SU1752763A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS MUScULUS L. - продуцент моноклональных антител к I @ Е человека - Google Patents

Abstract

Использование: биотехнологи , иммунологи  Штамм получают путем сли ний лимфоцитов мышей SIL, иммунизированных IgE человека, с культивируемым клетками мышиной миеломы 653 А. Штамм обозначен Е/4Ф4 и депонирован под номером ВСКК(П) 402. Штамм культивируют на питательной среде, содержащей сыворотку крупного рогатого скота. Титр моноклональ- ных антител в культуральной жидкости достигаетс  1:20000. Моноклональные антитела используютс  дл  иммунохимиче- ского определени  концентрации общего IgE и фракции аллергенспецифических антител lgE-класса в сыворотке крови человека , а также дл  контрол  загр зненности окружающей среды аллергенами. 2 ил , 10 табл.

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и предназначено дл  производства монокло- нальных антител (МКАТ) против эпсилон-цепи иммуноглобулина Е (IgE), которые используютс  в иммунохймической диагностике аллергических заболеваний человека.

Содержание IgE в крови человека в 10- 50 тыс. раз меньше уровн  иммуноглобулинов других классов (IgA, IgG, IgMJ. Селективность и чувствительность современных методов вы влени  аллергенспеци- фических lgE-антител (аллергосорбентный тест) или определени  общего содержани  IgE (двухдетерминатный иммунометриче- ский тест) обеспечиваютс  реализацией принципа твердофазного иммуноанализа, согласно которому IgE, содержащийс  в исследуемом образце, св зываетс  иммобилизованным на твердой фазе аллергеном или МКАТ, направленными к одной из антигенных детерминат эпсилон-цепи, после чего сформированный на твердой фазе иммунный комплекс вы вл етс  с помощью вторых МКАТ, несущих ферментную, изотопную или флуоресцентную метку.

В св зи с этим МКАТ, предназначенные дл  использовани  в аллергодиагностиче- ских методах твердофазного иммуноанализа , подвергаютс  отбору по критерию сохранени  функциональной активности при иммобилизации на твердой фазе и при ковалентном св зывании с маркерными молекулами . Кроме того, при этом отбирают МКАТ, специфичные к антигенным участкам эпсилон-цепи, которые, во-первых, не маскируютс  при формировании комплекса ал- лерген-lgE, а во-вторых, пространственно удалены друг от друга, что исключает конкуренцию между ними за св зывание IgE при постановке двухдетерминантного иммуно- метрического теста. Перспективными дл  практического применени  считаютс 

в

Х|

Ь

МКАТ, обладающие одним или несколькими из перечисленных свойств,

Известны гибридомные штаммы, вырабатывающие МКАТ против IgE человека табл, 1).

В числе аналогов описано семейство гибридомных клонов, при получении которых реализованы упом нутые выше принципы отбора продуцентов. Гибридомы получены на основе миеломной линии РЗХ63. Ад8.653 и лимфоцитов мышей линии BALB/C, иммуизированныхмиеломным IgE еловека. П ть штаммов этого семейства продуцируют МКАТ, относ щиес  к lgG1, продукты двух других штаммов относ тс  к lgG2a. Среди описывземх штаммов большинство продуцирует МКАТ, которые взаиодействуют как с гомогенным (миеломным), ак и с поликлональным IgE человека, т.е. пецифичны к константным эпитопам молекул IgE. Продукты двух штаммов сохран ют нтигенсв зывающую активность при иммобилизации на твердой фазе. МКАТ, способных вы вл ть аллерген специфические lgE-антитела или служить основой меченого реагента дл  двухдетерминантного опредеени  концентрации IgE, среди продуктов анного семейства гибридом не описано.

Недостаток известных гибридов состот в том, что дл  их получени  в качестве родительских клеток использованы миелом- ные клеточные линии с низкой автономнотью роста, требующие дл  размножени  ростовых факторов эмбриональной сыворотки , Высока  зависимость от ростовых факторов ограничивает возможности эксплуатации таких гибридом в качестве производственных штаммов, особенно при использовании метода массового культивировани  в ферментерах, а также может служить причиной их недостаточной стабильности .

Цель изобретени  - получение гибри- домного штамма, который не требует дл  размножени  ростовых факторов эмбриональной сыворотки, синтезирует МКАТ, пригодные дл  вы влени  общего IgE и фракции аллергенспецифических IgE в сыворотке крови человека.

Поставленна  цель достигаетс  использование при получении гибридом клеток ми- еломного штамма 653.А (ВСКК/П/М7Д), размножение которого не требует ростовых факторе эмбриональной сыворотки, а также отбором среди полученных гибридом штамма Е/4Ф4, синтзирующего МКАТ, которые сохран ют антигенсв зывающую активность при иммобилизации на твердой фазе и при присоединении ферментной метки и направлены к антигенной детерминанте , экспрессированной как на свободном IgE. так и на IgE, св занном в иммунном комплексе с аллергеном.

Описываемый штамм Е/4Ф4 подобно

известному синтезирует МКАТ, специфичные к константной области эпсилон-цепи IgE человека и способные при адсорбции на твердой фазе извлекать IgE из раствора. Штамм Е/4Ф4 получен на основе мие0 ломной клеточной линии 653. А и не требует дл  размножени  ростовых факторов эмбриональной сыворотки. Синтезируемые штаммом Е/4Ф4 МКАТ в составе конъюгата с ферментом позвол ют вы вл ть аллерген5 специфические lgE-антитела, а также определ ть общее содержание IgE с помощью двухдетерминантного иммунометрического теста.

Кроме того, предлагаемый штамм отли0 чаетс  от известного генотипом животных- доноров иммунных лимфоцитов (мыши линии SJL/J).

Штамм депонирован в ВСКК(П) под номером 402Д. Штамму присвоено наимено5 вание РИ-8-Е/4Ф4.

Получение гибридомного штамма. Донорами иммунных лимфоцитов служили мыши-самцы линии SJL/J, которых иммунизировали дважды с интервалом 1

0 нед. подкожно препаратом миеломного lgE/L(40 мкг) в полном адьюванте Фрейнда, на 11-й и 12-й дни после этого давали бустер-иммунизации внутрибрюшинно по 10 кг IgE в физиологическом растворе. Спленоци5 ты дл  сли ни  получали через 24 ч после последней бустер-иммунизации от мышей, у которых титр антиЧдЕ-антител превышал 1:20000. Партнерами дл  гибридизации служили клетки миеломного штамма 653.А,

0 выращенные на питательной среде, содержащей модифицированную Дюльбекко среду Игла (90%) и сыворотку крупного рогато го скота (10%). Дл  сли ни  использовали 100 млн клеток селезенки и 50 млн

5 клеток миеломы. Смесь клеток обрабатывали раствором полиэтиленгликол  (50%) с мол. м. 1000. Дл  выращивани  гибридов использовали питающий слой из перитоне- альных макрофагов мышей и питательную

0 среду указанного состава, содержащую, мкг на 100 мл: аминоптерин 10; гипоксантин 500; тимидин 500.

Отбор и тестирование культуральных надосадков проводили трижды с 11-го по

5 28-й дни после сли ни . Вы вление МКАТ, специфичных к констан тной области эпсилон-цепи , вели с помощью твердофазного иммуноферментного анализа аналогично известному способу использу  в качестве антигенов миеломные IgE, препараты IgG,

IgM, а также легкие цепи иммуноглобулинов человека каппа- и л мбда-типов (табл. 2).

Из 480 первичных культур 12 синтезировали антитепа, св зывающиес  с IgE/L- иммуногеном. Среди них одна культура, продуцировала антитела, направленные к легкой цепи каппа-типа. Продукты синтеза п ти культур св зывались с 1дЕ/1 -иммуно- геном, но не реагировали с миеломным lgE/Ю. Наконец, шесть культур синтезировали антитела, взаимодействующие как с IgE/L, так и с lgE/Ю. Эти шесть культур, обозначенные как семейство гибридомРИ- 8. были подвергнуты дальнейшему изучению .

Гибридомы клонировали 2-4 раза методом лимитирующих разведений на питающем слое из перитонеальных макрофагов мышей. Клоны, которые при двух последовательных клонировани х с плотностью посева 1 клетка на 1 или 2  чейки давали более 95% субклонов, синтезирующих анти-lgE- антитела, переводили в массовую культуру. Выращенные в культуре клетки прививали внутрибрюшинно гистосовместимым мышам (по 5 млн клеток на мышь), которым за 7-18 дней до этого также внутрибрюшинно был введен пристан (по 0,5 мл).

От мышей с растущими опухол ми на 14-21-й дни получали асцитические жидкости . МКАТ из асцитов адсорбировали на твердой фазе и исследовали их способность св зывать IgE из раствора. Замен   растворы IgE на образцы сыворотки крови здоровых людей и больных аллергией, вы вл ли МКАТ, которые св зывают поликло- нальный сывороточный IgE, т.е. специфичны к константным эпитопам эпсилон-цепи. Таким образом было отобрано п ть клонов, продуцирующих МКАТ, удовлетвор ющих критери м селекции.

МКАТ, прошедшие предыдущие ступени отбора, исследовали на способность сохран ть , иммунологическую активность при присоединении ферментной метки. Дл  этого МКАТ из асцитических жидкостей выдел ли осаждением сульфатом аммони  и методом периодатного окислени  к ним присоедин ли фермент - пероксидазу хрена. Иммунологическую активность полученных коньюгатов исследовали в твердофазном иммуноанализе, адсорбиру  на твердой фазе миеломный tgE. Продукты всех п ти клонов после присоединени  ферментной метки сохран ли антиген-св зыва- ющую активность.

Способность МКАТ, меченных ферментом , вы вл ть аллергенспецифическую фракцию IgE, оценивали с помощью аллер- госорбентного теста. В качестве антигена

использовали экстракт пыльцы березы, IgE- антитела вы вл ли в стандартных сыворотках А, В, С и D, прилагаемых к набору ФАДЕЗИМ (Швеци ). МКАТ клона 4Ф4,

коньюгированные с пероксидазой, вы вл ли фракцию IgE, специфичного к аллергену. МКАТ других клонов распознавали эпитопы, которые не экспрессируютс  на молекулах IgE, вход щих в комплекс с аллергеном, и в

0 силу этого неэффективны в аллергосорбен- тном тесте.

Подбор антител дл  двухдетерминант- ного иммунометрического теста определени  IgE проводили, испытыва  поочередно

5 сорбированныена твердую фазу МКАТ в качестве подложки и меченные ферментом МКАТ в качеств вы вл ющих реагентов (табл. 3). Найдено несколько сочетаний иммобилизованных и меченных МКАТ, позво0 л ющих определ ть IgE в сыворотке крови. Оптимальный результат получен при захвате IgE адсорбированными на твердой фазе МКАТ клона Е/5Д4 и вы влении фиксированного в комплексе IgE с помощью мечен5 ных пероксидазой МКАТ клона Е/4Ф4. Удовлетворительный результат был получен также при использовании МКАТ Е/4Ф4 в качестве иммобилизованного на1 твердой фазе lgE-св зывающего реагента.

0 Таким образом, в результате ступенчатого отбора был получен штамм Е/4Ф4, который обладает необходимой совокупностью свойств, т.е. способностью расти на среде, не содержащей эмбриональной сыворотки,

5 и продуцировать МКАТ. пригодные дл  определени  содержани  IgE в двухдетерми- нантном иммуноанализе в качестве меченого или иммобилизованного на твердой фазе lgE-св зующего реагента, а также

0 дл  выделени  lgE-антител в аллергосор- бентном тесте.

Характеристика штамма. Штамм Е/4Ф4 принадлежит к семейству гибридом РИ-8.

5 С момента получени  из родительских клеток штамм прошел 23 пассажа в культуре , включа  3 цикла клонировани  методом лимитирующих разведений на питающем слое из макрофагов мышей.

0

Стандартными услови ми культивировани   вл ютс  следующие: питательна  среда состоит из среды Игла в оригинальной прописи или в модификации Дюльбекко

5 (90%) и сыворотки крупного рогатого скота (10%). Клетки выращивают при 37°С в герметично закрытых флаконах или в открытой системе - в планшетах, чашках Петри или флаконах в атмосфере с 7,5% углекислоты в воздухе при 100% влажности.

Оптимальна  посевна  доза составл ет 200 тыс, клеток в 1 мл среды. Дл  поддержани  клеток в пролиферирующем состо нии их рассевают 2 раза в неделю с коэффициентом 1:4-1:5 при использовании стандартного состава ростовой среды. Клетки сохран ют способность к пролиферации при снижении содержани  сыворотки до 2,5%, при этом кратность рассева составл ет 1:2, Максимальна  плотность культуры с сохранением жизнеспособности 1.2-1,4 млн клеток в 1 мл.

Культура описываемого штамма представл ет взвесь одиночных округлых прозрачных клеток, встречаютс  агрегаты из четырех или более клеток, которые легко суспендируютс  пипетированием,

Культура штамма Е/4Ф4, посто нно выращиваема  без антибиотиков, не содержит бактерий, грибов, дрожжей и микоплазмы.

Клетки штамма перевивают в виде асци- тических или солидных опухолей (в зависимости от способа прививки) на гистосовмес- тимых мышах-гибридах F1 (SJL/JxBALB/c). При внутрибрюшинной прививке 5 млн клеток животным в возрасте 1,5-3 мес, предоб- работанным за 7-18 дней до этого внутрибрюшинным введением пристана, асцит развиваетс  в течение 14-21 дн . От одной мыши получают при первой пункции 4-10 мл, суммарно в результате повторных пункций от одного животного получают 7- 20 мл асцита.

Маркерные признаки штамма:

штамм синтезируют МКАТ против IgE человека, антитела вы вл ютс  в культу- ральной жидкости при поддержании клеток in vitro и в сыворотке или в асцитической жидкости при прививке животным;

штамм обладает онкогенностью, котора  выражаетс  в росте солидных или асци- тических опухолей у гистосовместимых мышей-гибридов F1(SJL/JxBALB/c) при прививке им клеток гибридомы.

Характеристика МКАТ, продуцируемых штаммов гибридомы Е/4Ф4,

Клетки гибридомы продуцируют МКАТ субкласса lgG2a. Антитела специфичны к константной области эпсилон цепи IgE человека . Специфичность МКАТ может быть проверена в твердофазном иммунофермен- тном анализе с помощью IgE, адсорбированного на твердой фазе. МКАТ св зываютс  с белком /& стафилококка, что может быть использовано при их очистке. При адсорбции на твердой фазе МКАТ способны св зывать сывороточный IgE и мог/т использоватьс  в качестве захватывающих антител в системе двухдетерминантного иммуноанализа (в паре с мечеными IgE специфичными антителами ) или при афинном извлечении IgE из сывороточных препаратов. МКАТ Е/4Ф4, сохран   антигенраспознающие свойства после присоединени  ферментной метки,

могут также служить вы влющим реагентом в двухдетерминантном иммуноанализе дл  определени  концентрации IgE, а также дл  вы влени  фракции аллергенспецифическо- го IgE с помощью аллергосорбентного тес0 та.

Продуцируемый штаммом иммуноглобулин вы вл етс  в культуральной среде при культивировании клеток. Обратный титр МКАТ в переросших культурах при вы5 ращивании клеток в стандартных услови  составл ет 3000-2400. Такой же титр может быть получен при снижении содержани  сыворотки в ростовой среде с 10 до 1,2 %. При росте гибридомных клеток в мышах обрат0 ный титр МКАТ в асцитической жидкости составл ет 0,1-6 млн. Среднее содержание иммуноглобулина в асците составл ет 10 мг/мл.

Стабильность продукции МКАТ оцени5 вали при пассировании клеток на мышах в течение 8 пассажей. За этот период клетки сохран ли исходную продуктивность. В культуре сохранение уровн  МКАТ прослежено в течение 18 пассажей.

0 Услови  криоконсервации.

Криосреда состоит из 45% среды Игла, 45% сыворотки крови крупного рогатого скота и 10% диметилсульфоксида. Ампулы, содержащие 1-10 млн клеток в криосреде,

5 помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок 1,5 см и выдерживают в нем при -70°С в течение суток, затем хран т при той же температуре или перенос т в жидкий азот. Дл  размораживани  клеток

0 ампулы извлекают из низкотемпературного хранилища и на 3 мин погружают в воду с температурой 40° С. Затем центрифугируют 3 мин при 1000 об/мин, убирают надосадок, а клетки суспендируют в ростовой среде и

5 рассевают в платы при концентрации 500 тыс. клеток в 1 мл. Жизнеспособность клеток после криоконсервации составл ет 70- 80% по данным пробы с 05%-ным трипановым синим. Через 1 сут клетки по0 вторно рассевают с концентрацией 200 тыс. клеток в 1 мл ростовой среды.

В табл. 1 приведены гибридомные штаммы-продуценты МКАТ против IgE человека , в табл. 2 - результат тестировани 

5 специфичности антител, продуцируемых первичными культурами гибридом, в табл. 3 - вы вление IgE с помощью двухдетерминантного твердофазного иммунофермент- ного анализа, в табл. 4 - титры МКАТ, продуцируемых клетками штамма 8Е/4Ф4

при выращивании в среде с низким содержанием сыворотки, в табл 5 - титры МКАТ, продуцируемых клетками штамма Е/4Ф4, в культуральной среде и в асцитической жидкости , в табл. 6 - содерджание IgE в образцах сыворотки крови человека, определенное в двухдетерминантном иммунометрическом тесте с помощью меченых МКАТ Е/4Ф4, в табл. 7 - содержание IgE в образцах сыворотки крови человека, определенное в двухдетерминантном иммунометрическом тесте с помощью МКАТ Е/4Ф4, иммобилизованных на твердой фазе, в табл. 8 - вы вление lgE-антител против амброзии в аллергосор- бентном тесте с помощью меченых МКАТ Е/4Ф4, в табл. 9 - результаты вы влени  IgE с помощью двухдетерминантного имму- нометрического теста, в табл. 10 - вы влени  аллергенспецифического IgE с помощью аллерго-сорбентного теста.

На фиг. 1 дана калибровочна  крива  дл  определени  содержани  IgE в сыворотке крови человека в двухдетерминантном иммунометрическом тесте с помощью меченых МКАТ Е/4Ф4; на фиг. 2 - калибровочна  крива  дл  определени  содержани  IgE в сыворотке крови человека в двухдетерминантном иммунометрическом тесте с помощью МКАТ Е/4Ф4, иммобилизованных на твердой фазе.

П р и м е р 1. Выращивание культуры гибридомы дл  последующей прививки мышам .

Посевным материалом служат гибри- домные клетки, хран щиес  в жидком азоте. Дл  размораживани  пробирку, содержащую 5 млн клеток, извлекают из сосуда с жидким азотом, погружают на 3 мин в воду с температурой 40°С, после полного оттаивани  пробирку центрифугируют 3 мин при 1000 об/мин, удал ют надосадок, клетки ре- суспендируют в 10 мл ростовой среды (модифицированна  Дюльбекко среда Игла 90%, сыворотка крупного рогатого скота 10%) и помещают в культуральный флакон (объем 25 мл). Флакон помещают в инкубатор с температурой 37°С, 100% влажности и 7,5% углекислоты в воздухе. Через 1 сут провод т визуальный контроль состо ни  клеток с помощью инвертированного микроскопа и к содержимому флакона прибавл ют 15 мл ростовой среды. На 4-е сутки после размораживани  клетки пересевают в разведении 1:5 и перенос т во флакон объемом 250 мл. Через 2 сут берут пробу дл  подсчета клеток -- в 1 мл суспензии содержитс  800 тыс. гибридомных клеток. Суммарное содержание клеток в культуре 120 мин, что составл ет 24 прививочные дозы. Клетки осаждают центрифугироаани

ем (1000 об/мин, 20 мин), суспендируют в среде Хенкса и ввод т по 5 млн в объеме 2 мл внутрибрюшинно мышам - межлинейным гибридам F1(SJL/JxBALB/c), получив- шим за 11 дней до прививки внутрибрю- шинную инъекцию пристана.

П р и м е р 2. Получение гибридомных асцитических жидкостей и выделение из них глобулиновой фракции, содержащей МКАТ.

0 Накопление асцита в брюшной полости мышей начинаетс  на 11-й день после прививки клеток. На 14-й день проводитс  перва  пункци . При этом от каждых 10 мышей получатот 45-50 мл асцита. На 17-й день

5 повторно пунктируют оставшихс  в живых мышей и получают от них еще 40-45 мл асцита. К 20-му дню остаетс  в живых 50% привитых мышей. В результате третьей пун кции от них получают 10-15 мл асцита. 060 щее количество асцита, получаемое от 10 мышей, составл ет 105-110 мл. После образовани  фибринового сгустка и отделени  его и клеточной массы с помощью центрифугировани  из 110 мл асцита получают 100

5 мл надосадочной жидкости, из которой выдел ют глобулиновую фракцию. Дл  этого к жидкости приливают по капл м в услови х непрерывного перемешивани  равный объем насыщенного раствора сульфата ам0 мони  с рН 7,0. Осадок отдел ют центрифугированием (6000 об/мин, 15 мин), надосадок отбрасывают, а осадок растао- . р ют в дистиллированной воде, довод  объем раствора до исходного. Процедуру

5 высаливани  повтор ют, полученный осадок суспендируют в половинном объеме полунасыщенного сульфата аммони  и в таком виде хран т при 4°С.

П р и м е р 3, Получение содержащих

0 МКАТ культуральных жидкостей при выращивании клеток гибридом на среде с низким содержанием сыворотки.

Источники клеток служит гибридомный штамм, хран щийс  в жидком азоте. Клетки

5 размораживают и высевают, как описано в примере 1. Через 1 сут контролируют состо ние клеток с помощью инвертированного микроскопа и определ ют их содержание в культуре с помощью камеры Гор ева. Сус0 пензи  содержит 400 тыс. клеток в 1 мл. При первом пересеве к. 10 мл культуры добавл ют 10 мл ростовой среды, содержащей 10% сыворотки. Через 1 сут культуру раздел ют на две части: первую оставл ют без

5 пересевов до перероста дл  определени  титра МКАТ, к второй прибавл ют 10 мл бессывороточной среды, в результате концентраци  сыворотки снижаетс  до 5%. Через 2 сут взвесь клеток, выросших на среде с 5% сыворотки, раздел ют на три части,

Первую оставл ют без рассева до перероста дл  определени  титра МКАТ. Вторую часть четырехкратно пересевают на среде с 5% сыворотки (каждые 3 дн  с коэффициентом 1:4) и затем оставл ют до перероста дл  определени  титра МКАТ. Третью часть пересевают с одновременным снижением концентрации сыворотки до 2,5%. На 3-й сутки культуру раздел ют на две части: первую оставл ют до перероста, во второй содержание сыворотки снижают до 1,25% и спуст  6 дней из нее берут пробу дл  определени  титра МКАТ.

Данные определени  титров МКАТ на всех стади х процесса приведены в табл. А.

П р и м е р А. Определение титра мышиных антител против IgE человека.

Источником мышиных антител против IgE служат: сыворотка крови мышей, иммунизированных IgE человека; культуральна  жидкость от растущих гибридомных клеток; асцитическа  жидкость мышей с растущими гибридомными опухол ми; глобулинова  фракци  содержащих МКАТ асцитических жидкостей.

Титр антител против IgE человека определ ют с помощью твердофазного иммуно- ферментного анализа. Реакцию провод т в четыре этапа. На всех этапах дл  промывани  и разбавлени  реагентов используют раствор, содержащий 0,85% хлористого натри , 0,01 М фосфатного буфера с рН 7,4 и 0,05% твина-20.

На первом этапе на твердую фазу адсорбируют антиген. Дл  этого в  чейки планшетов дл  иммуноанализа внос т по 100 мкл раствора, содержащего 10 мкг IgE/L в 1 мл карбонат-бикарбонатного буфера (0,01 М, рИ 9,5). Инкубируют не менее 10 ч при 4°С. Удал ют антиген из  чеек и однократно промывают. На втором этапе в лунках планшетов готов т серийные разведени  исследуемых образцов объемом по 100 мкл, инкубируют 1 ч при 37°С, лунки освобождают от проб и трижды промывают.

На третьем этапе к св занным на твердой фазе мышиным антителам присоедин ют меченые пероксидазой кроличьи антитела против иммуноглобулинов мышей, В лунки внос т по 100 мкл рабочего разведени  конъюгата, инкубируют 45 мин при 37°С, удал ют конъюгат и 5-кратно промывают .

На последнем этапе с помощью цветной реакции вы вл ют активность перокси- дазы, св завшейс  с твердой фазой. В лунки внос т по 100 мкл субстратной смеси (1 мг ортофенилендиамина и 2 мкл 33%-ной перекиси водорода в 10 мл 0,05 М цитратного буфера с рН 4,7), инкубируют 30 мин при

комнатной температуре в темноте и затем реакцию останавливают добавлением 50 мкл 2н серной кислоты, Оптическую плотность проб регистрируют на фотометре

Мультискан-МС при длине волны 492 нм. Результаты представлены в табл. 5.

П р и м е р 5. Использование МКАТ Е/4Ф4 в качестве меченого реагента дл  количественного определени  содержани 

0 IgE в сыворотке крови человека.

Концентрацию IgE в сыворотке крови определ ют с помощью двухдетерминант- ного твердофазного иммуноанализа. Дл  захвата IgE из раствора служат иммобили5 зованные на твердой фазе lgE-специфич- ные поликлональные антитела, производимые НПО Аллерген, (г. Ставрополь) или моноклональные антитела, синтезируемые гибридомным клоном РИ-8Е/5Д4. МКАТ

0 8Е/4Ф4, меченые пероксидазой, используют дл  вы влени  IgE, включенного в иммунный комплекс. Реакцию провод т в полистироловых планшетах фирмы NUNC. Дл  разбавлени  реагентов и отмывани 

5 планшетов от несв завшихс  компонентов используют раствор того же состава, что в примере 4.

На первом этапе в лунки планшета внос т раствор МКАТ 8Е/5Д4 или поликлональ0 ных антител, содержащий 5 мкг белка в 1 мл 0,01 М карбонат-бикарбонатного буфера, рН 9,5. Инкубируют в течение ночи при 4°С, затем раствор удал ют и лунки однократного промывают.

5 На втором этапе в лунки внос тобрэзцы исследуемых сывороток и растворы с известным содержанием IgE, предназначенные дл  построени  калибровочной кривой (калибраторы фирмы Pharmacia). Инкубируют

0 при 37°С 1 ч, образцы удал ют и лунки трехкратно промывают.

На третьем этапе в лунки внос т рабочее разведение конъюгата, МКАТ Е/4Ф4 с пероксидазой, инкубируют 1 ч при 37°С,

5 раствор удал ют, планшет промывают п тикратно .

На четвертом этапе в лунки внос т субстратную смесь дл  вы влени  активности пероксидазы. Состав смеси приведен в при0 мере 4.

Инкубируют 30 мин в темноте при комнатной температуре, реакцию останавливают серной кислотой и измер ют оптическую плотность проб при длине волны 492 нм (по

5 примеру 4).

На основании полученных данных стро т калибровочную кривую. По оси абсцисс откладывают концентрацию IgE в МЕ/мл, по оси ординат - оптическую плотность проб (фиг. 1). Пользу сь калибровочной кривой и учитыва  коэффициент разведени  исследуемых сывороток, определ ют содержание в них IgE (табл. 6).

П р и м е р 6. Использование иммобилизованных на твердой фазе МКАТ Е/4Ф4 дл  количественного определени  содержани  IgE в сыворотке крови человека.

Концентрацию IgE в сыворотке крови определ ют с помощью двухдетерминант- ного иммунометрического анализа. МКАТ 8Е /4Ф4, иммобилизованные на твердой фазе , служат дл  захвата антигена из образца. Дл  вы влени  IgE, включенного в иммунный комплекс, используют меченные перок- сидазой lgE-специфичные поликлональные антитела, выпускаемые НПО Аллерген или моноклональные антитела, синтезируемые гибридомным клоном РИ-8Е/5Д4. Реакцию провод т в полистироловых планшетах фирмы NUNC. Дл  разбавлени  реагентов и отмывани  планшетов от несв завшихс  компонентов используют раствор того же состава, что в примере 4

На первом этапе в лунки планшета внос т раствор МКАТ 8Е/4Ф4, содержащий 5 мкг белка в 1 мл 0,01 М карбонат-бикарбо- натного буфера, рН 9,5. Инкубируют в течение ночи при 4°С, затем раствор удал ют и лунки однократно промывают.

На втором этапе готов т разведение исследуемых сывороток (1:10 или 1:100 в данном примере) и растворы с известным содержанием IgE, предназначенные дл  построени  калибровочной кривой (использовали калибратор фирмы Pharmacia). Внос т образцы (в дубл х) в лунки планшетов и инкубируют при 37°С 1 ч, затем лунки освобождают от раствора и промывают трехкратно

На третьем этапе готов т рабочее разведение конъюгата МКАТ 8Е/5Д4 с перокси- дазой (1:10000) и внос т в лунки планшета. Инкубируют 1 ч при 37°С, раствор удал ют, планшет промывают п ть раз.

На четвертом этапе в лунки внос т субстратную смесь дл  вы влени  активности пероксидазы. Состав смеси приведен в примере 4. Инкубируют 30 мин в темноте при комнатной температуре, останавливают реакцию добавлением серной кислоты и измер ют оптическую плотность проб при длине волны 492 нм (по примеру 4).

На основании полученных данных стро т калибровочную кривую: по оси абсцисс (логарифмическа  шкала) откладывают концентрацию IgE в МЕ/мл, а по оси ординат - оптическую плотность соответствующих проб (фиг. 2). Пользу сь калибровочной кривой и учитыва  коэффициент разведени 

исследуемых сывороток, определ ют содержание в них IgE (табл. 7).

Пример. Вы вление с помощью МКАТ Е/4Ф4 фракции аллергенспецифичного IgE в сыворотке крови человека.

Аллергенспецифичные антитела определ ют с помощью аллергосорбентного теста , при котором вначале содержащиес  в сыворотке антитела вступают в соединение

с иммобилизованным на твердой фазе аллергеном , а затем включенные в иммунный комплекс анитела класса IgE вы вл ютс  с помощью меченых пероксидазой МКАТ Е/4Ф4 .

Раствор аллергена амброзии (НПО Аллерген ) - 40 мкг в 1 мл 0,01 М карбонат7би- карбонатного буфера рН 9,5 внос т в лунки полистироловых планшетов фирмы NUNC и инкубируют 18ч при 4°С. Удал ют аллерген,

а лунки промывают раствором того хе состава , что приведен в примере 4.

Готов т разведени  стандартных сывороток (выпускаемых НПО Аллерген). Стандартную позитивную сыворотку используют

цельной, а также в разведени х. 1:5, 1:25 и 1:50. Негативную сыворотку используют в цельном виде. Исследуемые сыворотки и образцы контрольных сывороток в обозначенных разведени х внос т по 200 мкл в лунки

планшета, в которые предварительно было внесено по 200 мкл развод щего раствора (например 4). Инкубируют 1 ч при 37°С. затем жидкость удал ют и лунки промывают 4 раза.

Рабочее разведение конъюгата пероксидазы и МКАТ внос т в объеме 200 мкл в лунки, инкубируют 1 ч при 37°С, отмывают 5-кратно, после чего в лунки внос т по200 мкл субстратной смеси (состав приведен в примере 4), инкубируют при комнатной температуре в темноте 30 мин. Остановку реакции и регистрацию оптической плотности провод т , как в примере 4. О содержании IgE, специфичного к аллергену, суд т по оптической плотности исследуемых образцов в сравнении с оптической плотностью стандартных сывороток. На основе результатов, представленных в табл. 8, содержание специфического IgE в исследованных сыворотках оценено следующим образом: очень высокое (4-й класс) - в сыворотках 2 и 4; среднее (2-й класс)- в сыворотке 1; низкое (1-й класс) - в сыворотках 3 и 6; антитела не определ ютс  в сыворотке 5.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК(П) Nk 402 D - продуцент моноклональных антител к IgE человека.

   Таблице 1

   + +

   Примечание, V - антитела св зываютс  с антигеном; - - отсутствие реакции между антителами и антигеном. При тестировании использованы препарата IgG и IgH мз донорской сыворотки. Легкие цепи каппа- и л мбда-типов выделены из мочи пациентов с множественной иивломой,

   1ТаблицаЗ

   Примечание, Определение IgE прочод т в пуле иэ 13 сывороток от аллергических больных, Разведение образца 1:10.

   ,3 - L

   Примечание. Представлены средние и предельные (в скобках) значени  обратных титров, полученные дл  6-9 отдельных культур.

   Таблица 2

   Таблица 5

   имечание.

   Представлены средние показатели обратных титров НКАТ, полученные при анализе 4-6 образцов.

   Этап

   Сущность этапа анализа

   1Иммобилизаци  МКАТ-1 против IgE на твердой фазе

   2Инкубаци  с исследуемыми об- . разцами, содержащими IgE,

   формирование иммунного комплекса МКАТ-1/IgE на твердой фазе

   3Инкубаци  с МКАТ-11 против IgE, меченными ферментом, изотопом или флуорохромом

   1) Про вление реакции - вы вление метки, фиксированной на

   Примечание. После каждого из указанных этапов

   производитс  отмывание от компонентов не св завшихс  с твердой фазбй.

   Т а б л и

   чание.

   Определение содержани  IgE в НЕ/мл в сыворотках проведено с помощью калибровочной кривой , представленной на фиг.2,

   JLuJL-QJu-y.---Схематическое изображение

   X У Y

   ЈЈi III

   Инкубаци  с сывороткой, тестируемой на присутствие lgE-антител, формирование иммунных комплексов сывороточных антител с аллергеном

   Инкубаци  с МКАТ против IgE, меченными ферментом или изотопом, формирование иммунного комплекса МКАТ и IgE, св занного с аллергеном

   Вы вление ферментной или изотопм ной метки, св занной на твердой фазе

   Примечание. После каждого из указанных этапов

   производитс  отмывание от компонентов , не св завшихс  с твердой фазой.

   ДД/А#/;да

   г/

   W

   JUUUL

   оп/ь гпт

   2,0

   w