JPH03500842A - 組換えタンパク質を対応の宿主細胞タンパク質から精製する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えタンパク質を対応の宿主細胞タンパク質から精製する方法発明の分野 本発明は組換えタンパク質を関連宿主細胞タンパク質から精製する方法に関する 。また、本発明はこの精製に用いるモノクローナル抗体、および関連宿主細胞タ ンパク質の検定に関する。

発明の背景 真核細胞において組換えタンパク質を製造すると、関連宿主細胞タンパク質を同 時精製する結果になることがある。即ち、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨ Ｏ）細胞においてヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）を製造する と、ＣＨＯ細胞が産生ずるチャイニーズ・ハムスクープラスミノーゲン活性化因 子（群）（ＣＨＯ−ＰＡ）を同時精製する結果になることがある。

ヒトｔ−ＰＡは、インビボで血餅を溶解するその強力な能力およびその高い特異 性のゆえに、血管障害の治療において非常に有望であることが示された極めて重 要かつ新規な生物学的医薬である。従つて、ｔ−ＰＡは、血管閉塞疾患、特に心 臓障害の治療に最近の歴史の中で最も顕著な新規薬物の１つとして医学界によっ て歓迎された。

これらおよびその他の理由により、ｔ−ＰＡは重篤な血管障害の臨床的処置に革 命をもたらすものと考えられている。

ヒトｔ−ＰＡタンパク質ならびにそれをコードしている基本の遺伝子配列は、こ れまでの数年間にわたる移しい数の科学的開示の対象であった。例えば、その天 然の供給源からの単離はＲｉｊｋｅｎ等［ξＢｉ。

＋、ｃｈｅｍ、　２５６．７０３５（１９８１）］および欧州特許出願公開Ｎｏ 、（１４１７６６が開示している。さらに、組換え供給源からのｔ−ＰＡの単離 およびその構造を詳しく記載する特許および種々の特許出願が公表されている［ 例えば、ＵＫ特許２．１１９．８０４　；および欧州特許出願公開Ｎ　ｏ、　０ ９３６１９を参照］。

ヒトｔ−ＰＡには結合するがブタｔ−Ｐ　Ａには結合しないモノクロ−〜ナル抗 体が製造されていた；例えば、欧州特許出願１９０７１１は、正常なヒト組織由 来細胞の組織培養液から得たヒト組織プラスミノーゲン活性化因子に特異的なモ ノクローナル抗体に関する。これらのモノクローナル抗体を用いるヒトｔ−ＰＡ の精製およびヒトｔ−ＰＡの検定が開示されている。モノクローナル抗体Ｘ−２ １およびＸ−２３はブタ心臓から抽出したプラスミノーゲン活性化因子あるいは ウロキナーゼとは交差反応しなかった。

欧州特許出願２１０８７０は、Ｅ　ｒｙｔｈｒｉｎａ　ｌａｔｉｓｓｉｍａおよ びその他のＥ　ｒｙｔｈｒｉｎａ植物の種子中に生成される固定化クニッツ阻害 剤を含有する親和試薬を開示している。この親和試薬は、ヒト細胞由来のｔ−Ｐ Ａおよび宿主細胞由来のプラスミノーゲン活性化因子を互いから分離することが できると言われている。

Ｖ　ｅｒｈｅｉ　ｊｅｎ等［ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、　Ｍｏ１．５．　Ｎｏ、 　１３．　ｐｐ３５２５−３５３０（１９８６）ｌ］は、ＣＨＯ細胞においてヒ トｔ−ＰＡを発現させたときのＣＨＯ−ＰＡの存在を開示している。

本発明の目的は、組換えタンパク質（例えば、ヒ）ｔ−ＰＡ）を、宿主細胞の対 応する内生タンパク質（例えば、チャイニーズ・／％ムスタープラスミノーゲン 活性化因子）を実質的に減少させることによって、極めて高いレベルまで精製す る方法を提供することである。

本発明の別の目的は、チャイニーズ・ハムスタープラスミノーゲン活性化因子に 対するモノクローナル抗体を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、チャイニーズ・ノ＼ムスタープラスミノーゲン活性 化因子の検定法を提供することである。

本発明のその他の目的、態様および特徴は、以下の記述および添付した請求の範 囲を考慮すれば明らかとなるであろう。

発明の要約 本発明は、組換えタンパク質を、宿主細胞の対応の内生タンｔ＜９質から精製す る方法であって、組換えタンノくり質を含有する液を、対応の内生タンパク質と 特異的に結合する抗体と接触させる工程、および該組換えタンパク質を回収する 工程を特徴とする方法に関する。また、本発明は、該対応の内生タンパク質の検 定法、および該対応の内生タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体に 関する。

発明の詳細な説明 モノクローナル抗体を用いる免疫精製法によって、組換えタンノくり質を関連の 宿主細胞タンパク質から単離しうろことがわかった。

本発明は、組換えタンパク質ならびに宿主細胞の対応の内生タンＢり質を発現し ている宿主細胞を培養することによって得られる液体を、該対応の内生タンパク 質と特異的に結合する抗体と接触させる方法に関する。このモノクローナル抗体 は対応の内生タン）＜り質と結合し、次いでヒト組換えタンパク質が回収される 。さらに詳しくは、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）が組換え 法ζこよってチャイニーズ・ノ＼ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中に産生されると きには、本発明の方法によって内生のチャイニーズ・ハムスタープラスミノーゲ ン活性化因子（群）（ＣＨＯ−Ｐ　Ａ、）カらヒ）ｔ−ＰＡを単離することがで きる。

本発明は、ヒトｔ−ＰＡならびにチャイニーズ・ハムスタープラスミノーゲン活 性化因子（Ｐ　Ａ）を発現するＣＨＯ細胞を培養することによって得られる液体 を、チャイニーズ・ハムスターＰＡと結合する抗体（モノクローナル抗体が有利 である）と接触させる方法を提供するものである。ヒ）　ｔ−Ｐ　Ａは結合せず 、分離が行わ４する。また、本発明はチャイニーズ・ハムスターＰＡに特異的な モノクローナル抗体、およびチャイニーズ・ハムスターＰＡの存在を検出するた めに検定法に関する。

本発明の方法はヒ）ｔ−ＰＡと特異的に結合する抗体を使用するよりも好ましい が、これは、ヒ）ｔ−Ｐ’Ａの濃度がＣＨＯ−ＰＡの１ｌＡｆＸよりも数オーダ ー高いので、後者の方法が本発明の方法よりも数オーダー高い精製手段、例えば カラムを必要とするからである。さらに、本発明の方法では、所望の産物を変性 剤または他の過酷な条件で処理して抗体から産物を溶離することがない。

本明細書中で用いる「ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子」、［ヒトｔ−ＰＡ Ｊあるいはｒｔ−ＰＡＪは、例えば天然供給源の抽出および精製によって（Ｃｏ ｌｌｅｎ等、上記を参照）、ならびに本明細書中に記載したような組換え細胞培 養系によって得られる、ヒト外因性（組織型）プラスミノーゲン活性化因子を指 す。その配列および特徴は、例えば、１９８２年５月５日の最初の出願を基礎と する欧州特許出願公開Ｎ　ｏ、　９３６１９（１９８３年１１月９日公開）に記 載されている。また、Ｒｉｊｋｅｎ等［ＪｏｕｒｎｓＩ　ｏｆ　Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅｍ、　２５６，７０３５（１９８１）］および１１９８０６６月１１の最初の 出願を基礎とする欧州特許出願公開Ｎ　ｏ、　４１７６６（１９８１年１２月１ ６日公開）も参照。さらに、この用語は、全配列中の１またはそれ以上のアミノ 酸が、またはグリコジル化パターンが異なっている生物学的に活性なヒト組織プ ラスミノーゲン活性化因子等個物をも包含している。また、本出願で用いるこの 用語は、翻訳後修飾あるいはｔ−ＰＡの置換、削除および挿入アミノ酸変異体を も包含しているものとする。

ヒトｔ−Ｐ　Ａは、種々の真核細胞、例えば幼ハムスター腎細胞、ミエローマ細 胞、昆虫細胞、３Ｔ３細胞、およびその他の有用なトランスフェクション後寿命 を有するトランスフェクションが可能な細胞をトランスフェクションすることに よって産生させることができる。チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞 を用いるのが好都合である。

本発明によれば、ＣＨＯ−ＰＡと特異的に結合するモノクローナル抗体は、抗原 −プライムした免疫リンパ球とミエローマ細胞の融合によって得た連続ハイブリ ッドセルラインから単離した。本発明の別の態様では、ＣＨＯ−ＦＡに特異的に 結合するポリクローナル抗体を用いる。

モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原性部位に指向性である。さらに 、別の決定基（エピトープ）に指向性である別の抗体を含むのが普通である通常 の抗体（ポリクローナル）調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体 は抗原上の単一の決定基に対して指向性である。モノクローナル抗体は、抗原− 抗体結合を利用する診断および分析検定法の選択性および特異性を改善するのに 有用である。モノクローナル抗体の第２の利点は、それらが他の免疫グロブリン によって汚染されないハイブリドーマ培養によって合成接種することによって誘 導した腹水から調製することができる。

ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ［Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．６，５ １１（１９７６）コによって初めて記載されたハイブリドーマ法が広く適用され 、多くの特異的抗原に対して高レベルのモノクローナル抗体を分泌するハイブリ ッドセルラインが調製されていた。

宿主動物あるいはこれら由来の培養された抗体産生細胞の免疫化の経路およびス ケジュールは、通常、抗体刺激および産生の確立された常法に一致する。本発明 者等は試験モデルとしてマウスを用いたが、ヒト対象を含むあらゆる哺乳動物対 象またはそれら由来の抗体産生細胞を本発明の方法に従って操作して、ヒトを含 む哺乳動物のハイブリ・７ドセルラインの調製のために用いることができる。

免疫化の後に、免疫リンパ様細胞をミエローマ細胞と融合させ、無限に培養およ び継代培養が可能なハイブリッドセルラインを得、大量のモノクローナル抗体を 産生させた。本発明のためには、融合用に選択した免疫リンパ様細胞はリンパ球 およびそれらの通常の分化した子孫であり、免疫した動物由来のリンパ腺組織ま たは肺臓組織のいずれかから採取した。本発明者等は免疫肺臓細胞を好んで用い たが、これは、これらがマウスの系についてはより濃縮された都合の良い抗体産 生細胞の供給源を与えるためである。ミエローマ細胞は融合ハイブリッドの連続 増殖の基礎を与える。ミニロー−７細胞は血漿細胞由来の腫瘍細胞である。

ある種の細胞を別の種のものと融合させることができる。しかし、免疫した抗体 産生細胞とミエローマの供給源は同一の種であるのが好ましい。

ハイブリッドセルラインは細胞培養培地中、インビトロの培養で維持することが できる。本発明のセルラインは、既知のヒボキサンチン−アミ／プテリン−チミ ジン（ＨＡＴ）培地中に連続セルラインを含有している組成物において実質的に 変わることなく維持し、モして／または選択することができる。実際のところ、 ハイブリドーマセルラインが一度樹立されると、これを種々の栄養が満たされて いる培地で維持することができる。さらに、液体窒素下での凍結と貯蔵を含むす べての通常の方法でハイブリッドセルラインを貯蔵および保存することができる 。凍結セルラインを生き返らせ°、これを変えることなく培養することができ、 再びモノクローナル抗体を合成および分泌させることができる。分泌された抗体 は、沈澱、イオン交換、アフィニティークロマトグラフィーなどの常法によって 組織培養上清から回収することができる。

細胞融合法に代わるものとしては、ＥＢＶ永久化Ｂ細胞を用いて本発明のモノク ローナル抗体を産生させる。組換えＤ　Ｎ　Ａなどのモノクローナル抗体を産生 させるその他の方法も考えられる。

ＣＨＯ−ＰＡの存在を測定するために本明細書中に記載されているのは血清学的 方法である。本質的に、本発明の方法は、被験試料をモノクローナル抗体とイン キュベートするか、またはその他の方法で接触させ、そして反応生成物の存在を 検出することからなる。

これらの基本的な方法に多数の変法が存在することは当業者の認めるところであ ろう。例えば、これらにはＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、沈澱法、凝集法、補体固定法、 および免疫蛍光法が含まれる。現在での好ましい方法では、モノクローナル抗体 を適切にラベルする。この検定用の好都合なラベルは放射活性同位体、特にＩｔ Ｓｉである。しかし、酵素、特にペルオキシダーゼも有用である。

抗体を放射活性要素、酵素または蛍光物質でラベルする。この放射ラベルを現在 利用可能な計測法のいずれかで検出することができる。好ましい同位体ラベルｌ ；！”ＣＳ”Ｉ、＋２５１，１ｌ）（およびｓｓＳである。酵素ラベルは現在利 用されている比色法、分光光度法、蛍光分光光度法または気体定量法のいずれか で検出することができる。

カルボジイミド、過ヨウ素酸、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどの架 橋分子を用いて酵素を抗体に結合させる。これらの方法に用いることができる多 数の酵素が既知であり、利用可能である。

その例を挙げると、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロ ニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシターセ、ウレアーゼ、 グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ＋ペル オキシダーゼおよび酸ホスファターゼである。使用することができる蛍光物質に は、例えばフルオレセイン、ローダミンおよびオーラミンが含まれる。様々なラ ベル法が、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　 ３２ｂ、１０３（１９７４）］、５ｙｖａｎｅｎ等［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 　２８４．３７６２（１９７３）コ、ならびにＢｏｌｔｏｎおよびＨｕｎｔｅｒ ［Ｂｉ以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら に限定されるものではない。

ヒ）　ｔ−Ｐ　Ａ遺伝子を欠く宿主細胞から精製した実質的にチャイニーズ・ハ ムスタープラスミノーゲン活性化因子に富むタンパク質溶液を用いて、雌性Ｂａ １ｂ／ｃマウスを１２週間にわたって免疫した。

それぞれ約３０μ９からなる５回の注射を行った。最初の注射は完全ソロインド アジニを幻、／　トで乳化し、１カ所の皮下部位に投与した。

１．５週間後の第２の注射は不完全フロインドアジュバントで乳化し、半分を皮 下投与し、半分を腹腔的投与した。残りの３回の注射は、リン酸緩衝食塩水（Ｐ ＢＳ）中、３．６および１２週ロー１カ所の腹腔中部位に投与した。

Ｂ、融合およびＣ１（Ｏ−ＰＡ特異的なモノ多口−ナル抗体の選択１３週ロー免 疫したマウスから肺臓を取り出し、Ｓ、ＦａｚｅｋａｓＳｄｅＳｔ、　Ｇｒｏｔ ｈおよびり、　Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｂｏｄｓ 　３５，１（１９８０）コ、ならびにＬａｎｅ、　Ｒ，Ｄ、　［Ｊ、　Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　８１．２２３（１９８５）コの一般的な方法を用い て肺細胞をマウスのミエローマセルラインＮＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合 させた。融合した細胞を、それぞれが９６ウエルの１０枚の微量滴定プレー１に 分配した。それぞれのウェルを、２種類のＥＬＴＳＡ（酵素結合の免疫吸着検定 ）における示差反応性を用いて特異的な抗体産生についてスクリーニングした。

第１のＥＬＩＳＡはＣＨＯ−ＰＡに対する抗体を特異的に検出し、第２のものは 組換えヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）と交差反応する抗体を 検出した。

ＣＨＯ−ＰＡ特異的なＥＬＩＳＡのためには、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９，６ ）中の５０ｎ９／ｘｉ２ＣＨＯ−ＰＡを、４°Ｃで一晩、微量滴定ウェルに吸着 させた。抗原を除去し、ウェルを０９０５％Ｔ　ｗｅｅｎ　２０を含むリン酸緩 衝食塩水（ＰＢＳ−ＴＷ２０）で洗浄した。このウェルにトリス緩衝食塩水［Ｔ ＢＳ　；　０．１５Ｍ　ＮａＣＱ、０．０５Ｍ　トリス（ｐＨ７，４）］中の１ ％ゼラチンを加え、室温で１時間インキュベートすることによって、さらに吸着 するのを阻害した。内容物を吸い出した後、５ｘ９／ｘＱのウシ血清アルブミン （Ｂ　Ｓ　Ａ）を含むＰＢＳ（０，０５１１２）をそれぞれのウェルに加え、続 いて、融合プレートのそれぞれのウェルからの上清（０，１ｚｆｆ）を加えた。

室温で２時間インキュベートした後、それぞれのウェルの内容物を吸い出し、Ｐ ＢＳ−ＴＷ２０で３回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたヤギ 抗−マウス免疫グロブリンを加え、次いで室温で１時間インキュベートした。こ のウェルをＰＢＳ−ＴＷ２０で３回洗浄し、０−フェニレンジアミンを基質とし て加え、次いで室温で３０分間インキュベートした。２．５Ｍ　Ｈ，Ｓｏ、で反 応を停止させ、それぞれのウェルの吸収を４９２１１１１で測定した。

ヒトｔ−ＰＡ特異的なＥＬＩＳＡは、最初の工程においてＣＨＯ−ＰＡ特異的な ＥＬＩＳＡとは異なっていた。ｐＨ９，６の５０ｍＭ炭酸緩衝液中の２００　ｎ ９／ＲＱ　ｔ−Ｐ　Ａを４℃で一晩、微量滴定ウェルに吸着させた。ＥＬＩＳＡ の残りは同一であった。

ＨＯ−ＰＡおよびヒトｔ−ＰＡと反応した。ＣＨＯ−２ＰＡ特異的な抗体を含有 しているウェルからのハイブリドーマ細胞を増殖させ、限界希釈法によってクロ ーンした［０；　Ｖ、Ｔ、およびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇｒ　Ｌ、　Ａ、　＋　（ １９８０）、１ｍＩＩｌｕｎｏｇｌｏｂｉｎ−Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｈｙｂｒｉ ｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ、　３５１−３７２頁、江佳ｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ）’＋　Ｍｉｓｈｅｌｌ、 Ｂ、Ｂ、およびＳｈｉｉｇｉ＋ｓ、Ｍ、ｍ、　Ｙ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ 　Ｃｏ、］。／＼イブリドーマ細胞の細胞培養によって、またはマウスにハイブ リドーマ細胞を注射して腹水症腫瘍を生成させることによって、大量の特異的な モノクローナル抗体を得た。

Ｉｌ、ＣＨＯ−ＰＡ特異的なＥＬ、　Ｉ　ＳＡまた、本発明は、チャイニーズ・ ハムスター卵巣細胞プラスミノーゲン活性化因子（ＣＨＯ−ＰＡ）の定量のため の、モノクローナル抗体に基づく検定法に関する。特異的なモノクローナル抗体 を用いる免疫検定法は、存在している少量のタンパク質不純物を、大過剰の生化 学的に関連した組換え産物の存在下で定量するための１つの手段を与える。ＣＨ Ｏ−ＰＡを特異的に検出し、ヒトｔ−Ｐ　Ａは検出しないＥ、Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａを 、３３５および３６１と命名した２種類のＣＨＯ−ＰＡ特異的なモノクローナル 抗体（Ｍ　Ａ　ｂ）を用いて開発した。これらのＭＡｂは、＋５■−ラベルした ＣＨＯ−ＰＡと結合するそれらの能力、それらのヒトｔ−ＰＡとの最少の交差反 応性、およびそれらがＣｌ０−ＰＡ上の別のエピトープにそれぞれ結合するとい うことに基づいて選択した。これらの抗体はＣＨＯ−ＰＡとはポジティブ応しな かった。ＣＨＯ−ＰＡと結合するそれぞれのＭＡｂの能力は、微量滴定ウェルに 非特異的ｌこ吸着させたそれぞれのＭＡｂに結合する１ｔ５Ｉ−ラベルしたＣＨ Ｏ−ＰＡの量を測定することによって調べた。ＭＡｂ３６１および３３５が別の エピトープに結合することを証明するために　１１５１−ラベルしたＣＨＯ−Ｐ Ａを１つのＭＡｂの溶液とプレーインキュベートし、次いでこの混合物を第２の ＭＡｂを含有している微量滴定ウェルに加えた。第１のＭＡｂは＋１５■−ラベ ルしたＣＨＯ−ＰＡの第２のＭＡｂへの結合を阻害せず、これらは別のエピトー プに対するものとみなされた。

ＭＡｂのヒトｔ−Ｐ　Ａとの交差反応性をＥＬＩＳＡによって調べた。

ＣＨＯ−ＰＡまたはｔ−ＰＡのいずれか１００ｎ９を微量滴定ウェルに吸着させ た。様々に希釈した精製ＭＡｂをそれぞれの抗原と反応させ、西洋ワサビペルオ キシダーゼコンジュゲートしたヤギ抗−マウス抗体を用いて、結合した抗体の量 を測定した。交差反応性は、あるＭＡｂについて、ＣＨＯ−ＰＡおよびヒトｔ− ＰＡに対して同一の吸収になる希釈から算出した。

これらの結果に基づき、微量滴定ウェルを被覆するためにＭＡｂ３３５を用い、 結合ＣＨＯ−Ｐ’Ａを検出するためにＭＡｂ３６１を西洋ワサビペルオキシダー ゼにコンジユゲートさせて、ＣＨＯ−ＰＡ特異的な「サンドイッチＪＥＬｒＳＡ を開発した。検定標準は、ＣＨＯ細胞中に発現されたクローンＣＨＯ−ＰＡであ る。この検定法は、ＣＨＯ−ＰＡの検出および定量に対して特異的であり、精密 かつ正確である。このＥＬＩＳＡの感度（検出限界）は約３　、９　ｎｇ／　ｚ （１のＣＨＯ−ＰＡであり、ヒトｔ−ＰＡとの交差反応性は約０．００２％以下 である。

検定それ自体の特異性を試験するため、ＣＨＯ−ＰＡを含有するヒトｔ−ＰＡを 、ＣＨＯ−ＰＡに特異的なモノクローナル抗体３４１と結合させたＳ　ｅｐｈａ ｒｏｓｅ４　Ｂのカラムに通した。このカラムから流出する物質はＣＨＯ−ＰＡ が減少したヒトｔ−Ｐ　Ａであり、従って検定の特異性を調べるための適切な試 料であった。抗体３４１は、抗体３３５または３６１とは別のＣＨＯ−ＰＡ上の 抗原決定基に指向している。従って、この抗体によるヒトｔ−ＰＡの精製は、同 一の抗体（即ち、同一の抗原決定基に指向している）によるＣＨＯ−ＰＡの精製 および後に行う測定を回避する。第１表は、この抗体を用０るヒトｔ−ＰＡから のＣＨＯ−ＰＡの免疫アフィニティー精製について得られる検定値を示すもので ある。

第１表モノクローナル抗体カラム（Ｆ３４１）を用いるＣＨＯ−ＰＡからのヒト Ｌ−ＰＡの精製１ １Ａ、カラム溶出液中のＣＨＯ−ＰＡｉｌの減少す溶出液　ＣＨＯ−ＰＡ　ヒト ｔ−ＰＡ　ＣＨＯ−ＰＡ量６　０．３８　７４゜０　１９３ ３０　０．７７　６９．２　９０ ６４　＜０．０５　８．８　＞１８４ １Ｂ、０．２Ｍグ’）　シン−ＨＣ（！（ｐＨ２，４）−１コヨルモ／　りｏ− ナル抗体カラムからのＣＨＯ−ＰＡの溶離０ 試　料　ＣＨＯ−ＰＡ　ヒ）ｔ−ＰＡ　ＣＨＯ−ＰＡ（μｙ）　（ｕ９）　の純 度（％） ａ：ヒ）　ｔ−Ｐ　Ａを含有する溶液（１００１のをカラムに通し、溶出液の分 画（各１．６７７！のを集めた。分画５１のところで１ＭＮａｃＩ２を含むＰＢ Ｓで洗浄を開始した。分画１００のところでグリシン−ＨＣＱによる溶離を始め 、分画の量を２．５ｄに増やした。

ｂ＝溶出液の３つの代表分画をＣＨＯ−ＰＡについて試験した。ヒトｔ−ＰＡの 濃度は、ヒ）ｔ−ＰＡの消衰係数を１．９と仮定して２８０ｎｍでの吸収によっ て測定した。

ｃ：ｃＨｏ−ＰＡの特異的な除去が、ＣＨＯ−ＰＡおよびヒトｔ−ＰＡに対する グリシン−ＨＣＱ溶離の検定によって示された。ヒトｔ−ＰＡ含量は、ヒトｔ− ＰＡに対するモノクローナル抗体に基づ＜ＥＬＩＳＡによって測定した。

この結果から、出発物質中のＣＨＯ−ＰＡの割合（％）をピーク流出分画中のも のと比較することによって決定すると、ＣＨＯ−ＰＡの量は約１００倍またはそ れ以上に減少したことが明らかである。

さらに、０．１Ｍグリシン−ＨＣｆｆまたは３ＭＮａ５ＣＮを用いてこのカラム から溶離させた吸着ＣＨＯ−ＰＡは６７〜９４％の純度であり、グリシン−ＨＣ Ｑプールは９５％のＣＨＯ−ＰＡを含有していた。流出液中の反応性のすべてが 検定における交差反応性の結果であると仮定する保守的な方法を採用すると、こ れは、多くとも０゜００２％の交差反応性に相当する。

精度を調べるために、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって内生のＣ ＨＯ−ＰＡを減少させておいたｒｔ−ＰＡの試料に組換えＣＨＯ−ＰＡを加えた 。１１．５および３１　、５　ｎ９／ｚ（ｌの濃度でそれぞれ加えたＣＨＯ−Ｐ Ａの添加回収分析は、それぞれ１０３および１０５％の平均回収率を示した。こ れらの結果は、この検定によってヒトｔ−ＰＡの存在下でＣＨＯ−ＰＡを正確に 検出することができることを示すものである。

箪又老　ヒトｔ−ＰＡに加えたＣＨＯ−ＰＡの回収内生の　添加した　予想され る　回収した　回収率１゜（ＨＯ−ＰＡ　ＣＨＯ−ＰＡ　Ｃ１（Ｏ−ＰＡ”　Ｃ ［１Ｏ−ＰＡ（ｎ９／　Ｘ（り　（ｎ９／　ｘ（２）　（ｎ９／　ｚの　（ｎｇ ／ｚの　（ｒ＋ｇ／ｉ＋ｆｆ）３３．７　１１．５　４５．２　４６．５　１０ ３３３．７　３１．５　６５．２　６８．５　１０５ａ：予想値−内生士添加 ｂ：回収値＝回収／予想ｘ　ｉｏ。

モデル実験においては、固定化したモノクローナル抗体＃３５４はＣＨＯ−ＰＡ 量を１回のカラムの通過で約１００倍以上に低下させた。この抗体は、いくつか の別の固定化の化学および過酷な洗浄条件に安定である。適切に配置したＭＡｂ ３５４アフイニテイーカラムを多数回にわたって再使用して、結合活性を有意に 損失することなく組換えヒトｔ−ＰＡ収穫液からＣＨＯ−ＰＡを除去することが できる。即ち、ＭＡｂ３５４カラムは、以下に示すように、ヒト１−ＰＡから痕 跡量のＣＨＯ−ＰＡを除去するための再使用が可能な生物持異的なフィルターと して用いるのに適している。

Ｃ’ＨＯ−ＰＡに指向性である８種類の異なる腹水液を、ＣＨＯ−Ｐ人被覆への 直接結合についてＥＬＩＳＡによって試験した。ポリスチレンＥＬＩＳＡプレー トを、炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）中、４°Ｃで一晩、ウェルあたり１μ９のアフ ィニティー精製したＣＨＯ−ＰＡで受動被覆し、次いでＰＢＳ中の０．５％ＢＳ Ａでブロックした。プロティンＡ精製したＭＡｂをＣＨＯ−ＰＡ結合について滴 定し、順位をつけた。それぞれのＭＡｂを最初のウェルで１／２００に希釈し、 続いて連続２倍希釈し、室温で２時間インキュベートした。次いで、ヤギ抗−マ ウスＩｇＧＨＲＰコンジニゲートを用いて、結合した抗体を検出した（ＲＴで１ 時間、１／４０，０００希釈でインキュベート）。ＯＰＤ基質を３０分間加え、 酸の添加によって反応を停止させることによって発色させた。次に、ｏＤ４□を ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて読み取った。ＥＬ　Ｉ　ＳＡ力価が濃度に ついて調節されているときには、次の順位が得られた：　ＣＨＯ−ＰＡ　ＭＡｂ ３５４＝３５９＝３６１＝３３５（区別できない）；シかじ、３２７＞３６０＞ ３４１＞３２５よりも強固にＣＨＯ−ＰＡ被被覆プレートに結合した。

また、ＥＬＩＳＡに基づく溶離試験を行った。種々のＭＡｂに対する溶離挙動の 分析を、いくつかの緩衝液について調べた；用いた緩衝液には、低（０，１５Ｍ ）および高（１，５Ｍ）ＮａＣＱを含むｐＨ３゜０およびｐＨ２，０酢酸；３Ｍ チオシアン酸ナトリウム（ｐＨ８，５、ｐＨ１０，０）；　２Ｍチオシアン酸ナ トリウム（ｐＨ８，５およびｐＨ５゜２）；　２．ＯＭ　ＭｇＣＱ、（ｐＨ５， ２）；およびグリシン（ｐＨ５，２）が含まれる（すべてが強力なアフィニティ ーカラム溶離液）。モノクローナル抗体はこれらの試薬に対して異なるパターン または感度を示した。例えば、３５４および３６１は酸の条件下でプレート被覆 したＣＨＯ−ＰＡから容易に除去され、３５９および３６１は３ＭＮａ５ＣＮ（ ｐＨ８，５）緩衝液に耐性であった。３５４ＭＡｂは広スペクトルの溶離液で除 去された。

組換えｔ−ＰＡ収穫液からのＣＨＯ−ＰＡ除去のために調製したものの中で最良 のＭＡｂを決めるために、７種の異なるＣＨＯ−ＭＡｂを、ＣＮＢｒ活性化した Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　４　Ｂに、ＩＩＱの樹脂あたり１戻９の結合量で 固定化した（ＭＡｂ固定化のための一般的な方法）。

反応しなかった部位はエタノールアミンでブロックした。７つの別々の小さなカ ラムをそれぞれが１ｆｆＣのアフィニティー樹脂を含むように詰めた。次いで、 このアフィニティーカラムを０，１Ｍ酢酸、０、１５Ｍ　ＮａＣ４＜ｐＨ３，０ ）で、続いて０．５Ｍ　Ｌ−ｖルギニンを含むＰＢＳ（ｐＨ７，４）で前洗浄し た。次に、それぞれのカラムを、細胞培養由来のｔ−ＰＡ収穫液からＣＨＯ−Ｐ Ａ不純物を除去する能力について試験した。ｔ−ＰＡ収穫液（２Ｍ）をそれぞれ のカラムにかけ、それぞれを３０カラム容量のＰＢＳで洗浄した。溶出したｔ− ＰＡ収穫液をクロマトグラフィー後にＣＨＯ−ＰＡについて検定した。種々のア フィニティーカラムを、流出液中に残存しているＣＨＯ−ＰＡの量にｉづいて順 位をつけた（第３表）。対照の実験では、ｔ−ｐＡ収穫液を、抗体を含有しない エタノールアミンブロックしたＳ　ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ　、　４　Ｂカラムに 付した。以下に示すように、ＭＡｂ３５４はＣＨＯ−ＰＡの除去について優れて いた。また、それぞれのカラムからの酢酸溶離液をＳＤＳゲル分析にかけ、ｔ− ＰＡ収穫液および精製組換えＣＨＯ−ＰＡ標準と比較したことについてふれるの も重要である。アフィニティーカラムの大部分から得られる溶離タンパク質は組 換えＣＨＯ−ＰＡ標準と一緒に移動するが、これは、試験したＭＡｂがＣＨＯ− ＰＡ痕跡不純物に対して選択性が高く、ヒ）　ｔ−Ｐ　Ａとは交差反応性でない ことを示すものである。

順　位　固定化した　流出液中の （１が最良）　ＣＨＯ−ＰＡ　ＭＡｂ　全ＣＨＯ−ＰＡ（％）２　３６１　０． ６１ ３　３３５　０．８６ ４　３５９　３．２ ５　３６０　９．４ ６　３４１　１３．２ ７　３２７　５４．６ 対照　エタノールアミン でブロック　１００ 別の固定化の化学、カオトロピズム溶離液、低ｐＨおよび複数のカラム再使用に 対する３５４．ＭＡｂの安定性ついての知見を、３種の別タイプのクロマトグラ フィー実験において得た。第１に、ＭＡｂ３５４をＣＮＢｒ活性化したＳ　ｅｐ ｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　４　Ｂに固定化し、これをアフィニティーカラム実験に用 いて、細胞培養液から組換えＣＨＯ−ＰＡを精製した。２Ｍ　Ｎａ５ＣＮ　（ｐ Ｈ８，５）およびグリシン（ｐＨ３，０）がＣＨＯ−ＰＡの溶離およびカラムの 再生に用いられるときには、ＭＡｂ３５４は複数の精製サイクルに対して安定で あるようである。

第２に、ＭＡｂ３５４を、Ｂｅｔｈｅｌ　１等［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２ ５４（８）、２５７２−２５７４（１９７９）］の方法によってカルボニルジイ ミダゾールで活性化しておいた５ｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗに 固定化した。この樹脂を用いてヒ）ｔ−ＰＡの一部精製した調製物からＣＨＯ− ＰＡを除去した。

ＣＨＯ−ＰＡの量は少なくとも１００倍減少し、この樹脂は３ＭのＮａ５ＣＮ（ ｐＨ８）を再生剤として用いると少なくとも６０サイクルにわたってその機能に 変化を示さなかった。

第３に、ＭＡｂ３５４をＢ　ｉｏＲａｄからのＮ−ヒドロキシスクシンイミド活 性化したＡｆｆｉＰｒｅｐ樹脂に固定化し、ｔ−ＰＡ収穫液からＣＨＯ−ＰＡを 除去する能力について４°Ｃで試験した。また、３５４アフイニテイーカラムの 再使用能力についても試験した。モノクローナル抗体を樹脂ｌｘＱあたり３貫？ で結合させた。カラムの流速は１時間あたり２０カラム容量に固定した。このカ ラムに２５カラム容量の未濃縮のｔ−ＰＡ収穫液を入れ、２０カラム容量のＰＢ Ｓ緩衝液で洗浄し、０．２Ｍ酢酸（ｐＨ３，０）中の２．０ＭグアニジンＨＣｊ （５カラム容量）で再生し、次いで１０カラム容量のＰＢＳで再平衡化した。出 発のｔ−ＰＡ収穫液中のＣＨＯ−ＰＡ量は、１００カラム再使用後の結合活性に 検出可能な損失がなく、１回のカラム通過で１００倍以上に低下した。即ち、３ ５４　ＭＡｂは、同様の工程条件下でのＣＨＯ−ＰＡ除去のための再使用可能な 生物特異的フィルターとして成功裏に用いられた。

例示した態様はヒトｔ−ｐ　ＡからのＣＨＯ−ＰＡの分離に関するものであるが 、本発明の方法は、トランスフェクションされた宿主細胞が組換えタンパク質に 対応する内生のタンパク質を産生じ、この対応の内生タンパク質に特異的に結合 する抗体を得ることができるすべての場合に用いることができる。さらに、本発 明はその好ましい態様と考えられるものについて説明が為されているが、本発明 は開示された態様に限定されるものではなく、添付した請求の範囲の思想および 範囲内に含まれる種々の修飾形および等価なものが包含され、その範囲はこのよ うな修飾形および等価なもののすべてを包含するように最も広く解釈されるべき である。

Ｘ際調査報告

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞から得られるヒト組織プラスミノーゲン 活性化因子の精製方法であって：ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を含有す る液を、チャイニーズ・ハムスタープラスミノーゲン活性化因子と特異的に結合 する抗体と接触させる工程、および 該ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を回収する工程、を特徴とする方法。
2. ２．抗体がチャイニーズ・ハムスタープラスミノーゲン活性化因子の１つの抗原 決定基に結合するモノクローナル抗体である請求項１記載の方法。
3. ３．抗体がチャイニーズ・ハムスタープラスミノーゲン活性化因子の２またはそ れ以上の抗原決定基に特異的に結合する請求項１記載の方法。
4. ４．接触させる工程が、ヒトプラスミノーゲン活性化因子を含有する液を、抗体 を固定化したクロマトグラフィー床に通すことからなる請求項１記載の方法。
5. ５．ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を含有する液が、ヒト組織プラスミノ ーゲン活性化因子を発現することができるチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞を 培養することによって得られる培養培地である請求項１記載の方法。
6. ６．モノクローナル抗体がネズミモノクローナル抗体である請求項２記載の方法 。
7. ７．チャイニーズ・ハムスタープラスミノーゲン活性化因子に特異的なモノクロ ーナル抗体。
8. ８．ネズミモノクローナル抗体である請求項７記載のモノクローナル抗体。
9. ９．チャイニーズ・ハムスタープラスミノーゲン活性化因子に特異的なモノクロ ーナル抗体を産生することができるハイブリドーマ。
10. １０．ネズミハイブリドーマである請求項９記載のハイブリドーマ。
11. １１．組換えタンパク質に対応する宿主細胞の内生タンパク質の存在を検定する 方法であって： 組換えタンパク質に対応する宿主細胞の内生タンパク質に特異的に結合し、該組 換えタンパク質には結合しない抗体を得る工程、該内生タンパク質を含んでいる かもしれない液を該抗体と接触させる工程、および 該抗体に結合した該内生タンパク質の量を測定する工程、を特徴とする方法。
12. １２．検定がＥＬＩＳＡ検定である請求項１１記載の方法。
13. １３．抗体がモノクローナル抗体である請求項１１記載の方法。
14. １４．内生タンパク質がチャイニーズ・ハムスタープラスミノーゲン活性化因子 であり、組換えタンパク質がヒトｔ−ＰＡである請求項１１記載の方法。
15. １５．組換えタンパク質を、宿主細胞の対応の内生タンパク質から精製する方法 であって： 組換えタンパク質を含有する液を、宿主細胞の対応の内生タンパク質と特異的に 結合する抗体と接触させる工程、および該組換えタンパク質を回収する工程、 を特徴とする方法。
16. １６．組換えタンパク質がヒトタンパク質である請求項１５記載の方法。
17. １７．抗体がモノクローナル抗体である請求項１５記載の方法。
18. １８．内生タンパク質がチャイニーズ・ハムスタープラスミノーゲン活性化因子 であり、組換えタンパク質がヒトｔ−ＰＡである請求項１５記載の方法。