CN116024222A

CN116024222A - 一种导致婴儿严重肌阵挛性癫痫的nac1基因突变体及其应用

Info

Publication number: CN116024222A
Application number: CN202211521427.7A
Authority: CN
Inventors: 曾桥; 李婵艺; 伊宁; 罗娇娇
Original assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-11-30
Filing date: 2022-11-30
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2042-11-30
Also published as: CN116024222B

Abstract

本发明涉及医学诊断领域，特别是涉及一种导致婴儿严重肌阵挛性癫痫的NAC1基因突变体及其应用。本发明提供了一种导致婴儿严重肌阵挛性癫痫的NAC1基因突变体，所述NAC1基因突变体与野生型NAC1基因相比在9号外显子的第939位存在C碱基的缺失。本发明所述NAC1基因突变体能够准确区分Dravet综合征的突变患者和正常人群。

Description

一种导致婴儿严重肌阵挛性癫痫的NAC1基因突变体及其应用

技术领域

本发明涉及医学诊断领域，特别是涉及一种导致婴儿严重肌阵挛性癫痫的NAC1基因突变体及其应用。

背景技术

婴儿严重肌阵挛性癫痫(severe myoclonic epilepsy in infancy，SMEI)(MIM182389)，又称为Dravet syndrome。该病是一种临床少见的癫痫综合征，以婴儿期起病、发作形式多样、精神运动发育迟滞、药物难治性等为主要特征，是难治性癫痫的代表综合征。该病发病率1/40000～1/20000，男女比例约为2:1；占小儿各型肌阵挛性癫痫的29.5％，占1岁以内婴幼儿癫痫的3％，3岁以内婴幼儿癫痫的7％，患儿早期死亡风险高达10％。

临床表现：8该病患儿出生时多正常，在1岁以内起病，平均发病年龄为5.6个月。首次发作常为热性惊厥，可为一侧性或全面性阵挛或强直阵挛发作，热性惊厥具有发作持续时间长和反复发作特点，可出现持续状态。28％～35％患儿可能以无热惊厥起病，但在以后病程中常有热敏感特点。各种原因引起的体温升高，包括运动、发热、疫苗接种、洗热水澡和环境温度高等，均容易诱发或使发作加重，并易发生癫痫持续状态。有些该病患儿会出现以癫痫持续状态之后深昏迷为特征的急性脑病。

该病患儿多于1～4岁期间出现无热惊厥，具有多种发作类型，如肌阵挛、不典型失神、部分性发作、全面强直阵挛发作等。肌阵挛发作常由光刺激、闭眼和某种特定的图形刺激诱发，一块或数块肌肉同时阵挛，均伴有同步异常脑电波阵发性发放。肌阵挛强度不一，仅侵犯轴性肌肉时，出现身体轻微向前或向后的动作，严重者跌倒或突然抛掷手中物体。肌阵挛发作可以是孤立的，也可群发，但持续状态比较罕见。约25％的该病患儿可以始终不出现肌阵挛发作。不典型失神发作同期脑电图显示半数为局灶起源放电，多数呈不规则不节律的慢棘慢波发放，经常伴随肌阵挛发作。30％的患儿可发生不典型失神持续状态。部分性发作发生率为43.0％～78.6％，表现为偏侧肢体或头部偏转性发作或阵挛性发作，亦有运动性发作伴有意识障碍和自主神经症状、自动症、肌张力降低等。该病患儿一般不出现强直发作。1岁以后患儿出现精神运动发育迟滞，尤其是语言发育迟缓。

辅助检查：1)头颅MRI：该病患儿早期头颅MRI绝大多数正常，随着年龄增长可出现异常。表现为大脑皮质萎缩，侧脑室扩大，灰白质容量减少，分界不清，少数患儿可出现海马硬化，半侧阵挛持续状态患儿恢复期可遗留半侧脑萎缩；2)视频脑电图(VEEG)：该病患儿早期脑电图多正常，1岁以后出现背景活动异常，以慢波增多为主，随后出现全导棘慢波或多棘慢波，局灶性或多灶性异常放电，约1/3的患儿可被闪光刺激诱发。在患儿1岁之后，发作类型增多，脑电图背景逐渐恶化，主要表现为双侧中央、顶区为主的5～7Hz节律慢波长程发放，也可有阵发高波幅慢波节律。

70％～80％的患者是由NAC1基因(MIM 608148)突变导致的常染色体显性遗传病。NAC1基因是定位于染色体2q24.3，包括29个外显子和28个内含子，基因长142.2kb，编码2009个氨基酸的钠离子通道α1亚单位，α亚基是钠通道的功能性单位，由四个高度同源性的结构域(D1～D4)通过胞内连接环相连而成。每个结构域含有6个跨膜片段(S1～S6)。目前已发现有600余种NAC1基因突变，如D188V、T875M、W1204R、V1353L、R1648H、I1656M、R1657C、L986F、K1270T、D1866Y、C121W、R85C、R85H、G1742D、R1596C、M145T等，突变类型绝大部分为错义突变，产生钠通道蛋白氨基酸的改变，导致钠通道功能增强或者减弱。癫痫发作为神经元异常放电所致，电压门控钠离子通道主要负责控制细胞电兴奋性活动，在中枢神经系统中对动作电位的起始和传播起着非常重要的作用，同时也是众多抗癫痫药物作用的关键靶点。与其他遗传性癫痫脑病相似，大多数该病病例为新生突变。

因此，基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊Dravet综合征的重要遗传学标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断。但目前并没有能特异性区分Dravet综合征的突变患者和正常人群的诊断试剂的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种导致婴儿严重肌阵挛性癫痫的NAC1基因突变体、致病基因及其应用。本发明所述NAC1基因突变体能够准确区分Dravet综合征的突变患者和正常人群。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种导致婴儿严重肌阵挛性癫痫的NAC1基因突变体，所述NAC1基因突变体与野生型NAC1基因相比在9号外显子的第939位存在C碱基的缺失；所述野生型NAC1基因的登录号为NM_001165963.4。

本发明提供了一种导致婴儿严重肌阵挛性癫痫的NAC1突变体蛋白，所述NAC1突变体蛋白含有p.W314Gfs*18的突变。

本发明提供了用于扩增上述技术方案所述的NAC1基因突变体或上述技术方案所述的致病基因的引物对，所述引物对包括NAC1-1F和NAC1-1R；

所述NAC1-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述NAC1-1R的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

本发明提供了上述技术方案所述NAC1基因突变体或上述技术方案所述NAC1突变体蛋白作为靶点或上述技术方案所述引物对在制备诊断、辅助诊断或筛查婴儿严重肌阵挛性癫痫的试剂或试剂盒中的应用。

本发明提供了一种诊断、辅助诊断或筛查婴儿严重肌阵挛性癫痫的试剂，所述试剂包括上述技术方案所述的引物对。

本发明提供了一种诊断、辅助诊断或筛查婴儿严重肌阵挛性癫痫的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的试剂。

优选的，所述试剂盒还包括测序引物对；所述测序引物对包括NAC1-Seq1F和NAC1-1R；所述NAC1-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述NAC1-1R的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。

优选的，所述试剂盒还包括阳性突变参考品DNA；所述阳性突变参考品DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明提供了一种鉴定NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC位点的基因型的方法，包括以下步骤：

以待测样品DNA为模板，利用上述技术方案所述的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；

将扩增产物进行测序，确定所述NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC位点的基因型。

优选的，所述样本优选包括血液。

有益效果：本发明提供了一种导致婴儿严重肌阵挛性癫痫的NAC1基因突变体，所述NAC1基因突变体与野生型NAC1基因相比在9号外显子的第939位存在C碱基的缺失。本发明所述NAC1基因突变体能够准确区分Dravet综合征的突变患者和正常人群。本发明首次发现NAC1一种新型突变，可导致Dravet综合征，并据此研制相应的诊断试剂盒，助力Dravet综合征基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。

而且本发明通过外显子组测序技术首次发现了NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC:p.W314Gfs*18位点突变可以导致婴儿严重肌阵挛性癫痫发病。通过检测受试者是否携带有上述突变，用于筛查或诊断婴儿严重肌阵挛性癫痫的遗传学诊断，以指导治疗，以及优生优育。本发明可以为治疗婴儿严重肌阵挛性癫痫提供可能的药物靶点，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。

特别地，本发明所提供的诊断试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断婴儿严重肌阵挛性癫痫。本发明为婴儿严重肌阵挛性癫痫的发病机制研究奠定了重要基础，为婴儿严重肌阵挛性癫痫患者的治疗提供全新的理论依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1显示婴儿严重肌阵挛性癫痫1号家系遗传图谱，其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者个体，↗表示先证者；

图2显示1号家系利用Sanger测序检测NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC:p.W314Gfs*18位点基因型的结果图，其中，A和B为家系中正常个体，C为家系中婴儿严重肌阵挛性癫痫患者，测序图中星号所指为突变发生位置；

图3显示婴儿严重肌阵挛性癫痫2号家系遗传图谱，其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者个体，↗表示先证者；

图4显示2号家系利用试剂盒检测NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC:p.W314Gfs*18位点基因型的结果图；其中，A和B为家系中正常个体，C为家系中婴儿严重肌阵挛性癫痫患者，测序图中箭头所指为突变发生位置。

具体实施方式

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内的广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。

文中术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。

在本发明中，术语“杂合子突变”/“杂合突变”是指是等位基因中只有其中一个基因出现突变。

文中术语“产前诊断”是指是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患病胎儿的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。

在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增NAC1基因是指，在PCR反应中引物只扩增NAC1基因，而不扩增其他基因。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring HarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明提供了一种导致婴儿严重肌阵挛性癫痫的NAC1基因突变体，所述NAC1基因突变体与野生型NAC1基因相比在9号外显子的第939位存在C碱基的缺失，所述野生型NAC1基因的登录号为NM_001165963.4；所述NAC1基因突变体的上游五个碱基和下游五个碱基的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.6所示，具体为：TTTGATGGAA，即在碱基A和碱基T之间发生碱基缺失。本发明当在登录号为NAC1:NM_001165963.4的基因的9号外显子的第939位存在C碱基的缺失时，则会导致该基因编码的NAC1蛋白在第314位氨基酸由色氨酸突变为甘氨酸，并造成后续移码突变，在后面16位氨基酸后终止。

本发明提供了一种导致婴儿严重肌阵挛性癫痫的NAC1突变体蛋白，所述NAC1突变体蛋白含有p.W314Gfs*18的突变；即所述NAC1突变体蛋白与野生型NAC1基因编码的蛋白相比，从第314位氨基酸发生移码突变，其中第314位氨基酸由色氨酸突变为甘氨酸，因此所述NAC1突变体蛋白含有p.W314Gfs*18的突变；所述突变是由于c.939delC的移码突变引起的。本发明所述NAC1突变体蛋白的第313位氨基酸到第330位氨基酸的氨基酸序列优选如SEQID NO.8所示，具体为DGSHIFKIQDIIISWRVF*(加粗斜体字母为移码突变后的氨基酸序列，*为终止密码位置)。

本发明还优选提供了一种导致婴儿严重肌阵挛性癫痫的致病基因，在登录号为NAC1:NM_001165963.4的基因的9号外显子的第939位存在C碱基的缺失形成致病基因。本发明当在登录号为NAC1:NM_001165963.4的基因的9号外显子的第939位存在C碱基的缺失时，则会导致该基因编码的NAC1蛋白在第314位氨基酸由色氨酸突变为甘氨酸，并造成后续移码突变，在后面第18位氨基酸终止。

本发明所述NAC1基因突变体、NAC1基因突变体蛋白和致病基因能够准确区分Dravet综合征的突变患者和正常人群。通过检测受试者是否携带有所述NAC1基因突变体、NAC1基因突变体蛋白或致病基因，可以诊断试受者是否为患者，因此，可以用于筛查或诊断Dravet综合征的遗传学诊断。

本发明提供了用于扩增上述技术方案所述的NAC1基因突变体或上述技术方案所述的致病基因的引物对，所述引物对包括NAC1-1F和NAC1-1R；所述NAC1-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述NAC1-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述引物对优选根据核苷酸序列为SEQ ID NO.5的序列设计得到。

基于上述技术方案所述NAC1基因突变体、NAC1突变体蛋白和致病基因的优势，本发明提供了上述技术方案所述NAC1基因突变体或上述技术方案所述NAC1突变体蛋白作为靶点或上述技术方案所述引物对在制备诊断、辅助诊断或筛查婴儿严重肌阵挛性癫痫的试剂或试剂盒中的应用。

本发明提供了一种诊断、辅助诊断或筛查婴儿严重肌阵挛性癫痫的试剂，所述试剂包括上述技术方案所述的引物对。本发明所述引物对在前文已经进行了详细的描述，因此在此处不再赘述。

本发明提供了一种诊断、辅助诊断或筛查婴儿严重肌阵挛性癫痫的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求8所述的试剂。本发明所述试剂在前文已经进行了详细的描述，因此在此处不再赘述。本发明所述试剂盒优选包括阳性突变参考品DNA；所述阳性突变参考品DNA的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示。本发明所述试剂盒还优选测序引物对包括NAC1-Seq1F和NAC1-1R；所述NAC1-Seq1F的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示；所述NAC1-1R的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种鉴定NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC位点的基因型的方法，包括以下步骤：

本发明所述PCR扩增的反应程序优选包括95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，44℃退火30秒，72℃延伸60秒，30个循环；72℃反应7分钟。本发明所述PCR扩增的反应体系以20μL计，优选包括10×PCR缓冲液2μL、10mmol/LdNTPs 0.4μL、100ng/μLNAC1-F0.5μL、100ng/μLNAC1-R0.5μL、100ng/μL模板DNA1μL、5u/μLTaq酶0.2μL和余量的ddH₂O。在本发明中，所述样本优选包括血液。

在本发明中，所述NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC位点的基因型具体为“c.939delC杂合子”、“c.939C/C纯合子”和“c.939delC纯合子”三种；其中c.939delC杂合子表述为“C/-”，c.939C/C纯合子表述为“C/C”(也称为野生型)，c.939delC纯合表述为“-/-”(也称为纯合突变)；

当NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC位点的基因型为“c.939delC杂合子”，则判断NAC1基因存在突变，个体为患者；当NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC位点的基因型为“c.939C/C纯合子”，则判断NAC1基因不存在突变，个体为正常人；当NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC位点的基因型为“c.939delC纯合子”，则判断NAC1基因存在纯合突变，个体为患者，但该突变非常罕见。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

发明人共筛查和检测18个癫痫家系中56位个体，其中在2个家系中发现NAC1基因“c.939delC杂合突变，实施例1选择其中1个性反转家系，简称家系1，实施例4选择另一个家系，简称家系2。

实施例1样本获取

家系1，即婴儿严重肌阵挛性癫痫家系，该家系部分成员的临床信息见表1。图1显示了家系1图谱，其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者个体，↗表示先证者。

1.诊断标准：

可参照《人类单基因遗传疾病》2010年版和《罕见病诊疗指南》2019年版：

临床诊断该病的诊断依靠临床表现、头部影像学、脑电图等临床和电生理评估。诊断标准(国际抗癫痫联盟诊断标准)：

1)有癫痫或热惊厥家族史；2)出现痫性发作前生长发育正常；3)癫痫发作出现在1岁前；4)多种类型癫痫(肌阵挛、局灶性痉挛发作、失神发作、全面性发作)；5)脑电图可见广泛性棘波和多棘波；6)早期光敏感；7)2岁后神经运动发育迟滞；8)发育迟滞症状开始后出现共济失调、锥体束损害、发作间期肌阵挛；9)体温升高加重癫痫发作。

遗传咨询与产前诊断基因诊断是该病的病因诊断，该病基因确诊后建议行遗传咨询以明确预后及家系内其他成员的患病风险，后续用药指导。在家属充分知情，征求意见后，再次生育前可考虑产前诊断。

表1婴儿严重肌阵挛性癫痫1号家系成员的临床信息

如图1所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

1号家系人员Ⅰ：1(父亲)、Ⅰ：2(母亲)、Ⅱ：1(先证者)外周血DNA用于测序分析。

实施例2外显子测序

1.仪器设备如表2所示。

表2仪器设备一览表

2.试剂耗材

人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDye Ter分钟atorV3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。

3.试剂配方

5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。

表3 5×TBE电泳液配方

试剂	Tris	硼酸	EDTA(pH 8.0,0.5mol/L)	<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>
					体积/重量	5.4g	750mg	2.0mL	90.0mL

用ddH₂O将最终体积调整为100mL。

0.5×TBE电泳液工作液为用ddH₂O将5×TBE电泳液稀释10倍即可。

10×红细胞裂解液按照表4配制。

表4 10×红细胞裂解液配方

试剂	<![CDATA[NH<sub>4</sub>Cl]]>	<![CDATA[KHCO<sub>3</sub>]]>	EDTA	<![CDATA[加ddH<sub>2</sub>O]]>
					体积/重量	82.9g	10.0g	0.37g	至1000mL

高压灭菌，4℃保存。

1×细胞核裂解液按照表5配制。

表5 1×细胞核裂解液配方

试剂	体积/重量
		2M Tris-HCl,pH8.2	0.5mL
4M NaCl	10.0mL
		2mM EDTA	0.4mL

4.实验步骤

签署知情同意书后，采集1号家系人员Ⅰ：1(父亲)、Ⅰ：2(母亲)、Ⅱ：1(先证者)外周血用于抽提DNA。

4.1样本DNA提取

1)对于肝素抗凝外周血样本，则将外周血3-5mL装入15mL离心管中，加2-3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。

2)4℃，3000转/分离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL 20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。

3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分离心10分钟。

4)小心移上清至另一离心管，加等体积酚/氯仿(1:1v/v)混匀，室温3000转/分离心10分钟。

5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。

6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。

7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。

4.2外显子测序

1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150-250bp片段；

2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；

3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；

4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；

5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。

4.3结果

最终在1号家系中得到1个具有致病意义的基因突变NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC:p.W314Gfs*18；c.939delC突变导致所编码的NAC1蛋白质第314位氨基酸由色氨酸变为甘氨酸，并造成后续移码突变，在后面16位氨基酸后终止。在1号家系患者个体中NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC:p.W314Gfs*18位点的基因型是“c.939delC杂合子”突变；在家系1正常个体中基因型是野生型。

实施例3Sanger测序验证

对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC:p.W314Gfs*18位点进行验证。分别对实施例1中的1号家系中3名人员和100名家系外正常人进行NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC:p.W314Gfs*18位点基因型检测。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取按照实施例1的方法提基因组DNA。

2、候选引物设计、验证及优选

2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome，或http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway？redirect＝manual&source＝genome.ucsc.edu)。

2.2针对c.939delC位点设计引物进行PCR检测，共设计16对候选引物(见表6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况

表6各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表

注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况。另外参考如下原则来综合评价和选择最优引物对：

①引物长度为15-30nt，常用为20nt左右；②G+C含量以40-60％为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布；③避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照；④引物内部不应出现互补序列；⑤两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3`端的互补重叠；⑥引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70％，引物3`末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

2.3候选引物PCR验证反应

按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。

表7引物检测PCR反应体系

反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃，5分钟；第二步：30个循环(95℃，30秒→Tm，30秒→72℃，60秒)；(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数，如为双引物则取Tm平均值)；第三步：72℃，7分钟；第四步：4℃直至取样时。

2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：

1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。

2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。

3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。

4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。

5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1-2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。

6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。

7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/mL的EB水溶液中染色10-15分钟。

8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。

2.5结果评价：

1)如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；

2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；

3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；

4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；

5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。

2.6根据表6验证测试后统计的结果，选择其中最优一对(表6中2位点1号)作为突变家系检测用引物，引物序列如下所示：

NAC1-1F：5’-TGTTCTGTCTGAGCGTA-3’，SEQ ID NO.1；

NAC1-1R：5’-GAAGCCATTGATAAGGT-3’，SEQ ID NO.2；

3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增

按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。

表8突变位点PCR反应体系

试剂	体积
		10×PCR缓冲液	2.0μL
10mmol/L dNTPs	0.4μL
		100ng/μL NAC1-F	0.5μL
100ng/μL NAC1-R	0.5μL
		100ng/μL抽提DNA	1.0μL
5u/μL Taq酶	0.2μL
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	15.4μL

PCR反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃，5分钟；第二步：30个循环(95℃，30秒→44℃，30秒→72℃，60秒)；第三步：72℃，7分钟；第四步：4℃直至取样时。

4、琼脂糖凝胶电泳检测

参照上述2.4步骤。

5、PCR产物酶解法纯化：5μLPCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。

6、BigDye反应

BigDye反应体系见表9。

表9 BigDye反应体系

试剂	用量
		PCR产物纯化后DNA	2.0μL
3.2pmol/μL测序引物	1.0μL
		BigDye	0.5μL
5×BigDye测序缓冲液	2.0μL
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	4.5μL

测序PCR循环条件：

第一步：96℃，1分钟；第二步：33个循环(96℃，30秒→55℃，15秒→60℃，4分钟)；第三步：4℃直至取样时。

7、BigDye反应产物纯化：

1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/L NaAc(Ph5.2)；

2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15分钟；

3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；

4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μL Hi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。

8、测序

将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物，测序引物序列如下所示：

NAC1-Seq1F：5’-GGGCAACCTGAGGAATAA-3’，SEQ ID NO.3；

NAC1-Seq1R：5’-AGCAATGAAAAGACCAAAT-3’，SEQ ID NO.4；

9、结果分析

图2的Sanger测序结果和测序图中箭头所指位置显示，1号家系中1名患者NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC:p.W314Gfs*18位点基因型是“c.939delC杂合子”；家系3名正常个体和100个无血缘关系的正常对照的NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC:p.W314Gfs*18位点基因型是野生型。其中图2中A和B层显示家系中正常个体NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC:p.W314Gfs*18位点基因型是野生型，图2中C层显示婴儿严重肌阵挛性癫痫患者NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC:p.W314Gfs*18位点基因型是“c.939delC杂合子”突变。

实施例4婴儿严重肌阵挛性癫痫诊断试剂盒

1、试剂盒组成：

1)扩增引物：采用的引物对为实施例3中的引物，该引物对为核苷酸序列具体如SEQ IDNO.1所示的NAC1-1F和核苷酸序列具体如SEQ ID NO.2所示的NAC1-1R；

2)缓冲液为500μL的10×PCR缓冲液，其中10×PCR缓冲液具体为500mmol/L KCl，100mmol/LTris.Cl(pH8.3)，15mmol/LMgCl₂；

3)Taq酶(20U)；

4)dNTPs(四种dNTP各4mM)；

5)NAC1:c.939delC阳性突变参考品DNA该参考品为一段双链DNA，c.939delC阳性突变参考品具体序列如下所示：

其中，单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置，方框为缺失突变发生位点，双下划线碱基为上下游测序引物位置。

6)测序引物：与实施例3中一致，采用序列如SEQ ID NO.3所示的NAC1-Seq1F和序列如SEQ ID NO.4所示的NAC1-1R；

2、使用方法：

试剂盒应用于家系2的患者进行检测(见表10)。

表10婴儿严重肌阵挛性癫痫家系2成员的临床信息

如图3所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

2号家系人员Ⅰ:1(先证者父亲)、Ⅰ:2(先证者母亲)、Ⅱ:1(先证者)外周血DNA用于试剂盒检测。

1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。

2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应；

3)对PCR扩增产物进行纯化；

4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；

5)对BiyDye反应产物纯化；

6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。

图4的试剂盒检测序结果和测序图中箭头所指位置显示，2号家系中先证者NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC:p.W314Gfs*18位点基因型是“c.939delC杂合突变”；先证者父母的NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC:p.W314Gfs*18位点也为野生型。图4中A和B层显示家系中正常个体NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC:p.W314Gfs*18位点基因型是野生型。图4中C层显示家系中先证者NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC:p.W314Gfs*18位点基因型是“c.939delC杂合突变”。结合病史和家系图，检测结果确认先证者为婴儿严重肌阵挛性癫痫；先证者父母没有该突变，下次妊娠再生育婴儿严重肌阵挛性癫痫的风险较低。

由以上实施例结果可以看出，本发明发现了新的NAC1基因突变体，且确认了新突变体与婴儿严重肌阵挛性癫痫的发病密切相关，所述致病突变体可用于婴儿严重肌阵挛性癫痫的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。可见本发明所述试剂盒主要用于罕见病的家系突变点验证检测以及产前诊断等，能够节约成本，也可以用于普通人群或特定人群的筛查，但成本会增加。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种导致婴儿严重肌阵挛性癫痫的NAC1基因突变体，所述NAC1基因突变体与野生型NAC1基因相比在9号外显子的第939位存在C碱基的缺失；所述野生型NAC1基因的登录号为NM_001165963.4。

2.一种导致婴儿严重肌阵挛性癫痫的NAC1突变体蛋白，所述NAC1突变体蛋白含有p.W314Gfs*18的突变。

3.用于扩增权利要求1所述的NAC1基因突变体的引物对，其特征在于，所述引物对包括NAC1-1F和NAC1-1R；

4.权利要求1所述NAC1基因突变体或权利要求2所述NAC1突变体蛋白作为靶点或权利要求3所述引物对在制备诊断、辅助诊断或筛查婴儿严重肌阵挛性癫痫的试剂或试剂盒中的应用。

5.一种诊断、辅助诊断或筛查婴儿严重肌阵挛性癫痫的试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求3所述的引物对。

6.一种诊断、辅助诊断或筛查婴儿严重肌阵挛性癫痫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求5所述的试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括测序引物对；所述测序引物对包括NAC1-Seq1F和NAC1-1R；所述NAC1-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述NAC1-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性突变参考品DNA；所述阳性突变参考品DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

9.一种鉴定NAC1:NM_001165963.4:exon9:c.939delC位点的基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述样本优选包括血液。