CN111269976A - 检测MeCP2突变的物质在检测MeCP2突变是否为致病突变以及筛选药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测MeCP2突变的物质在检测MeCP2突变是否为致病突变以及筛选药物中的应用。本发明发现MeCP2可以与核小体串珠结合发生相变，MeCP2致病性截短突变和点突变均导致其与核小体串珠发生的相变出现异常；而细胞内的实验结果表明，只有致病性点突变会引起相变异常，非致病性点突变对相变无明显影响，进一步证实了相变异常与MeCP2突变所致疾病的发生密切相关。因此，逆转异常相变很有可能成为治疗相关疾病的新思路和方向，可以通过高通量筛选获得可逆转异常相变的调控物并应用于潜在靶向药物开发，该策略也可为治疗其他相变异常相关疾病提供参考。

Description

检测MeCP2突变的物质在检测MeCP2突变是否为致病突变以及 筛选药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，检测MeCP2突变的物质在检测MeCP2突变是否为致病突变以及筛选药物中的应用。

背景技术

“相变”作为物质的一种特性在物理界及日常生活中早已广为人知，近几年科学家们逐渐发现相变(或相分离)机制也广泛存在于生物细胞中，且在细胞生命周期的时空调控等方面行使重要的生物学功能。

目前的研究发现，当溶液中的多价的大分子与其多价配体互作时，容易产生更大的复合物，后者的溶解度一般会降低，从而从普通溶液相分离出来，形成一个复合物富集的独立的液态相，这个转变过程被称为“液-液分离相变”(简称为“相变”)(LLPS，liquid-liquid phase separation)，所产生的液态相即为相变部分或相变相，其余为非相变部分或普通相。其中，多价的价数是指大分子或其配体中含有的可与对方互作的结合区的数量。对蛋白互作而言，多价蛋白和它们的多价配体在体外也会发生“液-液分离相变”现象，即可以产生一个正常的溶液相和一个蛋白富集的粘稠的液体相。在显微镜下可见蛋白富集的液体相内含有大量小液滴(即相变液滴)，液滴直径可达微米级甚至更大。

甲基化CpG结合蛋白2(Methyl CpG binding protein 2，MeCP2)可结合甲基化和非甲基化的DNA，且与甲基化DNA的亲和力更强。MeCP2是一个重要的转录调控因子，其表达异常或突变(包括点突变以及重复或缺失突变)，都会导致其调控的基因表达水平发生改变，引起神经元、轴突、树突发育异常，从而导致严重的神经系统疾病。MeCP2的R106W突变、R111G突变、Y120D突变、R133C突变、P152R突变、F157I突变、T158M突变、P225R突变、R306C突变以及第168位提前终止(R168X)、第255位提前终止(R255X)、第270位提前终止(R270X)、294位提前终止(R294X)会导致天使综合症，患者表现为智力减退，四肢运动刻板，言语发育迟缓，自闭症，其中第106、111、120、157、158位点的突变以及R168X、R255X、R270X截短突变导致的疾病程度更为严重，第133和306位的点突变，以及R294X的截短突变症状较前者轻。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测MeCP2突变是否为致病突变，以及如何筛选治疗和/或预防MeCP2突变所致疾病的药物。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述任一应用：

1、检测MeCP2突变的物质在制备检测或辅助检测所述MeCP2突变是否为致病突变产品中的应用；

2、检测MeCP2突变的物质在检测或辅助检测所述MeCP2突变是否为致病突变中的应用；

3、检测MeCP2突变的物质在筛选或辅助筛选治疗和/或预防所述MeCP2突变所致疾病药物中的应用；所述MeCP2突变为MeCP2致病突变；

4、检测MeCP2突变的物质在制备筛选或辅助筛选治疗和/或预防所述MeCP2突变所致疾病药物产品中的应用；所述MeCP2突变为MeCP2致病突变；

5、检测MeCP2突变的物质在制备检测或辅助检测所述MeCP2突变是否致病产品中的应用；

6、检测MeCP2突变的物质在检测或辅助检测所述MeCP2突变是否致病中的应用；

7、检测MeCP2突变的物质在制备诊断或辅助诊断所述MeCP2突变所致疾病产品中的应用；

8、检测MeCP2突变的物质在诊断或辅助诊断所述MeCP2突变所致疾病中的应用。

上述应用中，所述检测MeCP2突变的物质可包括发生所述MeCP2突变的MeCP2突变蛋白与下述a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)DNA片段；

a2)核小体串珠；

a3)用于制备核小体串珠的物质；

a4)含有核小体串珠的细胞。

所述核小体串珠是由DNA缠绕组蛋白八聚体形成的直径为11nm的结构。

上述应用中，a1)所述DNA片段可为a11)或a12)或a13)：

a11)核小体定位DNA；

a12)含有所述核小体定位DNA的DNA片段；

a13)以a12)为重复单元，重复n次所形成的DNA片段。

上述应用中，a11)所述核小体定位DNA具体可为“601”序列。所述“601”序列可为序列21的第31-177位或序列22的第24-170位。

a12)所述DNA片段可为序列21的第16-192位，或序列22的第9-185位或第186-362位或第1956-2132位。

a13)中，n为任一大于等于1的自然数。具体的，n可为4-12。a13)所述DNA片段具体可为序列表中序列21或序列22所示的DNA片段。

所述DNA片段可为甲基化或非甲基化DNA片段。

在本发明的一个实施例中，所述核小体串珠由序列21或序列22所示的DNA片段与组蛋白八聚体形成。

上述应用中，a3)所述物质可为a31)或a32)：

a31)组蛋白八聚体与所述DNA片段；

a32)H2A、H2B、H3和H4与所述DNA片段。

上述应用中，所述检测MeCP2突变的物质还可包括MeCP2未突变蛋白质。

所述检测MeCP2突变的物质还可包括报告基团，所述报告基团用于标记MeCP2或其突变蛋白质。

所述报告基团可为染料(如Alexa Fluor^TM 568NHS Ester(Succinimidyl Ester))或荧光蛋白(如mCherry)。

当所述报告基团为所述荧光蛋白时，所述荧光蛋白可直接连接或通过连接肽连接在所述MeCP2突变蛋白或MeCP2未突变蛋白质上。

所述检测MeCP2突变的物质可由所述MeCP2突变蛋白与上述a1)组成，也可由所述MeCP2突变蛋白与上述a2)组成，也可由所述MeCP2突变蛋白与上述a3)组成，也可由所述MeCP2突变蛋白与上述a4)组成，也可由所述MeCP2突变蛋白、上述a1)与MeCP2未突变蛋白质组成，也可由所述MeCP2突变蛋白、上述a2)与MeCP2未突变蛋白质组成，也可由所述MeCP2突变蛋白、上述a3)与MeCP2未突变蛋白质组成，也可由所述MeCP2突变蛋白、上述a4)与MeCP2未突变蛋白质组成，还可由所述MeCP2突变蛋白、上述a1)、MeCP2未突变蛋白质与所述报告基团组成，也可由所述MeCP2突变蛋白、上述a2)、MeCP2未突变蛋白质与所述报告基团组成，也可由所述MeCP2突变蛋白、上述a3)、MeCP2未突变蛋白质与所述报告基团组成，也可由所述MeCP2突变蛋白、上述a4)、MeCP2未突变蛋白质与所述报告基团组成。

具体的，利用所述检测MeCP2突变的物质检测所述MeCP2突变是否为致病突变的方法，包括：混合发生所述MeCP2突变的MeCP2突变蛋白质与所述核小体串珠，得到待测体系；混合MeCP2未突变蛋白质与所述核小体串珠，得到对照体系；比较所述待测体系与所述对照体系的相变情况确定所述MeCP2突变是否为致病突变：如所述待测体系的相变能力小于所述对照体系的相变能力，所述MeCP2突变为或候选为致病突变；如所述待测体系的相变能力不小于所述对照体系的相变能力，所述MeCP2突变为或候选为非致病突变。

利用所述检测MeCP2突变的物质筛选治疗和/或预防所述MeCP2突变所致疾病药物的方法，所述MeCP2突变为MeCP2致病突变，所述方法包括：混合待测药物、发生所述MeCP2突变的MeCP2突变蛋白质与所述核小体串珠，得到待测体系；混合所述MeCP2突变蛋白质与所述核小体串珠，得到对照体系；比较所述待测体系与所述对照体系的相变情况确定所述待测药物是否为可以治疗和/或预防所述MeCP2突变所致疾病药物：如所述待测体系的相变能力大于所述对照体系的相变能力，所述待测药物为或候选为可以治疗和/或预防所述MeCP2突变所致疾病药物；如所述待测体系的相变能力不大于所述对照体系的相变能力，所述待测药物不为或候选不为可以治疗和/或预防所述MeCP2突变所致疾病药物。

利用所述检测MeCP2突变的物质检测所述MeCP2突变是否致病的方法，包括：混合发生所述MeCP2突变的MeCP2突变蛋白质与所述核小体串珠，得到待测体系；混合MeCP2未突变蛋白质与所述核小体串珠，得到对照体系；比较所述待测体系与所述对照体系的相变情况确定所述MeCP2突变是否致病：如所述待测体系的相变能力小于所述对照体系的相变能力，所述MeCP2突变致病或候选致病；如所述待测体系的相变能力不小于所述对照体系的相变能力，所述MeCP2突变不致病或候选不致病。

上文中，所述待测体系和所述对照体系均可为细胞内环境或reaction buffer环境，所述reaction buffer可由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述reaction buffer中的浓度分别为20mM HEPES和100mM NaCl，pH 7.4。

所述相变能力可体现在是否发生相变、视野范围内相变相占视野的比例、相分离边界的清晰度和/或相变相中所述报告基团的信号强度上。

上述应用中，所述MeCP2突变可为MeCP2的截短突变或点突变。

在本发明的一个实施例中，所述MeCP2的截短突变为MeCP2第168位、第255位、第270位或第294位的提前终止。

所述MeCP2的点突变可为MeCP2的第106、111、120、133、152、157、158、225或/和306位的突变。具体的，所述MeCP2的点突变可为MeCP2的R106W突变、R111G突变、Y120D突变、R133C突变、P152R突变、F157I突变、T158M突变、P225R突变或/和R306C突变。

所述MeCP2突变所致疾病可为神经系统发育异常性疾病。具体的，所述MeCP2突变所致疾病可为MeCP2突变引起的神经系统发育异常性疾病，或含有MeCP2突变的神经系统发育异常性疾病。更进一步，所述MeCP2突变所致疾病可为天使综合症。

本发明还提供了具有如下任一功能的产品，所述产品为所述检测MeCP2突变的物质：

X1)制备检测或辅助检测所述MeCP2突变是否为致病突变产品；

X2)检测或辅助检测所述MeCP2突变是否为致病突变；

X3)筛选或辅助筛选治疗和/或预防所述MeCP2突变所致疾病药物；所述MeCP2突变为MeCP2致病突变；

X4)制备筛选或辅助筛选治疗和/或预防所述MeCP2突变所致疾病药物产品；所述MeCP2突变为MeCP2致病突变；

X5)制备检测或辅助检测所述MeCP2突变是否致病产品；

X6)检测或辅助检测所述MeCP2突变是否致病；

X7)制备诊断或辅助诊断所述MeCP2突变所致疾病产品；

X8)诊断或辅助诊断所述MeCP2突变所致疾病。

本发明体外实验表明，MeCP2可以与核小体串珠结合发生相变，MeCP2致病性截短突变和点突变均导致其与核小体串珠发生的相变出现异常；而细胞内的实验结果表明，只有致病性点突变会引起相变异常，非致病性点突变对相变无明显影响，进一步证实了相变异常与MeCP2突变所致疾病的发生密切相关。因此，逆转异常相变很有可能成为治疗相关疾病的新思路和方向，可以通过高通量筛选获得可逆转异常相变的调控物并应用于潜在靶向药物开发，该策略也可为治疗其他相变异常相关疾病提供参考。

附图说明

图1为MeCP2与核小体串珠的相变分析。A图中左上图为对照1，右上图为对照2，下边三张图为实验组；B图中左上图为对照1，右上图为对照3，下边三张图为对照4。AI568表示Alexa Fluor^TM 568 NHS Ester(Succinimidyl Ester)。

图2为截短MeCP2与核小体串珠的相变分析。A为截短MeCP2的结构示意图。B为不同浓度的全长/截短MeCP2与4×核小体串珠的相变成像分析。C为B图相变的量化分析，AreaOccupied表示视野中相变相或沉淀所占面积百分比，No LLPS表示视野中没发生相变而形成的带荧光信号的沉淀所占面积百分比，数值比较小；LLPS表示视野中发生相变的相变相所占面积百分比。该图中，R168×、R255×、R270×、R294×和MeCP2分别表示R168×-His、R255×-His、R270×-His、R294×-His和MeCP2-His，4×NA表示4×非甲基化核小体串珠。

图3为致病性点突变MeCP2与甲基化/非甲基化核小体串珠的相变分析。12xNative Nucleosome Aray(DNA)表示12×非甲基化核小体串珠，12x Nudeosome Aray(5me-DNA)表示12×甲基化核小体串珠。MeCP2 wt表示MeCP2-His，MeCP2 R106W、MeCP2 R111G、MeCP2 Y120D、MeCP2 R133C、MeCP2 F157I、MeCP2 T158M、MeCP2 P225R、MeCP2 R306C分别表示MeCP2_R106W-His、MeCP2_R111G-His、MeCP2_Y120D-His、MeCP2_R133C-His、MeCP2_F157I-His、MeCP2_T158M-His、MeCP2_P225R-His和MeCP2_R306C-His。

图4为不同点突变MeCP2对细胞内相变的影响。A为致病性点突变MeCP2(上)和非致病性点突变MeCP2(下)的位点分布示意图。B为分别转染致病性点突变MeCP2(左栏)和非致病性点突变MeCP2(右栏)的细胞成像分析。mCh-MeCP2、mCh-MeCP2_R106W、mCh-MeCP2_R111G、mCh-MeCP2_Y120D、mCh-MeCP2_R133C、mCh-MeCP2_P152R、mCh-MeCP2_F157I、mCh-MeCP2_K144R、mCh-MeCP2_P176R、mCh-MeCP2_T197M、mCh-MeCP2_A201V、mCh-MeCP2_R250H、mCh-MeCP2_R294P分别表示转染pmCherry-C1-MeCP2、pmCherry-C1-MeCP2_R106W、pmCherry-C1-MeCP2_R111G、pmCherry-C1-MeCP2_Y120D、pmCherry-C1-MeCP2_R133C、pmCherry-C1-MeCP2_P152R、pmCherry-C1-MeCP2_F157I、pmCherry-C1-MeCP2_K144R、pmCherry-C1-MeCP2_P176R、pmCherry-C1-MeCP2_T197M、pmCherry-C1-MeCP2_A201V、pmCherry-C1-MeCP2_R250H、pmCherry-C1-MeCP2_R294P的细胞；DAPI表示DAPI染色检测结果；Merge均为左侧两幅图的合并。

图5为mCherry融合蛋白在转染细胞系的相变相和普通相中分配系数的统计分析。图示分配系数为转染细胞系的DAPI深染区域和DAPI非着色区域中mCherry荧光信号强度的比值。MeCP2、R106W、R111G、Y120D、R133C、P152R、F157I、K144R、P176R、T197M、A201V、R250H、R294P分别表示转染pmCherry-C1-MeCP2、pmCherry-C1-MeCP2_R106W、pmCherry-C1-MeCP2_R111G、pmCherry-C1-MeCP2_Y120D、pmCherry-C1-MeCP2_R133C、pmCherry-C1-MeCP2_P152R、pmCherry-C1-MeCP2_F157I、pmCherry-C1-MeCP2_K144R、pmCherry-C1-MeCP2_P176R、pmCherry-C1-MeCP2_T197M、pmCherry-C1-MeCP2_A201V、pmCherry-C1-MeCP2_R250H、pmCherry-C1-MeCP2_R294P的细胞。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

实施例1、MeCP2突变影响相变状态

一、重组载体的制备

1.构建全长MeCP2与His标签的融合蛋白的重组载体

人工合成序列表中序列2中第1-1466位所示的DNA分子，将pET-28a(+)载体(Invitrogen)的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列2中第1-1466位所示的DNA分子，得到重组载体pET-28a(+)-MeCP2-His，pET-28a(+)-MeCP2-His含有序列2所示的DNA片段，能表达序列1所示的蛋白质(MeCP2融合His蛋白标签，记为MeCP2-His)。

其中，序列2的第1-6位和第1461-1466位分别为NcoI和XhoI的识别序列，序列2的第3-1484位所示的DNA分子编码序列1所示的MeCP2-His，序列1的第1-486位为MeCP2的氨基酸序列，序列1的第489-494位为His-tag的氨基酸序列。

2.构建截短MeCP2与His标签的融合蛋白的重组载体

1)构建MeCP2第168位提前终止的重组载体

人工合成序列表中序列4中第1-509位所示的DNA分子，将pET-28a(+)载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列4中第1-509位所示的DNA分子，得到重组载体pET-28a(+)-R168×-His，pET-28a(+)-R168×-His含有序列4所示的DNA片段，能表达序列3所示的蛋白质(MeCP2的第1-167位融合His蛋白标签，记为R168×-His)。

其中，序列4的第1-6位和第504-509位分别为NcoI和XhoI的识别序列，序列4的第3-527位所示的DNA分子编码序列3所示的R168×-His序列，序列3的第1-167位为MeCP2的第1-167位，序列3的第170-175位为His-tag的氨基酸序列。

2)构建MeCP2第255位提前终止的重组载体

人工合成序列表中序列6中第1-770位所示的DNA分子，将pET-28a(+)载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列6中第1-770位所示的DNA分子，得到重组载体pET-28a(+)-R255×-His，pET-28a(+)-R255×-His含有序列6所示的DNA片段，能表达序列5所示的蛋白质(MeCP2的第1-254位融合His蛋白标签，记为R255×-His)。

其中，序列6的第1-6位和第765-770位分别为NcoI和XhoI的识别序列，序列6的第3-788位所示的DNA分子编码序列5所示的R255×-His序列，序列5的第1-254位为MeCP2的第1-254位,序列5的第257-262位为His-tag的氨基酸序列。

3)构建MeCP2第270位提前终止的重组载体

人工合成序列表中序列8中第1-815位所示的DNA分子，将pET-28a(+)载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列8中第1-815位所示的DNA分子，得到重组载体pET-28a(+)-R270×-His，pET-28a(+)-R270×-His含有序列8所示的DNA片段，能表达序列7所示的蛋白质(MeCP2的第1-269位融合His蛋白标签，记为R270×-His)。

其中，序列8的第1-6位和第810-815位分别为NcoI和XhoI的识别序列，序列8的第3-833位所示的DNA分子编码序列7所示的R270×-His序列，序列7的第1-269位为MeCP2的第1-269位，序列7的第272-277位为His-tag的氨基酸序列。

4)构建MeCP2第294位提前终止的重组载体

人工合成序列表中序列10中第1-887位所示的DNA分子，将pET-28a(+)载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列10中第1-887位所示的DNA分子，得到重组载体pET-28a(+)-R294×-His，pET-28a(+)-R294×-His含有序列10所示的DNA片段，能表达序列9所示的蛋白质(MeCP2的第1-293位融合His蛋白标签，记为R294×-His)。

其中，序列10的第1-6位和第882-887位分别为NcoI和XhoI的识别序列，序列10的第3-905位所示的DNA分子编码序列9所示的R294×-His序列，序列9的第1-293位为MeCP2的第1-293位，序列9的第296-301位为His-tag的氨基酸序列。

3.构建点突变MeCP2与His标签的融合蛋白的重组载体

1)表达MeCP2_R106W-His的重组载体

将序列2所示DNA片段的第318位由C替换为T，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段1)，该DNA片段所编码蛋白质的序列为将序列1的第106位由精氨酸残基R替换为色氨酸残基W得到的氨基酸序列，将该蛋白质记为MeCP2_R106W-His。

人工合成DNA片段1，将pET-28a(+)载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为DNA片段1，得到重组载体pET-28a(+)-MeCP2_R106W-His，pET-28a(+)-MeCP2_R106W-His能表达MeCP2_R106W-His。

2)表达MeCP2_R111G-His的重组载体

将序列2所示DNA片段的第333位由A替换为G，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段2)，该DNA片段所编码蛋白质的序列为将序列1的第111位由精氨酸残基R替换为甘氨酸残基G得到的氨基酸序列，将该蛋白质记为MeCP2_R111G-His。

人工合成DNA片段2，将pET-28a(+)载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为DNA片段2，得到重组载体pET-28a(+)-MeCP2_R111G-His，pET-28a(+)-MeCP2_R111G-His能表达MeCP2_R111G-His。

3)表达MeCP2_Y120D-His的重组载体

将序列2所示DNA片段的第360位由T替换为G，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段3)，该DNA片段所编码蛋白质的序列为将序列1的第120位由酪氨酸残基Y替换为天冬氨酸残基D得到的氨基酸序列，将该蛋白质记为MeCP2_Y120D-His。

人工合成DNA片段3，将pET-28a(+)载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为DNA片段3，得到重组载体pET-28a(+)-MeCP2_Y120D-His，pET-28a(+)-MeCP2_Y120D-His能表达MeCP2_Y120D-His。

4)表达MeCP2_R133C-His的重组载体

将序列2所述DNA片段的第399位由C替换为T，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段4)，该DNA片段所编码蛋白质的序列为将序列1的第133位由精氨酸残基R替换为半胱氨酸残基C得到的氨基酸序列，将该蛋白质记为MeCP2_R133C-His。

人工合成DNA片段4，将pET-28a(+)载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为DNA片段4，得到重组载体pET-28a(+)-MeCP2_R133C-His，pET-28a(+)-MeCP2_R133C-His能表达MeCP2_R133C-His。

5)表达MeCP2_F157I-His的重组载体

将序列2所示DNA片段的第471位由T替换为A，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段5)，该DNA片段所编码蛋白质的序列为将序列1的第157位由苯丙氨酸残基F替换为异亮氨酸残基I得到的氨基酸序列，将该蛋白质记为MeCP2_F157I-His。

人工合成DNA片段5，将pET-28a(+)载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为DNA片段5，得到重组载体pET-28a(+)-MeCP2_F157I-His，pET-28a(+)-MeCP2_F157I-His能表达MeCP2_F157I-His。

6)表达MeCP2_T158M-His的重组载体

将序列2所示DNA片段的第475位由C替换为T，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段6)，该DNA片段所编码蛋白质的序列为将序列1的第158位由苏氨酸残基T替换为甲硫氨酸残基M得到的氨基酸序列，将该蛋白质记为MeCP2_T158M-His。

人工合成DNA片段6，将pET-28a(+)载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为DNA片段6，得到重组载体pET-28a(+)-MeCP2_T158M-His，pET-28a(+)-MeCP2_T158M-His能表达MeCP2_T158M-His。

7)表达MeCP2_P225R-His的重组载体

将序列2所示DNA片段的第676位由C替换为G，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段7)，该DNA片段所编码蛋白质的序列为将序列1的第225位由脯氨酸残基P替换为精氨酸残基R得到的氨基酸序列，将该蛋白质记为MeCP2_P225R-His。

人工合成DNA片段7，将pET-28a(+)载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为DNA片段7，得到重组载体pET-28a(+)-MeCP2_T158M-His，pET-28a(+)-MeCP2_T158M-His能表达MeCP2_T158M-His。

8)表达MeCP2_R306C-His的重组载体

将序列2所示DNA片段的第918位由C替换为T，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段8)，该DNA片段所编码蛋白质的序列为将序列1的第306位由精氨酸残基R替换为半胱氨酸残基C得到的氨基酸序列，将该蛋白质记为MeCP2_R306C-His。

人工合成DNA片段8，将pET-28a(+)载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为DNA片段8，得到重组载体pET-28a(+)-MeCP2_R306C-His，pET-28a(+)-MeCP2_R306C-His能表达MeCP2_R306C-His。

4、构建mCherry与MeCP2融合蛋白的重组载体

人工合成序列表中序列12所示的DNA分子，将pmCherry-C1载体(深圳伟通生物科技有限公司，货号zt333)的BspEI和HindIII识别序列间的DNA片段(包含BspEI和HindIII的识别序列)替换为序列表中序列12所示的DNA分子，得到重组载体pmCherry-C1-MeCP2，pmCherry-C1-MeCP2能表达序列11所示的蛋白质(mCherry融合MeCP2，记为mCherry-MeCP2)。

其中，序列12的第1-6位为BspEI的识别序列，第1465-1470位为HindIII的识别序列，第7-1464位为MeCP2的编码基因序列，序列11的第1-236位为mCherry的氨基酸序列，序列11的第239-724位为MeCP2的氨基酸序列。

5、构建mCherry与点突变MeCP2融合蛋白的重组载体

1)表达mCherry-MeCP2_R106W的重组载体

将序列12中MeCP2编码序列的第316位(即序列12的第322位)由C替换为T，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段9)。人工合成DNA片段9，将pmCherry-C1载体的BspEI和HindIII识别序列间的DNA片段(包含BspEI和HindIII的识别序列)替换为DNA片段9，得到重组载体pmCherry-C1-MeCP2_R106W，pmCherry-C1-MeCP2_R106W能表达将步骤4的mCherry-MeCP2中MeCP2的第106位(即序列11的第344位)由精氨酸残基R替换为色氨酸残基W得到的融合蛋白质，将该蛋白质记为mCherry-MeCP2_R106W。

2)表达mCherry-MeCP2_R111G的重组载体

将序列12中MeCP2编码序列的第331位由A替换为G，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段10)。人工合成DNA片段10，将pmCherry-C1载体的BspEI和HindIII识别序列间的DNA片段(包含BspEI和HindIII的识别序列)替换为DNA片段10，得到重组载体pmCherry-C1-MeCP2_R111G，pmCherry-C1-MeCP2_R111G能表达将步骤4的mCherry-MeCP2中MeCP2的第111位由精氨酸残基R替换为甘氨酸残基G得到的融合蛋白质，将该蛋白质记为mCherry-MeCP2_R111G。

3)表达mCherry-MeCP2_Y120D的重组载体

将序列12中MeCP2编码序列的第358位由T替换为G，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段11)。人工合成DNA片段11，将pmCherry-C1载体的BspEI和HindIII识别序列间的DNA片段(包含BspEI和HindIII的识别序列)替换为DNA片段11，得到重组载体pmCherry-C1-MeCP2_Y120D，pmCherry-C1-MeCP2_Y120D能表达将步骤4的mCherry-MeCP2中MeCP2的第120位由酪氨酸残基Y替换为天冬氨酸残基D得到的融合蛋白质，将该蛋白质记为mCherry-MeCP2_Y120D。

4)表达mCherry-MeCP2_R133C的重组载体

将序列12中MeCP2编码序列的第397位由C替换为T，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段12)。人工合成DNA片段12，将pmCherry-C1载体的BspEI和HindIII识别序列间的DNA片段(包含BspEI和HindIII的识别序列)替换为DNA片段12，得到重组载体pmCherry-C1-MeCP2_R133C，pmCherry-C1-MeCP2_R133C能表达将步骤4的mCherry-MeCP2中MeCP2的第133位由精氨酸残基R替换为半胱氨酸残基C得到的融合蛋白质，将该蛋白质记为mCherry-MeCP2_R133C。

5)表达mCherry-MeCP2_P152R的重组载体

将序列12中MeCP2编码序列的第455位由C替换为G，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段13)。人工合成DNA片段13，将pmCherry-C1载体的BspEI和HindIII识别序列间的DNA片段(包含BspEI和HindIII的识别序列)替换为DNA片段13，得到重组载体pmCherry-C1-MeCP2_P152R，pmCherry-C1-MeCP2_P152R能表达将步骤4的mCherry-MeCP2中MeCP2的第152位由脯氨酸残基P替换为精氨酸残基R得到的融合蛋白质，将该蛋白质记为mCherry-MeCP2_P152R。

6)表达mCherry-MeCP2_F157I的重组载体

将序列12中MeCP2编码序列的第469位由T替换为A，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段14)。人工合成DNA片段14，将pmCherry-C1载体的BspEI和HindIII识别序列间的DNA片段(包含BspEI和HindIII的识别序列)替换为DNA片段14，得到重组载体pmCherry-C1-MeCP2_F157I，pmCherry-C1-MeCP2_F157I能表达将步骤4的mCherry-MeCP2中MeCP2的第157位由苯丙氨酸残基F替换为异亮氨酸残基I得到的融合蛋白质，将该蛋白质记为mCherry-MeCP2_F157I。

7)表达mCherry-MeCP2_K144R的重组载体

将序列12中MeCP2编码序列的第431位由A替换为G，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段15)。人工合成DNA片段15，将pmCherry-C1载体的BspEI和HindIII识别序列间的DNA片段(包含BspEI和HindIII的识别序列)替换为DNA片段15，得到重组载体pmCherry-C1-MeCP2_K144R，pmCherry-C1-MeCP2_K144R能表达将步骤4的pmCherry-C1-MeCP2中MeCP2的第144位由赖氨酸残基K替换为精氨酸残基R得到的融合蛋白质，将该蛋白质记为mCherry-MeCP2_K144R。

8)表达mCherry-MeCP2_P176R的重组载体

将序列12中MeCP2编码序列的第527位由C替换为G，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段16)。人工合成DNA片段16，将pmCherry-C1载体的BspEI和HindIII识别序列间的DNA片段(包含BspEI和HindIII的识别序列)替换为DNA片段16，得到重组载体pmCherry-C1-MeCP2_P176R，pmCherry-C1-MeCP2_P176R能表达将步骤4的mCherry-MeCP2中MeCP2的第176位由脯氨酸残基P替换为精氨酸残基R得到的融合蛋白质，将该蛋白质记为mCherry-MeCP2_P176R。

9)表达mCherry-MeCP2_T197M的重组载体

将序列12中MeCP2编码序列的第590位由C替换为T，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段17)。人工合成DNA片段17，将pmCherry-C1载体的BspEI和HindIII识别序列间的DNA片段(包含BspEI和HindIII的识别序列)替换为DNA片段17，得到重组载体pmCherry-C1-MeCP2_T197M，pmCherry-C1-MeCP2_T197M能表达将步骤4的mCherry-MeCP2中MeCP2的第197位由苏氨酸残基T替换为甲硫氨酸残基M得到的融合蛋白质，将该蛋白质记为mCherry-MeCP2_T197M。

10)表达mCherry-MeCP2_A201V的重组载体

将序列12中MeCP2编码序列的第602位由C替换为T，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段18)。人工合成DNA片段18，将pmCherry-C1载体的BspEI和HindIII识别序列间的DNA片段(包含BspEI和HindIII的识别序列)替换为DNA片段18，得到重组载体pmCherry-C1-MeCP2_A201V，pmCherry-C1-MeCP2_A201V能表达将步骤4的mCherry-MeCP2中MeCP2的第201位由丙氨酸残基A替换为缬氨酸残基V得到的融合蛋白质，将该蛋白质记为mCherry-MeCP2_A201V。

11)表达mCherry-MeCP2_R250H的重组载体

将序列12中MeCP2编码序列的第749位由G替换为A，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段19)。人工合成DNA片段19，将pmCherry-C1载体的BspEI和HindIII识别序列间的DNA片段(包含BspEI和HindIII的识别序列)替换为DNA片段19，得到重组载体pmCherry-C1-MeCP2_R250H，pmCherry-C1-MeCP2_R250H能表达将步骤4的mCherry-MeCP2中MeCP2的第250位由精氨酸残基R替换为组氨酸残基H得到的融合蛋白质，将该蛋白质记为mCherry-MeCP2_R250H。

12)表达mCherry-MeCP2_R294P的重组载体

将序列12中MeCP2编码序列的第881位由G替换为C，得到点突变MeCP2的DNA片段(记为DNA片段20)。人工合成DNA片段20，将pmCherry-C1载体的BspEI和HindIII识别序列间的DNA片段(包含BspEI和HindIII的识别序列)替换为DNA片段20，得到重组载体pmCherry-C1-MeCP2_R294P，pmCherry-C1-MeCP2_R294P能表达将步骤4的mCherry-MeCP2中MeCP2的第294位由精氨酸残基R替换为脯氨酸残基P得到的融合蛋白质，将该蛋白质记为mCherry-MeCP2_R294P。

6.构建组蛋白重组载体

1)表达H2A的重组载体

人工合成序列表中序列14所示的DNA分子，将pET-3a载体(Invitrogen)的NdeI和BamHI识别序列间的DNA片段(包含NdeI和BamHI的识别序列)替换为序列表中序列14所示的DNA分子，得到重组载体pET-3a-H2A，pET-3a-H2A能表达序列13所示的H2A蛋白质。

其中，序列14的第1-6位和第399-404位分别为NdeI和BamHI的识别序列，序列14的第3-396位为非洲爪蟾(Xenopus laevis)的H2A序列，序列13为H2A的氨基酸序列。

2)表达H2B的重组载体

人工合成序列表中序列16所示的DNA分子，将pET-3a载体的XbaI和BamHI识别序列间的DNA片段(包含XbaI和BamHI的识别序列)替换为序列表中序列16所示的DNA分子，得到重组载体pET-3a-H2B，pET-3a-H2B能表达序列15所示的H2B蛋白质。

其中，序列16的第1-6位和第423-428位分别为XbaI和BamHI的识别序列，序列16的第40-408位为非洲爪蟾的H2B序列，序列15为H2B的氨基酸序列。

3)表达H3的重组载体

人工合成序列表中序列18所示的DNA分子，将pET-3a载体的XbaI和BlpI识别序列间的DNA片段(包含XbaI和BlpI的识别序列)替换为序列表中序列18所示的DNA分子，得到重组载体pET-3a-H3，pET-3a-H3能表达序列17所示的H3蛋白质。

其中，序列18的第1-6位和第503-509位分别为XbaI和BlpI的识别序列，第42-452位为非洲爪蟾的H3序列，序列17所示为H3的氨基酸序列。

4)表达H4的重组载体

人工合成序列表中序列20所示的DNA分子，将pET-3a载体的NdeI和BlpI识别序列间的DNA片段(包含NdeI和BlpI的识别序列)替换为序列表中序列20所示的DNA分子，得到重组载体pET-3a-H4，pET-3a-H4能表达序列19所示的H4蛋白质。

其中，序列20的第1-6位和第368-374位分别为NdeI和BlpI的识别序列，序列20的第4-315位为非洲爪蟾的H4序列，序列19为H4的氨基酸序列。

7.构建177-4重组载体

人工合成序列表中序列21所示的DNA分子，将EZ-T载体(Invitrogen)的PstI和SalI识别序列间的DNA片段(包含PstI和SalI的识别序列)替换为序列表中序列21所示的DNA分子，得到重组载体EZ-T-177-4。

其中，序列21的第1-6位和第801-806位分别为PstI和SalI的识别序列，第7-12位和第727-732位分别为EcoRV的识别序列，序列21的第16-192位、第193-369位、第370-546位和第547-723位分别为4个177bp的DNA序列。

其中，每个177bp的序列中含有一个147bp的“601”序列，该序列能够以高亲和力结合组蛋白八聚体，在“601”序列的两端各有15bp的linker DNA,使得每两个核小体的间隔为30bp。其中，“601”序列又被称为核小体定位DNA序列，是相对于其它序列，更容易形成核小体的区域。

8.构建177-12重组载体

人工合成序列表中序列22所示的DNA分子，将pWM530载体(Invitrogen)的PstI和ClaI识别序列间的DNA片段(包含PstI和ClaI的识别序列)替换为序列表中序列22所示的DNA分子，得到重组载体pWM530-177-12。

其中，序列22的第1-6位和第2133-2138位分别为PstI和ClaI的识别序列，第6-11位和第2130-2135位分别为EcoRV的识别序列，序列22的第9-185位、第186-362位、第363-539位、第540-716位、第717-893位、第894-1070位、第1071-1247位、第1248-1424位、第1425-1601位、第1602-1778位、第1779-1955位、第1956-2132位分别为12个177bp的DNA序列。

其中，每个177bp的序列中含有一个147bp的“601”序列，该序列能够以高亲和力结合组蛋白八聚体，在“601”序列的两端各有15bp的linker DNA,使得每两个核小体的间隔为30bp。MeCP2结合在linker DNA的进出口端，没有序列特异性。

二、重组蛋白的表达与纯化

1.带有His标签的野生型MeCP2、截短MeCP2以及点突变MeCP2的表达与纯化

将步骤一中步骤1-3各重组载体分别导入大肠杆菌BL21(DE3)(天根生化科技(北京)有限公司)中，得到含有不同重组载体的重组菌，对各重组菌分别按照如下步骤表达纯化目的蛋白：

1)将重组菌接种到100mL LB液体培养基中，37℃，220rpm,培养12h，得到种子液。

2)步骤1完)成后，将种子液按照1：50分别接种到6个750mL的LB液体培养基中扩大培养(37℃，220rpm),培养至OD＝0.6时，加入IPTG(终浓度为0.5mM)诱导4h。

3)步骤2)完成后，将得到的培养液离心，弃上清液，用100ml PBS重悬至2个50ml管中并离心(4℃，4000rpm,30min)，弃上清液。

4)步骤3)完成后，将所得菌体沉淀用80mL lysis buffer重悬至烧杯中，加入溶菌酶(sigma,货号10837059001)，终浓度0.2mg/mL)4℃放置10min。

5)步骤4完成后，对所得产物进行超声破碎，然后对破碎产物进行高速离心(4℃，18000RPM,离心30min)，收集上清。

6)步骤5)完成后，将上清与2mL His-beads 4℃孵育3h，转移至bio-rad空柱管并收集流穿液。

7)步骤6)完成后，用100ml wash buffer对beads进行洗涤。

8)步骤7)完成后，用不同咪唑浓度的elution buffer洗脱蛋白，收集洗脱液。

9)步骤8)完成后，采用SDS-PAGE凝胶电泳检测洗脱液中纯化结果后，将步骤8所得含有目的蛋白的洗脱液进行Hitrap SP HP柱纯化。

10)步骤9)完成后，分别用低盐buffer A和高盐buffer B对结合在Hitrap SP HP柱的蛋白进行洗脱，收集洗脱液，并再次使用SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化结果，结果显示获得高纯度目的蛋白。

11)对步骤10)所得含有目的蛋白的洗脱液进行透析(透析液为reactionbuffer)，透析完成后将蛋白样品冻存于-80℃备用，所得蛋白样品分别为MeCP2-His溶液、R168×-His溶液、R255×-His溶液、R270×-His溶液、R294×-His溶液、MeCP2_R106W-His溶液、MeCP2_R111G-His溶液、MeCP2_Y120D-His溶液、MeCP2_R133C-His溶液、MeCP2_F157I-His溶液、MeCP2_T158M-His溶液、MeCP2_P225R-His溶液和MeCP2_R306C-His溶液。

其中，各试剂具体如下：

lysis buffer：20mM Tris，500mM NaCl，20mM咪唑，1mM PMSF，pH 7.4，余量为水。

wash buffer：20mM Tris，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 7.4，余量为水。

elution buffer：20mM Tris，300mM NaCl，100mM/300mM/500mM/1M咪唑，pH 7.4，余量为水。

Buffer A：20mM Tris，300mM NaCl，pH 7.4，余量为水。

Buffer B：20mM Tris，1M NaCl，pH 7.4，余量为水。

reaction buffer：20mM HEPES，100mM NaCl，pH 7.4，余量为水。

2.组蛋白表达与纯化

将步骤一所得重组载体pET-3a-H2A、pET-3a-H2B、pET-3a-H3和pET-3a-H4分别导入大肠杆菌BL21(DE3)Plys(天根生化科技(北京)有限公司)，得到重组菌株BL21(DE3)Plys-pET-3a-H2A、BL21(DE3)Plys-pET-3a-H2B、BL21(DE3)Plys-pET-3a-H3和BL21(DE3)Plys-pET-3a-H4。

按照下述方法对上述重组菌株表达的蛋白进行表达和纯化：

1)将上述重组菌株接种到液体LB培养基中，过夜培养(37℃，200rpm)后，将所得菌液按照1:500-1:1000的体积比转接到50mL液体LB培养基中，再次过夜培养(37℃，200rpm)。

2)步骤1)结束后将所得菌液按1:50的体积比转接到750mL液体LB培养基中培养至OD600达到0.5-0.6后，加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃培养3hr诱导蛋白表达。

3)步骤2)结束后将所得菌液离心，收集沉淀，每6瓶菌用100ml 1×wash buffer(50mM Tris，100mM NaCl，1mM EDTA，5mM B-ME，PH8.0，余量为水)重悬菌体并进行超声破碎(5s/5s，400W，超声2-3轮，每轮99次)，然后将超声破碎产物超速离心(23000g离心20min)，弃上清，收集沉淀。

4)步骤3)结束后，将所得沉淀用100ml含有1％(v/v)TritonX-100的1×washbuffer重悬后并再次超声破碎(5s/5s，400W，超声两轮，每轮99次)，然后将超声破碎产物超速离心(20000g离心10min)，弃上清，收集沉淀。

5)将步骤4)重复一次(或多次)。

6)对步骤5)所得沉淀用100ml 1×wash buffer重悬后离心(20000g离心10min)，弃上清，收集沉淀。

7)将步骤6)重复一次(或多次)。

8)用30ml unfolding buffer(20mM Tris(PH8.0),7M Guanidinehydrochloride,5mM B-ME)重悬步骤7)所得沉淀(室温1hr搅拌溶解)，超速离心(23000g离心20min)，收集上清，得到蛋白溶液。

9)凝胶电泳检测步骤8)所得蛋白溶液中蛋白纯度和浓度。

上述纯化步骤如未特殊说明均在冰上进行。

步骤9)结束后分别得到含有目的蛋白的高纯度H2A溶液、H2B溶液、H3溶液和H4溶液。

三、组蛋白八聚体组装与纯化

1.组装八聚体：

取H2A溶液、H2B溶液、H3溶液和H4溶液加入透析袋中，H2A、H2B、H3和H4的量各4mg，然后置于透析液—refolding buffer(2M NaCl，10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0，余量为水)中透析，4℃搅拌12小时后，再换一次透析液，4℃透析24小时。

2.纯化八聚体：

步骤1结束后，将所得蛋白样品离心(4℃，21000g离心5min)，收集上清并浓缩至500μl，通过凝胶过滤层析对组蛋白八聚体进行纯化，纯化步骤如下：

平衡superdex 200柱：用refolding buffer(2M Nacl,10mM Tris,1mM EDTA，pH8.0)平衡superdex 200柱；

上样：将500μl的样品通过上样环load到柱中；

分离八聚体：用refolding buffer将样品送进柱中进行分离，收集不同的流出液,经SDS-PAGE鉴定获得组蛋白八聚体。

四、制备177-4和177-12DNA

分别利用步骤一的重组载体EZ-T-177-4和pWM530-177-12制备177-4和177-12DNA，首先将两种重组载体分别导入大肠杆菌DH5α(天根生化科技(北京)有限公司)中，得到两种重组菌，然后将两种重组菌分别按照如下步骤操作：

1.接种

将重组菌接种在50ml液体LB培养基中，37℃过夜培养，得到培养液。

2.扩增培养

将步骤1所得培养液转入800ml含有100ug/ml氨苄霉素的液体LB培养基中，37℃继续培养4-5h后，提高培养温度至42℃，继续培养约12-13h，得到培养液。

3.收集菌体

对步骤2所得培养液进行离心并收集菌体(4000rpm，30min)。

4.破碎菌体

①向步骤3所收集菌体中加入30ml冰冷S1(25mM Tris，50mM葡萄糖，10mM EDTA，pH8.0，余量为水)，震荡离心管使成均一菌悬液。

②向①的菌悬液中加入120ml新配的S2(0.2M NaOH，1％(质量比)SDS，余量为水，室温)，轻柔颠倒使充分混匀，室温放置5min，此时溶液应澄清透明，粘度较高。

③步骤②完成后，向所得液体中贴壁小心加入210ml冰冷的S3(3M乙酸钾，用乙酸调pH至5.2，余量为水)，朝一个方向摇离心管，使液相不再分层，杂质呈蛋花状，冰上放置10min。

④步骤③完成后，将所得液体4℃离心4000rpm 30min，小心吸出上清，经4层纱布过滤去除悬浮杂质，转移至4L烧杯中，得到溶液1。

5.质粒DNA回收

①向步骤4所得溶液1中加入是溶液1的0.52倍体积的异丙醇，充分混匀，室温放置≥15min。

②步骤①完成后，将所得液体离心(15000g 15min)，其上清液，回收核酸沉淀。

③步骤②完成后，用70％(v/v)乙醇水溶液涮洗离心管壁及底部的沉淀，离心(15000g 15min，4℃)，弃上清，使剩余乙醇挥发干净(无酒精味且沉淀潮湿不透明即可)，得到核酸沉淀。

6.去除RNA

①用100ml TE10/50(10mM Tris，50mM EDTA，pH8.0，余量为水)溶解步骤5所得核酸沉淀至250ml离心管中，加RNase(终浓度100ug/ml)消化过夜。

②步骤①完成后，向所得产物中加入产物1/5体积的4M NaCl水溶液和产物2/5体积的40％(质量比)PEG 6000水溶液，混匀后37℃温育5min，冰置30min。

③步骤②完成后，将所得液体4℃离心(20000g×15min)，弃尽上清，用70％(v/v)乙醇水溶液洗一次，将所得沉淀溶于50ml TE10/0.1(10mM Tris，0.1mM EDTA，pH8.0，余量为水)中，得到溶液2。

7.去除蛋白污染及PEG6000

①向步骤6所得溶液2中加入溶液2的1/5体积的酚：氯仿(V/V＝1:1)，震荡混匀，室温离心(20000g×10min)，小心吸出上层水相，重复此步骤两次。

②步骤①完成后，混合所得水相，并加入总水相加入1/5体积的酚：氯仿：异戊醇(V/V＝25:24:1)，震荡混匀，室温离心(20000g×10min)，小心吸出上层水相。

③步骤②完成后，向水相中加入水相1/10体积的3M NaAc(PH5.2)和2.5倍体积无水乙醇，-20℃放置至少1h。

④4℃离心(20000g×15min)，收集沉淀。

⑤用70％(v/v)乙醇水溶液洗涤沉淀，待乙醇挥发干净将沉淀溶于TE10/0.1中，得到含有载体的溶液3。

8.酶切分离目标DNA

①用限制性内切酶EcoRV对所得步骤7所得溶液3中的质粒进行酶切。

②用PEG6000将载体骨架与目标DNA进行分离，得到目的DNA。

③对所得目的DNA进行酚-氯仿抽提(除去PEG6000)后进行乙醇沉淀，用TE(10mMTris，1mM EDTA，pH 8.0，余量为水)溶解DNA，分别得到177-4DNA溶液和177-12DNA溶液，保存于-20℃备用。

五、制备甲基化177-12DNA

1、将步骤四所得177-12DNA进行甲基化反应(用NEB的甲基转移酶M.SssI来完成)，体系如下

NEBuffer2(10x)、S-adenosylmethionine和Methyltransferase均为NEB产品。

将所得体系于37℃下孵育8h。

2、用点杂交技术检测甲基化结果

1)取3μl步骤1反应后的混合物，加水7μl,混匀后加10μl 0.2M NaOH水溶液，然后95℃孵育10min；

2)步骤1)完成后，向体系中加入20μl 1M乙酸铵中和反应；

3)步骤2)完成后，分别取0.1μl和0.3μl中和后的样品滴到N+膜上(GEHealthcare)晾干；

4)步骤3)完成后，将膜置于80℃孵育30min；

5)步骤4)完成后，用5％(质量比)牛奶室温封闭N+膜，1小时，TBST洗涤3次；

6)步骤5)完成后，将膜用anti-5mC一抗(active motif)结合，结合在4℃下进行8h；TBST洗涤三次；

7)步骤6)完成后，将膜置于山羊抗小鼠二抗(中杉金桥)中，室温孵育1h；

8)步骤7)完成后，向膜上加发光底物(invitrogen),室温3min,进行显影。

3、对经检测发生甲基化修饰的177-12DNA进行纯化，纯化方法同步骤四第7步，得到177-12甲基化修饰DNA溶液。

六、体外组装4×与12×甲基化/非甲基化核小体串珠

分别利用步骤四所得177-4DNA、177-12DNA和步骤五所得177-12甲基化修饰DNA与步骤三所得组蛋白八聚体进行核小体串珠组装。组装体系如下：

其中，1×TE：10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0，余量为水。

样品按照上述组装体系混合后放入refolding buffer中梯度透析，起始buffer为450ml refolding buffer(向1×TE中添加NaCl得到的NaCl浓度为2M的溶液),利用蠕动泵将1050mL的1×TE泵入refolding buffer中，逐步降低盐离子浓度，经过至少16小时透析，使组装体系盐离子浓度降低至0.6M NaCl。然后进一步透析至低盐的reaction buffer中，得到核小体串珠。

将利用177-4DNA、177-12DNA、177-12甲基化修饰DNA得到的核小体串珠分别记为4×非甲基化核小体串珠、12×非甲基化核小体串珠和12×甲基化核小体串珠。

七、MeCP2与核小体串珠的相变

取10mg步骤二所得MeCP2-His以1:1的摩尔比与染料Alexa Fluor^TM 568 NHSEster(Succinimidyl Ester)(ThermoFisher，货号A20003)混匀孵育(置于旋转摇床上，室温1h)，以实现对蛋白的荧光标记。随后用reaction buffer对上述样品进行凝胶过滤层析(方法同步骤三)，除去剩余荧光染料，得到染料标记的MeCP2-His，冻存于-80℃备用。

将所得染料标记的MeCP2-His与未标记的MeCP2-His混和，得到蛋白混合物，使标记蛋白摩尔浓度占比为5％。将所得蛋白混合物与步骤六所得4×非甲基化核小体串珠(4×NA或4×601NA，NA为nucleosome array,即核小体串)混匀后得到实验组反应体系，4×非甲基化核小体串珠在反应体系中的浓度为112.5nM，蛋白混合物中总蛋白在反应体系中的浓度为10μM。并设置如下对照体系：

对照1反应体系：仅添加上述蛋白混合物，利用reaction buffer稀释至总蛋白浓度为20μM。

对照2反应体系：仅添加4×非甲基化核小体串珠，利用reaction buffer稀释至浓度为225nM。

对照3反应体系：仅添加步骤四所得177-4DNA，利用reaction buffer稀释至浓度为37.5nM。

对照4反应体系：仅添加步骤四所得177-4DNA与上述蛋白混合物，177-4DNA与MeCP2-His总蛋白的浓度分别为37.5nM和10μM。

将所各得反应体系4℃静置过夜，并通过激光共聚焦扫描显微镜进行成像分析。

结果发现，实验组反应体系发生相变，对照体系4发生相变，而对照体系1-3均未发生相变，说明，MeCP2可以与核小体定位序列以及含有核小体定位序列的核小体串发生相变(图1)。

八、截短MeCP2与核小体串珠的相变分析

很多发生在MeCP2上的错义突变和无义突变都会导致ReTT综合征。临床研究发现，在导致ReTT综合征的无义突变中，发生在MeCP2氨基酸序列的第168位、第255位、第270位和第294位的无义突变占比为90％以上。下面检测了这些无义突变是否影响MeCP2介导的相变。

将步骤二所得MeCP2-His以及R168×-His、R255×-His、R270×-His和R294×-His各取10mg以1:1的摩尔比分别与染料Alexa Fluor^TM 568 NHS Ester(Succinimidyl Ester)(利用氨基反应性Alexa Fluor 488羧酸、琥珀酰亚胺酯制备的偶联物的亮度和光稳定性显著优于荧光素。Alexa Fluor 488染料能发出明亮的绿色荧光，光谱与荧光素相似，在pH 4至pH10之间稳定。)(ThermoFisher，货号A20003)混匀孵育(置于旋转摇床上，室温1h)，以实现对相应蛋白的荧光标记。随后用reaction buffer对上述样品进行凝胶过滤层析(方法同步骤三)，除去剩余荧光染料，分别得到染料标记的MeCP2-His、染料标记的R168×-His、染料标记的R255×-His、染料标记的R270×-His和染料标记的R294×-His，将所得蛋白样品冻存于-80℃备用。

将所得五种染料标记的蛋白分别与各自未标记的蛋白混和，得到蛋白混合物，使标记蛋白摩尔浓度占比均为5％。将所得五种蛋白混合物分别与步骤六所得4×非甲基化核小体串珠(4×NA)按照图2所示终浓度混匀后得到不同的反应体系，4×非甲基化核小体串珠在反应体系中的浓度设置为14.06、28.13、56.25、112.5nM，蛋白混合物中总蛋白在反应体系中的浓度分别设置为1.25、2.5、5、10μM。将所得各反应体系4℃静置过夜，并通过激光共聚焦扫描显微镜进行成像分析。

结果发现，与全长MeCP2相比，所有截短突变与核小体串珠发生相变的能力都有不同程度地减弱，且C末端截短越多相变能力越弱，图2和表1。而前人研究发现，C末端截短越多的病人患病越严重。可见MeCP2与核小体串珠发生相变的能力与其致病力呈负相关，即突变造成的这种相变能力越弱，对应的疾病越严重。

表1、各反应体系发生相变能力的检测结果

九、点突变MeCP2与核小体串珠的相变分析

将步骤二所得野生型MeCP2-His以及各点突变的MeCP2-His按照步骤八的操作过程进行蛋白标记，分别得到染料标记的MeCP2-His、染料标记的MeCP2_R106W-His、染料标记的MeCP2_R111G-His、染料标记的MeCP2_Y120D-His、染料标记的MeCP2_R133C-His、染料标记的MeCP2_F157I-His、染料标记的MeCP2_T158M-His、染料标记的MeCP2_P225R-His和染料标记的MeCP2_R306C-His，冻存于-80℃备用。

将所得九种染料标记的蛋白分别与各自未标记的蛋白混和，得到蛋白混合物，使标记蛋白摩尔浓度占比均为5％。将所得蛋白混合物分别与步骤六所得12×非甲基化核小体串珠或12×甲基化核小体串珠按照图3所示终浓度混匀后得到不同的反应体系，12×非甲基化核小体串珠和12×甲基化核小体串珠在反应体系中的浓度设置均为4.6875、9.375、18.75、37.5nM，蛋白混合物中总蛋白在反应体系中的浓度除MeCP2_R111G-His外均设置为1.25、2.5、5、10μM，MeCP2_R111G-His的浓度设置为0.63、1.25、2.5、5μM。将所得反应体系4℃静置过夜，并通过激光共聚焦扫描显微镜进行成像分析。

结果发现，野生型MeCP2-His可与非甲基化以及甲基化的核小体串珠发生相变，且与后者的相变能力更强。前人的研究发现MeCP2蛋白可结合甲基化和非甲基化的DNA，且它与甲基化的DNA的亲和力更强，与本发明的实验结果相吻合。图3还显示，与野生型MeCP2-His相比，点突变MeCP2(图3所示点突变均有致病性)与甲基化和非甲基化核小体串珠发生相变的能力均有不同程度的减弱，而这种相变异常的程度与MeCP2点突变造成的疾病的严重程度基本呈正相关。

十、不同点突变MeCP2对细胞内相变的影响

转染NIH 3T3细胞：将步骤一中步骤4和5所得表达mCherry融合蛋白的重组载体(pmCherry-C1-MeCP2、pmCherry-C1-MeCP2_R106W、pmCherry-C1-MeCP2_R111G、pmCherry-C1-MeCP2_Y120D、pmCherry-C1-MeCP2_R133C、pmCherry-C1-MeCP2_P152R、pmCherry-C1-MeCP2_F157I、pmCherry-C1-MeCP2_K144R、pmCherry-C1-MeCP2_P176R、pmCherry-C1-MeCP2_T197M、pmCherry-C1-MeCP2_A201V、pmCherry-C1-MeCP2_R250H、pmCherry-C1-MeCP2_R294P)分别转染NIH 3T3细胞(贴壁培养)，所用转染试剂为VigoFect(威格拉斯生物技术(北京)有限公司)，并按照试剂说明书操作细胞转染，转染36小时后进行DAPI染色，DAPI染色步骤：

1.弃去细胞培养基，PBS洗涤细胞3次；

2.将细胞用4％的多聚甲醛固定15min；

3.弃去多聚甲醛，PBS洗涤三次；

4.DAPI(sigma)染色5min；

5.弃去DAPI,PBS洗涤两次；

6.加抗淬灭剂(SlowFade^TM Diamond Antifade Mountant with DAPIinvitrogen)，封片。

将所得DAPI染色细胞进行激光共聚焦扫描显微成像分析。

结果(图4)发现，转染野生型MeCP2产生的相分离的边界清晰，红色荧光信号(mCherry所产生的荧光信号)在相变相中高度聚集，与非相变部分的红色荧光信号强度差异明显。而与转染野生型MeCP2产生的相分离相比较，转染致病性点突变MeCP2(图4中B左栏)或者不发生相分离，或者所产生的相分离边界较模糊，且红色荧光信号在浓缩相中的聚集程度下降，与非相变部分的红色荧光信号强度差异减小。而转染非致病性点突变MeCP2(图4中B右栏)所产生的相分离形态及红色荧光信号的分布及在相变相中的聚集程度等与转染野生型MeCP2无明显差异。计算分配系数，见图5，分配系数为转染细胞系的DAPI深染区域和DAPI非着色区域中mCherry荧光信号强度的比值。转染pmCherry-C1-MeCP2、pmCherry-C1-MeCP2_R106W、pmCherry-C1-MeCP2_R111G、pmCherry-C1-MeCP2_Y120D、pmCherry-C1-MeCP2_R133C、pmCherry-C1-MeCP2_P152R、pmCherry-C1-MeCP2_F157I、pmCherry-C1-MeCP2_K144R、pmCherry-C1-MeCP2_P176R、pmCherry-C1-MeCP2_T197M、pmCherry-C1-MeCP2_A201V、pmCherry-C1-MeCP2_R250H、pmCherry-C1-MeCP2_R294P的细胞的分配系数分别为2.2877±1.733792、1.620161±1.110083、1.065981±0.177234、1.360667±1.900664、3.288191±2.781871、3.01643±1.964515、1.01914±0.724986、5.641106±0.431235、5.235031±0.375481、4.113438±2.736971、2.861968±1.881579、2.900806±3.608265、3.964675±4.663274。细胞内的实验数据进一步证实MeCP2介导的相变异常与疾病关系密切。

本发明体外实验表明，MeCP2可以与核小体串珠结合发生相变，MeCP2致病性截短突变和点突变均导致其与核小体串珠发生的相变出现异常；而细胞内的实验结果表明，只有致病性点突变会引起相变异常，非致病性点突变对相变无明显影响，进一步证实了相变异常与MeCP2突变所致疾病的发生密切相关。因此，逆转异常相变很有可能成为治疗相关疾病的新思路和方向，可以通过高通量筛选获得可逆转异常相变的调控物并应用于潜在靶向药物开发，该策略也可为治疗其他相变异常相关疾病提供参考。

<110> 清华大学、中国科学院生物物理研究所

<120> 检测MeCP2突变的物质在检测MeCP2突变是否为致病突变以及筛选药物中的应用

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 494

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

Met Val Ala Gly Met Leu Gly Leu Arg Glu Glu Lys Ser Glu Asp Gln

1 5 10 15

Asp Leu Gln Gly Leu Lys Asp Lys Pro Leu Lys Phe Lys Lys Val Lys

20 25 30

Lys Asp Lys Lys Glu Glu Lys Glu Gly Lys His Glu Pro Val Gln Pro

35 40 45

Ser Ala His His Ser Ala Glu Pro Ala Glu Ala Gly Lys Ala Glu Thr

50 55 60

Ser Glu Gly Ser Gly Ser Ala Pro Ala Val Pro Glu Ala Ser Ala Ser

65 70 75 80

Pro Lys Gln Arg Arg Ser Ile Ile Arg Asp Arg Gly Pro Met Tyr Asp

85 90 95

Asp Pro Thr Leu Pro Glu Gly Trp Thr Arg Lys Leu Lys Gln Arg Lys

100 105 110

Ser Gly Arg Ser Ala Gly Lys Tyr Asp Val Tyr Leu Ile Asn Pro Gln

115 120 125

Gly Lys Ala Phe Arg Ser Lys Val Glu Leu Ile Ala Tyr Phe Glu Lys

130 135 140

Val Gly Asp Thr Ser Leu Asp Pro Asn Asp Phe Asp Phe Thr Val Thr

145 150 155 160

Gly Arg Gly Ser Pro Ser Arg Arg Glu Gln Lys Pro Pro Lys Lys Pro

165 170 175

Lys Ser Pro Lys Ala Pro Gly Thr Gly Arg Gly Arg Gly Arg Pro Lys

180 185 190

Gly Ser Gly Thr Thr Arg Pro Lys Ala Ala Thr Ser Glu Gly Val Gln

195 200 205

Val Lys Arg Val Leu Glu Lys Ser Pro Gly Lys Leu Leu Val Lys Met

210 215 220

Pro Phe Gln Thr Ser Pro Gly Gly Lys Ala Glu Gly Gly Gly Ala Thr

225 230 235 240

Thr Ser Thr Gln Val Met Val Ile Lys Arg Pro Gly Arg Lys Arg Lys

245 250 255

Ala Glu Ala Asp Pro Gln Ala Ile Pro Lys Lys Arg Gly Arg Lys Pro

260 265 270

Gly Ser Val Val Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Lys Lys Lys Ala Val

275 280 285

Lys Glu Ser Ser Ile Arg Ser Val Gln Glu Thr Val Leu Pro Ile Lys

290 295 300

Lys Arg Lys Thr Arg Glu Thr Val Ser Ile Glu Val Lys Glu Val Val

305 310 315 320

Lys Pro Leu Leu Val Ser Thr Leu Gly Glu Lys Ser Gly Lys Gly Leu

325 330 335

Lys Thr Cys Lys Ser Pro Gly Arg Lys Ser Lys Glu Ser Ser Pro Lys

340 345 350

Gly Arg Ser Ser Ser Ala Ser Ser Pro Pro Lys Lys Glu His His His

355 360 365

His His His His Ser Glu Ser Pro Lys Ala Pro Val Pro Leu Leu Pro

370 375 380

Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Glu Pro Glu Ser Ser Glu Asp Pro Thr

385 390 395 400

Ser Pro Pro Glu Pro Gln Asp Leu Ser Ser Ser Val Cys Lys Glu Glu

405 410 415

Lys Met Pro Arg Gly Gly Ser Leu Glu Ser Asp Gly Cys Pro Lys Glu

420 425 430

Pro Ala Lys Thr Gln Pro Ala Val Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ala Glu

435 440 445

Lys Tyr Lys His Arg Gly Glu Gly Glu Arg Lys Asp Ile Val Ser Ser

450 455 460

Ser Met Pro Arg Pro Asn Arg Glu Glu Pro Val Asp Ser Arg Thr Pro

465 470 475 480

Val Thr Glu Arg Val Ser Leu Glu His His His His His His

485 490

<210> 2

<211> 1484

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

ccatggtagc tgggatgtta gggctcaggg aagaaaagtc agaagaccag gacctccagg 60

gcctcaagga caaacccctc aagtttaaaa aggtgaagaa agataagaaa gaagagaaag 120

agggcaagca tgagcccgtg cagccatcag cccaccactc tgctgagccc gcagaggcag 180

gcaaagcaga gacatcagaa gggtcaggct ccgccccggc tgtgccggaa gcttctgcct 240

cccccaaaca gcggcgctcc atcatccgtg accggggacc catgtatgat gaccccaccc 300

tgcctgaagg ctggacacgg aagcttaagc aaaggaaatc tggccgctct gctgggaagt 360

atgatgtgta tttgatcaat ccccagggaa aagcctttcg ctctaaagtg gagttgattg 420

cgtacttcga aaaggtaggc gacacatccc tggaccctaa tgattttgac ttcacggtaa 480

ctgggagagg gagcccctcc cggcgagagc agaaaccacc taagaagccc aaatctccca 540

aagctccagg aactggcaga ggccggggac gccccaaagg gagcggcacc acgagaccca 600

aggcggccac gtcagagggt gtgcaggtga aaagggtcct ggagaaaagt cctgggaagc 660

tccttgtcaa gatgcctttt caaacttcgc cagggggcaa ggctgagggg ggtggggcca 720

ccacatccac ccaggtcatg gtgatcaaac gccccggcag gaagcgaaaa gctgaggccg 780

accctcaggc cattcccaag aaacggggcc gaaagccggg gagtgtggtg gcagccgctg 840

ccgccgaggc caaaaagaaa gccgtgaagg agtcttctat ccgatctgtg caggagaccg 900

tactccccat caagaagcgc aagacccggg agacggtcag catcgaggtc aaggaagtgg 960

tgaagcccct gctggtgtcc accctcggtg agaagagcgg gaaaggactg aagacctgta 1020

agagccctgg gcggaaaagc aaggagagca gccccaaggg gcgcagcagc agcgcctcct 1080

caccccccaa gaaggagcac caccaccatc accaccactc agagtcccca aaggcccccg 1140

tgccactgct cccacccctg cccccacctc cacctgagcc cgagagctcc gaggacccca 1200

ccagcccccc tgagccccag gacttgagca gcagcgtctg caaagaggag aagatgccca 1260

gaggaggctc actggagagc gacggctgcc ccaaggagcc agctaagact cagcccgcgg 1320

ttgccaccgc cgccacggcc gcagaaaagt acaaacaccg aggggaggga gagcgcaaag 1380

acattgtttc atcctccatg ccaaggccaa acagagagga gcctgtggac agccggacgc 1440

ccgtgaccga gagagttagc ctcgagcacc accaccacca ccac 1484

<210> 3

<211> 175

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

Met Val Ala Gly Met Leu Gly Leu Arg Glu Glu Lys Ser Glu Asp Gln

1 5 10 15

Asp Leu Gln Gly Leu Lys Asp Lys Pro Leu Lys Phe Lys Lys Val Lys

20 25 30

Lys Asp Lys Lys Glu Glu Lys Glu Gly Lys His Glu Pro Val Gln Pro

35 40 45

Ser Ala His His Ser Ala Glu Pro Ala Glu Ala Gly Lys Ala Glu Thr

50 55 60

Ser Glu Gly Ser Gly Ser Ala Pro Ala Val Pro Glu Ala Ser Ala Ser

65 70 75 80

Pro Lys Gln Arg Arg Ser Ile Ile Arg Asp Arg Gly Pro Met Tyr Asp

85 90 95

Asp Pro Thr Leu Pro Glu Gly Trp Thr Arg Lys Leu Lys Gln Arg Lys

100 105 110

Ser Gly Arg Ser Ala Gly Lys Tyr Asp Val Tyr Leu Ile Asn Pro Gln

115 120 125

Gly Lys Ala Phe Arg Ser Lys Val Glu Leu Ile Ala Tyr Phe Glu Lys

130 135 140

Val Gly Asp Thr Ser Leu Asp Pro Asn Asp Phe Asp Phe Thr Val Thr

145 150 155 160

Gly Arg Gly Ser Pro Ser Arg Leu Glu His His His His His His

165 170 175

<210> 4

<211> 527

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

ccatggtagc tgggatgtta gggctcaggg aagaaaagtc agaagaccag gacctccagg 60

gcctcaagga caaacccctc aagtttaaaa aggtgaagaa agataagaaa gaagagaaag 120

agggcaagca tgagcccgtg cagccatcag cccaccactc tgctgagccc gcagaggcag 180

gcaaagcaga gacatcagaa gggtcaggct ccgccccggc tgtgccggaa gcttctgcct 240

cccccaaaca gcggcgctcc atcatccgtg accggggacc catgtatgat gaccccaccc 300

tgcctgaagg ctggacacgg aagcttaagc aaaggaaatc tggccgctct gctgggaagt 360

atgatgtgta tttgatcaat ccccagggaa aagcctttcg ctctaaagtg gagttgattg 420

cgtacttcga aaaggtaggc gacacatccc tggaccctaa tgattttgac ttcacggtaa 480

ctgggagagg gagcccctcc cggctcgagc accaccacca ccaccac 527

<210> 5

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

Met Val Ala Gly Met Leu Gly Leu Arg Glu Glu Lys Ser Glu Asp Gln

1 5 10 15

Asp Leu Gln Gly Leu Lys Asp Lys Pro Leu Lys Phe Lys Lys Val Lys

20 25 30

Lys Asp Lys Lys Glu Glu Lys Glu Gly Lys His Glu Pro Val Gln Pro

35 40 45

Ser Ala His His Ser Ala Glu Pro Ala Glu Ala Gly Lys Ala Glu Thr

50 55 60

Ser Glu Gly Ser Gly Ser Ala Pro Ala Val Pro Glu Ala Ser Ala Ser

65 70 75 80

Pro Lys Gln Arg Arg Ser Ile Ile Arg Asp Arg Gly Pro Met Tyr Asp

85 90 95

Asp Pro Thr Leu Pro Glu Gly Trp Thr Arg Lys Leu Lys Gln Arg Lys

100 105 110

Ser Gly Arg Ser Ala Gly Lys Tyr Asp Val Tyr Leu Ile Asn Pro Gln

115 120 125

Gly Lys Ala Phe Arg Ser Lys Val Glu Leu Ile Ala Tyr Phe Glu Lys

130 135 140

Val Gly Asp Thr Ser Leu Asp Pro Asn Asp Phe Asp Phe Thr Val Thr

145 150 155 160

Gly Arg Gly Ser Pro Ser Arg Arg Glu Gln Lys Pro Pro Lys Lys Pro

165 170 175

Lys Ser Pro Lys Ala Pro Gly Thr Gly Arg Gly Arg Gly Arg Pro Lys

180 185 190

Gly Ser Gly Thr Thr Arg Pro Lys Ala Ala Thr Ser Glu Gly Val Gln

195 200 205

Val Lys Arg Val Leu Glu Lys Ser Pro Gly Lys Leu Leu Val Lys Met

210 215 220

Pro Phe Gln Thr Ser Pro Gly Gly Lys Ala Glu Gly Gly Gly Ala Thr

225 230 235 240

Thr Ser Thr Gln Val Met Val Ile Lys Arg Pro Gly Arg Lys Leu Glu

245 250 255

His His His His His His

260

<210> 6

<211> 788

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

ccatggtagc tgggatgtta gggctcaggg aagaaaagtc agaagaccag gacctccagg 60

gcctcaagga caaacccctc aagtttaaaa aggtgaagaa agataagaaa gaagagaaag 120

agggcaagca tgagcccgtg cagccatcag cccaccactc tgctgagccc gcagaggcag 180

gcaaagcaga gacatcagaa gggtcaggct ccgccccggc tgtgccggaa gcttctgcct 240

cccccaaaca gcggcgctcc atcatccgtg accggggacc catgtatgat gaccccaccc 300

tgcctgaagg ctggacacgg aagcttaagc aaaggaaatc tggccgctct gctgggaagt 360

atgatgtgta tttgatcaat ccccagggaa aagcctttcg ctctaaagtg gagttgattg 420

cgtacttcga aaaggtaggc gacacatccc tggaccctaa tgattttgac ttcacggtaa 480

ctgggagagg gagcccctcc cggcgagagc agaaaccacc taagaagccc aaatctccca 540

aagctccagg aactggcaga ggccggggac gccccaaagg gagcggcacc acgagaccca 600

aggcggccac gtcagagggt gtgcaggtga aaagggtcct ggagaaaagt cctgggaagc 660

tccttgtcaa gatgcctttt caaacttcgc cagggggcaa ggctgagggg ggtggggcca 720

ccacatccac ccaggtcatg gtgatcaaac gccccggcag gaagctcgag caccaccacc 780

accaccac 788

<210> 7

<211> 277

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

Met Val Ala Gly Met Leu Gly Leu Arg Glu Glu Lys Ser Glu Asp Gln

1 5 10 15

Asp Leu Gln Gly Leu Lys Asp Lys Pro Leu Lys Phe Lys Lys Val Lys

20 25 30

Lys Asp Lys Lys Glu Glu Lys Glu Gly Lys His Glu Pro Val Gln Pro

35 40 45

Ser Ala His His Ser Ala Glu Pro Ala Glu Ala Gly Lys Ala Glu Thr

50 55 60

Ser Glu Gly Ser Gly Ser Ala Pro Ala Val Pro Glu Ala Ser Ala Ser

65 70 75 80

Pro Lys Gln Arg Arg Ser Ile Ile Arg Asp Arg Gly Pro Met Tyr Asp

85 90 95

Asp Pro Thr Leu Pro Glu Gly Trp Thr Arg Lys Leu Lys Gln Arg Lys

100 105 110

Ser Gly Arg Ser Ala Gly Lys Tyr Asp Val Tyr Leu Ile Asn Pro Gln

115 120 125

Gly Lys Ala Phe Arg Ser Lys Val Glu Leu Ile Ala Tyr Phe Glu Lys

130 135 140

Val Gly Asp Thr Ser Leu Asp Pro Asn Asp Phe Asp Phe Thr Val Thr

145 150 155 160

Gly Arg Gly Ser Pro Ser Arg Arg Glu Gln Lys Pro Pro Lys Lys Pro

165 170 175

Lys Ser Pro Lys Ala Pro Gly Thr Gly Arg Gly Arg Gly Arg Pro Lys

180 185 190

Gly Ser Gly Thr Thr Arg Pro Lys Ala Ala Thr Ser Glu Gly Val Gln

195 200 205

Val Lys Arg Val Leu Glu Lys Ser Pro Gly Lys Leu Leu Val Lys Met

210 215 220

Pro Phe Gln Thr Ser Pro Gly Gly Lys Ala Glu Gly Gly Gly Ala Thr

225 230 235 240

Thr Ser Thr Gln Val Met Val Ile Lys Arg Pro Gly Arg Lys Arg Lys

245 250 255

Ala Glu Ala Asp Pro Gln Ala Ile Pro Lys Lys Arg Gly Leu Glu His

260 265 270

His His His His His

275

<210> 8

<211> 833

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

ccatggtagc tgggatgtta gggctcaggg aagaaaagtc agaagaccag gacctccagg 60

gcctcaagga caaacccctc aagtttaaaa aggtgaagaa agataagaaa gaagagaaag 120

agggcaagca tgagcccgtg cagccatcag cccaccactc tgctgagccc gcagaggcag 180

gcaaagcaga gacatcagaa gggtcaggct ccgccccggc tgtgccggaa gcttctgcct 240

cccccaaaca gcggcgctcc atcatccgtg accggggacc catgtatgat gaccccaccc 300

tgcctgaagg ctggacacgg aagcttaagc aaaggaaatc tggccgctct gctgggaagt 360

atgatgtgta tttgatcaat ccccagggaa aagcctttcg ctctaaagtg gagttgattg 420

cgtacttcga aaaggtaggc gacacatccc tggaccctaa tgattttgac ttcacggtaa 480

ctgggagagg gagcccctcc cggcgagagc agaaaccacc taagaagccc aaatctccca 540

aagctccagg aactggcaga ggccggggac gccccaaagg gagcggcacc acgagaccca 600

aggcggccac gtcagagggt gtgcaggtga aaagggtcct ggagaaaagt cctgggaagc 660

tccttgtcaa gatgcctttt caaacttcgc cagggggcaa ggctgagggg ggtggggcca 720

ccacatccac ccaggtcatg gtgatcaaac gccccggcag gaagcgaaaa gctgaggccg 780

accctcaggc cattcccaag aaacggggcc tcgagcacca ccaccaccac cac 833

<210> 9

<211> 301

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

Met Val Ala Gly Met Leu Gly Leu Arg Glu Glu Lys Ser Glu Asp Gln

1 5 10 15

Asp Leu Gln Gly Leu Lys Asp Lys Pro Leu Lys Phe Lys Lys Val Lys

20 25 30

Lys Asp Lys Lys Glu Glu Lys Glu Gly Lys His Glu Pro Val Gln Pro

35 40 45

Ser Ala His His Ser Ala Glu Pro Ala Glu Ala Gly Lys Ala Glu Thr

50 55 60

Ser Glu Gly Ser Gly Ser Ala Pro Ala Val Pro Glu Ala Ser Ala Ser

65 70 75 80

Pro Lys Gln Arg Arg Ser Ile Ile Arg Asp Arg Gly Pro Met Tyr Asp

85 90 95

Asp Pro Thr Leu Pro Glu Gly Trp Thr Arg Lys Leu Lys Gln Arg Lys

100 105 110

Ser Gly Arg Ser Ala Gly Lys Tyr Asp Val Tyr Leu Ile Asn Pro Gln

115 120 125

Gly Lys Ala Phe Arg Ser Lys Val Glu Leu Ile Ala Tyr Phe Glu Lys

130 135 140

Val Gly Asp Thr Ser Leu Asp Pro Asn Asp Phe Asp Phe Thr Val Thr

145 150 155 160

Gly Arg Gly Ser Pro Ser Arg Arg Glu Gln Lys Pro Pro Lys Lys Pro

165 170 175

Lys Ser Pro Lys Ala Pro Gly Thr Gly Arg Gly Arg Gly Arg Pro Lys

180 185 190

Gly Ser Gly Thr Thr Arg Pro Lys Ala Ala Thr Ser Glu Gly Val Gln

195 200 205

Val Lys Arg Val Leu Glu Lys Ser Pro Gly Lys Leu Leu Val Lys Met

210 215 220

Pro Phe Gln Thr Ser Pro Gly Gly Lys Ala Glu Gly Gly Gly Ala Thr

225 230 235 240

Thr Ser Thr Gln Val Met Val Ile Lys Arg Pro Gly Arg Lys Arg Lys

245 250 255

Ala Glu Ala Asp Pro Gln Ala Ile Pro Lys Lys Arg Gly Arg Lys Pro

260 265 270

Gly Ser Val Val Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Lys Lys Lys Ala Val

275 280 285

Lys Glu Ser Ser Ile Leu Glu His His His His His His

290 295 300

<210> 10

<211> 905

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 10

ccatggtagc tgggatgtta gggctcaggg aagaaaagtc agaagaccag gacctccagg 60

gcctcaagga caaacccctc aagtttaaaa aggtgaagaa agataagaaa gaagagaaag 120

agggcaagca tgagcccgtg cagccatcag cccaccactc tgctgagccc gcagaggcag 180

gcaaagcaga gacatcagaa gggtcaggct ccgccccggc tgtgccggaa gcttctgcct 240

cccccaaaca gcggcgctcc atcatccgtg accggggacc catgtatgat gaccccaccc 300

tgcctgaagg ctggacacgg aagcttaagc aaaggaaatc tggccgctct gctgggaagt 360

atgatgtgta tttgatcaat ccccagggaa aagcctttcg ctctaaagtg gagttgattg 420

cgtacttcga aaaggtaggc gacacatccc tggaccctaa tgattttgac ttcacggtaa 480

ctgggagagg gagcccctcc cggcgagagc agaaaccacc taagaagccc aaatctccca 540

aagctccagg aactggcaga ggccggggac gccccaaagg gagcggcacc acgagaccca 600

aggcggccac gtcagagggt gtgcaggtga aaagggtcct ggagaaaagt cctgggaagc 660

tccttgtcaa gatgcctttt caaacttcgc cagggggcaa ggctgagggg ggtggggcca 720

ccacatccac ccaggtcatg gtgatcaaac gccccggcag gaagcgaaaa gctgaggccg 780

accctcaggc cattcccaag aaacggggcc gaaagccggg gagtgtggtg gcagccgctg 840

ccgccgaggc caaaaagaaa gccgtgaagg agtcttctat cctcgagcac caccaccacc 900

accac 905

<210> 11

<211> 724

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 11

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe

1 5 10 15

Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe

20 25 30

Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr

35 40 45

Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp

50 55 60

Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His

65 70 75 80

Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe

85 90 95

Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val

100 105 110

Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys

115 120 125

Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys

130 135 140

Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly

145 150 155 160

Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly

165 170 175

His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val

180 185 190

Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser

195 200 205

His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly

210 215 220

Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser Gly Met Val

225 230 235 240

Ala Gly Met Leu Gly Leu Arg Glu Glu Lys Ser Glu Asp Gln Asp Leu

245 250 255

Gln Gly Leu Lys Asp Lys Pro Leu Lys Phe Lys Lys Val Lys Lys Asp

260 265 270

Lys Lys Glu Glu Lys Glu Gly Lys His Glu Pro Val Gln Pro Ser Ala

275 280 285

His His Ser Ala Glu Pro Ala Glu Ala Gly Lys Ala Glu Thr Ser Glu

290 295 300

Gly Ser Gly Ser Ala Pro Ala Val Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Lys

305 310 315 320

Gln Arg Arg Ser Ile Ile Arg Asp Arg Gly Pro Met Tyr Asp Asp Pro

325 330 335

Thr Leu Pro Glu Gly Trp Thr Arg Lys Leu Lys Gln Arg Lys Ser Gly

340 345 350

Arg Ser Ala Gly Lys Tyr Asp Val Tyr Leu Ile Asn Pro Gln Gly Lys

355 360 365

Ala Phe Arg Ser Lys Val Glu Leu Ile Ala Tyr Phe Glu Lys Val Gly

370 375 380

Asp Thr Ser Leu Asp Pro Asn Asp Phe Asp Phe Thr Val Thr Gly Arg

385 390 395 400

Gly Ser Pro Ser Arg Arg Glu Gln Lys Pro Pro Lys Lys Pro Lys Ser

405 410 415

Pro Lys Ala Pro Gly Thr Gly Arg Gly Arg Gly Arg Pro Lys Gly Ser

420 425 430

Gly Thr Thr Arg Pro Lys Ala Ala Thr Ser Glu Gly Val Gln Val Lys

435 440 445

Arg Val Leu Glu Lys Ser Pro Gly Lys Leu Leu Val Lys Met Pro Phe

450 455 460

Gln Thr Ser Pro Gly Gly Lys Ala Glu Gly Gly Gly Ala Thr Thr Ser

465 470 475 480

Thr Gln Val Met Val Ile Lys Arg Pro Gly Arg Lys Arg Lys Ala Glu

485 490 495

Ala Asp Pro Gln Ala Ile Pro Lys Lys Arg Gly Arg Lys Pro Gly Ser

500 505 510

Val Val Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Lys Lys Lys Ala Val Lys Glu

515 520 525

Ser Ser Ile Arg Ser Val Gln Glu Thr Val Leu Pro Ile Lys Lys Arg

530 535 540

Lys Thr Arg Glu Thr Val Ser Ile Glu Val Lys Glu Val Val Lys Pro

545 550 555 560

Leu Leu Val Ser Thr Leu Gly Glu Lys Ser Gly Lys Gly Leu Lys Thr

565 570 575

Cys Lys Ser Pro Gly Arg Lys Ser Lys Glu Ser Ser Pro Lys Gly Arg

580 585 590

Ser Ser Ser Ala Ser Ser Pro Pro Lys Lys Glu His His His His His

595 600 605

His His Ser Glu Ser Pro Lys Ala Pro Val Pro Leu Leu Pro Pro Leu

610 615 620

Pro Pro Pro Pro Pro Glu Pro Glu Ser Ser Glu Asp Pro Thr Ser Pro

625 630 635 640

Pro Glu Pro Gln Asp Leu Ser Ser Ser Val Cys Lys Glu Glu Lys Met

645 650 655

Pro Arg Gly Gly Ser Leu Glu Ser Asp Gly Cys Pro Lys Glu Pro Ala

660 665 670

Lys Thr Gln Pro Ala Val Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ala Glu Lys Tyr

675 680 685

Lys His Arg Gly Glu Gly Glu Arg Lys Asp Ile Val Ser Ser Ser Met

690 695 700

Pro Arg Pro Asn Arg Glu Glu Pro Val Asp Ser Arg Thr Pro Val Thr

705 710 715 720

Glu Arg Val Ser

<210> 12

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 12

tccggaatgg tagctgggat gttagggctc agggaagaaa agtcagaaga ccaggacctc 60

cagggcctca aggacaaacc cctcaagttt aaaaaggtga agaaagataa gaaagaagag 120

aaagagggca agcatgagcc cgtgcagcca tcagcccacc actctgctga gcccgcagag 180

gcaggcaaag cagagacatc agaagggtca ggctccgccc cggctgtgcc ggaagcttct 240

gcctccccca aacagcggcg ctccatcatc cgtgaccggg gacccatgta tgatgacccc 300

accctgcctg aaggctggac acggaagctt aagcaaagga aatctggccg ctctgctggg 360

aagtatgatg tgtatttgat caatccccag ggaaaagcct ttcgctctaa agtggagttg 420

attgcgtact tcgaaaaggt aggcgacaca tccctggacc ctaatgattt tgacttcacg 480

gtaactggga gagggagccc ctcccggcga gagcagaaac cacctaagaa gcccaaatct 540

cccaaagctc caggaactgg cagaggccgg ggacgcccca aagggagcgg caccacgaga 600

cccaaggcgg ccacgtcaga gggtgtgcag gtgaaaaggg tcctggagaa aagtcctggg 660

aagctccttg tcaagatgcc ttttcaaact tcgccagggg gcaaggctga ggggggtggg 720

gccaccacat ccacccaggt catggtgatc aaacgccccg gcaggaagcg aaaagctgag 780

gccgaccctc aggccattcc caagaaacgg ggccgaaagc cggggagtgt ggtggcagcc 840

gctgccgccg aggccaaaaa gaaagccgtg aaggagtctt ctatccgatc tgtgcaggag 900

accgtactcc ccatcaagaa gcgcaagacc cgggagacgg tcagcatcga ggtcaaggaa 960

gtggtgaagc ccctgctggt gtccaccctc ggtgagaaga gcgggaaagg actgaagacc 1020

tgtaagagcc ctgggcggaa aagcaaggag agcagcccca aggggcgcag cagcagcgcc 1080

tcctcacccc ccaagaagga gcaccaccac catcaccacc actcagagtc cccaaaggcc 1140

cccgtgccac tgctcccacc cctgccccca cctccacctg agcccgagag ctccgaggac 1200

cccaccagcc cccctgagcc ccaggacttg agcagcagcg tctgcaaaga ggagaagatg 1260

cccagaggag gctcactgga gagcgacggc tgccccaagg agccagctaa gactcagccc 1320

gcggttgcca ccgccgccac ggccgcagaa aagtacaaac accgagggga gggagagcgc 1380

aaagacattg tttcatcctc catgccaagg ccaaacagag aggagcctgt ggacagccgg 1440

acgcccgtga ccgagagagt tagcaagctt 1470

<210> 13

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 13

Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Thr Arg Ala Lys Ala Lys

1 5 10 15

Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His

20 25 30

Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ala Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala

35 40 45

Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu

50 55 60

Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile

65 70 75 80

Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Val Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys

85 90 95

Leu Leu Gly Arg Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile

100 105 110

Gln Ser Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser Ser Lys Ser Ala Lys

115 120 125

Ser Lys

130

<210> 14

<211> 404

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 14

catatgtcag gaagaggcaa acaaggcggt aaaacccgcg ctaaggccaa gactcgctca 60

tctcgggctg ggctacagtt ccctgttggc cgtgttcacc ggctgttaag gaaaggcaat 120

tatgcagagc gggtgggagc tggagctcca gtctatctgg ctgcagtgtt ggagtatctg 180

accgctgaga ttttggaatt ggccgggaat gcggcccgtg ataacaagaa gactcgcatt 240

atccccagac acctgcagct cgctgtgcgc aacgatgagg aactgaacaa actgctcgga 300

agagtcacta tcgctcaggg cggggtcctg cccaacatcc agtccgtgct gctgcccaag 360

aaaaccgaga gttccaagtc ggccaagagc aagtgatcgg atcc 404

<210> 15

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 15

Met Ala Lys Ser Ala Pro Ala Pro Lys Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val

1 5 10 15

Thr Lys Thr Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Arg Lys Thr Arg Lys

20 25 30

Glu Ser Tyr Ala Ile Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln Val His Pro

35 40 45

Asp Thr Gly Ile Ser Ser Lys Ala Met Ser Ile Met Asn Ser Phe Val

50 55 60

Asn Asp Val Phe Glu Arg Ile Ala Gly Glu Ala Ser Arg Leu Ala His

65 70 75 80

Tyr Asn Lys Arg Ser Thr Ile Thr Ser Arg Glu Ile Gln Thr Ala Val

85 90 95

Arg Leu Leu Leu Pro Gly Glu Leu Ala Lys His Ala Val Ser Glu Gly

100 105 110

Thr Lys Ala Val Thr Lys Tyr Thr Ser Ala Lys

115 120

<210> 16

<211> 428

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 16

tctagaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatatata tggccaagtc cgctccagcc 60

ccgaagaaag gctccaagaa agcggtgacc aagactcaga agaaagacgg gaaaaagcgc 120

aggaagacaa ggaaggagag ttatgccatt tacgtgtaca aggtgctgaa gcaggtgcac 180

cccgataccg gcatctcgtc caaggccatg agcatcatga actcctttgt caacgatgtg 240

tttgagcgca tcgcagggga agcctcccgc ctggctcatt acaacaagcg ctccaccatc 300

acctcccggg agatccagac cgcggtccga ctgctgctgc ctggggagtt ggccaaacac 360

gccgtgtccg agggcaccaa ggctgtcacc aagtacacca gcgccaagta actgctgctg 420

ccggatcc 428

<210> 17

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 17

Met Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala

1 5 10 15

Pro Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala

20 25 30

Thr Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly Thr Val Ala

35 40 45

Leu Arg Glu Ile Arg Arg Tyr Gln Lys Ser Thr Glu Leu Leu Ile Arg

50 55 60

Lys Leu Pro Phe Gln Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys

65 70 75 80

Thr Asp Leu Arg Phe Gln Ser Ser Ala Val Met Ala Leu Gln Glu Ala

85 90 95

Ser Glu Ala Tyr Leu Val Ala Leu Phe Glu Asp Thr Asn Leu Cys Ala

100 105 110

Ile His Ala Lys Arg Val Thr Ile Met Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala

115 120 125

Arg Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ala

130 135

<210> 18

<211> 509

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 18

tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac catggcccgt accaagcaga 60

ccgcccgtaa atccaccgga gggaaggctc cccgcaagca gctggccacc aaggcagcca 120

ggaagtccgc tcctgctacc ggcggagtca agaaacctca ccgttaccgg cccggcacag 180

tcgctctccg cgagatccgc cgctaccaga aatccaccga gctgctcatc cgcaaactgc 240

ctttccagcg cctggtccgg gagatcgctc aggacttcaa gaccgacctg cgcttccaga 300

gctcggccgt tatggctctg caggaggcca gcgaggctta tctggtcgct ctctttgagg 360

acaccaacct gtgcgccatc cacgccaaga gggtcaccat catgcccaag gacatccagc 420

tggcccgcag aatccgaggc gagagggctt agatccggct gctaacaaag cccgaaagga 480

agctgagttg gctgctgcca ccgctgagc 509

<210> 19

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 19

Met Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala

1 5 10 15

Lys Arg His Arg Lys Val Leu Arg Asp Asn Ile Gln Gly Ile Thr Lys

20 25 30

Pro Ala Ile Arg Arg Leu Ala Arg Arg Gly Gly Val Lys Arg Ile Ser

35 40 45

Gly Leu Ile Tyr Glu Glu Thr Arg Gly Val Leu Lys Val Phe Leu Glu

50 55 60

Asn Val Ile Arg Asp Ala Val Thr Tyr Thr Glu His Ala Lys Arg Lys

65 70 75 80

Thr Val Thr Ala Met Asp Val Val Tyr Ala Leu Lys Arg Gln Gly Arg

85 90 95

Thr Leu Tyr Gly Phe Gly Gly

100

<210> 20

<211> 374

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 20

catatgtctg gtcgtggtaa aggtggtaaa ggtctgggta aaggtggtgc taaacgtcac 60

cgtaaagttc tgcgtgacaa catccagggt atcaccaagc cggctatccg tcgtctggct 120

cgtcgtggtg gtgttaaacg tatctccggt ctgatctacg aagaaacccg cggtgttctg 180

aaagttttcc tggaaaacgt tatccgtgac gctgttacct acaccgaaca cgctaaacgt 240

aaaaccgtta ccgctatgga cgttgtttac gctctgaaac gtcagggtcg taccctgtac 300

ggtttcggtg gttaaagatc cggctgctaa caaagcccga aaggaagctg agttggctgc 360

tgccaccgct gagc 374

<210> 21

<211> 806

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 21

ctgcaggata tcctcgggtc cggcactgga acaggatgta tatatgtgac acgtgcctgg 60

agactaggga gtaatcccct tggcggttaa aacgcggggg acagcgcgta cgtgcgttta 120

agcggtgcta gagctgtcta cgaccaattg agcggcctcg gcaccgggat tctccagggg 180

atccggatgc tcgggtccgg cactggaaca ggatgtatat atgtgacacg tgcctggaga 240

ctagggagta atccccttgg cggttaaaac gcgggggaca gcgcgtacgt gcgtttaagc 300

ggtgctagag ctgtctacga ccaattgagc ggcctcggca ccgggattct ccaggggatc 360

cggatgctcg ggtccggcac tggaacagga tgtatatatg tgacacgtgc ctggagacta 420

gggagtaatc cccttggcgg ttaaaacgcg ggggacagcg cgtacgtgcg tttaagcggt 480

gctagagctg tctacgacca attgagcggc ctcggcaccg ggattctcca ggggatccgg 540

atgctcgggt ccggcactgg aacaggatgt atatatgtga cacgtgcctg gagactaggg 600

agtaatcccc ttggcggtta aaacgcgggg gacagcgcgt acgtgcgttt aagcggtgct 660

agagctgtct acgaccaatt gagcggcctc ggcaccggga ttctccaggg gatccggatg 720

ctcggggata tcggatcctt cattcttggg agttcctaca gcccggcgga tcgacaagtt 780

ctagtgccgc cgccacggcg gtcgac 806

<210> 22

<211> 2138

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 22

ctgcagatat cagatcttac atgcacagga tgtatatatc tgacacgtgc ctggagacta 60

gggagtaatc cccttggcgg ttaaaacgcg ggggacagcg cgtacgtgcg tttaagcggt 120

gctagagctg tctacgacca attgagcggc ctcggcaccg ggattctcca gggcggccgc 180

gtagtactgg atcttacatg cacaggatgt atatatctga cacgtgcctg gagactaggg 240

agtaatcccc ttggcggtta aaacgcgggg gacagcgcgt acgtgcgttt aagcggtgct 300

agagctgtct acgaccaatt gagcggcctc ggcaccggga ttctccaggg cggccgcgta 360

gtactggatc ttacatgcac aggatgtata tatctgacac gtgcctggag actagggagt 420

aatccccttg gcggttaaaa cgcgggggac agcgcgtacg tgcgtttaag cggtgctaga 480

gctgtctacg accaattgag cggcctcggc accgggattc tccagggcgg ccgcgtagta 540

ctggatctta catgcacagg atgtatatat ctgacacgtg cctggagact agggagtaat 600

ccccttggcg gttaaaacgc gggggacagc gcgtacgtgc gtttaagcgg tgctagagct 660

gtctacgacc aattgagcgg cctcggcacc gggattctcc agggcggccg cgtagtactg 720

gatcttacat gcacaggatg tatatatctg acacgtgcct ggagactagg gagtaatccc 780

cttggcggtt aaaacgcggg ggacagcgcg tacgtgcgtt taagcggtgc tagagctgtc 840

tacgaccaat tgagcggcct cggcaccggg attctccagg gcggccgcgt agtactggat 900

cttacatgca caggatgtat atatctgaca cgtgcctgga gactagggag taatcccctt 960

ggcggttaaa acgcggggga cagcgcgtac gtgcgtttaa gcggtgctag agctgtctac 1020

gaccaattga gcggcctcgg caccgggatt ctccagggcg gccgcgtagt actggatctt 1080

acatgcacag gatgtatata tctgacacgt gcctggagac tagggagtaa tccccttggc 1140

ggttaaaacg cgggggacag cgcgtacgtg cgtttaagcg gtgctagagc tgtctacgac 1200

caattgagcg gcctcggcac cgggattctc cagggcggcc gcgtagtact ggatcttaca 1260

tgcacaggat gtatatatct gacacgtgcc tggagactag ggagtaatcc ccttggcggt 1320

taaaacgcgg gggacagcgc gtacgtgcgt ttaagcggtg ctagagctgt ctacgaccaa 1380

ttgagcggcc tcggcaccgg gattctccag ggcggccgcg tagtactgga tcttacatgc 1440

acaggatgta tatatctgac acgtgcctgg agactaggga gtaatcccct tggcggttaa 1500

aacgcggggg acagcgcgta cgtgcgttta agcggtgcta gagctgtcta cgaccaattg 1560

agcggcctcg gcaccgggat tctccagggc ggccgcgtag tactggatct tacatgcaca 1620

ggatgtatat atctgacacg tgcctggaga ctagggagta atccccttgg cggttaaaac 1680

gcgggggaca gcgcgtacgt gcgtttaagc ggtgctagag ctgtctacga ccaattgagc 1740

ggcctcggca ccgggattct ccagggcggc cgcgtagtac tggatcttac atgcacagga 1800

tgtatatatc tgacacgtgc ctggagacta gggagtaatc cccttggcgg ttaaaacgcg 1860

ggggacagcg cgtacgtgcg tttaagcggt gctagagctg tctacgacca attgagcggc 1920

ctcggcaccg ggattctcca gggcggccgc gtagtactgg atcttacatg cacaggatgt 1980

atatatctga cacgtgcctg gagactaggg agtaatcccc ttggcggtta aaacgcgggg 2040

gacagcgcgt acgtgcgttt aagcggtgct agagctgtct acgaccaatt gagcggcctc 2100

ggcaccggga ttctccaggg cggccgcgtg atatcgat 2138

Claims (10)

1.检测MeCP2突变的物质在制备检测或辅助检测所述MeCP2突变是否为致病突变产品中的应用。

2.检测MeCP2突变的物质在检测或辅助检测所述MeCP2突变是否为致病突变中的应用。

3.检测MeCP2突变的物质在筛选或辅助筛选治疗和/或预防所述MeCP2突变所致疾病药物中的应用；

或，检测MeCP2突变的物质在制备筛选或辅助筛选治疗和/或预防所述MeCP2突变所致疾病药物产品中的应用；所述MeCP2突变为MeCP2致病突变。

4.检测MeCP2突变的物质在制备检测或辅助检测所述MeCP2突变是否致病产品中的应用；

或，检测MeCP2突变的物质在检测或辅助检测所述MeCP2突变是否致病中的应用。

5.检测MeCP2突变的物质在制备诊断或辅助诊断所述MeCP2突变所致疾病产品中的应用；

或，检测MeCP2突变的物质在诊断或辅助诊断所述MeCP2突变所致疾病中的应用。

6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述检测MeCP2突变的物质包括发生所述MeCP2突变的MeCP2突变蛋白与下述a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)DNA片段；

a2)核小体串珠；

a3)用于制备核小体串珠的物质；

a4)含有核小体串珠的细胞。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：a1)所述DNA片段为a11)或a12)或a13)：

a11)核小体定位DNA；

a12)含有所述核小体定位DNA的DNA片段；

a13)以a12)为重复单元，重复n次所形成的DNA片段。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：a3)所述物质为a31)或a32)：

a31)组蛋白八聚体与所述DNA片段；

a32)H2A、H2B、H3和H4与所述DNA片段。

9.根据权利要求1-8中任一所述的应用，其特征在于：所述MeCP2突变为MeCP2的截短突变或点突变。

10.具有如下任一功能的产品，为权利要求1-8中任一所述检测MeCP2突变的物质：

X1)制备检测或辅助检测所述MeCP2突变是否为致病突变产品；

X2)检测或辅助检测所述MeCP2突变是否为致病突变；

X3)筛选或辅助筛选治疗和/或预防所述MeCP2突变所致疾病药物；所述MeCP2突变为MeCP2致病突变；

X4)制备筛选或辅助筛选治疗和/或预防所述MeCP2突变所致疾病药物产品；所述MeCP2突变为MeCP2致病突变；

X5)制备检测或辅助检测所述MeCP2突变是否致病产品；

X6)检测或辅助检测所述MeCP2突变是否致病；

X7)制备诊断或辅助诊断所述MeCP2突变所致疾病产品；

X8)诊断或辅助诊断所述MeCP2突变所致疾病。

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