JP3550410B2 - 好塩基球に結合するモノクローナル抗体、好塩基球の分離方法、好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離方法、及び好塩基球由来ケミカルメディエーター遊離試験法 - Google Patents
好塩基球に結合するモノクローナル抗体、好塩基球の分離方法、好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離方法、及び好塩基球由来ケミカルメディエーター遊離試験法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、（１） 好塩基球と反応し、（２） 担体固相化後も抗体活性を保持し、（３） 該好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離を阻害せず、さらに（４） 該好塩基球の非特異的なヒスタミン遊離を誘発しないモノクローナル抗体、および該モノクローナル抗体が担体に固相化した固相化モノクローナル抗体を提供する。さらに本発明は、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体を用いる体液からの好塩基球の分離方法、該分離方法により分離した好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離方法、及び好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離試験法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
白血球の一種である好塩基球はＩｇＥの標的細胞であり、その顆粒中にヒスタミンを始めとする種々の化学伝達物質（ケミカルメディエーター）を貯蔵し、肥満細胞とともにアレルギー反応の中心的存在として注目されている。
【０００３】
通常、好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離機序は大きく２つに分けられる。
その１つは好塩基球の膜表面のレセプターに結合したＩｇＥ同志がアレルゲンや抗ＩｇＥ抗体により架橋され、その刺激により脱顆粒反応がおこりケミカルメディエーターが遊離するというもので、アレルギー反応による遊離がこれに相当する（以下、ＩｇＥを介した特異的なケミカルメディエーター遊離、と記す）。もう１つは、その遊離機序や意義は明らかにされていないが、直接好塩基球膜表面のＩｇＥを架橋することなく生じる遊離で、対応するＩｇＥを介した特異的な遊離反応に照らして、抗ＩｇＥ抗体や、アレルゲンの非存在下でも起こるものである（以下、非特異的なケミカルメディエーター遊離、と記す）。
【０００４】
アレルギー疾患の診断や病態解析にはＩｇＥを介した特異的なケミカルメディエーター遊離を試験することが有用であり、その代表的な試験としてヒスタミン遊離試験がある。ヒスタミンはＩ型アレルギー反応を引き起こす特に重要なケミカルメディエーターであり、気管支平滑筋の収縮、血管透過性の亢進などの諸反応を惹起することが知られている。ヒスタミン遊離試験は、ヒト末梢血中の好塩基球表面にレセプターを介して結合した免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）を、種々のアレルゲンと反応させることにより、これに伴って遊離したヒスタミン量を測定する生物学的反応を利用した特徴ある検査法であり、他のアレルゲン同定法である特異ＩｇＥ試験（ＲＡＳＴ）、皮膚試験等と異なって、アレルギー患者の原因アレルゲン探索のより臨床症状に近い方法として有用である。
【０００５】
この末梢血を用いるヒスタミン遊離試験には全血を用いる方法と、洗浄白血球を用いる方法がある。全血法は、患者のアレルギー状態を総合的に把握する上で有用と考えられているが、好塩基球以外の他の血清成分がヒスタミン遊離の測定に影響を及ぼす可能性がある。このため、薬剤などの作用機序を研究したり、ヒスタミン遊離機構の基礎的研究をする場合など、正確な好塩基球の反応性を分析する場合には、通常洗浄白血球を用いる。しかし、洗浄白血球を分離するためには、デキストラン溶液にて赤血球を除去した後、２〜３回の遠心を伴った洗浄を行い、更に白血球数を調整するなどの煩雑な操作が必要であり、このため検査に必要な血液量も多くなり、日常検査として利用するには多くの難点がある。
【０００６】
また、好塩基球の脱顆粒反応と共に放出される物質の中には、ロイコトリエンや血小板活性化因子（ＰＡＦ）などの、強力な血管透過性亢進作用・白血球遊走能を示すケミカルメディエーターの存在が知られており、アレルギーの病態解析を目的として、これら種々の好塩基球由来ケミカルメディエーターが基礎研究対象物質となってきている。しかし、これらのケミカルメディエーターは血液中に放出された場合速やかに代謝されてしまうものが多く、これらの測定を行う際には特に試料の取り扱いを迅速かつ厳密に行うことが重要な要件となってくる。このような好塩基球由来ケミカルメディエーターの多くは、現在分析が非常に難しい。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離には、アレルギー反応によるＩｇＥを介した特異的な遊離と、それ以外の非特異的な遊離があり、アレルギー疾患の診断にはＩｇＥを介して特異的に遊離されたケミカルメディエーターを測定することが必要である。しかし、前述のように血清成分の影響を受けることなくヒスタミン遊離試験を行うためには白血球を分離しなければならないため、煩雑な操作と多量の血液が必要であり、日常の検査には不向きである。さらに、ヒスタミン以外のケミカルメディエーターについても試料の取り扱いが煩雑であるので現在分析を行うのが困難な状況である。
【０００８】
そこで本発明者らは、血液中から好塩基球を分離し、ヒスタミン等の遊離試験に用いれば上記の問題を解決できるのではないかと考え研究を行った。
これまで、好塩基球の分離・精製法としては、比重遠心法で予め好塩基球の密度を高めた試料から好塩基球以外の細胞成分に反応する抗体を結合した磁性粒子を用いて不純物細胞を除くことにより好塩基球の精製を行うＰ．Ｊ．フレデリック（Ｐ． Ｊ． Ｆｒｅｄｅｒｉｋ）らの方法 ［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ） １４９， ２０７ （１９９２）］ 等がある。
しかし、この方法は目的とする好塩基球そのものを分離する精製法ではなく、夾雑物を除去することによる精製法であるので、効率が悪い上に操作性も煩雑である。
【０００９】
一方、好塩基球そのものに反応する抗体も多数知られており ［例えば、Ｐ．バレント（Ｖａｌｅｎｔ）ら、インターナショナル・アーカイブズ・アレルギー・アプライド・イムノロジー（Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ） ９１， １９８ （１９９０）］ 、またヒト好塩基球に対して特異的な反応を示すモノクローナル抗体も報告されている ［Ｍ．Ｐ．ボジャー （Ｂｏｄｇｅｒ） ら、ブラッド （Ｂｌｏｏｄ） ６９， １４１４ （１９８７）］ 。しかし、かかる好塩基球反応性抗体を固相担体に結合させ、ヒト好塩基球の分離に利用した試みの成功例は知られておらず、したがって、当然にそのような方法で分離したヒト好塩基球をヒスタミンなどのケミカルメディエーター遊離試験に用いた例も見られない。
【００１０】
この事実は、好塩基球反応性抗体を固相担体に結合させることによる好塩基球反応性の喪失等による失敗も考えられる（後述実験例１（１））が、最も大きな原因は、かかる好塩基球反応性抗体を利用して分取された好塩基球がダメージを受けており、ＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離が阻害される場合〔例えば、Ｐ．Ｊ．フレデリックら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ） １４９， ２１３ （１９９２）、及びＪ．Ｔ．シュレーダー（Ｊ． Ｔ． Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ） ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ） １３３， ２６９ 〜２７７ （１９９０）〕やＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離に比して非特異的ヒスタミン遊離が著しく高くなったため、ヒスタミン遊離反応の定量等の使用に耐え得なくなっている場合が多いことが考えられる（後述実験例１（２））。Ｐ．Ｊ．フレデリックらが、好塩基球以外の細胞成分と反応する抗体を用いて好塩基球の精製を行うという一見迂遠な方法を採ったのも上述の欠点を回避するためであったと解される。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
しかしながら、好塩基球そのものをターゲットとし好塩基球反応性抗体を用いて好塩基球の分離精製を行うことができれば、簡易かつ高精度の精製が達成可能となるはずである。
そこで、本発明者らは、かかる目的に使用し得る抗体すなわち好塩基球と反応するモノクローナル抗体であって、固相担体と結合した後も好塩基球に対する反応性を有し、かつ、好塩基球と結合後も当該好塩基球にダメージを与えることのない、すなわちＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離にも非特異的ヒスタミン遊離にも有意の影響を与えることのない特性を有するモノクローナル抗体の探索を鋭意行った。その結果、目的のモノクローナル抗体の調製に成功した。そして、かかる抗体を担体に固相化して体液と反応させ、該モノクローナル抗体により該体液中の好塩基球を捕捉した後、未反応の体液を除去することにより容易に好塩基球を分離する方法を確立し、分離した好塩基球にアレルゲンまたは抗ＩｇＥ抗体を反応させてヒスタミンを遊離させることに成功した。さらに本発明者らは、該抗体を用いて分離した好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離試験法を確立して、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の性質を有するモノクローナル抗体を提供する。
（１） 好塩基球と反応する、
（２） 担体固相化後も抗体活性を保持する、
（３） 該好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離を阻害しない、
（４） 該好塩基球の非特異的なヒスタミン遊離を誘発しない、
【００１３】
本発明が提供する上記（１） 、（２） 、（３） および（４） の性質を有するモノクローナル抗体において、（１） 好塩基球と反応する、とは該モノクローナル抗体が好塩基球の表面抗原と反応することを意味する。
【００１４】
また、（２） 担体固相化後も抗体活性を保持する、とは該モノクローナル抗体を担体に結合させた後も好塩基球の捕捉能を失わないことを意味する。該担体としては、例えば、ガラスまたは合成樹脂製の粒状物（ビーズ）あるいは球状物（ボール）、チューブ、プレート、マグネチックビーズのような磁性粒子など、通常抗体を固相化するときに用いる担体であれば全て用いることができるが、好ましくは磁性粒子を用いるのが良い。
【００１５】
固相化抗体の好塩基球捕捉能は、固相化したモノクローナル抗体が好塩基球と結合したか否かを検定することにより判定され、具体的にはヒスタミンを指標とし、次のような方法により行う。まず、マグネチックビーズに固相化した、ヒト好塩基球と反応するモノクローナル抗体をヒト血液と反応させる。次いで磁石でビーズを集めて上清を除いた後、ヒスタミン遊離用緩衝液（塩化カルシウム、塩化マグネシウム等を含むＨＥＰＥＳ緩衝液）を加え凍結融解を数回繰り返し、その上清の総ヒスタミン量を既知の方法、例えばＨＰＬＣ法によるヒスタミン測定システム ［ Ｙ．ツルタ （Ｔｓｕｒｕｔａ）ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．） ２２４， １０５ （１９８１）］ （島津製作所）により測定し、ヒスタミンが検出された抗体を好塩基球捕捉能を有する抗体として選択する。
【００１６】
また、（３） 該好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離を阻害しないとは、該モノクローナル抗体と結合した好塩基球が、血液中で本来有するＩｇＥを介した特異的ヒスタミン遊離能を実質的に維持していることを意味する。
実質的に維持するか否かは、本発明において発見されたモノクローナル抗体ＢＡ３１２との比較実験によって確認することができる。すなわち、ＢＡ３１２により捕捉された好塩基球は血液中で本来有するヒスタミン遊離能を維持している（後述実験例２）から、被検固相化モノクローナル抗体を固相化ＢＡ３１２と同条件で好塩基球と反応させ、得られた両モノクローナル抗体結合好塩基球を同条件下で抗ＩｇＥ抗体処理を行い遊離されたヒスタミン量がＢＡ３１２のそれの６０％以上である場合に当該モノクローナル抗体は「該好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離を阻害しない」ものと判定し、本発明の対象となると決定する。
【００１７】
さらに、（４） 該好塩基球の非特異的なヒスタミン遊離を誘発しない、とは該モノクローナル抗体と結合した好塩基球からの非特異的なヒスタミン遊離の量が、ＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離の量の３０％以下であることを意味する。
【００１８】
非特異的なヒスタミン遊離の量は、該好塩基球に適当な溶媒、例えば塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等を含むヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ヒスタミン遊離用緩衝液）を加え１０〜５０℃で１０〜６０分間反応させることにより遊離するヒスタミンの量を既知の方法、例えばＨＰＬＣ法により測定することにより得ることができる。
【００１９】
ＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離の量は、該好塩基球とヒスタミン遊離用緩衝液で調製した抗ＩｇＥ抗体とを上と同一の温度・反応時間の下で反応させることにより遊離するヒスタミンの量を、上と同一の方法・条件の下で測定することにより得ることができる。
【００２０】
以下に本発明のモノクローナル抗体の作製方法を簡単に示す。
（１） ハイブリドーマの調製
マウスをヒト好塩基球で免疫する。免疫は、ヒト好塩基球を数週間おきにマウスの腹腔、皮下、または静脈に数回繰り返し接種することにより行う。免疫されたマウスから抗体産生細胞を得、これと骨髄腫細胞を融合しハイブリドーマを作製する。得られたハイブリドーマの内ヒト好塩基球に反応する抗体を産生するハイブリドーマのウエルを選択する。
【００２１】
選択されたハイブリドーマをクローニングし、出現したハイブリドーマクローンの産生した抗体を、ヒツジ抗マウス免疫グロブリン抗体が予め結合してあるマグネチックビーズに結合した後、ヒト血液中の好塩基球の捕捉能、及び分離した好塩基球のヒスタミン遊離に関する特性を検定する。
捕捉能の検定は、前述の方法で行うことができる。
【００２２】
分離した好塩基球のヒスタミン遊離に関する特性の検定は、捕捉能の検定と同様マグネチックビーズに固相化した該抗体をヒト血液と反応させ、磁石でビーズを集めて上清を除いた後、前述の方法に従って非特異的なヒスタミン遊離の量とＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離の量を測定し、ＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離が阻害されず、かつ非特異的なヒスタミン遊離が促進されていない抗体すなわち非特異的なヒスタミン遊離の量がＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離の量の３０％以下、好ましくは１０％以下となった抗体を選択する。
【００２３】
このようにして、担体に結合後も抗体活性を失わず好塩基球の捕捉能を有しており、かつ分離した好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離を阻害せず、かつ非特異的なヒスタミン遊離を誘発しない抗体を産生するハイブリドーマクローンを選択し、これを培養してモノクローナル抗体を回収する。
【００２４】
上記の免疫法、細胞融合法、融合細胞の選択、クローニングなどは公知の通常の方法によって行うことができる。
【００２５】
（２） モノクローナル抗体の作製
選択したハイブリドーマをインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）培養法、またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ） 培養法により増殖させ、モノクローナル抗体を得る。インビトロ培養法としては、ハイブリドーマを牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地（完全ＲＰＭＩ培地）で増殖限界になるまで培養し、その培養上清を回収することによってモノクローナル抗体を得ることができる。インビボ培養法としては、予めプリステンを腹腔内投与処理したマウスの腹腔にハイブリドーマを移植し、数週後にマウスの腹部肥大を確かめてその腹水を採取し、腹水からＩｇＧ、若しくはＩｇＭ画分を硫安分画、ＤＥＡＥセファロースカラム等の既知の方法を適宜組み合わせて分離・精製することによってモノクローナル抗体を得ることができる。
【００２６】
上記方法により得られた本発明のモノクローナル抗体ＢＡ１０１、ＢＡ２０、ＢＡ１３５、およびＢＡ３１２を産生するハイブリドーマは、１９９２年９月１０日から、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）にある通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に、それぞれ「ＢＡ１０１シオノギ」（微工研条寄第４００４号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４００４）、「ＢＡ２０シオノギ」（微工研条寄第４００５号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４００５）、「ＢＡ１３５シオノギ」（微工研条寄第４００６号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４００６）、「ＢＡ３１２シオノギ」（微工研条寄第４００７号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４００７）として、ブダペスト条約に基づき寄託されている。
このように本発明のモノクローナル抗体は、例えば寄託されたハイブリドーマにより産生されるものが挙げられるが、上述した （１）〜（４） の性質を有しているモノクローナル抗体であればいずれも本発明の範囲である。好ましくはモノクローナル抗体ＢＡ３１２が用いられる。
【００２７】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト好塩基球を含む白血球と反応し、ヒト赤血球とは反応しない。さらに本発明のモノクローナル抗体は、担体に固相化した後も好塩基球を充分に捕捉することができ、捕捉した好塩基球の非特異的なケミカルメディエーターの遊離を誘発せず、ＩｇＥを介した特異的なケミカルメディエーター遊離を阻害しない。また、本発明のモノクローナル抗体は、前記のような担体に結合させて得られる固相化モノクローナル抗体として有利に用いることができる。モノクローナル抗体を担体に結合させて固相化させる方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法、例えば〔Ｔ．リー（Ｌｅａ）ら、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．） ２２， ２０７ （１９８５）］により行うことができる。例えば、モノクローナル抗体をアンコーテッド、又はトシル基のような化学的活性基を持つ化合物または抗マウス免疫グロブリンでコートされた固相担体と０〜５０℃、好ましくは４〜４０℃で５分〜７２時間、好ましくは３０分〜４８時間反応させる。
【００２８】
本発明はまた、前記のようにして得られる本発明の固相化モノクローナル抗体と体液とを反応させ、該体液中の好塩基球を該固相化モノクローナル抗体に結合させて捕捉することを特徴とする、好塩基球の分離方法を提供する。
【００２９】
該体液としては、血液、鼻汁、涙液、唾液などが挙げられるが、好ましくは血液を用いる。
【００３０】
ところで磁性粒子に抗体を結合させて目的の細胞を分離する方法は、Ｇ．ゴーダーナックらの報告 ［Ｇ．ゴーダーナック （Ｇａｕｄｅｒｎａｃｋ） ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド （Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ） ９０， １７９ （１９８６）］など、広く知られている。また、比重遠心法で予め好塩基球の密度を高めた試料から、好塩基球以外の細胞成分に反応する抗体を結合した磁性粒子を用いて不純物細胞を除くことにより好塩基球の精製を行う方法も、Ｐ．Ｊ．フレデリックらにより報告されている ［Ｐ．Ｊ．フレデリック （Ｆｒｅｄｅｒｉｃ） ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド （Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ） １４９， ２０７ （１９９２）］ が、本発明とは、好塩基球に対する抗体を用いるのか、好塩基球以外の細胞に対する抗体を用いるのかという部分で本質的な相違がある。
【００３１】
一方、本発明の好塩基球の分離方法は、本発明のモノクローナル抗体を担体、例えば磁性粒子に、直接または抗マウス免疫グロブリンを介して固相化して抗体結合磁性粒子とし、これを体液、好ましくは血液と０〜５０℃、好ましくは１５〜４０℃で短時間（１〜６０分）反応させた後、磁石を用いて磁性粒子を引き寄せて未反応の試料を除去するという簡便な操作で好塩基球を高濃度で含む細胞集団を調製分離することができる。
【００３２】
本発明はまた、本発明の好塩基球の分離法により分離した好塩基球をアレルゲンまたは抗ＩｇＥ抗体と反応させることを特徴とする、該好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離方法を提供する。
【００３３】
アレルゲンとしては、室内塵や花粉などの吸入性アレルゲンや、食肉や卵などの食餌性アレルゲンをはじめとして、その他化学物質など、通常アレルギー診断で用いられるものを、適宜必要に応じて用いることができる。
【００３４】
該好塩基球とアレルゲンまたは抗ＩｇＥ抗体との反応は１０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃で０．５〜３００分間、好ましくは１０〜６０分間行う。
【００３５】
本発明はさらに、以下の（１） 〜（３） の工程よりなる好塩基球からのケミカルメディエーター遊離試験法を提供する。
（１） 本発明の固相化モノクローナル抗体と体液とを反応させ、該体液中の好塩基球を該固相化モノクローナル抗体に結合させて捕捉し、該好塩基球を分離する工程、
（２） 工程（１） で分離した好塩基球をアレルゲンまたは抗ＩｇＥ抗体と反応させて好塩基球からケミカルメディエーターを遊離させる工程、および
（３） 工程（２） で好塩基球から遊離したケミカルメディエーターの量を測定する工程、
【００３６】
上記（１） および（２） はそれぞれ前記の本発明の好塩基球の分離方法および好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離方法に従って行うと良い。
【００３７】
上記（３） の遊離したケミカルメディエーターの量の測定は、目的とするケミカルメディエーターに応じて、適宜既知の方法により測定すればよい。例えば、ヒスタミンの場合はＨＰＬＣ法によるヒスタミン測定システム ［ Ｙ．ツルタ （Ｔｓｕｒｕｔａ）ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー （Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．） ２２４， １０５（１９８１）］（島津製作所）により、ロイコトリエンおよびＰＡＦの場合は、ぞれぞれ〔Ｅ．ヘイズ（Ｈａｙｅｓ）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３１， ４２９ （１９８３）、及び〔Ｍ．Ａ．スマル（Ｓｍａｌ）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ） １２８， １８３ （１９９０）〕により測定することができる。即ち、ＨＰＬＣによるヒスタミンの測定は、例えば次のようにして行う。陽イオン交換樹脂を充填したカラムに試料を通じ、分離溶出したヒスタミンに０．１％オルソフタルアルデヒドとＮａＯＨを加えて４５℃で反応し、ヒスタミンを蛍光体とする。つぎにＨ２ ＳＯ４ と反応させ、蛍光体の安定化と蛍光強度の増強を行った後、蛍光強度を測定する。
【００３８】
また、ＲＩＡによるロイコトリエンの測定は、試料または標準の非標識ロイコトリエン、抗ロイコトリエン抗体、３ Ｈ標識ロイコトリエンを４℃、５ 〜２４時間反応させた後、デキストランコーテッドチャーコールと氷中１０分間反応させる。遠心後、上清を分取し、放射活性を測定する。
また、ＲＩＡによるＰＡＦの測定は、試料または標準の非標識ＰＡＦ、抗ＰＡＦ抗体、１２５ Ｉ標識ＰＡＦと二次抗体を室温で５〜２４時間反応させた後、遠心分離で得られた沈さの放射活性を測定する。
また、ヒスタミンの測定法についても、ＲＩＡによって測定することができる。ＲＩＡで測定する場合、例えば試料または標準の非標識ヒスタミン、抗ヒスタミン抗体、１２５ Ｉ−標識ヒスタミンを０〜４０℃、好ましくは０〜１０℃で５分〜４８時間、好ましくは３０分〜２４時間反応させる。その後Ｂ／Ｆ分離剤、例えばポリエチレングリコールを加えて氷中１０分間反応を行い、遠心で得られた沈さの放射活性を測定する。
【００３９】
さらに、ヒスタミンの測定法としてＥＩＡによって行うこともできる。即ち、サンドイッチ法、競合法、ＥＬＩＳＡなど公知の酵素免疫測定法は全て用いることができるが、好ましくは例えば、クノックスバンバイク（Ｋｎｏｘ Ｖａｎ Ｄｙｋｅ）らによって報告される方法（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ２〜１０， １９９０） に従って測定する。すなわち、試料、ビオチン標識した標準ヒスタミン、酵素標識抗ヒスタミン抗体の混合物を、アビジンを固相化した担体と反応させる。洗浄後、アビジン固相化担体に結合した、ビオチン標識ヒスタミン−酵素標識抗ヒスタミン抗体複合体の酵素活性を測定する。担体および酵素は、酵素免疫測定法で通常用いられるものは全て用いることができる。好ましくは担体としてはマイクロプレート、酵素としては西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いる。
【００４０】
本発明の試験法においては、分離した好塩基球からの非特異的なケミカルメディエーター遊離の影響を除去するため、前述の方法に従って総ケミカルメディエーター量（総ヒスタミン量の測定方法に準じる）、および非特異的なケミカルメディエーター遊離の量も同時に測定し下記式：
【００４１】
【数１】
【００４２】
によりＩｇＥを介した特異的なケミカルメディエーター遊離率を算出することが好ましい。
【００４３】
【実施例】
以下、実施例および実験例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。
１．好塩基球に反応するモノクローナル抗体の作製
（１） 免疫
８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス２匹に、それぞれ１×１０６ 個のヒト好塩基球を腹腔内投与し、以降３週間毎に３回、それぞれ１×１０６ 個のヒト好塩基球を腹腔内投与した。
【００４４】
（２） 細胞融合
最終免疫の３日後に、２匹のマウスから脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ培地を用いて細胞浮遊液を調製した。この２×１０８ 個の脾細胞と６×１０７ 個の骨髄腫細胞ＮＳ−１とを混合し、遠沈後、沈殿に５０％ポリエチレングリコール（平均分子量４０００）１ｍｌを緩やかに撹拌しながら加え、更に１分間撹拌した。ＲＰＭＩ培地１ｍｌを１分間を要して加え、同じく１ｍｌを追加した後、更に、７ｍｌを３分間を要して加えた。遠沈後、沈殿を１５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地（完全ＲＰＭＩ培地）４０ｍｌに浮遊させ、９６穴マイクロ培養プレート４枚の各ウエルに、０． １ｍｌずつ接種し、７％炭酸ガスの存在下、３７℃で培養した。２４時間後、ヒポキサンチン１００μＭ、アミノプテリン０． ４μＭ、チミジン１６μＭを含む完全ＲＰＭＩ培地（ＨＡＴ培地）０． １ｍｌを加えた。培養開始後、２、３、５及び８日後に、培養上清０． １ｍｌを捨て、ＨＡＴ培地０． １ｍｌを加えた。１１及び１４日目に、培養上清０． １ｍｌを捨て、ヒポキサンチン１００μＭ、チミジン１６μＭを含む完全ＲＰＭＩ培地（ＨＴ培地）０． １ｍｌを加えた。計３８４の全てのウエルからハイブリドーマのコロニーが出現した。
【００４５】
（３） ハイブリドーマの選択
培養ウエル中のハイブリドーマを完全ＲＰＭＩ培地で培養し、その培養上清中の特異抗体産生の有無を次のようにして検出した。
【００４６】
ヒト末梢血２０ｍｌに、５％デキストラン生理食塩溶液を５ｍｌ加えて、赤血球を沈澱させた後、上清の白血球を分離した。この白血球から、比重１． ０７及び１． ０８に調製したパーコールを用いて、不連続比重遠心法により、比重１． ０７〜１． ０８からなる細胞を分離した。分離細胞を、アルシアンブルー法 ［Ｓ． Ｇ． ハリエット （Ｈａｒｒｉｅｔ） ら、ブラッド （Ｂｌｏｏｄ） ４６， ２７９ （１９７５）］ により染色して好塩基球数を算定し、好塩基球として４×１０５ 個／ｍｌとなるように、０． ８％塩化ナトリウム、０． ０３７％塩化カリウム、及び０． ０３％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む１０ｍＭヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７． ４）（ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液）で調製した。試験管に、好塩基球数として２×１０４ 個となるように分離細胞を分注した。これにハイブリドーマの培養上清を５０μｌ加え、３７℃で１時間反応させた。ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で１回洗浄の後、フルオレッセンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体、及びフィコエリスリン標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体の混合液５０μｌを加えて、室温で１時間反応させた。ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で１回洗浄の後、蛍光顕微鏡による観察を行い、ＦＩＴＣ標識された細胞が、フィコエリスリンによっても標識されているかどうかを判定した。このようにして、ＦＩＴＣ標識された好塩基球に対して、ハイブリドーマの培養上清に含まれるモノクローナル抗体が反応するものを、１００ウエル選択した。
【００４７】
上記の如く選択したハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングした後、フラスコ培養によりそれぞれ増殖限界まで培養を行った。この培養上清１ｍｌを、ヒツジ抗マウス免疫グロブリン抗体が予め結合してあるマグネチックビーズ１５ｍｇに加えて、緩やかな撹拌を行いながら４℃で１６時間反応させて、モノクローナル抗体固相化マグネチックビーズを得た。これらのモノクローナル抗体固相化マグネチックビーズを用いて、下記実施例４に記載の方法に従い、ヒト末梢血からの好塩基球捕捉能、及び分離された好塩基球のＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離と、非特異的なヒスタミン遊離に関する性質を調べた。その結果、前記の特性を有し、後記実験例から明らかなように、本発明のヒト好塩基球を含む細胞集団の分離と、分離細胞のヒスタミン遊離試験方法に適したモノクローナル抗体ＢＡ１０１、ＢＡ２０、ＢＡ１３５及びＢＡ３１２を産生するハイブリドーマＢＡ１０１シオノギ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００４）、ＢＡ２０シオノギ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００５）、ＢＡ１３５シオノギ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００６）及びＢＡ３１２シオノギ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００７）を選択した。
【００４８】
また、上記４種のモノクローナル抗体の属するマウス免疫グロブリンのクラスを調べた結果、ＢＡ２０、ＢＡ１０１、及びＢＡ１３５はＩｇＧ１に属し、ＢＡ３１２はＩｇＭに属することが判明した。
【００４９】
（４） モノクローナル抗体の作製
（ａ） ｉｎ ｖｉｔｒｏ 培養法
ハイブリドーマを完全ＲＰＭＩ培地で増殖限界（１×１０６ 個／ｍｌ）になるまで培養し、その培養上清を回収した。
【００５０】
（ｂ） ｉｎ ｖｉｖｏ 培養法
予めプリステン０． ５ｍｌで腹腔内投与処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０６ 個のハイブリドーマを腹腔内に移植した。約３週間後、マウスの腹部肥大を確かめて、その腹水を採取した。
【００５１】
（５） モノクローナル抗体の精製
（ａ） プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー法
前工程で得られた腹水を１８％硫酸ナトリウム溶液で塩析し、生じた沈澱を０． ０１Ｍホウ酸緩衝食塩液（ｐＨ８． ０）に溶解後、同液にて透析した。塩析により得られたモノクローナル抗体２０ｍｇを０． ０１Ｍホウ酸緩衝食塩液（ｐＨ８． ０）２ｍｌに溶かし、プロテインＡ−セファロース［ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ） ］のカラム（１． ６×５ｃｍ）に吸着させた。まず、０． ０１Ｍホウ酸緩衝食塩液（ｐＨ８． ０）約５０ｍｌで不純物を流出し、次いで０． ０１Ｍクエン酸緩衝食塩液（ｐＨ４． ０）約１００ｍｌで溶出して、精製モノクローナル抗体ＢＡ２０、ＢＡ１０１及びＢＡ１３５を得た。
【００５２】
（ｂ） セファロースＣＬ−４Ｂゲルクロマトグラフィー法
前記塩析により得られたモノクローナル抗体２０ｍｇを０． ０１Ｍホウ酸緩衝食塩液２ｍｌに溶かし、セファロースＣＬ−４Ｂ［ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ） ］のカラム（１． ６×７０ｃｍ）に通して分画し、メインピークを分取して、精製モノクローナル抗体ＢＡ３１２を得た。
【００５３】
２．モノクローナル抗体の２次抗体結合ビーズへの固相化
ダイナビーズ Ｍ−４５０ ヒツジ抗マウス免疫グロブリン［ダイナル社 （Ｄｙｎａｌ）］の３０ｍｇ・ｂｅａｄｓ ／ｍｌ懸濁液を、撹拌後１ｍｌ試験管に分取した。磁石でビーズを集め上清を除いた後、ハイブリドーマ培養上清１ｍｌを加え、緩やかな撹拌を行いながら４℃で１６時間反応を行った。磁石でビーズを集め上清を除いた後、ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で４回、４℃で３０分間ずつ緩やかな撹拌を行いながら洗浄して、モノクローナル抗体固相化マグネチックビーズを得た。
また、ハイブリドーマ培養上清の代わりに、ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で調製した精製モノクローナル抗体（２０μｇ／ｍｌ）１ｍｌを加えて、上記と同様の方法でモノクローナル抗体固相化マグネチックビーズを得た。
【００５４】
３．モノクローナル抗体のアンコーテッドビーズへの固相化
ダイナビーズ Ｍ−４５０ アンコーテッド［（ダイナル社 （Ｄｙｎａｌ）］の３０ｍｇ・ｂｅａｄｓ ／ｍｌ懸濁液を、撹拌後１ｍｌ試験管に分取した。磁石でビーズを集め、上清を除いた後、ＢＡ３１２の０． ０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９． ５）溶液（０． ３ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを加え、良く撹拌した。緩やかな撹拌を行いながら、４℃で１６時間反応を行った。磁石でビーズを集め、上清を除いた後、０． ５％ＨＳＡを含む０． ０１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７． ４）で５分間ずつ４回洗浄を行い、更にＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で４℃で１６時間洗浄を行い、ＢＡ３１２固相化マグネチックビーズを得た。
【００５５】
４．モノクローナル抗体固相化マグネチックビーズによる細胞分離と、ヒスタミン遊離反応
ＥＤＴＡ採血管に採血した健常人血液１０ｍｌに、ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液４０ｍｌを加えて２０％血液を調製した。ハイブリドーマＢＡ２０シオノギ、ＢＡ１０１シオノギ、ＢＡ１３５シオノギ及びＢＡ３１２シオノギの培養上清をそれぞれ固相化したマグネチックビーズを、ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で３ｍｇ・ｂｅａｄｓ ／ｍｌとなるように調製した。２０％血液を試験管に５００μｌずつ分注し、ここに上記ＢＡ２０、ＢＡ１０１、ＢＡ１３５及びＢＡ３１２固相化マグネチックビーズ５０μｌを加え、室温で緩やかな振盪条件下、５分間反応を行った。磁石でビーズを集め上清を除いた後、ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液５００μｌで１回洗浄を行った。洗浄終了後、０． ５ｍＭ塩化カルシウム、０． ２５ｍＭ塩化マグネシウム、０． １％グルコース、０． ９％塩化ナトリウム、０． ０３５％重炭酸ナトリウム、及び０． １％ＨＳＡを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７． ０）（ヒスタミン遊離用緩衝液）、若しくはヒスタミン遊離用緩衝液で４μｇ／ｍｌとなるように調製されたモノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体（ＨＥ−６９Ｂ）５００μｌを加えて撹拌を行った。分離細胞の総ヒスタミン量は、ヒスタミン遊離用緩衝液を加えた検体で凍結融解を３回繰り返して行ったものを検体とした。ＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離反応は、モノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体を加えた検体を、３７℃で１時間反応させて行った。また、非特異的なヒスタミン遊離反応は、ヒスタミン遊離用緩衝液を加えた検体を３７℃で１時間反応させて行った。反応終了後撹拌して、１５００ｒｐｍ×５分間遠沈した後、上清３００μｌを分取した。遊離ヒスタミン量の測定は、ＨＰＬＣ法によるヒスタミン測定システム ［Ｙ． ツルタ （Ｔｓｕｒｕｔａ） ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー （Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．） ２２４， １０５ （１９８１）］（島津製作所）により行った。
【００５６】
表１に示すように、ＢＡ２０、ＢＡ１０１、ＢＡ１３５及びＢＡ３１２固相化マグネチックビーズで分離した細胞の総ヒスタミン量を測定したところ、すべての抗体においてヒスタミンが検出され、好塩基球の分離能を有していることが分かった。また、図１に示すように分離細胞のＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離率は良好であり、なおかつ非特異的なヒスタミン遊離は、特異的なヒスタミン遊離に比較して、３０％以下に抑えられていた。
【００５７】
【表１】
【００５８】
実験例
１．ＣＤ抗体と、本発明モノクローナル抗体との比較
（１） 好塩基球捕捉能
Ｐ．バレントらの報告 ［Ｐ． バレント （Ｖａｌｅｎｔ） ら、インターナショナル・アーカイブス・アレルギー・アプライド・イムノロジー （Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．） ９１， １９８ （１９９０）］に基づいて、好塩基球表面に良く発現する抗原に反応するＣＤ抗体、即ちＣＤ９抗体（ＴＰ８２、ニチレイ社）、ＣＤ１１ｂ抗体（ＢＥＡＲ１、イムノテック社）、ＣＤ１３抗体（ＭＣＳ２、ニチレイ社）、及びＣＤ３２抗体（２Ｅ１、イムノテック社）の各抗体を用いて、上記実施例の２に示した方法により、抗体固相化マグネチックビーズの調製を行った。上記ＣＤ抗体、及びＢＡ２０、ＢＡ３１２固相化マグネチックビーズを用いて実施例の４と同様の方法により特定の細胞集団の分離を行い、分離細胞由来の総ヒスタミン量を測定した。
【００５９】
表２に示すように、ＣＤ９抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、及びＢＡ２０、ＢＡ３１２では良好な好塩基球捕捉を認めたが、ＣＤ１３抗体、及びＣＤ３２抗体では、好塩基球の分離が認められなかった。
【００６０】
【表２】
【００６１】
（２） 分離細胞のヒスタミン遊離能
上記実験例の１．（１） で検討したＣＤ抗体の内、好塩基球捕捉能の認められたＣＤ９抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、及びＢＡ２０、ＢＡ３１２の各抗体固相化マグネチックビーズによる分離細胞のヒスタミン遊離能、即ち、総ヒスタミン量、ＩｇＥ特異的遊離ヒスタミン量、及び非特異的遊離ヒスタミン量の３項目を、２０例の健常人血液を用いて、上記実施例の４と同様の方法で測定した。
【００６２】
その結果、全ての抗体で好塩基球の分離を確認するとともに血液検体毎の差はあるものの、全ての抗体でＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離を認めた。
【００６３】
本発明においては、マグネッチックビーズに固相化した抗体により捕捉・分離された好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離の量に対する非特異的なヒスタミン遊離の量の比率が３０％以下であれば該抗体はケミカルメディエーター遊離試験法に有用であると考えられ、１０％以下では特に有用と考えられる。ＣＤ９抗体及びＣＤ１１ｂ抗体では、ＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離と比較して、著しく高い非特異的ヒスタミン遊離を示す検体が頻発しているため、表３に示すように、上記比率も３０％を大きく上回っておりこれらの分離細胞からＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離に関する解析を行うことは極めて困難であった。これに対して、本発明のモノクローナル抗体であるＢＡ３１２はこの比率が７． ５％と極めて優れたものであった。
【００６４】
【表３】
【００６５】
以上より、好塩基球捕捉率が高く、ＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離も良好で、なおかつ非特異的なヒスタミン遊離が最も抑えられているのはＢＡ２０、及びＢＡ３１２固相化マグネチックビーズによる分離細胞であった。とりわけＢＡ３１２固相化マグネチックビーズによる分離細胞は、本発明のヒト血液からの好塩基球の分離、及び該分離細胞のヒスタミン遊離試験を行うのに最も適していた。
【００６６】
２．全血と、分離細胞によるヒスタミン遊離試験
健常人ボランティア血液１例を用いて、全血と分離細胞によるヒスタミン遊離試験の比較検討を行った。
全血による方法では、まずヘパリン採血管に血液１０ｍｌを採血した。この血液１００μｌずつを試験管に分注し、これにヒスタミン遊離用緩衝液、若しくはヒスタミン遊離用緩衝液で５００００、５０００、５００、５０及び５ｎｇ／ｍｌとなるように調製したモノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体（ＨＥ−６９Ｂ）を、それぞれ４００μｌずつ加えて攪拌を行った（モノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体は、終濃度４００００、４０００、４００、４０及び４ｎｇ／ｍｌとなる）。総ヒスタミン量は、ヒスタミン遊離用緩衝液を加えた検体で凍結融解を３回繰り返して行ったものを検体とした。ＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離反応は、モノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体を加えた検体を、３７℃で１時間反応させて行った。また、非特異的なヒスタミン遊離反応は、ヒスタミン遊離用緩衝液を加えた検体を３７℃で１時間反応させて行った。反応終了後攪拌して、１５００ｒｐｍ×５分間遠沈した後、上清３００μｌを分取した。遊離ヒスタミン量の測定は、ＨＰＬＣ法によるヒスタミン測定システム（島津製作所）により行った。
【００６７】
分離細胞による方法では、上記実施例の４の方法と同様の方法で細胞分離と、分離細胞のヒスタミン遊離試験を行った。モノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体（ＨＥ−６９Ｂ）は、ヒスタミン遊離用緩衝液で４００００、４０００、４００、４０及び４ｎｇ／ｍｌとなるよう調製し、これによるヒスタミン遊離率を求めた。特異的ヒスタミン遊離率は、次式にて算出される。
【００６８】
【数２】
【００６９】
図２に示すように、特異的ヒスタミン遊離率は、全血による方法と、分離細胞による方法とで同等の結果を得た。このことから、本発明のモノクローナル抗体を用いて得られた分離細胞は、血液中で本来有するヒスタミン遊離能を維持していることがわかった。
【００７０】
３．臨床検体による分離細胞のヒスタミン遊離試験
卵白が原因アレルゲンである小児アトピー性皮膚炎患者血液検体２例に関して、上記実施例の３に示した方法で調製したＢＡ３１２固相化マグネチックビーズを用いて、上記実施例の４と同様の方法で細胞分離と、分離細胞のヒスタミン遊離試験を行った。試験に用いた卵白アレルゲンは、ヒスタミン遊離用緩衝液で４０００、４００、４０、４、及び０． ４ｎｇ／ｍｌとなるように調製し、これによるＩｇＥ特異的ヒスタミン遊離率を前述の式に従って算出した。
図３に示すように、特異的ヒスタミン遊離率は卵白アレルゲン濃度に依存的であった。また、アレルゲン濃度がある濃度よりも濃くなるとヒスタミン遊離率が低下する、ベル状の濃度依存曲線となる例もあった。
【００７１】
４．ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法によるヒスタミン濃度測定
上記実施例の３に示した方法で調製したＢＡ３１２固相化マグネチックビーズを用いて、上記実施例の４と同様の方法で細胞分離と分離細胞のヒスタミン遊離試験を行った。得られた遊離ヒスタミン試料に関して、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法にてヒスタミン濃度の測定を行った。即ち、遊離ヒスタミン試料、若しくは標準ヒスタミン溶液１００μｌを試験管に分取し、０．３％ヒト血清アルブミン、０．１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝食塩液ｐＨ７．０（アッセイ緩衝液）で調製した１２５ Ｉ−標識ヒスタミン溶液（１０ＫＢｑ／ｍｌ）１００μｌ、及びアッセイ緩衝液で調製した抗ヒスタミン抗体溶液１００μｌを加えて、４℃で２時間反応を行った。これに、０．１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝食塩液ｐＨ７．０（５０ｍＭＰＢＳ）で調製した２．５％牛γ−グロブリン溶液１００μｌ、及び５０ｍＭＰＢＳで調製した２５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ＃６０００）溶液５００μｌを加えて４℃で１０分間反応を行った。反応終了後、４℃で２０分間１８００×ｇで遠心分離を行い、沈さの放射活性を測定した。図４に得られた標準曲線を示す。
【００７２】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体は担体に固相化後も抗体活性を保持し、また、アレルゲンや抗ＩｇＥ抗体負荷によるケミカルメディエーター遊離を阻害せず、かつ非特異的なケミカルメディエーターの遊離を誘発しないので、ＩｇＥを介した特異的なケミカルメディエーター遊離試験に適した好塩基球を分離することができる。また、本発明の好塩基球の分離方法は、簡便に血球から好塩基球を分離することができるので、従来煩雑な操作を要したヒスタミン遊離試験を簡便に行うことができる。さらに本発明の好塩基球の分離方法により得られた細胞集団は、従来取り扱いに特別な技術を必要としたロイコトリエンやＰＡＦなどの好塩基球由来ケミカルメディエーターを対象とした遊離試験にも、簡便に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】マグネチックビーズに固相化した本発明のモノクローナル抗体を用いて分離した好塩基球からの総ヒスタミン量（白色棒グラフ）、ＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離の量（斜線棒グラフ）、および非特異的なヒスタミン遊離の量（黒色棒グラフ）を示すグラフである。
【図２】全血及びＢＡ３１２固相化マグネチックビーズによる分離細胞を用いたヒスタミン遊離反応のモノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体濃度依存曲線である。
【図３】ＢＡ３１２固相化マグネチックビーズによる小児アトピー性皮膚炎患者血液由来分離細胞を用いた、ヒスタミン遊離反応の卵白アレルゲン濃度依存曲線である。
【図４】ラジオイムノアッセイにより得られたヒスタミン濃度の標準曲線である。Ｂ／Ｂｏは標識された結合被検体の％を示す。
【産業上の利用分野】
本発明は、（１） 好塩基球と反応し、（２） 担体固相化後も抗体活性を保持し、（３） 該好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離を阻害せず、さらに（４） 該好塩基球の非特異的なヒスタミン遊離を誘発しないモノクローナル抗体、および該モノクローナル抗体が担体に固相化した固相化モノクローナル抗体を提供する。さらに本発明は、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体を用いる体液からの好塩基球の分離方法、該分離方法により分離した好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離方法、及び好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離試験法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
白血球の一種である好塩基球はＩｇＥの標的細胞であり、その顆粒中にヒスタミンを始めとする種々の化学伝達物質（ケミカルメディエーター）を貯蔵し、肥満細胞とともにアレルギー反応の中心的存在として注目されている。
【０００３】
通常、好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離機序は大きく２つに分けられる。
その１つは好塩基球の膜表面のレセプターに結合したＩｇＥ同志がアレルゲンや抗ＩｇＥ抗体により架橋され、その刺激により脱顆粒反応がおこりケミカルメディエーターが遊離するというもので、アレルギー反応による遊離がこれに相当する（以下、ＩｇＥを介した特異的なケミカルメディエーター遊離、と記す）。もう１つは、その遊離機序や意義は明らかにされていないが、直接好塩基球膜表面のＩｇＥを架橋することなく生じる遊離で、対応するＩｇＥを介した特異的な遊離反応に照らして、抗ＩｇＥ抗体や、アレルゲンの非存在下でも起こるものである（以下、非特異的なケミカルメディエーター遊離、と記す）。
【０００４】
アレルギー疾患の診断や病態解析にはＩｇＥを介した特異的なケミカルメディエーター遊離を試験することが有用であり、その代表的な試験としてヒスタミン遊離試験がある。ヒスタミンはＩ型アレルギー反応を引き起こす特に重要なケミカルメディエーターであり、気管支平滑筋の収縮、血管透過性の亢進などの諸反応を惹起することが知られている。ヒスタミン遊離試験は、ヒト末梢血中の好塩基球表面にレセプターを介して結合した免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）を、種々のアレルゲンと反応させることにより、これに伴って遊離したヒスタミン量を測定する生物学的反応を利用した特徴ある検査法であり、他のアレルゲン同定法である特異ＩｇＥ試験（ＲＡＳＴ）、皮膚試験等と異なって、アレルギー患者の原因アレルゲン探索のより臨床症状に近い方法として有用である。
【０００５】
この末梢血を用いるヒスタミン遊離試験には全血を用いる方法と、洗浄白血球を用いる方法がある。全血法は、患者のアレルギー状態を総合的に把握する上で有用と考えられているが、好塩基球以外の他の血清成分がヒスタミン遊離の測定に影響を及ぼす可能性がある。このため、薬剤などの作用機序を研究したり、ヒスタミン遊離機構の基礎的研究をする場合など、正確な好塩基球の反応性を分析する場合には、通常洗浄白血球を用いる。しかし、洗浄白血球を分離するためには、デキストラン溶液にて赤血球を除去した後、２〜３回の遠心を伴った洗浄を行い、更に白血球数を調整するなどの煩雑な操作が必要であり、このため検査に必要な血液量も多くなり、日常検査として利用するには多くの難点がある。
【０００６】
また、好塩基球の脱顆粒反応と共に放出される物質の中には、ロイコトリエンや血小板活性化因子（ＰＡＦ）などの、強力な血管透過性亢進作用・白血球遊走能を示すケミカルメディエーターの存在が知られており、アレルギーの病態解析を目的として、これら種々の好塩基球由来ケミカルメディエーターが基礎研究対象物質となってきている。しかし、これらのケミカルメディエーターは血液中に放出された場合速やかに代謝されてしまうものが多く、これらの測定を行う際には特に試料の取り扱いを迅速かつ厳密に行うことが重要な要件となってくる。このような好塩基球由来ケミカルメディエーターの多くは、現在分析が非常に難しい。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離には、アレルギー反応によるＩｇＥを介した特異的な遊離と、それ以外の非特異的な遊離があり、アレルギー疾患の診断にはＩｇＥを介して特異的に遊離されたケミカルメディエーターを測定することが必要である。しかし、前述のように血清成分の影響を受けることなくヒスタミン遊離試験を行うためには白血球を分離しなければならないため、煩雑な操作と多量の血液が必要であり、日常の検査には不向きである。さらに、ヒスタミン以外のケミカルメディエーターについても試料の取り扱いが煩雑であるので現在分析を行うのが困難な状況である。
【０００８】
そこで本発明者らは、血液中から好塩基球を分離し、ヒスタミン等の遊離試験に用いれば上記の問題を解決できるのではないかと考え研究を行った。
これまで、好塩基球の分離・精製法としては、比重遠心法で予め好塩基球の密度を高めた試料から好塩基球以外の細胞成分に反応する抗体を結合した磁性粒子を用いて不純物細胞を除くことにより好塩基球の精製を行うＰ．Ｊ．フレデリック（Ｐ． Ｊ． Ｆｒｅｄｅｒｉｋ）らの方法 ［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ） １４９， ２０７ （１９９２）］ 等がある。
しかし、この方法は目的とする好塩基球そのものを分離する精製法ではなく、夾雑物を除去することによる精製法であるので、効率が悪い上に操作性も煩雑である。
【０００９】
一方、好塩基球そのものに反応する抗体も多数知られており ［例えば、Ｐ．バレント（Ｖａｌｅｎｔ）ら、インターナショナル・アーカイブズ・アレルギー・アプライド・イムノロジー（Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ） ９１， １９８ （１９９０）］ 、またヒト好塩基球に対して特異的な反応を示すモノクローナル抗体も報告されている ［Ｍ．Ｐ．ボジャー （Ｂｏｄｇｅｒ） ら、ブラッド （Ｂｌｏｏｄ） ６９， １４１４ （１９８７）］ 。しかし、かかる好塩基球反応性抗体を固相担体に結合させ、ヒト好塩基球の分離に利用した試みの成功例は知られておらず、したがって、当然にそのような方法で分離したヒト好塩基球をヒスタミンなどのケミカルメディエーター遊離試験に用いた例も見られない。
【００１０】
この事実は、好塩基球反応性抗体を固相担体に結合させることによる好塩基球反応性の喪失等による失敗も考えられる（後述実験例１（１））が、最も大きな原因は、かかる好塩基球反応性抗体を利用して分取された好塩基球がダメージを受けており、ＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離が阻害される場合〔例えば、Ｐ．Ｊ．フレデリックら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ） １４９， ２１３ （１９９２）、及びＪ．Ｔ．シュレーダー（Ｊ． Ｔ． Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ） ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ） １３３， ２６９ 〜２７７ （１９９０）〕やＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離に比して非特異的ヒスタミン遊離が著しく高くなったため、ヒスタミン遊離反応の定量等の使用に耐え得なくなっている場合が多いことが考えられる（後述実験例１（２））。Ｐ．Ｊ．フレデリックらが、好塩基球以外の細胞成分と反応する抗体を用いて好塩基球の精製を行うという一見迂遠な方法を採ったのも上述の欠点を回避するためであったと解される。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
しかしながら、好塩基球そのものをターゲットとし好塩基球反応性抗体を用いて好塩基球の分離精製を行うことができれば、簡易かつ高精度の精製が達成可能となるはずである。
そこで、本発明者らは、かかる目的に使用し得る抗体すなわち好塩基球と反応するモノクローナル抗体であって、固相担体と結合した後も好塩基球に対する反応性を有し、かつ、好塩基球と結合後も当該好塩基球にダメージを与えることのない、すなわちＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離にも非特異的ヒスタミン遊離にも有意の影響を与えることのない特性を有するモノクローナル抗体の探索を鋭意行った。その結果、目的のモノクローナル抗体の調製に成功した。そして、かかる抗体を担体に固相化して体液と反応させ、該モノクローナル抗体により該体液中の好塩基球を捕捉した後、未反応の体液を除去することにより容易に好塩基球を分離する方法を確立し、分離した好塩基球にアレルゲンまたは抗ＩｇＥ抗体を反応させてヒスタミンを遊離させることに成功した。さらに本発明者らは、該抗体を用いて分離した好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離試験法を確立して、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の性質を有するモノクローナル抗体を提供する。
（１） 好塩基球と反応する、
（２） 担体固相化後も抗体活性を保持する、
（３） 該好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離を阻害しない、
（４） 該好塩基球の非特異的なヒスタミン遊離を誘発しない、
【００１３】
本発明が提供する上記（１） 、（２） 、（３） および（４） の性質を有するモノクローナル抗体において、（１） 好塩基球と反応する、とは該モノクローナル抗体が好塩基球の表面抗原と反応することを意味する。
【００１４】
また、（２） 担体固相化後も抗体活性を保持する、とは該モノクローナル抗体を担体に結合させた後も好塩基球の捕捉能を失わないことを意味する。該担体としては、例えば、ガラスまたは合成樹脂製の粒状物（ビーズ）あるいは球状物（ボール）、チューブ、プレート、マグネチックビーズのような磁性粒子など、通常抗体を固相化するときに用いる担体であれば全て用いることができるが、好ましくは磁性粒子を用いるのが良い。
【００１５】
固相化抗体の好塩基球捕捉能は、固相化したモノクローナル抗体が好塩基球と結合したか否かを検定することにより判定され、具体的にはヒスタミンを指標とし、次のような方法により行う。まず、マグネチックビーズに固相化した、ヒト好塩基球と反応するモノクローナル抗体をヒト血液と反応させる。次いで磁石でビーズを集めて上清を除いた後、ヒスタミン遊離用緩衝液（塩化カルシウム、塩化マグネシウム等を含むＨＥＰＥＳ緩衝液）を加え凍結融解を数回繰り返し、その上清の総ヒスタミン量を既知の方法、例えばＨＰＬＣ法によるヒスタミン測定システム ［ Ｙ．ツルタ （Ｔｓｕｒｕｔａ）ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．） ２２４， １０５ （１９８１）］ （島津製作所）により測定し、ヒスタミンが検出された抗体を好塩基球捕捉能を有する抗体として選択する。
【００１６】
また、（３） 該好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離を阻害しないとは、該モノクローナル抗体と結合した好塩基球が、血液中で本来有するＩｇＥを介した特異的ヒスタミン遊離能を実質的に維持していることを意味する。
実質的に維持するか否かは、本発明において発見されたモノクローナル抗体ＢＡ３１２との比較実験によって確認することができる。すなわち、ＢＡ３１２により捕捉された好塩基球は血液中で本来有するヒスタミン遊離能を維持している（後述実験例２）から、被検固相化モノクローナル抗体を固相化ＢＡ３１２と同条件で好塩基球と反応させ、得られた両モノクローナル抗体結合好塩基球を同条件下で抗ＩｇＥ抗体処理を行い遊離されたヒスタミン量がＢＡ３１２のそれの６０％以上である場合に当該モノクローナル抗体は「該好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離を阻害しない」ものと判定し、本発明の対象となると決定する。
【００１７】
さらに、（４） 該好塩基球の非特異的なヒスタミン遊離を誘発しない、とは該モノクローナル抗体と結合した好塩基球からの非特異的なヒスタミン遊離の量が、ＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離の量の３０％以下であることを意味する。
【００１８】
非特異的なヒスタミン遊離の量は、該好塩基球に適当な溶媒、例えば塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等を含むヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ヒスタミン遊離用緩衝液）を加え１０〜５０℃で１０〜６０分間反応させることにより遊離するヒスタミンの量を既知の方法、例えばＨＰＬＣ法により測定することにより得ることができる。
【００１９】
ＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離の量は、該好塩基球とヒスタミン遊離用緩衝液で調製した抗ＩｇＥ抗体とを上と同一の温度・反応時間の下で反応させることにより遊離するヒスタミンの量を、上と同一の方法・条件の下で測定することにより得ることができる。
【００２０】
以下に本発明のモノクローナル抗体の作製方法を簡単に示す。
（１） ハイブリドーマの調製
マウスをヒト好塩基球で免疫する。免疫は、ヒト好塩基球を数週間おきにマウスの腹腔、皮下、または静脈に数回繰り返し接種することにより行う。免疫されたマウスから抗体産生細胞を得、これと骨髄腫細胞を融合しハイブリドーマを作製する。得られたハイブリドーマの内ヒト好塩基球に反応する抗体を産生するハイブリドーマのウエルを選択する。
【００２１】
選択されたハイブリドーマをクローニングし、出現したハイブリドーマクローンの産生した抗体を、ヒツジ抗マウス免疫グロブリン抗体が予め結合してあるマグネチックビーズに結合した後、ヒト血液中の好塩基球の捕捉能、及び分離した好塩基球のヒスタミン遊離に関する特性を検定する。
捕捉能の検定は、前述の方法で行うことができる。
【００２２】
分離した好塩基球のヒスタミン遊離に関する特性の検定は、捕捉能の検定と同様マグネチックビーズに固相化した該抗体をヒト血液と反応させ、磁石でビーズを集めて上清を除いた後、前述の方法に従って非特異的なヒスタミン遊離の量とＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離の量を測定し、ＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離が阻害されず、かつ非特異的なヒスタミン遊離が促進されていない抗体すなわち非特異的なヒスタミン遊離の量がＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離の量の３０％以下、好ましくは１０％以下となった抗体を選択する。
【００２３】
このようにして、担体に結合後も抗体活性を失わず好塩基球の捕捉能を有しており、かつ分離した好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離を阻害せず、かつ非特異的なヒスタミン遊離を誘発しない抗体を産生するハイブリドーマクローンを選択し、これを培養してモノクローナル抗体を回収する。
【００２４】
上記の免疫法、細胞融合法、融合細胞の選択、クローニングなどは公知の通常の方法によって行うことができる。
【００２５】
（２） モノクローナル抗体の作製
選択したハイブリドーマをインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）培養法、またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ） 培養法により増殖させ、モノクローナル抗体を得る。インビトロ培養法としては、ハイブリドーマを牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地（完全ＲＰＭＩ培地）で増殖限界になるまで培養し、その培養上清を回収することによってモノクローナル抗体を得ることができる。インビボ培養法としては、予めプリステンを腹腔内投与処理したマウスの腹腔にハイブリドーマを移植し、数週後にマウスの腹部肥大を確かめてその腹水を採取し、腹水からＩｇＧ、若しくはＩｇＭ画分を硫安分画、ＤＥＡＥセファロースカラム等の既知の方法を適宜組み合わせて分離・精製することによってモノクローナル抗体を得ることができる。
【００２６】
上記方法により得られた本発明のモノクローナル抗体ＢＡ１０１、ＢＡ２０、ＢＡ１３５、およびＢＡ３１２を産生するハイブリドーマは、１９９２年９月１０日から、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）にある通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に、それぞれ「ＢＡ１０１シオノギ」（微工研条寄第４００４号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４００４）、「ＢＡ２０シオノギ」（微工研条寄第４００５号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４００５）、「ＢＡ１３５シオノギ」（微工研条寄第４００６号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４００６）、「ＢＡ３１２シオノギ」（微工研条寄第４００７号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４００７）として、ブダペスト条約に基づき寄託されている。
このように本発明のモノクローナル抗体は、例えば寄託されたハイブリドーマにより産生されるものが挙げられるが、上述した （１）〜（４） の性質を有しているモノクローナル抗体であればいずれも本発明の範囲である。好ましくはモノクローナル抗体ＢＡ３１２が用いられる。
【００２７】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト好塩基球を含む白血球と反応し、ヒト赤血球とは反応しない。さらに本発明のモノクローナル抗体は、担体に固相化した後も好塩基球を充分に捕捉することができ、捕捉した好塩基球の非特異的なケミカルメディエーターの遊離を誘発せず、ＩｇＥを介した特異的なケミカルメディエーター遊離を阻害しない。また、本発明のモノクローナル抗体は、前記のような担体に結合させて得られる固相化モノクローナル抗体として有利に用いることができる。モノクローナル抗体を担体に結合させて固相化させる方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法、例えば〔Ｔ．リー（Ｌｅａ）ら、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．） ２２， ２０７ （１９８５）］により行うことができる。例えば、モノクローナル抗体をアンコーテッド、又はトシル基のような化学的活性基を持つ化合物または抗マウス免疫グロブリンでコートされた固相担体と０〜５０℃、好ましくは４〜４０℃で５分〜７２時間、好ましくは３０分〜４８時間反応させる。
【００２８】
本発明はまた、前記のようにして得られる本発明の固相化モノクローナル抗体と体液とを反応させ、該体液中の好塩基球を該固相化モノクローナル抗体に結合させて捕捉することを特徴とする、好塩基球の分離方法を提供する。
【００２９】
該体液としては、血液、鼻汁、涙液、唾液などが挙げられるが、好ましくは血液を用いる。
【００３０】
ところで磁性粒子に抗体を結合させて目的の細胞を分離する方法は、Ｇ．ゴーダーナックらの報告 ［Ｇ．ゴーダーナック （Ｇａｕｄｅｒｎａｃｋ） ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド （Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ） ９０， １７９ （１９８６）］など、広く知られている。また、比重遠心法で予め好塩基球の密度を高めた試料から、好塩基球以外の細胞成分に反応する抗体を結合した磁性粒子を用いて不純物細胞を除くことにより好塩基球の精製を行う方法も、Ｐ．Ｊ．フレデリックらにより報告されている ［Ｐ．Ｊ．フレデリック （Ｆｒｅｄｅｒｉｃ） ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド （Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ） １４９， ２０７ （１９９２）］ が、本発明とは、好塩基球に対する抗体を用いるのか、好塩基球以外の細胞に対する抗体を用いるのかという部分で本質的な相違がある。
【００３１】
一方、本発明の好塩基球の分離方法は、本発明のモノクローナル抗体を担体、例えば磁性粒子に、直接または抗マウス免疫グロブリンを介して固相化して抗体結合磁性粒子とし、これを体液、好ましくは血液と０〜５０℃、好ましくは１５〜４０℃で短時間（１〜６０分）反応させた後、磁石を用いて磁性粒子を引き寄せて未反応の試料を除去するという簡便な操作で好塩基球を高濃度で含む細胞集団を調製分離することができる。
【００３２】
本発明はまた、本発明の好塩基球の分離法により分離した好塩基球をアレルゲンまたは抗ＩｇＥ抗体と反応させることを特徴とする、該好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離方法を提供する。
【００３３】
アレルゲンとしては、室内塵や花粉などの吸入性アレルゲンや、食肉や卵などの食餌性アレルゲンをはじめとして、その他化学物質など、通常アレルギー診断で用いられるものを、適宜必要に応じて用いることができる。
【００３４】
該好塩基球とアレルゲンまたは抗ＩｇＥ抗体との反応は１０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃で０．５〜３００分間、好ましくは１０〜６０分間行う。
【００３５】
本発明はさらに、以下の（１） 〜（３） の工程よりなる好塩基球からのケミカルメディエーター遊離試験法を提供する。
（１） 本発明の固相化モノクローナル抗体と体液とを反応させ、該体液中の好塩基球を該固相化モノクローナル抗体に結合させて捕捉し、該好塩基球を分離する工程、
（２） 工程（１） で分離した好塩基球をアレルゲンまたは抗ＩｇＥ抗体と反応させて好塩基球からケミカルメディエーターを遊離させる工程、および
（３） 工程（２） で好塩基球から遊離したケミカルメディエーターの量を測定する工程、
【００３６】
上記（１） および（２） はそれぞれ前記の本発明の好塩基球の分離方法および好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離方法に従って行うと良い。
【００３７】
上記（３） の遊離したケミカルメディエーターの量の測定は、目的とするケミカルメディエーターに応じて、適宜既知の方法により測定すればよい。例えば、ヒスタミンの場合はＨＰＬＣ法によるヒスタミン測定システム ［ Ｙ．ツルタ （Ｔｓｕｒｕｔａ）ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー （Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．） ２２４， １０５（１９８１）］（島津製作所）により、ロイコトリエンおよびＰＡＦの場合は、ぞれぞれ〔Ｅ．ヘイズ（Ｈａｙｅｓ）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３１， ４２９ （１９８３）、及び〔Ｍ．Ａ．スマル（Ｓｍａｌ）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ） １２８， １８３ （１９９０）〕により測定することができる。即ち、ＨＰＬＣによるヒスタミンの測定は、例えば次のようにして行う。陽イオン交換樹脂を充填したカラムに試料を通じ、分離溶出したヒスタミンに０．１％オルソフタルアルデヒドとＮａＯＨを加えて４５℃で反応し、ヒスタミンを蛍光体とする。つぎにＨ２ ＳＯ４ と反応させ、蛍光体の安定化と蛍光強度の増強を行った後、蛍光強度を測定する。
【００３８】
また、ＲＩＡによるロイコトリエンの測定は、試料または標準の非標識ロイコトリエン、抗ロイコトリエン抗体、３ Ｈ標識ロイコトリエンを４℃、５ 〜２４時間反応させた後、デキストランコーテッドチャーコールと氷中１０分間反応させる。遠心後、上清を分取し、放射活性を測定する。
また、ＲＩＡによるＰＡＦの測定は、試料または標準の非標識ＰＡＦ、抗ＰＡＦ抗体、１２５ Ｉ標識ＰＡＦと二次抗体を室温で５〜２４時間反応させた後、遠心分離で得られた沈さの放射活性を測定する。
また、ヒスタミンの測定法についても、ＲＩＡによって測定することができる。ＲＩＡで測定する場合、例えば試料または標準の非標識ヒスタミン、抗ヒスタミン抗体、１２５ Ｉ−標識ヒスタミンを０〜４０℃、好ましくは０〜１０℃で５分〜４８時間、好ましくは３０分〜２４時間反応させる。その後Ｂ／Ｆ分離剤、例えばポリエチレングリコールを加えて氷中１０分間反応を行い、遠心で得られた沈さの放射活性を測定する。
【００３９】
さらに、ヒスタミンの測定法としてＥＩＡによって行うこともできる。即ち、サンドイッチ法、競合法、ＥＬＩＳＡなど公知の酵素免疫測定法は全て用いることができるが、好ましくは例えば、クノックスバンバイク（Ｋｎｏｘ Ｖａｎ Ｄｙｋｅ）らによって報告される方法（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ２〜１０， １９９０） に従って測定する。すなわち、試料、ビオチン標識した標準ヒスタミン、酵素標識抗ヒスタミン抗体の混合物を、アビジンを固相化した担体と反応させる。洗浄後、アビジン固相化担体に結合した、ビオチン標識ヒスタミン−酵素標識抗ヒスタミン抗体複合体の酵素活性を測定する。担体および酵素は、酵素免疫測定法で通常用いられるものは全て用いることができる。好ましくは担体としてはマイクロプレート、酵素としては西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いる。
【００４０】
本発明の試験法においては、分離した好塩基球からの非特異的なケミカルメディエーター遊離の影響を除去するため、前述の方法に従って総ケミカルメディエーター量（総ヒスタミン量の測定方法に準じる）、および非特異的なケミカルメディエーター遊離の量も同時に測定し下記式：
【００４１】
【数１】
によりＩｇＥを介した特異的なケミカルメディエーター遊離率を算出することが好ましい。
【００４３】
【実施例】
以下、実施例および実験例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。
１．好塩基球に反応するモノクローナル抗体の作製
（１） 免疫
８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス２匹に、それぞれ１×１０６ 個のヒト好塩基球を腹腔内投与し、以降３週間毎に３回、それぞれ１×１０６ 個のヒト好塩基球を腹腔内投与した。
【００４４】
（２） 細胞融合
最終免疫の３日後に、２匹のマウスから脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ培地を用いて細胞浮遊液を調製した。この２×１０８ 個の脾細胞と６×１０７ 個の骨髄腫細胞ＮＳ−１とを混合し、遠沈後、沈殿に５０％ポリエチレングリコール（平均分子量４０００）１ｍｌを緩やかに撹拌しながら加え、更に１分間撹拌した。ＲＰＭＩ培地１ｍｌを１分間を要して加え、同じく１ｍｌを追加した後、更に、７ｍｌを３分間を要して加えた。遠沈後、沈殿を１５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地（完全ＲＰＭＩ培地）４０ｍｌに浮遊させ、９６穴マイクロ培養プレート４枚の各ウエルに、０． １ｍｌずつ接種し、７％炭酸ガスの存在下、３７℃で培養した。２４時間後、ヒポキサンチン１００μＭ、アミノプテリン０． ４μＭ、チミジン１６μＭを含む完全ＲＰＭＩ培地（ＨＡＴ培地）０． １ｍｌを加えた。培養開始後、２、３、５及び８日後に、培養上清０． １ｍｌを捨て、ＨＡＴ培地０． １ｍｌを加えた。１１及び１４日目に、培養上清０． １ｍｌを捨て、ヒポキサンチン１００μＭ、チミジン１６μＭを含む完全ＲＰＭＩ培地（ＨＴ培地）０． １ｍｌを加えた。計３８４の全てのウエルからハイブリドーマのコロニーが出現した。
【００４５】
（３） ハイブリドーマの選択
培養ウエル中のハイブリドーマを完全ＲＰＭＩ培地で培養し、その培養上清中の特異抗体産生の有無を次のようにして検出した。
【００４６】
ヒト末梢血２０ｍｌに、５％デキストラン生理食塩溶液を５ｍｌ加えて、赤血球を沈澱させた後、上清の白血球を分離した。この白血球から、比重１． ０７及び１． ０８に調製したパーコールを用いて、不連続比重遠心法により、比重１． ０７〜１． ０８からなる細胞を分離した。分離細胞を、アルシアンブルー法 ［Ｓ． Ｇ． ハリエット （Ｈａｒｒｉｅｔ） ら、ブラッド （Ｂｌｏｏｄ） ４６， ２７９ （１９７５）］ により染色して好塩基球数を算定し、好塩基球として４×１０５ 個／ｍｌとなるように、０． ８％塩化ナトリウム、０． ０３７％塩化カリウム、及び０． ０３％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む１０ｍＭヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７． ４）（ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液）で調製した。試験管に、好塩基球数として２×１０４ 個となるように分離細胞を分注した。これにハイブリドーマの培養上清を５０μｌ加え、３７℃で１時間反応させた。ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で１回洗浄の後、フルオレッセンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体、及びフィコエリスリン標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体の混合液５０μｌを加えて、室温で１時間反応させた。ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で１回洗浄の後、蛍光顕微鏡による観察を行い、ＦＩＴＣ標識された細胞が、フィコエリスリンによっても標識されているかどうかを判定した。このようにして、ＦＩＴＣ標識された好塩基球に対して、ハイブリドーマの培養上清に含まれるモノクローナル抗体が反応するものを、１００ウエル選択した。
【００４７】
上記の如く選択したハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングした後、フラスコ培養によりそれぞれ増殖限界まで培養を行った。この培養上清１ｍｌを、ヒツジ抗マウス免疫グロブリン抗体が予め結合してあるマグネチックビーズ１５ｍｇに加えて、緩やかな撹拌を行いながら４℃で１６時間反応させて、モノクローナル抗体固相化マグネチックビーズを得た。これらのモノクローナル抗体固相化マグネチックビーズを用いて、下記実施例４に記載の方法に従い、ヒト末梢血からの好塩基球捕捉能、及び分離された好塩基球のＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離と、非特異的なヒスタミン遊離に関する性質を調べた。その結果、前記の特性を有し、後記実験例から明らかなように、本発明のヒト好塩基球を含む細胞集団の分離と、分離細胞のヒスタミン遊離試験方法に適したモノクローナル抗体ＢＡ１０１、ＢＡ２０、ＢＡ１３５及びＢＡ３１２を産生するハイブリドーマＢＡ１０１シオノギ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００４）、ＢＡ２０シオノギ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００５）、ＢＡ１３５シオノギ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００６）及びＢＡ３１２シオノギ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００７）を選択した。
【００４８】
また、上記４種のモノクローナル抗体の属するマウス免疫グロブリンのクラスを調べた結果、ＢＡ２０、ＢＡ１０１、及びＢＡ１３５はＩｇＧ１に属し、ＢＡ３１２はＩｇＭに属することが判明した。
【００４９】
（４） モノクローナル抗体の作製
（ａ） ｉｎ ｖｉｔｒｏ 培養法
ハイブリドーマを完全ＲＰＭＩ培地で増殖限界（１×１０６ 個／ｍｌ）になるまで培養し、その培養上清を回収した。
【００５０】
（ｂ） ｉｎ ｖｉｖｏ 培養法
予めプリステン０． ５ｍｌで腹腔内投与処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０６ 個のハイブリドーマを腹腔内に移植した。約３週間後、マウスの腹部肥大を確かめて、その腹水を採取した。
【００５１】
（５） モノクローナル抗体の精製
（ａ） プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー法
前工程で得られた腹水を１８％硫酸ナトリウム溶液で塩析し、生じた沈澱を０． ０１Ｍホウ酸緩衝食塩液（ｐＨ８． ０）に溶解後、同液にて透析した。塩析により得られたモノクローナル抗体２０ｍｇを０． ０１Ｍホウ酸緩衝食塩液（ｐＨ８． ０）２ｍｌに溶かし、プロテインＡ−セファロース［ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ） ］のカラム（１． ６×５ｃｍ）に吸着させた。まず、０． ０１Ｍホウ酸緩衝食塩液（ｐＨ８． ０）約５０ｍｌで不純物を流出し、次いで０． ０１Ｍクエン酸緩衝食塩液（ｐＨ４． ０）約１００ｍｌで溶出して、精製モノクローナル抗体ＢＡ２０、ＢＡ１０１及びＢＡ１３５を得た。
【００５２】
（ｂ） セファロースＣＬ−４Ｂゲルクロマトグラフィー法
前記塩析により得られたモノクローナル抗体２０ｍｇを０． ０１Ｍホウ酸緩衝食塩液２ｍｌに溶かし、セファロースＣＬ−４Ｂ［ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ） ］のカラム（１． ６×７０ｃｍ）に通して分画し、メインピークを分取して、精製モノクローナル抗体ＢＡ３１２を得た。
【００５３】
２．モノクローナル抗体の２次抗体結合ビーズへの固相化
ダイナビーズ Ｍ−４５０ ヒツジ抗マウス免疫グロブリン［ダイナル社 （Ｄｙｎａｌ）］の３０ｍｇ・ｂｅａｄｓ ／ｍｌ懸濁液を、撹拌後１ｍｌ試験管に分取した。磁石でビーズを集め上清を除いた後、ハイブリドーマ培養上清１ｍｌを加え、緩やかな撹拌を行いながら４℃で１６時間反応を行った。磁石でビーズを集め上清を除いた後、ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で４回、４℃で３０分間ずつ緩やかな撹拌を行いながら洗浄して、モノクローナル抗体固相化マグネチックビーズを得た。
また、ハイブリドーマ培養上清の代わりに、ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で調製した精製モノクローナル抗体（２０μｇ／ｍｌ）１ｍｌを加えて、上記と同様の方法でモノクローナル抗体固相化マグネチックビーズを得た。
【００５４】
３．モノクローナル抗体のアンコーテッドビーズへの固相化
ダイナビーズ Ｍ−４５０ アンコーテッド［（ダイナル社 （Ｄｙｎａｌ）］の３０ｍｇ・ｂｅａｄｓ ／ｍｌ懸濁液を、撹拌後１ｍｌ試験管に分取した。磁石でビーズを集め、上清を除いた後、ＢＡ３１２の０． ０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９． ５）溶液（０． ３ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを加え、良く撹拌した。緩やかな撹拌を行いながら、４℃で１６時間反応を行った。磁石でビーズを集め、上清を除いた後、０． ５％ＨＳＡを含む０． ０１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７． ４）で５分間ずつ４回洗浄を行い、更にＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で４℃で１６時間洗浄を行い、ＢＡ３１２固相化マグネチックビーズを得た。
【００５５】
４．モノクローナル抗体固相化マグネチックビーズによる細胞分離と、ヒスタミン遊離反応
ＥＤＴＡ採血管に採血した健常人血液１０ｍｌに、ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液４０ｍｌを加えて２０％血液を調製した。ハイブリドーマＢＡ２０シオノギ、ＢＡ１０１シオノギ、ＢＡ１３５シオノギ及びＢＡ３１２シオノギの培養上清をそれぞれ固相化したマグネチックビーズを、ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で３ｍｇ・ｂｅａｄｓ ／ｍｌとなるように調製した。２０％血液を試験管に５００μｌずつ分注し、ここに上記ＢＡ２０、ＢＡ１０１、ＢＡ１３５及びＢＡ３１２固相化マグネチックビーズ５０μｌを加え、室温で緩やかな振盪条件下、５分間反応を行った。磁石でビーズを集め上清を除いた後、ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液５００μｌで１回洗浄を行った。洗浄終了後、０． ５ｍＭ塩化カルシウム、０． ２５ｍＭ塩化マグネシウム、０． １％グルコース、０． ９％塩化ナトリウム、０． ０３５％重炭酸ナトリウム、及び０． １％ＨＳＡを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７． ０）（ヒスタミン遊離用緩衝液）、若しくはヒスタミン遊離用緩衝液で４μｇ／ｍｌとなるように調製されたモノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体（ＨＥ−６９Ｂ）５００μｌを加えて撹拌を行った。分離細胞の総ヒスタミン量は、ヒスタミン遊離用緩衝液を加えた検体で凍結融解を３回繰り返して行ったものを検体とした。ＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離反応は、モノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体を加えた検体を、３７℃で１時間反応させて行った。また、非特異的なヒスタミン遊離反応は、ヒスタミン遊離用緩衝液を加えた検体を３７℃で１時間反応させて行った。反応終了後撹拌して、１５００ｒｐｍ×５分間遠沈した後、上清３００μｌを分取した。遊離ヒスタミン量の測定は、ＨＰＬＣ法によるヒスタミン測定システム ［Ｙ． ツルタ （Ｔｓｕｒｕｔａ） ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー （Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．） ２２４， １０５ （１９８１）］（島津製作所）により行った。
【００５６】
表１に示すように、ＢＡ２０、ＢＡ１０１、ＢＡ１３５及びＢＡ３１２固相化マグネチックビーズで分離した細胞の総ヒスタミン量を測定したところ、すべての抗体においてヒスタミンが検出され、好塩基球の分離能を有していることが分かった。また、図１に示すように分離細胞のＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離率は良好であり、なおかつ非特異的なヒスタミン遊離は、特異的なヒスタミン遊離に比較して、３０％以下に抑えられていた。
【００５７】
【表１】
実験例
１．ＣＤ抗体と、本発明モノクローナル抗体との比較
（１） 好塩基球捕捉能
Ｐ．バレントらの報告 ［Ｐ． バレント （Ｖａｌｅｎｔ） ら、インターナショナル・アーカイブス・アレルギー・アプライド・イムノロジー （Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．） ９１， １９８ （１９９０）］に基づいて、好塩基球表面に良く発現する抗原に反応するＣＤ抗体、即ちＣＤ９抗体（ＴＰ８２、ニチレイ社）、ＣＤ１１ｂ抗体（ＢＥＡＲ１、イムノテック社）、ＣＤ１３抗体（ＭＣＳ２、ニチレイ社）、及びＣＤ３２抗体（２Ｅ１、イムノテック社）の各抗体を用いて、上記実施例の２に示した方法により、抗体固相化マグネチックビーズの調製を行った。上記ＣＤ抗体、及びＢＡ２０、ＢＡ３１２固相化マグネチックビーズを用いて実施例の４と同様の方法により特定の細胞集団の分離を行い、分離細胞由来の総ヒスタミン量を測定した。
【００５９】
表２に示すように、ＣＤ９抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、及びＢＡ２０、ＢＡ３１２では良好な好塩基球捕捉を認めたが、ＣＤ１３抗体、及びＣＤ３２抗体では、好塩基球の分離が認められなかった。
【００６０】
【表２】
（２） 分離細胞のヒスタミン遊離能
上記実験例の１．（１） で検討したＣＤ抗体の内、好塩基球捕捉能の認められたＣＤ９抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、及びＢＡ２０、ＢＡ３１２の各抗体固相化マグネチックビーズによる分離細胞のヒスタミン遊離能、即ち、総ヒスタミン量、ＩｇＥ特異的遊離ヒスタミン量、及び非特異的遊離ヒスタミン量の３項目を、２０例の健常人血液を用いて、上記実施例の４と同様の方法で測定した。
【００６２】
その結果、全ての抗体で好塩基球の分離を確認するとともに血液検体毎の差はあるものの、全ての抗体でＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離を認めた。
【００６３】
本発明においては、マグネッチックビーズに固相化した抗体により捕捉・分離された好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離の量に対する非特異的なヒスタミン遊離の量の比率が３０％以下であれば該抗体はケミカルメディエーター遊離試験法に有用であると考えられ、１０％以下では特に有用と考えられる。ＣＤ９抗体及びＣＤ１１ｂ抗体では、ＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離と比較して、著しく高い非特異的ヒスタミン遊離を示す検体が頻発しているため、表３に示すように、上記比率も３０％を大きく上回っておりこれらの分離細胞からＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離に関する解析を行うことは極めて困難であった。これに対して、本発明のモノクローナル抗体であるＢＡ３１２はこの比率が７． ５％と極めて優れたものであった。
【００６４】
【表３】
以上より、好塩基球捕捉率が高く、ＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離も良好で、なおかつ非特異的なヒスタミン遊離が最も抑えられているのはＢＡ２０、及びＢＡ３１２固相化マグネチックビーズによる分離細胞であった。とりわけＢＡ３１２固相化マグネチックビーズによる分離細胞は、本発明のヒト血液からの好塩基球の分離、及び該分離細胞のヒスタミン遊離試験を行うのに最も適していた。
【００６６】
２．全血と、分離細胞によるヒスタミン遊離試験
健常人ボランティア血液１例を用いて、全血と分離細胞によるヒスタミン遊離試験の比較検討を行った。
全血による方法では、まずヘパリン採血管に血液１０ｍｌを採血した。この血液１００μｌずつを試験管に分注し、これにヒスタミン遊離用緩衝液、若しくはヒスタミン遊離用緩衝液で５００００、５０００、５００、５０及び５ｎｇ／ｍｌとなるように調製したモノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体（ＨＥ−６９Ｂ）を、それぞれ４００μｌずつ加えて攪拌を行った（モノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体は、終濃度４００００、４０００、４００、４０及び４ｎｇ／ｍｌとなる）。総ヒスタミン量は、ヒスタミン遊離用緩衝液を加えた検体で凍結融解を３回繰り返して行ったものを検体とした。ＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離反応は、モノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体を加えた検体を、３７℃で１時間反応させて行った。また、非特異的なヒスタミン遊離反応は、ヒスタミン遊離用緩衝液を加えた検体を３７℃で１時間反応させて行った。反応終了後攪拌して、１５００ｒｐｍ×５分間遠沈した後、上清３００μｌを分取した。遊離ヒスタミン量の測定は、ＨＰＬＣ法によるヒスタミン測定システム（島津製作所）により行った。
【００６７】
分離細胞による方法では、上記実施例の４の方法と同様の方法で細胞分離と、分離細胞のヒスタミン遊離試験を行った。モノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体（ＨＥ−６９Ｂ）は、ヒスタミン遊離用緩衝液で４００００、４０００、４００、４０及び４ｎｇ／ｍｌとなるよう調製し、これによるヒスタミン遊離率を求めた。特異的ヒスタミン遊離率は、次式にて算出される。
【００６８】
【数２】
図２に示すように、特異的ヒスタミン遊離率は、全血による方法と、分離細胞による方法とで同等の結果を得た。このことから、本発明のモノクローナル抗体を用いて得られた分離細胞は、血液中で本来有するヒスタミン遊離能を維持していることがわかった。
【００７０】
３．臨床検体による分離細胞のヒスタミン遊離試験
卵白が原因アレルゲンである小児アトピー性皮膚炎患者血液検体２例に関して、上記実施例の３に示した方法で調製したＢＡ３１２固相化マグネチックビーズを用いて、上記実施例の４と同様の方法で細胞分離と、分離細胞のヒスタミン遊離試験を行った。試験に用いた卵白アレルゲンは、ヒスタミン遊離用緩衝液で４０００、４００、４０、４、及び０． ４ｎｇ／ｍｌとなるように調製し、これによるＩｇＥ特異的ヒスタミン遊離率を前述の式に従って算出した。
図３に示すように、特異的ヒスタミン遊離率は卵白アレルゲン濃度に依存的であった。また、アレルゲン濃度がある濃度よりも濃くなるとヒスタミン遊離率が低下する、ベル状の濃度依存曲線となる例もあった。
【００７１】
４．ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法によるヒスタミン濃度測定
上記実施例の３に示した方法で調製したＢＡ３１２固相化マグネチックビーズを用いて、上記実施例の４と同様の方法で細胞分離と分離細胞のヒスタミン遊離試験を行った。得られた遊離ヒスタミン試料に関して、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法にてヒスタミン濃度の測定を行った。即ち、遊離ヒスタミン試料、若しくは標準ヒスタミン溶液１００μｌを試験管に分取し、０．３％ヒト血清アルブミン、０．１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝食塩液ｐＨ７．０（アッセイ緩衝液）で調製した１２５ Ｉ−標識ヒスタミン溶液（１０ＫＢｑ／ｍｌ）１００μｌ、及びアッセイ緩衝液で調製した抗ヒスタミン抗体溶液１００μｌを加えて、４℃で２時間反応を行った。これに、０．１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝食塩液ｐＨ７．０（５０ｍＭＰＢＳ）で調製した２．５％牛γ−グロブリン溶液１００μｌ、及び５０ｍＭＰＢＳで調製した２５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ＃６０００）溶液５００μｌを加えて４℃で１０分間反応を行った。反応終了後、４℃で２０分間１８００×ｇで遠心分離を行い、沈さの放射活性を測定した。図４に得られた標準曲線を示す。
【００７２】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体は担体に固相化後も抗体活性を保持し、また、アレルゲンや抗ＩｇＥ抗体負荷によるケミカルメディエーター遊離を阻害せず、かつ非特異的なケミカルメディエーターの遊離を誘発しないので、ＩｇＥを介した特異的なケミカルメディエーター遊離試験に適した好塩基球を分離することができる。また、本発明の好塩基球の分離方法は、簡便に血球から好塩基球を分離することができるので、従来煩雑な操作を要したヒスタミン遊離試験を簡便に行うことができる。さらに本発明の好塩基球の分離方法により得られた細胞集団は、従来取り扱いに特別な技術を必要としたロイコトリエンやＰＡＦなどの好塩基球由来ケミカルメディエーターを対象とした遊離試験にも、簡便に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】マグネチックビーズに固相化した本発明のモノクローナル抗体を用いて分離した好塩基球からの総ヒスタミン量（白色棒グラフ）、ＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離の量（斜線棒グラフ）、および非特異的なヒスタミン遊離の量（黒色棒グラフ）を示すグラフである。
【図２】全血及びＢＡ３１２固相化マグネチックビーズによる分離細胞を用いたヒスタミン遊離反応のモノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体濃度依存曲線である。
【図３】ＢＡ３１２固相化マグネチックビーズによる小児アトピー性皮膚炎患者血液由来分離細胞を用いた、ヒスタミン遊離反応の卵白アレルゲン濃度依存曲線である。
【図４】ラジオイムノアッセイにより得られたヒスタミン濃度の標準曲線である。Ｂ／Ｂｏは標識された結合被検体の％を示す。
Claims (15)
- 以下の性質を有するモノクローナル抗体。
(1) 好塩基球と反応する、
(2) 担体固相化後も抗体活性を保持する、
(3) 該好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離を阻害しない、
(4) 該モノクローナル抗体と結合した好塩基球からの非特異的なヒスタミン遊離の量が、ＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離の量の３０％以下である、 - マウス免疫グロブリンのクラスがＩｇＧ１またはＩｇＭに属することを特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体。
- ハイブリドーマＢＡ１０１シオノギ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００４）、ＢＡ２０シオノギ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００５）、ＢＡ１３５シオノギ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００６）、およびＢＡ３１２シオノギ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００７）によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ＢＡ１０１、ＢＡ２０、ＢＡ１３５、およびＢＡ３１２よりなる群から選択される請求項１記載のモノクローナル抗体。
- 請求項１、２又は３記載のモノクローナル抗体を担体に固相化した固相化モノクローナル抗体。
- 該担体がガラス又は合成樹脂製の粒状物、球状物、チューブ、プレートおよび磁性粒子よりなる群から選択される請求項４記載の固相化モノクローナル抗体。
- 該磁性粒子がマグネチックビーズである請求項５記載の固相化モノクローナル抗体。
- 請求項１、２又は３記載のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマ。
- ハイブリドーマＢＡ１０１シオノギ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００４）、ＢＡ２０シオノギ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００５）、ＢＡ１３５シオノギ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００６）、およびＢＡ３１２シオノギ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００７）よりなる群から選択される請求項７記載のハイブリドーマ。
- 請求項４、５又は６記載の固相化モノクローナル抗体と体液とを反応させ、該体液中の好塩基球を該固相化モノクローナル抗体に結合させて捕捉することを特徴とする、好塩基球の分離方法。
- 該体液が、血液、鼻汁、涙液、および唾液よりなる群から選択される請求項９記載の分離方法。
- 請求項９又は１０記載の方法により分離した好塩基球をアレルゲンまたは抗ＩｇＥ抗体と反応させることを特徴とする、該好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離方法。
- 該ケミカルメディエーターがヒスタミン、ロイコトリエンおよび血小板活性化因子（ＰＡＦ）よりなる群から選択される請求項１１記載の遊離方法。
- 該アレルゲンが室内塵、花粉、食餌性アレルゲンおよび化学物質よりなる群から選択される請求項１１記載の遊離方法。
- 以下の工程を有する好塩基球からのケミカルメディエーター遊離試験法。
（１） 請求項４、５又は６記載の固相化モノクローナル抗体と体液とを反応させ、該体液中の好塩基球を該固相化モノクローナル抗体に結合させて捕捉し、該好塩基球を分離する工程、
（２） 工程（１） で分離した好塩基球をアレルゲンまたは抗ＩｇＥ抗体と反応させて好塩基球からケミカルメディエーターを遊離させる工程、および
（３） 工程（２） で好塩基球から遊離したケミカルメディエーターの量を測定する工程、 - 該ケミカルメディエーターがヒスタミン、ロイコトリエンおよび血小板活性化因子（ＰＡＦ）よりなる群から選択されるものである請求項１４記載の遊離試験法。
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