A6 B6 五、發明説明（3 ) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) [産業上之利用範赙] 本發明提供具備（1 )能與嘀驗細胞反應，（2 )被固定於 檐髏以後仍能保持抗體活性，（3)不阻害該嗦鹼細胞由I g E 介合之特異性組織胺之游離，而且（4)不誘發該嗦鹼細胞 之非特異^0織胺之游離等特性之單源抗體，以及將該單源 抗體固定於擒體後之固定化單源抗體。本發明還提供産生 該單源抗髏之融合瘤，從使用該單源抗體之體液分離_鹼 .細胞之方法，由該分離方法分離得到的嗦鹼細胞之化學介 體游離方法，以及喃鹼細胞之化學介體游離試驗方法。 [習知技術] 屬於白血球種類之一的嗦鹼細胞是I g E之標的細胞， 在其顆粒中貯藏有包括組織胺在內之各種化學介體（ m e di a t 〇 r )，該細胞因為和肥滿細胞共同構成過敏反應中 心而廣受注目。 通常，從嗦鹼細胞之化學介髖游離機制，可大致區分 為兩種類。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 其一是結合在嗦鹼細胞胞膜表而之受髖（r e c e p t 〇 r )上 的I g E分子被過敏原或I g E抗體架橋化，由該刺激誘發顆粒 脱離反應，造成化學介體之游離，所以是相當於所謂由過 敏反應引發之游離（以下稱為由I g E介合之特異性化學介體 游離）。另一種情況之游離機制或意義雖然尚未明瞭，但 已知是在嗦鹼細胞胞膜表而IgE未架橋時發生之游離，與 前述有對應I g E介合之特異性游離反應相對照，這種情況 是在抗I g E抗體及過敏原等不存在時也能發生之游離（以下 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 3 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（4 ) 稱為非特異性化學介體游離）。 由IgE介合之特異性化學介體游離之試驗，對過敏患 者之診斷或病態解析都很有用，組織胺游離試驗是其中具 代表性之試驗。組織胺是引發I型過敏反應之特別重要化 學介體，已知能誘發支氣管平滑肌之收縮、血管通透性之 亢進等反應。組織胺游離試驗，是使人體末梢血液中經由 介體之介合而結合在嗦鹼細胞表面的免疫球蛋白E(IgE)與 各種過敏原進行反應，再測定反應過程中游離出來的組織 胺量之利用生物學反應為特徵的撿査法。該法不同於特異 性IgE試驗（RAST)或皮虜試驗等其他過敏原鑑定法，而是 探索過敏患者之致病過敏原的方法中較接近臨床症狀的方 法，因此極為有用。 這種使用末梢Ιίπ.液的組織胺游離試驗，又可分成使用 全血或者所甩洗淨的白血球等方法。使用全血的方法雖然 在掌握患者的綜合過敏狀態方而被認為有用，但是嗦鹼細 胞以外的其他血清成份也有可能影響到組織胺游離之測定 結果。因此，在研究藥劑等之作用機制或進行組織胺游離 機制之基礎研究等必須正確分析瞎鹼細胞之反應性時，通 常使用洗淨的白血球。但是為了分離取得洗淨的白血球， 必須進行在糊精溶液中除去紅血球後，離心2〜3次同時進 行洗淨，然後再調整白血球數目等煩雜操作，因此檢查時 需要較多血液景，利用來作為日常檢査將有諸多困難點。 再者，和喃鹼細胞之脱顆粒反應一齊釋出的物質中， 已知存在有白三烯或血小板活化因子（P A F)等具有強力血 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝_ 、1T_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 4 A6 B6 五、發明説明（5 ) 管通透性亢進作用及白血球遊走能力之化學介體，就作為 過敏病態解析之目的而言，這呰從喃鹼細胞得來的化學介 體正是基礎研究的對象物質。但是這些化學介體在血液中 被放出後立刻被代謝掉的情況頗多，對這些物質進行測定 時，樣品之迅速及嚴密處理己成為必須特別留意之重要事 件。這些從嗦鹼細胞得來的化學介體之中，許多種類之分 析到現在仍然非常困難。 [本發明預期解決的問題]. 如上所述，從嗦鹼細胞發生之化學介體游離，.有導因 , . ； · · ..... 於過敏反應而有由I g E介合的特異性游離，以及除此之外 的非特異性游離等兩種類，而對過敏患者之診斷則必需測 定由IgE介合而特異性游離釋出之化學介體。但是，如前 所述為了要在不受血清成份影響之下進行組織胺之游離試 驗，則不得不進行白血球分離，因此則必須進行煩雜的操 作並且必須使用多景血液，事實上不適用於日常檢查。此 外，組織胺以外的化學介髏也有樣品之處理手續煩雜等問 題，目前這些物質之分析仍處於困難狀態。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 丨裝. 因此本案發明人等考慮到若能夠從血液中分離嗦鹼細 胞以便用來進行組織胺等之游離試驗，則上述問題或許能 夠解決，於是就此方向進行研究。 到目前為止所知之喃鹼細胞分離和純化方法，有P . J . Frederik等人所發表[J. Immuno'l. Methods, 1 4 9. 2 0 7 ( 1 9 9 2 )],以比重離心法 '從預先使嘀鹼細胞之密度提高的樣 品中，使用結合了能夠和嗦鹼細胞以外之細胞成份進行反 本·紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 5 A6 ___B6_ 五、發明説明（6 ) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 應之抗體的磁性粒子，以除去不純物細胞而達成喃鹼細胞 之純化等方法。 但是這種方法並不是針對目的_鹸細胞本身的分離純 化法，而是除去樣品中夾雜物的純化法，不但效率不佳， 操作性也極煩雜。 另——方面，已經知道有多種能與嗦鹼細胞本身進行反 應的抗體[例如 P. Valent等，Int. Arch. Allergy. Appl. I m m u η ο 1 . ) 1 9 8 ( 1 9 9 Ο )]。另外，對人髏嘀鹼細胞進行 待異反應之單源抗體也曽被提出報告[Μ. P. Bodger等， Blood, £!_，1414(1987)]。 但是能夠成功的使對嗦鹼細胞具有反應性之抗體結合 在固態檐體上，以便用來試行分離人髖嗦鹼細胞之例子則 仍未知曉，因此，以這種方法分離人體嘀鹼細胞以便用來 進行組織胺等化學介體遊離試驗之例子，也未曾見過。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 使對嗦鹼細胞具有反應性之抗體結合於固態擔體的過 程中，由於對嗦鹼細胞之反應性喪失等·原因，失敗而造成 此一事實之情況，也是可以想像的[參見後述實驗例1(1)] 。但是最主要的原因，則被認為是利用對喃鹼細胞具有反 應性之抗體進行分劃取得之_鹼細胞常已受到傷害，於是 導致由I g E介合之特異性組織胺游離作用被阻害之現象[例 如 P. J. Frederik等，J. Immunol. Mithods, 149. 213( 1992);以及 J. T. Schroeder等，J. Immunol. Methods， L1X，2 6 9〜2 7 7 ( 1 9 9 0 )]，或是非特異件組織胺游離作用顯 著比由I g E介合之特異性組織胺的游離作用更高，因而無 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 6 A6 __B6_ 五、發明説明（7 ) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 法用來進行組織胺游離反應之定景等目的之情況佔大多數 [後述實驗例1 ( 2 ) ]。P · J · F r e d e r i k等人使用能與喃鹼細 胞以外的細胞成分進行反應之抗體來進行喃鹼細胞之純化 ，採用這種迂迥方法的原因，可以瞭解也是為了迴避上述 缺點。 [解決問題的方法] 如果能夠使用對嗦鹼細胞具有反應性之抗體,以嗦鹼 細胞本身為目標來進行嗦鹼細胞之分離純化，則必然能夠 達成簡單而且高精密度純化之目的。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 有鑑於此，本案發明人等針對具備與固態擔髖結合後 仍對晴鹼細胞有反應性、與嗦鹼細胞結合後不致對該嗦鹼 細胞造成傷害，對由IgE介合之特異性組織胺之游離以及 非特異性組織胺之游離都不會造成影響等特性之單源抗體 ，也就是能與嗦鹼細胞反應，能夠配合既定目的使用之單 源抗體，刻意進行深入探討，結果終於完成了目的單源抗 體之調製，隨後將這些抗體固定於擔體後使之與體液進行 反應，待這些單源抗體將該體液中之喃鹼細胞捕捉後，將 未反應之體液除去，由此確立了簡單的喃鹼細胞分離方法 ，再使分離得到的嗦鹼細胞與過敏原或是抗I g E抗體反應， 成功的使組織胺游離出來。本案發明人等還確立了對使用 該杭體而分離得到喃鹼細胞之由IsE介合之特異性組織胺 的游離試驗法，終於完成本發明。 也就是説，本發明提供具有下列性質之單源抗體： U )能與嚿鹼細胞反應， 7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） A6 __B6_ 五、發明説明（8 ) (2 )被固定在擔髖上後仍然保持抗體活性， (3 )不阻害該喃鹼細胞由I g E介合的待異性組織胺之游 離， (4 )不誘發該嗦鹼細胞非特異性組織胺之游離。 本發明所提供具有上述（1 )、 （ 2 )、 （ 3 )及（4 )等性質之 單源抗體，第（1 )項所謂能與嘀鹼細胞反應是指該單源抗 體能與嘀鹼細胞之表面抗原進行反應之意。 再者，第（2)項所謂被固定在擔體上後仍然保持抗體 活性，是指使該單源抗體與擒體結合後，仍然不致喪失捕 捉嗦鹼細胞的能力之意。至於作為擔體之材料，例如玻璃 以及合成樹脂製成之粒狀物（b e a d s )或球狀物（b a 1 1 )、管 狀物、板狀物、以及磁性珠粒般的磁性粒子等，一般抗髖 固定化時使用之擔髖都能夠使用，其中又以使用磁性粒子 較佳。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 固定化抗體之嗦鹼細胞捕捉能力，是以檢定固定化單 源抗體是否能夠和_鹼細胞結合來加以判定，具體而言是 以組織胺為指標，依照下述方法進行：首先，使固定於磁 性粒子，能與人髖嗦鹼細胞反應的單源抗體，和人體血液 進行反應；隨後以磁石收集粒子並除去上清液後，加入組 織胺遊離用緩衝液（含有氮化鈣、氣化鎂等之Η E P E S緩衝液 )並反覆進行數次凍結及解凍操作，所得上清液之組織胺 總量以已知之方法，例如由Η P L C法構成的組織胺測定条統 [Y . TsurutaH，J . Chromatography，2 2 4· 1 0 5 ( 1 9 8 1 )] (島津公司産製）進行測定，能夠撿出組織胺之抗體即被選 8 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（9 ) 為具有嗦鹼細胞捕捉能力之抗體。 此外，第（3 )項所謂不阻害該_鹼細胞由I g E介合之特 異性組織胺之游離，是指與該單源抗體結合後之瞎鹼細胞 ，能夠實質的維持血液中本來具有的由I g E介合之組織胺 -游離能力之意。 能否實質的予以維持，能夠以本發明中發現之單源抗 體BA312之比較實驗加以確認。亦即因為被BA312捕捉之喃 鹼細胞，能夠維持血液中原有組織胺之游離能力[參照後 述實驗例2]，衹要使被檢試之固定化單源抗體和固定化: BA312在相同條件下與嗦鹼細胞反應，得到的兩種單源抗 體與嗦驗細胞結合體並在相同條件進行抗IgE抗髖處理， 被檢視抗體造成之游離組織胺量.若能達到由BA312造成游 離量之6 0 %以上，則判定該單源抗體是「不阻害該喃鹼細 胞由IgE介合之特異性組織胺游離反應」，據此決定該抗 體為本發明之對象。 至於第（4 )項所諝不誘發該嗦鹼細胞之非特異性組織 胺游離反應，是指從與該單源抗體結合後之嗦鹼細胞生成 之非特異性組織胺游離景，是由I g E介合之特異性組織胺 游離景之3 0 %以下之意。 非特異性紐纈胺之游離景測定，傺在例如含有氛化鈣 、氯化鎂、人類血清白蛋白（H S A )等物質之羥乙基式次乙 亞胺-氮'-2 -乙磺酸（Η E P E S )緩衝液（組織胺游離用緩衝液） 等適當溶劑中加入該_鹼細胞，並使在1 〇〜5 0 10反應1 0〜 60分鐘，然後以例如HPLC法等既知方法測定游離之組織胺 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 9 (請先閲讀背面之注意事項再填寫衣頁)
A6 B6_ 五、發明説明（1 0) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 量。 由I g E介合之特異性組織胺之游離景，則可將該喃鹼 細胞與使用組織胺游離用缓衝液調製之I g E抗體，在和上 述相同溫度及時間之條件下進行反應，游離之組織胺量再 於和上述相同方法及條件下測定之。 以下簡單說明本發明之單源抗體之製造方法。 (1)融合瘤之調製 將小白鼠以人類嗔鹼細胞使免疫。免疫過程是將人類 喃鹼細胞每隔數週重複接種於小白鼠之腹腔、皮下、或是 靜脈中。從被免疫之小白鼠取得抗體産生細胞後，使之與 骨髓腫瘤細胞融合而製成融合瘤，再由得到的融合瘤中選 擇能夠産生與人類嗦鹼細胞進行反應之抗體的融合瘤。 選出之融合瘤使進行無性繁殖，由生成之融合瘤無性 繁殖細胞所産生之抗體，使之與已經預先連接了綿羊抗小 白鼠球蛋白抗體的磁性珠粒結合後，再逐項檢定對人類血 液中嗔鹼細胞之捕捉能力以及所分離之喃鹼細胞的組織胺 游離之相關特性。 捕捉能力之檢定可依照前述之方法進行。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 分離得到的嗦鹼細胞之組織胺游離相關特性之檢定， 是將該抗體以和檢定捕捉能力時之相同磁性粒子進行固定 化後，使之與人類血液反應，以磁石收集粒子並除去上清 胶後，可依照前述方法測定非特異性組織胺游離景以及由 I g E介合之特異性組織胺游離景，再由其中選擇不阻害由 I g E介合之特異性組織胺游離，並且不會促進非特異性組 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 10 A6 B6 五、發明説明（1 1 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫泰頁) 織胺游離現象的抗體，也就是非特異性組織胺游離景為山 lgE介合之待異性組織胺游離景之30 %以下之抗體，10% 以下者更佳。 就像這樣選擇與擔體結合後不致喪失抗體活性，具有 對嗦鹸細胞之捕捉能力，不會阻害所分離嗦鹼細胞由I g E 介合之特異性組織胺游離，並旦不會誘發非特異性組織胺 游離現象的融合瘤無法繁飱細胞条，再經過培養後即可回 收單源抗體。. 上述之免疫法.、細胞融合法、融合細胞之選擇、無毕 繁殖化等操作，都可以採用一般熟知之方法進行。 (2)單源抗體之製造 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 選得之融合瘤以髖外（i n v it r 〇 )培養法或是體内（i η v i ν ο )培養法使增殖，即可製得單源抗體。體外培養法可 將融合瘤培養在含有牛胎兒血清的RPMI培養基（完全RPMI 培養基）中使達到增殖上限，再回收培養液之上清液即可 得到單源抗髖。體内培養法可將融合瘤移植於預先經過 2，6，1 0 , 1 4 -四甲基十五烷酸之腹腔内投與處理的小白鼠之 腹腔，數週後確認小白鼠腹部肥大現象即可抽取腹水，所 得腹水中之I g E或I g Μ經由硫銨沈澱劃分、D E A E瓊脂糖管柱 層析等既知方法之適當組合進行分離純化，就能得到單源 抗體。 經由上述方法得到能夠産生本發明之單源抗體B A 1 0 1 、BA20、 BA135、以及BA312之融合瘤，已經於1992年9月 1 0日依據布達佩斯公約之規定，分別以「B A1 0 1塩野義」（ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 __B6_ 五、發明説明（12) 撤工研條寄第4004號、FERMBP-4004)、 「BA20塩野義j ( 微工研條寄第4005號、FERM BP-4005)、 「BA135塩野義」 (微工研條寄第 4 006號、FERMBP-4006)、「BA312塩野義 」（撤工研條寄第4007號、FERM BP-4007)等編號，寄存於 曰本國茨城縣筑波市東1 丁目1番3號（郵遞區號3 0 5 )之通商 産業省工業技術院微生物工業技術研究所。 本發明之單源抗體雖然僅舉出由寄存之融合瘤生.産茗 抗體為例，但是只要是具備上述（1)〜（4)各項性質之單源 抗體，都屬於本發明之範圍，其中又以使用單源抗體] , BA312最為適當。 本發明之單源抗體能與含有人類喃鹼細胞之白血球反 應，但是不與人類紅血球反應。再者，本發明之單源抗體 雖被固定於擔體後，仍然能夠充分捕捉嗦鹼細胞，不誘發 被捕捉_鹼細胞之非特異性化學介髖之游離，也不阻害由 IgE介合之特異性化學介體之游離。此外，本發明之單.源 抗體能夠以如前述使結合於擔體而製得固定化單源抗體之 形式使用，有利於各種目的之應用。使單源抗體與擒髖結 合而成為固定化之方法，並不是特殊限定的方法，例如T . Lea等，Scand. J. Immunol.，H 207(1985)等已經公開 的方法都能夠採用進行。例如使單源抗髖與未覆被或持有 對甲苯磺酰基等宫能基之化合物，或是以抗小白鼠免疫球 蛋白被覆之固態擔體在0〜5 0 °C反應5分鐘到7 2小時，其 中以在4〜40 °C反應30分〜48小時較為適當。 本發明還提供體液中喃鹼細胞之分離方法。該方法之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 12 (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 ____B6 五、發明説明（1 3 ) 特徵是使如前述製得本發明之固定化單源抗體與體液進行 反應，該鶄液中的喃鹼細胞將與固定化單源抗體結合而被 捕捉。 所稱之體液可舉血液液、淚液、唾液等為例，其 中以使用血液較為理想。 使抗體結合於磁性粒子以分離目的細胞之方法，有G . Gaudernack等報告[G. Gaudernack 等.，J. Immunol. Methods, QJL, 179(1986)]已廣為人知。此外，從預先以 比重離心法提高嗦鹼細胞密度之樣品中，使用結合了能夠 和嗦鹼細胞以外之細胞成分進行反應之抗體的磁性粒子， 藉由去除不純物細胞之方式來純化嗦鹼細胞的方法，雖然 也有P. J. Frederic等人提出報告[P. J. Frederic等， J. Immunol. Methods, 1 4 9. 2 0 7 ( 1 9 9 2 )],本發明則使用 直接對喃鹼細胞作用之抗體，與上述使用對_鹼細胞以外 之細胞進行反應之抗髖的例子，在本質上已有顯箸差別。 另一方而，本發明之嗦鹼細胞分離方法，是將本發明 之單源抗體直接或經由小白鼠免疫球蛋白之間介，固定於 例如磁性粒子等擔體上，做成結合了抗體的磁性粒子，再 使之與體液（使用血液較佳）在0〜5 0 °C進行反應，其中以 1 5〜4 0 t較為理想，短時間（1〜6 0分鐘）後藉使用磁石吸 住磁性粒子以便除去未反應樣品成份之簡便操作，就可以 分離製成含有高濃度喃鹼細胞的細胞群。 本發明還提供利用本發明之_鹼細胞分離法，分離製 取嗦鹸細胞，並使之與過敏原或抗I g E抗體進行反應為特 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 ，訂. SMgr· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)曱4规格（210x297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（14 ) 徽之該喃鹼細胞來源之化學介髖的游離方法。 所稱之過敏原包括室内灰塵或花粉等趿入性過敏原、 肉品或蛋類等食料性過敏原、以及其他化學物質等，通常 用來診斷過敏症狀的材料，都可以順應需要來使用。 該嗦鹼細胞與過敏原或U E抗體間之反應，通常 '在1 〇 〜5 0 °C之間進行〇 . 5〜3 0 0分鐘，而以在2 5〜4 0 t之間反應 10〜60分錆較為適當。 本發明還經由下述（1 )〜（3 )之步驟，提供_鹼細胞來 源之化學介髏的游離試驗法。 (1 )使本發明之固定化單源抗髖與體液反應，使該體 液中之嗦鹼細胞與該固定化單源抗體結合而被捕捉，以便 分離該嗦鹼細胞之步驟。 (2)分離得到的嗦鹼細胞與過敏原或是IsE抗體反應， 使化學介體從嗦鹼細胞游離釋出之步驟。 (3 )游離化學介髏數景之測定步驟。 上述（1 )和（2 )，只要分別依照前述本發明之嗦鹼細胞 的分離方法以及從喃鹼細胞游離釋出化學介體的方法進行 即可。 上述（3 )之游離化學介體數景之測定，衹要配合目的 化學介髏，選用既知之方法進行測定即可。例如針對組織 胺可以採用Η P L C法之組織胺測定糸統[Y . T s u r u t a等，J . Chromatogr. , 2 2 4. 1 0 5 ( 1 9 8 1 )](島津公司製造），針對 έΐ 三烯以R P A F則可以分別採用[E . H q y e s等，J . I m m u η ο 1 .， 13 1 . 429(198 3 )]以及[M. A. Smal 等，J. Immunol. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（21〇χ 297公變)"" ΓΤ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 .、可. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（15 ) Methods t 1 2 8, 1 8 3 U 9 9 0 )]等方法測定之。亦即至於採川 Η P L C法之組織胺測定，可依照例如下述步驟進行：將樣品 溶液通過充填有陽離子交換樹脂之管柱，在分離溶出之紐 織胺中加入0 . 1 %鄰苯二甲薛及氫氧化鈉溶液並在4 5 t：下 反應，使組織胺成為螢光體•接著再與硫酸反應以進行螢 光體之安定化及螢光強度之增強後，測定其螢光強度。 採用放射性免疫分析法之白三烯測定，是使樣品或未 檸識白三烯標準品、抗白三烯抗體、以及以氚標識之白三 烯在410反應5〜24小時後，使之與糊精被覆之.木炭在冰浴 中反應1 0分鐘。離心後取上清液測定放射活性。 採用放射性免疫分析法之血小板活化因子（P AF )測定， 是將樣品或未標識之PAF標準品、抗PAF抗體、碘125標識 之P A F、以及二次抗體在室溫下反應5〜2 4小時後，離心並 測定所得沈澱物之放射活性。 此外，組織胺之測定也可以採用放射性免疫分析法進 行之。以放射性免疫分析法測定時，例如可將樣品或未標 識之組織胺標準品、抗組織胺抗體、以及碘1 2 5標識之組 織胺在0〜4 0 °C反應5分鐘〜4 8小時，其中以在0〜1 0 °C反 應3 0分鐘〜2 4小時較為適當。隨後加入例如聚乙二醇等B / F分離劑並在冰浴中反應1 〇分鐘後離心，測定所得沈澱物 之放射活性。 再者，組織胺之測定也可以採用酵素免疫分析法（ E I A )進行之。包括三明治法、競爭反應法、酵素連結免疫 吸著分析法（E L I S A )等既知之酵素免疫測定法都能被使用 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210x297公釐)~： Γβ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝 I *βτ. 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A6 _____B6 五、發明説明（1 6 ) 。較理想者例如依照Κ η ο X V a η B y k e等所提報告（ Luminescence Immunology and Molecular Application， CRC Press, pp2〜10， 19 9 0)之方法測定之。亦即將樣品 、以生物素標識之組織胺標準品、以及以酵素標識之Μ織 胺抗體混合物，與固定有抗生物素蛋白之擔體進行反應。 洗淨後測定結合於抗生物素蛋白固定化擔體之生物素標識 組織胺和酵素標識抗組纈胺抗髖之複合體的酵素活性。至 於所使用之擔體和酵素，只要是酵素免疫測定法中常用者 都能夠使用。其中以使用徹景培養盤為擔體、西洋山葵過 氧化酶為反應酵素較為適宜。 本發明之試驗法之中，為了除去對被分離的_鹺細胞 之非特異性化學介髖游離之影響，若能夠依照前述方法同 時測定化學介體之總景（依據組織胺總量之測定方法）以及 非特異性化學介體之游離量，再由下式： 待異性化學介體游離率（％ )= IgE特異性化學介體游離量-非特異性化學介體游離量 _XI 00 化學介體總量-非特異性化學介體游離景 計算出由I s E介合之特異性化學介體游離率，則較為理想。 [實施例] 以下將以實施例以及實驗例更進一步詳細説明本發明 ，但是本發明並不受這些實驗例等之任何限制。 1 .能夠對_鹼細胞進行反應的單源抗體之製造 (1 )免疫 對2隻8週齡之雌性B A L B / c小白鼠，分別於腹腔内注 本紙張尺度適用t ϋ畔標準（哪）甲4規格（210x297公變) Γ&~ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α6 Β6 五、發明説明（17) 入1 X 1 0 6個人類釀鹼細胞，以後再於3週内分別於腹腔内 注入1 X 1 0 6値人類嗦鹼細胞3次。 (2)細胞融合 最後一次免疫處理之3天後，摘取該2隻小白鼠之脾 臓，配合使用R Ρ Μ I培養基調製成細胞懸浮液。將得到的2 X 1 0 8個脾臓細胞與6 X 1 0 7値骨髓腫瘤細胞N S - 1混合，離 心後對沈澱物缓緩攪拌同時加入1 m 1平均分子量為4 0 0 0之 50 %聚乙二醇溶液，再繼續攪拌1分離。然後在1分鐘間 加入R Ρ Μ I培養基1 m 1，同樣追加1 m 1後，’再於3分鐘間加入 7 m 1。經離心後將沈澱物懸浮於4 0 m 1含有1 5 %牛胎兒血清 之RPMI培養基（完全RPMI培養基）中，分別取0.1ml接種於 4片9 6孔徹景培養盤的各井孔中，於7 %二氧化碩存在下， 於3 7 °C進行培養。2 4小時後加入0 . 1 m 1含有1 0 0 w Μ 6 -氧化 嘌昤、0.4W M2 -胺基-4-氧蝶啶及16w Μ胸腺嘧啶核甘之 R Ρ Μ I培養基（H A Τ培養基）。培養2、3、5及8天後，捨棄0 . 1 m 1培養液之上清液並加入0 . 1 m 1 H A T培養基；在第1 1及第 1 4天則捨棄0 . 1 m 1培養液之上清液後，加入0 . 1 m 1含有1 0 0 w Μ 6-氧化嘌昤及16/i Μ胸腺嘧啶核f之完全RPMI培養基（ HT培養基）。經過前述培養過程後，在全部384個井孔中都 發現生成融合瘤之細胞群。 (3 )融合瘤之選擇- 培養井孔中的融合瘤以完全R Ρ Μ I培養基進行培養，培 養液之上清液有否産生特異抗體，則依照下述方法檢出之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210x297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) .裝 ,、*!. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（18) 在2 0 m 1人類末梢血液中，加入5 m 1含有5 %糊精的生理 食塩水，使紅血球沈澱後，分離收集上清液中之白血球。 從這呰白血球中，使用比電分別調製成1 . 0 7及1 . 0.8之等密 度離_心用溶液（商品名Percoll， Pharmacia公司産品），以 不連續比重離心法分離收集比重介於1 . 0 7〜1 . 0 8之間的紬 胞。分離得到的細胞以亞哂藍（a i c i a n b 1 u e )法[S . G . Harriet等，Blood, H 279(1975)]染色後算出嚙鹼細胞 數目，再以含有〇 . 8 %氮化鈉、0 . 0 3 7 %氯化鈣、以及0 . 0 3 %人類血清白蛋白（H S A )之1 0 m Μ羥乙基貳次乙亞胺-氮’ -2 -乙磺酸（Η E P E S )缓衝液（ρ Η 7 . 4 ) ( H A - Η E P E S缓衝液），將嗦鹼 細胞數目調製成每毫升1〇5個，再將每2Χ104値嚙鹼細胞 分注於試管中。在該試管内加入50 w 1之融合瘤培養液之 上清液，於3 7 °C反應1小時，再以H A - Η E P E S緩衝液洗淨1 次後，加入50 w 1以螢光異硫氡化物（FI TC)標識之山羊抗 人類I g E抗體，以及以海藻剌桐素標識之山羊抗小白鼠免 疫球蛋白抗體之混合液，並使在室溫下反應1小時。以 H A - Η E P E S緩衝液洗淨1次後，用螢光顯撤鏡進行觀察，以 判定被F I T C標識之細胞是杏也被海藻剌桐素標識。經過前 述處理後，選得培養液之上清液中所含單源抗體能夠對被 F I T C檫識之嗦鹼細胞進行反應的融合瘤培養井孔計1 〇 〇値 0 依照上述方法取得的融合瘤，以限界稀釋法進行無性 繁殖操作後，在三角瓶中分別培養到增頰界限為止。在 1 m 1該培養液之上清液中加入已預先結合了綿羊抗小白鼠 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210x297公釐) fg {請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) -裝 —訂. 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（19) 免疫球蛋白抗體的磁性粒子1 5 m g，在4 C下緩慢攪拌反應 1 6小時後，得到單源抗體固定化磁性粒子。使用這些單$ 抗體固定化磁性粒子，依照下述實施例4記載之方法，調 査對人類末梢血液中嗦鹼細胞之捕捉能力，以及分離1辱到1 的喃鹼細胞之I g Ε特異性組織胺游離和非特異性組織胺# 離之相關性質等。結果選得具有前述各項特性，並息由@ 述實驗例可證明其適用於本發明之含有人類嗦鹼細胞之細 胞群的分離，以及所分離之細胞的組織胺遊離試驗方法的 單源抗體BA101、BA20、BA135、以及BA312之生産用融合 瘤 BA101塩野義（FERM BP-4004)、BA20塩野義（FERM BP-4005) 、 BA135 塩野義 （FERM BP-4006)、 以及 BA312 塩野義 （ FERM BP-40 07 )等。 此外，經調査上述4種單源抗體所屬之小白鼠免疫球 蛋白之類別，結果判明B A 2 0、B A 1 0 1、以及B A 1 3 5屬於I g G 1 、B A 3 1 2 則屬於 I g Μ。 (4)單源抗體之製備 (a )體外培養法- 將融合瘤在RPMI完全培養基中培養至達到增殯界限（ IX 106個/ ml)後，回收培養液之上清液。 (b )體内培養法 將5X 106個融合瘤移植於預先經過0·5ιη1 2,6，10，14-四甲基十五烷酸腹肸内投與處理的BALBYc小白鼠的腹腔内 ，約3週後經確認小白鼠腹部之肥大現象後，採取其腹水 0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210X297公釐） 1 9 (請先閒讀背面之注意事項再填寫本頁} .裝 .、ΤΓ. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（20 ) (5 )單源抗體之純化 (a)蛋白質A親和性層析法 由前述步驟取得之腹水，以1 8 %硫酸鈉溶液進行塩析 、生成的沈澱物溶解於0.01 Μ硼酸緩衝食塩液（PH8.0)後， 以相同溶液進行透析。塩析得到的單源抗體2 0 m g溶於2 m 1 之0.01 Μ硼酸缓衝食塩液（PH8.0)中，再使被吸箸於蛋白質 Α-瓊脂糖（Pharmacia公司商品）之管柱（1.6Χ 5cm)内。首 先以大約5 0 m 1之0 . 0 1 Μ硼酸緩衝食塩液（p Η 8 . 0 )將不純物流 洗出來，其次以0. 01 Μ檸樣酸缓衝食塩液（ρΗ4. 0)約1 0 0 0 ml 進行溶離，得到純化單源抗體BA20、BA101、以及BA135。 (b )瓊脂糖C L - 4 B膠體層析法 由前述塩析操作得到的單源抗體2〇mg,溶解於2ml之 0 . 1 Μ硼酸緩衝食塩液中，使通過瓊脂糖C L - 4 B ( P h a r m a c i a 公司商品）之管柱U . 6 x 7 0 c m )以進行分劃，分別收集主要 高峰即可得到純水單源抗體B A 3 1 2。 2.單源抗體在2次抗體結合珠粒上之固定化 代那珠粒（d y n a 1 b e a d s ) Μ - 4 5 0綿羊抗小白鼠免疫球谐 白（Dynal公司商品）之30mg· beads/ml懸浮液，經攪拌後 分取1 m 1置於試管中。以磁石收集珠粒並除去上清液後， 加入1 in 1融合瘤培養液之上清液，在4 t下缓慢攪拌使反應 1 6小時，再以磁石收集珠粒並除去上清液，隨後以^-H E P E S緩衝液於4 t下缓慢攪拌同時洗淨4次，每次3 0分鐘 ,即得到單源抗體固定化磁性珠粒。 此外，以1 m 1用H A - Η E P E S緩衝液調製的純化單源抗體 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210X297公釐) 9〇 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) -裝 經濟部中央標準局員工消#合作社印製 A6 B6 五、發明説明（2 1) 溶液（2 Ο μ g / m 1 )取代融合瘤培養液之上清液，再依照上述 相同方法製得單源抗體固定化磁性珠粒。 3.單源抗髏在未被覆珠粒（uncoated beads)上之固定化 代那珠粒M-450未被覆（Dynal公司商品）之30mg'· b e a d s / in 1懸浮液，經攪拌後分取1 m 1置於試管中。以磁石 收集珠粒並除去上清液後，加人lnil BA312之0.05MTRIS-塩酸缓衝液（PH9.5)溶液（0.3mg/nl)，並均句攪拌。隨後 於4 ΐ：下缓慢攪拌反應1 6小時，再以磁石收集珠粒並除去 上清液後，以含有0.5%HSA之0.01Μ HE.PES緩衝液（ΡΗ7.4) 洗淨4次，每次5分鐘，最後於4¾下以HA-HEPES缓衝液 洗淨1 6小時，得到B A 3 1 2固定化磁性珠粒。 4 .以單源抗體固定化磁性珠粒進行細胞分離和組織胺游 離反應 採取正常人血液1 〇 in 1置於E D T A採血管中，加人Η A -HEPES緩衝液40ml調製成20%血液樣品。分別固定有BA20 塩野義、BA101塩野義、BA135塩野義、以及BA312墙野義 等融合瘤細胞培養液之上清液的磁性珠粒，以H A - Η E P E S緩 衝液調製成3mg· beads/ml。將20%血液樣品每500y 1分 注於試管中，分別加人5 0 w 1之上述B A 2 0、B A 1 0 1、B A 1 3 5 、以及BA312之固定化磁性珠粒，在室溫下缓慢振鹽反應 5分鐘。以磁石收集珠粒並除去上清液後，用HA-HEPES^ 衝液5 0 0 /i 1洗淨1次。洗淨後加入以含有0 . 5"^氯化鈣、 0.25mM氣化鎂、〇.1%葡萄糖、0.9%氣化鈉、0.035 %碩 酸氫鈉、以及0.1% H.SA之20mM HEPES緩衝液（pH7.0)(組織 本紙4尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210X297公釐) 7Ϊ .............................. ............................裝......................訂.................· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A6 B6 五、發明説明（2 2 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 胺游離用緩衝液）或是組織胺游離用緩衝液調製而成4 w g / m 1之抗人類I g E單源抗體（Η E - 6 9 B ) 5 0 0 w 1並加以攪拌。所 分離細胞之組織胺總量測定，是在組織胺游離用緩衝液中 置入檢體，再經過3次反覆凍結解凍處理後，以之作為檢 體。I g Ε特異性組織胺游離反應，是將抗人類I g Ε單源抗體 加入檢體中，並使在3 7 t反應1小時以進行之。再者，非 特異性組織胺游離反應，是使加有組織胺游離用缓衝液的 檢髖在3 7 t反應1小時進行之。反應完畢後先加以攪拌， 經1 5 0 0 r p m離心5分鐘後，分取3 0 0 w 1上清液。游離組織 胺量之測定，是以使用Η P L C法的組織胺測定条統[Y . Tsuruta等，J. Chromatogr.， 2 2 4, 105(1981)](島津公 司製造）進行之。 如表1所示，對BA20, BA101、 BA135、以及BA312之 固定化磁性珠粒分離所得細胞的組纈胺總景進行測定時， 在每一種抗體中都能檢出組織胺，可知具有喃鹼細胞之分 離能力。此外，如圖1所示，所分離細胞之IgE特異性組 織胺游離率良好，而且，非特異性組織胺之游離，被抑制 在特異性組織胺游離量的3 0 %以下。 表1 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ΒΑ2 0 ΒΑ1 01 ΒΑ135 ΒΑ312 非固定珠粒 血液檢體 + + + + + + + + - 嗦鹼細胞之分離能力 + + :有；-:無 本紙張尺度適用中ϋ H家標準（哪）甲4规格（21GX297公變) '2~2 A6 B6 五、發明説明（23 ) 蜜駱例 1. CD抗體與本發明單源抗體之比較 (1 )喃鹼細胞捕捉能力 依據 P. Va.lent等之報告[P. Valent等，In.t. Arch-Allergy Appl. Immunol·, 9 1 , 1 9 8 ( 1 9 9 0 )],使用能夠與 在嗑鹼細胞表面常發現之抗源進行反應之CD抗髖，也就是 CD9抗體（TP82， Nichilei公司）、CDllb抗體（BEAR1， Imunotech公司），CD13抗體（MCS2, Nichilei公司），以及 C D 3 2抗體（2 E 1， I in u η 〇 t e c h公司）等各種抗體，依照前述實 施例2所示方法，進行抗體固定化磁性珠粒之調製。使用 上述CD抗體以及BA20、B A3 12之固定化磁性珠粒，依照賁 驗例3之同樣方法進行特定細胞群之分離，並測定由所分 離細胞生成的組織胺總景。 如表2所示，對CD9抗體，CDllb抗髖、以及BA20、 B A 3 1 2等能夠確認其對_鹼細胞之良好捕捉能力，但是對 C D 1 3抗髖以及C D 3 2抗髖，則不能確認其對嚙鹼細胞之分離 能力。 表2 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 CD9 CDllb CD13 CD32 BA20 BA31 2 血液檢體A + + + 屮 一 - ++ + + 血液檢體B + + + + - - + + + + 對嗦鹼細胞之捕捉能力：+ + :有；-:無 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210x297公釐) 23 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 _B6_ 五、發明説明（24) (2 )分離細胞之組織胺游離能力 在上述實驗例1 .(1 )被檢討的C D抗體之中，由被確認 具有嗦鹼細胞捕捉能力之CD9抗髏、CD lib抗體、以及 BA20、BA312等各抗體之固定化磁性珠粒分離得到之細胞 的組織胺游離能力，亦即組織胺鹚量、I g E特異性游離組 織胺量、以及非特異性游離組織胺量等3項目，使用20個 正常人的血液，依照與上述實施例4的同樣方法進行測定 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 每 認 確 在 但 別 差 所 有 間 之 農 ΟΘΠ 檢 液 血 個 每 然 雖 果 結 都 髖 抗 1 毎 認 確 也 時 同 之 力 .能 0. 分 胞 細 鹼 嗦 有 都 6 髖Ig 抗成 個造 象 現 離 游 胺 .織 組 性 異 特 it 0 分 K- 且 I 並於 捉對 捕相 體 ， 抗 量 之離 粒游 珠胺 性織 磁組 於性 定異 固特 以非 ，之 中胞 明 細 發鹼 本嗦 在的 到 得 在 果 如 率 比 之 量 0 游 胺 織 組 性 異 的 用 , δ 有 I 是與 中 C- 法用 驗有 試別 離特 游是 體為 介認 學被 化則 在 ， 為下 -裝 特 認 被 體 抗 該 則 下 以 為 率 比 果 如 以 相 離 游 之 胺 織 組 性 異 特 出上 現 ， 表示 ，所 中 3 胞表 細如 的 ， 到高 得極 離率 分頻 體之 抗離 lb游 D1胺 :織 組 性 異 特 CD非 , 高 較箸 比顯 及 以 髖 抗 於 大 遠 也 率 比 述 行 進 胞 細 離 分 的 體 抗 些 這 以 擬 以 所 這 於 對 相 〇 難 困 為 極 時 析 解 關 相 之 離 游 胺 織 組 性 異 特 體 杭 源 單 之 〇 明料 發材 本的 , 異 象優 現極 種是 有 只 率 比 一 此 之 ，訂. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210x297公釐） A6 B6 五、發明説明（2 5 ) 3 表 單源抗體 CD9 CDllb BA20 BA3 1 2 非特異性/特異性％ 46.9 39.7 2 2.0 7 . 5 SD 1 7.6 2 8.5 1 5.1 5 . 3 <請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
非特異性/特異性：非特異性紐織胺之游離量對由I g E 介合之特異性組織胺游離量之比率 S D :標準偏差 由以上數據可知，以B A 2 0以及B A 3 1 2之固定化磁性珠 粒分離之細胞，對喃鹼細胞之捕捉率高i I s E特異性組織 胺游離現象良好，而且對非特異性組織胺游離之抑制也最 有效。尤其以B A 3 1 2之固定化磁性珠粒分離之細胞，對本 發明從人類血液分離嗑鹸細胞，以及對該分離細胞之組織 訂 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 n>· 細 離 分 及 血 行 當Η ’ 適SI液 i 離 t 為游血 最Η之,；者 行U願 進 j志 之 2胞入 標 常 目纟正 ^ ^ ^ 分驗Η 一 試 用 離色使 全 游 胺 2 取 採 管 血 採 〇 酯 討燐 檢肝 較以 比是 的法 驗方 試的 離血 游全 胺 用 織使 組 之 將 液 血 胺 織ο 組00 H ο 5 W ο 之 40製 入調 加液 別衝 分緩 , 用 中離 管游 試胺 於織 注組 ^ 以 ί是 或 10液 取衝 各缓 液用 血離 此游
W 25 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210χ 297公釐） A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（26 ) 5 0 0 0、5 0 0、5 0、以及5 n g / m 1之抗人類I g E單源抗體（Η E - 6 9 Β )溶液並加以攪拌（抗人類I g Ε單源抗體之終濃度分別成為 40000、4000、400、 40、及4ng/ml)。總組織胺景之測定， 是以添加了組織胺游離用缓衝液之檢體經過3次凍結解凍 反覆處理後作為檢體。I g E特異性組織胺游離反應，是使 己加入抗人類I g E單源抗體之檢體在3 7 °C反應1小時以進 行之。非特異性組織胺游離反應，是使已加入組織胺游離 用緩衝液之檢髖在3 7 °C反應1小時以進行之。反應完畢後 加以攪拌並以1 5 0 0 r p m離心5分鐘後，分取3 0 0 w 1上清液 。游離Μ織胺量之測定，是以縣用Η P L C法之組織胺測定条 統（島津公司製造）來進行。 使用分離細胞的方法，是以上述實驗例4之相同方法 進行細胞分離以及分離細胞之組織胺游離試驗。抗人類 I gE單源抗體（Η Ε - 6 9 Β )以組織胺游離用缓衝液調製成 40000、4000、400、40、以及4ng/ml溶液，用以求取紐織 胺之游離率。特異性組織胺游離率則依照下式算出 特異性組織胺游離率（％ )= IgE特異性游離組織胺景-非特異性游離組織胺景 -X 100 總組織胺景-非特異性游離組織胺量 如圖2所示，特異性組織胺游離率，不論採用全血的 方法或採用分離細胞的方法，都得到相同結果。由此結果 可知，使用本發明之單源抗體得到的分離細胞，能夠維持 血液中原有的組織胺游離能力。 3 .從臨床檢體分離所得細胞之組織胺游離試驗 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210x297公釐) ΖΈ …：……：…：........................................, ................裝................訂..................« (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) A6 B6 五、發明説明（2 7 ) 以卵白為原因週敏原之兩位小兒特異反應性皮慮炎患 者血液檢髏，使用如上述實施例3之方法調製之B A3 1 2固 定化磁性珠粒，依照上述實施例4之相同方法進行細胞分 離以及分離細胞之組織胺游離試驗。試驗中使用的卵白過 敏原，以組織胺游離用缓衝液調製成4000、400、40、4、 以及0 . 4 n g / m 1之溶液，再由這呰樣品依照前述.之計算式計 算出I g E特異性組織胺之游離率。 如圖3所示，特異性組織胺游離率對卵白過敏原濃度 具有相闊性。此外，過敏原濃度高於某一濃度時，組織胺 濃度反而降低，兩者間的濃度相關曲線也有呈鐘狀的例子 Ο 4 .採用放射性免疫分析法（R I A )測定組織胺濃度 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 使用由上述實施例3所示方法調製而得之B A 3 1 2固定 化磁性珠粒，依照上述實施例4之同樣方法進行細胞分離 以及所分離細胞之組織胺游離試驗。所得到之游離組織胺 樣品，以放射性免疫分析法（R I A )進行組織胺濃度之測定 。就是分取1 〇 〇 w 1之游離組織胺樣品或是組織胺標準溶液 置於試管中，加入以含有〇 . 3 %人類血清白蛋白及〇 . 1 %蠱 氮化鈉之5 0 m Μ辚酸缓衝食塩溶液（P Η 7 . 0 )(分析用緩衝液） 調製之碘1 2 5標識組織胺溶液（1 〇 K B q / m 1 ) 1 0 0 μ 1 ,以及用 分析用缓衝液調製之杭組織胺抗體溶液1 〇 〇 w 1，並在4 °C 反應2小時。在此反應液中再加入用含有〇 · 1 %疊氮化鈉 之5 0 m Μ磷酸緩衝食塩溶液（P Η 7 . 0 ) ( 5 0 m Μ P B S )調製之2 . 5 % 牛7 -球蛋白溶液1 0 0 w 1、以及用5 0 m Μ P B S調製之2 5 聚乙 27 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（28) 二醇（P E G # 6 0 0 0 )溶液5 0 0 /i 1，於4 反應1 0分鏵後，在4 °C 以1 8 Ο Ο X g離心2 0分鏵，再測定沈澱物之放射活性。測得 之標準曲線示如圖4。 [發明之效果] 本發明的單源抗體被固定於換體後仍然保持抗體活性 ，此外，不會阻害由於過敏原或抗I g E抗髏之負荷造成的 化學介髖游離，並且不會誘發非特異件化學介體之游離， 所以能夠用來分離適用於由I g E介合之特異性化學介體游 離試驗的嗦鹼細胞。再者，本發明的嗦鹼細胞分離方法， 能夠簡便的從血球分離嗦鹼細胞，所以能夠極簡便的進行 原來必需要煩雜操作之組織胺游離試驗。而目.，由本發明 之嗦鹼細胞分離方法得到的細胞群，也能夠簡便的適用於 以白三烯、PAF等嗦鹼細胞由來之化學介髖為對象，原來 必須有特別技術進行處理的游離試驗。 [圖之簡單説明] 圖1表示使用固定於磁件珠粒的本發明之單源抗體分 離得到之嘀鹼細胞生成的總紐織胺景（白色圖棒），由I g E 介合之特異件紐織胺游離景（斜線圖棒）、以及非特異件組 織胺游離景（異色圖棒）。 阃2表示以f Ifn以及B A 3 1 2固定化磁性珠粒分離所得 細胞進行組織胺游離反應之抗人類I s E單源抗體濃度相關 曲線。 阃3表示使用由B A 3 1 2固定化磁件珠粒從小兒待異反 應性皮虜炎患者血液分離得到之細胞，進行組織胺游離反 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210X 297公釐I Τδ ……：：-.........................................................裝......................tr (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A6 B6 五、發明説明（29 )應時之卵白過敏原濃度相關曲線。圖4表示以放射性免疫分析法測得組繃胺濃度之標準 曲線。B/Bo表示結合之樣品中被標識樣品之百分率。 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210x297公釐) 29