DK174414B1 - Slægtspecifikt Listeria-antigen, monoklonalt antistof mod antigenet, immunoanalysefremgangsmåde og immunoanalyseforsøgssæt til påvisning af Listeria samt immunreagens omfattende antigenet eller antistoffet - Google Patents

Description

DK 174414 B1

Opfindelsen angår et Listeria-specifikt antigen, antistoffer over for disse, monoklonale antistoffer produceret fra specifikke hybridomcellelinier, en immunanalysefremgangs-måde til påvisning af Listeria i en prøve og immunanalyseforsøgssæt og komponenter deraf til brug i et immunreagens ved en sådan immunanalysefremgangsmåde.

^ Listeria monocytogenes har fået stigende opmærksomhed som et humant patogen. Der er blevet rapporteret om adskillige dokumenterede udbrud af listeriosis i U.S.A., hvor der er blevet i dent i fi ceret Lister ia-forurenede fødevarer som infektionskilden. I 1981 var der et større udbrud forbundet med kål, i 1983 med mælk og i 1985 var der flere end 100 tilfælde, der tilskrives forurenet ost.

10 U.S. FDA har angivet, at der er en tolerance på nul for Listeria i fødevarer. Der har været adskillige nylige tilbagekaldelser fra U.S. FDA af produkter indeholdende Listeria, generelt bestående af mejeriprodukter, især ost og is, hvoraf nogle var importerede. Der har også været talrige fødevarepro-15 dukter, der er blevet tilbagekaldt af virksomheder.

Skønt der helt klart er et behov for en pålidelig fremgangsmåde til identifikation af Listeria-forurenede fødevareproduk-ter, er der for tiden ingen nem og universelt accepteret fremgangsmåde til dyrkning eller bekræftelse af Listeria. The As-20 sociation of Official Analytic Chemists (AOAC), den organisation, som godkender analysemetoder til fødevareindustrien, skal endnu godkende enhver fremgangsmåde til dyrkning af Listeria fra fødevareprodukter. Den af FDA foreslåede metode kræver langvarig, kold berigelsesdyrkning før afprøvning. Andre fremgangsmåder kræver omstændelig instrumentering til 2^ dataanalyse.

Listeria er en grampositiv, ikke-sporedannende, bevægelig stav, som har evnen til at vokse over et bredt temperaturområde (4eC til 45eC). Den er blevet rapporteret til at være antigent beslægtet med andre grampositive organismer, såsom Staphylococcus aureus og Streptococcus fecalis. Derfor kræver en immundiagnostisk metode til Listeria-identifikation meget spe- 2 DK 174414 B1 cifikke antistoffer og/eller et antigen, som er meget specifikt for denne organisme. Der er blevet fremstillet og karakteriseret en serie monoklone museantistoffer, der identificerer et slægtspecifikt L i ster i a-ant i gen , som begge med held 5 kan anvendes til udvikling af en diagnostisk analyse for Listeria.

Der er blevet produceret monoklone museantistoffer, som reagerer med Listeria-varmeekstrakter fra alle Listeria-arter 10 bortset fra L. den itrifi cans. Disse monoklone antistoffer er alle reaktive med et bestemt protein, som har et molekylvægtsområde på fra cirka 30 til cirka 38 kD, målt under både reducerende og ikke-reducerende betingelser. Dette antigen blev identificeret i alle arter med en ringe molekylstørrelsesva-15 riation mellem arterne. Dette antigen er karakteriseret ved at have mindst tre immunogene epitoper. De dannede antistoffer var således spec i fikt reaktive med enhver af de tre epitoper. Antigener med lavere molekylvægt blev identificeret, som havde et molekylvægtsområde på fra cirka 17 kD til cirka 30 kD, og 20 som karakteriseres ved at indeholde en epitop, som har samme immunreaktivitet som én af de tre epitoper i 30-38 kD-protei-net.

Figur 1 er en Western-aftryksprofi 1 af reaktivitet med varme-25 ekstraktproteiner fra Listeria monocytogenes. Søjlen længst til højre illustrerer profilen for hele varmeekstrakten. Søjlerne 1 til 15 illustrerer immunreaktiviteterne for de angivne antistoffer med varmeekstrakten.

30 Figur 2 illustrerer immunreaktiviteten af monoklont antistof 10-12C med varmeekstrakter af den angivne Listeria-art og andre bakterier.

Figur 3 illustrerer immunreaktiviteten af det monoklone anti-35 stof 10-12C med den angivne Listeria-art.

Figur 4 illustrerer immunreaktiviteten af 3 af de monoklone antistoffer, der genkender bestemte epitoper på hovedantigenet, idet Li ster i a-arten er angivet med numrene 1-7-.

3 DK 174414 B1 1. Listeria monocytogenes (type 1); 2. Listeria monocytogenes (type 2); 3* Listeria monocytogenes (type 4a); 4. Listeria monocytogenes (type 4c); 5 S. Listeria monocytogenes (type 4d); 6. Listeria monocytogenes (type 4e); 7. Listeria grayi (type 5).

Den for tiden af U.S. FDA godkendte påvisningsmetode for Li-10 steria i mange fødevareprodukter kræver kulde-berigelsesdyrkning i mindst syv dage før afprøvning. Dette er arbejds- og tidsforbrugende og forsinker frigivelsen af det færdige produkt. For tiden er dec ikke nogen hurtig og præcis test for Listeria tilgængelig, såsom én, hvori der anvendes monoklone 15 antistoffer.

Mod målet, udvikling af en hurtig immunanalyse til Listeria-påvisning, er der blevet udviklet og karakteriseret monoklone antistoffer, som viser specificitet over for Listeria. Disse 20 monoklone antistoffer er blevet omfattende afprøvet ved en2ym- bundne immunsorbentanalyser (ELISA) for reaktivitet i et bredt område med et panel af Listeria-serotyper (1-5). Der er blevet identificeret seksten monoklone antistoffer (tabel 1), som reagerer med varmeekstrakter fra alle Listeria-arter, herunder 25 L. monocytogenes (serotyperne 1-4), L. Grayi (serotype 5), L. ivanovii, L. murrayi, L. seeligeri og L. innocua, med én undtagelse, nemlig L. denitrificans. L. denitrificans, som blev opnået fra ATCC, er blevet rapporteret som værende "uoverensstemmende med beskrivelsen af slægten Listeria” [ATCC Catalo-30 gue of Bacteria, Phages, and rONA Vectors, 16. udgave, 1985, side 96]. Ikke-reakti vi teten af de monoklone antistoffer mod Listeria med denne varmeekstrakt kan derfor skyldes, at L. de-nitrificans ukorrekt er klassificeret i slægten Listeria.

35

Tabel 1 4 DK 174414 B1

Screening af ELISA-reakt i vitet hos monoklone antistoffer 5 Hybridombetegnelse Monoklont antistof-isotype 2 -1C IgGj 2- 3H IgG^ 3- 1D IgG! 10 7-5H IgG j 7-6H IgGj 7- 8H Ig62a.

8- 7 A igG 2 a 8-8A igG^ 15 8-6D IgG2a 8-9D IgGj 8- 4H IgGi 9- 5E 196¾ 10-2A IgG2a 20 10-11A IgGj 10-7C IgGj 10-12C IgGj

Specificiteten for Listeria ved hjælp af ELISA blev bekræftet 25 ved afprøvning af de monoklone antistoffer mod et omfattende panel af relevante grampositive og gramnegative organismer, hvoraf mange ofte vokser ud af præberigede medier ved dyrkning for Listeria. Da ingen af de 16 monoklone antistoffer reagerede signifikant med nogen af ikke-Listeria-varmeekstrakterne, 30 kan det konkluderes, at de genkender et slægtspecifikt Listeri a-ant i gen.

Af de monoklone antistoffer, som. er specifikke for Listeria, viste det sig, at de monoklone IgG2a’'ant 1 stoffer også viser 35 reaktivitet med S. aureus (tabel 2). Dette viste sig imidlertid at skyldes tilstedeværelsen af cellevægsmateriale i varme-ekstrakten, der bandt antistofferne.

Tabel 2 5 DK 174414 B1

Protein A, ikke-specifik binding 5 Hybridom Listeria Listeria Staphylococ- Staphylococ- monocyto- monocyto- cus aureus cus aureus genes genes suspenderet centrifugeret suspenderet centrifugeret 10 2- 1C + 2 +2 - 2-3H +3 +3 3 - ID + 3 +3 - 7-5H +2.+2 7- 6H +2 +2 - 15 7-8H +4 +4+2 8- 7A +4 +4 +2 8-8A +2 +2 8-6D +4 +4 +3 8- 9D +3 +3 20 8-4H +2 +2 - 9- 5E +3 +3 10-2A +3 +3 +3 10-11A +2 +2 - 10-7C +2 +2 +4 +3 25 10-12C +3 +3 -

IgGj kontrol - -

IgG2a kontrol +2 Nøgles - = < 0,2 30 +1 = 0,2 til 0,5 +2 = 0,5 til 1,0 +3 = 1,0 til 2,0 +4 = > 2,0 35 Da dette blev fjernet ved centrifugering, blev det konkluderet, at bindingen af de monoklone lgG2a“anti stoffer til S. aureus formidledes af protein-A i cellevæggen, som vides at binde IgG2a gennem deres Fc-del [J. Goding (1987), J. Immunol.

6 DK 174414 B1

Meth. 20-.241]. Konklusionen blev understøttet af den kendsgerning, at ingen af de Listeria-specifikke monoklone IgGi-an-tistoffer, der generelt binder protein-A med mindre affinitet end IgG2a [Goding, (1987)], gav en positiv reaktion med S. au-5 reus. Der blev også identificeret et monoklont antistof, 10-7C, som så ud til at genkende alle grampositive organismer. 10-7C fortsatte med at reagere med både Listeria- og S. aure-us-varmeekstrakter på trods af centri fuger i ng.

10 Der er blevet karakteriseret antigener, med hvilke de foreliggende Listeria-specifikke monoklone antistoffer reagerede ved Western-aftryksanalyse. Alle 16 Listeria-specifikke monoklone antistoffer genkendte et protein i molekylvægtsområdet fra 30 til 38 kD under både reducerende og ikke-reducerende be-15 tingelser. De monoklone IgG2a“antisf°ffer °9 nogle af de monoklone IgGi-antistoffer bandt også antigener med lavere molekylvægt, som varierede i størrelse fra cirka 17 kD til størrelsen af hovedantigenet. Hovedantigenet blev fundet i to molekylvægtsområder, afhængigt af den afprøvede Listeriaart. I 20 L. monocytogenes (serotyperne 1-4), L. ivanovii, L. seeligeri og L. innocua er dette antigen cirka 30 til 34 kD. I L. grayi og L. murrayi er det cirka 34 til 38 kD.

Der ser ud til at være mindst tre grupper Listeriaspeci-25 fikke monoklone antistoffer baseret på under isotypeanalyse- og ELISA- og Western-aftryksresu1 tater. Én gruppe (gruppe I) består af monoklone IgGi-antistoffer, der generelt fremkaldte mindre ELISA-signaler og kun så ud til at reagere med det slægtsspecifikke antigen i området 30 til 38 kD (se figur 1, 30 for eksempel monoklont antistof 9-5E). Den anden gruppe (gruppe II) består af monoklone IgGj-antistoffer, som generelt fremkaldte middelstore ELISA-signaler og primært blev bundet til 30-38 kD antigenet, men også. genkendte 2 til 4 antigener med lavere molekylvægt (se figur 1, for eksempel monoklont an-35 tistof 10-12C). Den tredje gruppe (gruppe III) består af monoklone IgG2a_anti stoffer, der generelt fremkaldte større ELISA-aflæsninger og primært blev bundet til 30-38 kD-antigenet, men som også genkendte mindst 4 antigener med lavere molekyl- 7 DK 174414 B1 vægt (se figur 1, for eksempel monoklont antistof 10-2A). Eksistensen af mindst tre epitopspecifi c iteter blev yderligere understøttet af den vellykkede anvendelse af flere af disse monoklone antistoffer i en 2-stedssandwich-ELISA, som viste 5 den identiske specificitet som beskrevet her for de individuelle monoklone antistoffer. Desuden blev det grampositivspeci-fikke monoklone antistof, 10-7C, karakteriseret som klart bindende til et andet antigen end de Listeriaspecifikke, monoklone antistoffer, baseret på både ELISA- og Western-aftryks-10 resultater.

Ifølge den foreliggende opfindelse kan Listeria påvises med høj specificitet i en prøve ved anvendelse af antistoffer, som er rettet mod det ovennævnte antigen. Der kan fordelagtigt an-15 vendes monoklone antistoffer, og der kan i sær anvendes mono-klone antistoffer hørende til de ovenfor angivne grupper I, II og/eller III.

Nærmere bestemt kan der anvendes ét eller flere af de 16 Li-20 steriaspecifikke, monoklone antistoffer, som definerer et slægtsspecifkt proteinantigen i området 30 til 34 kD eller 34 til 38 kD, afhængigt af arten.

Til denne Listeria-påvisning kan anvendes ethvert egnet format 25 for immunanalyser. Et meget egnet format til dette formål er den såkaldte' sandwichanalyse, mest bekvemt under anvendelse af enzymer, radioaktive atomer eller grupper, fluorescerende forbindelser, kromoforer, eller metal- eller farvesolpartikler som mærker. Alternativt kan der anvendes en såkaldt inhibe-30 ringsanalyse, hvori Listeriaantigenet i prøven konkurrerer med Listeriaantigenet ifølge opfindelsen om binding til et fælles antistof. I dette format bindes enten Listeriaantigenet ifølge opfindelsen eller antistoffet der imod til en fast fase, og den anden forbindelse bindes til et mærke som tidligere be-35 skrevet. I endnu en anden alternativ analysemetode påvises Listeria i prøven ved agglutinering eller agglutineringsinhi-bering. Ved agglutinering bringes Listeriaprøven i kontakt med antistoffer, hvorefter der sker aggregering af Listeriaanti- 8 DK 174414 B1 gener og antistoffer, som til slut resulterer i dannelsen af et sediment. Sedimentation af aggregatet kan forøges ved anvendelse af antistoffer, som er bundet til partikler såsom la~ tices, erythrocytter, solpartikler af farvestoffer, metaller 5 eller metalforbindelser etc. På den anden side bringes i ag-glutineringsinhiberingsanalyser ifølge opfindelsen prøven, der skal undersøges, i kontakt med en blanding af Listeriaparti-kelbundet antigen og antistoffer der imod, hvilken blanding aggregerer og til slut sedimenterer i fravær af Listeria i 10 prøven. Denne agglutinering vil blive inhiberet i nærværelse af frie Listeria-antigener i prøven.

I enhver af disse ovenfor beskrevne analysemetoder kan der som en prøve anvendes et fødevareprodukt eller en fraktion deraf, 15 der eventuelt kan være forbehandlet for at frigøre Listeria-ant i generne.

Forsøgssæt til udførelse af de ovenfor beskrevne analyser samt hidtil ukendte komponenter til brug i et sådant forsøgssæt 20 hører også til den foreliggende opfindelse.

Hidtil ukendte forsøgsætkomponenter ifølge opfindelsen er de ovenfor nævnte antigener eller fragmenter deraf eller antistoffer der imod bundet til en fast bærer, til et mærke eller 25 til en partikel. Egnede faste bærere i denne forbindelse er prøverør, brønde i mi krot i trer ingsplader, kugler, stave, stænger etc.

Hensigtsmæssigt kan forsøgssæt til sandwichanalyser omfatte 30 som essentielle komponenter: a. fast bærer-bundet antigen ifølge opfindelsen eller antistof der imod, og 35 b. mærket antistof mod antigenet, eller: 9 DK 174414 B1 a. fast bærer-bundet antistof ifølge opfindelsen, og b. mærket antigen ifølge opfindelsen.

5 Forsøgssæt til agglutineringsanalyser omfatter mest hensigtsmæssigt antistoffer ifølge opfindelsen bundet til partikler.

Antigenet ifølge opfindelsen kan oprenses fra Lister i aarten ved biokemiske teknikker, der er kendte inden for fagområdet.

10 Der kan især anvendes immunsorbent tekni kker, hvor antigenet indfanges af søjlebundne antistoffer (fortrinsvis monoklone antistoffer af grupperne I, II og III eksemplificeret ved henholdsvis antistofferne .9-5E, 10-12C og 10-2A) og derefter elu-eres fra søjlen ved brydning af antigen-anti stof-bi ndi ngen.

15

Eksempler

Bakteriekulturer 20 Kulturer (se tabel 3) af Listeria og andre organismer blev bibeholdt på agarskråku1 turer eller som stikkulturer ved 4eC på medier indeholdende Tryptic Soy Broth (TSB) (BBL) + 0,6¾ gærekstrakt (YE) (BBL) + 1,5% bacto-agar (Difco).

25 1 35

Tabel 3 10 DK 174414 B1

Bakteriekulturer 5

Benævnelse Organisme Type Stamme LI Listeria monocvtogenes — — L5 L. innocua — — L8 L. monocytogenes la V-7 SB1 L. ivanovii 5 KC1714 10 SB2 L. ivanovii — ATCC 19919 SB3 L. monocytogenes 3b SE35 SB4 L. monocytogenes 3a KC 1708 SB5 L. monocytogenes la V-7 SB6 L. monocytogenes — F3406 SB7 L. monocytogenes 4b F9061 SB8 L. monocytogenes l/2a F9014 15 20 25 1 35 ii DK 174414 B1

Benævnelse ~| Organisme Type Stamme SB9 L. monocytogenes 3b SE31 SB10 L. monocytogenes lb Brie 1 SB11 L. monocytogenes 4b KC1710 SB12 L. monocytogenes l/2a F9190 SB13 L. monocytogenes — F2379 SB14 L. monocytogenes 4b F9089 SB15 L. monocytogenes l/2b F8964 SB16 L. monocvtoaenes la Brie 18 SB17 L. monocytogenes 3 ATCC 19113 SB18 L. monocytogenes 3a F8828

SB19 L. monocvtoaenes 4b Scott A

SB20 L. monocytogenes 3b F9035 SB21 L. monocvtooenes l/2b F9069 SB22 L. innocua -— ATCC 33091

Al L. denitrificans — ATCC 14870 A2 L. gravi — ATCC 25400 A3 L. monocytogenes 1 ATCC 19111 A4 L. monocytogenes 2 ATCC 19112 A5 L. monocytogenes 4a ATCC 19114 A6 L. monocytogenes 4c ATCC 19116 A7 L. monocytogenes 4d ATCC 19117 A8 L. monocytogenes 4e ATCC 19118 A9 L. denitrificans — ATCC 14870 A10 L. gravi 5 ATCC 25400

All L. murravi — ATCC 25401 A12 L. seeliaeri — ATCC 25967 L6 Streptococcus sp — — A13 S. cremoris — ATCC 19257 A14 S. bovis — ATCC 27960 A15 s. pyogenes — ATCC 19615 A16 S. thermophilus — ATCC 14485 A17 S. fecalis — ATCC 828 L7 Pseudomonas fluorescens — — A18 P. fluorescens — ATCC 949 A19 Micrococcus varians — ATCC 15306 A20 Staphylococcus aureus — ATCC 12598 A21 S. epidermidis — ATCC 155 A22 S. haemolvticus — ATCC 29970 A23 Enterbacter aerooenes — ATCC 13048 A24 Escherichia coli — ATCC 4157 A25 Lactobacillus casei — ATCC 393 A26 Actinomyces pyogenes — ATCC 8104 A27 Ervsipelothrix rhusiopathiae — ATCC 15306 J1 Staphylococcus aureus — ATCC 12598 12 DK 174414 B1

Fremstilling af bakterievarmeekstrakter

Rør med 10 ml TSB + 0,6% YE blev podet fra agarskråku 1 turer eller stik, og organismerne fik lov til at vokse i 4 dage ved 5 22°C. Rørene blev derefter centrifugeret ved 1000 o/m ved 25eC

i 10 minutter. Supernatanterne blev aspireret og pellet gensuspenderet i 1,0 ml steril, phosphatpufret saltopløsning (PBS). De gensuspenderede pellets blev opvarmet i kogende vandbad i 30 minutter og lagret ved 4eC indtil brug.

10

Dyrkede celler P3X63Ag8.653 musemyelomceller og 1929-musefibroblaster (ATCC, Rockville, HD, USA) blev· dyrket i Iscove's modificerede 15 Dulbecco's medium (Iscove’s), (Mediatech Inc., Herndon, VA, USA) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), (HyClone Laboratories, Inc., Logan, UT, USA). Kulturerne blev bibeholdt i 75 mm2 dyrkningskolber (Corning Glassworks, Corning, NY, USA) i en fugtet CO2-inkubator (Queue Systems, Inc., Parkersburg, 20 WV, USA) ved 37eC i en atmosfære med 93% luft/7% CO2. Til fusioner anvendtes myelomceller i log-vækstfase (< 5xl05 celler/ml). Til fremstilling af konditioneret medium blev L929-eeller dyrket som et monolag i 3 til 4 dage. Mediet blev derefter høstet, steri 1fi 1 treret (0,22 μ) og lagret frosset 25 (-20°C).

D*r BALB/c-hunmus (Charles River, Cambridge, Mass., USA) eller 30 CD2Fl-hunmus (CBA x BALB/c) anvendtes i en alder på 8 til 12 uger. Til ascitesproduktion blev CD2Fl-mus primerbehandlet med 2,6,10,14-tetramethylpentadecan (Pristane), (Alderich Chemical Co., Milwaukee, MI, USA) i 10 til 14 dage før celleinjektion.

35 Immuniseringer BALB/c-mus fik administreret 100 μΐ af en varmeekstrakt fra Listeria monocytogenes (LI, Dr. R. Flowers, Silliker Lab., 13 DK 174414 B1

Chicago Heigths, IL, USA) ved subkutan injektion og blev derefter boosterbehandl et ved intraperitoneal injektion med det samme antigen i ugerne 4, 10 og 15. Milten fra den bedste im-munreaktionsgivende mus som bestemt ved ELISA-reaktivitet blev 5 fjernet 3 dage efter den sidste boosterbehandling og anvendt til en hybridomfusion.

Cellefusion 10 Musemyelomceller og immune splenocytter blev sammensluttet i 50% polyethylenglycol (PEG 1000) (Kodak) i et forhold på 1:5 under anvendelse af en modifikation af teknikken beskrevet af Kohier og Milstein [Gi Kohier og C. Milstein (1975) Nature 256:4953. Sammensluttede celler blev gensuspenderet i 100 ml 15 Iscove's +20% FBS og fordelt i ti 96-brøndes mikrotitrerings-dyrkningsplader (Corning) i en densitet på 2,2 x 105 celler/brønd, Efter 24 timers forløb tilsattes HAT-selektivt medium [Iscove's +20% FBS indeholdende hypoxanthin (H), ami-nopterin (A) og thymidin (T)], og mediet blev skiftet hver 3.

20 til 4. dag, indtil makroskopisk vakst var synlig. Kulturer, som viste positiv vækst i HAT, blev screenet for monoklone antistoffer mod Listeria som beskrevet nedenfor. Positive kulturer blev udstrakt til dyrkningsplader med 24 brønde (Corning) og derefter klonet to gange ved begrænsning af fortyn-25 ding i Iscove's indeholdende 50% L929-konditioneret medium, 20% FBS og HT, idet cellerne blev vænnet fra aminopterin.

ELISA-screeninq af hybridomer 30 Primær screening

Hybri domkul turer, som viste makroskopisk vækst, blev screenet for reaktive, monoklone antistoffer ved hjælp af ELISA under anvendelse af varmeekstraherede Listeria-antigener bundet til 35 mikrotiterplader. Til dette formål blev Immulon 2-polystyren-plader (flad bund), (Dynatech Laboratories, Inc. Alexandria, VA, USA) belagt natten over (4®C) med en varmeekstrakt af LI fortyndet 1:100 i PBS (100 μΐ/brønd). Pladerne blev blokeret 14 DK 174414 B1 med PBS indeholdende 3% fiskegelatine i 60 minutter (22 eC) og derefter inkuberet med hybridomsupernatanter (100 μΐ/brønd) i 60 minutter (37eC). Efter 3 ganges vask blev pladerne inkuberet i 60 minutter (37°C) med 0,1 pg/ml peberrodsperoxidasekon-5 jugerede, polyklone gedeanti stoffer over for muse-IgG + IgM + IgA (HyClone Laboratories, Inc., Logan, UT, USA). Efter fem ganges vask blev pladerne fremkaldt i 30 minutter (22eC) med tetrame-thylbenzidinsubstratopløsning (100 μΐ/brønd), (Organon Teknika Corp., Durham, NC, USA), og den kromogene reaktion blev af-10 sluttet med 4 N H2SO4 (100 μΊ/brønd). Optiske densitetsværdier (00) blev bestemt ved en bølgelængde på 4S0 nm under anvendelse af en automatiseret pladeaflæser (model EL309, BioTek Instruments, Inc., Burlington, VT, USA) med luft som blindværdi. Et positivt resultat blev fortolket til at være en 00-15 aflæsning på mere end 0,2.

Anden screening af hvbridotner

Kulturer, som viste positiv reaktivitet i den primære scree-20 ning, blev afprøvet igen mod et panel af Listeria- og ikke-Listeriavarmeekstrakter som beskrevet ovenfor. Panelet bestod af L. monocytogenes, L. innocua, Streptococcus-art, Pseudo-monas-art, Salmonella typhi og Escherichia coli.

25 Specificitetsafprøvninq af monoklone antistoffer mod Listeria

Positive monoklone antistoffer fra den anden screening blev afprøvet mod et omfattende panel af Listeria-varmeekstrakter under anvendelse af det samme ELISA-format. De afprøvede orga-30 nismer omfattede 26 forskellige præparater af L. monocytogenes, 2 af L. ivanovii og 1 af hver af L. innocua, L. grayi, L. denitrificans, L. murrayi og L. seeligeri.

Et omfattende panel af grampositi.ve organismer, der kan vokse 35 i den samme suppe og forårsage bekymring om krydsreaktivitet, blev afprøvet ved hjælp af ELISA under anvendelse af hybridom-supernatanter ved at følge den ovenfor beskrevne procedure. Dette panel bestod af Micrococcus varians, Streptococcus cre- 15 DK 174414 B1

Boris, S. pyogenes, S. bovis, S. thermophi 1us, S. fecalis, Staphylococcus erpidermis, S. haemolyticus, S. aureus, Actinomyces pyogenses, Bacillus cereus, Lactobacillus casei og Ery-sipelothrix rhusiopatiae.

5 I nogle tilfælde blev varmeekstrakter af S. aureus og L. monocytogenes først centrifugeret ved 12.000 x g i 5 minutter ved 22*C (Microfuge, Beckman Instruments) for at fjerne bakterie-cellerester. Supernatanten anvendtes derefter til pladebelæg-10 ning (1:100) og inkubation med hybridomsupernatanter som beskrevet ovenfor.

Et panel af varmeekstrakter fra gramnegative organismer blev afprøvet under anvendelse af det samme ELSA-format og omfat-15 tede Psudomonas fluorescens, Citrobacter freundii, Enterobac-ter aerogenes, Escherichia coli og Salmonella typhi.

Fremstilling og oprensning af monoklone antistoffer 20 Ascitesvækst af hybridomkloner til fremstilling af milligrammængder af monoklone antistoffer blev opnået ved injektion af 3,0 x 106 celler i pristan-primerbehandlede CD2Fl-mus og høst af fluida 10 til 14 dage senere. Monoklone anti stoftitere blev bestemt ved hjalp af ELISA under anvendelse af L. monocyto-25 genes-varmeekstrakt (LI) bundet til mikrotitreringsplader som beskrevet ovenfor. Monoklone antistoffer blev affi nitetsopren-sede ved protein-A-sepharosekromatografi (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, USA) og lagret ved -70eC indtil brug.

30 Immunkemisk karakterisering af monoklone antistoffer

Monoklont antistof-underisotypeanalyse blev udført under anvendelse af et kommercielt dobbeltimmundiffusionssæt (ICN Im-munobiologicals, Lisle, IL, USA). Identifikation af målanti-35 gener blev opnået ved Western-aftryksanalyse af L. monocyto-genes-varmeekstrakt (LI) fra SDS-PAGE-geler. Proteiner blev elektroforesebehandlede på en diskontinuert SDS-gra-dientpolyacrylamidgel (5 til 15%) [U.K. Laemmli, (1970), 16 DK 174414 B1

Nature 227:680] og derefter overført til nitrocellulose ved elektroaftryk [H. Towbin, T. Staehelin og J. Gordon, (1979), P.N.A.S. 76:4350]. Aftrykkene blev blokeret i 2 timer {37eC) i PBS indeholdende ikke-fed tørmælk, skyllet to gange i PBS +· 5 0,05% Tween® 20 og derefter mærket som følger: 1 cm strimler af det præparative aftryk blev inkuberet med individuelle hy-bridomklonsupernantanter i 2 timer (37°C) under omrøring og derefter skyllet to gange som ovenfor og yderligere inkuberet i 60 minutter ved 37 eC med 0,25 pg/ml HR P-kon jugerede gede-10 antistoffer mod muse-IgG + IgM (H+L) (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MO, USA). Efter to ganges vask blev aftrykkene farvet {22eC) med PBS indeholdende 0,06% diamino-benzidin (Sigma) + 0,03% H2O2· 15 Adskillige paneler af varmeekstrakter fra flere Listeria- og ikke-Listeriaorganismer blev underkastet analytisk SDS-gradient-PAGE- og Western-aftryksanalyse som beskrevet ovenfor. Panelerne bestod af L. monocytogenes (serotyperne 1-4), L. grayi, L. ivanovi i, L. innocua, L. denitrificans, L.

20 seeligeri, L. murrayi, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Lactobacillus casei, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhi og Citrobacter freundii. Udvalgte oprensede monoklone antistoffer (5 pg/ml) anvendtes derefter til immunfarvning af dette panel som be-25 skrevet ovenfor.

Oprensning og koniuqerinq af antistoffer 10-15 ml ascites blev blandet 1:2 med bindingspuffer, pH-værdi 30 9,0, (Affi-Gel Protein A MAPS II Buffers, Bio-Rad Laboratories,

Richmond, CA, USA) og påført på en 30 ml Protein A-søjle (Sepharose 4B-CL-proteiη A, Pharmacia Fine Chemicals, Piscata-way, NJ, USA). Antistof blev elueret under anvendelse af elue-ringspufferen, pH-værdi 3,0 (Bio-Rad). Proteinet blev regi-35 streret ved 280 nm og fraktioner opsamlet. 1 nogle tilfælde blev disse antistoffer yderligere konjugeret til peberrodsperoxidase (Sigma type VI, St. Louis, M0, USA) 17 DK 174414 B1 under anvendelse af metoden ifølge P.K. Nakane og A. Kawaoi [(1974) J. Histochem. Cytochem. 22:1084], ELISA-procedure med indfangning i et trin 5

Immulon Microtiter®-p1ader (Dynatech) blev belagt natten over (4e C) med protein A-oprenset 10-12C (gruppe II) (100 pg/brønd), fortyndet til 10 pg/ml i 0,05 M natriumcarbonat/-bicarbonatpuffer (pH-værdi 9,6). Pladerne blev blokeret med en 10 proteinpuffer i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter aspire-ring af blokeringsopløsningen tilsattes 100 μΊ af varmeeks-trakten og 100 μΐ af HRP-konjugatet 10-2A (gruppe III) (0,25 pg/rtil) på samme tidspunkt (&ttrins-ELISA) og der inkuberedes i 60 minutter ved 37°C. Efter inkubationen blev pladerne vasket 15 6 gange, og 100 μΐ/brønd tetramethy1benzidin (KPL)-substrat tilsattes. Pladen blev inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter, hvorpå der tilsattes 100 μΊ/brønd 2 N H2SO4. Den optiske densitet blev målt ved 450 nm i en automatiseret pladeaflæser (Bio-Tek) med luft som blindværdi. 100 μΐ PBS anvend-20 tes som en negativ kontrol.

Modifikationer af denne procedure blev udført i nogle tilfælde ved anvendelse af et andet monoklont antistof på pladerne til indfangning af antigenet, eller ved anvendelse af en kombina-25 ti on af monoklone antistoffer fra to eller tre forskellige grupper. Tilsvarende modifikationer blev ofte udført under anvendelse af andre HRP-konjugerede monoklone antistoffer enten individuelt eller i kombination.

30 Resultater

Screening af hvbridomkulturer

Af 511 afprøvede hydromer viste 37 positiv ELISA-reaktivitet 35 med L. monocytogenes-(LI)-varmeekstrakten. Positive materialer blev derefter udvidet og afprøvet igen mod et lille panel af Listeria- og ikke-Listeria-varmeekstrakter for at bestemme deres specificitet. Seksten af de 37 monoklone hybridomanti- 18 DK 174414 B1 stoffer viste specificitet for Listeria. Alle 16 reagerede med både L. monocytogenes og L. innocua. De resterende 21 monoklone antistoffer viste forskellige reaktivitetsprofiler med ikke-Listeria-varmeekstrakter (Streptococcus, Pseudomonas, 5 Salmonella, Escherichia). Et af disse (10-7C), som reagerede med både Listeria og Streptococcus, blev tilbageholdt til yderligere undersøgelse.

Et omfattende panel af Listeria-varmeekstrakter anvendtes til 10 ELISA-afprøvning af de 16 monoklone antistoffer mod Listeria for reaktivitet i et bredt område. Alle serotyper af L. monocytogenes (1-4) og alle andre Listeri aarter bortset fra L. de-nitrificans blev påvist af de 16 monoklone antistoffer.

15 Et panel af varmeekstrakter fra grampos i t i ve organismer, som sædvanligvis er til stede i forberigede supper fra fødevare-prøver, blev afprøvet for ELISA-krydsreaktivitet med de 16 monoklone antistoffer mod Listeria. Ingen af de 16 reagerede specifikt med disse varmeekstrakter. De monoklone IgG2a"anti“ 20 stoffer, herunder en irrelevant IgG2a-kontrol, viste imidlertid en positiv reaktion med S. aureus-varmeekstrakten. Denne reaktion blev elimineret ved centrifugering af varmeekstrakten til fjernelse af cellevægsmateriale før anvendelse til ELISA-pladebelægning. Centrifugering af Listeria-varmeekstrakten på-25 virkede imidlertid ikke bindingen af monoklont antistof (tabel 2). Det er også interessant at bemærke, at 10-7C (IgGj) bandt til alle undersøgte grampos i ti ve organismer, herunder S. aureus. Reaktiviteten af 10-7C med S. aureus blev ikke ophævet ved præcentr ifuger ing af varmeekstrakten.

30

Et panel af varmeekstrakter fra gramnegative organismer blev også afprøvet for ELISA-krydsreaktivi tet under anvendelse af de 16 monoklone antistoffer mod Listeria. Ingen af de monoklone antistoffer mod Listeria gav en positiv reaktion med 35 nogen af disse organismer.

Isotype- og Western-aftrvksanalvse DK 174414 B1 19

Isotypeanalyse af klonede hybridomsupernatanter afslørede, at alle 16 producerede monoklone IgG-antistoffer. Tolv var IgG^ og 4 var IgG2a- Oprensede monoklone antistoffer fra hver af de 16 hybridomkloner anvendtes til afprøvning af Listeria monocy-5 togenes (Ll)-varmeekstrakten i Western-aftryk. De 16 Listeria-specifikke monoklone antistoffer genkendte et proteinantigen med en molekylvægt i området fra 30 til 38 kD under både reducerende og ikke-reducerende betingelser. Desuden genkendte de monoklone IgG2a~antistoffer (gruppe III) og nogle af de mono* 10 klone IgGi-antistoffer (gruppe II) også bånd med lavere molekylvægt (figur 1).

For yderligere at anal.ysere antigenfordelingen og -størrelsen blev varmeekstrakter fra både Listeria og ikke-Listeria elek-15 troforesebehandlede, aftrykt og undersøgt med udvalgte monoklone antistoffer mod Listeria. Kun Listeria-varmeekstrakterne viste sig at indeholde det antigen, der genkendtes af de monoklone antistoffer (figur 2). Interessant observeredes en let variation i molekylvægt af hovedantigenet (30 til 38 kD) mel-20 lem de forskellige serotyper af L. monocytogenes (figur 3).

Det er yderligere interessant at bemærke, at L. grayi- og L. murrayi-antigenerne var cirka 5 kD større end ethvert af L. monocytogenes-anti generne. I overensstemmelse med ELISA-re-sultaterne i ndeholdt L . deni tr ifi cans ikke det antigen, der 25 genkendes af de monoklone antistoffer mod Listeria (figurerne 2 og 3). Desuden indeholdt ingen af ikke-Listeria-varme-ekstrakterne dette antigen (figur 2). Disse resultater var ensartede, uafhængigt af, hvilket monoklont antistof mod Listeria, som blev afprøvet. 10-7C, som har en anden ELISA- 30 reaktivitetsprofil, reagerede imidlertid ikke med nogen af Listeria-polypeptidantigenerne i Western-aftrykkene (figur 1).

30-34 kD- og 34-38 kD-hovedantigenet, idet mo 1eky1 s tørre 1 sen varierede let men reproducerbart med arten, indeholder altid 3 5 tre ep i toper. Hvert monoklont antistof, som i dent i fi ceres som immunspecifikt for dette antigen, reagerer med én af disse 3 epitoper. To af de således definerede tre epitoper fremkommer også i antigener med en molekylstørrelse, som varierer mellem 17 kD og molekylvægten for hovedantigenet.

20 DK 174414 B1

Typiske ELISA-resultater er vist i tabel 4.

Tabel 4 5 ELISA-resultater med ettrins-indfangning

Organisme Fortynding OD450

Negativ kontrol (PBS) _ 0,084 10 L. monocytogenes (LI) 1:100 >3,0 L. monocytogenes (LI) 1:1.000 1,245 L. monocytogenes (LI) 1:10.000 0,3B6 L. grayi . l:10o >3,0 L· grayi 1:1.000 0,545 15 L. ivanovi i 1 :100 2,205 L. ivanovi i 1 :1.000 0,482 L. innocua 1:100 >3,0 L. innocua 1:1,000 1,487 L. innocua 1:10.000 0,405 20 L. seeligeri 1:100 1,769 L. seeligeri 1:1.000 0,496 L. murrayi 1;100 1,512 L. murrayi 1:1.000 0,468

Staphylococcus aureus 1:10 0,144 25 Staphylococcus faecalis 1:10 0,138

Lactobacillus casei 1:10 0,149

Actinomyces pyogenes 1:10 0,131

Erysipelothrix rhusiopathiae 1:10 0,091 30 Når et antistof af gruppe II (10-12C) anvendes på pladen som en indfanger og et andet antistof af gruppe III (10-2A) HRP-markes og anvendes som konjugatet, identificeres varmeeks-trakter af alle afprøvede Listeria nemt som positive ved denne analyse, og varmeekstrakter af alle afprøvede ikke-Listeria 35 identificeres nemt som negative. 1 de fleste tilfælde kunne Listeria-varmeekstrakterne fortyndes 2-4 log 10-fortyndi nger og forblive positive.

21 DK 174414 B1

Deponeringer af F61/9-5E (9-5E), F61/10-12C (10-12C) og F6/10-2A (10-2A) blev foretaget ved ATCC i Rockville, USA under numrene henholdsvis HB 9493, HB 9494 og HB 9492 den 7. august 1987.

5 10 15 20 25 30 35

Claims (7)

1. Antigen, kendetegnet ved, at det er karakteristisk for Listeria-arter og er reaktivt med mindst ét af de monoklonale antistoffer valgt blandt 9-5E, 10-12C og 10-2 A 5 deponeret ved ATCC med de respektive accessionsnumre HB9493, HB9494 og HB9492, og idet antigenet omfatter et protein, som findes i Listeria-varmeekstrakter, og som har en molekylvægt på fra ca. 30 til ca. 38 kD, idet antigenet omfatter tre immunologisk forskellige epitoper, hvortil antistoffer produceret af miltceller fra mus immuniseret med Listeria-varmeekstrakteme er specifikt reaktive, og idet antigenet findes i varme-10 ekstrakter af alle Listeria-arter bortset fra L. denitrificans.

2. Antistof, kendetegnet ved, at det er immunreaktivt med Listeria-antigenet ifølge krav 1.

3. Monoklont antistof mod antigenet ifølge krav 1, kendetegnet ved en epitop-specificitet af et monoklonalt antistof valgt blandt 9-5E, 10-12C og 10-2 A deponeret ved

15 ATCC med de respektive accessionsnumre HB9493, HB9494 og HB9492.

4. Monoklonalt antistof ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det er fremstillet ved immunisering af et dyr med Listeria-varmeekstrakter, udødeliggørelse af antistofprodu-cerende celler fra dyret, dyrkning af de udødeliggjorte celler til fremstilling af antistoffer og udvælgelse af udødeliggjorte celler, der fremstiller antistoffer, som er immunre- 20 aktive med antigenet.

5. Immunanalysefremgangsmåde til påvisning af Listeria i en prøve, kendetegnet ved, at prøven inkuberes med mindst et antistof, som er immunreaktivt med antigenet ifølge krav 1. DK 174414 B1

6. Immunanalyseforsøgssæt til påvisning af Listeria, kendetegnet ved, at det omfatter mindst et antistof, som er immunreaktivt med antigenet ifølge kav 1.

7. Immunreagens, kendetegnet ved, at det omfatter et antigen ifølge krav 1 eller et antistof, som er immunreaktivt med antigenet bundet til en fast bærer, et mærke eller 5 en partikel.