JPH02195A - モノクローナル抗体によって同定される属特異的リステリア抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）に特異的な抗
原、これら抗原に対する抗体、試料中のリステリアを検
出するための分析法、並びにこの分析法で使用するため
のテスＩ〜キット及びその構成要素に係わる。

Ｌｉ５ｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏＨｅｎｅｓはヒト
病原体として次第に注目されるようになってきた。米国
におけるリステリア病の発生に関する幾つかの文書には
、リステリアで汚染された食物が怒染源として確認され
たという報告が見られる。１９８１年にはキャベツによ
る大量発生が報告され、１９８３年にはミルクによる発
生、そして１９８５年には汚染チーズに起因する１００
以上の症例が報告された。

Ｕ、Ｓ、Ｆ’ＤΔ（アメリカ合衆国食品医薬凸周）は、
食物中のリステリアに対する許容度はゼロであると表明
している。最近ではＵ、Ｓ、ＦＤ＾によってリステリア
含有製品、一般的には乳製品、特にチーズ及びアイスク
°リームの回収が行われた。その中には輸入製品も含ま
れていた。また、会社側の発意による食品の回収も何回
か実施された。

リステリア汚染食品を同定するための信頼できる方法が
必要なことは明白であるが、現在のところ、リステリア
と培養又は確認する簡単な又は−般的に使用できる方法
は存在していない。食品業界の分析方法を公認する機関
であるＴｈｅ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｒ　０ｆｆ
ｉｃｉａｌΔｎａｌｙｔｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ　（八
〇ＡＣ）は、食品からリステリアを培養する方法をまだ
１つも承認していない。ＦＤ八が提案する方法は、検査
に先立って長時間の低温集積培養を必要とする。他の方
法はデータ分析に複雑な装置を使用しなければならない
。

リステリアは胞子を形成しないダラム陽性の運動性桿菌
であり、広い温度範囲（４℃〜４５°Ｃ）で増殖能力を
示す。この菌は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）及び糞便連鎖球菌（Ｓｔｒ
ｃｐＬ。

Ｈ（ＨＣｌ２　ｆｅｃａ！ｉｓ）のような他のグラム陽
性微生物に対して抗原的な関係を有すると報告されてい
る。

従って、リステリアを免疫診断法で同定するためには、
極めて特異的な抗体及び／又はこの微生物に対して極め
て特異的な抗原が必要となる。我々は属特異的リステリ
ア抗原を同定する一連のネズミモノクローナル抗体を製
造し、その特性を分析した。これらはいずれもリステリ
ア診断アッセイの開発に有効に使用することができる。

我々はり、ｄｅｎｉｔｒｉｆ　１ｃａｎｓ以外の総ての
リステリアの種から抽出したリステリア熱抽出物と反応
するマウスモノクローナル抗体を製造した。これらのモ
ノクローナル抗体はいずれも、還元条件及び非還元条件
で測定して約３０〜約３８ｋＤの分子量をもつ１つの特
定タンパク質と反応する。この抗原は総ての種において
確認され、その分子サイズはこれらの種の間で少し変化
していた。この抗原は少なくとも３つの免疫原性エピト
ープを有することを特徴とす゛る。従って、形成した抗
体はこれら３つのエピトープのいずれか１つに対して特
異的反応性を示した。約１．７　ｋ　Ｄ〜約３０ｋＤの
より低い分子量の抗原が同定されたが、これらの抗原は
前記３０〜３８ｋＤタンパク質の前記３つのエピトープ
のうちの１つと同じ免疫反応性を示すエピｌ−−プを含
むという特徴を有する。

多くの食品に関して現在Ｕ、Ｓ、ＦＤ八で承認されてい
るリステリア検出方法では、検査に先立って少なくとも
７日間の低温集積培養を実施しなければならない。これ
は労力と時間の要る仕事であり、そのため完成製品の発
売が遅くなる。現在のところ、モノクローナル抗体を使
用するような、迅速で正確なリステリア検査法は存在し
ない。

リステリア検出用の時間のかからないイムノアッセイを
開発すべく、我々はリステリアに対して特異性を示すモ
ノクローナル抗体を開発し、その特性を分析した。我々
はこれらのモノクローナル抗体をＥＬｒＳ＾（ｅｎｚｙ
ｍｅ　１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｒ＋Ｌ　
ａｓｓａｙｓ）で十分に検査して、成るリステリア血清
型（１〜５）パネルに対する広範囲の反応性を調べた。

Ｌ、ｄｃｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓを除いて、Ｌ、ｍｏｎ
ｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（血清型１〜４）、Ｌ４ｒａｙｉ
（血清型５）、Ｌ、１ｖａｎｏｖｉｉ、Ｌ、＋＋＋ｕｒ
ｒａｙｉ、Ｌ、＊ｅｅｌｉｇｅｒｉ及びり、１ｎｎｏｃ
ｕａを含む総てのリステリア種からの熱抽出物と反応す
る１６種のモノクローナル抗体（表１）が同定された。

Ｌ、ｄｅｎｉＬｒｉｆ　１ｃａｎｓはＡＴＣＣから入手
したものであり、［リステリア属に関する記述と矛盾す
る」と報告されている［八ＴＣＣＣａｔａｌｏｇｕｅ　
ｏｒ　Ｂａｃｔｅｒｉａ、ＰＩ＋ａｇｅｓａｎｄ　　ｒ
ＤＮ八　Ｖｃｔｏｒｓ、　　１６Ｌｂ　　ｅｄｉｔｉｏ
ｎ、　　１９８５．　　ｐ、９６］。

従って、抗リステリアモノクローナル抗体がこの熱抽出
物と反応しない理由は、Ｌ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃｕｎ
ｓがリステリア属に間違って分預されたためではないか
と考えられる。

艮−−Ｌ ＭｏＡｂｓのεＬＩＳ＾反応性のスクリーニングれらの
モノクローナルはリステリアの属特異的抗原を認識する
と結論することができる。

リスプリアに特異的なモノクローナル抗体のうち、ＩＨ
Ｇ２ｍモノクローナル抗体はＳ、ａｕｒｅｕｓに対する
反応性も示したく表２）。しかしながら、これは熱抽出
物中に抗体と結合した細胞壁物質が存在するために生し
たものであることが判明した。

表　　２ プロティンＡ非特異的結合 ラム陽性及びダラム陰性微生物の総合パネルに対してＥ
ＬＩＳＡ検査することにより、リステリアに対する特異
性を確認した。前記微生物の多くはしばしばリステリア
培養時に、予め強化した培地（ｐｒｅｅｎｒｉｃｈｍｅ
ｎｔ　１１ｅｄｉａ）から増殖する。これら１６種のモ
ノクローナル抗体は総て、非リステリア熱抽出物のいず
れとも余り反応しなかった。従って、こ記号ニー＝＜０
．２ ＋１＝０．２〜０．５ ＋２＝０．５〜１．０ ＋３＝１．０〜２．０ ＋４＝＞２．０ この現象は遠心分離処理によって消滅したため、我々は
、Ｓ、ａｕｒｅｕｓに対する１ｇＧ２．モノクローナル
抗体の結合が細胞壁中のプロティンＡを介して行われる
と結論した。このプロティンＡはＩｇＧ２ｍ抗体のＦｃ
部分と結合することが知られている［Ｊ。

Ｇｏｄｉｎｇ、　（１９８７）　、Ｊ、Ｉ＋ｕｓｕｎｏ
１．ＭｅＬｈ、２０：２４１コ、我々の結論は、通常１
ｇＧ２ａより小さい親和力でプロティンＡと結合するリ
ステリア特異的１ｇＧ、モノクローナル抗体［（：ｏｄ
ｉｎｇ、　（１９８７）］のいずれもＳ、ａｕｒｅｕｓ
と陽性反応しなかったという事実によって裏付けられた
。我々はまた、総てのグラム陽性微生物を認識すると思
われるモノクローナル抗体１０−７Ｃも同定した。この
１０−７Ｃは遠心分離処理してもリステリア及びＳ、ａ
ｕｒｅｕｓの両方と反応し続けた。

我々のリステリア特異的モノクローナル抗体が反応した
抗原の特性をウェスタン法（１＋Ｉｅｓｔｅｒｎｂｌｏ
Ｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ）によって分析した。１６種のリ
ステリア特異的モノクローナル抗体は総て、還元及び非
還元条件下で分子量３０〜３８ｋＤのタンパク質を認識
した。ｒｇＧ２□モノクローナル抗体と一部のＩｇＧモ
ノクローナル抗体は約１７ｋＤから主要抗原のサイズに
及ぶ範囲のより小さい分子量サイズの抗原にも結合した
゛。主要抗原は被検リステリア種の種類に応じて２つの
分子量範囲を有していた。

Ｌ、ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（血清型１〜４）、Ｌ
、１ｖａｎｏｖｉｉ。

Ｌ、ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ及びり、１ｎｎｏｃｕａでは前
記主要抗原の分子量が約３０〜３４ｋＤであり、Ｌ、ｇ
ｒａｙｉ及びり、ｍｕｒａｙｉでは約３４〜３８ｋＤで
ある。

サブアイソタイプ分析並びにＥＬＩＳ八及びウェスタン
法の結果によれば、リステリア特異的モノクローナル抗
体には少なくとも３つのグループが存在すると考えられ
る。そのうちの１つ（グループＩ）は、全体的に小さい
ＥＬＩＳ＾シグナルを発生したＩｇＧ、モノクローナル
抗体からなり、３０〜３８ｋＤの属特異的抗原としか反
応しないと思われる（例えば第１図のモノクローナル抗
体９−５Ｅ参照）。第２のブルーフ責グループ１１）は
、全体的に中間のＥＬＩＳ＾シグナルを発生したＩｇＧ
１モノクローナル抗体からなり、主に３０〜３８ｋＤの
抗原に結合したが、それより２〜４小さい分子量の抗原
も認識したく例えば第１図のモノクローナル抗体１０−
１２Ｃ参照）。第３のグループ（グループＩＩＩ）は、
全体的に大きいＥＬ［ＳΔシグナレ読取りを生した１、
Ｇ２．からなり、主に３０〜３８ｋＤの抗原に結合した
が、それより少なくとも４小さい分子量の抗原も認識し
た（例えば第１図のモノクローナル抗体１０−２＾参照
）。少なくとも３つのエピトープ特異性が存在すること
は、前記モノクローナル抗体の幾つかを２部位サンドイ
ッチ式ＥＬＩＳ八で使用することによっても立証できた
。即ち、個々のモノクローナル抗体に関して説明したも
のと同じ特異性が示されたのである。更に、ＥＬＩＳ＾
及びウェスタン法の両方の結果に基づいて特性を分析し
たところ、グラム陽性特異的モノクローナル抗体１０−
７Ｃはリステリア特異的モノクローナル抗体とは異なる
抗原に明らかに結合していた。

本発明では、前記抗原に対する抗体を使用することによ
って試料中のリステリアを極めて特異的に検出すること
ができる。有利にはモノクローナル抗体を庚用し得、特
に前記グループ■、■！及び／又はＩＩＩに属するモノ
クローナル抗体を使用し得る。

より特定的には、種に応じて３０〜３４ｋＤ又は３４〜
３８ｋＤの分子量をもつ属特異的タンパク質抗原を規定
する前記１６種のリステリア特異的モノクローナル抗体
のうちの１つ又はそれ以上を使用し得る。

このリステリア検出には任意の適当なイムノアッセイフ
ォーマツＩ・を使用し得る。この目的で使用するのに極
めて適したフォーマットはいわゆるサンドイッチ型アッ
セイであり、標識としては酵素、放射性の原子もしくは
基、蛍光化合物、発色団、又は金属もしくは染料ゾル粒
子を使用すると極めて有利である。あるいは、いわゆる
阻害アッセイを使用することもできる。この場合は、試
料中のリステリア抗原が本発明のリステリア抗原と競合
して共通の抗体に結合しようとする。このフォーマット
では、本発明のリステリア抗原又をこれに対する抗体を
固相に結合させ、別の化合物を前述のごとき標識に結合
させる。更に別のアッセイ法として、試料中のリステリ
アを凝集又はａ２集−阻害により検出することもできる
。凝集アッセイではリステリア試料を抗体と接触させる
と、リステｌコ リア抗原及び抗体が集合し、最ｔ＆７沈降物が形成され
る。この集合物の沈降はラテックス、赤血球、染料ゾル
粒子、金属又は金属化合物ゾル粒子等のような粒子に結
合した抗体を使用することによって促進できる。一方、
本発明の′ａ集−阻害アッセイでは被検試料を、リステ
リア粒子結合抗原とこれに対する抗体との混合物に接触
させる。試料中にリステリアが存在しない時にはこの混
合物が集合し、最終的に沈降する。試料中に遊にリステ
リア抗原が存在すれば前記凝集は阻害される。

これらのアッセイ法のいずれにおいても、試料としては
食品又はその断片を使用し得る。この試料は、リステリ
ア抗原を遊離させるべく任意に前処理し得る。

本発明は、前述のアッセイを実施するためのテストキッ
ト、及びこのテストキットで使用される新規の構成要素
にも係わる。

本発明の新規のテストキット構成要素とは、前記抗原も
しくはそのフラグメント、又はこれに対する抗体であっ
て個体状支持体、標識又は粒子に結合したものである。

この場合の適当な個体状支持体は試験管、微量滴定プレ
ートの凹部、球体、ロッド、スティック、等である。

サンドイッチ型アッセイのテストキットは下記の必須構
成要素を含むのが適切であるコａ１個体状支持体に結合
した本発明の抗原又はこれに対する抗体、及び す、前記抗原に対する標識した抗体、 又は ａ、固体状支持体に結合した本発明の抗体、及びす１本
発明の標識した抗原。

凝集アッセイのテストキットは、粒子に結合した本発明
の抗体を含むのが最も適切である。

本発明の抗原は当業者に公知の生化学技術によってリス
テリア種から精製できる。特に適切な方法として、カラ
ムに結合した抗体（好ましくは、抗体９−５Ｅ、１０−
１２Ｃ及びｌｏ−２＾によって夫々代表されるようなグ
ループＩ、ＩＩ及びＩＩＩのモノクローナル抗体）によ
り抗原を捕捉し、次いで抗原−抗体結合の切断により前
記抗原をカラムから溶離するイムノソルベント・法と使
用するとよい。

Ｔｒｙｐｔｉｃ　Ｓｏｙ　Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）（ＢＢ
Ｌ）＋０．６％イースト抽出物（ＹＥ）　（［１１３Ｌ
）＋１．５％ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ（Ｄｉｒｃｏ）を含
む培地中４℃で、リステリア及び他の微生物の培養物（
表３参照）を寒天傾斜体上に又は穿刺培養物として保持
した。

衣−ニト 細菌培養物 １０ｍ１のＴＳＢ＋０．６％ＹＥを入れた管に寒天傾斜
培養物又は穿刺培養物より接種し、微生物を４日間２２
℃で増殖させた。次いでこれらの管を１００ＯＲＰＭ、
２５℃でＩＯ分間円遠心分離にかけた。上澄みを吸出し
、ベレットを１．Ｏ＋ｏｌの滅菌リン酸緩衝溶液（ＰＢ
Ｓ）中に再懸濁させた。この再懸濁ベレットを沸騰水浴
中で３０分間加熱し、使用するまで４℃で貯蔵した。

ダルベヅコの培地を改質した１０％のウシ胎児血清（Ｆ
ＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
Ｉｎｃ、、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ。

ＵＳＡ）を含むｌ５ｃｏｖｅ’　ｓの培地（Ｉｓｃｏｖ
ｅ’　ｓ）　（ＭｅｄｉａｔｅｃｈＩｎｃ　、　、　ｌ
１ｅｒｎｄｏｎ　、　Ｖ八、　ＵＳＡ）で、Ｐ３Ｘ６３
＾ｇ８．６５３７ウス骨髄腫細胞及びＬ９２９マウス繊
維芽細胞（＾ＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ、Ｕ
ＳＡ）を培養した。この培養物を、湿潤Ｃ０２インキユ
ベータ（Ｑｕｅｕｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、。

ＰａｒｋｅｒｓｂｕｒｇＪＶ、ＩＪＳ＾）内の７５ｎ＋
＋ｏ”培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｇｌａｓｓｗｏ
ｒｋｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）中で９３％空
気７７％ＣＯ２雰囲気下３７°Ｃに維持した。融合には
骨髄腫細胞を対数増殖期（細胞数＜５ｘＬＯ’個／ｍ１
）で使用した。ならし培地を調製すべ（Ｌ９２９細胞を
３〜４日間単層培養した。次いで培地を採取し、滅菌濾
過（０，２２ｕ）にかけ、凍結して（−２０℃）貯蔵し
た。

１１ＢＡＬＢ／ｅ（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ、Ｃａ
ｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ、、ＵＳＡ）又はＣＤ２Ｆ１
（ＣＢＡ　ｘ　ＢＡＬＢ／ｃ）マウスを８〜１２週令で
使用した。腹水を産生すべく、細胞注射の１０〜１４日
前に一次免疫注射として２，６，１０．１４−テトラメ
チルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）　（＾１ｄｅｒ
ｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、。

Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、旧、ＵＳＡ）をＣＤ２Ｆ１マウス
に注射した。

度兼」Ｕ覧 ＢＡＬＢ／ｃマウスに！、１ｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃ
ｙｔｏｇｅｎｅｓの熱抽出物（Ｌｌ、Ｄｒ、Ｒ，Ｆｌｏ
ｗｅｒｓ、５ｉｌｌｉｋｅｒ　Ｌａｂ、、Ｃｈｉｃａｇ
。

Ｈｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ、ＵＳＡ＞１００ｐｌを皮下注
射し、次いで４週間、１０週間及び１５週間目に二次免
疫注射として同じ抗原を腹腔内注射した。　ＥＬＩＳ＾
反応性による測定で最高の免疫反応性を示したマウスの
脛臓を最後の二次免疫注射の３日後に切除し、ハイブリ
ドーマ融合に使用した。

Ｋｏｈ　Ｉｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの方法［Ｇ、Ｋａ
ｈｌｅｒ及びＣ０Ｍ１ｌｓｔｅｉｎ（１９７５）　Ｎａ
ｔｕｒｅ　２５６：４９５］を改変した方法を用いて、
マウス骨髄腫細胞及び免疫脾臓細胞を５０％ポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ　１０００）（Ｋｏｄａｋ）中１
：５の割合で融合させた。融合した細胞を１００ｍ　ｌ
のｌ５ｃｏｖｅ’　ｓ＋２０％ＦＢＳ中に再懸濁させ、
９６穴微量滴定プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）１０枚に２
．２ｘ　１０５細胞／大の密度で分配した。２４時間後
にＨＡＴ選択培地［ヒボキサンチン（ＩＩ）、アミノプ
テリン（＾）及びチミジン（Ｔ）を含むｌ５ｃｏｖｅ’
　ｓ＋２０％ＦＢＳ］を加え、この培地を増殖が肉眼で
見えるようになるまで３〜４日毎に取り替えた。ＩＩＡ
Ｔ培地中で陽性増殖を示した培養物を、抗リステリアモ
ノクローナル抗体を得るべくスクリーニングにかけた。

このスクリーニング操作は、前記陽性培養物を２４穴培
養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に分配し、次いで５０％
のＬ９２９ならし培地と２０％のＦＢＳと１１八Ｔとを
含むｌ５ｃｏｖｅ’　ｓでの限界希釈により２回クロー
ニングし、細胞をアミノプテリンから分離することによ
って実施した。

反応性モノクローナル抗体を得るべ（、ｍ１ｃｒ。

Ｌｉｔｅｒプレートに結合した熱抽出リステリア抗原を
使用して、肉眼で見えるまで増殖したハイブリドーマ培
養物をＥＬＩＳ＾によりスクリーニングにかけた。その
ためには、Ｉｍｍｕｉｏｎ　２ポリスチレンプレート（
平底）（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
、　Ｉｎｃ。

＾１ｅｘａｎｄｒｉａ、　Ｖ＾、ＵＳＡ）をＰＢＳ中１
：１００に希釈したＬｌの熱抽出物で一晩（４℃）被覆
した（１００μｌ／穴）。これらのプレートを魚ゼラチ
ンを３％含むＰＢＳで６０分間（２２℃）ブロックし、
次いでハイブリドーマ上澄み（１００μｍ／穴）と共に
６０分間（３７℃）インキュベ−１・しな。これらのプ
レートを３回洗浄し、マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ＋Ｉｇ＾に
対するヤギのホースラデイツシュペルオキシダーゼ結合
ポリクローナル抗体（ＩＩｙＣｌｏｎｅＬａｂｏ−ｒａ
ｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳ
Ａ）０．１ｐｇ／ｍｌと共に６０分間インキュベートし
た。５回洗浄した後で、これらのグレートを３０分間（
２２℃）テトラメチルベンジジン基質溶液（１００，１
／穴）（ＯｒＨａｎｏｎ　ＴｅｋｎｉｋａＣｏｒｐ、　
、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ，ＵＳＡ）で展開処理し、色原体
反応を４Ｎ１１□Ｓｏ、　（１００μｍ／穴）で終了さ
せた。空気ブランク処理した°自動プレート読取機（Ｍ
ｏｄｅｌ　ＥＬ３０９゜［１ｉｏ−Ｔｅｋ　Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ、、８ｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＶＴ
、ＥＬＳ＾）を使用し、波長４５０ｎｍで光学密度（０
，Ｄ、）の値を測定した。０．２より大きい０、Ｄ、読
取り値を陽性とした。

ハイブリドーマの二゛スクリーニング ー次スクリーニングで陽性反応を示した培養物を前述の
ようにリステリア及び非リステリア熱抽出物パネルに対
して再検査した。このパネルはり、ｍｏｎｏｃｙｔｏｇ
ｅｎｅｓ、　Ｌ、１ｎｎｏｃｕａ＋５ｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓの種ゝ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種、Ｓａ！
ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｂｉ
ａ　ｃｏｌｉからなっていた。

スー１アモノクローナル　　の 二次スクリーニングで陽性だったモノクローナル抗体を
、同じＥＬｒＳ＾フォーマットを用いてリステリア熱抽
出物総合パネルに対し検査した。検査した微生物は、Ｌ
、ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの２６の異なる調製物、
Ｌ、１ｖａｎｏｖｉｉの２つの異なる調製物、並びにし
、１ｎｎｏｃｕａ、Ｌ、ｇｒａｙｉ＋　Ｌ、ｄｅｎｉｔ
ｒｉｆｉｃａｎｓ。

Ｌ、ｍｕｒｒａｙｉ及びり、ｓｅｅｌｉｇｅｒｉの１つ
の調製物を含む。

同じブロス中で増殖して交差反応の問題を生じ得るグラ
ム陽性微生物の総合パネルを、前述の方法に従いハイブ
リドーマ上澄みを用いてＥＬＩＳ＾で検査した。このパ
ネルはＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｖａｒｉａｎｓ。

５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｒｅｍｏｒｉｓ％Ｓ、
ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ、ｂｏｖｉｓ。

Ｓ、Ｌｈｅｒｎｏｐｈｉｌｕｓ＋Ｓ、ｆｅｃａｌｉｓ、
　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｅｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉ
ｓ＋Ｓ、ｌ＋ａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ％Ｓ、ａｕｒｅｕ
ｓ。

＾ｃＬｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｐｙｏｇｅｎｓｅｓ、　Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ。

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ及びＥｒｙｓ
ｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ　ｒｈｕｓｉ−ｏｐａｔｌ＋ｉａ
ｅからなっていた。

場合によってはＳ、ａｕｒｅｕｓ及びＬ　、Ｊｆｏｎｏ
ｃｙ　ｔｏｇｅｎｅｓの熱抽出物を先ず１２．ＯＯＯｘ
ｇ、２２℃で５分間遠心分＠　（Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ、
　Ｂｅｃｋ＋ａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）にかけて
、細菌細胞の破片を除去した。次いで、前述のごとく上
澄みを用いてプレートをコーティングしく１：１００）
、ハイブリドーマ上澄みと共にインキュベートシた。

ダラム陰性微生物熱抽出物パネルを、同じＥＬＩＳ＾フ
ォーマットを用いて検査した。このパネルはＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ＋Ｃ１Ｌｒｏ
ｂａｃｔｅｒ　　ｆｒｅｕｎｄｉｉ。

Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ＋Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｃｏｌｉ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ　ｔｙｐｈｉを含んでいた。

モノクローナル　　の　１　び ブリスタンを一次免疫注射したＣＤ２Ｆｌマウスに３．
０ｘ　１０’個の細胞を注射し、１０〜１４日後に液体
を採取することによって、ミリグラム量のモノクローナ
ル抗体を製造するためのハイブリドーマクローン腹水増
殖を行った。前述のごとき微量滴定プレートに結合した
り、ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ熱抽出物（Ｌｌ）を用
いてＥＬＩＳ八によりモノクローナル抗体の力価を測定
した。モノクローナル抗体をプロティンＡセファロース
クロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ　。

Ｉｎｃ、、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）でア
フィニティ精製にかけ、使用するまで一７０℃で貯蔵し
た。

モノ　ロー　ル　　の 市販の二重免疫拡散キット（ＩＣＮ　Ｉｍｓ＋ｕｎｏｂ
ｉ。

１ｏｇｉｃａｌｓ、　Ｌｉ５ｌｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用
いてモノクローナル抗体サブアイソタイプ分析を行った
。標的抗原は５ＤＳ−ＰＡ（：Ｅゲルからのり、ｍｏｎ
ｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ熱抽出物（Ｌｌ）のウェスタン法
によって同定された。タンパク質を不連続ＳＤＳ勾配ポ
リアクリルアミドゲル（５〜１５％）中で電気泳動させ
［Ｕ、に、Ｌａｅｏ＋ｎｌ　ｉ　、　（１９７０）　。

Ｎａｔｕｒｅ■７：６８０］、次いでエレクトロブロッ
ティングによりニトロセルロースに移行させた［ＩＩ。

Ｔｏｗｂｉｎ、　Ｔ、５Ｌａｅｂｅｌｉｎ及びＪ　、Ｇ
ｏｒｄｏｎ　、　（１９７０）　。

Ｐ、Ｎ、八、Ｓ、７６：４３５０］。これらのプロ・ン
トを、ノンファッ）・乾燥ミルク５％含有ＰＢＳ中で２
時間（３７℃）ブロックし、Ｉ’ＢＳ＋０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ’２０で洗浄し、次いで標識した。この標識操１
ヤでは、準備したプロットの１ｃｍストリップを個々の
ハイブリドーマクローン上澄みと共に撹拌しながら２時
間（３７℃）インキュベートし、次いで前述のごとく２
回洗浄し、更にマウス［ｇＧｒＩｇＨ（Ｈ＋Ｌ）に対す
るヤギのＩＩＲＰ結合抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａ
ｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉ
Ｌｈｅｒｓ−ｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）０．２ｈｇ／ｍ
ｌと共に３７℃で６０分間インキュベートした。２回洗
浄した後、これらのプロットをジアミノベンジジン（Ｓ
ｉｇ＋ａａ）０．０６％＋１１　□０□０．０３％含有
ＰＢＳで染色した（２２℃）。

幾つかのリステリア及び非リステリア微生物熱抽出物の
幾つかのパネルを前述のごとく分析ＳＤＳ勾配ＰＡＧＥ
及びウェスタン法分析にかけた。これらのパネルはり、
＋＊ｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（血清型１〜４）、Ｌ、
ｇｒａｙｉＳＬ、１ｖａｎｏｖｉｉ、　Ｌ、１ｎｎｏｃ
ｕａ＋Ｌ、ｄｅｎｉｔｒｉｒｉ−ｃａｎｓ、　Ｌ、ｓｅ
ｅｌｉｇｅｒｉ、　Ｌ、ｍｕｒｒａｙｉ＋Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、　５ｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、　ＬａｃＬｏｂａｃｉｌ
Ｉｕｓ　ｃａｓｅｉ％Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ　
ｒｌ＋ｕｓｉｏｐａｈｉａｅ。

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ＋Ｓ
ａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ及びＣ１ｔｒｏｂａｃ
ｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉで構成されていた。次いで選
択した精製モノクローナル抗体（’ｎｇ／＋ａｌ）を使
用してこのパネルを前述のごとく免疫染色（ｉｍｍｕｎ
ｏｓｔａｉｎ）　した。

の　　　　　　　　ム １０〜１５ｍ１の腹水をｐＨ９，０の結合バッファ（八
ｆｆ１−Ｇｅｌ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　八　ＭＡＰＳ　
　ＩＩ　　Ｉ）ｕｆｆｅｒｓ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　　Ｌａ
ｂｏ−ｒａＬｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈ＋ａｏｎｄ、　Ｃ
＾、ＵＳＡ）と１：２で混合し、３０…１のプロティン
Ａカラム（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ−ＣＬＩ’ｒｏｔ
ｅｉｎ　　Ａ　、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　　Ｆｉｎｅ　　
Ｃｂｅ＋ｎ１ｃａｌｓ、Ｐｉｓｃａｔａ−ｗａｙ、　Ｎ
Ｊ、　ＵＳＡ）に充填した。　ｐＨ３，ｏの溶離バッフ
ァ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて抗体を溶離した。タンパ
ク質を２８０ｎｎ＋でモニターし、両分を回収した。

場合によっては、Ｐ、に、Ｎａｋａｎｅ及び＾、Ｋａｗ
ａｏｉの方法［（１９７４）　Ｊ、１１ｉｓＬｏｃｈｅ
ｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｎ、２２：１０８４］を用いて、こ
れらの抗体を更にホースラディシュペルオキシダーゼと
結合させた。

一゛−ＪＥＬＩＳ＾・′ ０．０５Ｍ炭酸／重炭酸すトリウムバッファ（ｐＨ１９
，６）中にｌＯμｇ／ｌａ　Ｉで希釈したプロティンＡ
精製１０−１２Ｃ（グループＩＩ）（１００ｕｇ／穴）
でＩＩｕｌｏｎ　Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ’プレート（Ｄ
ｙｎａｔ’ｅｃｈ）を−晩被覆した。これらのプレート
をタンパク質バッファにより室温で３０分間ブロックし
た。ブロッキング溶液を吸出した後、１００μｍの熱抽
出物と１００．１のＨＲＰ結合１０−２＾（グループＩ
ＩＩ）（０，２５ｐｇ／ｍ　ｌ　）とを同時に加え（−
段Ｅ１．ｌ５Ａ）、３７℃で６０分間インキュベートし
た。インキュベート後にプレートを６回洗浄し、１００
ｕｌ／穴のテトラメチルベンジジン（ＫＰＬ）基質を加
えた。このプレートを室温で３０分間インキュベートし
、次いで１００μｍ／穴の２８１１２ｓＯ７を加えた。

空気ブランク処理した自動プレート読取り機（Ｂｉｏ−
Ｔｅｋ＞により４５０ｎｌで光学密度を測定した。陰性
対照として１００，１のＰ［ｌＳを使用した。

場合によっては前記方法を改変して、異なるモノクロー
ナル抗体又は２つもしくは３つの異なるグループのモノ
クローナル抗体の組合わせをプレート上で使用して抗原
を捕捉した。このような改変は、別のＨＲＰ結合モノク
ローナル抗体を個々に又は組合わせて使用することによ
りしばしば実施した。

結」し ハイブリドーマ　　　のスクリーニング検査した５１１
のハイブリドーマのうち３７がり、ｍｏｎｏｃｙｔｏＨ
ｅｎｅｓ（ＬＬ）熱抽出物に対して陽性ＥＬＩＳΔ反応
を示した。これら陽性ハイブリドーマを分配し、リステ
リア及び非リステリア熱抽出物小パネルに対し再検査し
てその特異性を調べた。これら３７のハイブリドーマモ
ノクローナル抗体のうち１６がリステリアに対する特異
性を示した。これら１６の抗体はいずれもり、ｍｏｎｏ
ｃｙｔｏｇｅｎｅＳ及びり、１ｎｎｏｃｕａの両方と反
応した。残りの２１のモノクローナル抗体は非リステリ
ア熱抽出物（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ＋Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ、　Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｌ＋ｉａ）に対して様々な反応プロフィルを示した
。これらモノクローナル抗体のうち１つ（１０−７Ｃ）
はリステリア及び５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの両方と
反応した。この抗体を更に検査する°ためにとっておい
た。

リステリア熱抽出物総合パネルを使用して前記１６の抗
リステリアモノクローナル抗体のＥＬＩＳΔテストを行
い、広範囲の反応性を調べた。Ｌ、ｍｏｎ。

ｃｙｔｏｇｅｎｅｓの血清型（１〜４）及びり、ｄｅｎ
ｉｔｒｉｒｉｃａｎｓ以外の総てのリステリア種の血清
型の総てが前記１６のモノクローナル抗体によって検出
された。

食品試料からの予め強化したブロスに共通して存在する
グラム陽性微生物の熱抽出物パネルを、前記１６の抗リ
ステリアモノクローナル抗体とのＥＬＩＳΔ交差反応に
関して検査した。これら１６の抗体はいずれも前記熱抽
出物と特異的に反応することはなかった。しかしながら
、関係の無い［ｇＧ２゜対照を含めてＩｇＧｚａモノク
ローナル抗体はＳ、ａｕｒｅｕｓ熱抽出物に対し陽性反
応を示した。この反応は、ＥＬＩＳ＾プレートコーティ
ングに使用する前に細胞壁物質を除去すべく熱抽出物を
遠心分離にかけると生じなくなった。リステリア熱抽出
物の前記遠心分離処理はモノクローナル抗体結合には影
響しなかった（表２）、また、これも興味深いことに、
１０１０−７Ｃ（Ｉ＋＞はＳ、ａｕｒｅｕｓを含めて総
ての被検グラム陽性微生物に結合した。Ｓ、ａｕｒｅｕ
ｓに対する１０−７Ｃの反応性は熱抽出物の事前遠心分
離処理によって消滅することはなかった。

ダラム陰性微生物熱抽出物パネルも前記１６の抗リステ
リアモノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳ八交差へ応検
査にかけた。これら抗リステリアモノクローナルは総て
前記微生物のいずれに対しても陽性反応を示さなかった
。

アイソタイプ　びウェスタンプロット クローン化したハイブリドーマの上澄みをアイソタイプ
分析にかけたところ、前記１６のクローン化ハイブリド
ーマは総てｔｇｃモノクローナル抗体を産生じていた。

そのうち１２はＩｇＧ、であり、４つはＩｇＧ２□であ
った。これら１６のハイブリドーマクローンの各々から
精製したモノクローナル抗体を使用してつ°ニスタンプ
ロットでＬｉ５ｔｅｒｉａ　Ｉｏｏｎ。

ｃｙＬｏｇｅｎｅｓ（Ｌｌ）熱抽出物を探査した。これ
ら１６のリステリア特異性モノクローナル抗体は還元条
件及び非還元条件の両方で３０〜３８ｋＤの分子量をも
つタンパク質抗原を認識した。また、１ｇＧ２．モノク
ローナル抗体（グループｌ１１）と一部のＩｇＧ、モノ
クローナル抗体（グルー７１１）は、より小さい分子量
バンドを認識した（第１図）。

抗原の分布及び大きさを更に分析すべく、リステリア及
び非リステリア熱抽出物を電気泳動にかけ、染色しくｂ
ｌｏｔｔｅｃｌ）且つ選択抗リステリアモノクローナル
抗体で探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。これらのモノクロー
ナル抗体で認識される抗原を含んでいたのはリステリア
熱抽出物だけであった（第２図）。

興味深いことに、Ｌ、ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの種
々の血清型の間では主要抗体の分子量に変化が少し観察
された（３０〜３８ｋＤ）　（第３図）、また、これも
興味深いことであるが、Ｌ、ｇｒａｙｉ及びり、ｍｕｒ
ｒａｙｉ抗原はいずれのり、ｍｏｎｏｃｙＬｏｇｅｎｅ
ｓ抗原よりも約５ｋＤ大きいことが判明した。　ＥＬＩ
Ｓへの結果を裏付けるように、Ｌ、ｄｅｎｉｔｒｉｆ　
１ｃａｎｓは抗リステリアモノクローナル抗体によって
認識される抗原を含んでいなかった（第２図及び第３図
）。また、この抗原を含む非リステリア熱抽出物は１つ
もなかったく第２図）。これらの結果は、検査した抗リ
ステリアモノクローナル抗体の種類に拘わりなく一貫し
ていたが、他とは異なるＥＬＩＳ八反応へプロフィルを
示すｔｏ−７Ｃはウェスタンプロットでいずれのリステ
リアポリペプチド抗原とも反応しなかった（第１図）。

３０〜３４ｋＤ及び３４〜３８ｋＤの主要抗原は分子量
サイズが種部に再現性をもってやや異なり、必ず３つの
エピトープを含んでいる。この抗原に対して免疫特異性
を有することが判明した各モノクローナル抗体は前記３
つのエピトープの１つと反応する。

これら３つのエピトープのうち２つは１７ｋＤから主要
抗原の分子量サイズまでの範囲の分子量サイズをもつ抗
原に°も存在する。

ＥＬＩＳへの典型的結果を表４に示す。

ｌ−先 −段捕捉型ＥＬＩＳへの結果 グループＩＩの１つの抗体（１０−１２ｃ）をプレート
上で捕捉体（ｃａｐｔｕｒｅ）として使用し且つグルー
プＩＩＩの別の抗体（１０−２＾）をＩＩＲＰ標識して
結合体（ｃｏｎｊｕｇａＬｅ）として使用すると、総て
の被検リステリアの熱抽出物がこのアッセイにより陽性
として容易に同定され、且つ総ての被検非リステリアの
熱抽出物が陰性として容易に同定される。リステリア熱
抽出物は通常２〜４　ｌｏｇ　１０希釈度に希釈し得、
陽性を維持する。

Ｆ６１／９−５Ｅ（９−５Ｅ）、ＦＢＩ／１０−１２Ｃ
（１０−１２Ｃ）及びＦ６／１０−２＾（１０４＾）は
１９８７年８月７日に夫々番号８８９４９３、）ＩＢ　
９４９４及びＨＢ　９４９２で米国Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
のＡＴＣＣに寄託した。

【図面の簡単な説明】

第１図はＬｉ５ｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅ
ｓからの熱抽出タンパク質に対する本発明のモノクロー
ナル抗体の反応性をウェスタン法のプロフィルで示す説
明図であり、右端の欄は熱抽出物全体のプロフィル、１
番目から１５番目の欄は前記熱抽出物に対する種々の抗
体の免疫反応性を示す。第２図は種々のリステリア種及
び他の細菌の熱抽出物に対するモノクローナル抗体ｔｏ
−１ｚｃの免疫反応性を示す説明図、第３図は種々のリ
ステリア種に対するモノクローナル抗体１０−１２Ｃの
免疫反応性を示す説明図、第４図は主要抗原上の異なる
エピトープを認識する前記モノクローナル抗体のうちの
３つが下記の番号１〜７のリステリア種に対して示す免
疫反応性を示す説明図である： １、　Ｌｉ５ｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙＬｏｇｅｎｅｓ
（タイプ１）２、　Ｌｉ５ｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔ
ｏＨｅｎｅｓ（タイプ２）３、　Ｌｉ５ｔｅｒｉａ　ｍ
ｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（タイプ４ａ）ＦＩＧ、　２

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｌ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ以外のリステリ
   ア種に特有の、９−５Ｅ、１０−１２Ｃ及び１０−２Ａ
   の中から選択した少なくとも１つのモノクローナル抗体
   と反応する抗原。
2. （２）リステリア熱抽出物中に存在する分子量約３０〜
   約３８ｋＤのタンパク質を含む抗原であって、免疫原的
   に異なる３つのエピトープを含み、前記リステリア熱抽
   出物で免疫したマウスの脾臓細胞によって産生した抗体
   が前記エピトープと特異的に反応し、この抗原がＬ．ｄ
   ｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ以外の総てのリステリアの種
   の熱抽出物中に存在する、請求項１に記載の抗原。
3. （３）グループ I のＩｇＧ＿１抗体が第１エピトープ
   と反応し、グループIIのＩｇＧ＿１抗体が第２エピトー
   プと反応し、グループIIIのＩｇＧ＿２＿ａ抗体が第３
   エピトープと反応する請求項２に記載のリステリア抗原
   。
4. （４）リステリア熱抽出物中に存在し主要抗原よりは小
   さいが少なくとも１７ｋＤはある分子量をもつタンパク
   質を含むリステリア抗原であつて、請求項１に記載の抗
   原のエピトープにも免疫反応性を示すモノクローナル抗
   体と免疫反応するエピトープを含むリステリア抗原。
5. （５）請求項１に記載のリステリア抗原と免疫反応する
   抗体。
6. （６）９−５Ｅ、１０−１２Ｃ及び１０−２Ａの中から
   選択したモノクローナル抗体のエピトープ特異性を特徴
   とする請求項１に記載の抗原に対するモノクローナル抗
   体。
7. （７）動物をリステリア熱抽出物で免疫し、この動物か
   らの抗体産生細胞に無限増殖性を付与し、抗体を産生さ
   せるべくこの無限増殖性を付与した細胞を培養し、且つ
   前記抗原と免疫反応する抗体を産生する無限増殖性を付
   与した細胞を選択することによって産生される請求項６
   に記載のモノクローナル抗体。
8. （８）試料中のリステリアを検出するためのイムノアッ
   セイ法であって、試料を請求項１に記載の抗原と免疫反
   応する少なくとも１つの抗体と共にインキュベートする
   ことを特徴とするイムノアッセイ法。
9. （９）請求項１に記載の抗原と免疫反応する少なくとも
   １つの抗体を含むリステリア検出用イムノアッセイテス
   トキット。
10. （１０）請求項１に記載の抗原を含むか又は固体状支持
    体、標識もしくは粒子に結合した前記抗原と免疫反応す
    る抗体を含む免疫試薬。