하는 콜로니는 패스트 레드 TR/나프톨 AS-MX 포스페이트로 보이게 하였다. 항-스테이지-특이적 배아 항원(SSEA)-1(MC-480, 1:1000 희석액), 항-SSEA-3(MC-631, 1:1000 희석액), 항-SSEA-4(MC-813-70, 1:1000 희석액), 항-인테그린 α6(P2C62C4, 1:1000 희석액) 및 항-인테그린 β1(MH25, 1:1000 희석액) 항체들은 발생 연구 하이브리도마 은행(Iowa City, IA, 미국)으로부터 공급된 모노클로날 항체를 이용하였다. 항체의 위치 측정은 다코시토메이션 키트(DakoCytomation, Carpinteria, CA, 미국)를 이용하여 검출하였다.
배아체 형성 및 3배엽으로부터 유래한 세포의 검출
확립된 ES 세포를 0.04% (v/v) 트립신-EDTA액(Gibco Invitrogen, 미국)으로 처리한 후 100-mm 플라스틱 페리 디쉬로 옮겼다. 세포 부유물을 배아체가 형성될 때까지 LIF 및 β-머캅토에탄올-부재 배지에서 배양하였다. 그 다음 각 배아체를 96-웰 플레이트에 접종하였고, 7일간 배양한 후 3배엽에 특이적인 마커로 염색하였다. 예를 들면, 외배엽에 대해서는 신경 카드헤린(cadherin) 접착 분자(NCAM, 1:1,000 희석; BIODESIGN International, Saco, ME) 및 S-100(1:1,000 희석; BIODESIGN International), 중배엽에 대한 근육 액틴(1:1,000 희석; BIODESIGN International) 및 데스민(1:1,000 희석; Santa Cruz Biotechnology, Delaware, CA, 미국), 내배엽에 대한 α-페토프로틴(1:1,000 희석; BIODESIGN International) 및 트로마-1(1:1,000 희석; Hybridoma Bank)로 염색하였다. 항체의 위치 측정은 위와 같이 검출하였다.
신경 분화에 대한 유도 및 검출
신경 계통 세포로 in vitro-분화시키기 위하여, 미분화 ES 세포를 분리하여 0.5-1.5 x 104/cm2의 밀도로 0.1% 젤라틴으로 코팅된 플라스틱 배양 디쉬에 놓았다. 배양 디쉬에는 N2(Gibco Invitrogen)와 B27(Gibco Invitrogen)을 첨가한 DMEM/F12를 구성하는 변형된 N2B27 배지를 포함시켰다. 형태학적 평가와 함께 배양을 1주 동안 계속되었으며 배지는 2일에 한번 교체하였다. 세포의 관리를 위하여, 분화된 세포는 피브로넥틴(fibronectin)으로 코팅된 조직 배양 디쉬로 옮겨졌다.
세포 분화를 검출하기 위하여 면역세포화학 분석을 하였다. 분화된 세포는 4% 파라포름알데히드에 5분간 고정시켰다. 5% FBS가 첨가된 PBS로 정지시킨 후 고정된 세포를 제1차 항체와 반응시켰다. 제1차 항체는 Nestin(염소 IgG, SC-21247, Santa Cruz Biotechnology), β-튜블린 타입 Ⅲ(마우스 IgG, CBL412, Chemicon, Temecula, CA, 미국), D4(마우스 IgM, MAB345, Chemicon, 미국) 및 GFAP(마우스 IgG, MAB360, Chemicon, 미국)을 이용하였다. 항원-항체 복합체는 형광 제2차 항체를 이용하여 검출하였다. 제2차 항체는 Alexa Fluor 488-접합 항-염소 IgG(A-11055, Molecular Probes, Eugene, OR, 미국), Alexa Fluor 568-접합 항-마우스 IgG(A-11061, Molecular Probes, 미국), 또는 Alexa Fluor 488-접합 항-마우스 IgG(A-21042, Molecular Probes, 미국)를 사용하였다. 488 nm 또는 568 nm에서 크립톤-아르곤 혼합 가스 레이저 여기 되고 플루오르세인 필터(fluorescein filter; Bio-Rad, Hemel Hempstead, 영국)가 장착된 레이저 주사 공초점 현미경을 이용하여 염색된 세포를 관찰하였다.
테라토마(Teratoma) 형성
MEF 피더층에서 20번 계대하여 확립한 ES 세포는 피더 세포 없이 수거하였으며, 1 x 107개 세포를 다 자란 NOD-SCID 마우스의 피하에 주입하였다. 주입한 지 8주째 되는 테라도마를 4% (v/v) 파라포름알데히드로 고정시켰다. 조직은 파라핀 블록으로 넣고, 헤마톡실린과 에오신으로 염색하여 위상차 현미경(BX51TF; Olympus. Kogaku, 일본)으로 관찰하였다.
동형접합 전강 나포-유래 ES 세포의 기탁
상기에 기술된 모든 ES 세포 특성을 나타내는 난포-유래 ES 세포는 “FpB6D2-sun-1"로 명명하였고, 2006년 4월 10일 국제기탁기관인 한국 세포주 연구 재단에 기탁하였으며, 기탁번호는 KCLRF-BP-00133이다.
실험 결과
Ⅰ 전강 난포 조작에 대한 기초 시스템의 확립
회수 효과의 비교
총 2,432개의 전강 난포는 2가지의 다른 방법에 의하여 난소로부터 회수하였다(표 1). 세포군이 회수한 것과 비교하였을 때, 회수 방법과 상관없이 초기 제2차 난포의 수는 제1차 난포 및 말기 제2차 난포보다 더 많았다(1,249개 세포 vs 485개 및 698개 세포, P<0.0001). 도 2에서 나타내는 것과 같이, 난소에서 모아진 전강 난포는 단일 또는 그룹 형태를 나타내었다. 그룹으로 부터 모아진 난포의 경우에는, 복합체(complexes)로부터 단일 난포를 분리하는데 매우 어렵기 때문에 단일 난포 배양이 불가능하다.
전반적으로, 마우스 당 회수된 총 전강 난포의 수는 효소적 방법을 이용했 을 때보다 기계적 방법을 이용하였을 때가 더 많았다(339±48개 세포 vs 202±28개 세포). 효소 처리로 인하여, 전강 난포가 서로 뭉쳐지는 정도가 매우 낮았다. 제1차 난포, 초기 제2차 난포 및 말기 제2차 난포의 수는 각각 84±14, 97±12 및 56±17개 이었다. 효소적 방법을 사용하는 경우 기계적 방법보다 더 많은 단일 복합체(complex) 전강 난포를 얻을 수 있었다(202±28개 vs 102±26개). 효소적 회수 방법으로 증가된 제1차 난포(52±12개 vs 35±9), 초기 제2차 난포(110±18개 vs 46±13개) 및 말기 제2차 난포는(39±12개 vs 21±7개)인 것으로 나타났다.
도 3에서 나타나듯이, 기계적 방법에 의해서 회수된 전강 난포는 구형 모양을 가지고 있으며 손상되지 않은 기저막을 유지하고 있었다. 몇 몇의 막세포는 기저막에 여전히 붙어있었다. 효소적인 방법에 의해 회수된 전강 난포는 부분적으로 또는 전체적으로 기저막을 손실하였으며 막세포는 더 이상 난포에 붙어있지 않았다. 효소적인 방법에 의해 회수된 전강 난포의 세포질, 특히 인접 주변에는 기계적 방법에 의해 회수된 전강 난포의 것과 비교하여 조잡한 모습을 나타내었다.
분리 방법 | 회수된 난포의 평균±표준 편차 수 | 단일로 회수된 전강 난포의 평균±표준 편차 수 |
소계 | ||
제1차 전강 난포 |
초기 제2차 전강난포 |
초기 제2차 전강난포 |
|||
기계적 방법 | 339±48a | 35±9 | 46±13 | 21±7 | 102±26a |
효소적 방법 | 202±28b | 52±12 | 110±18 | 39±12 | 202±28b |
총 16마리의 암컷 F1 마우스가 희생되었으며 각각의 처리는 8번 반복하였다. 회수된 전강 난포의 총 수, 단일 및 그룹으로 회수된 난포의 서브총 수에서 모델의 효과는 0.0001(P 값)보다 작았다.
분리 방법 | 회수된 난포의 평균±표준 편차 수 | 그룹으로 회수된 전강 난포의 평균±표준 편차 수 |
소계 | ||
제1차 전강 난포 |
초기 제2차 전강난포 |
초기 제2차 전강난포 |
|||
기계적 방법 | 339±48a | 84±14 | 97±12 | 56±17 | 237±38a |
효소적 방법 | 202±28b | 0 | 0 | 0 | 0b |
총 16마리의 암컷 F1 마우스가 희생되었으며 각각의 처리는 8번 반복하였다. 회수된 전강 난포의 총 수, 단일 및 그룹으로 회수된 난포의 서브총 수에서 모델의 효과는 0.0001(P 값)보다 작았다.
전강 난포의 배양에 있어서의 형태적 변화
일반적으로, 전강 난포의 in vitro-성장은 4단계, 즉 난포, 확산, 슈도강 및 퇴화적 단계로 분류하였다(도 4). 난포 단계에서 전강 난포는 원래 형태 그대로 남아 있었고, 원형 모양과 뚜렷한 기저막을 가진다. 확산 단계에서, 난포 난목세포를 함입하는 과립막 세포는 활발히 증식하였고, 과립막 세포층의 팽창 및 증가를 유도하였다. 난포 크기의 증가는 난포 단계와 비교하여 명확하게 나타내었다. 슈도강 단계에서 전강 난포는 강-유사, 과립막 세포-부재 부위를 형성함으로써 특성화 되었다. 과립막 세포의 최대 증가는 과립막 세포 기질사이에 빈 공간을 형성하였고, 난포의 기저막은 더 이상 보이지 않았다. 난포내 난포세포 및 인접한 과립막(cumulus) 세포는 세포 복합체(complex)로 부터 자발적으로 분리되었다. 퇴화 단계에서, 검은 점은 과립막 세포 기질에서 볼 수 있었다. 과립막 세포의 모습은 점점 감소하였고, 결국 과립막 세포 복합체는 붕괴되었다.
전강 난포의 in vitro 성장
전강 난포의 타입에 상관없이, in vitro 배양된 모든 난포는 난포에서 퇴화 단계로 점진적인 성장을 하였다. 도 5에서 볼 수 있듯이, 전강 난포의 in vitro 성장에서 중요한 차이점을 나타내었으며, 전강 난포의 발생 단계 및 회수 방법은 성장에 있어서 영향을 미쳤다. 제1차 난포의 경우에, 기계적으로 회수된 난포는 배양 6일째에서 확산 단계에 진입하였다. 제1차 난포는 배양 8일째에 슈도강 단계로 진입하였으며, 피크(peak) 발생 시점은 배양 11일째이었다(63%). 퇴화 단계는 관찰 전 기간을 통하여 확인되었다(배양 8일째에서 14일 사이). 효소적 방법에 의하여 회수된 제1차 난포의 상당 부분(97%)은 배양 1일째에 확산 단계로 접어들었다. 그러나, 슈도강 단계로 진입하는 난포는 없었으며 배양 4일째에 퇴화 단계로 접어들었다. 초기 제2차 난포의 경우에, 슈도강 단계는 기계적 및 효소적 회수에 있어서 각각 배양 5일과 4일째에 처음으로 확인되었다. 확산 및 슈도강 단계로 진행하는 난포는 기계적 회수에 의한 경우에는 배양 6일째(87%) 및 10일째(74%)에서 피크를 나타내었으며, 효소적 회수에 의한 경우에는 배양 4일째(86%) 및 9일째(70%)에서 피크를 각각 나타내었다. 말기 제2차 난포의 경우, 확산단계는 기계적 회수 방법에 있어서 배양 4일째(94%)에서 피크를 나타냈으며, 효소적 회수 방법에 있어서는 배양 3일째에서 피크를 나타내었다. 슈도강 단계로 발전하는 난포는 기계적 및 효소적 회수의 그룹에 있어 배양 4일째(1%) 및 배양 3일째에 각각 처음 나타내었다. 배양 7일째(63%) 및 6일째(80%)에서 각각 피크를 나타내었다.
난포속 난모 세포의 성숙 및 수정
효소적 방법에 의해 회수된 제1차 난포가 슈도강 단계로 발전하지 아니하였기 때문에(도5), 난포의 총 5가지의 카테고리(기계적 방법에의해 회수된 제1차 난포, 기계적으로 또는 효소적으로 회수된 초기 및 말기 제2차난포들)로부터 유래된 난모 세포를 본 실험에 제공하였다. 제1차 난포의 경우, 유사 분열 중기 Ⅱ단계 난모 세포는 배양 10일째(17%)에서 처음 나타났으며, 배양 11일째(27%)에 피크를 나타내었다. 반면, 초기 제2차 난포로부터 유래한 난모 세포는 기계적과 효소적 방법에 있어서 각각 배양 8일째(15%) 및 6일째(43%)부터 유사 분열 중기 Ⅱ단계에 도달하였다. 유사 분열 중기 Ⅱ단계의 난모 세포를 회수하기 위한 적절한 시점은 기계적 방법에 있어서는 9일째(47%)이고 효소적 방법에 있어서는 7일째(54%)이었다. 말기 제2차 난포의 경우에, 각 배양 방법(기계적인경우에는 29% 및 효소적 방법인 경우에는 57%)에 있어서 5일째 되는 날부터 유사 분열 중기 Ⅱ단계에 도달하였으며 난모 세포 성숙의 배양 7일째(기계적 방법에 있어서는 38%이고 효소적 방법에 있어서는 78%)에 피크 시점을 나타내었다.
In vitro 배양된 전강 난포에서 회수된 유사분열 중기 Ⅱ단계의 난모 세포의 투명대 두께 및 직경을 in vivo 난소에서 배란된 난모 세포와 비교하였다. 표 2 및 도 7에서 볼 수 있듯이, 난모 세포의 직경은 일반적으로 in vivo-유래 난모 세포와 비교하여 in vitro-배양된 전강 난포로부터 유래한 모든 그룹의 난모 세포에서 감소하는 양상을 나타내었다(63.31에서 65.53 ㎛ vs 75 ㎛). 효소적으로 회수된 난포에서 유래한 난모 세포의 경우에는 투명대의 두께가 매우 얇게 나타났다(5.41에서 5.74 ㎛ vs 7.76 ㎛). 제1차 난포로부터 유래한 난모 세포는 초기 및 말기 제2차 난포로부터 유래한 난모 세포보다 더 작은 직경을 가졌다.
난모세포의 근원 | In vitro 배양에 있어서 회수 방법 | M Ⅱ단계 난모 세포의 수 | 투명대의 평균 두께(㎛) | 난모 세포의 평균 직경(㎛) |
제1차 난포 | 기계적 방법 | 52 | 7.88±1.06a | 63.31±3.35a |
초기 제2차 난포 | 기계적 방법 | 52 | 8.08±0.91a | 64.57±2.60b |
초기 제2차 난포 | 효소적 방법 | 52 | 5.74±0.74b | 65.20±1.92b |
말기 제2차 난포 | 기계적 방법 | 52 | 7.65±0.78a | 65.06±3.21b |
말기 제2차 난포 | 효소적 방법 | 52 | 5.41±0.89b | 65.53±2.40b |
성숙 난포 (Graffian follicle in vivo) |
- | 20 | 7.76±0.16a | 75.0±0.04c |
난모 세포의 투명대 두께 및 직경에 있어서 모델 효과는 0.001보다 낮았다(P 값).
abc)컬럼 안에서 상이한 위첨자는 유의적 차이가 있다, P<0.05
단위생식 활성화 후 전핵(pronuclear) 형성 비율은 86에서 94%의 범위(표 3)이고 인 비보-유래 난모세포의 91%가 상기 활성화 후에 전핵을 형성 하였다. 처리 사이에서는 유의한 차이가 검출되지 않았다.
성숙된 난모 세포 | 전강 난포 회수 방법 | 회수된 난포의 단계 | M Ⅱ 단계 난모세포의 수(%) | |
활성된 | 전핵 형성 | |||
In-vivo b | N/A | N/A | 45 | 41(91) |
In-vitro | 기계적 방법 | 제1차 난포 | 14 | 12(86) |
초기 제2차난포 | 23 | 21(91) | ||
말기 제2차난포 | 16 | 15(94) | ||
효소적 방법 | 초기 제2차난포 | 57 | 53(93) | |
말기 제2차난포 | 49 | 45(92) |
a) 배양된 전강 난포는 2가지 다른 방법에 의하여 난로로부터 회수하였다.
b) 난모 세포는 자연 배란 후 플러싱(flushing)한 난관으로부터 얻었다.
c) 단위생식 활성화는 SrCl2 및 사이토칼라신 B(cytochalasin B)으로 하였다.
전핵을 형성하는 M Ⅱ단계의 난모 세포의 수에 있어서의 표본 효과는 0.972이었다(P values).
Ⅱ. 전강 난포로부터 유래한 동형접합 배아 줄기 세포
F1(C57BL6 x DBA2) 혼성 마우스로부터 유래한 전강 난포의 조작
예비 실험에서 기계적으로 회수된 전강 난포의 약 60%는 초기 제2차 난포인 반면, 나머지 40%는 제1차 난포(< 직경 100 ㎛) 또는 말기 제2차 난포(< 직경 125 ㎛)이었다. 8-10일 배양된 성숙 난모 세포를 스트론티움 클로라이드(strontium chloride) 및 사이토칼라신 B(cytochalasin B)로 처리한 경우, 배양기간에 상관없이 90% 이상 2개의 전핵을 형성하는 단위생식적 활성화가 이루어졌다. 그러나, 단위생식적으로 활성화된 후 8일 또는 10일 배양에서는 분열된 난모 세포를 생산하지 못하였다. 표 4에서 볼 수 있듯이, 9일 배양은 최적의 분열(29/107=27%)을 야기하였으나, 배지에 LH를 첨가하는 경우에는 분열 비율을 추가적으로 향상시키지 못하였다(16-33%). 13번 반복 실험에서, 25개 배반포가 116개 난모 세포에서 유래하였고, LIF-첨가 배지 배양을 통하여 1개의 초기 ES 세포를 확립하였다.
F1(C57BL6 x CBA/Ca) 혼성 마우스로부터 유래한 전강 난포의 조작
C57BL6 x CBA2 마우스로부터의 결과에 기초하여, LH는 난포 배양 배지에 첨가하지 않았다. 전강 난포에서 있는 난포내 난모 세포는 8-13일 배양하였고, 단위생식적 활성화된 후 분열 비율은 8, 9, 10, 11, 12 및 13일 배양에 있어 43% (3/7), 67% (61/92), 33% (4/12), 50% (6/12), 0% (0/7) 및 0% (0/11)를 각각 나타내었다(표 4). 5번 반복실험으로부터 유래한 74개의 분열된 난모 세포중 59개(80%)는 배반포로 발달하였다. 9개의 제1차 차 ES 세포 주를 확립하였고, 9개 모두 9일 배양된 난포 세포로부터 유래하였다.
변종 | 세트 | 회수 시간a | 배지b 첨가물 | 활성화된 난모 세포 | 난모 세포 수(%)c | 콜로니화 된 ICM 세포의수 | 확립된 ES 세포의 수 | |
분열된 난모 세포 | 배반포로 발달된 난모세포 수 | |||||||
B6/D2 | 1 1 1 |
8 8 10 |
미첨가 미첨가 미첨가 |
1 3 3 |
0(0) 0(0) 0(0) |
0(0) 0(0) 0(0) |
0 0 0 |
0 0 0 |
2 2 2 |
9 9 9 |
미첨가 2.5 IU LH 5 IU LH |
19 17 16 |
10(53) 7(41) 13(81) |
4(21) 2(12) 2(13) |
0 0 0 |
0 0 0 |
|
3 3 3 |
9 9 9 |
2.5 IU LH 5 IU LH 10 IU LH |
15 15 16 |
6(40) 5(33) 1(6) |
2(13) 1(7) 0(0) |
1 0 0 |
1 0 0 |
|
4 4 4 |
9 9 9 |
미첨가 5 IU LH 10 IU LH |
5 12 12 |
5(100) 8(67) 7(58) |
3(60) 3(25) 0(0) |
0 0 0 |
0 0 0 |
|
5 5 5 |
9 9 9 |
미첨가 5 IU LH 10 IU LH |
14 7 15 |
0(0) 0(0) 0(0) |
0(0) 0(0) 0(0) |
0 0 0 |
0 0 0 |
|
6 6 6 |
9 9 9 |
미첨가 5 IU LH 10 IU LH |
18 13 17 |
0(0) 0(0) 1(6) |
0(0) 0(0) 0(0) |
0 0 0 |
0 0 0 |
|
7 7 7 |
9 9 9 |
미첨가 5 IU LH 10 IU LH |
12 13 14 |
0(0) 1(8) 0(0) |
0(0) 1(8) 0(0) |
0 0 0 |
0 0 0 |
|
8 8 8 |
9 9 9 |
미첨가 2.5 IU LH 5 IU LH |
9 14 14 |
2(22) 3(21) 3(21) |
0(0) 0(0) 0(0) |
0 0 0 |
0 0 0 |
|
9 9 9 |
9 9 9 |
2.5 IU LH 5 IU LH 10 IU LH |
8 10 8 |
4(50) 2(20) 4(50) |
2(25) 0(0) 0(0) |
0 0 0 |
0 0 0 |
|
10 10 10 |
9 9 9 |
미첨가 2.5 IU LH 10 IU LH |
10 15 13 |
5(50) 3(20) 3(23) |
0(0) 3(20) 0(0) |
0 0 0 |
0 0 0 |
|
11 11 11 |
9 9 9 |
미첨가 2.5 IU LH 10 IU LH |
12 10 9 |
4(33) 5(50) 1(11) |
0(0) 1(10) 0(0) |
0 0 0 |
0 0 0 |
|
12 12 12 |
9 9 9 |
미첨가 2.5 IU LH 10 IU LH |
8 11 12 |
3(38) 4(36) 1(8) |
0(0) 0(0) 1(8) |
0 0 0 |
0 0 0 |
|
13 13 |
9 9 |
2.5 IU LH 5 IU LH |
17 8 |
3(18) 2(25) |
0(0) 0(0) |
0 0 |
0 0 |
|
합계 최적의 회수 시간=배양 후 9일/25 배반포로부터 1개의 ES 세포주(9 반복실험) | ||||||||
B6C/Ca | 1 | 9 | 미첨가 | 13 | 9(69) | 7(54) | 3 | 1d |
2 | 9 | 미첨가 | 68 | 42(62) | 37(54) | 17 | 7d | |
3 3 |
8 9 |
미첨가 미첨가 |
7 11 |
3(43) 10(91) |
1(14) 8(73) |
1 4 |
0 1d |
|
4 4 |
10 11 |
미첨가 미첨가 |
12 12 |
4(33) 6(50) |
2(17) 4(33) |
2 1 |
0 0 |
|
5 5 |
12 13 |
미첨가 미7첨가 |
7 11 |
0(0) 0(0) |
0(0) 0(0) |
0 0 |
0 0 |
|
합계 최적의 회수 시간=배양 후 9일/59 배반포로부터 9개 이상 ES 세포주(5 반복실험) |
a슈도강 난포를 회수하기 위한 배양 기간.
bFBS, 인슐린, 트랜스퍼린, 셀레니움 및 재조합 인간 FSH가 첨가된 리보뉴클레오시드- 및 디옥시리보뉴클레오시드-함유 α-MEM-glutamax 배지는 초기 제2차 난포의 배양을 위한 기초 배지로서 이용하였다.
c인공적으로 SrCl2 및 사이토칼라신 B로 활성화시킨 난모 세포 수의 백분율.
d콜로니-형성 ICM 세포군은 -196℃에 저장하였다.
ES 세포의 특성화
10개의 제1차 차 ES 세포 배양(C57BL6 x DBA2 마우스로부터 1개 및 C57BL6 x CBA/Ca 마우스로부터 9개)을 확립하였으며 C57BL6 x CBA/Ca로부터 유래한 하나의 세포주를 제외하고 확립된 세포를 50번 이상 성공적으로 계대 배양하였다. 20th 계대배양에서 콜로니-형성 세포는 AP, 항-SSEA-1, 항-인테그린 α6(anti-integrin α6), 항-인테그린 β1 및 Oct-4 항체에 양성으로 염색된 반면, 항-SSEA-3 또는 항-SSEA-4 항체에 대한 반응은 검출되지 않았다(도 9).
결과적으로, 확립된 세포는 LIF 없이도 배아체를 형성하였다. 면역세포화학 분석에서 배아체-형성 세포가 3배엽중 하나에 대한 특이적인 마커에 양성 반응을 나타내었다. 신경 카드헤린 접착 분자(Neural cadherin adhesion molecular), S-100, Troma-1, 근육 액틴(muscle actin), 데스민(desmin) 및 α-페토프로틴(α-fetoprotein)을 마커로서 이용하였다(도10).
도 11에서 볼 수 있듯이, 확립된 세포는 명시된 배지에서 배양한 후 뉴런(Tuj1- 및 nestin-positive 세포), 희돌기아교세포(oligodendrocytes) 및 성상세포(astrocyte)로 추가적으로 분화하였다.
확립된 ES 세포를 NOD-SCID 마우스로 이식하는 경우에 선 위-유사 구조(glandular stomach-like structure), 외분비 췌장 조직(exocrine pancreatic tissue), 호흡기 섬모 상피(respiratory ciliary epithelium), 각질중층편평상피(keratinized and stratified squamous epithelium), 신경상피 로제트(neuroepithelial rosettes), 색소망막 상피(pigmented retinal epithelium), 피지선(sebaceous glands), 지방세포(adipocytes) 및 골 근육 다발(skeletal muscle bundle)를 포함하는 테라토마(teratoma)를 형성하였다(도 12). 염색체 분석(karyotyping)에서 확립된 세포가 XX로 된 40개 염색체를 갖는 것으로 확인되었다.
기술적 어려움으로 인하여, ES 세포를 확립하기 위하여 난소 조직에서 밀집해 있는 원시 또는 제1차 난포를 사용하지는 못하였지만, 초기 제2차 난포는 ES 세포의 근원으로서 충분하였다. 회수된 난모 세포군의 60%는 초기 제2차 난포 단계에 있었으며, 평균 80개 이상의 난포를 한 마리의 마우스에서 회수하였다. 성숙(데이터에 없는 예비결과에서의 50-60%), 최적의 처리 조건하에서 분열(60%), 배반포 형성(80%) 및 ES 세포 확립(20%)의 평균율을 가정하면, 적어도 5개 또는 6개의 제1차 ES 세포를 하나의 동물로부터 확립할 수 있었다. 사실, 안락사 시킨 모든 동물에서 초기 제2차 난포로부터 ES 세포를 확립하는데 성공하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (10)
- 다음 단계를 포함하는 전강 난포-유래 배아 줄기세포의 생산 방법:(a) 포유동물의 난소로부터 분리된 전강 난포를 인 비트로 배양시키는 단계;(b) 배양된 전강 난포에 존재하는 인 비트로 난포 세포를 성숙시키는 단계;(c) 성숙된 난모 세포를 활성화하여 단위생식 시키는 단계;(d) 활성화된 난모 세포를 배양하여 배반포를 형성시키는 단계; 및(e) 전강 난포-유래 배아 줄기 세포를 생산하기 위하여 배반포의 내세포괴(inner cell mass: ICM) 세포를 배양하는 단계.
- 제 1 항에 있어서, 상기 전강 난포는 기계적 방법으로 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 전강 난포는 초기 제2차 난포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 포유동물은 인간, 소, 양, 돼지, 말, 토끼, 염소, 마우스, 햄스터 또는 랫트인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 전강 난포는 단계 (a)에서 슈도강(pseudoantral) 단계로 인 비트로 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 전강 난포의 배양은 단일세포 배양방법에 의하여 인 비트로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)의 활성화된 난모 세포의 배양은 단일세포 배양방법에 의하여 인 비트로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
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