SU1712411A1

SU1712411A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к иммуноглобулину G павианов

Info

Publication number: SU1712411A1
Application number: SU904803739A
Authority: SU
Inventors: Игорь Наумович Клоц; Александр Феликсович Воеводин; Татьяна Генриховна Талло; Ирина Григорьевна Зоделава
Original assignee: Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Патологии И Терапии Амн Ссср
Priority date: 1990-03-19
Filing date: 1990-03-19
Publication date: 1992-02-15

Description

Изобретение относитс к биологии и медицине и может быть применено в медико-биологических исследовани х, например , дл опреде{1ени иммуноглобулинов G у павианов.,

Целью изобретени вл етс получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (мон-Ар, направленные к классоспецифическрй детерминанте IgG павианов. Это позволит проводить пр мое сравнение данных, полученньгх на павианах, с результатами, найденными у человека, что крайне важно при моделировании р да заболеваний человека на обезь нах.,

Штамм гибридных клеток ПГСЗ| (гибридома ) получают путем сли ни мышиной миеломы Х63-А. 8,653 с клетками селезенки мыши BALB/C, иммунизированной IgG павиана-гамадрила . Отбор продуцирующих МКА клонов на первом этапе провод т с помощью igG павиана-гамадрила. Наиболее реактивные клоны тестируют на реактивность с IgG других видов рода павианов: анубиса (рар)о anubis) и гвинейского павиана (papio papio) Гидридому, имеющую одинаковую реактивность с IgG этих видов, провер ют в вестерн-блотинге на секрецию МОН-АТ против т желых цепей IgG павианов. Далее гибридома прошла три этапа клони ровани методом предельных разведений. Штамм nrGt депонирован в,коллекцию Института Цитологии АН СССР. Ниже даетс характеристика штамма гибридомы:

1.Регистрационный номер ВСКК(П) 376Д, авторское наименование штамма: ПГС|.

2.Причины депонировани : продуцент моноклональных антител против IgG павианов .

3.Д Родословна штамма:

Клетки миеломы Х63-Ад 8.653 + клетки селезенки мыши BALB/c, иммунизированной IgG павиана-гамадрила, сливающий агент - ПЭГ 6000, селекци клеток на среде HAT, 3 клонировани методом предельных разведений (1 клетка/3 лунки).

4.Число пассажей к моменту паспортизации и депонировани : 7.

5.Стандартные услови выращивани : Среда RPMI - 1640 + 15% FCS, 37°С,

газова фаза - воздух + 5% С02.

6.Культуральные свойства:

способ культивировани - встекл нных или пластиковых флаконах на 50-250 мл, посевна доза - 500.000 клеток/мл, кратность рассева - 1ч2, врем субкультивировани 3-4 дн .

7.Характеристика культивировани гибридомы в организме животного: мышь BALB/C, обработанна приставом /1 мл, в/б за 10 дней до инокул ции/, доза инокул ции -.5-10 млн клеток, врем образовани асцита 10-20 дней.

,8. Данные по видовой принадлежности: мышиные клетки линии BALB/c.

9.Маркерйые признаки и методы их оценки:

гибридома секретирует Мон-АТ против т желых цепей IgG павианов, определ емые иммуноферментными, иммунофлюоресцентными и радиоиммунологическими методами..

10.Контроль контаминации бактери ми , грибами, микоплазмами и вирусами:

.контаминации бактери ми, грибами и микроплазмы нет.

Один из родительских клеток продуцируют эндогенный ретровирус С-типа мышей .

11.Характеристика полезного вещества , продуцируемого штаммом: мон-АТ IgG класса , направленные к классоспецифической детерминанте т желых цепей, IgG павианов: специфичность оценивалась иммуноферментным методом и вестернблотингом .

12.Концентра1ди полезного продукта (моноклональных антител) в среде около 10 мкг/мл, в асцитиой жидкости около Юмг/мл.

Титры данных антител при определении с помощью твердоазного иммуноферментf

ного метода около 2x10 (среда/ и 2х10-6/асцит при концентрации антитена 1 мкг/мл. Определение антител можно проводить также иммунофлюоресцентными и радиоиммунологическими методами. Продукци моноклональных антител стабильна, по крайней мере, в течение 9 пассажей in vitro.

13. Способ криоконсервации:

0 5-6 млн клеток в FCS + 10% DMSO, программное замораживани около 90% (оценка жизнеспособности по исключению трипанового синего).

Использование штамма илюстрируетс

5 следующими примерами:

П р и м е р 1. Сыворотки трех видов, павианов (анубиса. гвинейского и гамадрила ) используют дл приготовлени 2-кратных разведений, начина с 1:2000. В лунке

0 96-луночных пластинок дл твердофазного иммуноферментного анализа внос т приготовленные разведени сывороток обезь н. Параллельно используют такие же разведени сыворотки человека. При этом происходит сорбци белков сыворотки на пластине лунок. Несв завшиес белки удад ют, свободные адсорбционные точки блокируют 8%-ным раствором сухого обезжиренного молока, после чего в лунки внос т разведение либо асцитной жидкости Мон-АТ ПГСк либо прототип - мон-АТСз (1:2000). После инкубации в течение 1 ч при 37°С лунки промываютдл удалени несв завщихс антител, внос т антимышиный коньюгат,

5 меченный пероксидазой, и провод т стадии инкубации и отмывки. Затем в лунке добавл ют раствор о-фенилендиамина, который пероксидаза в присутствии перекиси водорода превращает в окрашенное соедине0 ние. Степень окраски, измеренна при 492

нм, пропорциональна концентрации IgG в

сыворотке. Из получаемых результатов сле дует, что мон-АТ nfGI одинаково хорош.о

реагирует с IgG всех трех видов павиата и

5 человека. Отношение оптических плотностей дл разведени 1:4000 при 492 нм, полученных на сыворотках павианов. к оптической плотности, полученной на сыворотке человека, при использовании мон-АТ

0 nrGi равны 0,97:0,85, 1,39 (среднее 1,04), тогда как МКА Gs хорошо реагирует с сывороткой человека, но практически не реагирует с сыворотками павианов. Отношение, близкое к единице, позвол ет проводить

5 пр мое сравнение данных, полученных при. определении антител IgG класса у павианов, с результатами, полученными у человека.

П р и м е р 2. Навески IgG трех видов павианов и человека в количестве 10 мкг каждого на трех кип т т в течение 5 мин на

вод ной бане в буфере дл образцов, содбржащем мер - каптоэтанол. При этом происходит разрушение дисульфидных св зей и при электрофорезе иммуноглобулиннраздел ют на т желые и легкие цепи. Белки элюируютс электропереносом на нитроцеллюлозу , которую инкубируют в 8%-ном растворе сухого молока дл блокировани свободных адсорбционно-ак ивных точек. Определение ведут в двух параллельнь хрбразцах . Первую половину инкубирукл с мон-АТ Сз (прототип), а вторую с ПГС| (1:500) в течение 2 ч при . После отмывки несв завшихс антител нитроцеллюлозу инкубируют и повтор 2 ч при 37°С с антимышиным конъюгатом, меченным nfроксидазой , и повтор ют отмывку. Пе|31оксидаза в присутствии перекиси водорода

перевод т субстрат-диаминобензидин в окрашенное соединение, причем только в том месте, где Мон-АТ взаимодействует со своим антигеном. В данном случае, прототипМон-АТ Сз, реагирует с т желыми цеп ми только IgG человека, тогда как предлагаемое Мон-АТ ПГС| реагирует с т желыми цеп ми человека и всех трех видов павианов. Полученные результаты показывают, .

что в отличие от прототипа, Мон-АТ ПГСг направленно к кпассосг ецифической детерминанте , общей дл т желых цепей IgG павианов и человека.

«В о р м у л а и 3 о б р е т е н и

Штамм гибридных культивируемых кле ток животнь х Mus musculus, L. ВСКК(П) Nfe 376 Д-продуцентмоноклональных антител к иммуноглобулину G павианов.

Claims

Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus. L. ВСКК(П) № 376 Д-продуцент моноклональных антител к иммуноглобулину G павианов/