JPH06205695A - 好塩基球に結合するモノクローナル抗体、好塩基球の分離方法、好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離方法、及び好塩基球由来ケミカルメディエーター遊離試験法 - Google Patents
好塩基球に結合するモノクローナル抗体、好塩基球の分離方法、好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離方法、及び好塩基球由来ケミカルメディエーター遊離試験法Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】以下の(1) 〜(4) の性質を有するモノクローナ
ル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ、該モノクローナル抗体を用いる体液からの好塩基球
の分離方法、好塩基球からのケミカルメディエーターの
遊離方法、及び好塩基球からのケミカルメディエーター
の遊離試験法。 (1) 好塩基球と反応する、(2) 担体に固相化後も抗体活
性を保持する、(3) 該好塩基球のＩｇＥを介した特異的
なケミカルメディエーター遊離を阻害しない、(4) 該好
塩基球の非特異的なケミカルメディエーター遊離を誘発
しない。 【効果】本発明のモノクローナル抗体は、ＩｇＥを介し
た特異的なケミカルメディエーター遊離試験に適した好
塩基球の分離に利用することができる。
ル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ、該モノクローナル抗体を用いる体液からの好塩基球
の分離方法、好塩基球からのケミカルメディエーターの
遊離方法、及び好塩基球からのケミカルメディエーター
の遊離試験法。 (1) 好塩基球と反応する、(2) 担体に固相化後も抗体活
性を保持する、(3) 該好塩基球のＩｇＥを介した特異的
なケミカルメディエーター遊離を阻害しない、(4) 該好
塩基球の非特異的なケミカルメディエーター遊離を誘発
しない。 【効果】本発明のモノクローナル抗体は、ＩｇＥを介し
た特異的なケミカルメディエーター遊離試験に適した好
塩基球の分離に利用することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、(1) 好塩基球と反応
し、(2) 担体固相化後も抗体活性を保持し、(3) 該好塩
基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離を阻害せ
ず、さらに(4)該好塩基球の非特異的なヒスタミン遊離
を誘発しないモノクローナル抗体、および該モノクロー
ナル抗体が担体に固相化した固相化モノクローナル抗体
を提供する。さらに本発明は、該モノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体を用い
る体液からの好塩基球の分離方法、該分離方法により分
離した好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離方
法、及び好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離
試験法を提供する。
し、(2) 担体固相化後も抗体活性を保持し、(3) 該好塩
基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離を阻害せ
ず、さらに(4)該好塩基球の非特異的なヒスタミン遊離
を誘発しないモノクローナル抗体、および該モノクロー
ナル抗体が担体に固相化した固相化モノクローナル抗体
を提供する。さらに本発明は、該モノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体を用い
る体液からの好塩基球の分離方法、該分離方法により分
離した好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離方
法、及び好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離
試験法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】白血球の一種である好塩基球はＩｇＥの
標的細胞であり、その顆粒中にヒスタミンを始めとする
種々の化学伝達物質（ケミカルメディエーター）を貯蔵
し、肥満細胞とともにアレルギー反応の中心的存在とし
て注目されている。
標的細胞であり、その顆粒中にヒスタミンを始めとする
種々の化学伝達物質（ケミカルメディエーター）を貯蔵
し、肥満細胞とともにアレルギー反応の中心的存在とし
て注目されている。
【０００３】通常、好塩基球からのケミカルメディエー
ターの遊離機序は大きく２つに分けられる。その１つは
好塩基球の膜表面のレセプターに結合したＩｇＥ同志が
アレルゲンや抗ＩｇＥ抗体により架橋され、その刺激に
より脱顆粒反応がおこりケミカルメディエーターが遊離
するというもので、アレルギー反応による遊離がこれに
相当する（以下、ＩｇＥを介した特異的なケミカルメデ
ィエーター遊離、と記す）。もう１つは、その遊離機序
や意義は明らかにされていないが、直接好塩基球膜表面
のＩｇＥを架橋することなく生じる遊離で、対応するＩ
ｇＥを介した特異的な遊離反応に照らして、抗ＩｇＥ抗
体や、アレルゲンの非存在下でも起こるものである（以
下、非特異的なケミカルメディエーター遊離、と記
す）。
ターの遊離機序は大きく２つに分けられる。その１つは
好塩基球の膜表面のレセプターに結合したＩｇＥ同志が
アレルゲンや抗ＩｇＥ抗体により架橋され、その刺激に
より脱顆粒反応がおこりケミカルメディエーターが遊離
するというもので、アレルギー反応による遊離がこれに
相当する（以下、ＩｇＥを介した特異的なケミカルメデ
ィエーター遊離、と記す）。もう１つは、その遊離機序
や意義は明らかにされていないが、直接好塩基球膜表面
のＩｇＥを架橋することなく生じる遊離で、対応するＩ
ｇＥを介した特異的な遊離反応に照らして、抗ＩｇＥ抗
体や、アレルゲンの非存在下でも起こるものである（以
下、非特異的なケミカルメディエーター遊離、と記
す）。
【０００４】アレルギー疾患の診断や病態解析にはＩｇ
Ｅを介した特異的なケミカルメディエーター遊離を試験
することが有用であり、その代表的な試験としてヒスタ
ミン遊離試験がある。ヒスタミンはＩ型アレルギー反応
を引き起こす特に重要なケミカルメディエーターであ
り、気管支平滑筋の収縮、血管透過性の亢進などの諸反
応を惹起することが知られている。ヒスタミン遊離試験
は、ヒト末梢血中の好塩基球表面にレセプターを介して
結合した免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）を、種々のアレル
ゲンと反応させることにより、これに伴って遊離したヒ
スタミン量を測定する生物学的反応を利用した特徴ある
検査法であり、他のアレルゲン同定法である特異ＩｇＥ
試験（ＲＡＳＴ）、皮膚試験等と異なって、アレルギー
患者の原因アレルゲン探索のより臨床症状に近い方法と
して有用である。
Ｅを介した特異的なケミカルメディエーター遊離を試験
することが有用であり、その代表的な試験としてヒスタ
ミン遊離試験がある。ヒスタミンはＩ型アレルギー反応
を引き起こす特に重要なケミカルメディエーターであ
り、気管支平滑筋の収縮、血管透過性の亢進などの諸反
応を惹起することが知られている。ヒスタミン遊離試験
は、ヒト末梢血中の好塩基球表面にレセプターを介して
結合した免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）を、種々のアレル
ゲンと反応させることにより、これに伴って遊離したヒ
スタミン量を測定する生物学的反応を利用した特徴ある
検査法であり、他のアレルゲン同定法である特異ＩｇＥ
試験（ＲＡＳＴ）、皮膚試験等と異なって、アレルギー
患者の原因アレルゲン探索のより臨床症状に近い方法と
して有用である。
【０００５】この末梢血を用いるヒスタミン遊離試験に
は全血を用いる方法と、洗浄白血球を用いる方法があ
る。全血法は、患者のアレルギー状態を総合的に把握す
る上で有用と考えられているが、好塩基球以外の他の血
清成分がヒスタミン遊離の測定に影響を及ぼす可能性が
ある。このため、薬剤などの作用機序を研究したり、ヒ
スタミン遊離機構の基礎的研究をする場合など、正確な
好塩基球の反応性を分析する場合には、通常洗浄白血球
を用いる。しかし、洗浄白血球を分離するためには、デ
キストラン溶液にて赤血球を除去した後、２〜３回の遠
心を伴った洗浄を行い、更に白血球数を調整するなどの
煩雑な操作が必要であり、このため検査に必要な血液量
も多くなり、日常検査として利用するには多くの難点が
ある。
は全血を用いる方法と、洗浄白血球を用いる方法があ
る。全血法は、患者のアレルギー状態を総合的に把握す
る上で有用と考えられているが、好塩基球以外の他の血
清成分がヒスタミン遊離の測定に影響を及ぼす可能性が
ある。このため、薬剤などの作用機序を研究したり、ヒ
スタミン遊離機構の基礎的研究をする場合など、正確な
好塩基球の反応性を分析する場合には、通常洗浄白血球
を用いる。しかし、洗浄白血球を分離するためには、デ
キストラン溶液にて赤血球を除去した後、２〜３回の遠
心を伴った洗浄を行い、更に白血球数を調整するなどの
煩雑な操作が必要であり、このため検査に必要な血液量
も多くなり、日常検査として利用するには多くの難点が
ある。
【０００６】また、好塩基球の脱顆粒反応と共に放出さ
れる物質の中には、ロイコトリエンや血小板活性化因子
（ＰＡＦ）などの、強力な血管透過性亢進作用・白血球
遊走能を示すケミカルメディエーターの存在が知られて
おり、アレルギーの病態解析を目的として、これら種々
の好塩基球由来ケミカルメディエーターが基礎研究対象
物質となってきている。しかし、これらのケミカルメデ
ィエーターは血液中に放出された場合速やかに代謝され
てしまうものが多く、これらの測定を行う際には特に試
料の取り扱いを迅速かつ厳密に行うことが重要な要件と
なってくる。このような好塩基球由来ケミカルメディエ
ーターの多くは、現在分析が非常に難しい。
れる物質の中には、ロイコトリエンや血小板活性化因子
（ＰＡＦ）などの、強力な血管透過性亢進作用・白血球
遊走能を示すケミカルメディエーターの存在が知られて
おり、アレルギーの病態解析を目的として、これら種々
の好塩基球由来ケミカルメディエーターが基礎研究対象
物質となってきている。しかし、これらのケミカルメデ
ィエーターは血液中に放出された場合速やかに代謝され
てしまうものが多く、これらの測定を行う際には特に試
料の取り扱いを迅速かつ厳密に行うことが重要な要件と
なってくる。このような好塩基球由来ケミカルメディエ
ーターの多くは、現在分析が非常に難しい。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】上述したように、好塩
基球からのケミカルメディエーターの遊離には、アレル
ギー反応によるＩｇＥを介した特異的な遊離と、それ以
外の非特異的な遊離があり、アレルギー疾患の診断には
ＩｇＥを介して特異的に遊離されたケミカルメディエー
ターを測定することが必要である。しかし、前述のよう
に血清成分の影響を受けることなくヒスタミン遊離試験
を行うためには白血球を分離しなければならないため、
煩雑な操作と多量の血液が必要であり、日常の検査には
不向きである。さらに、ヒスタミン以外のケミカルメデ
ィエーターについても試料の取り扱いが煩雑であるので
現在分析を行うのが困難な状況である。
基球からのケミカルメディエーターの遊離には、アレル
ギー反応によるＩｇＥを介した特異的な遊離と、それ以
外の非特異的な遊離があり、アレルギー疾患の診断には
ＩｇＥを介して特異的に遊離されたケミカルメディエー
ターを測定することが必要である。しかし、前述のよう
に血清成分の影響を受けることなくヒスタミン遊離試験
を行うためには白血球を分離しなければならないため、
煩雑な操作と多量の血液が必要であり、日常の検査には
不向きである。さらに、ヒスタミン以外のケミカルメデ
ィエーターについても試料の取り扱いが煩雑であるので
現在分析を行うのが困難な状況である。
【０００８】そこで本発明者らは、血液中から好塩基球
を分離し、ヒスタミン等の遊離試験に用いれば上記の問
題を解決できるのではないかと考え研究を行った。これ
まで、好塩基球の分離・精製法としては、比重遠心法で
予め好塩基球の密度を高めた試料から好塩基球以外の細
胞成分に反応する抗体を結合した磁性粒子を用いて不純
物細胞を除くことにより好塩基球の精製を行うＰ．Ｊ．
フレデリック(P. J. Frederik)らの方法 [ジャーナル・
オブ・イムノロジカル・メソッヅ（J. Immunol. Method
s) 149, 207 (1992)] 等がある。しかし、この方法は目
的とする好塩基球そのものを分離する精製法ではなく、
夾雑物を除去することによる精製法であるので、効率が
悪い上に操作性も煩雑である。
を分離し、ヒスタミン等の遊離試験に用いれば上記の問
題を解決できるのではないかと考え研究を行った。これ
まで、好塩基球の分離・精製法としては、比重遠心法で
予め好塩基球の密度を高めた試料から好塩基球以外の細
胞成分に反応する抗体を結合した磁性粒子を用いて不純
物細胞を除くことにより好塩基球の精製を行うＰ．Ｊ．
フレデリック(P. J. Frederik)らの方法 [ジャーナル・
オブ・イムノロジカル・メソッヅ（J. Immunol. Method
s) 149, 207 (1992)] 等がある。しかし、この方法は目
的とする好塩基球そのものを分離する精製法ではなく、
夾雑物を除去することによる精製法であるので、効率が
悪い上に操作性も煩雑である。
【０００９】一方、好塩基球そのものに反応する抗体も
多数知られており [例えば、Ｐ．バレント(Valent)ら、
インターナショナル・アーカイブズ・アレルギー・アプ
ライド・イムノロジー（Int. Arch. Allergy Appl. Imm
unol. ) 91, 198 (1990)] 、またヒト好塩基球に対して
特異的な反応を示すモノクローナル抗体も報告されてい
る [Ｍ．Ｐ．ボジャー (Bodger) ら、ブラッド (Blood)
69, 1414 (1987)] 。しかし、かかる好塩基球反応性抗
体を固相担体に結合させ、ヒト好塩基球の分離に利用し
た試みの成功例は知られておらず、したがって、当然に
そのような方法で分離したヒト好塩基球をヒスタミンな
どのケミカルメディエーター遊離試験に用いた例も見ら
れない。
多数知られており [例えば、Ｐ．バレント(Valent)ら、
インターナショナル・アーカイブズ・アレルギー・アプ
ライド・イムノロジー（Int. Arch. Allergy Appl. Imm
unol. ) 91, 198 (1990)] 、またヒト好塩基球に対して
特異的な反応を示すモノクローナル抗体も報告されてい
る [Ｍ．Ｐ．ボジャー (Bodger) ら、ブラッド (Blood)
69, 1414 (1987)] 。しかし、かかる好塩基球反応性抗
体を固相担体に結合させ、ヒト好塩基球の分離に利用し
た試みの成功例は知られておらず、したがって、当然に
そのような方法で分離したヒト好塩基球をヒスタミンな
どのケミカルメディエーター遊離試験に用いた例も見ら
れない。
【００１０】この事実は、好塩基球反応性抗体を固相担
体に結合させることによる好塩基球反応性の喪失等によ
る失敗も考えられる（後述実験例１（１））が、最も大
きな原因は、かかる好塩基球反応性抗体を利用して分取
された好塩基球がダメージを受けており、ＩｇＥを介し
た特異的なヒスタミン遊離が阻害される場合〔例えば、
Ｐ．Ｊ．フレデリックら、ジャーナル・オブ・イムノロ
ジカル・メソッヅ（J.Immunol. Methods) 149, 213 (19
92)、及びＪ．Ｔ．シュレーダー(J. T. Schroeder)
ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ（J.
Immunol. Methods) 133, 269 〜277 (1990)〕やＩｇＥ
を介した特異的なヒスタミン遊離に比して非特異的ヒス
タミン遊離が著しく高くなったため、ヒスタミン遊離反
応の定量等の使用に耐え得なくなっている場合が多いこ
とが考えられる（後述実験例１（２））。Ｐ．Ｊ．フレ
デリックらが、好塩基球以外の細胞成分と反応する抗体
を用いて好塩基球の精製を行うという一見迂遠な方法を
採ったのも上述の欠点を回避するためであったと解され
る。
体に結合させることによる好塩基球反応性の喪失等によ
る失敗も考えられる（後述実験例１（１））が、最も大
きな原因は、かかる好塩基球反応性抗体を利用して分取
された好塩基球がダメージを受けており、ＩｇＥを介し
た特異的なヒスタミン遊離が阻害される場合〔例えば、
Ｐ．Ｊ．フレデリックら、ジャーナル・オブ・イムノロ
ジカル・メソッヅ（J.Immunol. Methods) 149, 213 (19
92)、及びＪ．Ｔ．シュレーダー(J. T. Schroeder)
ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ（J.
Immunol. Methods) 133, 269 〜277 (1990)〕やＩｇＥ
を介した特異的なヒスタミン遊離に比して非特異的ヒス
タミン遊離が著しく高くなったため、ヒスタミン遊離反
応の定量等の使用に耐え得なくなっている場合が多いこ
とが考えられる（後述実験例１（２））。Ｐ．Ｊ．フレ
デリックらが、好塩基球以外の細胞成分と反応する抗体
を用いて好塩基球の精製を行うという一見迂遠な方法を
採ったのも上述の欠点を回避するためであったと解され
る。
【００１１】
【課題を解決するための手段】しかしながら、好塩基球
そのものをターゲットとし好塩基球反応性抗体を用いて
好塩基球の分離精製を行うことができれば、簡易かつ高
精度の精製が達成可能となるはずである。そこで、本発
明者らは、かかる目的に使用し得る抗体すなわち好塩基
球と反応するモノクローナル抗体であって、固相担体と
結合した後も好塩基球に対する反応性を有し、かつ、好
塩基球と結合後も当該好塩基球にダメージを与えること
のない、すなわちＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊
離にも非特異的ヒスタミン遊離にも有意の影響を与える
ことのない特性を有するモノクローナル抗体の探索を鋭
意行った。その結果、目的のモノクローナル抗体の調製
に成功した。そして、かかる抗体を担体に固相化して体
液と反応させ、該モノクローナル抗体により該体液中の
好塩基球を捕捉した後、未反応の体液を除去することに
より容易に好塩基球を分離する方法を確立し、分離した
好塩基球にアレルゲンまたは抗ＩｇＥ抗体を反応させて
ヒスタミンを遊離させることに成功した。さらに本発明
者らは、該抗体を用いて分離した好塩基球のＩｇＥを介
した特異的なヒスタミン遊離試験法を確立して、本発明
を完成させるに至った。
そのものをターゲットとし好塩基球反応性抗体を用いて
好塩基球の分離精製を行うことができれば、簡易かつ高
精度の精製が達成可能となるはずである。そこで、本発
明者らは、かかる目的に使用し得る抗体すなわち好塩基
球と反応するモノクローナル抗体であって、固相担体と
結合した後も好塩基球に対する反応性を有し、かつ、好
塩基球と結合後も当該好塩基球にダメージを与えること
のない、すなわちＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊
離にも非特異的ヒスタミン遊離にも有意の影響を与える
ことのない特性を有するモノクローナル抗体の探索を鋭
意行った。その結果、目的のモノクローナル抗体の調製
に成功した。そして、かかる抗体を担体に固相化して体
液と反応させ、該モノクローナル抗体により該体液中の
好塩基球を捕捉した後、未反応の体液を除去することに
より容易に好塩基球を分離する方法を確立し、分離した
好塩基球にアレルゲンまたは抗ＩｇＥ抗体を反応させて
ヒスタミンを遊離させることに成功した。さらに本発明
者らは、該抗体を用いて分離した好塩基球のＩｇＥを介
した特異的なヒスタミン遊離試験法を確立して、本発明
を完成させるに至った。
【００１２】すなわち、本発明は以下の性質を有するモ
ノクローナル抗体を提供する。 (1) 好塩基球と反応する、(2) 担体固相化後も抗体活性
を保持する、(3) 該好塩基球のＩｇＥを介した特異的な
ヒスタミン遊離を阻害しない、(4) 該好塩基球の非特異
的なヒスタミン遊離を誘発しない、
ノクローナル抗体を提供する。 (1) 好塩基球と反応する、(2) 担体固相化後も抗体活性
を保持する、(3) 該好塩基球のＩｇＥを介した特異的な
ヒスタミン遊離を阻害しない、(4) 該好塩基球の非特異
的なヒスタミン遊離を誘発しない、
【００１３】本発明が提供する上記(1) 、(2) 、(3) お
よび(4) の性質を有するモノクローナル抗体において、
(1) 好塩基球と反応する、とは該モノクローナル抗体が
好塩基球の表面抗原と反応することを意味する。
よび(4) の性質を有するモノクローナル抗体において、
(1) 好塩基球と反応する、とは該モノクローナル抗体が
好塩基球の表面抗原と反応することを意味する。
【００１４】また、(2) 担体固相化後も抗体活性を保持
する、とは該モノクローナル抗体を担体に結合させた後
も好塩基球の捕捉能を失わないことを意味する。該担体
としては、例えば、ガラスまたは合成樹脂製の粒状物
（ビーズ）あるいは球状物（ボール）、チューブ、プレ
ート、マグネチックビーズのような磁性粒子など、通常
抗体を固相化するときに用いる担体であれば全て用いる
ことができるが、好ましくは磁性粒子を用いるのが良
い。
する、とは該モノクローナル抗体を担体に結合させた後
も好塩基球の捕捉能を失わないことを意味する。該担体
としては、例えば、ガラスまたは合成樹脂製の粒状物
（ビーズ）あるいは球状物（ボール）、チューブ、プレ
ート、マグネチックビーズのような磁性粒子など、通常
抗体を固相化するときに用いる担体であれば全て用いる
ことができるが、好ましくは磁性粒子を用いるのが良
い。
【００１５】固相化抗体の好塩基球捕捉能は、固相化し
たモノクローナル抗体が好塩基球と結合したか否かを検
定することにより判定され、具体的にはヒスタミンを指
標とし、次のような方法により行う。まず、マグネチッ
クビーズに固相化した、ヒト好塩基球と反応するモノク
ローナル抗体をヒト血液と反応させる。次いで磁石でビ
ーズを集めて上清を除いた後、ヒスタミン遊離用緩衝液
（塩化カルシウム、塩化マグネシウム等を含むＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液）を加え凍結融解を数回繰り返し、その上清の
総ヒスタミン量を既知の方法、例えばＨＰＬＣ法による
ヒスタミン測定システム [ Ｙ．ツルタ (Tsuruta)ら、
ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー(J. Chromatog
r.) 224, 105 (1981)] （島津製作所）により測定し、
ヒスタミンが検出された抗体を好塩基球捕捉能を有する
抗体として選択する。
たモノクローナル抗体が好塩基球と結合したか否かを検
定することにより判定され、具体的にはヒスタミンを指
標とし、次のような方法により行う。まず、マグネチッ
クビーズに固相化した、ヒト好塩基球と反応するモノク
ローナル抗体をヒト血液と反応させる。次いで磁石でビ
ーズを集めて上清を除いた後、ヒスタミン遊離用緩衝液
（塩化カルシウム、塩化マグネシウム等を含むＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液）を加え凍結融解を数回繰り返し、その上清の
総ヒスタミン量を既知の方法、例えばＨＰＬＣ法による
ヒスタミン測定システム [ Ｙ．ツルタ (Tsuruta)ら、
ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー(J. Chromatog
r.) 224, 105 (1981)] （島津製作所）により測定し、
ヒスタミンが検出された抗体を好塩基球捕捉能を有する
抗体として選択する。
【００１６】また、(3) 該好塩基球のＩｇＥを介した特
異的なヒスタミン遊離を阻害しないとは、該モノクロー
ナル抗体と結合した好塩基球が、血液中で本来有するＩ
ｇＥを介した特異的ヒスタミン遊離能を実質的に維持し
ていることを意味する。実質的に維持するか否かは、本
発明において発見されたモノクローナル抗体ＢＡ３１２
との比較実験によって確認することができる。すなわ
ち、ＢＡ３１２により捕捉された好塩基球は血液中で本
来有するヒスタミン遊離能を維持している（後述実験例
２）から、被検固相化モノクローナル抗体を固相化ＢＡ
３１２と同条件で好塩基球と反応させ、得られた両モノ
クローナル抗体結合好塩基球を同条件下で抗ＩｇＥ抗体
処理を行い遊離されたヒスタミン量がＢＡ３１２のそれ
の６０％以上である場合に当該モノクローナル抗体は
「該好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離
を阻害しない」ものと判定し、本発明の対象となると決
定する。
異的なヒスタミン遊離を阻害しないとは、該モノクロー
ナル抗体と結合した好塩基球が、血液中で本来有するＩ
ｇＥを介した特異的ヒスタミン遊離能を実質的に維持し
ていることを意味する。実質的に維持するか否かは、本
発明において発見されたモノクローナル抗体ＢＡ３１２
との比較実験によって確認することができる。すなわ
ち、ＢＡ３１２により捕捉された好塩基球は血液中で本
来有するヒスタミン遊離能を維持している（後述実験例
２）から、被検固相化モノクローナル抗体を固相化ＢＡ
３１２と同条件で好塩基球と反応させ、得られた両モノ
クローナル抗体結合好塩基球を同条件下で抗ＩｇＥ抗体
処理を行い遊離されたヒスタミン量がＢＡ３１２のそれ
の６０％以上である場合に当該モノクローナル抗体は
「該好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離
を阻害しない」ものと判定し、本発明の対象となると決
定する。
【００１７】さらに、(4) 該好塩基球の非特異的なヒス
タミン遊離を誘発しない、とは該モノクローナル抗体と
結合した好塩基球からの非特異的なヒスタミン遊離の量
が、ＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離の量の３０
％以下であることを意味する。
タミン遊離を誘発しない、とは該モノクローナル抗体と
結合した好塩基球からの非特異的なヒスタミン遊離の量
が、ＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離の量の３０
％以下であることを意味する。
【００１８】非特異的なヒスタミン遊離の量は、該好塩
基球に適当な溶媒、例えば塩化カルシウム、塩化マグネ
シウム、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等を含むヒドロ
キシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸
（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ヒスタミン遊離用緩衝液）を加
え１０〜５０℃で１０〜６０分間反応させることにより
遊離するヒスタミンの量を既知の方法、例えばＨＰＬＣ
法により測定することにより得ることができる。
基球に適当な溶媒、例えば塩化カルシウム、塩化マグネ
シウム、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等を含むヒドロ
キシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸
（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ヒスタミン遊離用緩衝液）を加
え１０〜５０℃で１０〜６０分間反応させることにより
遊離するヒスタミンの量を既知の方法、例えばＨＰＬＣ
法により測定することにより得ることができる。
【００１９】ＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離の
量は、該好塩基球とヒスタミン遊離用緩衝液で調製した
抗ＩｇＥ抗体とを上と同一の温度・反応時間の下で反応
させることにより遊離するヒスタミンの量を、上と同一
の方法・条件の下で測定することにより得ることができ
る。
量は、該好塩基球とヒスタミン遊離用緩衝液で調製した
抗ＩｇＥ抗体とを上と同一の温度・反応時間の下で反応
させることにより遊離するヒスタミンの量を、上と同一
の方法・条件の下で測定することにより得ることができ
る。
【００２０】以下に本発明のモノクローナル抗体の作製
方法を簡単に示す。 (1) ハイブリドーマの調製 マウスをヒト好塩基球で免疫する。免疫は、ヒト好塩基
球を数週間おきにマウスの腹腔、皮下、または静脈に数
回繰り返し接種することにより行う。免疫されたマウス
から抗体産生細胞を得、これと骨髄腫細胞を融合しハイ
ブリドーマを作製する。得られたハイブリドーマの内ヒ
ト好塩基球に反応する抗体を産生するハイブリドーマの
ウエルを選択する。
方法を簡単に示す。 (1) ハイブリドーマの調製 マウスをヒト好塩基球で免疫する。免疫は、ヒト好塩基
球を数週間おきにマウスの腹腔、皮下、または静脈に数
回繰り返し接種することにより行う。免疫されたマウス
から抗体産生細胞を得、これと骨髄腫細胞を融合しハイ
ブリドーマを作製する。得られたハイブリドーマの内ヒ
ト好塩基球に反応する抗体を産生するハイブリドーマの
ウエルを選択する。
【００２１】選択されたハイブリドーマをクローニング
し、出現したハイブリドーマクローンの産生した抗体
を、ヒツジ抗マウス免疫グロブリン抗体が予め結合して
あるマグネチックビーズに結合した後、ヒト血液中の好
塩基球の捕捉能、及び分離した好塩基球のヒスタミン遊
離に関する特性を検定する。捕捉能の検定は、前述の方
法で行うことができる。
し、出現したハイブリドーマクローンの産生した抗体
を、ヒツジ抗マウス免疫グロブリン抗体が予め結合して
あるマグネチックビーズに結合した後、ヒト血液中の好
塩基球の捕捉能、及び分離した好塩基球のヒスタミン遊
離に関する特性を検定する。捕捉能の検定は、前述の方
法で行うことができる。
【００２２】分離した好塩基球のヒスタミン遊離に関す
る特性の検定は、捕捉能の検定と同様マグネチックビー
ズに固相化した該抗体をヒト血液と反応させ、磁石でビ
ーズを集めて上清を除いた後、前述の方法に従って非特
異的なヒスタミン遊離の量とＩｇＥを介した特異的なヒ
スタミン遊離の量を測定し、ＩｇＥを介した特異的なヒ
スタミン遊離が阻害されず、かつ非特異的なヒスタミン
遊離が促進されていない抗体すなわち非特異的なヒスタ
ミン遊離の量がＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離
の量の３０％以下、好ましくは１０％以下となった抗体
を選択する。
る特性の検定は、捕捉能の検定と同様マグネチックビー
ズに固相化した該抗体をヒト血液と反応させ、磁石でビ
ーズを集めて上清を除いた後、前述の方法に従って非特
異的なヒスタミン遊離の量とＩｇＥを介した特異的なヒ
スタミン遊離の量を測定し、ＩｇＥを介した特異的なヒ
スタミン遊離が阻害されず、かつ非特異的なヒスタミン
遊離が促進されていない抗体すなわち非特異的なヒスタ
ミン遊離の量がＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離
の量の３０％以下、好ましくは１０％以下となった抗体
を選択する。
【００２３】このようにして、担体に結合後も抗体活性
を失わず好塩基球の捕捉能を有しており、かつ分離した
好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離を阻
害せず、かつ非特異的なヒスタミン遊離を誘発しない抗
体を産生するハイブリドーマクローンを選択し、これを
培養してモノクローナル抗体を回収する。
を失わず好塩基球の捕捉能を有しており、かつ分離した
好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離を阻
害せず、かつ非特異的なヒスタミン遊離を誘発しない抗
体を産生するハイブリドーマクローンを選択し、これを
培養してモノクローナル抗体を回収する。
【００２４】上記の免疫法、細胞融合法、融合細胞の選
択、クローニングなどは公知の通常の方法によって行う
ことができる。
択、クローニングなどは公知の通常の方法によって行う
ことができる。
【００２５】(2) モノクローナル抗体の作製 選択したハイブリドーマをインビトロ(in vitro)培養
法、またはインビボ(invivo) 培養法により増殖させ、
モノクローナル抗体を得る。インビトロ培養法として
は、ハイブリドーマを牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地
（完全ＲＰＭＩ培地）で増殖限界になるまで培養し、そ
の培養上清を回収することによってモノクローナル抗体
を得ることができる。インビボ培養法としては、予めプ
リステンを腹腔内投与処理したマウスの腹腔にハイブリ
ドーマを移植し、数週後にマウスの腹部肥大を確かめて
その腹水を採取し、腹水からＩｇＧ、若しくはＩｇＭ画
分を硫安分画、ＤＥＡＥセファロースカラム等の既知の
方法を適宜組み合わせて分離・精製することによってモ
ノクローナル抗体を得ることができる。
法、またはインビボ(invivo) 培養法により増殖させ、
モノクローナル抗体を得る。インビトロ培養法として
は、ハイブリドーマを牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地
（完全ＲＰＭＩ培地）で増殖限界になるまで培養し、そ
の培養上清を回収することによってモノクローナル抗体
を得ることができる。インビボ培養法としては、予めプ
リステンを腹腔内投与処理したマウスの腹腔にハイブリ
ドーマを移植し、数週後にマウスの腹部肥大を確かめて
その腹水を採取し、腹水からＩｇＧ、若しくはＩｇＭ画
分を硫安分画、ＤＥＡＥセファロースカラム等の既知の
方法を適宜組み合わせて分離・精製することによってモ
ノクローナル抗体を得ることができる。
【００２６】上記方法により得られた本発明のモノクロ
ーナル抗体ＢＡ１０１、ＢＡ２０、ＢＡ１３５、および
ＢＡ３１２を産生するハイブリドーマは、１９９２年９
月１０日から、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
（郵便番号３０５）にある通商産業省工業技術院微生物
工業技術研究所に、それぞれ「ＢＡ１０１シオノギ」
（微工研条寄第４００４号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４００
４）、「ＢＡ２０シオノギ」（微工研条寄第４００５
号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４００５）、「ＢＡ１３５シオノ
ギ」（微工研条寄第４００６号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４０
０６）、「ＢＡ３１２シオノギ」（微工研条寄第４００
７号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４００７）として、ブダペスト
条約に基づき寄託されている。このように本発明のモノ
クローナル抗体は、例えば寄託されたハイブリドーマに
より産生されるものが挙げられるが、上述した (1)〜
(4) の性質を有しているモノクローナル抗体であればい
ずれも本発明の範囲である。好ましくはモノクローナル
抗体ＢＡ３１２が用いられる。
ーナル抗体ＢＡ１０１、ＢＡ２０、ＢＡ１３５、および
ＢＡ３１２を産生するハイブリドーマは、１９９２年９
月１０日から、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
（郵便番号３０５）にある通商産業省工業技術院微生物
工業技術研究所に、それぞれ「ＢＡ１０１シオノギ」
（微工研条寄第４００４号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４００
４）、「ＢＡ２０シオノギ」（微工研条寄第４００５
号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４００５）、「ＢＡ１３５シオノ
ギ」（微工研条寄第４００６号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４０
０６）、「ＢＡ３１２シオノギ」（微工研条寄第４００
７号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４００７）として、ブダペスト
条約に基づき寄託されている。このように本発明のモノ
クローナル抗体は、例えば寄託されたハイブリドーマに
より産生されるものが挙げられるが、上述した (1)〜
(4) の性質を有しているモノクローナル抗体であればい
ずれも本発明の範囲である。好ましくはモノクローナル
抗体ＢＡ３１２が用いられる。
【００２７】本発明のモノクローナル抗体は、ヒト好塩
基球を含む白血球と反応し、ヒト赤血球とは反応しな
い。さらに本発明のモノクローナル抗体は、担体に固相
化した後も好塩基球を充分に捕捉することができ、捕捉
した好塩基球の非特異的なケミカルメディエーターの遊
離を誘発せず、ＩｇＥを介した特異的なケミカルメディ
エーター遊離を阻害しない。また、本発明のモノクロー
ナル抗体は、前記のような担体に結合させて得られる固
相化モノクローナル抗体として有利に用いることができ
る。モノクローナル抗体を担体に結合させて固相化させ
る方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法、
例えば〔Ｔ．リー（Lea)ら、スカンジナビアン・ジャー
ナル・オブ・イムノロジー（Scand. J. Immunol.) 22,
207 (1985)]により行うことができる。例えば、モノク
ローナル抗体をアンコーテッド、又はトシル基のような
化学的活性基を持つ化合物または抗マウス免疫グロブリ
ンでコートされた固相担体と０〜５０℃、好ましくは４
〜４０℃で５分〜７２時間、好ましくは３０分〜４８時
間反応させる。
基球を含む白血球と反応し、ヒト赤血球とは反応しな
い。さらに本発明のモノクローナル抗体は、担体に固相
化した後も好塩基球を充分に捕捉することができ、捕捉
した好塩基球の非特異的なケミカルメディエーターの遊
離を誘発せず、ＩｇＥを介した特異的なケミカルメディ
エーター遊離を阻害しない。また、本発明のモノクロー
ナル抗体は、前記のような担体に結合させて得られる固
相化モノクローナル抗体として有利に用いることができ
る。モノクローナル抗体を担体に結合させて固相化させ
る方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法、
例えば〔Ｔ．リー（Lea)ら、スカンジナビアン・ジャー
ナル・オブ・イムノロジー（Scand. J. Immunol.) 22,
207 (1985)]により行うことができる。例えば、モノク
ローナル抗体をアンコーテッド、又はトシル基のような
化学的活性基を持つ化合物または抗マウス免疫グロブリ
ンでコートされた固相担体と０〜５０℃、好ましくは４
〜４０℃で５分〜７２時間、好ましくは３０分〜４８時
間反応させる。
【００２８】本発明はまた、前記のようにして得られる
本発明の固相化モノクローナル抗体と体液とを反応さ
せ、該体液中の好塩基球を該固相化モノクローナル抗体
に結合させて捕捉することを特徴とする、好塩基球の分
離方法を提供する。
本発明の固相化モノクローナル抗体と体液とを反応さ
せ、該体液中の好塩基球を該固相化モノクローナル抗体
に結合させて捕捉することを特徴とする、好塩基球の分
離方法を提供する。
【００２９】該体液としては、血液、鼻汁、涙液、唾液
などが挙げられるが、好ましくは血液を用いる。
などが挙げられるが、好ましくは血液を用いる。
【００３０】ところで磁性粒子に抗体を結合させて目的
の細胞を分離する方法は、Ｇ．ゴーダーナックらの報告
[Ｇ．ゴーダーナック (Gaudernack) ら、ジャーナル・
オブ・イムノロジカル・メソッド (J. Immunol. Method
s) 90, 179 (1986)]など、広く知られている。また、比
重遠心法で予め好塩基球の密度を高めた試料から、好塩
基球以外の細胞成分に反応する抗体を結合した磁性粒子
を用いて不純物細胞を除くことにより好塩基球の精製を
行う方法も、Ｐ．Ｊ．フレデリックらにより報告されて
いる [Ｐ．Ｊ．フレデリック (Frederic) ら、ジャーナ
ル・オブ・イムノロジカル・メソッド (J. Immunol. Me
thods) 149, 207 (1992)] が、本発明とは、好塩基球に
対する抗体を用いるのか、好塩基球以外の細胞に対する
抗体を用いるのかという部分で本質的な相違がある。
の細胞を分離する方法は、Ｇ．ゴーダーナックらの報告
[Ｇ．ゴーダーナック (Gaudernack) ら、ジャーナル・
オブ・イムノロジカル・メソッド (J. Immunol. Method
s) 90, 179 (1986)]など、広く知られている。また、比
重遠心法で予め好塩基球の密度を高めた試料から、好塩
基球以外の細胞成分に反応する抗体を結合した磁性粒子
を用いて不純物細胞を除くことにより好塩基球の精製を
行う方法も、Ｐ．Ｊ．フレデリックらにより報告されて
いる [Ｐ．Ｊ．フレデリック (Frederic) ら、ジャーナ
ル・オブ・イムノロジカル・メソッド (J. Immunol. Me
thods) 149, 207 (1992)] が、本発明とは、好塩基球に
対する抗体を用いるのか、好塩基球以外の細胞に対する
抗体を用いるのかという部分で本質的な相違がある。
【００３１】一方、本発明の好塩基球の分離方法は、本
発明のモノクローナル抗体を担体、例えば磁性粒子に、
直接または抗マウス免疫グロブリンを介して固相化して
抗体結合磁性粒子とし、これを体液、好ましくは血液と
０〜５０℃、好ましくは１５〜４０℃で短時間（１〜６
０分）反応させた後、磁石を用いて磁性粒子を引き寄せ
て未反応の試料を除去するという簡便な操作で好塩基球
を高濃度で含む細胞集団を調製分離することができる。
発明のモノクローナル抗体を担体、例えば磁性粒子に、
直接または抗マウス免疫グロブリンを介して固相化して
抗体結合磁性粒子とし、これを体液、好ましくは血液と
０〜５０℃、好ましくは１５〜４０℃で短時間（１〜６
０分）反応させた後、磁石を用いて磁性粒子を引き寄せ
て未反応の試料を除去するという簡便な操作で好塩基球
を高濃度で含む細胞集団を調製分離することができる。
【００３２】本発明はまた、本発明の好塩基球の分離法
により分離した好塩基球をアレルゲンまたは抗ＩｇＥ抗
体と反応させることを特徴とする、該好塩基球からのケ
ミカルメディエーターの遊離方法を提供する。
により分離した好塩基球をアレルゲンまたは抗ＩｇＥ抗
体と反応させることを特徴とする、該好塩基球からのケ
ミカルメディエーターの遊離方法を提供する。
【００３３】アレルゲンとしては、室内塵や花粉などの
吸入性アレルゲンや、食肉や卵などの食餌性アレルゲン
をはじめとして、その他化学物質など、通常アレルギー
診断で用いられるものを、適宜必要に応じて用いること
ができる。
吸入性アレルゲンや、食肉や卵などの食餌性アレルゲン
をはじめとして、その他化学物質など、通常アレルギー
診断で用いられるものを、適宜必要に応じて用いること
ができる。
【００３４】該好塩基球とアレルゲンまたは抗ＩｇＥ抗
体との反応は１０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃で
０．５〜３００分間、好ましくは１０〜６０分間行う。
体との反応は１０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃で
０．５〜３００分間、好ましくは１０〜６０分間行う。
【００３５】本発明はさらに、以下の(1) 〜(3) の工程
よりなる好塩基球からのケミカルメディエーター遊離試
験法を提供する。 (1) 本発明の固相化モノクローナル抗体と体液とを反応
させ、該体液中の好塩基球を該固相化モノクローナル抗
体に結合させて捕捉し、該好塩基球を分離する工程、
(2) 工程(1) で分離した好塩基球をアレルゲンまたは抗
ＩｇＥ抗体と反応させて好塩基球からケミカルメディエ
ーターを遊離させる工程、および(3) 工程(2) で好塩基
球から遊離したケミカルメディエーターの量を測定する
工程、
よりなる好塩基球からのケミカルメディエーター遊離試
験法を提供する。 (1) 本発明の固相化モノクローナル抗体と体液とを反応
させ、該体液中の好塩基球を該固相化モノクローナル抗
体に結合させて捕捉し、該好塩基球を分離する工程、
(2) 工程(1) で分離した好塩基球をアレルゲンまたは抗
ＩｇＥ抗体と反応させて好塩基球からケミカルメディエ
ーターを遊離させる工程、および(3) 工程(2) で好塩基
球から遊離したケミカルメディエーターの量を測定する
工程、
【００３６】上記(1) および(2) はそれぞれ前記の本発
明の好塩基球の分離方法および好塩基球からのケミカル
メディエーターの遊離方法に従って行うと良い。
明の好塩基球の分離方法および好塩基球からのケミカル
メディエーターの遊離方法に従って行うと良い。
【００３７】上記(3) の遊離したケミカルメディエータ
ーの量の測定は、目的とするケミカルメディエーターに
応じて、適宜既知の方法により測定すればよい。例え
ば、ヒスタミンの場合はＨＰＬＣ法によるヒスタミン測
定システム [ Ｙ．ツルタ (Tsuruta)ら、ジャーナル・
オブ・クロマトグラフィー (J. Chromatogr.) 224, 105
(1981)]（島津製作所）により、ロイコトリエンおよび
ＰＡＦの場合は、ぞれぞれ〔Ｅ．ヘイズ（Hayes)ら、ジ
ャーナル・オブ・イムノロジー（J. Immunol. 131, 42
9 (1983)、及び〔Ｍ．Ａ．スマル(Smal)ら、ジャーナル
・オブ・イムノロジカル・メソッヅ（J. Immunol. Meth
ods) 128, 183 (1990)〕により測定することができる。
即ち、ＨＰＬＣによるヒスタミンの測定は、例えば次の
ようにして行う。陽イオン交換樹脂を充填したカラムに
試料を通じ、分離溶出したヒスタミンに０．１％オルソ
フタルアルデヒドとＮａＯＨを加えて４５℃で反応し、
ヒスタミンを蛍光体とする。つぎにＨ2 ＳＯ4 と反応さ
せ、蛍光体の安定化と蛍光強度の増強を行った後、蛍光
強度を測定する。
ーの量の測定は、目的とするケミカルメディエーターに
応じて、適宜既知の方法により測定すればよい。例え
ば、ヒスタミンの場合はＨＰＬＣ法によるヒスタミン測
定システム [ Ｙ．ツルタ (Tsuruta)ら、ジャーナル・
オブ・クロマトグラフィー (J. Chromatogr.) 224, 105
(1981)]（島津製作所）により、ロイコトリエンおよび
ＰＡＦの場合は、ぞれぞれ〔Ｅ．ヘイズ（Hayes)ら、ジ
ャーナル・オブ・イムノロジー（J. Immunol. 131, 42
9 (1983)、及び〔Ｍ．Ａ．スマル(Smal)ら、ジャーナル
・オブ・イムノロジカル・メソッヅ（J. Immunol. Meth
ods) 128, 183 (1990)〕により測定することができる。
即ち、ＨＰＬＣによるヒスタミンの測定は、例えば次の
ようにして行う。陽イオン交換樹脂を充填したカラムに
試料を通じ、分離溶出したヒスタミンに０．１％オルソ
フタルアルデヒドとＮａＯＨを加えて４５℃で反応し、
ヒスタミンを蛍光体とする。つぎにＨ2 ＳＯ4 と反応さ
せ、蛍光体の安定化と蛍光強度の増強を行った後、蛍光
強度を測定する。
【００３８】また、ＲＩＡによるロイコトリエンの測定
は、試料または標準の非標識ロイコトリエン、抗ロイコ
トリエン抗体、3 Ｈ標識ロイコトリエンを４℃、5 〜24
時間反応させた後、デキストランコーテッドチャーコー
ルと氷中１０分間反応させる。遠心後、上清を分取し、
放射活性を測定する。また、ＲＩＡによるＰＡＦの測定
は、試料または標準の非標識ＰＡＦ、抗ＰＡＦ抗体、
125 Ｉ標識ＰＡＦと二次抗体を室温で５〜２４時間反応
させた後、遠心分離で得られた沈さの放射活性を測定す
る。また、ヒスタミンの測定法についても、ＲＩＡによ
って測定することができる。ＲＩＡで測定する場合、例
えば試料または標準の非標識ヒスタミン、抗ヒスタミン
抗体、125 Ｉ−標識ヒスタミンを０〜４０℃、好ましく
は０〜１０℃で５分〜４８時間、好ましくは３０分〜２
４時間反応させる。その後Ｂ／Ｆ分離剤、例えばポリエ
チレングリコールを加えて氷中１０分間反応を行い、遠
心で得られた沈さの放射活性を測定する。
は、試料または標準の非標識ロイコトリエン、抗ロイコ
トリエン抗体、3 Ｈ標識ロイコトリエンを４℃、5 〜24
時間反応させた後、デキストランコーテッドチャーコー
ルと氷中１０分間反応させる。遠心後、上清を分取し、
放射活性を測定する。また、ＲＩＡによるＰＡＦの測定
は、試料または標準の非標識ＰＡＦ、抗ＰＡＦ抗体、
125 Ｉ標識ＰＡＦと二次抗体を室温で５〜２４時間反応
させた後、遠心分離で得られた沈さの放射活性を測定す
る。また、ヒスタミンの測定法についても、ＲＩＡによ
って測定することができる。ＲＩＡで測定する場合、例
えば試料または標準の非標識ヒスタミン、抗ヒスタミン
抗体、125 Ｉ−標識ヒスタミンを０〜４０℃、好ましく
は０〜１０℃で５分〜４８時間、好ましくは３０分〜２
４時間反応させる。その後Ｂ／Ｆ分離剤、例えばポリエ
チレングリコールを加えて氷中１０分間反応を行い、遠
心で得られた沈さの放射活性を測定する。
【００３９】さらに、ヒスタミンの測定法としてＥＩＡ
によって行うこともできる。即ち、サンドイッチ法、競
合法、ＥＬＩＳＡなど公知の酵素免疫測定法は全て用い
ることができるが、好ましくは例えば、クノックスバン
バイク（Knox Van Dyke)らによって報告される方法（Lu
minescence Immunology and Molecular Application,CR
C Press pp2〜10, 1990) に従って測定する。すなわ
ち、試料、ビオチン標識した標準ヒスタミン、酵素標識
抗ヒスタミン抗体の混合物を、アビジンを固相化した担
体と反応させる。洗浄後、アビジン固相化担体に結合し
た、ビオチン標識ヒスタミン−酵素標識抗ヒスタミン抗
体複合体の酵素活性を測定する。担体および酵素は、酵
素免疫測定法で通常用いられるものは全て用いることが
できる。好ましくは担体としてはマイクロプレート、酵
素としては西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用
いる。
によって行うこともできる。即ち、サンドイッチ法、競
合法、ＥＬＩＳＡなど公知の酵素免疫測定法は全て用い
ることができるが、好ましくは例えば、クノックスバン
バイク（Knox Van Dyke)らによって報告される方法（Lu
minescence Immunology and Molecular Application,CR
C Press pp2〜10, 1990) に従って測定する。すなわ
ち、試料、ビオチン標識した標準ヒスタミン、酵素標識
抗ヒスタミン抗体の混合物を、アビジンを固相化した担
体と反応させる。洗浄後、アビジン固相化担体に結合し
た、ビオチン標識ヒスタミン−酵素標識抗ヒスタミン抗
体複合体の酵素活性を測定する。担体および酵素は、酵
素免疫測定法で通常用いられるものは全て用いることが
できる。好ましくは担体としてはマイクロプレート、酵
素としては西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用
いる。
【００４０】本発明の試験法においては、分離した好塩
基球からの非特異的なケミカルメディエーター遊離の影
響を除去するため、前述の方法に従って総ケミカルメデ
ィエーター量（総ヒスタミン量の測定方法に準じる）、
および非特異的なケミカルメディエーター遊離の量も同
時に測定し下記式：
基球からの非特異的なケミカルメディエーター遊離の影
響を除去するため、前述の方法に従って総ケミカルメデ
ィエーター量（総ヒスタミン量の測定方法に準じる）、
および非特異的なケミカルメディエーター遊離の量も同
時に測定し下記式：
【００４１】
【数１】
【００４２】によりＩｇＥを介した特異的なケミカルメ
ディエーター遊離率を算出することが好ましい。
ディエーター遊離率を算出することが好ましい。
【００４３】
【実施例】以下、実施例および実験例により本発明をさ
らに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によ
りなんら限定されるものではない。 １．好塩基球に反応するモノクローナル抗体の作製 (1) 免疫 ８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス２匹に、それぞれ１×１
０6 個のヒト好塩基球を腹腔内投与し、以降３週間毎に
３回、それぞれ１×１０6 個のヒト好塩基球を腹腔内投
与した。
らに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によ
りなんら限定されるものではない。 １．好塩基球に反応するモノクローナル抗体の作製 (1) 免疫 ８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス２匹に、それぞれ１×１
０6 個のヒト好塩基球を腹腔内投与し、以降３週間毎に
３回、それぞれ１×１０6 個のヒト好塩基球を腹腔内投
与した。
【００４４】(2) 細胞融合 最終免疫の３日後に、２匹のマウスから脾臓を摘出し、
ＲＰＭＩ培地を用いて細胞浮遊液を調製した。この２×
１０8 個の脾細胞と６×１０7 個の骨髄腫細胞ＮＳ−１
とを混合し、遠沈後、沈殿に５０％ポリエチレングリコ
ール（平均分子量４０００）１ｍｌを緩やかに撹拌しな
がら加え、更に１分間撹拌した。ＲＰＭＩ培地１ｍｌを
１分間を要して加え、同じく１ｍｌを追加した後、更
に、７ｍｌを３分間を要して加えた。遠沈後、沈殿を１
５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地（完全ＲＰＭＩ培
地）４０ｍｌに浮遊させ、９６穴マイクロ培養プレート
４枚の各ウエルに、０. １ｍｌずつ接種し、７％炭酸ガ
スの存在下、３７℃で培養した。２４時間後、ヒポキサ
ンチン１００μＭ、アミノプテリン０. ４μＭ、チミジ
ン１６μＭを含む完全ＲＰＭＩ培地（ＨＡＴ培地）０.
１ｍｌを加えた。培養開始後、２、３、５及び８日後
に、培養上清０. １ｍｌを捨て、ＨＡＴ培地０. １ｍｌ
を加えた。１１及び１４日目に、培養上清０. １ｍｌを
捨て、ヒポキサンチン１００μＭ、チミジン１６μＭを
含む完全ＲＰＭＩ培地（ＨＴ培地）０. １ｍｌを加え
た。計３８４の全てのウエルからハイブリドーマのコロ
ニーが出現した。
ＲＰＭＩ培地を用いて細胞浮遊液を調製した。この２×
１０8 個の脾細胞と６×１０7 個の骨髄腫細胞ＮＳ−１
とを混合し、遠沈後、沈殿に５０％ポリエチレングリコ
ール（平均分子量４０００）１ｍｌを緩やかに撹拌しな
がら加え、更に１分間撹拌した。ＲＰＭＩ培地１ｍｌを
１分間を要して加え、同じく１ｍｌを追加した後、更
に、７ｍｌを３分間を要して加えた。遠沈後、沈殿を１
５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地（完全ＲＰＭＩ培
地）４０ｍｌに浮遊させ、９６穴マイクロ培養プレート
４枚の各ウエルに、０. １ｍｌずつ接種し、７％炭酸ガ
スの存在下、３７℃で培養した。２４時間後、ヒポキサ
ンチン１００μＭ、アミノプテリン０. ４μＭ、チミジ
ン１６μＭを含む完全ＲＰＭＩ培地（ＨＡＴ培地）０.
１ｍｌを加えた。培養開始後、２、３、５及び８日後
に、培養上清０. １ｍｌを捨て、ＨＡＴ培地０. １ｍｌ
を加えた。１１及び１４日目に、培養上清０. １ｍｌを
捨て、ヒポキサンチン１００μＭ、チミジン１６μＭを
含む完全ＲＰＭＩ培地（ＨＴ培地）０. １ｍｌを加え
た。計３８４の全てのウエルからハイブリドーマのコロ
ニーが出現した。
【００４５】(3) ハイブリドーマの選択 培養ウエル中のハイブリドーマを完全ＲＰＭＩ培地で培
養し、その培養上清中の特異抗体産生の有無を次のよう
にして検出した。
養し、その培養上清中の特異抗体産生の有無を次のよう
にして検出した。
【００４６】ヒト末梢血２０ｍｌに、５％デキストラン
生理食塩溶液を５ｍｌ加えて、赤血球を沈澱させた後、
上清の白血球を分離した。この白血球から、比重１. ０
７及び１. ０８に調製したパーコールを用いて、不連続
比重遠心法により、比重１.０７〜１. ０８からなる細
胞を分離した。分離細胞を、アルシアンブルー法 [Ｓ.
Ｇ. ハリエット (Harriet) ら、ブラッド (Blood) 46,
279 (1975)] により染色して好塩基球数を算定し、好
塩基球として４×１０5 個／ｍｌとなるように、０. ８
％塩化ナトリウム、０. ０３７％塩化カリウム、及び
０. ０３％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む１０ｍ
Ｍヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスル
ホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７. ４）（ＨＡ−Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液）で調製した。試験管に、好塩基球数と
して２×１０4 個となるように分離細胞を分注した。こ
れにハイブリドーマの培養上清を５０μｌ加え、３７℃
で１時間反応させた。ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で１回洗
浄の後、フルオレッセンイソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体、及びフィコエリスリン
標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体の混合液５０μｌ
を加えて、室温で１時間反応させた。ＨＡ−ＨＥＰＥＳ
緩衝液で１回洗浄の後、蛍光顕微鏡による観察を行い、
ＦＩＴＣ標識された細胞が、フィコエリスリンによって
も標識されているかどうかを判定した。このようにし
て、ＦＩＴＣ標識された好塩基球に対して、ハイブリド
ーマの培養上清に含まれるモノクローナル抗体が反応す
るものを、１００ウエル選択した。
生理食塩溶液を５ｍｌ加えて、赤血球を沈澱させた後、
上清の白血球を分離した。この白血球から、比重１. ０
７及び１. ０８に調製したパーコールを用いて、不連続
比重遠心法により、比重１.０７〜１. ０８からなる細
胞を分離した。分離細胞を、アルシアンブルー法 [Ｓ.
Ｇ. ハリエット (Harriet) ら、ブラッド (Blood) 46,
279 (1975)] により染色して好塩基球数を算定し、好
塩基球として４×１０5 個／ｍｌとなるように、０. ８
％塩化ナトリウム、０. ０３７％塩化カリウム、及び
０. ０３％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む１０ｍ
Ｍヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスル
ホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７. ４）（ＨＡ−Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液）で調製した。試験管に、好塩基球数と
して２×１０4 個となるように分離細胞を分注した。こ
れにハイブリドーマの培養上清を５０μｌ加え、３７℃
で１時間反応させた。ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で１回洗
浄の後、フルオレッセンイソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体、及びフィコエリスリン
標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体の混合液５０μｌ
を加えて、室温で１時間反応させた。ＨＡ−ＨＥＰＥＳ
緩衝液で１回洗浄の後、蛍光顕微鏡による観察を行い、
ＦＩＴＣ標識された細胞が、フィコエリスリンによって
も標識されているかどうかを判定した。このようにし
て、ＦＩＴＣ標識された好塩基球に対して、ハイブリド
ーマの培養上清に含まれるモノクローナル抗体が反応す
るものを、１００ウエル選択した。
【００４７】上記の如く選択したハイブリドーマを限界
希釈法によりクローニングした後、フラスコ培養により
それぞれ増殖限界まで培養を行った。この培養上清１ｍ
ｌを、ヒツジ抗マウス免疫グロブリン抗体が予め結合し
てあるマグネチックビーズ１５ｍｇに加えて、緩やかな
撹拌を行いながら４℃で１６時間反応させて、モノクロ
ーナル抗体固相化マグネチックビーズを得た。これらの
モノクローナル抗体固相化マグネチックビーズを用い
て、下記実施例４に記載の方法に従い、ヒト末梢血から
の好塩基球捕捉能、及び分離された好塩基球のＩｇＥ特
異的なヒスタミン遊離と、非特異的なヒスタミン遊離に
関する性質を調べた。その結果、前記の特性を有し、後
記実験例から明らかなように、本発明のヒト好塩基球を
含む細胞集団の分離と、分離細胞のヒスタミン遊離試験
方法に適したモノクローナル抗体ＢＡ１０１、ＢＡ２
０、ＢＡ１３５及びＢＡ３１２を産生するハイブリドー
マＢＡ１０１シオノギ（FERM BP-4004）、ＢＡ２０シオ
ノギ（FERM BP-4005）、ＢＡ１３５シオノギ（FERM BP-
4006）及びＢＡ３１２シオノギ（FERM BP-4007）を選択
した。
希釈法によりクローニングした後、フラスコ培養により
それぞれ増殖限界まで培養を行った。この培養上清１ｍ
ｌを、ヒツジ抗マウス免疫グロブリン抗体が予め結合し
てあるマグネチックビーズ１５ｍｇに加えて、緩やかな
撹拌を行いながら４℃で１６時間反応させて、モノクロ
ーナル抗体固相化マグネチックビーズを得た。これらの
モノクローナル抗体固相化マグネチックビーズを用い
て、下記実施例４に記載の方法に従い、ヒト末梢血から
の好塩基球捕捉能、及び分離された好塩基球のＩｇＥ特
異的なヒスタミン遊離と、非特異的なヒスタミン遊離に
関する性質を調べた。その結果、前記の特性を有し、後
記実験例から明らかなように、本発明のヒト好塩基球を
含む細胞集団の分離と、分離細胞のヒスタミン遊離試験
方法に適したモノクローナル抗体ＢＡ１０１、ＢＡ２
０、ＢＡ１３５及びＢＡ３１２を産生するハイブリドー
マＢＡ１０１シオノギ（FERM BP-4004）、ＢＡ２０シオ
ノギ（FERM BP-4005）、ＢＡ１３５シオノギ（FERM BP-
4006）及びＢＡ３１２シオノギ（FERM BP-4007）を選択
した。
【００４８】また、上記４種のモノクローナル抗体の属
するマウス免疫グロブリンのクラスを調べた結果、ＢＡ
２０、ＢＡ１０１、及びＢＡ１３５はＩｇＧ１に属し、
ＢＡ３１２はＩｇＭに属することが判明した。
するマウス免疫グロブリンのクラスを調べた結果、ＢＡ
２０、ＢＡ１０１、及びＢＡ１３５はＩｇＧ１に属し、
ＢＡ３１２はＩｇＭに属することが判明した。
【００４９】(4) モノクローナル抗体の作製 （ａ） in vitro 培養法 ハイブリドーマを完全ＲＰＭＩ培地で増殖限界（１×１
０6 個／ｍｌ）になるまで培養し、その培養上清を回収
した。
０6 個／ｍｌ）になるまで培養し、その培養上清を回収
した。
【００５０】（ｂ） in vivo 培養法 予めプリステン０. ５ｍｌで腹腔内投与処理したＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスに、５×１０6 個のハイブリドーマを腹腔
内に移植した。約３週間後、マウスの腹部肥大を確かめ
て、その腹水を採取した。
Ｂ／ｃマウスに、５×１０6 個のハイブリドーマを腹腔
内に移植した。約３週間後、マウスの腹部肥大を確かめ
て、その腹水を採取した。
【００５１】(5) モノクローナル抗体の精製 （ａ） プロテインＡアフィニティークロマトグラフィ
ー法 前工程で得られた腹水を１８％硫酸ナトリウム溶液で塩
析し、生じた沈澱を０. ０１Ｍホウ酸緩衝食塩液（ｐＨ
８. ０）に溶解後、同液にて透析した。塩析により得ら
れたモノクローナル抗体２０ｍｇを０. ０１Ｍホウ酸緩
衝食塩液（ｐＨ８. ０）２ｍｌに溶かし、プロテインＡ
−セファロース［ファルマシア社（Pharmacia AB) ］の
カラム（１. ６×５ｃｍ）に吸着させた。まず、０. ０
１Ｍホウ酸緩衝食塩液（ｐＨ８. ０）約５０ｍｌで不純
物を流出し、次いで０. ０１Ｍクエン酸緩衝食塩液（ｐ
Ｈ４. ０）約１００ｍｌで溶出して、精製モノクローナ
ル抗体ＢＡ２０、ＢＡ１０１及びＢＡ１３５を得た。
ー法 前工程で得られた腹水を１８％硫酸ナトリウム溶液で塩
析し、生じた沈澱を０. ０１Ｍホウ酸緩衝食塩液（ｐＨ
８. ０）に溶解後、同液にて透析した。塩析により得ら
れたモノクローナル抗体２０ｍｇを０. ０１Ｍホウ酸緩
衝食塩液（ｐＨ８. ０）２ｍｌに溶かし、プロテインＡ
−セファロース［ファルマシア社（Pharmacia AB) ］の
カラム（１. ６×５ｃｍ）に吸着させた。まず、０. ０
１Ｍホウ酸緩衝食塩液（ｐＨ８. ０）約５０ｍｌで不純
物を流出し、次いで０. ０１Ｍクエン酸緩衝食塩液（ｐ
Ｈ４. ０）約１００ｍｌで溶出して、精製モノクローナ
ル抗体ＢＡ２０、ＢＡ１０１及びＢＡ１３５を得た。
【００５２】（ｂ） セファロースＣＬ−４Ｂゲルクロ
マトグラフィー法 前記塩析により得られたモノクローナル抗体２０ｍｇを
０. ０１Ｍホウ酸緩衝食塩液２ｍｌに溶かし、セファロ
ースＣＬ−４Ｂ［ファルマシア社（PharmaciaAB) ］の
カラム（１. ６×７０ｃｍ）に通して分画し、メインピ
ークを分取して、精製モノクローナル抗体ＢＡ３１２を
得た。
マトグラフィー法 前記塩析により得られたモノクローナル抗体２０ｍｇを
０. ０１Ｍホウ酸緩衝食塩液２ｍｌに溶かし、セファロ
ースＣＬ−４Ｂ［ファルマシア社（PharmaciaAB) ］の
カラム（１. ６×７０ｃｍ）に通して分画し、メインピ
ークを分取して、精製モノクローナル抗体ＢＡ３１２を
得た。
【００５３】２．モノクローナル抗体の２次抗体結合ビ
ーズへの固相化 ダイナビーズ Ｍ−４５０ ヒツジ抗マウス免疫グロブ
リン［ダイナル社 (Dynal)］の３０ｍｇ・beads ／ｍｌ
懸濁液を、撹拌後１ｍｌ試験管に分取した。磁石でビー
ズを集め上清を除いた後、ハイブリドーマ培養上清１ｍ
ｌを加え、緩やかな撹拌を行いながら４℃で１６時間反
応を行った。磁石でビーズを集め上清を除いた後、ＨＡ
−ＨＥＰＥＳ緩衝液で４回、４℃で３０分間ずつ緩やか
な撹拌を行いながら洗浄して、モノクローナル抗体固相
化マグネチックビーズを得た。また、ハイブリドーマ培
養上清の代わりに、ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で調製した
精製モノクローナル抗体（２０μｇ／ｍｌ）１ｍｌを加
えて、上記と同様の方法でモノクローナル抗体固相化マ
グネチックビーズを得た。
ーズへの固相化 ダイナビーズ Ｍ−４５０ ヒツジ抗マウス免疫グロブ
リン［ダイナル社 (Dynal)］の３０ｍｇ・beads ／ｍｌ
懸濁液を、撹拌後１ｍｌ試験管に分取した。磁石でビー
ズを集め上清を除いた後、ハイブリドーマ培養上清１ｍ
ｌを加え、緩やかな撹拌を行いながら４℃で１６時間反
応を行った。磁石でビーズを集め上清を除いた後、ＨＡ
−ＨＥＰＥＳ緩衝液で４回、４℃で３０分間ずつ緩やか
な撹拌を行いながら洗浄して、モノクローナル抗体固相
化マグネチックビーズを得た。また、ハイブリドーマ培
養上清の代わりに、ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で調製した
精製モノクローナル抗体（２０μｇ／ｍｌ）１ｍｌを加
えて、上記と同様の方法でモノクローナル抗体固相化マ
グネチックビーズを得た。
【００５４】３．モノクローナル抗体のアンコーテッド
ビーズへの固相化 ダイナビーズ Ｍ−４５０ アンコーテッド［（ダイナ
ル社 (Dynal)］の３０ｍｇ・beads ／ｍｌ懸濁液を、撹
拌後１ｍｌ試験管に分取した。磁石でビーズを集め、上
清を除いた後、ＢＡ３１２の０. ０５Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ９.５）溶液（０. ３ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを
加え、良く撹拌した。緩やかな撹拌を行いながら、４℃
で１６時間反応を行った。磁石でビーズを集め、上清を
除いた後、０. ５％ＨＳＡを含む０. ０１Ｍ ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７. ４）で５分間ずつ４回洗浄を行い、
更にＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で４℃で１６時間洗浄を行
い、ＢＡ３１２固相化マグネチックビーズを得た。
ビーズへの固相化 ダイナビーズ Ｍ−４５０ アンコーテッド［（ダイナ
ル社 (Dynal)］の３０ｍｇ・beads ／ｍｌ懸濁液を、撹
拌後１ｍｌ試験管に分取した。磁石でビーズを集め、上
清を除いた後、ＢＡ３１２の０. ０５Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ９.５）溶液（０. ３ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを
加え、良く撹拌した。緩やかな撹拌を行いながら、４℃
で１６時間反応を行った。磁石でビーズを集め、上清を
除いた後、０. ５％ＨＳＡを含む０. ０１Ｍ ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７. ４）で５分間ずつ４回洗浄を行い、
更にＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で４℃で１６時間洗浄を行
い、ＢＡ３１２固相化マグネチックビーズを得た。
【００５５】４．モノクローナル抗体固相化マグネチッ
クビーズによる細胞分離と、ヒスタミン遊離反応 ＥＤＴＡ採血管に採血した健常人血液１０ｍｌに、ＨＡ
−ＨＥＰＥＳ緩衝液４０ｍｌを加えて２０％血液を調製
した。ハイブリドーマＢＡ２０シオノギ、ＢＡ１０１シ
オノギ、ＢＡ１３５シオノギ及びＢＡ３１２シオノギの
培養上清をそれぞれ固相化したマグネチックビーズを、
ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で３ｍｇ・beads ／ｍｌとなる
ように調製した。２０％血液を試験管に５００μｌずつ
分注し、ここに上記ＢＡ２０、ＢＡ１０１、ＢＡ１３５
及びＢＡ３１２固相化マグネチックビーズ５０μｌを加
え、室温で緩やかな振盪条件下、５分間反応を行った。
磁石でビーズを集め上清を除いた後、ＨＡ−ＨＥＰＥＳ
緩衝液５００μｌで１回洗浄を行った。洗浄終了後、
０. ５ｍＭ塩化カルシウム、０. ２５ｍＭ塩化マグネシ
ウム、０. １％グルコース、０. ９％塩化ナトリウム、
０. ０３５％重炭酸ナトリウム、及び０. １％ＨＳＡを
含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７. ０）（ヒス
タミン遊離用緩衝液）、若しくはヒスタミン遊離用緩衝
液で４μｇ／ｍｌとなるように調製されたモノクローナ
ル抗ヒトＩｇＥ抗体（ＨＥ−６９Ｂ）５００μｌを加え
て撹拌を行った。分離細胞の総ヒスタミン量は、ヒスタ
ミン遊離用緩衝液を加えた検体で凍結融解を３回繰り返
して行ったものを検体とした。ＩｇＥ特異的なヒスタミ
ン遊離反応は、モノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体を加え
た検体を、３７℃で１時間反応させて行った。また、非
特異的なヒスタミン遊離反応は、ヒスタミン遊離用緩衝
液を加えた検体を３７℃で１時間反応させて行った。反
応終了後撹拌して、１５００ｒｐｍ×５分間遠沈した
後、上清３００μｌを分取した。遊離ヒスタミン量の測
定は、ＨＰＬＣ法によるヒスタミン測定システム [Ｙ.
ツルタ (Tsuruta) ら、ジャーナル・オブ・クロマトグ
ラフィー (J. Chromatogr.) 224, 105 (1981)]（島津製
作所）により行った。
クビーズによる細胞分離と、ヒスタミン遊離反応 ＥＤＴＡ採血管に採血した健常人血液１０ｍｌに、ＨＡ
−ＨＥＰＥＳ緩衝液４０ｍｌを加えて２０％血液を調製
した。ハイブリドーマＢＡ２０シオノギ、ＢＡ１０１シ
オノギ、ＢＡ１３５シオノギ及びＢＡ３１２シオノギの
培養上清をそれぞれ固相化したマグネチックビーズを、
ＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で３ｍｇ・beads ／ｍｌとなる
ように調製した。２０％血液を試験管に５００μｌずつ
分注し、ここに上記ＢＡ２０、ＢＡ１０１、ＢＡ１３５
及びＢＡ３１２固相化マグネチックビーズ５０μｌを加
え、室温で緩やかな振盪条件下、５分間反応を行った。
磁石でビーズを集め上清を除いた後、ＨＡ−ＨＥＰＥＳ
緩衝液５００μｌで１回洗浄を行った。洗浄終了後、
０. ５ｍＭ塩化カルシウム、０. ２５ｍＭ塩化マグネシ
ウム、０. １％グルコース、０. ９％塩化ナトリウム、
０. ０３５％重炭酸ナトリウム、及び０. １％ＨＳＡを
含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７. ０）（ヒス
タミン遊離用緩衝液）、若しくはヒスタミン遊離用緩衝
液で４μｇ／ｍｌとなるように調製されたモノクローナ
ル抗ヒトＩｇＥ抗体（ＨＥ−６９Ｂ）５００μｌを加え
て撹拌を行った。分離細胞の総ヒスタミン量は、ヒスタ
ミン遊離用緩衝液を加えた検体で凍結融解を３回繰り返
して行ったものを検体とした。ＩｇＥ特異的なヒスタミ
ン遊離反応は、モノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体を加え
た検体を、３７℃で１時間反応させて行った。また、非
特異的なヒスタミン遊離反応は、ヒスタミン遊離用緩衝
液を加えた検体を３７℃で１時間反応させて行った。反
応終了後撹拌して、１５００ｒｐｍ×５分間遠沈した
後、上清３００μｌを分取した。遊離ヒスタミン量の測
定は、ＨＰＬＣ法によるヒスタミン測定システム [Ｙ.
ツルタ (Tsuruta) ら、ジャーナル・オブ・クロマトグ
ラフィー (J. Chromatogr.) 224, 105 (1981)]（島津製
作所）により行った。
【００５６】表１に示すように、ＢＡ２０、ＢＡ１０
１、ＢＡ１３５及びＢＡ３１２固相化マグネチックビー
ズで分離した細胞の総ヒスタミン量を測定したところ、
すべての抗体においてヒスタミンが検出され、好塩基球
の分離能を有していることが分かった。また、図１に示
すように分離細胞のＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離率は
良好であり、なおかつ非特異的なヒスタミン遊離は、特
異的なヒスタミン遊離に比較して、３０％以下に抑えら
れていた。
１、ＢＡ１３５及びＢＡ３１２固相化マグネチックビー
ズで分離した細胞の総ヒスタミン量を測定したところ、
すべての抗体においてヒスタミンが検出され、好塩基球
の分離能を有していることが分かった。また、図１に示
すように分離細胞のＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離率は
良好であり、なおかつ非特異的なヒスタミン遊離は、特
異的なヒスタミン遊離に比較して、３０％以下に抑えら
れていた。
【００５７】
【表１】
【００５８】実験例 １．ＣＤ抗体と、本発明モノクローナル抗体との比較 (1) 好塩基球捕捉能 Ｐ．バレントらの報告 [Ｐ. バレント (Valent) ら、イ
ンターナショナル・アーカイブス・アレルギー・アプラ
イド・イムノロジー (Int. Arch. Allergy Appl. Immun
ol.) 91, 198 (1990)]に基づいて、好塩基球表面に良く
発現する抗原に反応するＣＤ抗体、即ちＣＤ９抗体（Ｔ
Ｐ８２、ニチレイ社）、ＣＤ１１ｂ抗体（ＢＥＡＲ１、
イムノテック社）、ＣＤ１３抗体（ＭＣＳ２、ニチレイ
社）、及びＣＤ３２抗体（２Ｅ１、イムノテック社）の
各抗体を用いて、上記実施例の２に示した方法により、
抗体固相化マグネチックビーズの調製を行った。上記Ｃ
Ｄ抗体、及びＢＡ２０、ＢＡ３１２固相化マグネチック
ビーズを用いて実施例の４と同様の方法により特定の細
胞集団の分離を行い、分離細胞由来の総ヒスタミン量を
測定した。
ンターナショナル・アーカイブス・アレルギー・アプラ
イド・イムノロジー (Int. Arch. Allergy Appl. Immun
ol.) 91, 198 (1990)]に基づいて、好塩基球表面に良く
発現する抗原に反応するＣＤ抗体、即ちＣＤ９抗体（Ｔ
Ｐ８２、ニチレイ社）、ＣＤ１１ｂ抗体（ＢＥＡＲ１、
イムノテック社）、ＣＤ１３抗体（ＭＣＳ２、ニチレイ
社）、及びＣＤ３２抗体（２Ｅ１、イムノテック社）の
各抗体を用いて、上記実施例の２に示した方法により、
抗体固相化マグネチックビーズの調製を行った。上記Ｃ
Ｄ抗体、及びＢＡ２０、ＢＡ３１２固相化マグネチック
ビーズを用いて実施例の４と同様の方法により特定の細
胞集団の分離を行い、分離細胞由来の総ヒスタミン量を
測定した。
【００５９】表２に示すように、ＣＤ９抗体、ＣＤ１１
ｂ抗体、及びＢＡ２０、ＢＡ３１２では良好な好塩基球
捕捉を認めたが、ＣＤ１３抗体、及びＣＤ３２抗体で
は、好塩基球の分離が認められなかった。
ｂ抗体、及びＢＡ２０、ＢＡ３１２では良好な好塩基球
捕捉を認めたが、ＣＤ１３抗体、及びＣＤ３２抗体で
は、好塩基球の分離が認められなかった。
【００６０】
【表２】
【００６１】(2) 分離細胞のヒスタミン遊離能 上記実験例の１．(1) で検討したＣＤ抗体の内、好塩基
球捕捉能の認められたＣＤ９抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、及
びＢＡ２０、ＢＡ３１２の各抗体固相化マグネチックビ
ーズによる分離細胞のヒスタミン遊離能、即ち、総ヒス
タミン量、ＩｇＥ特異的遊離ヒスタミン量、及び非特異
的遊離ヒスタミン量の３項目を、２０例の健常人血液を
用いて、上記実施例の４と同様の方法で測定した。
球捕捉能の認められたＣＤ９抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、及
びＢＡ２０、ＢＡ３１２の各抗体固相化マグネチックビ
ーズによる分離細胞のヒスタミン遊離能、即ち、総ヒス
タミン量、ＩｇＥ特異的遊離ヒスタミン量、及び非特異
的遊離ヒスタミン量の３項目を、２０例の健常人血液を
用いて、上記実施例の４と同様の方法で測定した。
【００６２】その結果、全ての抗体で好塩基球の分離を
確認するとともに血液検体毎の差はあるものの、全ての
抗体でＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離を認めた。
確認するとともに血液検体毎の差はあるものの、全ての
抗体でＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離を認めた。
【００６３】本発明においては、マグネッチックビーズ
に固相化した抗体により捕捉・分離された好塩基球のＩ
ｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離の量に対する非特
異的なヒスタミン遊離の量の比率が３０％以下であれば
該抗体はケミカルメディエーター遊離試験法に有用であ
ると考えられ、１０％以下では特に有用と考えられる。
ＣＤ９抗体及びＣＤ１１ｂ抗体では、ＩｇＥ特異的なヒ
スタミン遊離と比較して、著しく高い非特異的ヒスタミ
ン遊離を示す検体が頻発しているため、表３に示すよう
に、上記比率も３０％を大きく上回っておりこれらの分
離細胞からＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離に関する解析
を行うことは極めて困難であった。これに対して、本発
明のモノクローナル抗体であるＢＡ３１２はこの比率が
７. ５％と極めて優れたものであった。
に固相化した抗体により捕捉・分離された好塩基球のＩ
ｇＥを介した特異的なヒスタミン遊離の量に対する非特
異的なヒスタミン遊離の量の比率が３０％以下であれば
該抗体はケミカルメディエーター遊離試験法に有用であ
ると考えられ、１０％以下では特に有用と考えられる。
ＣＤ９抗体及びＣＤ１１ｂ抗体では、ＩｇＥ特異的なヒ
スタミン遊離と比較して、著しく高い非特異的ヒスタミ
ン遊離を示す検体が頻発しているため、表３に示すよう
に、上記比率も３０％を大きく上回っておりこれらの分
離細胞からＩｇＥ特異的なヒスタミン遊離に関する解析
を行うことは極めて困難であった。これに対して、本発
明のモノクローナル抗体であるＢＡ３１２はこの比率が
７. ５％と極めて優れたものであった。
【００６４】
【表３】
【００６５】以上より、好塩基球捕捉率が高く、ＩｇＥ
特異的なヒスタミン遊離も良好で、なおかつ非特異的な
ヒスタミン遊離が最も抑えられているのはＢＡ２０、及
びＢＡ３１２固相化マグネチックビーズによる分離細胞
であった。とりわけＢＡ３１２固相化マグネチックビー
ズによる分離細胞は、本発明のヒト血液からの好塩基球
の分離、及び該分離細胞のヒスタミン遊離試験を行うの
に最も適していた。
特異的なヒスタミン遊離も良好で、なおかつ非特異的な
ヒスタミン遊離が最も抑えられているのはＢＡ２０、及
びＢＡ３１２固相化マグネチックビーズによる分離細胞
であった。とりわけＢＡ３１２固相化マグネチックビー
ズによる分離細胞は、本発明のヒト血液からの好塩基球
の分離、及び該分離細胞のヒスタミン遊離試験を行うの
に最も適していた。
【００６６】２．全血と、分離細胞によるヒスタミン遊
離試験 健常人ボランティア血液１例を用いて、全血と分離細胞
によるヒスタミン遊離試験の比較検討を行った。全血に
よる方法では、まずヘパリン採血管に血液１０ｍｌを採
血した。この血液１００μｌずつを試験管に分注し、こ
れにヒスタミン遊離用緩衝液、若しくはヒスタミン遊離
用緩衝液で５００００、５０００、５００、５０及び５
ｎｇ／ｍｌとなるように調製したモノクローナル抗ヒト
ＩｇＥ抗体（ＨＥ−６９Ｂ）を、それぞれ４００μｌず
つ加えて攪拌を行った（モノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗
体は、終濃度４００００、４０００、４００、４０及び
４ｎｇ／ｍｌとなる）。総ヒスタミン量は、ヒスタミン
遊離用緩衝液を加えた検体で凍結融解を３回繰り返して
行ったものを検体とした。ＩｇＥ特異的なヒスタミン遊
離反応は、モノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体を加えた検
体を、３７℃で１時間反応させて行った。また、非特異
的なヒスタミン遊離反応は、ヒスタミン遊離用緩衝液を
加えた検体を３７℃で１時間反応させて行った。反応終
了後攪拌して、１５００ｒｐｍ×５分間遠沈した後、上
清３００μｌを分取した。遊離ヒスタミン量の測定は、
ＨＰＬＣ法によるヒスタミン測定システム（島津製作
所）により行った。
離試験 健常人ボランティア血液１例を用いて、全血と分離細胞
によるヒスタミン遊離試験の比較検討を行った。全血に
よる方法では、まずヘパリン採血管に血液１０ｍｌを採
血した。この血液１００μｌずつを試験管に分注し、こ
れにヒスタミン遊離用緩衝液、若しくはヒスタミン遊離
用緩衝液で５００００、５０００、５００、５０及び５
ｎｇ／ｍｌとなるように調製したモノクローナル抗ヒト
ＩｇＥ抗体（ＨＥ−６９Ｂ）を、それぞれ４００μｌず
つ加えて攪拌を行った（モノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗
体は、終濃度４００００、４０００、４００、４０及び
４ｎｇ／ｍｌとなる）。総ヒスタミン量は、ヒスタミン
遊離用緩衝液を加えた検体で凍結融解を３回繰り返して
行ったものを検体とした。ＩｇＥ特異的なヒスタミン遊
離反応は、モノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体を加えた検
体を、３７℃で１時間反応させて行った。また、非特異
的なヒスタミン遊離反応は、ヒスタミン遊離用緩衝液を
加えた検体を３７℃で１時間反応させて行った。反応終
了後攪拌して、１５００ｒｐｍ×５分間遠沈した後、上
清３００μｌを分取した。遊離ヒスタミン量の測定は、
ＨＰＬＣ法によるヒスタミン測定システム（島津製作
所）により行った。
【００６７】分離細胞による方法では、上記実施例の４
の方法と同様の方法で細胞分離と、分離細胞のヒスタミ
ン遊離試験を行った。モノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体
（ＨＥ−６９Ｂ）は、ヒスタミン遊離用緩衝液で４００
００、４０００、４００、４０及び４ｎｇ／ｍｌとなる
よう調製し、これによるヒスタミン遊離率を求めた。特
異的ヒスタミン遊離率は、次式にて算出される。
の方法と同様の方法で細胞分離と、分離細胞のヒスタミ
ン遊離試験を行った。モノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体
（ＨＥ−６９Ｂ）は、ヒスタミン遊離用緩衝液で４００
００、４０００、４００、４０及び４ｎｇ／ｍｌとなる
よう調製し、これによるヒスタミン遊離率を求めた。特
異的ヒスタミン遊離率は、次式にて算出される。
【００６８】
【数２】
【００６９】図２に示すように、特異的ヒスタミン遊離
率は、全血による方法と、分離細胞による方法とで同等
の結果を得た。このことから、本発明のモノクローナル
抗体を用いて得られた分離細胞は、血液中で本来有する
ヒスタミン遊離能を維持していることがわかった。
率は、全血による方法と、分離細胞による方法とで同等
の結果を得た。このことから、本発明のモノクローナル
抗体を用いて得られた分離細胞は、血液中で本来有する
ヒスタミン遊離能を維持していることがわかった。
【００７０】３．臨床検体による分離細胞のヒスタミン
遊離試験 卵白が原因アレルゲンである小児アトピー性皮膚炎患者
血液検体２例に関して、上記実施例の３に示した方法で
調製したＢＡ３１２固相化マグネチックビーズを用い
て、上記実施例の４と同様の方法で細胞分離と、分離細
胞のヒスタミン遊離試験を行った。試験に用いた卵白ア
レルゲンは、ヒスタミン遊離用緩衝液で４０００、４０
０、４０、４、及び０. ４ｎｇ／ｍｌとなるように調製
し、これによるＩｇＥ特異的ヒスタミン遊離率を前述の
式に従って算出した。図３に示すように、特異的ヒスタ
ミン遊離率は卵白アレルゲン濃度に依存的であった。ま
た、アレルゲン濃度がある濃度よりも濃くなるとヒスタ
ミン遊離率が低下する、ベル状の濃度依存曲線となる例
もあった。
遊離試験 卵白が原因アレルゲンである小児アトピー性皮膚炎患者
血液検体２例に関して、上記実施例の３に示した方法で
調製したＢＡ３１２固相化マグネチックビーズを用い
て、上記実施例の４と同様の方法で細胞分離と、分離細
胞のヒスタミン遊離試験を行った。試験に用いた卵白ア
レルゲンは、ヒスタミン遊離用緩衝液で４０００、４０
０、４０、４、及び０. ４ｎｇ／ｍｌとなるように調製
し、これによるＩｇＥ特異的ヒスタミン遊離率を前述の
式に従って算出した。図３に示すように、特異的ヒスタ
ミン遊離率は卵白アレルゲン濃度に依存的であった。ま
た、アレルゲン濃度がある濃度よりも濃くなるとヒスタ
ミン遊離率が低下する、ベル状の濃度依存曲線となる例
もあった。
【００７１】４．ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法に
よるヒスタミン濃度測定 上記実施例の３に示した方法で調製したＢＡ３１２固相
化マグネチックビーズを用いて、上記実施例の４と同様
の方法で細胞分離と分離細胞のヒスタミン遊離試験を行
った。得られた遊離ヒスタミン試料に関して、ラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）法にてヒスタミン濃度の測定を
行った。即ち、遊離ヒスタミン試料、若しくは標準ヒス
タミン溶液１００μｌを試験管に分取し、０．３％ヒト
血清アルブミン、０．１％アジ化ナトリウムを含む５０
ｍＭリン酸緩衝食塩液ｐＨ７．０（アッセイ緩衝液）で
調製した125 Ｉ−標識ヒスタミン溶液（１０ＫＢｑ／ｍ
ｌ）１００μｌ、及びアッセイ緩衝液で調製した抗ヒス
タミン抗体溶液１００μｌを加えて、４℃で２時間反応
を行った。これに、０．１％アジ化ナトリウムを含む５
０ｍＭリン酸緩衝食塩液ｐＨ７．０（５０ｍＭＰＢＳ）
で調製した２．５％牛γ−グロブリン溶液１００μｌ、
及び５０ｍＭＰＢＳで調製した２５％ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ＃６０００）溶液５００μｌを加えて４
℃で１０分間反応を行った。反応終了後、４℃で２０分
間１８００×ｇで遠心分離を行い、沈さの放射活性を測
定した。図４に得られた標準曲線を示す。
よるヒスタミン濃度測定 上記実施例の３に示した方法で調製したＢＡ３１２固相
化マグネチックビーズを用いて、上記実施例の４と同様
の方法で細胞分離と分離細胞のヒスタミン遊離試験を行
った。得られた遊離ヒスタミン試料に関して、ラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）法にてヒスタミン濃度の測定を
行った。即ち、遊離ヒスタミン試料、若しくは標準ヒス
タミン溶液１００μｌを試験管に分取し、０．３％ヒト
血清アルブミン、０．１％アジ化ナトリウムを含む５０
ｍＭリン酸緩衝食塩液ｐＨ７．０（アッセイ緩衝液）で
調製した125 Ｉ−標識ヒスタミン溶液（１０ＫＢｑ／ｍ
ｌ）１００μｌ、及びアッセイ緩衝液で調製した抗ヒス
タミン抗体溶液１００μｌを加えて、４℃で２時間反応
を行った。これに、０．１％アジ化ナトリウムを含む５
０ｍＭリン酸緩衝食塩液ｐＨ７．０（５０ｍＭＰＢＳ）
で調製した２．５％牛γ−グロブリン溶液１００μｌ、
及び５０ｍＭＰＢＳで調製した２５％ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ＃６０００）溶液５００μｌを加えて４
℃で１０分間反応を行った。反応終了後、４℃で２０分
間１８００×ｇで遠心分離を行い、沈さの放射活性を測
定した。図４に得られた標準曲線を示す。
【００７２】
【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は担体に固
相化後も抗体活性を保持し、また、アレルゲンや抗Ｉｇ
Ｅ抗体負荷によるケミカルメディエーター遊離を阻害せ
ず、かつ非特異的なケミカルメディエーターの遊離を誘
発しないので、ＩｇＥを介した特異的なケミカルメディ
エーター遊離試験に適した好塩基球を分離することがで
きる。また、本発明の好塩基球の分離方法は、簡便に血
球から好塩基球を分離することができるので、従来煩雑
な操作を要したヒスタミン遊離試験を簡便に行うことが
できる。さらに本発明の好塩基球の分離方法により得ら
れた細胞集団は、従来取り扱いに特別な技術を必要とし
たロイコトリエンやＰＡＦなどの好塩基球由来ケミカル
メディエーターを対象とした遊離試験にも、簡便に適用
することができる。
相化後も抗体活性を保持し、また、アレルゲンや抗Ｉｇ
Ｅ抗体負荷によるケミカルメディエーター遊離を阻害せ
ず、かつ非特異的なケミカルメディエーターの遊離を誘
発しないので、ＩｇＥを介した特異的なケミカルメディ
エーター遊離試験に適した好塩基球を分離することがで
きる。また、本発明の好塩基球の分離方法は、簡便に血
球から好塩基球を分離することができるので、従来煩雑
な操作を要したヒスタミン遊離試験を簡便に行うことが
できる。さらに本発明の好塩基球の分離方法により得ら
れた細胞集団は、従来取り扱いに特別な技術を必要とし
たロイコトリエンやＰＡＦなどの好塩基球由来ケミカル
メディエーターを対象とした遊離試験にも、簡便に適用
することができる。
【図１】マグネチックビーズに固相化した本発明のモノ
クローナル抗体を用いて分離した好塩基球からの総ヒス
タミン量（白色棒グラフ）、ＩｇＥを介した特異的なヒ
スタミン遊離の量（斜線棒グラフ）、および非特異的な
ヒスタミン遊離の量（黒色棒グラフ）を示すグラフであ
る。
クローナル抗体を用いて分離した好塩基球からの総ヒス
タミン量（白色棒グラフ）、ＩｇＥを介した特異的なヒ
スタミン遊離の量（斜線棒グラフ）、および非特異的な
ヒスタミン遊離の量（黒色棒グラフ）を示すグラフであ
る。
【図２】全血及びＢＡ３１２固相化マグネチックビーズ
による分離細胞を用いたヒスタミン遊離反応のモノクロ
ーナル抗ヒトＩｇＥ抗体濃度依存曲線である。
による分離細胞を用いたヒスタミン遊離反応のモノクロ
ーナル抗ヒトＩｇＥ抗体濃度依存曲線である。
【図３】ＢＡ３１２固相化マグネチックビーズによる小
児アトピー性皮膚炎患者血液由来分離細胞を用いた、ヒ
スタミン遊離反応の卵白アレルゲン濃度依存曲線であ
る。
児アトピー性皮膚炎患者血液由来分離細胞を用いた、ヒ
スタミン遊離反応の卵白アレルゲン濃度依存曲線であ
る。
【図４】ラジオイムノアッセイにより得られたヒスタミ
ン濃度の標準曲線である。Ｂ／Ｂｏは標識された結合被
検体の％を示す。
ン濃度の標準曲線である。Ｂ／Ｂｏは標識された結合被
検体の％を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 17/14 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｑ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (15)
- 【請求項１】 以下の性質を有するモノクローナル抗
体。 (1) 好塩基球と反応する、 (2) 担体固相化後も抗体活性を保持する、 (3) 該好塩基球のＩｇＥを介した特異的なヒスタミン遊
離を阻害しない、 (4) 該好塩基球の非特異的なヒスタミン遊離を誘発しな
い、 - 【請求項２】 マウス免疫グロブリンのクラスがＩｇＧ
１またはＩｇＭに属することを特徴とする請求項１記載
のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 ハイブリドーマＢＡ１０１シオノギ（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４００４）、ＢＡ２０シオノギ（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４００５）、ＢＡ１３５シオノギ（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４００６）、およびＢＡ３１２シオノギ（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−４００７）によりそれぞれ産生されるモノ
クローナル抗体ＢＡ１０１、ＢＡ２０、ＢＡ１３５、お
よびＢＡ３１２よりなる群から選択される請求項１記載
のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 請求項１、２又は３記載のモノクローナ
ル抗体を担体に固相化した固相化モノクローナル抗体。 - 【請求項５】 該担体がガラス又は合成樹脂製の粒状
物、球状物、チューブ、プレートおよび磁性粒子よりな
る群から選択される請求項４記載の固相化モノクローナ
ル抗体。 - 【請求項６】 該磁性粒子がマグネチックビーズである
請求項５記載の固相化モノクローナル抗体。 - 【請求項７】 請求項１、２又は３記載のモノクローナ
ル抗体を産生し得るハイブリドーマ。 - 【請求項８】 ハイブリドーマＢＡ１０１シオノギ（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４００４）、ＢＡ２０シオノギ（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４００５）、ＢＡ１３５シオノギ（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４００６）、およびＢＡ３１２シオノギ（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−４００７）よりなる群から選択される請求
項７記載のハイブリドーマ。 - 【請求項９】 請求項４、５又は６記載の固相化モノク
ローナル抗体と体液とを反応させ、該体液中の好塩基球
を該固相化モノクローナル抗体に結合させて捕捉するこ
とを特徴とする、好塩基球の分離方法。 - 【請求項１０】 該体液が、血液、鼻汁、涙液、および
唾液よりなる群から選択される請求項９記載の分離方
法。 - 【請求項１１】 請求項９又は１０記載の方法により分
離した好塩基球をアレルゲンまたは抗ＩｇＥ抗体と反応
させることを特徴とする、該好塩基球からのケミカルメ
ディエーターの遊離方法。 - 【請求項１２】 該ケミカルメディエーターがヒスタミ
ン、ロイコトリエンおよび血小板活性化因子（ＰＡＦ）
よりなる群から選択される請求項１１記載の遊離方法。 - 【請求項１３】 該アレルゲンが室内塵、花粉、食餌性
アレルゲンおよび化学物質よりなる群から選択される請
求項１１記載の遊離方法。 - 【請求項１４】 以下の工程を有する好塩基球からのケ
ミカルメディエーター遊離試験法。 (1) 請求項４、５又は６記載の固相化モノクローナル抗
体と体液とを反応させ、該体液中の好塩基球を該固相化
モノクローナル抗体に結合させて捕捉し、該好塩基球を
分離する工程、 (2) 工程(1) で分離した好塩基球をアレルゲンまたは抗
ＩｇＥ抗体と反応させて好塩基球からケミカルメディエ
ーターを遊離させる工程、および (3) 工程(2) で好塩基球から遊離したケミカルメディエ
ーターの量を測定する工程、 - 【請求項１５】 該ケミカルメディエーターがヒスタミ
ン、ロイコトリエンおよび血小板活性化因子（ＰＡＦ）
よりなる群から選択されるものである請求項１４記載の
遊離試験法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29737993A JP3550410B2 (ja) | 1992-11-04 | 1993-11-02 | 好塩基球に結合するモノクローナル抗体、好塩基球の分離方法、好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離方法、及び好塩基球由来ケミカルメディエーター遊離試験法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4-321164 | 1992-11-04 | ||
| JP32116492 | 1992-11-04 | ||
| JP29737993A JP3550410B2 (ja) | 1992-11-04 | 1993-11-02 | 好塩基球に結合するモノクローナル抗体、好塩基球の分離方法、好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離方法、及び好塩基球由来ケミカルメディエーター遊離試験法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06205695A true JPH06205695A (ja) | 1994-07-26 |
| JP3550410B2 JP3550410B2 (ja) | 2004-08-04 |
Family
ID=18129523
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29737993A Expired - Lifetime JP3550410B2 (ja) | 1992-11-04 | 1993-11-02 | 好塩基球に結合するモノクローナル抗体、好塩基球の分離方法、好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離方法、及び好塩基球由来ケミカルメディエーター遊離試験法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5500348A (ja) |
| EP (1) | EP0596479B1 (ja) |
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