RU1835848C

RU1835848C - Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l - продуцент моноклональных антител к холерному энтеротоксину

Info

Publication number: RU1835848C
Authority: RU
Inventors: С.Н. Бабицын; И.Г. Сидорович; Г.А. Игнатьева; Г.А. Темиралиева
Original assignee: Институт иммунологии МЗ РФ
Priority date: 1990-12-19
Filing date: 1990-12-19
Publication date: 1995-07-20

Abstract

Использование: биотехнология, иммунология. Сущность изобретения: штамм получен путем слияния клеток мышиной миеломы Р3.Х63.Ag8.653 с клетками селезенки мышей линии BALB/с, иммунизированных внутрибрюшинно высокоочищенным препаратом холерного энтеротоксина. Селекция гибридомы проведена на среде RPMI-1640. Штамм синтезирует моноклональные антитела, специфически взаимодействующие с холерным энтеротоксином. Титр антител достигает в культуральной жидкости 1 250 1 500, в асцитной 1 1000000. Антитела могут быть использованы для конструирования иммунобиологических препаратов, превосходящих по чувствительности имеющиеся аналоги.

Description

Изобретение относится к гибридной технологии и может быть использовано в диагностических тест-системах иммуноанализов на холерный энтеротоксин, его отдельную В-субъединицу, в частности при дифференциации токсинпродуцирующих штаммов холерного вибриона.

Цель изобретения получение штамма гибридомных клеток, продуцирующих моноклональное антитело заданной специфичности против В-субъединицы холерного токсина, отличающегося удовлетворительной продуктивностью по антителам и по пролиферации клеток-продуцентов. В литературе имеются публикации зарубежных авторов, описывающиеся моноклональные антитела к энтеротоксину холерного вибриона. Среди них описаны и антитела, специфичные к В-субъединице холерного токсина. В частности, в одной из последних работ указано, что выделено 10 монАТ к В-субъединице. Эпитопная специфичность их не приведена в публикации. Указано, что три из них перекрестно реагируют с термолабильным токсином R. coli, все они относятся к субклассу иммуноглобулинов мыши lgG 1, холерный токсин получали от вибрионов серотипа 569В, при получении гибридомы использовали клетки миеломы SP2/0.

В нашем случае эпитопная специфичность антитела штамма N 469 охарактеризована только частично (в сравнении с реактивностью монАТ штамма-прототипа Н2/f7), монАТ N 469 относится к классу иммуноглобулинов lgM, родительская миелома Х63, Ag8.653, серотип холерного вибриона продуцента токсина Inaba. Таким образом тождества с аналогами не наблюдается.

За прототип принят штамм гибридомных клеток H2/f7, продуцирующий моноклональное антитело класса lgG1, полученное против холерного энтеротоксина вибриона штамма Inaba и при гибридизации с клетками миеломы Х63.Ag8.653. МонАТ H2/f7 направлено к общему антигенному эпитопу А- и В-субъединиц холерного токсина. В конкурентном радиоиммуноанализе монАТ H2/f7 выявляет холерный токсин с чувствительностью определения 10 нг/мл. В отличие от прототипа монАТ штамма N 469 относится к классу lgM, реагирует только с В-субъединицей токсина, следовательно, направлено к заведомо другому эпитопу, чем антитело H2/f7, в ловушечном иммуноферментном анализе монАТ N 469 выявляет холерный токсин с чувствительностью 1 нг/мл.

Штамм "HT-2", ВСКК П N 469 получают следующим способом. Мышей Balb/c иммунизируют внутрибрюшинно трижды с интервалом в 3-6 недель по 1 мкг цельного хроматографически очищенного холерного токсина с адьювантом Фрейнда. Иммунные клетки селезенки гибридизуют с клетками перевивной миеломы Х63. Ag8.653 в соотношении 10:1 в 45%-ном растворе полиэтиленгликоля 4000 с 10% диметилсульфоксида на среде RPMI 1640 в течение 1 мин совместной инкубации. После гибридизации клетки рассеивают в культуральные микропанели в селективной среде состава: RPMI 1640, 10% сыворотки эмбриона коровы, 4 мМ 1-глютамина, 5 ˙ 10^-5 М 2-меркаптоэтанола, 10^-4 М гипоксантина, 1,6 ˙ 10^-5 М тимидина, 4 ˙ 10^-7 М аминоптерина. В дальнейшем после завершения этапа метаболической селекции гибридных клеток от родительской миеломы через три недели гибридому штамма N 469 культивируют на среде того же состава, исключая гипоксантин, аминоптерин, тимидин. Через 7-10 дней после гибридизации в лунках вырастают колонии гибридомных клеток. Из лунок с моноклональным ростом отбирают на анализ супернатант и тестируют наличие в нем антител к холерному токсину твердофазным иммуноферметным методом. Для этого на ИФА-панели сорбируют антигены хроматографически чистый цельный токсин, хроматографически очищенную В-субъединицу холерного токсина, а также посторонние контрольные белки бычий сывороточный альбумин, овальбумин F1-антиген чумного микроба цитолизин холерного вибриона, нейраминидазу холерного вибриона. Сорбцию проводят из концентрации белков 1 мкг/мл. Затем в лунки вносят испытуемые супернатанты, инкубируют 1 ч при комнатной температуре, отмывают водой с 0,05% твина-20, вносят конъюгат кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой из корня хрена, инкубируют 30 мин при комнатной температуре, отмывают и вносят субстрат пероксидазы: 0,04%-ный раствор о-фенилендиамина в цитрат-фосфатном буфере с рН 5,0 с добавлением 0,001% перекиси водорода. Через 10-20 мин реакцию останавливают добавлением 50 мкл 40%-ной серной кислоты. Интенсивность окраски регистрируют спектрофотометрически при длине волны 420 нм.

Отбирают супернатанты и соответствующие штаммы гибридных клеток, которые показывают достоверную положительную реакцию с холерным токсином, а также с отдельной В-субъединицей, но не реагируют ни с одним из посторонних контрольных белков. Отобранный штамм гибридомы N 469 клонируют методом предельных разведений в жидкой среде в микропанелях четырежды. В двух последних клонированиях процент позитивных клонов равен 100%
Штамм N 469 характеризуется следующими свойствами.

В культуре клетки штамма пролиферируют в интервале концентраций 10⁵ 10⁶ в 1 мл и требуют пересева каждые 72 ч. Продуктивность штамма по антителам in vitro составляет в величинах титра супернатанта в ИФА 500-1000. Клетки штамма культивируют в среде RPMI 1640 с 10% сыворотки эмбриона коровы, в атмосфере с 5% углекислого газа в воздухе при 36,6^оС.

Клетки прививают в организм сингенных мышей, предобработанных за 10-14 дней до инокуляции гибридомы в брюшную полость 0,5 мл/мышь пристана. Доза клеток на мышь 10⁶ 10⁷. Опухоль растет смешанным асцитно-солидным образом. Объемы асцитных жидкостей от 3 до 10 мл от мыши. Титр монАТ в асцитных жидкостях в ИФА составляет 10⁶ 10⁷.

Кариотип клеток штамма N 469 по видовой принадлежности мышинной, по модальному числу хромосом 88.

Антитела, продуцируемые клетками штамма N 469, относятся к классу иммуноглобулинов lgM по данным ИФА с типирующими моноспецифическими антисыворотками против отдельных классов иммуноглобулинов мыши.

Культуру клеток N 469 перевивают на среде, не содержащей антибиотики. Контаминации бактериями и грибами не обнаруживают.

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Определение токсигенности изолятов холерных вибрионов, выделенных от носителей и больных методом прямого твердофазного иммуноферментного анализа с применением монАТ N 469.

В работе используют 50 конкретных штаммов холерных вибрионов. Супернатанты с культур этих вибрионов наносят на твердую фазу микропланшетов в качестве испытуемых антигенов. Затем в лунки этих микропланшетов вносят монАТ штамма N 469, инкубируют 1 ч при комнатной температуре, отмывают водой с 0,05-ным твином-20, вносят антииммуноглобулиновый конъюгат с пероксидазой, инкубируют, отмывают, проявляют о-фенилендиамином. Результаты показывают, что монАТ N 469 дает положительную реакцию с 25 супернатантами культур холерных вибрионов, и с 25 отрицательную реакцию, т.е. монАТ N 469 идентифицирует 25 штаммов вибрионов как токсинпродуцирующие и 25 других штаммов как токсиннепродуцирующие. Для верификации результатов эти штаммы холерных вибрионов исследовали методом гибридизации нуклеиновых кислот со специфическим зондом ДНК на ген холерного энтеротоксина. Данные гибридизации полностью совпали с данными иммуноферментного анализа с применением монАТ N 469: в 25 негативных штаммах холерных вибрионов отсутствует ген холерного токсина.

П р и м е р 2. Использование монАТ N 469 в конструировании эритроцитарного диагностикума для индикации холерного токсина или его отдельной В-цепи.

Эритроцитарный диагностикум используют в реакции непрямой гемагглютинации для определения в испытуемом образце (супернатанте с культур вибрионов или иных биологических жидкостях) наличия холерного токсина или его В-субъединицы. Для использования в эритроцитарном диагностикуме монАТ выделают из асцитных жидкостей осаждением каприловой кислотой. В качестве носителей используют эритроциты барана (ЭБ). Получают кровь барана, отмывают эритроциты, фиксируют их в 10%-ном формалине, готовят их 10%-ную взвесь. В таком виде их обрабатывают танином с глютаровым альдегидом, для чего смешивают равные объемы взвеси ЭБ с раствором, содержащим 5 мг танина и 2 мл глютаральдегида в 100 мл фосфатного буфера с рН 6,4. Инкубируют 15 мин при 37^оС, трижды отмывают. К осадку добавляют раствор монАТ N 469 с концентрацией 50 мкг/мл по белку. Инкубируют 1 ч при 45^оС, после чего добавляют формалин до конечной концентрации 1% После фиксации отмывают трижды фосфатным буфером с твином-80 (концентрация твина 1:25000), и наконец, ресуспендируют в фосфатном буфере с рН 7,2 до 2,5 или 10%-ной взвеси. В таком виде диагностикум готов к употреблению и имеет срок хранения 1 год. Используют его так: в круглодонные лунки микропанелей вносят по 100 мкл фосфатного буфера с добавками 0,05% твина-20, 0,2% БСА, рН 7,2. В этих лунках титруют испытуемый образец путем двукратных или других разведений, после чего в каждую лунку добавляют по 50 мл 0,6%-ного эритроцитарного диагностикума. Панели встряхивают и инкубируют 2 ч при 37^оС. Учет результата проводят визуально по наличию или отсутствию гемагглютинации: в положительном случае на дне лунки образуется "зонтик", в отрицательном "пуговка". Чувствительность определения, как показывают результаты тестирования супернатантов с тех же 50 штаммов холерных вибрионов и калибровочная кривая с чистыми препаратами для холерного токсина и его отдельной В-субъединицы, 10-20 мкг/мл.

П р и м е р 3. Применение монАТ N 469 в ловушечном варианте ИФА на холерный токсин и его В-субъединицу.

В тест-системе используют два монАТ H2/f7 и N 469, направленные против разных этитопов молекулы холерного токсина. МонАТ N 469 сорбируют первым слоем на дне микропанелей из концентрации 10 мкг/мл. Затем вносят испытуемые образцы в различных разведениях, инкубируют, отмывают. Вносят конъюгат второго монАТ N H2/f7 с пероксидазой хрена. Инкубируют, отмывают, проявляют реакцию о-фенилендиамином с перекисью водорода. Результаты титрования в этой системе растворов с известной концентрацией чистого холерного токсина и его отдельной В-субъединицы показывают, что чувствительность определения цельной молекулы холерного токсина 1 нг/мл, отдельной В-субъединицы 0,1 мкг/мл.

Предложенные анализы можно использовать для тестирования на наличие токсина в биоматериалах, а также для иммунологического анализа сохранности препаратов токсина и отдельной В-субъединицы при их выделении и очистке.

Claims

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L ВСКК (П) N 469D продуцент моноклональных антител к холерному энтеротоксину.