JPS6357599A

JPS6357599A - イヌ心糸状虫ワクチンおよび診断試験

Info

Publication number: JPS6357599A
Application number: JP62200729A
Authority: JP
Inventors: スティーブン・エイ・フラー; ジョン・ジイ・アール・ハーレル
Original assignee: Allelix Inc
Current assignee: Allelix Biopharmaceuticals Inc
Priority date: 1986-08-11
Filing date: 1987-08-11
Publication date: 1988-03-12
Also published as: US4842999A; AU611091B2; AU7672987A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、イヌ心糸状虫用ワクチンに関する。

さらに詳しくは、本発明は、イヌ心糸状虫寄生虫の存在
を識別できる診断試験に関する。

従来技術イヌ心糸状虫疾患は、寄生虫ディロフィラリア・イミテ
ィス（Ｄｉｒｏｒｉｌａｒｉａ　　１ｍｍ１ｔｉｓ　（
Ｄ。

１ｍｍ１ｔｉｓ））により発症する。この寄生虫は、蚊
媒介動物を介してイヌに伝染される。感染した蚊におい
て発育した感染性ディー・イミティス（Ｄ、１ｍｍ１ｔ
ｉｓ）幼虫は、該蚊咬合傷を通してイヌに浸入する。イ
ヌの循環系に侵入すると、該幼虫は発育し、それらが成
熟し、繁殖するイヌの心臓に移動する。「ミクロフィラ
リア」と称するディロフィラリア・イミティス幼虫はイ
ヌの循環系じゅうを移動し、それらは、該感染イヌを刺
した蚊に吸い込まれる。ディロフィラリア生活環は、吸
い込まれたミクロフィラリアが該蚊中にて感染性幼虫に
成長して完結する。

肺動脈およびイヌ心臓の右心室におけろ心糸状虫寄生虫
の身体の存在および生じた組織の破壊は、ストレスまた
は激しい運動の状況下で致命的でありうる呼吸および循
環問題を引き起こす。該心糸状虫寄生虫は、また、ヒト
の病巣肺、肝臓、眼および皮膚障害の原因であることが
セ１明している（ハミルトン、アール・ノーら、エクス
ペリメンタル・パラシトロジー（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、’
　　Ｒ，Ｇ、、　ｅｔ　　ａｌ、。

Ｅｘｐｅｒ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、　）、　　５６．
２９８−３１３（１９８３））。

従来、イヌ心糸状虫の診断は、イヌの血液試料中のディ
ー・イミティス・ミクロフィラリアの同定により行われ
ていた（ノット、ジェイ、トランスレージョンズ・オブ
・ローヤル・ソサイエティー・オブ・トロピカル・メデ
ィシン・アンド・ハイジーン（Ｋｎｏｔｔ、Ｊ、　、　
　Ｔｒａｎｓ、　Ｒｏｙ、　Ｓｏｃ。

Ｔｒｏｐ、　Ｍｅｄ、　Ｈｙｇ、　）、　３３．　　Ｉ
　９１〜１９６（１９３９）・ウェイナー、ディー・ジ
エイら、プリテン・オブ・ニス・イー命アソシエーショ
ン・オブ・バイオロジー（Ｗｅｉｎｅｒ、　Ｄ、　Ｊ、
　ｅｔ　　ａｌ、。

Ｂｕｌｌ、　Ｓ、　Ｅ、　Ａｓ５ｏｃ、　Ｂｉｏｔ）、
　　Ｉ　７　；　６９（１９７０））。正確な診断に対
する主な障害は、約３５％の心糸状虫感染イヌが、巡回
ミクロフィラリアが観察されない「潜在」感染として知
られている感染に罹患しているという事実である。潜在
的感染は、（１）ミクロフィラリアを検出できる段階ま
で心糸状虫感染が進行していない、（２）動物が単一の
性のみのディー・イミティスに感染している、（３）該
感染性ディー・イミティス寄生虫が不妊であるか、（４
）該感染が免疫伝達不妊感染である場合のいずれかの場
合に生じうる（ローリンゲス、シー・ニーら、ジャーナ
ル・オブ・アメリカン・ベテリナリー・メディカル・ア
ソシエーンヨン（Ｒａｗｌｉｎｇｓ、　Ｃ，Ａ、　ｅｔ
　　ａｌ、　、　　Ｊ、　Ａｍｅｒ。

Ｖｅｔｅｒ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、　）、　　１８
０．　１３２３〜＋３２６（１９８２））。

イヌ心糸状虫感染の重大性および潜在的ケースにおいて
さえその正確な診断の重要性は、イヌ心糸状虫感染を診
断する別法の開発に導いた。カド−、ケー・エッチ（Ｋ
ａｔｏ、　　Ｋ、　Ｈ，（米国特許第４３２２４９５号
））は、イヌ心糸状虫感染に応答してイヌにより産生さ
れろ抗体を検出てきるイムノアッセイを開示している。

カド−の方法により検出される抗体は、心糸状虫寄生虫
の表面抗原に対するイムノグロブリンの未分画収集から
なる。

このイムノアッセイは、抗心糸状虫抗体の存在を試験す
るので、該試験は、イヌ心糸状虫疾患の潜在および顕在
段階の両方の診断に有用である。

この方法の診断的可能性は、多くの潜在的心糸状虫感染
にみられる抗心糸状虫抗体の低力価によって制限されう
る（ンヨルテンス、アール・ノーら、アメリカン・ジャ
ーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Ｓｃｈｏｌｔ
ｅｎｓ、　Ｒ，Ｇ、　ｅｔ　　ａｌ、　、　Ａｍｅｒ。

Ｊ、Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、）、４４，８６１〜８６４（１９
８３）。さらに、低親和力、交差反応性イヌ抗体による
干渉が、偽陽性結果の比率を増太さ仕ることが判明して
いる（ギリス、ジエイ・エムら、アメリカン・ジャーナ
ル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Ｇｉｌｌｉｓ、　
Ｊ、　Ｍ、　ｅｔ　　ａｌ、　、　Ａｍｅｒ、　Ｊ。

−Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、）、４５．２２８９〜２２９２（１
９８４））。

前記の方法の欠陥は、イヌ心糸状虫疾患を診断する別法
の開発を目的とする研究をさらに刺激した。ワイル、ジ
ー・ジェイら（アメリカン・ジャーナル・オブ・トロピ
カル・メディシン・アンド＋１ハイジーン（Ｗｅｉｌ、
　Ｇ、　　Ｊ、　ｅ’ｔ　　ａｌ、　、　（Ａｍｅｒ。

Ｊ、　Ｔｒｏｐ、　Ｍｅｄ、　Ｈｙｇ、　）、　３３．
４２５〜４３０（１９８４））は、ディー・イミティス
感染が、循環血液中の寄生虫特異的抗原の存在によって
診断されうろことを見出した。かくして、ワイルらの方
法により、標準化抗血清（ディー・イミティスの抗原に
対する抗体を含有する）および潜在的感染イヌの血清の
間の免疫反応は、イヌ心糸状虫感染が発症していること
を示す。その後の研究は、２つのディー・イミティスの
抗原（１０００００ダルトン以上の分子量を有する）が
、フィルら、イムノアッセイ（ワイル、ジー・ジエイ、
イムノロジー（Ｗｅｉｌ、　Ｇ、　　Ｊ、　　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、　）、上ｌ±。

！１８５〜１１９１（１９８５））にて同定された単独
の免疫原性タンパク質であることを示した。

これらの抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を産
生ずるハイブリドーマ細胞系が得られ、フィルおよび共
同研究者により特性付けられた（ワイル、ジーφジエイ
ら（Ｗｅｉｌ、　Ｇ、　　Ｊ、　ｅｔ　　ａｌ、　）（
１９８５）、前記文献）。この研究を記載した特許出願
が米国（出願番号第５５７１１７号）およびオーストラ
リア（出願番号第８４３６０９５号）に出願されている
。フィルにより開発されたイムノアッセイが、近年、ニ
ューヨーク、マリンクロヅド・インコーボレーティッド
のフィラロチェック・ケイナイン・ハートウオーム・ア
ンティジエン・テスト・キット（ｔｈｅ　　Ｐ　Ｉ　Ｌ
ＡＲＯＣＩ４ＥＫｊＭＣＡＮＩＮＥ　　ＨＥＡＲＴＷＯ
ＲＭ　　ＡＮＴｒＧＥＮ　　ＴＥＳＴ　　ＫＩＴ　　ｏ
ＣＭＡＬＬＩＮＣＫＲＯＤＴ、Ｉｎｃ、、Ｎ、Ｙ、）と
して市販されている。

その初期段階において正確に診断した場合、心糸状虫疾
患は十分に治療できる。現在、心糸状虫疾患は、抗寄生
虫剤を感染動物に投与することにより治療する（ブレア
、エル・ニス（Ｂ　１ａｉｒ、　Ｌ　。

Ｓ、）、米国特許第４４３０３２９号）。不索にして、
その初期段階において診断されなかった心糸状虫疾患は
、治療することが全く手に負えなくなる。こういうわけ
で、研究者は、予防ワクチンとして役立ちうる成分を同
定しようと試みている。

前記のごとく、ディー・イミティスの生活環は、イヌお
よび蚊宿主の両方を必要とする。主に蚊に見られる０糸
状寄生虫の第３幼虫期（Ｌ３）は、イヌの免疫応答を誘
発しうる抗原を産生ずることが判明している（ウォング
、エム・エムら、エクスベリメンタル・パラサイトロジ
ー（Ｗｏｎｇ、　Ｍ、　Ｍ。

ｅｔ　　ａｌ、　、　Ｅｘｐｅｒ、　Ｐａｒａｓｉｔｏ
ｌ、　）、　　３５　、　４６５〜４７４　（１９，７
４））。

ウォング、エム・エムおよび共同研究者は、Ｌ３ディー
・イミティス幼虫にＸ線を照射し、該照射幼虫をイヌに
導入した。予防接種したイヌは、低力価の抗心糸状虫抗
体を産生ずることが判明した。感染性非照射し３幼虫で
攻撃した場合、予防接種動物の５０％だけが８糸状感染
のいずれかの臨床的徴候を示した。実験イヌ中の生存上
の集団および媒介動物蚊の大コロニーをＱ（を持するの
に要する高費用が、現在まで、該ウォング「ワクチンコ
の商業的使用を妨げてきた（ウォング、エム・エムら（
Ｗｏｎｇ、　Ｍ、　Ｍ、　ｅｔ　　ａｌ、　）、前記文
献）。

培養の容易な微生物にて心糸状虫抗原を産生させる困難
性が、ルー、ケー、ケー（米国特許第４５６８６３９号
）により報告された。ルーは、それが所望のディー・イ
ミティス抗原を産生できるように培養の容易な切土を修
飾することの可能性を開示している。ルーは、かつて、
かかる遺伝子修飾切土を得、該抗原をコードする遺伝子
をクローンし、該抗原を精製できたことを開示している
。

彼の方法を用いて、ルーは、イヌ心糸状虫感染の診断に
用いることができる線虫ケノルハブディティス・エレガ
ンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　　ｅｌｅｇａｎ
ｓ）の突然変異誘導体を単離するのに成功した。

かくして、要約すると、従来技術は、イヌ心糸状虫疾忠
のための診断試験および予防ワクチンの重要性を開示し
ている。心糸状虫抗原または心糸状虫抗原に対するイヌ
抗体のいずれかの同定に基づく診断試験が開発されてい
る。ディー・イミティスをそのイヌおよび蚊宿主中にて
培養する困難性が、現在まで、商業化可能で有効なワク
チンの開発を困難かつ捕らえどころのない問題としてき
た。

発明の要約本発明は、イヌ心糸状虫疾患に対するワクチンとして有
用な免疫的に活性なタンパク質の発見に基づいている。

さらに、本発明は、たとえ潜在感染であってもイヌ心糸
状虫疾患を診断する方法を提供するものである。さらに
詳しくは、本発明は、約１４ｋｄ。

約５８ｋｄ、約６６ｋｄおよび約９０ｋｄからなる群か
ら選択される分子量を有するポリペプチドであって、該
タンパク質が実質的に天然不純物不含であるディー・イ
ミティスに関係するポリペプチドからなることを特徴と
する。

さらに、本発明は、ディー・イミティスに関係する免疫
的に活性なポリペプチドであって、実質的に天然不純物
不含であり、かつ、約１４ｋｄ、約５８ｋｄ、約６６ｋ
ｄおよび約９０ｋｄからなる群から選択される分子量を
有する該ポリペプチドならびに担体からなることを特徴
とするイヌ心糸状虫疾患の予防に有用なワクチンに関す
る。

本発明は、また、（Ａ）ディー・イミティスに関係する
免疫的に活性なポリペプチドであって、実質的に天然不
純物不含であり、かつ、約１４ｋｄ、約５８ｋｄ、約６
６ｋｄおよび約９０ｋｄからなる群から選択される分子
量を有する該ポリペプチドならびに（Ｂ）担体からなる
組成物の有効ｍを感受性動物に投与することを特徴とす
るイヌ心糸状虫疾小を予防する方法に関する。

本発明は、また、約１４ｋｄ、約５８ｋｄ、約６６ｋｄ
および約９０ｋｄからなる群から選択される分子量を有
するディー・イミティスに関係する免疫的に活性なポリ
ペプチドに結合し得る、実質的に天然不純物不含の抗体
に関する。

本発明は、また、１４ｋｄデイー・イミティス抗原に対
するＩＤｉｌＯモノクロ一ナル抗体を産生するＩＤｉｌ
ＯおよびＧＰＡタンパク質に対するＩＤｉ７６モノクロ
一ナル抗体を産生するＩＤｉ７６細胞系に関する。これ
らの細胞系は、１９８６年８月４日にメリーランド、ロ
ックヒル、ノ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ＡＴＣＣ）に寄託され、それぞれ、ＡＴＣＣ
−ＨＢ９１６４およびＡＴＣＣ−９１６３なる呼称が付
けられた。

本発明は、また、約１４　ｋｄ、約５８ｋｄ、約６６ｋ
ｄおよび約９０ｋｄからなる群から選択される分子量を
有するディー・イミティスに関係するポリペプチドの存
在について動物を検査することを特徴とするディー・イ
ミティス感染を診断する方法を提供するものである。

さらに、本発明は、抗ディー・イミティス抗体の存在に
ついて動物を検査することからなり、該抗体がディー・
イミティスに関係するポリペプチドに結合可能であり、
該ポリペプチドが約１４ｋｄ。

約５８　’ｋｄｓ約６６ｋｄおよび約９０ｋｄからなる
群から選択される分子量を有することを特徴とするディ
ー・イミティス感染を診断する方法を提供するものであ
る。

本発明は、また、（Ａ）抗ディー・イミティス抗体を含
在していると推測される試料に、該抗体により結合され
る前記のポリペプチドであって固体担体に結合している
該ポリペプチドを供給し、（Ｂ）該試料に、第２抗体で
あって検出できるように標識し、かつ、該抗ディー・イ
ミティス抗体を結合可能な該第２抗体を供給し、（Ｃ）
該固体担体に結合している該第２抗体の量を測定するこ
とにより該試料中に存在する該抗ディー・イミティス抗
体の量を測定することを特徴とするイムノアッセイによ
るディー・イミティス感染を診断する方法を提供するも
のである。

本発明は、また、固体担体手段からなり、該担体手段が
約１４　ｋｄ、約５８ｋｄ、約６６ｋｄおよび約９０ｋ
ｄからなる群から選択される分子量を有するディー・イ
ミティスに関係するポリペプチドに結合していることを
特徴とする前記の方法を実施するのに有用な試験細片を
提供するものである。

好ましい具体例の記載本発明は、イヌ心糸状虫感染が、ある種の抗原性ディー
・イミティスボリベプチドの存在について検定すること
により診断されうろという発見に基づいている。

本明細書に用いられているある種の用語をその矛盾のな
い理解に供するため以下に定義する。

ある種の物質を、通常、天然に見出される物質から実質
的に精製した場合に「実質的に天然不純物不含」と称す
る。イヌ心糸状虫抗原に関係しうる天然不純物の例とし
ては、他のペプチド、遊離炭水化物、他のグリコジル化
ペプチド、リピド、膜などが挙げられる。ある種の物質
は、また、これらの不純物が実質的に該物質の試料に存
在しない場合に実質的に天然不純物不含と称する。

「ペプチドフラグメント」なる語は、天然産アミノ酸配
列からの合成および天然産アミノ酸配列誘導体の両方を
包含することを色味す屹。

ある種のポリペプチドは、それが、特定の生物体に関係
して天然に見出されうるか、特定の生物体から誘導でき
る場合に特定の生物体に「関係する」と称する。

ある種のポリペプチドは、それが、天然産の選択した配
列を開裂させることにより得られるか、それが、選択し
た配列またはこの配列をコードする遺伝物質（ＤＮＡま
たはＲＮＡ）の情報に基づいて合成されうる場合に「天
然産アミノ酸配列から誘導しうる」と称する。

本明細書にて用いられているごとく、タンパク質または
ポリペプチドは、それが、ある種の動物に免疫応答の開
始を生ぜしめうる場合に「免疫的に活性」であると称す
る。かかる応答は、免疫的に活性なタンパク質に対する
抗体合成の誘発を包含しうる。

免疫的に活性なタンパク質またはポリペプチドは、ある
種の動物中へのその導入が、疾病起因剤に対して活性で
ある（すなわち、反応または中和しうる）抗体の産生を
もたらす場合に「ワクチンとして有用」であると称する
。したがって、感受性動物へのかかるタンパク質または
ポリペプチドの投与は、さもなければ感受性である動物
を該疾病起因剤から保護しうる。ある種の動物が、該疾
病起因剤の存在に関係する疾病に罹弘しうる種に属する
場合に該動物は疾病起因剤に感受性であると称しうる。

ある種のディー・イミティス抗原は、該抗原が、該寄生
虫が成育する外部環境（すなわち、培養培地、血清等）
中に遊離形（すなわち、ディー・イミティス微生物に対
し非結合）にて、通常、天然に見出される場合に「排出
されたまたは分泌された」と称する。

本発明のディー・イミティス抗原は、２種類に区分され
ろ。［排出〜分泌タンパク質（ＥＳＰ）」と弥する第１
の種類は、成虫により天然に放出される。したがって、
ＥＳＰは、細胞培養培地にて成虫を飼育することにより
得られうる。ディー・イミティス虫を飼育するのに適し
たいずれの培地ら用いることができる。しかしながら、
グルコース４．５ｇ／Ｑ、Ｌ−グルタミン２０ｍＭを含
有するダルｌ＼ツコ修正イーグル培地からなる成長培地
を用いるのか好ましい。該培地は血清を含まない。該培
地を毎日取り換え、アミコンＴＦ′ＹＭ５膜を用いて限
外濾過して該ＥＳＰを収集する。すなわち、ＥＳＰは、
虫担抽出物中に見出される全タンパク質の限定サブセン
トである。それは、１４．１６．１８および２０〜２２
ｋｄの主要タンパク質成分を有する。糖タンパク質抗原
もＥＳＰの成分であるが、前記のものほど顕著ではない
。ｌ　４　ＭＥ　Ｓ　ＰはＬ３幼虫およびディー・イミ
ティスミクロフイラリアおよび成虫により産生される。

本発明により提供される第２の種類の抗原は、「糖タン
パク質抗原Ｊ（Ｇ　Ｐ　Ａ）からなる。「糖タンパク質
」は、共有結合した糖残基を含有するポリペプチドであ
る。これらの抗原は、全ディー・イミティス成虫の粗抽
出物から得ることができる。

ディー・イミティス成虫の粗抽出物は、組織粉砕機を用
いて、核上を２容のリン酸塩緩衝生理食塩水（リン酸ナ
トリウム１０ｍＬＪ、塩化ナトリウム０゜１５Ｍ、ｐ）
Ｉ７．２）に均一化することにより調製した。遠心分離
により残渣を除去し、該上清を収集し、「成虫粗抽出物
」と称した。

本発明に用いられうる抗原性ポリペプチドは、１４．５
８．６６または９０ｋｄのいずれかの分子量を有する複
雑な一連の抗原ま几はそのフラグメントのいずれかであ
る。それは、イヌ発生ディー・イミティス寄生虫の全段
階に発現するディー・イミティス抗原を検定するのに特
に好ましい。さらに、それは、排出または分泌されたデ
ィー・イミティス抗原の存在を検定することによりイヌ
心糸状虫疾屯を診断するのに好ましい。本発明は、１４
．５８．６Ｇまたは９０ｋｄデイー・イミティス抗原の
存在を検定することにより行うことができる。しかしな
がら、それは、５８．６６または９０ｋｄＧＰＡデイー
・イミティス抗原の存在について検定することによりイ
ヌ心糸状虫感染を診断するのに最も好ましい。

心糸状虫ワクチンまたは診断目的として機能しうる前記
ポリペプチドのそれらのアミノ酸配列も本発明の範囲内
に包含される。担体タンパク質への結合を増強するため
に加えた追加のアミノ酸残基または治療もしくは診断効
果を増強するために加えたアミノ酸残基の使用ら包含さ
れる。

本発明は、本明細書に開示されたいずれのディー・イミ
ティス抗原のアミノ酸配列から誘導しうるいずれのペプ
チドも包含するものである。

さらに、本発明は、該選択配列に加え、天然産配列に存
在しない／またはそれ以上のアミノ酸を含有するか欠い
ているポリペプチド、または通常該抗ペプチドに関係す
る該炭水化物のいくつかまたは全てを欠いているポリペ
プチド、または該ポリペプチドが該選択ポリペプチドと
機能的に類似している限り該ポリペプチドに通常関係す
るそれらと異なるグリコジル化のパターンを含有するポ
リペプチドに関する。本発明のかかるポリペプチドは、
それらが、前記心糸状虫抗原のそれと実質的に類似の活
性を示す場合に「機能的誘導体」と称する。

明らかなごとく、該アミノ酸残基は、適当なアミノまた
はカルボキシ保護基を用いて、それらの保護または非保
護形とすることかできる。

不定の長さのペプチドは、遊離アミン（Ｎ−末端の）ま
たはその酸付加塩の形容とすることができる。一般的な
酸付加塩としては、ハロゲン化水素酸塩、すなわち、Ｈ
Ｂｒ、ＨＩまたはより好ましくはＨＣｌ２塩が挙げられ
る。

本発明の一態様において、イヌ心糸状虫疾患は、感受性
宿主動物の体液試料（例えば、血液、リンパ液など）と
免疫反応する抗体（ディー・イミティス抗原に特異的に
結合しうる）の能力を検定することにより診断しうる。

この具体例は、ディー・イミティス抗原の検定である。

本発明のもう１つの態様は、前記のディー・イミティス
抗原のいずれかに対する抗体の存在を検定することによ
りイヌ心糸状虫疾患を診断する方法を提供する。明らか
なごとく、本発明のこれらの目的を達成するために様々
の異なった免疫アッセイおよび方法を適用することがで
きる。

■、ディー・イミティス抗原およびそれに対する抗体用
イムノアッセイ抗原を検定する場合、抗体のごとき結合分子を利用する
結合検定が通常用いられる。

本発明の結合分子は、抗体を予め用いたイムノアッセイ
のいずれかに用いることかできる。１つの態様において
、公知の通常の標識法を用いて、該結合分子を検出でき
るように標識する。すなわち、該結合分子は、例えば、
３Ｈ，＋２Ｊ、′３１１および３５Ｓのごとき放射性ア
イソト−プを用いて放射性標識することができる。

該結合分子は、また、公知の方法を用い、蛍光標識、酵
素標識、フリーラジカル標識またはバタテリオファージ
標識を用いて標識できる。

代表的蛍光標識は、フルオレセインイソチオシアネート
、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、ア
ロフィコシアニンおよびテキサスレッドを包含する。

適当な酵素は、アルカリホスファターゼ、ウレアーゼ、
ベーターガラクトシダーゼ、グルコース−６−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ、マレエートデヒドロゲナーゼお
よびパーオキシダーゼを包含する。

主な２種類のエンザイムイムノアッセイは、酵素結合イ
ムノソルベントアッセイ（ＥＬｒＳＡ）および酵素増幅
イムノアッセイ（ＥＭＩＴ）としても知られる均一酵素
イムノアッセイである。ＥＬＩＳＡ系においては、分離
は、例えば、固相に結合した抗体を用いることにより行
うことができる。

該ＥＭＩＴ系は、トレーサー−抗体複合体中の該酵素の
不活化に基づき、かくして、該活性は、分離工程を要す
ることなく測定できる。

さらに、化学ルミネセンス化合物を標識として用いろこ
とができる。代表的な化学ルミネセンス化合物は、ルミ
ノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステ
ル類、イミダゾール類、アクリジニウム塩およびシュウ
酸エステルを包含する。同様に、ルシフェリン、ルシフ
ェラーゼおよびエクオリンを包含する。

標識後、該結合分子を用いて検出、すなわち、公知の方
法を用いて免疫相対物を同定および／または定量するこ
とができる。かくして、本発明において、「検出」なる
語は、該分子または機能性基の存在の同定を包含し、か
つ、その定量をも包含する。

ラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）の優れた記載は、特
にチャード、ティー、ノース・ホランド・パブリッシン
グ・カンパニー、ニューヨーク、二ニーヨーク州（１９
７８）による「アン・イントロダクション・トウー・ラ
ジオイミューン・アッセイ・アンド・リレイティッド・
テクニクス」（“ＡｎＩ　ｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　　
ｔｏ　　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ　　Ａｓ５ａｙ　　ａ
ｎｄＲｅｌａｔｅｄ　　Ｔ　ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ″ｂｙ
　　Ｃｈａｒｄ、　Ｔ、　。

Ｎｏｒｔｈ　　　　Ｈｏ１ｌａｎｄ　　　　Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ　　　　Ｃｏｍｐａｎｙ。

Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ、　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ（１９７８
））なる表題の章に関する、ワーク、ティー・ニスらに
よるラボラトリ−・テクニクス・アンド・バイオケミス
トリー・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｌ　ａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　　Ｔ　ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　　ａｎｄ
　　Ｂ　１ｏｃｈｌＩｌｉｓｔｒｙｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　ｂｙ　　Ｗｏｒｋ、　
Ｔ、　Ｓ。

ｅｔａｌ、）に見出されうる。

本発明の結合分子は、また、「２部位」（“２−ｓｉｔ
ｅ”）または「サンドイッチ」検定としても知られる免
疫計量検定に利用するために適用できる。代・友釣免疫
計量検定において、一定量の未標識抗体を、試験する該
体液に不溶な固体担体に結合し、かつ、固相抗体、抗原
および標識抗体の間に形成された三重複合体の検出およ
び／または定量を許容する標識を結合した一定量の可溶
性抗体を加える。

代表的免疫計量検定は、最初に該固相に結合した抗体を
試験する試料に接触さ仕、二重固相抗体−抗原複合体の
形成により該試料から該抗原を抽出する［フォワード（
ｆｏｒｗａｒｄ）Ｊ検定を包含する。

適当なインキュベーション期間後、該固体担体を洗浄し
て、たとえあったとしても未反応抗原を含む該体液試料
の残渣を除去し、ついで、未知量の標識抗体を含有する
該溶液と接触させる。該標識抗体を該未標識抗体を介し
て該固体担体に結合した該抗原と複合させる第２インキ
ュベーション期間後、該固体担体を別の一定時間洗浄し
て該未反応標識抗体を除去する。この種のフォーワード
・サンドイッチ検定は、単なる「存在／非存在」検定て
あり、抗原が存在しているか否かを測定するか、標識抗
体の測定と既知量の抗原を含有する標準試料について得
られた測定を比較することにより定量を行うことができ
る。これらの「２部位」または「サンドイッチ」検定は
、「ラジオイミューン・アッセイ・メソッド」、カーク
ハムおよびハンター編、イー・アンド・ニス・リビング
ストン、ニブインバーブ（”Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ　
　Ａｓ５ａｙ　　Ｍｅｔｈｏｄ”ｅｄｉｔｅｄ　　ｂｙ
　　Ｋｉｒｋｈａｍ　　ａｎｄ　　Ｈｕｎｔｅｒ、　Ｅ
、　＆Ｓ　、　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、　Ｅｄｉｎｂ
ｕｒｇｈ）、　１９７０の１９９〜２０６頁にワイド（
Ｗｉｄｅ）により記載されている。

本発明の抗原にも有用な別種の「サンドイッチＪ検定に
おいては、いわゆる「同時」および「逆」検定を用いろ
。同時検定は、該固体担体に結合した抗体および標識抗
体を共に試験する試料に同時に加えるごとき単一インキ
ュベーシぢン工程を包含する。インキュベーション終了
後、該固体担体を洗浄し、体液試料の残渣および非複合
標識抗体を除去する。ついで、該固体担体に関係した標
識抗体の存在を、通常の「フォーワード」サンドイッチ
検定におけるごとく測定する。

逆検定においては、まず、標識抗体の溶液を該体液試料
に段階的に加え、適当なインキュベーション１ｇ１間を
用いた後、固体担体に結合した未標識抗体を加えるっさ
らにインキュベーション後、該固相を常法にて洗浄して
試験する試料の残渣および未反応標識抗体の溶液をそれ
に含まれないようにする。ついで、固体担体に関係する
標識抗体の測定を同時およびフォーワード検定における
ごとく行う。

以上の説明のごとく、抗原に関する免疫計量検定は、特
定の結合分子が「リポータ−分子」で標識されている必
要がある。これらのリポータ−分子または標識は、前記
の同定のごとく、通常の公知のものである。本発明の実
施において、酵素標識が好ましい態様である。ただ１つ
の酵素だけが、全ての考えられうる免疫計量検定におい
て標識として用いるのに理想的ではない。代わりに、ど
の酵素が特定の検定系に適しているか決定しなければな
らない。酵素の選択に重要な規準は、純粋な酵素の転換
数（単位時間当りの酵素部位当りの産生物に変換された
基質分子の数）、該酵素調製物の純度、その産生物の検
出の感度、該酵素反応の検出の容易さおよび速度、該試
験体液中の妨害因子または酵素様活性の欠如、該酵素お
よびその共役物の安定性、該酵素およびその共役物の入
手可能性および費用等である。本発明の免疫計量検定に
標識として用いられる酵素の中には、セイヨウワサビパ
ーオキシダーゼアルカリホスファターゼ、ベーターＤ−
ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、グルコアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリン
エステラーゼ、リゾデーム、マレートデヒドロゲナーゼ
オ５よびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼが包含される。ウレアーゼは、特に、その活性を肉眼
にて容易に認識できるようにする発色性１）　ｔＩ指示
薬であるため、好ましい酵素標識に包含される。

本発明の該標識結合分子または抗体は、公知の方法を用
いて調製できる。代表的な方法は、ケネディ、ジエイ・
エッチら、クリニカル・ヒミカ・アクタ（Ｋｅｒｉｎｅ
ｄｙ、　　Ｊ、　Ｈ，ｅｔ　　ａｌ、　、　ＣＣｌ１ｎ
Ｃｈｉ、Ａｃｔａ）、７０．１〜３１（１９７６）およ
びシュールズ、ニー・エッチ・ダブりニー・エムら、ク
リニカル・ヒミカ・アクタ（Ｓ　ｃｈｕｕｒｓ、　Ａ　
。

Ｈ，Ｗ、　　Ｍ、　　ｅｔ　　ａｌ、　　Ｃｌ１ｎ、　
　Ｃｈｉｍ、　　Ａｃｔａ）。

８１．１〜４０（１９７７）により記載されている。

後者に記述されている結合法は、ゲルタールアルデヒド
法、過ヨウ素酸塩法、シマレインイミド法、ｍ−マレイ
ンイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシースクシンイミドエ
ステル法であり、これらの全てのの方法が本明細書に包
含される。

本発明のモノクローナル抗体は、コーラ−ら、ネイチャ
ー（Ｋｏｈｌｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、　、　Ｎａｔｕｒ
ｅ）、２５６．４９５〜４９７（１９７５）の方法を適
用することにより産生できる。すなわち、本発明のモノ
クローナル抗体を得るため、マウス、好ましくはＢＡＬ
Ｂ−Ｃマウスを、免疫応答を誘発しうる量のディー・イ
ミティス抗原にて免疫感作する。他の手段を用いること
もできるが、５〜２００μ９の間のディー・イミティス
抗原の腹腔内注射によりマウスを免疫感作するのが好ま
しい。必要ならば、該マウスの免疫応答は、最初の免疫
化の２〜３力月後投与する追加抗原刺激用量の静脈内ま
たは腹腔内注射により増強できる。該追加抗原刺激用量
は、好ましくは、５〜５０μ９の間である。

最初の免疫感作の約２〜３ケ月後、該マウスを層殺し、
ゲハードら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノ
ロジー（Ｇｅｒｈａｒｄ　　ｅｔ　　ａｌ、　、　Ｅｕ
ｒ。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ！、）、５，７２０−７２５（１９７
５）により教示された方法にて膵臓細胞＠詞液を調製す
る。本発明のモノクローナル抗体を産生しうるハイブリ
ドーマ細胞は、前記１１１’−微細胞とコーラ−ら（Ｋ
ｏｈｌｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、　）、前記文献により記
載されたＭＯＰＣ−２１系または、好ましくは、シュル
マン、エムら、ネイチャー（Ｓｃｈｕｌｍａｎ、　Ｍ、
　ｅｔａｌ、、　　Ｎａｔｕｒｅ）、２７６．２６９−
２７０（１９７８）により記載された５Ｐ２１０メラノ
ーマ細胞系のごときメラノーマ細胞系を融合することに
より形成する。ディー・イミティス抗原に対するモノク
ローナル抗体を産生ずるそれらのハイブリドーマ細胞系
は、得られたハイブリドーマ細胞系により産生されたイ
ムノグロブリンと精製ディー・イミティス抗原をインキ
ュベートすることにより同定する。抗ディー・イミティ
ス抗体を産生するハイブリドーマ細胞系とこれらの抗原
を反応し、それにより、同定、精製および所望のモノク
ローナル抗体産生細胞系の増殖を可能にする。本明細書
にて用いられているごとく、診断試薬（抗体または抗原
のごとき）の有効量は、前記の診断的識別を行うことを
可能とする量である。診断試験に用いる抗体の量は、通
常、０．０１〜１μ９、好ましくは、０．１−１μ９で
ある。診断検定に用いる抗原の量は、代表的には、０．
０１−１μ２、好ましくは、０．１〜１μ９である。

さらに、本発明は、ディー・イミティス抗原に対ｌ、て
特異的である抗体の存在を検出する方法を提供するので
ある。動物の血ｌｎ中のかかる抗体の存在は該動物がイ
ヌ心糸状虫寄生虫に以前または現在暴露していることを
示している。したがって、抗ディー・イミティス抗体の
検出および定量に基づくイムノアッセイは、イヌ心糸状
虫疾弘を診断する別の方法を提供する。かかるイムノア
ッセイは、フリドレンダー、ビー・アール（Ｆ　ｒｉｄ
ｌｅｎｄｅｒ。

Ｂ、Ｒ，）、米国特許第４３１３９２７号の方法を適用
することにより行うことができＳｏすなわち、精製した
ディー・イミティス抗原を固体表面にカップルまたは結
合する。前記結合法のいずれも、この目的を達成するた
めに修正しうる。該抗原が結合する固定化表面は、ナイ
ロン、ラテックス、グラス、シリカ、ポリエチレン、ポ
リスチレン、ポリビニルクロライドまたはポリカーボネ
ートのごとき多種類の可能性のある表面から選択できる
。該担体物質は、該結合抗原が、供給されるいずれのデ
ィー・イミティス抗体にも結合しうる限り事実上、いず
れらの可能な構造的形容をとりうる。すなわち、該担体
形態は、ビーズのごとき球形または試験管の内面もしく
は棒の外面のごとき円筒形であってよい。さらに、該表
面は、ンート、試験細片等のごとき平面であってもよい
。

抗ディー・イミティス抗体の存在を検定するため、結合
ディー・イミティス抗原（前記のごとき）を、血清の試
料またはディー・イミティス抗体を含有すると推測され
る他の体液と免疫反応しワーク、ティー・ニスら（Ｗｏ
ｒｋ、　Ｔ、　Ｓ、　ｅｔ　　ａｌ、　。

前記文献）させるに十分な方法にてインキュベートする
。すなわち、該結合ディー・イミテイス抗原に特異的な
いずれの抗体も該抗原に結合し、それにより該固体表面
上に固定化する。このインキュベーションを１〜３０分
間の期間継続させた後、該結合抗原−固体表面（いずれ
のディー・イミティス抗体ら結合している）を十分洗浄
して該試料中に存在するいずれの非結合ディー・イミテ
ィス抗体ら除去する。これらの非結合抗体の存在は、該
試料が該結合ディー・イミティス抗原の結合能力を超え
る量のディー・イミティス抗体を含有しているという事
実を表わしている。さらに、非結合抗体の存在は、該イ
ムノアッセイが完結するまで進行しないという事実を表
わしている。

ついで、洗浄固体担体（前記）を、該結合ディー・イミ
ティス特異的抗体に結合しうろ第２の抗体の存在下にイ
ンキュベートする。それ故、この第２の抗体：よ、該固
体表面に結合した特定のディー・イミティス抗体に特異
的なイムノグロブリンであってよい（「抗抗ディー・イ
ミティス抗体」）。さらに、該第２抗体は、該体液試料
を供与する種から得たいずれの抗体と反応しうるちので
あってよい。すなわち、例えば、イヌ体液の試料からの
ディー・イミティス抗体の存在を検定したい場合、それ
ゆえ、第２の抗体は、抗抗ディー・イミティス、抗イヌ
抗体または実質的にイヌ抗体と交差反応性を有する抗体
のいずれかとすることができろ。

本発明によれば、前記イムノアッセイに用いる第２抗体
を、該第２抗体を該複合第１抗体に結合させるのに十分
な条件下にて該固体表面−抗原−結合ディー・イミティ
ス抗体複合体の存在下にインキュベートする。かかるイ
ンキュベーション期間後、該固体表面を洗浄し、該複合
ディー・イミティス抗体に結合した第２抗体の量を測定
する。

該第２抗体は該結合ディー・イミティス抗体へのその結
合を通してのみ該固体表面に付着するので、該固体表面
に結合した第２抗体の量は、検査する体液試料に存在す
る抗ディー・イミティス抗体の濃度を示し、かつ、比例
する。すなわち、本発明によれば、体液試料中に存在す
る該抗ディー・イミティス抗体の量は、それに結合した
第２抗体の量を測定することにより決定される。この測
定を実施するためには、第２抗体を検出できるように標
識するのが好ましい。多種類の標識を本発明に用いるこ
とかできる。すなわち、例えば、第２抗体は、ＩＡｃ、
ＩＩＪ等のごときラジオアイソトープにて放射性標識し
てよい。さらに、蛍光を発しうる化合物群を第２抗体に
結合し、ついで、蛍光発光により検出しうる。適当な蛍
光標識および結合法は前記のごとくである。さらに、第
２抗体を前記のごとき酵素にて標識しうる。明らかなご
とく、結合第２抗体の量の検出また゛は定量を可能とす
る第２抗体のいずれの検出可能標識手段も本発明に用い
ることができる。

■、ディー・イミティス抗原に用いるワクチン組成物イヌ心糸状虫感染の診断方法の提供に加えて、本発明は
、また、かかる感染の開始を予防しおよび感染動物を治
療する手段を提供する。本発明の１つの発見は、ディー
・イミティス抗原（１４，５８，６６または９０ｋｄの
いずれかの分子量を存する）を含有する組成物がワクチ
ンとして適しているという事実である。すなわち、かか
る抗原の投与は、心糸状虫寄生虫に結合しまたは中和し
うる抗体の合成をもたらす。抗心糸状虫抗体の形成を誘
発しうるいずれものかかるディー・イミ゛ティス抗原を
用いることもできるが、イヌ心糸状虫寄生虫の１４ｋｄ
抗原性タンパク質をワクチン候補として用いるのが好ま
しい。

本発明は、また、イヌ心糸状虫寄生虫に感染した動物の
受動治療の手段を提供する。本発明のこの具体例におい
て、ディー・イミティス抗原に特異的に結合しうる抗血
清を感染動物に導入する（注射によるごとき）。

明らかなごとく、ワクチン組成物は、塩、緩衝剤、アジ
ュバントまたは該ワクチン組成物の効力を改善するのに
好ましい他の物質を含有してよい。

アジュバントは、特定の免疫応答を特異的に増加させる
ために用いることのできる物質である。通常、該アジュ
バントおよび該抗原は、該免疫系に投与する曲に混合す
るか、別々に、しかし、免疫感作するりｊ物の同一部位
に投与する。アジュバントは、それらの成分に基づいて
いくつかの群に大雑把に分割できる。これらの群は、オ
イルアジュバント（例えば、フロイント完全および不完
全）、無機塩（例えば、Ａ＜！Ｋ　（Ｓ　Ｏ４）ｔｌ、
へＱＭａＣ３０−）ｔ、八〇、ＮＦ■、（ＳＯ４）、シ
リカ、カオリンおよび炭素）、ポリヌクレオヂド（例え
ば、ポリＩＣおよびポリＡＵ酸）およびある種の天然物
質（例えば、マイコバクテリウム・ラベルクロシス（Ｍ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）
からのワックスＤならびにコリネバクテリウム・パーバ
ム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕｍ）ま
たはボルデテラ・ペルツシス（［３ｏｒ−ｄｅｔｅｌｌ
ａ　　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）中に見出される物質および
プルセラ（Ｂ　ｒｕｃｅｌ　ｌａ）属の構成員）を包含
する。アジュバントとして特に有用な物質中には、例え
ば、キルＡ（スーパーホス（Ｓ　ｕｐｅｒｆｏｓ）Ａ　
／　Ｓ　、デンマーク）のごときサボニンが含まれろ。

ワクチン組成物に用いるのに適している物質の例は、レ
ミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンンーズ
（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ　　５ｃｉｅｎｃｅｓ）（オソル、ニー編、マッ
グ・パブリッシング・コーポレーション、イーストン、
ペンンルベニア（Ｏｓｏｌ、Ａ、、　Ｅｄ、、　Ｍａｃ
ｋ　　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　　Ｃｏ、。

Ｅａｓｔｏｎ、　Ｐａ、　）、１３２４〜＋３４１頁（
１９８０））にて供給される。

該ワクチン組成物は、注射、急速点滴注射、鼻咽頭吸収
（経鼻咽頭）、経皮吸収により非経口投与または経口投
与できる。さらに、該ワクチン組成物は、筋肉内または
静脈内投与できる。非経口投与用調製物は、滅菌または
水性まｒコは非水溶液、懸濁液およびエマルジョンを包
含する。非水溶媒の例としては、プロピレングリコール
、ポリエチレングリコール、オリーブ油のごとき植物油
およびオレイン酸エチルのごとき注射用有機エステルが
挙げられる。担体または閉鎖包帯は、皮膚透の性を高め
、かつ、抗原吸収を増強するｒ二めに用いろことができ
る。経口投与用液体投与形態は、通常、リポソーム溶液
を含有する該液体投与形態からなる。リポソームを懸濁
するのに適した形態は、エマルジョン、＠濁液、溶液、
シロップおよび精製水のごとき当該分野にて通常用いら
れている不活性希釈剤を含有するエリキシルを包含する
。該不活性希釈剤のほかに、かかる組成物は、またアジ
ュバント、加湿剤、乳化および懸濁剤または甘味剤、フ
レーバーまたは香料を含有しうる。

多重免疫感作法を用いる場合、該免疫感作のタイミング
に対して多くの異なる方法が存在する。

該免疫感作動物により発現されたイムノグロブリンｍの
発現のレベルおよび多様性を増大させるため何度も本発
明の抗原性調製物を用いることができる。代表的には、
多重免疫感作する場合、それらは、１〜３力月間隔にて
投与する。

本発明によれば、「有効量」のワクチンは、所望の生物
効果を達成するのに十分な量である。通常、有効量の該
ワクチンからなる動物に投与する該ワクチン組成物の用
量は、例えあるとしても、該動物の年令、状態、性およ
び疾病の程度のごとき因子および当業者により調製され
うる他の変量により変化する。

本発明の抗原性調製物は、有効量の単一または多重用１
のいずれかにより投与できる。本発明の組成物の有効量
は、■用量光り０．０１−１０００μ９／ｘ（１、さら
に好ましくは、■用量光り０．１〜５００μｇ／ｍ（１
、最も好ましくは、■用量光り１０〜３００μ？／　１
ｒＱの間で変更できる。

求皇履つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
これらに限定されるものではない。

実施例１ディー・イミティスＢＳＰの調製８％ＣＯ３中３７℃にて２〜４週間、ディー・イミティ
ス虫をダルベツコ修正イーグル培地（グルコース４．５
９／１２、ＨＥＰＥＳ２０ｍＭおよびし一グルタミン２
ｍＭを補足）にて成育させる。該培地を毎日取り換える
。培養培地の試料を毎日取り換え、排出−分泌タンパク
質を限外濾過により除去する。該上清物質を１２％また
は１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のい
ずれかに付し、ニトロセルロース紙（ミリボアＨＡＨＹ
Ｏ０００１）に移す。心糸状虫感染または非感染イヌか
らの血清をこれらのニトロセルロース紙にてインキュベ
ートする。感染イヌ血清に存在する抗体によってのみ認
識される抗原を抗イヌｒｇＧ（アルレリクス）を用い、
ついでヤギ抗マウスＩｇＧバーオキノダーゼ（カッペル
）を用いて可視化する。

所望のＥＳＰ抗京を該ゲルから溶出し、精製する。

電気泳動およびニトロセルロース移転の方法は、マニア
ナイス、ティーら（モレキュラー・クローニング・ア・
ラボラトリ−・マニュアル、コールド・スプリング・ハ
ーバ−、ニューヨーク（１９８２））（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ、　Ｔ、　ｅｔ　　ａｌ、　（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ　　Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａ
ｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ、
　ＮＹ（１９８２））により開示されている。

実施例２ＧＰＡタンパク質の調製全ディー・イミティス虫を面圧実施例１のごとく培養す
る。成虫岨抽出物を前記のごとく調製し、１２％５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付す。該電気泳動
パターンをニトロセルロース紙に移し、イヌ心糸状虫感
染イヌ血清の抗体により認識できる抗原を、抗イヌＩｇ
Ｇおよび結合パーオキシダーゼ反応を用いて可視化する
。糖タンパク質抗原（ＧＰＡ）は、物質の広いじみとし
て検出され、最小抗原サイズは約１０ｋｄである。より
強い強度のじみのバンドは、５８．６６．９０および１
２０ｋｄにて可視化される。

実施例３ＥＳＰ抗原に特異的な抗体を産生しうるハイブリドーマ
の：Ａ製ＥＳＰ抗原を前記実施例Ｉのごとく調製する。

約２００μ２のＥＳＰ試料を５ＤＳ−１２％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により精製する。ＥＳＰタンパク
質は、該ゲルを冷１００ｍＭＫＣＱ中に浸漬することに
より可視化する。適当なバンドを該ゲルから切断し、つ
いで分子量により精製する。該ゲルの一部を、リン酸塩
緩衝生理食塩水の存在下ポリトロン組織粉砕機にて細く
砕く。２匹のマウスのそれぞれに１４　ｋｄＥ　Ｓ　Ｐ
抗原」０μ９の３免疫感作を行う（Ｑ、５！Ｑ／１免疫
感作）。

該マウスを層殺し、コーラ−、ジーら、ネイチャー（Ｋ
ｏｈｌｅｒ、　Ｇ、　ｅｔ　　ａｌ、　、　Ｎａｔｕｒ
ｅ）、　　２５６　。

４９ｂ（１９７５）の記載のごとく膵臓細胞／メラノー
マ融合を行う。ウレアーゼを基本とするＥＬＩＳＡにて
ＥＳＰ被覆ポリビニルプレートを用い心糸状虫特異的抗
体についてハイブリドーマ上清をスクリーニングする。

抗１４ｋｄ抗体を分泌するハイブリドーマをクローンす
る。

前記と同方法にて、ＧＰＡタンパク質を精製し、それを
用いてマウスを免疫感作し、該ＧＰＡタンパク質に対す
るモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ系を産
生させる。２つのかかるモノクローナル抗体産生細胞系
を得る。粗抽出物の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動後のイムノプロットに関し、ＧＰＡは、これらの
抗体によりＩ　０ｋｄ−＋　２０ｋｄの分子量の範囲の
物質の広いじみとして検出される。

実施例４ＥＳＰ抗原およびＧＰＡタンパク質の特性付けＥＳＰ抗
原およびＧＰＡタンパク質を認鑓する抗体の存在につい
て、感染後種々の時間心糸状虫感染イヌからの血清をサ
ンプリングする。ＥＳＰの成虫粗抽出物ｌＯ〜５０μ９
を１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに付す。該タ
ンパク質をニトロセルロースに移し、イヌ血清にてイン
キュベートする。抗ディー・イミティス抗体をモノクロ
ーナル抗イヌＩｇＧ、ついでヤギ抗マウスＩｇＧパーオ
キシダーゼにより可視化する。かくして、感染イヌ血清
中の抗体によりそれぞれの心糸状虫抗原を検出する。感
染後早くも３力月にて１＝ｉｋｄ抗原およびＧＰＡタン
パク質の両方を矛盾なく検出し、認識する。感染後約５
カ月まで成虫は存在しないので、この結果は、＋４ｋｄ
抗原およびＧｌ’Ａタンパク質の両方が該心糸状虫生物
体の成育の幼虫期に必ず発現するということを示してい
る。

さらに、該１４ｋｄ抗原および該ＧＰＡタンパク質は、
ディー・イミティス成育の全段階において発現されるこ
とが見出された。

Ｎａ”’Ｉを用いｉｎ　　ｖｉｖｏにてディー・イミテ
ィス虫をインキュベートする場合、外表面タンパク質の
みが放射性標識される。１ｍＣ４Ｎａ”Ｊおよびクロミ
ランＴｌ　００μ９／７Ｑを用い０℃にて１０分間生存
ディー・イミティス成虫をインキュベートする。Ｎａ＊
５ｔＯｓを用いて該標識化を止め、＋２Ｊ　　ｆｑ識虫
をホモジネートする。抗１４ｋｄモノクローナル抗体は
放射性標識化１４ｋｄ抗原を免疫沈澱でき、したがって
、該１４ｋｄ抗原は、ディー・イミティス表面または膜
タンパク質であることが確認される。対応する実験は、
いずれの放射性標識ＧＰＡも同定できなかった。

該１４ｋｄ抗原の生化学的特性付けは、該タンパク質が
ネイティブモノマーであることを示している。ゲル濾過
フラクションに関係する炭水化物を検定し、アラビノー
スおよびマンノース標品と比較する。該炭水化物濃度と
抗ＧＰＡおよび抗１４ｋｄ抗体により測定した同一フラ
クションの抗原活性を比較する。ＧＰＡ５００μ９／Ｉ
ＩＱの炭水化物ピークはＧＰＡタンパク質６００μ９／
ｍ（ｌと関連している。１４ｋｄ抗原活性を含存するフ
ラクションは、測定可能な炭水化物をほとんどまたは全
く有しない（最高推定値は、タンパク質５００μｇ／ｍ
Ｑと比べ炭水化物２５μｇ／ｙＱである。）。

実施例５イヌ心糸状虫疾患用診断試験本発明にて開示したいずれの抗原ら、イヌ心糸状虫疾巳
用診断試験に用いることができる。Ｇｌ）Ａタンパク質
用ＥＴＡ（エンザイムイムノアッセイ）を開発した。こ
の検定においては、ポリビニルプレートまたはガラスキ
ャピラリデユープを、ＧＰＡに対して特異的なモノクロ
ーナル抗体（ＳｔＡｂｓ）を付着させる固体坦体として
用いる。［ＭＡｂｓを、０．１Ｍ炭酸塩緩衝ｔＬ（ｐＨ
９、６）中ポリビニルまたはポリスチレンプレートに受
動吸着させる；ＭＡｂｓを、ガラスキャピラリチューブ
とアミノプロピルトリエトキシシランをインキュベート
することにより予め活性化したガラスキャピラリチュー
ブに共有結合的に結合する。？ｖＩＡｂｓを、ゲルター
ルアルデヒドにより活性化したチューブに架橋する。］
ついで、イヌ血清を該固体坦体の存注下にインキュベー
トした後、酵素ウレアーゼに共役しｆこ第２モノクロー
ナル抗体の存在下に続いてインキュベートする。イヌ血
清中に存在するいずれのＧＰＡも第１モノクローナル抗
体に結合する。この検定を用いると、感染後早くも５力
月（該寄生虫の若成虫期）でＧＰＡを検出できる。ディ
ロフイラリア０レペンス（Ｄ　１ｒｏｆｉｌａｒｉａ　
　ｒｅｐｅｎｓ）、ノペタロネマ・レコンジタム（Ｄ　
ｉｐｅｔａｌｏｎｅｍａｒｅｃｏｎｄｉｔｕｍ）または
トキソカラ・カニメ（Ｔｏｘｏｃａｒａｃａｎｉｓ）の
ごとき寄生虫により感染したイヌの血清中の抗原に対し
て、例えあるとしても非常に僅かの交差反応しか見られ
ない。

実施例６＋４ｋｄ抗原の精製面圧実施例３のごとく該＋４ｋｄ抗原に対するモノクロ
−゛ナル抗体を調製する。該モノクローナル抗体をＣＮ
　Ｂ　ｒ活性化セファロースカラムに付着させ、モノク
ローナル抗体アフィニティカラムを形成する。このモノ
クローナル抗体アフィニティカラムは、虫粗抽出物また
は細胞培養上清からたった１回の工程にて少なくとも９
８％の均一性まで該１４ｋｄ抗原を精製できる。ついで
逆相カラムＩｔＰＬＣを用いて分画して本質的に均一な
調製物を得る。ＨＰＬＣには、バイダック（Ｖ　ｙｄａ
ｃＴＨ）Ｃ４逆相カラム、粒子サイズｌＯμ、孔サイズ
３００人を用いる。濃度勾配法にて溶出を行う。試料を
０．１％水中ＴＦＡに入れ、０．０５％ＴＦ”Ａ含有ア
セトニトリルの線型濃度勾配法を用いて溶出する。

実施例フイヌ心糸状虫疾患用ワクヂンディー・イミティスの第３期成虫（Ｌ３）を、実験的に
感染させた蚊から切開し、直ちに、１０％ウマ血清含有
イスコウブ（Ｉ　５ｃｏｖｅ）の修正ダルベツコ培地（
ＧＩＢＣＯラボラトリーズ）に入れる。幼虫１００匹を
、培地０　、５　ｙ（ｌ含有ウェル（ウェル組織培養プ
レート２４個を用いて）３６個のそれぞれに移す。マウ
ス腹腔マクロファージを１４個のウェルに加える（ｌウ
ェル当り１０５マクロフアージ）。前記のごとく調製し
たアフィニティ精製モノクローナル抗体を別々にまたは
１００μ９７Ｍ（１または２００μ９７Ｍ（ｌの濃度に
て混合物にて該ウェルに加える。抗ディー・イミティス
１４ｋｄ抗原モノクローナル抗体を、ＩＤｉ５、ＩＤｉ
ｌＯ１ＩＤｉ３７および２ＤＩ２２と称する。抗ディー
・イミティスＧＰＡタンパク質モノクローナル抗体を、
ＩＤｉ７６．５Ｄｉ５２．５Ｄｉｌ１５および５’Ｄｉ
３１と称する。モノクローナル抗体２Ｇ１３１および６
６６７は抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗体である。該
モノクローナル抗体の添加後毎日生存および脱皮につい
て該幼虫を観察する。

３７℃、大気圧下にてｉｎ　　ｖｉｔｒｏ培養第１培養
第１抗目４ｋｄ抗原モノクローナル抗体含有ウェルのい
くつかに幼虫クヂクラの形態変化が見られた。

これらの形態の変化は、培養の３日目までに明らかにな
る該幼虫の死亡を速める。この実験の結果を第１表に示
す。該マウスマクロファージは認識てきる効渠を有さず
、したがって、その存在または非存在は重要ではない。

第１表３日目なし　　　　　　　　　　　　９０ＩＤｉｌＯ（１００７ｚ　９１ｍ（１）　　　　　　　
３　　　　１００ＩＤｉｌＯ（２００μ９／肩Ｑ）　　
　　　　　３　　　　１００１ＤｉｌＯ＋　！Ｄｉ５＋
　１Ｄｉ３７＋　２Ｄｉ２２（各２５μｇ＃＋ｆｆ）　
　　　　　　　　　３　　　　　１００ＩＤｉｌＯ＋　
ＩＤｉ７６（各１００μｇ／ｌ（り　　　　　　　　　２　　　　
　１００ＩＤｉ７６（１００μ９＃Ｉ４）　　　　　　
　２　　　　　０ＩＤｉ７６（２００μｇ／ｍ１２）　
　　　　　　２　　　　　０１Ｄｉ７６＋５Ｄｉ５２＋
５Ｄｉｌ１５＋６Ｄｉ３１（各２５ｔｔ　９／１１７９
）２　　　　　　ｔｏ０２Ｇ１３１（１，００μ９／肩
Ｃ）　　　　　　　　　　　　　０２Ｇ１３１（２００
μ９／ｍＱ）２　　　　　０６Ｇ６７（１００μ９ｈｎ
Ｑ）　　３　リ６Ｇ６７（２００μ９７匁０　　　　　
　３６７第２表は、用いた抗体の種類により分類した前
記実験の結果を示している。抗１．ｉｋｄおよび抗ＧＰ
Ａ抗体は共にディー・イミティス幼虫を十分に殺虫する
ことをこれらの結果は示している。精製１４ｋｄおよび
ＧＰＡタンパク質（それぞれ）による予防接種に応じて
これらの抗体が増加するので、イヌ心糸状虫ワクチン中
の１４ｋｄＥＳＰ抗原およびＧＰＡタンパク質の潜在的
効力をこれらの結果は示している。

第２表３日目なし　　　　　　　　　　　　９０抗１４ｋｄ　　　　　　　　　９　　　　ｔｏ。

抗Ｇ　Ｐ　Ａ　　　　　　　　　　６　　　　３３抗１
４ｋｄ＋抗Ｇ　Ｐ　Ａ　　　　　２　　　　１００抗ｈ
ＣＧ　　　　　　　　　　　１０　　　　　２、特許出
願人　アレリックス・インコーボレイテソド

Claims

【特許請求の範囲】

（１）約１４ｋｄ、約５８ｋｄ、約６６ｋｄおよび約９
０ｋｄからなる群から選択される分子量を有し、実質的
に天然不純物不含であるディー・イミティス（Ｄ．ｉｍ
ｍｉｔｉｓ）に関係するポリペプチド。
（２）約１４ｋｄの分子量を有する前記第（１）項のポ
リペプチド。
（３）ディー・イミティスにより産生される前記第（１
）〜（２）項のいずれかのポリペプチド。
（４）糖タンパク質である前記第（１）〜（２）項のい
ずれかのポリペプチド。
（５）分泌−排出タンパク質である前記第（４）項の糖
タンパク質。
（６）ディー・イミティスに関係する免疫的に活性なポ
リペプチドであって、実質的に天然不純物不含であり、
かつ、約１４ｋｄ、約５８ｋｄ、約６６ｋｄおよび約９
０ｋｄからなる群から選択される分子量を有する該ポリ
ペプチドならびに担体からなることを特徴とするイヌ心
糸状虫疾患の予防に有用なワクチン。
（７）該ポリペプチドが約１４ｋｄの分子量を有する前
記第（６）項のワクチン。
（８）該担体がフロイント完全アジュバント、フロイン
ト不完全アジュバント、無機塩、ポリヌクレオチドおよ
びサボニンからなる群から選択されるアジュバントから
なる前記第（６）〜（７）項のいずれかのワクチン。
（９）（Ａ）ディー・イミティスに関係する免疫的に活
性なポリペプチドであって、実質的に天然不純物不含で
あり、かつ、約１４ｋｄ、約５８ｋｄ、約６６ｋｄおよ
び約９０ｋｄからなる群から選択される分子量を有する
該ポリペプチドならびに（Ｂ）担体からなる組成物の有
効量を感受性動物に投与することを特徴とするイヌ心糸
状虫疾患を予防する方法。
（１０）（Ａ）ディー・イミティスに関係する免疫的に
活性なポリペプチドであって、実質的に天然不純物不含
であり、かつ約１４ｋｄ、約５８ｋｄ、約６６ｋｄおよ
び約９０ｋｄからなる群から選択される分子量を有する
該ポリペプチドを結合可能なイムノグロブリンならびに
（Ｂ）担体からなる組成物の有効量を感受性動物に投与
することを特徴とするイヌ心糸状虫疾患を予防する方法
。
（１１）該組成物を非経口、静脈内、筋肉内、経鼻咽頭
、経口または経皮吸収により投与する前記第（９）〜（
１０）項のいずれかの方法。
（１２）ディー・イミティスに関係する、約１４ｋｄ、
約５８ｋｄ、約６６ｋｄおよび約９０ｋｄからなる群か
ら選択される分子量を有する免疫的に活性なポリペプチ
ドに結合可能な実質的に天然不純物不含の抗体。
（１３）かかるポリペプチドが約１４ｋｄの分子量を有
する前記第（１２）項の抗体。
（１４）該抗体がイヌ抗体である前記第（１２）〜（１
３）項のいずれかの抗体。
（１５）該抗体がモノクローナル抗体である前記第（１
２）〜（１３）項のいずれかの抗体。
（１６）細胞系ＩＤｉ１０。
（１７）細胞系ＩＤｉ７６。
（１８）約１４ｋｄ、約５８ｋｄ、約６６ｋｄおよび約
９０ｋｄからなる群から選択される分子量を有するディ
ー・イミティスに関係するポリペプチドの存在について
動物を検査することを特徴とするディー・イミティス感
染を診断する方法。
（１９）該ポリペプチドの存在をイムノアッセイにより
測定する前記第（１８）項の方法。
（２０）該イムノアッセイが、該ポリペプチドを含有す
ると推測される試料と該ポリペプチドを結合可能な抗体
をインキュベートし、かつ、該ポリペプチドに結合して
いる該抗体の量を測定することにより該試料中に存在す
る該ポリペプチドの量を測定することからなる前記第（
１９）項の方法。
（２１）該抗体が固体担体に結合している前記第（１９
）項の方法。
（２２）該抗体を検出可能なように標識した前記第（２
０）〜（２１）項のいずれかの方法。
（２３）該検出可能標識が、放射性標識、蛍光標識、化
学ルミネセンス標識、酵素標識、フリーラジカル標識ま
たはバクテリオファージ標識からなる群から選択される
前記第（２２）項の方法。
（２４）抗ディー・イミティス抗体の存在について動物
を検査することからなり、該抗体がディー・イミティス
に関係するポリペプチドに結合可能であり、該ポリペプ
チドが約１４ｋｄ、約５８ｋｄ、約６６ｋｄおよび約９
０ｋｄからなる群から選択される分子量を有することを
特徴とするディー・イミティス感染を診断する方法。
（２５）該抗体の存在をイムノアッセイにより測定する
前記第（２４）項の方法。
（２６）（Ａ）該抗ディー・イミティス抗体を含有して
いると推測される試料に、該抗体により結合されうるポ
リペプチドであって固体担体に結合している該ポリペプ
チドを供給し、（Ｂ）該試料に、第２抗体であって検出
できるように標識し、かつ、該抗ディー・イミティス抗
体を結合可能な該第２抗体を供給し、（Ｃ）該固体担体
に結合している該第２抗体の量を測定することにより該
試料中に存在する該抗ディー・イミティス抗体の量を測
定することからなる前記第（２５）項の方法。
（２７）該第２抗体の導入前に該試料をさらに処理して
過剰のまたは非結合の抗ディー・イミティス抗体を除去
する前記第（２６）項の方法。
（２８）該第２抗体を検出可能なように標識した前記第
（２６）〜（２７）項のいずれかの方法。
（２９）該検出可能標識が放射性標識、蛍光標識、化学
ルミネセンス標識、酵素標識、フリーラジカル標識また
はバクテリオファージ標識からなる群から選択させる前
記第（２８）項の方法。
（３０）固体担体手段からなり、該担体手段が約１４ｋ
ｄ、約５８ｋｄ、約６６ｋｄおよび約９０ｋｄからなる
群から選択される分子量を有するディー・イミティスに
関係するポリペプチドに結合していることを特徴とする
前記第（２４）項の方法を実施するのに有用な試験細片
。